DE19964044A1 - Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Säugetier-Epitope nachahmen - Google Patents
Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Säugetier-Epitope nachahmenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Peptiden mit 9 bis 15 Aminosäuren, die Epitope von Trophoblasten von Säugetieren nachahmen, umfassend folgende Schritte: DOLLAR A a) Immunisierung von Hühnern mit Trophoblasten oder Trophoblasten-Fragmenten DOLLAR A b) Immortalisierung der Immunantwort der Hühner in Form einer Phagen-Bibliothek, die scFv-Fragmente enthält DOLLAR A c) Identifizierung von Mitgliedern der Phagen-Bibliothek, die die synzytiale Fusion von Trophoblasten hemmen DOLLAR A d) Identifizierung von Peptiden aus einer Peptidbibliothek, die an die selektierten scFv-Fragmente binden.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
spezifischen monoklonalen immunologischen Bindungsmolekülen mit
Bindungsfähigkeit für Epitope von Säugetieren und die immunologischen
Bindungsmoleküle sowie ein Verfahren zur Identifizierung von
niedermolekularen Substanzen, die die Epitope von Säugetieren
nachahmen und die entsprechenden niedermolekularen Substanzen.
Dem Fachmann sind Verfahren zur Herstellung von immunologischen
Bindungsmolekülen, insbesondere Antikörpern bekannt. Gängige
Verfahren beruhen auf der Immunisierung von Versuchstieren mit
Substanzen, gegen die Antikörper erzeugt werden sollen. Zur
Verstärkung der Immunantwort werden im Normalfall Adjuvantien
hinzugegeben, die stark wirkende Immunogene enthalten. Die durch eine
oder mehrfache Immunisierung erreichte Immunantwort im Versuchstier
kann in Form polyklonaler Antikörperseren verwendet werden oder durch
die Hybridomtechnik immortalisiert werden und wird gegebenenfalls
gefolgt von einer Monoklonalisierung durch Vereinzelung.
Alternativ kann auch die in den Zellen enthaltene genetische Information
über die Struktur der Antikörper verwendet werden, um synthetische
Bindungsmoleküle wie beispielsweise single chain Antikörper zu erhalten.
Alle diese Verfahren beruhen auf der ursprünglichen Immunisierung des
Versuchstieres und sind daher von der Qualität der dadurch erzeugten
Immunantwort abhängig. Hierbei ist zu berücksichtigen, dass für eine
Immortalisierung der Immunantwort mit Hilfe der Hybridomtechnik
nahezu ausschließlich Mäuse zur Immunisierung verwendet werden, da
nur für Labornager entsprechende immortalisierte Myleomzellen zur
Verfügung stehen.
Bei der üblichen Immunisierung von Mäusen oder Kaninchen werden nur
dann gute Immunantworten erreicht, wenn das entsprechende Protein
vom Versuchstier als "fremd" erkannt wird. Dies ist insbesondere dann
problematisch, wenn es sich bei den relevanten Strukturen um
Strukturen handelt, die über einen langen Abschnitt der Evolution
konserviert wurden.
In vielen Fällen ist es von besonderem Interesse auch die Struktur der als
immunogen wirkenden Substanzen zu ermitteln. Soweit es sich dabei
beispielsweise um einfache Peptide und Proteine handelt, können diese
mittels der gewonnenen immunologischen Bindungsmoleküle identifiziert
und durch chromatographische Verfahren isoliert und charakterisiert
werden. Die genaue Strukturaufklärung folgt dann beispielsweise durch
Proteinsequenzierung.
Handelt es sich bei den immunogenen Strukturen jedoch um
Verbindungen komplexer Struktur, z. B. durch Beteiligung von
Lipidstrukturen ist eine Charakterisierung erschwert, da solche
Verbindungen bei einer Aufreinigung häufig ihre Struktur verlieren und
somit auch nicht mehr von den immunologischen Bindungsmolekülen
erkannt werden. In einem solchen Fall wären Substanzen von großem
Interesse, die identische räumliche Strukturen aufweisen, da diese
möglicherweise als Bestandteil von Vakzinen verwendet werden könnten,
um hiermit eine Immunisierung zu erreichen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die genannten Probleme und
Nachteile des Standes der Technik zu überwinden.
