WO2016028045A1 - 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 이의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a veterinary composition for preventing and treating infertility containing a mixed herbal extract as an active ingredient, a feed additive, and a use thereof, and specifically, a male containing a herbal extract consisting of pageokcheon, earth and sand and onion as an active ingredient.
  • the present invention relates to a veterinary composition for preventing and treating infertility, a feed additive, and a use thereof containing the mixed herbal extract as an active ingredient. It relates to a veterinary composition, a feed additive and its use containing the herbal extract as an active ingredient.
  • Varicocele 19% to 41% of primary infertility males and secondary male infertility males characterized by the expansion of the pampiniform plexus of the spermatic cord It appears in more than 80% of patients and is a major factor leading to male infertility (Agarwal A, Deepinder F, Cocuzza M, Agarwal R, Short RA, Sabanegh E , et al. (2007) Efficacy of varicocelectomy in improving semen parameters: new meta-analytical approach Urology 70, 532-538 ;.. Agarwal A, Sharma RK, Desai NR, Prabakaran S, Tavares A & Sabanegh E.
  • Surgical therapies for treating male infertility with the most commonly performed varicose veins include centuries of nonmicrosurgical approaches, laparoscopic or microsurgical varicose vein ligation in the male infertility area.
  • Varicocelectomy has been performed (Mehta A & Goldstein M. (2012) Microsurgical varicocelectomy: a review.Asian J Androl 15, 56-60.).
  • Varicocelectomy has been performed (Mehta A & Goldstein M. (2012) Microsurgical varicocelectomy: a review.Asian J Androl 15, 56-60.).
  • Despite a dramatic improvement in semen parameters in 50-80% of infertile men who underwent varicocelectomy pregnancy rates: pregnancy rates, 31-74%) (Cheng D, Zheng XM, Li SW, Yang ZW & Hu LQ.
  • ROS is a byproduct of oxygen metabolism and energy production that acts as a regulator of essential physiological intracellular processes. Small amounts of ROS play an important role in regulating sperm function in the male reproductive tract. Under abnormal conditions, oxidative stress is followed when an increase in ROS levels or a decrease in antioxidant capacity occurs. Specifically, oxidative stress results in alteration of protein expression levels in sperm, eventually leading to molecular and genetic defects (Sharma R, Agarwal A, Mohanty G, Hamada AJ, Gopalan B, Willard B , et al. (2013) Proteomic analysis of human spermatozoa proteins with oxidative stress.Reprod Biol Endocrinol 11, 48.).
  • Pregnancy in normal couples ranges from 20-25% in the first month after normal sex, 75% in 6 months, and 85-90% in 1 year. Infertility is considered to be infertility in one year despite the normal marital relationship. Infertility patients account for 13-20% of married couples, and it is estimated that there are 1.4 million infertile couples in Korea. . Among them, infertility causes 35-50% of men, and 30% of them are caused by decreased sperm motility, and male infertility is an important disease occupying 4% of urological outpatient male patients.
  • Pakrukcheon ( ⁇ ⁇ , Monrinda officinalis) is a root of Pakrukcheon, which belongs to the rubiaceae, a vine, and is distributed in southern China and is known to contain vitamin C and sugars. (See Information Interpretation, Dohae Hyangjeom Dictionary, Younglim History, 1998, pp.927-928).
  • Tosa is a seed of Cuscuta japonica or other related plants (Melancholia and Convolvulaceae). It is known to contain a (lutein) component and the like. (Refer to Information, Dohae Hyangdae, Yeonglim, 1998, p882-883).
  • Allium cepa is the diameter of Siberia, Liliaceae onions from Altai, thiol, dimethyl disulfide and diallyl-disulfide. It is known to contain caffeic acid, ferulic acid and cinapic acid. (Information disclosure, Dohae Hyangdae, Yeonglim, 1998, pp. 155-156).
  • the present inventors have found that in vitro (In vitro) to measure the impact as part tosaja, pageukcheon and / or sperm count and motility changes in the pig cum targets Onion herbal extracts of research to develop effective therapeutics in animal infertility sperm motility promoting efficacy assays (example 1), in vivo for sperm count and motility effects on the measured change in the in vivo (in vivo) political varicose animal models
  • the sperm varicose animal model evaluation method confirmed that the sperm count in the semen obtained from the vas deferens in the sample administration group of the veterinary varicose veins inducing group was confirmed and completed the present invention.
  • the task of the present invention is to develop a new fertility overcoming technology to improve fertilization rate by improving the sperm movement, through the present invention to contribute to the birth of the infertile couple to contribute to the recovery of the fertility rate and the elderly society policy policy, and to develop natural products new drugs It is to create new added value, revitalize industry and increase national interests.
  • the present invention provides a veterinary composition for preventing and treating infertility, which contains a herbal extract consisting of pageokcheon, earth and sand and onion as an active ingredient.
  • the present invention provides an animal feed additive for preventing and improving infertility, which contains a herbal extract consisting of pageokcheon, earth and sand, and onion as an active ingredient, and a feed comprising the same.
  • the herbal extract as defined herein preferably has a weight mixing ratio (w / w) of pagokcheon, earth and sand and onions of 0.01-100: 0.01-1: 1-100 parts by weight, more preferably 0.1-50: 0.1-1 1-50 parts by weight (w / w), even more preferably 1-30: 1: 1-30 parts by weight (w / w).
  • Extracts as defined herein include water, lower alcohols of C 1 to C 4 or mixed solvents thereof, preferably extracts available in water or a mixed solvent of water and ethanol, more preferably a mixed solvent of water and ethanol. .
  • Infertility as defined herein includes: spermosis (if there is no sperm in the sperm), spermosis (if the number of sperm is less than 20 million / ml), spermatosis (less than 40% of sperm motility), malformed sperm (normal Sperm morphology, including 40% or less (Korean society for sexual medicine and andrology, Textbook of andrology, 2010).
  • Animals of infertility include mammals such as pigs, horses, cows, goats, dogs, and sheep except humans; Fish such as carp and goldfish; And poultry such as pheasants, chickens, ducks, turkeys and the like.
  • Single and mixed herbal extracts can be obtained through the usual extraction procedures as follows.