In einem Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch ein
Verfahren zur Herstellung von spezifischen monoklonalen
immunologischen Bindungsmolekülen mit Bindungsfähigkeit für Epitope
von Säugetieren umfassend folgende Schritte
- a) Isolierung von Strukturen, die die Epitope enthalten, um eine Epitop- Präparation zu erhalten
- b) Immunisierung von Nicht-Säugetieren mit der Epitop-Präparation, um eine Immunantwort zu erhalten
- c) Immortalisierung der Immunantwort, um eine Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle zu erhalten
- d) Selektion der immunologischen Bindungsmoleküle an den Epitopen, um spezifische monoklonale immunologische Bindungsmoleküle zu erhalten.
Dabei ist ein "immunologisches Bindungsmolekül" ein Molekül, das direkt
oder indirekt durch Immunisierung erhalten wird und andere Moleküle
binden kann. Der Begriff umfasst insbesondere Antikörper und
Antikörperfragmente sowie single chain Antikörper.
"Spezifische immunologische Bindungsmoleküle" bedeutet, dass diese
Bindungsmoleküle andere Substanzen mit einer Dissoziationskonstante Kd
von weniger als 10-5, vorzugsweise zwischen 10-6 und 10-12 mol/l binden.
"Monoklonale immunologische Bindungsmoleküle" sind solche, die von
einer Mehrzahl von Zellen gebildet werden können, wobei alle Zellen
jedoch identische Bindungsmoleküle exprimieren.
"Immortalisierung der Immunantwort" bedeutet, dass die erhaltene
Immunantwort in eine Form überführt wird, die es erlaubt, über einen
längeren Zeitraum entsprechende Bindungsmoleküle von Zellen in vitro
erzeugen zu lassen.
"Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle" bedeutet eine Vielzahl
von verschiedenen Bindungsmolekülen, die noch so mit ihrer DNA-
Information verbunden sind, dass durch Vereinzelung von Mitgliedern
monoklonale Bindungsmoleküle erhalten werden können.
"Selektion immunologischer Bindungsmoleküle" bedeutet ein Verfahren,
bei dem die Bindungsfähigkeit der Bindungsmoleküle an Substanzen
getestet wird und Moleküle isoliert werden, die besonders hohe
Bindungsaffinitäten zeigen.
Das Verfahren eignet sich insbesondere für konservierte Epitope.
"Konservierte Epitope" von Säugetieren sind insbesondere solche, die
- a) bei verschiedenen Säugetierspezies auftreten und
- b) relativ geringe Speziesunterschiede aufweisen, sowie gegebenenfalls
- c) dadurch gekennzeichnet sind, dass Konsensussequenzen oder Konsensusstrukturen mindestens für die Säugetiere definieren lassen, wobei c) nur zum Tragen kommt, wenn es sich um ein Epitop handelt, von dem aufgrund seiner stofflichen Natur Sequenzdaten ermittelbar sind.
Konservierte Epitope von Säugetieren sind in Nicht-Säugetieren stärker
immunogen als in Säugetieren.
Hierin werden insbesondere - neben diesem aus der Phylogenese
abgeleiteten Begriff - auch alle ontogenetisch relevanten menschlichen
Epitope unter dem Begriff "konservierte Epitope" verstanden, die
- a) im menschlichen Trophoblastgewebe, in menschlichen embryonalem Gewebe und/oder in maligne entarteten Zellen und Geweben bzw. Zwischenstadien zwischen normalem und maligne entartetem Gewebe exprimiert werden und
- b) in den zu den maligne entarteten Zellen korrespondierenden normalen, gewebstypisch ausdifferenzierten, adulten Zellen und Geweben nicht exprimiert werden und
- c) dadurch charakterisiert sind, dass sie in Säugetieren in der Regel schwächer immunogen sind als in Nicht-Säugetieren, die weder Trophoblast noch Placenta aufweisen.
Die bevorzugte Spezies zur Immunisierung sind Hühner.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von
niedermolekularen Substanzen, die Epitope von Säugetieren nachahmen,
wobei mit gemäß dem oben genannten Verfahren erhaltenen spezifischen
monoklonalen immunologischen Bindungsmolekülen aus einer Bibliothek
niedermolekularer Substanzen solche mit einer hohen Bindungsaffinität
zu den immunologischen Bindungsmoleküle identifiziert werden.
Entsprechende Moleküle ahmen somit die native Struktur der
ursprünglich eingesetzten Epitope nach, können jedoch aus grundsätzlich
anderen Stoffklassen gewählt sein; sie weisen ähnliche stereochemische
Eigenschaften auf.
Die bevorzugte Säugetierspezies, deren Epitope von Interesse sind, ist
Homo sapiens. Die Bibliothek niedermolekularer Substanzen enthält
bevorzugt Peptide, und zwar insbesondere in Form einer Phagen-
Peptidbibliothek. Bevorzugterweise umfassen die Peptide 7 bis 15
Aminosäuren, noch mehr bevorzugt 9 oder mehr bzw. 12 oder weniger
Aminosäuren.
Gegenstand der Erfindung sind auch die immunologischen
Bindungsmoleküle, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten
werden können, ein Diagnostikmittel, das die immunologischen
Bindungsmoleküle enthält, eine niedermolekulare Substanz, die durch das
erfindungsgemäße Verfahren zur Identifizierung der niedermolekularen
Substanzen identifiziert werden kann und ein Arzneimittel, das eine der
erfindungsgemäßen niedermolekularen Substanzen enthält.
In einer bevorzugten Ausführungsform lassen sich die
erfindungsgemäßen Verfahren einsetzen zur Erzeugung eines
Impfstoffes zur Empfängnisverhütung.
Die WO-A-93/06857 beschreibt bereits einen Impfstoff zur
Empfängnisverhütung, bei dem eine Proteinzusammensetzung, das aus
Trophoblastenmembranen aufgereinigt wird, als Impfstoff verwendet
wird. Aufgrund der geringen Immunogenität humaner Epitope im
Menschen sind hiermit nur geringe Erfolge zu erwarten.
Beim Menschen implantiert sich der frühe Embryo als Blastozyste
invasiv im stromalen Anteil des Endometriums, d. h. die Blastozyste
durchdringt das Epithel des Uterus und es erfolgt eine interstitielle
Implantation. Die eindringende Zellpopulation ist die äußere, epitheliale
Lage von Zellen, der sogenannte Trophoblast. Die interstitielle
Implantation kommt beim Menschen und einer Reihe von verwandten
Säugetieren, wie z. B. Mäusen und Ratten vor. Während der gesamten
Schwangerschaft durchdringen einzelne Trophoblastenzellen die
mütterlichen Gewebe bis in den Bereich der endometrial/myometrialen
Übergangszone, durchdringen die Wand mütterlicher Arterien und
ersetzen an dieser Stelle das Endothel. Beim Durchdringen des uterinen
Epithels fusionieren die Zellen des Trophoblasten zu einem synzytialen
Verband, ein Vorgang, der für eine erfolgreiche Implantation
unerlässlich ist. Der Vorgang der trophoblastären Synzytiogenese wird
durch Signalepitope ausgelöst, von denen bisher nur bekannt ist, dass
ein "Flip" von Phosphatidylserin auf die Außenseite der Plasmamembran
an ihrer Entstehung beteiligt ist. So ist bekannt, dass
- a) Frauen mit erhöhtem anti-Phospholipid Antikörpern (z. B. bei Lupus erythematodes) vermehrt Probleme mit Schwangerschaften haben und teilweise infertil sind,
- b) die Externalisierung von Phosphatidylserin auf die Außenseite der Plasmamembran der synzytialen Fusion unmittelbar vorausgeht,
- c) Antikörper, die gegen Phosphatidylserin in Versuchstieren induziert wurden, die synzytiale Fusion in vitro hemmen können.
Der Flip von Phosphatidylserin ist kein trophoblastspezifisches
Phänomen, sondern ein Ereignis, das im Rahmen jeder Apoptose im
Körper auftritt. Apoptopische Zellen fusionieren nur selten und stets nur
mit gleichartigen Zellen. Es werden daher weitere, eventuell mit
Phosphatidylserin assoziierte Epitope postuliert, die das
gewebsspezifische Ereignis der synzytialen Fusion nur im Trophoblasten,
bei der Genese von Skelettmuskelfasern und bei Osteoklasten auslösen.