  • washing the dried herbal medicines Papocheon, earth and sand and onions obtained in the step respectively, 1 to 20 times (w / v) weight of the sample, preferably 1 to 10 times (w / v) weight of water, methanol, Hot water extraction method, cold needle extraction method with ethanol or a mixed solvent thereof, preferably water and ethanol mixed solvent at 50 to 120 ° C, preferably about 80-100 ° C for 1 hour to 5 hours, preferably 2 hours to 4 hours Or a first step of performing an ultrasonic extraction method, preferably a hydrothermal extraction method; A second step of filtering the extract obtained in the above step with a filter paper to obtain a filtrate; A third step of performing the freeze drying, room temperature drying or hot air drying, preferably lyophilization of the filtrate to obtain individual dried herbal extracts, respectively; In the dry individual single herbal extract, the blending ratio of pagokcheon, earth and sand and onion is 0.01-100: 0.01-1: 1-100 parts by weight, more preferably 0.1-50:
  • the present invention provides a veterinary composition and animal feed additives for the prevention and treatment of infertility, containing the herbal extract consisting of Pageukcheon, Tosa and onion obtained by the above manufacturing method as an active ingredient and a feed comprising the same. to provide.
  • Veterinary compositions containing extracts of the present invention comprise from 0.1 to 50% by weight of said extract, relative to the total weight of the composition.
  • the extract of the present invention has little toxicity and side effects, it can be used with confidence even when taken for a long time for the purpose of prevention.
  • Veterinary dosage forms of the extracts of the present invention may be used in the form of their veterinary acceptable salts and may also be used alone or in combination with other veterinary active compounds, as well as in any suitable collection.
  • Veterinary compositions comprising extracts of the present invention may further comprise suitable excipients and diluents commonly used in the manufacture of veterinary compositions.
  • Excipients and diluents that may be included in the veterinary composition comprising the extract of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium Phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the veterinary composition comprising the extract of the present invention may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a spice, an emulsifier, a preservative, and the like, and after the veterinary composition according to the present invention is administered to an animal, Formulations may be formulated using methods well known in the art to provide rapid, sustained or delayed release, wherein the formulations are powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, solutions, syrups, aerosols, soft or hard Gelatin capsules, suppositories, sterile injectable solutions, sterile external preparations, and the like.
  • the veterinary composition according to the present invention may vary depending on the age, sex and weight of the animal, but may be administered once to several times in an amount of 0.1 to 100 mg / kg.
  • the dosage of the extract may be increased or decreased depending on the route of administration, the degree of disease, sex, weight, age and the like. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • the present invention also provides a sperm motility enhancer for animals comprising the herbal extract consisting of the cheongakcheon, earth and sand and onion, this sperm motility enhancer is to improve fertilization rate in vitro fertilization.
  • the present invention also provides an animal vaginal sperm and vaginal detergent, and a vaginal insert as an agent for treating infertility of sperm motility comprising the extract.
  • the present invention also provides an additive for sperm storage for animals in vitro fertilization comprising the extract in order to improve fertilization rate in vitro fertilization.
  • the present invention also provides a treatment method for treating infertility or infertility animals, comprising administering a herbal extract consisting of pageokcheon, earth and sand and onions to infertility or infertility animals.
  • the present invention also provides the use of a herbal extract consisting of pageokcheon, earth and sand and onion for the manufacture of a veterinary medicament for the treatment of infertility or infertility.
  • the present invention is composed of rupture cloth, earth and sand and onion obtained in the process It provides an animal feed additive for preventing and improving infertility or infertility containing the herbal extract as an active ingredient and a feed comprising the same.
  • the extract for animal feed additives may be 20 to 90% high concentrate or powder or granule form.
  • Extracts for animal feed additives of the present invention are organic acids such as citric acid, fumaric acid, adipic acid, lactic acid, malic acid, phosphates such as sodium phosphate, potassium phosphate, acid pyrophosphate, polyphosphate (polyphosphate), polyphenols, catechins (catechin ), Alpha-tocopherol, rosemary extract (rosemary extract), vitamin C, green tea extract, licorice extract, chitosan, tannic acid, phytic acid and the like may further include any one or more than one.
  • Animal feed additives containing the extract of the present invention and feed containing them are various supplements such as amino acids, inorganic salts, vitamins, antibiotics, antibacterial substances, antioxidants, antifungal enzymes, live microbial preparations, etc. Milled or crushed wheat, oats, barley, corn and rice; Vegetable protein feed, such as rape, soybeans and sunflower; Animal protein feeds such as blood meal, meat meal, bone meal and fish meal; Sugars and dairy products, for example, a dry ingredient consisting of various powdered milk and whey powder, and a drying additive, all mixed together with a liquid component, and a component which becomes a liquid after heating, that is, a lipid, for example, an animal liquefied by heating.
  • the main components such as fats and vegetable fats can be used with substances such as nutritional supplements, digestion and absorption enhancers, growth promoters, disease prevention agents and the like.
  • the animal feed additive extract may be administered to an animal in combination with other feed additives in an edible carrier alone.
  • the extract for animal feed additives can be easily administered as a top dressing or directly mixed with the animal feed or separately from the feed, in a separate oral formulation, by injection or transdermal or in combination with other ingredients.
  • a single daily dose or divided daily doses can be used, as is well known in the art.
  • the extract for animal feed additives When the extract for animal feed additives is administered separately from the animal feed, they may be prepared in an immediate release or sustained release formulation in combination with a non-toxic pharmaceutically acceptable edible carrier, as is well known in the art.
  • a non-toxic pharmaceutically acceptable edible carrier may be solid or liquid, for example corn starch, lactose, sucrose, soy flakes, peanut oil, olive oil, sesame oil and propylene glycol.
  • the dosage form of the extract may be tablets, capsules, powders, torokies or sugar-containing tablets or top dressings in microdisperse form.
  • a liquid carrier If a liquid carrier is used, it may be in the form of soft gelatin capsules or syrups or liquid suspensions, emulsions or solutions.
  • the dosage form may contain auxiliaries such as preservatives, stabilizers, wetting or emulsifying agents, solution promoters and the like. They may also contain other substances useful for the improvement and prevention of infertility.
  • animal feed included as the animal feed additive of the present invention may be any protein-containing organic cereal meal conventionally used to meet the dietary needs of animals.
  • protein-containing flours typically consist mainly of corn, soy flour, or corn / bean flour mixtures.
  • the animal feed additive may be used by adding to the animal feed by dipping, spraying or mixing.
  • the invention is applicable to a number of animal diets, including mammals, poultry and fish. More specifically, the diet is commercially important mammals such as pigs, cows, sheep, goats, laboratory rodents (rats, mice, hamsters and gerbils), furry-owned animals (eg minks and foxes). , And zoo animals (eg monkeys and tailless monkeys), as well as livestock (eg cats and dogs).
  • Commercially important poultry typically include chickens, turkeys, ducks, geese, pheasants and quails.
  • Commercially raised fish, such as trout may also be included.
  • the extract is incorporated into the animal feed in an amount of about 1 g to 100 g per kg of feed on a dry weight basis.
  • the feed mixture is thoroughly mixed and then a viscous granulated or granular material is obtained depending on the degree of grinding of the components. It is fed as a mash or formed into the desired discrete shape for further processing and packaging. At this time, it is preferable to add water to the animal feed and then go through the usual pelletization, expansion, or extrusion process to prevent separation during storage. Excess water may be removed to dryness.
  • Pacheukcheon, earth and sand of the present invention Herbal extracts were evaluated for in vitro sperm motility evaluation (Experimental Example 1), sperm counts in animal models of In Vivo spermatogonia var .
  • Example 1 sperm counts in animal models of In Vivo spermatogonia var .
  • Example 2 For measuring the effects on motility changes
  • In Vivo Veterinary composition and animal feed for the prevention and treatment of infertility by confirming that the sperm count increases in the semen obtained from the vas deferens in the sample administration group of the varicose veins inducing group through the evaluation method of the varicose vein animal model (Experimental Example 2) It is possible to provide an additive and a feed comprising the same.
  • Figure 1 shows the effect on the sperm count in the vas deferens of the compound varicose veins animal model of the complex natural extract (meaning CTR; Control, OP; Operation);
  • Figure 2 shows the effect of sperm motility in the vas deferens of the vein varicose animal model of the complex natural extract. (Means CTR; Control, OP; Operation)
  • the above ingredients are mixed to prepare an ointment in a conventional manner.
  • the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules in a conventional manner.
  • Each component is added to the purified water to dissolve it, the lemon flavor is added appropriately, the above components are mixed, and then purified water is added to adjust the total amount to 100 ml, and then sterilized by filling in a brown bottle to prepare a liquid solution in a conventional manner.
  • composition ratio of the mixture is a composition suitable for a relatively suitable feed composition in a preferred embodiment
  • the mixing ratio may be arbitrarily modified, and after mixing the above components according to a conventional feed composition manufacturing method, It can be used for manufacture according to the powder preparation method.
  • the dried extract was dissolved in physiological saline and mixed vigorously for 2 minutes at room temperature.
  • the dried extract was dissolved in physiological saline and mixed vigorously for 2 minutes at room temperature.
  • the dried extract was dissolved in physiological saline and mixed vigorously for 2 minutes at room temperature.
  • CINTM1 10 mg of dried Pagokcheon extract (CINThera-1), 1 mg of Tosa seed extract (CINThera-2) and 10 mg of onion extract (CINThera-3) obtained in Example 1 were weighed, respectively (Vortex genie-2, scientific industries, USA) to obtain a mixed herbal extract 21mg was used as a sample of the following experimental example (hereinafter referred to as CINTM1).
  • Diluted semen from KPG (Swine Gene, Gimje) was diluted 10-fold with pig diluent (Ginsose, ingredient Glucose, Tris, Getamicin sulfate, Serum albumin etc), and then placed in an incubator at 37 o C for one hour. After the semen has sufficiently liquefied, the candidate substance is added to the final concentration of 0.0005 to 0.5 mg / ml, and the sperm motility after 3 hours is measured using a chamber (MAKLER counting chamber; MAKLER counting chamber; self-Medical Instruments, Haifa, Israel). It was measured under a microscope (Axiovert25, ZEISS, USA).
  • Controls include 3H buffer ⁇ Hams F-10 (N6635, Sigma Chemical Co., USA) + 0.4% HAS (A1653, Sigma Chemical Co., USA) + 12 mM HEPES (H4034, Sigma Chemical Co., USA) [3H, pH 7.4] ⁇ , and the samples were also dissolved in 3H buffer and the pH was adjusted to 7.4, followed by centrifugation (13,000 rpm, 2 min, 4 ° C.) using a centrifuge (A32010 (1), LABOGENE). ) To obtain a supernatant.
  • the sperm count and motility of the semen from pigs were measured as 67.1, 68, at 0.05 mg / ml concentration in CINThera-1, CINThera-2, CINThera-3 and CINTM1 (10: 1: 10), respectively.
  • the highest increase in sperm motility was found at 70.5 and 73.5%.
  • the mixed herbal extract of CINTM1 (10: 1: 10) showed the highest increase in sperm motility compared to the other natural extracts alone (Table 1). )
  • the probe was removed to reduce the diameter of the renal vein to 50%, and the internal spermatic vein (ISV) branch was ligated into an experimental group. After a few weeks, the samples were dissolved in physiological saline and administered orally.
  • ISV internal spermatic vein
  • the number of sperm in the vas deferens was measured 28 days after administration, and the sperm count increased in the semen obtained from the vas deferens of the mixed herbal extract administration group.
  • the sperm count of vas deferens was 18.25 ⁇ 9.53 x 10 6 / ml, but the sperm count of 100 and 200 mg / kg / 2ml / day was 20.91 ⁇ 12.25 x 10 6 and A significant increase of 28.63 ⁇ 8.90 ⁇ 10 6 / ml was observed (FIG. 1).
  • the present invention relates to a veterinary composition for preventing and treating infertility using a mixed herbal extract, an animal feed additive, and a feed comprising the same.
  • Breaking cloth, earth and sand of the present invention And / or onion herbal extracts in vitro ( In Vitro ) Sperm Motif Efficacy Evaluation (Experimental Example 1), In Vivo static varicose vein animal model to determine the effect on the sperm count and motility changes of porcine sperm
  • To measure the effects of sperm count and motility on In Vivo Veterinary composition and animal feed for the prevention and treatment of infertility by confirming that the sperm count increases in the semen obtained from the vas deferens in the sample administration group of the varicose veins inducing group through the evaluation method of the varicose vein animal model (Experimental Example 2) It can be usefully used as an additive and a feed containing the same.