Da es sich bei diesen, unter Beteiligung von Phosphatidylserin
entstehenden Epitopen nicht um reine Proteinepitope handelt, sind sie
biochemisch nur schwer isolier- und charakterisierbar.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können Substanzen isoliert
werden, die als Vakzine geeignet sind, die synzytiale Fusion zu
hemmen. Hierzu können beispielsweise Trophoblasten-Präparationen
verwendet werden, um Hühner zu immunisieren. Da Hühner weder
Trophoblast noch Trophoblastimplantation aufweisen sowie demzufolge
eine gänzlich andere, auf der Ablage von befruchteten Eiern beruhende
Reproduktion aufweisen, sind sie in der Lage, hierauf eine hinreichende
Immunantwort zu produzieren. Die Immunantwort lässt sich dann
beispielsweise mittels der Phagen Display-Technik als Phagenbibliothek
immortalisieren. Aus diesen Phagen-Bibliotheken werden solche single
chain Antikörper isoliert, die spezifisch an Trophoblast-Zellen binden. Als
alternativer oder zusätzlicher Selektionsschritt können auch solche
single chain Antikörper selektiert werden, die die synzytiale Fusion
hemmen können. Die so isolierten Antikörperstrukturen können nun
wiederum benutzt werden, um Substanzen zu isolieren, die die Struktur
der Trophoblasten-Epitope nachahmen. Beispielsweise können
Substanz-Bibliotheken wie Peptid-Bibliotheken, die gegebenenfalls
ebenfalls als Phagen Display libraries vorliegen können, gescreent
werden. Da es sich bei den so erhaltenen Peptiden um "mimics" der
ursprünglichen Epitope handelt, können diese zur Grundlage der
Entwicklung von Impfstoffen gemacht werden, die nach
Antikörperproduktion im Säugetier wiederum hemmend auf die
synzytiale Fusion wirken und somit eine empfängnisverhütende Wirkung
aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Verbindungen lassen sich
darüber hinaus auch in der Tumordiagnostik und Behandlung einsetzen.
Die oben beschriebene Durchwanderung von Gewebe durch epitheliale
Zellen, die sich von ihrer Basalmembran abgelöst haben, ist außerhalb
der Schwangerschaft nur in malignen Tumoren, insbesondere in den von
Epithel- und Drüsengewebe abstammenden Carcinomen zu beobachten.
Die Invasion maligne entarteter Epithel-Zellen hat ihre ontogenetischen
Vorläufer in der invadierenden Trophoblastzelle. Daher weisen beide
invasive Situationen Ähnlichkeiten auf:
- a) Obwohl maligne entartete Zellen sich genetisch und phänotypisch von den normalen Körperzellen unterscheiden, gibt es keine klinisch wirksame Immunantwort gegen diese Zellen. In gleicher Form wird menschlicher Trophoblast nicht abgestoßen, obwohl es sich formal sogar um ein allohaploides Transplantat handelt. In beiden Vorgängen kommt es nicht zu der erwarteten T-Zell vermittelten Immunantwort.
- b) Viele Moleküle, die während der Schwangerschaft im Trophoblasten exprimiert werden, treten in normalen adulten Geweben nicht mehr auf. Sie können aber während der malignen Entartung reexprimiert werden. Diejenigen Epitope, die sowohl während der Fetalzeit als auch im Rahmen der Carcinogenese exprimiert werden, werden als oncofetale Epitope bezeichnet. Aufgrund der weitgehenden Analogien zwischen Trophoblast-Invasion und Tumor-Invasion
besteht im Bereich der Tumordiagnostik und Tumortherapie ein weiteres
Anwendungsgebiet der erfindungsgemäßen immunologischen
Bindungsmoleküle und der niedermolekularen Substanz.
Weitere Epitope, für die das erfindungsgemäße Verfahren von
besonderem Wert sein könnte, sind
a) Epitope, die durch oligo- bis polymere Kohlehydrate gebildet werden,
unabhängig davon, ob diese selbständig existieren oder in Verbindung mit
Proteinen, Lipiden oder Nukleinsäuren auftreten,
- a) Epitope, die durch Assoziation von Untereinheiten an der Oberfläche von Zellen entstehen, insbesondere Rezeptormoleküle sowie Zell-Zell und Zell-Matrix Kontaktmoleküle
Fig. 1 zeigt ein Agarosegel der Inserts einiger Mitglieder einer
Phagenbibliothek. Zur Überprüfung der Diversität der kumulativen
Bibliothek wurden 9 Klone willkürlich gepickt, die Plasmide isoliert und
die Inserts in einer PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden gereinigt,
mit MspI restringiert, in einem 2% Agarosegel aufgetrennt und mit
Ethidiumbromid gefärbt. Die Probenreihen sind von links nach rechts
wie folgt in aufsteigender Nummerierung angeordnet. Reihe 1 : 100 bp
Größen-Leiter; Reihe 2: ΦX174/HaeIII; Reihe 3-11: Klone 1-9. Dies
zeigt, dass die Bibliothek nicht von wenigen Klonen dominiert wird.