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Abstract

본 발명은 혼합 생약 추출물을 이용한 불임증 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료에 대한 것이다. 본 발명의 파극천, 토사자 및/또는 양파 생약 추출물은 돼지정액의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향을 측정하기 위한 시험관내 (In vitro) 정자 운동 증진 효능 평가법(실험예 1), 생체내 (In Vivo) 정계 정맥류 동물모델에서의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향측정을 위한 In Vivo 정계 정맥류 동물모델 평가법(실험예 2)을 통하여 본 발명의 시료들이 정계 정맥류 유발군 중 시료 투여군의 정관에서 얻어진 정액에서 정자 수가 증가함을 확인하여 불임증의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물, 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

혼합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 이의 용도
본 발명은 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는, 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 남성 불임증 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 이의 용도에 관한 것이다.
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[문헌 13] Mark sigman, Stacy Glass, Janice Campagnone, John L. Reyor, Carnitine for the treatment of idiopathic asthenospermia: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial, Fertility and Sterility Vol 85, No 5, 2006
본 발명은 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 이의 용도에 관한 것으로서, 구체적으로는, 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 수의학적 조성물, 사료첨가제 및 이의 용도에 관한 것이다.
정삭(spermatic cord)의 망상정맥총 (pampiniform plexus) 확장현상을 특징으로 하는 정계정맥류 (Varicocele), 1차 불임증 (primary infertility) 남성 환자의 19%~41% 및 2차 남성 불임증 (secondary male infertility) 남성 환자의 80% 이상에서 나타나고, 남성 불임증을 초래하는 주요 인자이다 (Agarwal A, Deepinder F, Cocuzza M, Agarwal R, Short RA, Sabanegh E, et al.(2007) Efficacy of varicocelectomy in improving semen parameters: new meta-analytical approach. Urology 70, 532-538; Agarwal A, Sharma RK, Desai NR, Prabakaran S, Tavares A & Sabanegh E. (2009) Role of Oxidative Stress in Pathogenesis of Varicocele and Infertility. Urology 73, 461-469.). 가장 흔하게 수행되는 정계정맥류에 의한 남성 불임증 치료를 위한 수술요법은 남성 불임증 영역에서 수세기 동안 비미세 수술적 (nonmicrosurgical) 접근법, 복강경 (laparoscopic) 또는 미세수술적 (microsurgical) 정계정맥류 결찰술 (varicocelectomy)을 포함한 정계정맥류 결찰술 (varicocelectomy)이 수행되어 왔다 (Mehta A & Goldstein M. (2012) Microsurgical varicocelectomy: a review. Asian J Androl 15, 56-60.). 정계정맥류 결찰술 (varicocelectomy)을 받은 불임증 남성의 환자의 50~80%에서 정자 매개변수(semen parameters) 상의 급격한 개선효과를 나타냄에도 불구하고, (임신율: pregnancy rates, 31~74%) (Cheng D, Zheng XM, Li SW, Yang ZW & Hu LQ. (2006) Effects of epidermal growth factor on sperm content and motility of rats with surgically induced varicoceles. Asian J Androl 8, 713-717. Ding H, Tian JQ, Du W, Zhang LY, Wang HZ & Wang ZP. (2012) Open non-microsurgical, laparoscopic or open microsurgical varicocelectomy for male infertility: a meta-analysis of randomized controlled trials. BJU Int 110, 1536-1542; Fisch H & Hyun G. (2012) Varicocele repair for low testosterone. Curr Opin Urol 22, 495-498; Fretz PC & Sandlow JI. (2002) Varicocele: current concepts in pathophysiology, diagnosis, and treatment. Urol Clin North Am 29, 921-937; Mehta A & Goldstein M. (2013) Microsurgical varicocelectomy: a review. Asian J Androl 15, 56-60; Tanriverdi O, Miroglu C, Horasanli K, Altay B, Caliskan KC & Gumus E. (2006) Testicular blood flow measurements and mean resistive index values after microsurgical and high ligation varicocelectomy. Urology 67, 1262-1265.), 상당부분의 수술후 임신 (fertile postoperation) 실패율과 이 수술법이 가진 장점의 부정을 주장하는 다른 보고들이 있어 왔다 (Evers JL & Collins JA. (2003) Assessment of efficacy of varicocele repair for male subfertility: a systematic review. The Lancet 361, 1849-1852; Ficarra V, Cerruto MA, Liguori G, Mazzoni G, Minucci S, Tracia A, et al. (2006) Treatment of varicocele in subfertile men: the Cochrane reviewa contrary opinion. Eur Urol 49, 258-263.). 정계정맥류 (Varicocele) 유도 불임증의 정확한 기전은 아직 명확하지 않다. 고환내 혈류 변화 (blood flow alterations in the testis), 음낭 온도 상승 (scrotal temperature elevations), 비정상적 남성호르몬수치 (abnormal hormone values), 과도한 반응성 산소종 (excessive reactive oxygen species, ROS)을 포함한 정계정맥류-관련 고환 기능부전 (varicocelerelated testicular dysfunction)을 연구하기 위하여 몇몇 가정된 기전이 제시된 바가 있다 (Agarwal A, Sharma RK, Desai NR, Prabakaran S, Tavares A & Sabanegh E. (2009) Role of Oxidative Stress in Pathogenesis of Varicocele and Infertility. Urology 73, 461-469; Fretz PC & Sandlow JI. (2002) Varicocele: current concepts in pathophysiology, diagnosis, and treatment. Urol Clin North Am 29, 921-937.).
ROS는 필수적 생리학적 세포간 경로 (vital physiological intracellular processes) 조절자로서 작용하는 산소 대사과정 (oxygen metabolism) 및 에너지 생성 (energy production)의 부산물이다. 소량의 ROS는 남성 생식 기관 (male reproductive tract)에서의 정자 기능을 조절하는데 중요한 역할을 수행한다. 비정상적 조건하에서, ROS 수준 증가 또는 항산화능 상의 감소현상이 발생시에 산화적 스트레스 (oxidative stress)가 뒤따른다. 구체적으로, 산화적 스트레스는 정자에서의 단백질 발현 수준의 변형을 초래하고, 결국, 분자 및 유전자 결함을 유발한다 (Sharma R, Agarwal A, Mohanty G, Hamada AJ, Gopalan B, Willard B, et al. (2013) Proteomic analysis of human spermatozoa proteins with oxidative stress. Reprod Biol Endocrinol 11, 48.).
정상부부에서 임신 가능성은 정상적인 성생활 후 첫 달에 20-25%, 6개월에 75%, 1년에 85-90%에 이른다. 정상적인 부부관계에도 불구하고 1년 내에 임신이 안 되는 경우를 불임이라고 볼 때 임상적으로 불임 환자는 기혼부부의 13-20%정도를 차지하고 있으며, 우리나라에서는 140만 쌍의 불임부부가 있을 것으로 추정된다. 그 중 불임 원인이 남성에게 있는 경우가 35-50%를 차지하고, 이 중 30%정도가 정자의 운동성 감소로 인해 발생하며, 남성불임증은 비뇨기과 외래 남성 환자의 4%를 점유하는 중요한 질환이다.
최근 생식 생물학과 보조생식기술의 발달로 in vitro fertilization (IVF), micromanipulation 등 assisted reproductive technique (ART) 기술이 매우 진전하였으나 그 성공률이 20-40% 정도이며, 과도한 비용이 들며, 여성에게 매우 힘들고, 합병증이 발생할 수 있는 문제점이 있다. 체외 수정은 유전자의 문제를 초래할 수 있어 최대한 자연 임신을 목표로 하고 있다.
현재까지 불임의 치료에 많은 발전이 있었지만 정자의 운동성을 향상시키는 남성불임치료제는 부재 상태이며, 임신을 향상시킬 수 있는 약물의 개발도 매우 저조한 편이다. 또한 내과적, 외과적 치료에도 불구하고 원인을 알 수 없이 정액의 질이 나쁜 남성에서 정액의 질을 향상시킬 수 있는 약물로 현재 L-carnitine이 사용되고 있으나 뚜렷한 효능을 보이지 못하고 있다. (Mark sigman, Stacy Glass, Janice Campagnone, John L. Reyor, Carnitine for the treatment of idiopathic asthenospermia: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial, Fertility and Sterility Vol 85, No 5, 2006)
파극천 (巴戟天, Monrinda officinalis)은 덩굴성 식물인 꼭두서니과 (rubiaceae)에 속하는 파극천의 뿌리로서, 중국 남부지방에 분포하며, 비타민 C, 당류 등을 함유하는 것으로 알려져 있다. (정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998년, p927-928 참조).
토사자 (絲子)는 새삼 (Cuscuta japonica) 또는 기타 동속 근연식물 (메꽃과 Convolvulaceae)의 종자로써 수지배당체, 당류, 비타민 A, 베타-카로텐 (carotene), 감마-카로텐, 테라산틴 (teraxanthin), 루테인 (lutein) 성분 등을 함유하는 것으로 알려져 있다. (정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998년, p882-883 참조).
양파 (Allium cepa)는 시베리아 (Siberia), 알타이 (Altai) 원산인 백합과 (Liliaceae) 양파의 인경으로서, 티올 (thiol), 디메틸설피드 (dimethyl disulfide), 디아릴-디설피드 (diallyl-disulfide), 카페인산 (caffeic aicd), 페룰산 (ferulic acid), 시나핀 (sinapic acid) 등을 함유하는 것으로 알려져 있다. (정보섭외, 도해향약대사전, 영림사, 1998년, p155-156 참조).
그러나, 상기 문헌의 어디에도 토사자, 파극천 및/또는 양파로 구성된 혼합생약추출물이 남성 불임증의 치료효과에 대하여 개시되거나 교시된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 동물 불임증에 효과적인 치료제를 개발하기 위한 연구의 일환으로 토사자, 파극천 및/또는 양파 생약 추출물을 대상으로 돼지정액의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향을 측정하기 위한 시험관내 (In vitro) 정자 운동 증진 효능 평가법(실험예 1), 생체내 (In Vivo) 정계 정맥류 동물모델에서의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향측정을 위한 In Vivo 정계 정맥류 동물모델 평가법(실험예 2)을 통하여 본 발명의 시료들이 동물 정계 정맥류 유발군 중 시료 투여군의 정관에서 얻어진 정액에서 정자 수가 증가함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 과제는 정자운동 증진에 의한 수정률 향상의 새로운 불임 극복기술개발로, 본 발명을 통해 불임부부의 출산을 도와 국가 정책인 출산율 회복 및 고령사회 대응 체계 개발에 기여하고, 천연물 신약을 개발하여 새로운 부가가치를 창출하고 산업 활성화 및 국익 증대를 하기 위한 것이다.
상기 목적을 해결하기 위해 본 발명은 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증 예방 및 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.
본원에서 정의되는 생약 추출물은 바람직하게는, 파극천, 토사자 및 양파의 중량 혼합비(w/w)가 0.01-100 : 0.01-1 : 1-100 중량부, 보다 바람직하게는 0.1-50 : 0.1-1 : 1-50 중량부 (w/w), 보다 더 바람직하게는 1-30 : 1 : 1-30중량부 (w/w)로 배합된 배합물을 포함하는 것임을 특징으로 한다.
본원에서 정의되는 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매에 가용한 추출물을 포함한다.
본원에서 정의되는 불임증은 무정자증 (정액에 정자가 없는 경우), 감정자증 (정자의 수가 2000만마리/ml 이하인 경우), 약정자증(정자의 운동성이 있는 비율이 40%이하), 기형정자 (정상 정자의 형태가 40% 이하)(Korean society for sexual medicine and andrology, Textbook of andrology, 2010) 등의 정자와 관련된 모든 불임증을 포함한다.
상기 불임증의 대상 동물은 사람을 제외한 돼지, 말, 소, 염소, 개, 양 등의 포유동물; 잉어, 금붕어 등의 어류; 및 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 하기와 같은 통상의 추출과정을 통하여 단일 및 혼합 생약 추출물을 수득가능하다.