Die folgenden Ausführungen stellen ein Beispiel für die Anwendung des
erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Das Beispiel umfasst die Schritte
der Immunisierung eines Nicht-Säugetieres mit verschiedenen Antigen-
Präparationen, die Erstellung einer Phagen-Bibliothek sowie die
Selektion spezifischer immunologischer Bindungsmoleküle im Sinne des
Verfahrens.
12 "white leghorn" Hühner im Alter von 6 bis 18 Monaten wurden
immunisiert. Die Immunisierungsprotokolle wurden auf publizierten
Standardschemata aufgebaut (Gassmann, M. et al. FASEB J (1990)
4: 2528-2532) und umfassten eine erste Injektion der
Antigenpräparation (siehe Tabelle 2) in komplettem Freund'schem
Adjuvans, die von zwei Booster-injektionen im Abstand von jeweils 2 bis
4 Wochen gefolgt wurden. Booster-Injektion wurden mit inkomplettem
Freund'schem Adjuvans durchgeführt. Falls mit lebenden menschlichen
Zellen immunisiert wurde, wurden pro Injektion eine Million Zellen ohne
Adjuvans verabreicht (siehe auch Tabelle 2). 5 Tage nach der letzten
Injektion wurden die immunisierten Tiere getötet, die Milzen entfernt
und in steriler isotoner Lösung ins Labor verbracht.
Unter sterilen Bedingungen wurde die Milz in 8-10 kleine Stücke zerteilt.
Diese Stücke wurden in einem Elvehjem Glasröhrchen mit Hilfe des
passenden Pistills vorsichtig von Hand weiter in 3 ml steriler isotoner
Salzlösung suspendiert. Diese Suspension wurde durch ein Edelstahlsieb
(150 mesh) filtriert, die im Filtrat enthaltenen Milzzellen pelletiert
(400 g, 5 min. Raumtemperatur) und anschließend in Lyse-Puffer
(0.15 M NH4Cl; 1 mM KHCO3; 0.1 mM Na2EDTA; pH 7.2) die
Erythrozyten selektiv (ysiert. Aus den verbleibenden Splenozyten wurde
die Gesamt-RNA präpariert sowie cDNA nach einer reversen
Transkription mit oligo-dT Primern hergestellt.
Primer, die benutzt werden können, um die variablen Regionen von
leichter (Vk) und schwerer Kette (Vh) der Immunglobulin-cDNAs zu
amplifizieren, sind in Tabelle 1 zusammengefasst (Andris-Widhopf, J. et
al. J Immunolt 2000 (in press)). Die PCR wurde mit folgenden
Parametern durchgeführt: Die initiale Denaturierung wurde für 1 min bei
94°C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen mit 15 s Denaturierung
(94°C), 15 s Annealing (56°C) und 90 s Elongation (74°C). Die Primer
führen einen Überlappungsbereich ein, der für die splice overlap
extension PCR bei der Erstellung der für scFv codierenden Abschnitte
benötigt wird. Die PCR führt zu Produkten von ca. 350 bp Größe. Nach
gründlicher Reinigung der Produkte wurden diese für die splice overlap
extension PCR eingesetzt.
Äquimolare Mengen (je 100 ng) der Amplifikate von Vk und Vh wurden
in der splice overlap extension PCR eingesetzt. Weiterhin enthielten die
Reaktionsmischungen ein Paar speziell definierter Primer (Siehe Tabelle
1; Andris-Widhopf, J. et al. J Immunol. 2000 (in press)),
zusammengefasst, die unter anderem die für die Restriktion und
Ligation benötigten Restriktionsschnittstellen in das Produkt einführen.
Nach initialer Denaturierung bei 94°C für 1 min. folgten 35 Zyklen mit
15 s Denaturierung (94°C), 15 s Annealing (56°C) und 120 s Elongation
(74°C). Das gewünschte Produkt hat eine Größe von 750 bp.
Verwendet wurde der Vektor pComb3H-SS (Barbas, CF 3rd. Curn Opin.
Biotechnol. (1993) 4: 526-530, Biassoni, R. et al. Semin. Cancer BioL
(1999) 9: 13-18, Siegel, D.L. et al. J Immunol. Methods (1997) 206: 73-
85, Andris-Widhopf, J. et al. J Immunol. 2000 (in press)).