상기 단계에서 얻은 건조생약재료인 파극천, 토사자 및 양파를 각각 세척하여, 상기 시료의 1 내지 20배 (w/v) 중량, 바람직하게는 1 내지 10배 (w/v) 중량의 물, 메탄올, 에탄올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매로 50 내지 120℃, 바람직하게는 약 80-100℃에서 1시간 내지 5시간, 바람직하게는 2시간 내지 4시간 동안 열수 추출법, 냉침 추출법 또는 초음파 추출법, 바람직하게는 열수 추출법을 수행하는 제 1단계; 상기 단계에서 얻은 추출액을 여과지로 여과하여 여과물을 수득하는 제 2단계; 상기 여과물을 동결건조, 상온건조 또는 열풍건조, 바람직하게는 동결건조를 수행하여 건조상태의 개개 단일 생약 추출물을 각각 수득하는 제 3단계; 상기 건조상태의 개개 단일 생약 추출물을 파극천, 토사자 및 양파의 배합비가, 0.01-100 : 0.01-1 : 1-100 중량부, 보다 바람직하게는 0.1-50 : 0.1-1 : 1-50 중량부 (w/w), 보다 더 바람직하게는 1-30 : 1 : 1-30 중량부로 배합하는 제 4단계 공정을 통하여 본 발명의 혼합생약 추출물을 제조가능하다.
따라서, 본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조공정으로 얻어진 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물 및 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.
상기에서 수득된 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물은 돼지정액의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향을 측정하기 위한 시험관내 (In vitro) 정자 운동 증진 효능 평가법(실험예 1), 생체내 (In Vivo) 정계 정맥류 동물모델에서의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향측정을 위한 In Vivo 정계 정맥류 동물모델 평가법(실험예 2)을 통하여 본 발명의 시료들이 정계 정맥류 유발군 중 시료 투여군의 정관에서 얻어진 정액에서 정자 수가 증가함을 확인하여 불임증의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물, 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공가능하다.
본 발명의 추출물을 함유하는 수의학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 추출물 자체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 추출물의 수의학적 투여 형태는 이들의 수의학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 수의학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 수의학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물에 포함될 수 있는 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 수의학적 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향신료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있는데, 본 발명에 의한 수의학적 조성물이 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있고, 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 좌제, 멸균 주사용액, 멸균 외용제 등의 형태일 수 있다.
본 발명에 의한 수의학적 조성물은 동물의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 포함하는 동물용 정자 운동 증진제를 제공하며, 이러한 정자 운동 증진제는 체외수정시 수정율을 향상시키기 위한 것이다. 본 발명은 또한 상기 추출물을 포함하는 정자 운동 증진의 불임 치료제로서 동물용 질정 및 질세정제, 그리고 질삽입제를 제공한다.
본 발명은 또한 체외수정시 수정율을 향상시키기 위하여 상기 추출물을 포함하는 동물 체외수정용 정자보관용 첨가제를 제공한다.
또한 본 발명은 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 불임증 또는 난임증 동물 에게 투여함을 포함하는, 불임증 또는 난임증 동물을 치료하기 위한 치료방법을 제공한다.
또한 본 발명은 불임증 또는 난임증 동물 치료용 수의학 약제를 제조하기 위한 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 공정에서 얻어지는 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증 또는 난임증의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공한다.
상기의 동물사료 첨가제용 추출물은 20 내지 90% 고농축액이거나 분말 또는 과립 형태일 수 있다.
본 발명의 동물사료 첨가제용 추출물은 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물을 함유하는 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료는 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종보조제가 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.
상기 동물사료 첨가제용 추출물은 동물에게 단독으로 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다.
또한, 상기 동물사료 첨가제용 추출물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 동물 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 주사 또는 경피로 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 투여량 또는 분할 일일 투여량을 사용할 수 있다.
상기 동물사료 첨가제용 추출물을 동물 사료와 별도로 투여할 경우, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 이들을 비-독성 제약상 허용 가능한 식용 담체와 조합하여 즉석 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 추출물의 투여형은 정제, 캡슐제, 산제, 토로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 연 젤라틴 캡슐제, 또는 시럽제 또는 액체 현탁액제, 에멀젼제 또는 용액제의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여 형태는 보조제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 용액 촉진제 등을 함유할 수 있다. 또한 이들은 불임증의 개선 및 예방상 유용한 다른 물질을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 동물사료 첨가제로 포함되는 동물사료는 동물의 식이 요구를 충족시키는데 통상적으로 사용되는 임의의 단백질-함유 유기 곡분일 수 있다. 이러한 단백질-함유 곡분은 통상적으로 옥수수, 콩 곡분 또는 옥수수/콩 곡분 믹스로 주로 구성되어 있다.
상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 상기 동물사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐), 모피 소유 동물(예를 들어, 밍크 및 여우), 및 동물원 동물(예를 들어, 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이), 뿐만 아니라 가축(예를 들어, 고양이 및 개)에게 사용할 수 있다. 통상적으로 상업상 중요한 가금에는 닭, 터키, 오리, 거위, 꿩 및 메추라기가 포함된다. 송어와 같은 상업적으로 사육되는 어류도 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함한 동물용 사료 배합 방법은, 상기 추출물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1 g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.
또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 매시로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성한다. 이때, 저장 중에 분리되는 것을 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하다. 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.
본 발명의 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물은 돼지정액의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향을 측정하기 위한 시험관내 (In vitro) 정자 운동 증진 효능 평가법(실험예 1), 생체내 (In Vivo) 정계 정맥류 동물모델에서의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향측정을 위한 In Vivo 정계 정맥류 동물모델 평가법(실험예 2)을 통하여 본 발명의 시료들이 정계 정맥류 유발군 중 시료 투여군의 정관에서 얻어진 정액에서 정자 수가 증가함을 확인하여 불임증의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물, 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료를 제공가능하다.
도 1은 복합천연물 추출물의 정계 정맥류 동물 모델의 정관에서의 정자수에 대한 효과를 나타낸 것이며(CTR; Control, OP; Operation을 의미함);
도 2은 복합천연물 추출물의 정계 정맥류 동물 모델의 정관에서의 정자 운동성에 대한 효과를 나타내는 것이다. (CTR; Control, OP; Operation을 의미함)
하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예1. 연고제의 제조
CINTM1 --------------------------------------------------- 15 g
70% 에탄올 ----------------------------------------------- 15 g
PEG 400 ------------------------------------------------- 800 g
PEG 4000 ------------------------------------------------ 200 g
메틸 파라벤 --------------------------------------------- 1.6 g
프로필 파라벤 ------------------------------------------- 0.4 g
상기의 성분들을 혼합하여 통상의 방법으로 연고제를 제조한다.
제제예2. 유두삽입용 주사제의 제조
CINTM1 ------------------------------------------------- 0.7 ml
생리식염수 --------------------------------------------- 0.2 ml
폴리에칠렌글리콜 -------------------------------------- 0.05 ml
트윈-80 ------------------------------------------------ 0.5 ml
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 방법으로 유두삽입용 주세제를 제조한다.
제제예3. 캡슐제의 제조
CINTM1 ------------------------------------------------- 10 mg
결정성 셀룰로오스 --------------------------------------- 3 mg
락토오스 --------------------------------------------- 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 --------------------------------- 0.2 mg
상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충진하여 통상의 방법으로 캡슐제를 제조한다.
제제예4. 액제의 제조
CINTM1 ------------------------------------------------- 10 mg
이성화당 ------------------------------------------------ 10 g
만니톨 --------------------------------------------------- 5 g
정제수 -------------------------------------------------- 적량
정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 통상의 방법으로 액제를 제조한다.
제제예5. 사료 조성물
CINTM1 추출물 ------------------------------------------- 240g
부형제(말분) -------------------------------------------- 760g
상기의 혼합물의 조성비는 비교적 사료조성물에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 대한약전 산제제법에 준하여 제조에 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 단일생약 추출물의 제조예
( 1) 파극천 추출물의 제조 ( CINThera -1)
- 건조된 파극천 (덕현당) 3,000g에 95% 에탄올 6ℓ를 넣고 90분씩 3회 초음파 추출한 후, 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 여과물은 감압 조건하에서 냉동 건조기 (ScanVac, Labogene)로 동결 건조하여 139.4g (4.6%)의 추출물 분말을 얻어 4℃에서 보관하였다.
실험에 사용하기 전, 건조된 추출물을 생리식염수에 녹이고 실온에서 2분간 격렬하게 섞었다.
(2) 토사자 추출물의 제조 ( CINThera -2)
- 건조된 토사자 (백장생) 5.2Kg에 95% 에탄올 5ℓ를 넣고 90분씩 2회 초음파 추출한 후, 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 여과물은 감압 조건하에서 냉동 건조기 (ScanVac, Labogene)로 동결 건조하여 264.3g (4.36%)의 추출물 분말을 얻어 4℃에서 보관하였다.
실험에 사용하기 전, 건조된 추출물을 생리식염수에 녹이고 실온에서 2분간 격렬하게 섞었다.
(3) 양파추출물의 제조 ( CINThera -3)
- 양파 (창녕)를 잘 씻고 건조한 후 겉껍질을 포함한 3겹 부위를 1,000g에 70% 에탄올 5ℓ를 넣고 70℃ 에서 2시간 추출한 후, 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 여과물은 감압 조건하에서 냉동 건조기 (ScanVac, Labogene)로 동결 건조하여 13.8g (1.38%)의 추출물 분말을 얻어 4℃에서 보관하였다.
실험에 사용하기 전, 건조된 추출물을 생리식염수에 녹이고 실온에서 2분간 격렬하게 섞었다.
실시예 2. 혼합생약 추출물의 제조예 (CINThera -1: CINThera -2: CINThera -3= 10: 1: 10 )
- 상기 실시예 1에서 얻은 건조 상태의 파극천 추출물 (CINThera-1) 10mg, 토사자 추출물 (CINThera-2) 1mg 및 양파추출물 (CINThera-3) 10mg을 각각 칭량하여 혼합기(Vortex genie-2, scientific industries, USA)로 혼합하여 혼합생약 추출물 21mg을 얻어 이를 하기 실험예의 시료로 사용하였다(이하, CINTM1이라 함).
실험예 1. In vitro 정자 운동 증진 효능 평가
상기 실시예의 시료들의 돼지정액의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 문헌에 기재된 시험관내 (In vitro) 정자 운동 증진 효능 평가법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Adedara IA, Oyebiyi OO, Lawal TA, Adesina AA, Farombi EO. (2013) VInvolvement of oxidative stress in municipal landfill leachate-induced toxicity in boar sperm, Vol.36, No.3 pp. 972-8).
1-1. 실험 과정
돼지로부터 얻은 정액(K.P.G. 한국돼지유전자, 김제)을 돼지정액 희석제(진스펌, 성분Glucose, Tris, Getamicin sulfate, Serum albumin etc)로 10배 희석후, 한 시간 동안 37oC의 인큐베이터에 넣은 후, 정액이 충분히 액화되면 후보물질을 넣어 최종 농도를 0.0005~0.5mg/ml되게 한 후 3시간 후의 정자의 운동성을 챔버 (MAKLER counting chamber; MAKLER counting chamber; self-Medical Instruments, Haifa, Israel)를 사용하여 현미경(Axiovert25, ZEISS, USA)으로 측정하였다.
대조군으로는 3H 완충액 {Hams F-10(N6635,Sigma Chemical Co., USA) + 0.4% HAS(A1653,Sigma Chemical Co., USA) + 12mM HEPES (H4034,Sigma Chemical Co., USA) [3H, pH 7.4]}을 사용하였으며, 시료들도 3H 완충액을 사용하여 녹인 후에 pH를 7.4로 맞춘 후, 원심분리기(centrifuge; A32010(1), LABOGENE)를 사용하여 원심분리 (13,000rpm, 2min, 4℃)하여 상등액을 수득하여 사용하였다.