Dieser Vektor sowie die oben beschriebenen Primer wurden im Scripps
Research Institut, La Jolla, Kalifornien, USA, speziell für das Phage
Display von Antikörperbibliotheken hergestellt und entworfen.
Vor der Ligation wurde der Vektor durch Verdau mit Sfi I linearisiert.
Da der Vektor zwei asymmetrische Schnittstellen dieses
Restriktionsenzyms enthält, ist nach Verdau und Reinigung des Vektors
eine direktionelle Klonierung direkt ohne weiteren Verdauungsschritt
möglich. Parallel dazu wurde auch das Produkt der splice overlap
extension PCR mit dem Enzym verdaut und das restringierte Produkt
gereinigt.
Präparierter Vektor (14 µg) und PCR-Produkt (10 µg) wurden
zusammen in der Gegenwart von 20 U T4-ligase über Nacht bei 4°C
inkubiert, die Reaktionsprodukte mit Ethanol präzipitiert und in 50 µl
Aqua Bidestillata resuspendiert. Mit dieser DNA Lösung wurden
elektrokompetente E.coli (XL-1 Blue) transformiert. Die Anzahl der
Transformanten wurde durch Titerung auf LB-Ampicillin Platten
bestimmt (Sambrook, J., E.F.Fritsch, and T.Maniatis. Cold Spring Harbor
Laboratory (1989), Cold Spring Harbor, N.Y.) und die Phagen-
Bibliotheken nach Superinfektion der transformierten E.coli mit dem
Helferphagen M13KO7 geerntet. Die in Phagenform vorliegenden
Bibliotheken wurden sowohl einzeln als auch als gemischte
Gesamtbibliothek (kumulative Bibliothek) gelagert.
Um einen Eindruck von der Diversität der Bibliothek zu bekommen und
die Dominanz einiger weniger Klone auszuschließen, wurden die
Bandenmuster von 9 zufällig gezogenen Klonen nach Restriktion des
Inserts analysiert (s. Fig. 1).
Als Antigen für die Selektion wurde die Kombination von
Phosphatidylserin mit beta-2-Glycoprotein 1 (GP1) ausgewählt. Es ist
bekannt, dass Autoantikörper gegen dieses Kombinationsepitop mit
Störungen der synzytialen Fusion assoziiert sind. Die Autoantikörper
sind dadurch charakterisiert, dass sie an Phosphatidylserin, das auf der
Außenseite der Zellen kurz vor der Fusion auftritt, in Gegenwart von
GP1 binden.
Um Antiköper mit einer Spezifität zu gewinnen, die dieser vergleichbar
ist, wurde folgende Selektionsstrategie durchgeführt:
- 1. 0.1 µg Phosphatidylserin wurden in 100 µl Ethanol gelöst und in einem ELISA Well bei 37°C aufgebunden.
- 2. Das Weil wurde 3 mal 5 min. mit Aqua bidest. gewaschen.
- 3. Das Well wurde mit phosphatgepufferter (pH 7.2) isotoner Salzlösung (enthaltend: 10% fetales Kälberserum) inkubiert (30 Minuten bei 37°C). Parallel dazu wurden auch die zu selektierenden Phagen mit derselben Lösung bei denselben Bedingungen in einem nicht mit Phosphatidylserin beschickten Well inkubiert. Das Kälberserum dient dabei sowohl als Blockierungsreagenz wie auch als Quelle für GP1. Menschliches und bovines GP1 sind hochhomologe Proteine, die beide von den menschlichen Autoantikörpern mit erkannt werden.
- 4. Die Phagensuspension wurde in das phosphatidylserinhaltige Well gegeben und 1 h bei 37°C inkubiert.
- 5. Nach dieser Inkubationszeit wurde die phagenhaltige Suspension aus dem Well entfernt und mit phosphatgepufferter (pH 7.2) isotoner Salzlösung (enthaltend: 10% fetales Kälberserum) mindestens 3 mal 5 min. gewaschen, um unspezifisch bindende Phagen sowie solche Phagen, die mit GP1 alleine reagieren, zu entfernen.