정자 운동성은 하기 수학식 1에 따라 계산되었다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2015008577-appb-I000001
1-2. 실험 결과
- 상기에서 돼지로부터 얻은 정액에서 정자의 수, 운동성을 측정한 결과 CINThera-1, CINThera-2, CINThera-3 및 CINTM1(10:1:10) 각각에서 0.05mg/ml의 농도에서 67.1, 68, 70.5 및 73.5%로 정자 운동성 증가가 가장 높게 나타났으며 그 중 CINTM1(10:1:10)의 혼합생약 추출물이 다른 각각의 단독 천연물 추출물에 비해 가장 높게 정자 운동성을 증가시킴을 관찰하였다 (표 1)
Figure PCTKR2015008577-appb-T000001
실험예 2. In Vivo 정계 정맥류 동물모델을 통한 복합천연물 추출물의 효력 평가
상기 실시예의 시료들의 생체내 (In Vivo) 정계 정맥류 동물모델에서의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 문헌에 기재된 In Vivo 정계 정맥류 동물모델 평가법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Zhang LT, Kim HK, Choi BR, Zhao C, Lee SW, Jang KY, et al.(2014) Analysis of testicular-internal spermatic vein variation and the recreation of varicocoele in a Sprague-Dawley rat model. Andrology . 2, 466-73).
2-1. 정계 정맥류 동물 모델 구축
- 실험동물은 생후 9주 된 300~350g Sprague-Dawley 흰쥐를 ㈜KOATECH (평택, 한국)에서 제공받아 1주일간의 적응기간을 거친 뒤, 플라스틱 케이지에 4마리씩 사육하였다. 사육장은 인공조명에 의하여 아침 7시부터 저녁 7시까지 12시간으로 조절하였으며, 실내온도는 18~23℃와 40~60%의 습도를 유지하고 정수된 식수와 사료를 자유롭게 먹게 하였다. Ketamine+Xylazine 50mg/kg+25mg/kg)으로 복강마취 후, 복부정중절개를 통하여 좌측신장으로 접근한 후에 대정맥과 연접한 좌신정맥 (renal vein)을 노출시켰다. 좌신정맥과 평행하게 0.85mm probe을 대고 5.0 Nylon으로 결찰을 시도한 후 probe을 제거하여 신정맥의 직경을 50%로 감소시키고, 내정계정맥 (internal spermatic vein;ISV) branch를 결찰하여 실험군으로 만든 뒤에 4주 경과한 후에 시료를 생리 식염수에 녹여 경구 투여하였다.
2-2. 정계 정맥류 동물 모델에서 복합천연물 추출물의 효력 평가
- 좌신정맥을 부분 결찰하여 정계정맥류를 유발시킨 정계 정맥류 수술군과 정상 대조군에 대해 수술 후 28일 (대조군은 안정후 28일) 후부터 28일간 시료 또는 생리식염수 2 ml (정상 대조군: 생리식염수 2 ml/day, 혼합생약 추출물 100 mg/kg/2ml/day, 혼합생약 추출물 200 mg/kg/2ml/day, 정계 정맥류 수술군: 생리식염수 2 ml/day, 혼합생약 추출물 100 mg/kg/2ml/day, 혼합생약 추출물 200 mg/kg/2ml/day)을 매일 복용시킨 후에 체중을 확인하고, 전신 마취하에 정관을 제거하여 정관 속의 정자의 수와 운동성을 측정하고 양측고환, 부고환의 무게를 각각 비교하였다.
2-3. 실험 결과
- 투여 후 28일에 정관에서의 정자의 수를 측정한 결과, 정계 정맥류 유발군 중 혼합생약 추출물 투여군의 정관에서 얻어진 정액에서 정자 수가 증가함을 관찰하였다. 정계 정맥류 유발군 중 생리 식염수 투여군에서는 정관 정액의 정자 수가 18.25±9.53 x 106/ml이었으나 100 및 200 mg/kg/2ml/day의 혼합생약 추출물에 의해서는 정자 수가 각각 20.91±12.25 x 106 및 28.63±8.90 x 106/ml으로 대폭 증가함을 관찰하였다 (도 1).
투여 후 28일에 정관에서의 정자의 운동성을 측정한 결과, 정계 정맥류 유발군 중 복합천연물 추출물 투여군의 정관에서 얻어진 정액에서 정자 운동성이 증가함을 관찰하였다. 정계 정맥류 유발군 중 생리 식염수 투여군에서는 정관 정자 운동성이 31.3±18.8%이었으나 100 및 200 mg/kg/2ml/day의 혼합생약 추출물 투여군에서는 정자 운동성은 각각 53.8±20.7 및 53.3±12.1%로 나타나 정자운동 증진 효능이 탁월한 것으로 확인되었다 (도 2).
본 발명은 혼합 생약 추출물을 이용한 불임증 예방 및 치료용 수의학적 조성물, 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료에 대한 것이다. 본 발명의 파극천, 토사자 및/또는 양파 생약 추출물은 돼지정액의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향을 측정하기 위한 시험관내 (In vitro) 정자 운동 증진 효능 평가법(실험예 1), 생체내 (In Vivo) 정계 정맥류 동물모델에서의 정자수와 운동성 변화에 미치는 영향측정을 위한 In Vivo 정계 정맥류 동물모델 평가법(실험예 2)을 통하여 본 발명의 시료들이 정계 정맥류 유발군 중 시료 투여군의 정관에서 얻어진 정액에서 정자 수가 증가함을 확인하여 불임증의 예방 및 치료를 위한 수의학적 조성물, 동물사료 첨가제 및 이를 포함하는 사료로서 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증의 예방 및 치료용 수의학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 정제수를 포함한 물, C1 내지 C4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물인 수의학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 불임증의 대상 동물은 포유동물, 어류 또는 가금류인 수의학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량% 포함하는 수의학적 조성물.
  5. 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 유효성분으로 함유하는 불임증의 예방 및 개선용 동물사료 첨가제.
  6. 제 5항에 있어서, 상기의 동물사료 첨가제는 침지, 분무 또는 혼합하여 동물사료에 첨가하는 것을 특징으로 하는 동물사료 첨가제.
  7. 제 5항의 동물사료 첨가제를 포함하는 사료.
  8. 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물을 불임증 또는 난임증 동물 에게 투여함을 포함하는, 불임증 또는 난임증 동물을 치료하기 위한 치료방법.
  9. 또한 본 발명은 불임증 또는 난임증 동물 치료용 수의학 약제를 제조하기 위한 파극천, 토사자 및 양파로 구성된 생약 추출물의 용도.
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