- 6. Bindende Phagen wurden mit Glycin-Puffer (pH 2.2) eluiert, die Lösung neutralisiert und die gewonnenen Phagen wurden zur Infektion von E.coli XL-lBlue verwendet. Nach Amplifikation der eluierten Phagen in E.coli über Nacht wurden die produzierten Phagen geerntet und bei Schritt 1 wieder in den Zyklus eingeführt. Die Schritte von 1 bis 5 wurden so insgesamt fünfmal nacheinander durchlaufen. Dabei wurde die Stringenz der Waschschritte in Schritt S bei jedem Zyklus durch längeres Waschen erhöht.
Aus der nach dem letzten Zyklus gewonnen Phagenpopulation wurden
15 zufällige Klone isoliert und monoklonale Phagensuspensionen durch
Kultur über Nacht hergestellt.
Die isolierten Klone sowie die unselektierten Phagen der kumulativen
Bibliothek wurden in einem Phagen-ELISA auf ihre Reaktivität mit
Phosphatidylserin getestet.
Dazu wurden die Schritte 1 bis 5 wie oben beschrieben durchlaufen.
Anschließend wurden die Wells mit einem kommerziellen Maus-
Antikörper gegen die Phagen sowie mit einem Peroxidase-gekoppelten
Antikörper gegen Maus-Immunglobuline inkubiert. Die Peroxidase wurde
durch eine chromogene Reaktion nachgewiesen und die Farbstoffmenge
im ELISA-Reader photometrisch bestimmt. Höhere Extinktion zeigt eine
höhere Anzahl bindender Phagen an. Die Ergebnisse für 15 Klone und
die kumulative Bibliothek sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Unter den
15 Klonen sind mehrere (1, 2, 4, 8, 10 und 15), die sehr viel stärker an
Phosphatidylserin binden als die Phagen der kumulativen Bibliothek.
Dies belegt die erfolgreiche Anreicherung und Selektion spezifisch
bindender Antikörper aus der kumulativen Bibliothek.
Claims (3)
1. Verfahren zur Identifizierung von Peptiden mit 9 bis 15 Aminosäuren,
die Epitope von Trophoblasten von Säugetieren nachahmen,
umfassend folgende Schritte
- a) Immunisierung von Hühnern mit Trophoblasten oder Trophoblasten-Fragmenten
- b) Immortalisierung der Immunantwort der Hühner in Form einer Phagen-Bibliothek, die scFv-Fragmente enthält
- c) Identifizierung von Mitgliedern der Phagen-Bibliothek, die die synzytiale Fusion von Trophoblasten hemmen
- d) Identifizierung von Peptiden aus einer Peptidbibliothek, die an die selektierten scFv-Fragmente binden.
2. Verfahren nach Anspruche 1, dadurch gekennzeichnet, dass die
Säugetierspezies Homo sapiens ist.
3. Verwendung der gemäß Anspruch 1 erhältlichen Peptide zur
Herstellung eines Impfstoffes zur Kontrazeption oder zur
Herstellung eines Impfstoffes zur Tumorbehandlung.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE1999164044 DE19964044C2 (de) | 1999-12-30 | 1999-12-30 | Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Säugetier-Epitope nachahmen |
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| DE1999164044 DE19964044C2 (de) | 1999-12-30 | 1999-12-30 | Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Säugetier-Epitope nachahmen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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|---|---|
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993006857A1 (en) * | 1991-09-30 | 1993-04-15 | Flinders Technologies Pty. Ltd. | Preparation and use of human trophoblast membrane expressed protein in an anti-fertility vaccine |
| US5503981A (en) * | 1988-12-06 | 1996-04-02 | Flinders Technologies Pty, Ltd. | Isolation of fetal cells from maternal blood to enable prenatal diagnosis |
-
1999
- 1999-12-30 DE DE1999164044 patent/DE19964044C2/de not_active Expired - Fee Related
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| HUPPERTZ,B. u.a.: Villous cytotrophoblast regula- tion of the syncytial apoptotic cascade in the human placenta. Histochemistry and Cell Biology, Nov. 1998, Vol. 110, No. 5, pages 495-508. (abstract) MEDLINE [online]. [recherchier am 21.09.2000]. In: STN. Accession No. 1999041502 TRAVERS, P. und BODMER, W.: Preparation and characterzation of monoclonal antibodies against placental alkaline phosphatase and other human rophoblast-associated determinants. International Journal of Cancer, May 1984, Vol. 33, No. 5, pages633-641. (abstract) MEDLINE [online]. [recheriert am 21.09.2000]. In: STN. Accession No. 84211248 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19964044C2 (de) | 2001-11-22 |
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|
| 8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |