WO2016026014A1

WO2016026014A1 - Derivado de ácido perílico, processo para a preparação de um derivado de ácido perílico, composição farmacêutica, uso de um derivado de ácido perílico e método de tratamento de câncer

Info

Publication number: WO2016026014A1
Application number: PCT/BR2015/000127
Authority: WO
Inventors: Antonio Carlos SANI; Maria Antonieta Ferrara; Paulo Sérgio Bergo DE LACERDA; Raquel Elisa da Silva LÓPEZ; André Luiz Franco SAMPAIO; Marcelo Raul Romero TAPPIN; Elba Pinto da Silva BON
Original assignee: Fundação Oswaldo Cruz
Priority date: 2014-08-20
Filing date: 2015-08-20
Publication date: 2016-02-25
Also published as: BR102014020443A2; EP3184503A4; WO2016026014A8; US20170260121A1; CN106660927A; EP3184503A1

Abstract

A presente invenção proporciona um composto do ácido perílíco em forma de sal possuindo a Fórmula lI, tendo a atividade anti-câncer, onde o contra-íon M* compreende metais alcalinos ou alcalinos terrosos, como Na* (sódio), K⁺ (potássio), Ca⁺²/2 (cálcio), etc. A invenção contempla ainda um processo de obtenção do composto, uma composição farmacêutica, uso do composto e um método de tratamento de câncer.

Description

DERIVADO DE ÁCIDO PERÍLICO, PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM DERIVADO DE ÁCIDO PERÍLICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DE UM DERIVADO DE

ÁCIDO PERÍLICO E MÉTODO DE TRATAMENTO DE CÂNCER

CAMPO OA INVENÇÃO

[001] A pesquisa e desenvolvimento de medicamentos antícancerígenos é uma prioridade em todo o mundo devido ao avanço exponencial da doença, entretanto, vem se pesquisando o desenvolvimento de um medicamento que, além de empregar tecnologia limpa, utilize também niatéria-prima de baixo custo, contribuindo para a diminuição de gastos com a quimioterapia convencional. Corno exemplo, podemos citar os compostos derivados da indústria de cítricos, onde o Brasil ocupa liderança mundial. Um desses compostos é o limoneno, que é obtido a partir dos resíduos industriais, ou seja, as cascas de cítricos. O ácido perilico (AP) (fórmula I) é conhecido pela sua ativtdade anti-cancer, podendo ser produzido a partir da atuacão de microorganismos, em especial as leveduras pertencentes aos géneros Anula, Cândida e Yarrowia sobre o limoneno, através da síntese biológica (bioconversâo).

[002] A presente invenção compreende compostos derivados do ácido perilico em forma de sal tendo a Fórmula II, podendo ser obtidos a partir do acido perilico, que por sua vez é obtido pela bioconversâo do limoneno, tendo a atividade anti -câncer e sendo solúvel em água.

(003J Os compostos de sais derivados do ácido perilico onde o contra- ion M⁺ compreende metais alcalinos ou alcalinos terrosos, como por exemplo Na⁺ (sódio), K⁺ (potássio), Ca⁺² (cálcio) e estão representados peia Fórmuia II onde o contra-íon M⁺ pode ser Na, K, Ca/2, etc.

[004] A presente invenção compreende, particularmente, a obtenção de compostos derivados do ácido períiico em forma de sai, como por exemplo o perilato de sódio, aqui descrito como NAP (Fórmula til), tendo a atividade anticâncer e sendo solúvel em água.

[005] Particularmente, a presente invenção trata de um composto, composição farmacêutica, processo de obtenção de um composto, uso do composto no tratamento de câncer e método de tratamento de câncer.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[006] O limoneno consiste de um monoterpeno de baixo custo, amplamente distribuído na natureza, sendo um subproduto abundante da indústria de cítricos e pode fornecer derivados oxigenados que possuem elevado valor agregado de grande importância farmacêutica. Entre esses derivados temos o ácido períiico que ocupa lugar de destaque por apresentar ativídades anticancer e antimicrobiana, bem como o álcool perílico e o perilaldeído, conforme fórmulas estruturais descritas a seguir

[007] Os processos de bioconversão oferecem vantagens técnicas, económicas a ambientais em comparação com a síntese química, dentre elas destacamos a formação de produtos com químío, régio e enaniiossefetividade, com menor formação de subprodutos, uso de condições brandas de reaçâo e baixo consumo de energia. A aplicação industrial da bioconversão vem adquirindo importância crescente, especialmente para a produção de fármacos e intermediários de drogas, devido a capacidade de produzir produtos enantiomericamente puros

[008] Devido à abundante disponibilidade do isômero dextrogiro R ·(+)- limoneno a partir de resíduos industriais cítricos, a bioconversão microbiana deste composto tem sido intensamente explorada para estabelecer métodos de baixo custo para a produção de compostos aromáticos (por exemplo, a- terptneol) e derivados farmacologicamente ativos, tais como álcool perílico e ácido perilico, os quais encontram -se descritos em.

• Cadwallader K.R.; Braddock RJ.; Parish M.E.; Higgins D.P.

Btocortversíon of ó-Hmomne by Pseudomonas gfadtofí. J. Food Sei. 54,

1241-1245 (1989); • Mirata; MA.; Beerd D.; Schrader J. integrated bioprocess for tbe oxfdatton of limonene to periilic actd with Pseudomonas putida DSM 12264, Process Biochem. 44, 764-771 (2009);

• Speetmans G.; Bijlsma A.; Eggink G. LJmomne bioconversion to high concentrations of a singfe and stabfe product, peritHc acfcl, by a sofvent- resistant Pseudomonas putkiastmn Appi Microbiol. Biotechnol. 50, 538-544 (1998).

[009] Derivados obtidos de límonerto têm sido estudados como agentes antimicrobianos e anticancerígenos pelos seguintes autores.

• Da Fonseca, C.O.; Simão, M.; Uns, l R.; Caetano, R. O.; Futuro, D.;

Quirico-Santos, T. Efftcacy of monoterpeneperillyi alcohoí upon survivai rate of patients wrth recurmnt gltoblastoma J. Câncer Res. Clin. Oncot. 137. 287-293 (2011 );

• Yeruva, L; Pierre, KJ.; Begbede, A,; Wang, R.C.; Carper, S.W, Penfíyt alcohot and periitíc add índuced cell cycfe and apoptosis in nonsmall cell iung câncer. Câncer tetters 257, 216-226 (2007).

[010] O pedido de patente W09S/24895 descreve a utilização de álcool perílico e de éster metílico do ácido peniico para reduzir os níveis de colesterol no soro de modo a m\btr a formação e provocar a regressão do carcinoma, enquanto o documento de patente BRPt0107262 refere-se ao tratamento de tumores de células no sistema nervoso de mamíferos através do uso do álcool perílico para tntbtr a formação e causar a regressão de tumores.

[011] O ácido perílico (AP) encontra-se disponível comercialmente na forma levogtra, ou (S)-AP, assim como o álcool perilrco, lnfere-se disso que o (S)-AP é obtido por síntese química que envolve várias etapas iniciadas com outros precursores que não o (R)-limoneno, já que este produziria moléculas dextrogiras.

[012] Assim, considera-se relevante para a saúde da população a produção de um medicamento anticancerígeno obtido a partir de uma matéria- prima de baixo custo. Esta é representada pefo limoneno, que é um derivado da indústria de cítricos, o qual é transformado através de uma tecnologia limpa, sem utilizar solventes ou catalisadores tóxicos para a produção do princípio ativo. Ao contrário, o método utiliza meto biológico aquoso para converter o limoneno peia atuação de uma levedura biologicamente segura. Adicionalmente, o processo desenvolvido apenas utiliza energia elétrica para agitação do sistema, sem aplicação de calor, ou seja, o mesmo é realizado á temperatura ambiente, com pH neutro (pH da água). Dessa maneira, além de aproveitar rejeitos industriais, o processo fermentativo gera resíduos biodegradáveis, encaixando-se, portanto, nos princípios da Química Verde.

[013] É importante enfatizar que o objeto da presente invenção trata de um composto e de composição farmacêutica, cujo processo de produção tem alto grau de sustentabilidade,

SUMÁRIO OA INVENÇÃO

[014] A presente invenção compreende um composto derivado do ácido perílico em forma de sal, de acordo com a Fórmula II, onde o contra-íon M⁺ compreende metais alcalinos ou alcalinos terrosos, como por exemplo Na⁺ (sódio), K⁺ (potássio), Ca⁺² (cálcio), etc. Particularmente, o composto da invenção é o perilato de sódio (NAP), representado pela Fórmula III, obtido a partir do ácido perílico, o qual foi produzido por bioconversáo do limoneno.

[015] Outro objetivo da presente invenção está relacionado a uma composição farmacêutica compreendendo compostos derivados do ácido perílico em forma de sal de Fórmula II, particularmente, o composto perilato de sódio (NAP) de Fórmula IH.

[016] Outro objetivo da presente invenção compreende o processo de obtenção de compostos derivados do ácido perílico em forma de sal de Fórmula II, particularmente, o composto perilato de sódio (NAP) de Fórmula HL Além disso, a invenção se refere ao uso de compostos derivados do ácido perílico em forma de sal, particularmente, o perílato de sódio (MAP), no tratamento de câncer.

[017] A presente invenção proporciona ainda um método de tratamento de câncer utilizando compostos derivados do ácido perílico em forma de sal, particularmente, o periiato de sódio (NAP)

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] A seguir descreve-se resumidamente o conteúdo de cada figura,

[019] A figura 1 representa o fluxograma do processo de obtenção do composto derivado do ácido perílico

[020] A figura 2 mostra o efeito do (S)-NAP na viabilidade de HCT-116 (adenocarcinoma de cólon humano de alta malignidade). A regressão linear possui coeficiente de correlação (R²) de 0,9347, com importante significância estatística, utilizando intervalo de confiança de 95%

[021] A figura 3 mostra o efeito do (S)-NAP na viabilidade de células tumorais HT-29 (adenocarcinoma de cólon humano). A regressão linear possui coeficiente de correlação (R²) de 0,9569, com importante significância estatística, utilizando intervalo de confiança de 96%.

[022] ^A figura 4 mostra o resultado do ensaio antiproliferativo em células K562 (leucemia).

[023] A figura 5 mostra o resultado do ensaio antiproliferativo em células MCF7 (tumor de mama).

[024] A figura 6 mostra o resultado do ensaio antiproliferativo em células Lucena (leucemia multidroga-resistente).

[025] A figura 7 mostra o resultado do ensaio antiproliferativo em células SKMEL (melanoma).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[026] O ácido perílico (AP) (Fórmula I) é conhecido pela sua ativídade anti-câncer, podendo ser produzido pela síntese biológica (bioconversão) promovida pela atuação de micro-organísmos, em especial leveduras pertencentes aos géneros Arxufa, Cândida e Yarrowia, sobre o iimoneno. Por sua vez, o iimoneno é um composto classificado como monoterpeno, sendo obtido em larga escala a partir dos resíduos da indústria de cítricos (cascas de laranjas).

[027] Em função dos resultados dos ensaios clínicos e pré-dínícos com o álcool perílico (POH) e também com o ácido perto (PA) descritos na literatura, os compostos derivados do ácido perílico em forma de sal, em particular o perilato de sódio (NAP), surgem como agentes viáveis para impedir o crescimento de tumores. As principais razões para a utilização de compostos derivados do ácido perílico em forma de sal no tratamento de tumores são as seguintes:

(i) foi encontrada elevada concentração de ácido perílico e ácido dihidroperilico em plasmas de pacientes que receberam tratamento clínico com álcool perílico; (ii) a solubilidade do NAP em meio aquoso é maior que a do POH e PA, por conseguinte, possui solubilidade maior em meio fisiológico e no plasma sanguíneo; o que o toma mais disponível no organismo, levando a requerer menores concentrações para exercer os mesmos níveis de atividade que os derivados mais lipofílícos, como o ácido perílico e o álcool perílico;

(iii) a maior biodisponíbilidade dos compostos de sais de ácido perílico possⁱbilita que a atuação nos diferentes órgãos do corpo seja mais abrangente, em comparação com as moléculas mais lipofllicas do álcool perílico ou do ácido perílico; (iv) a funcionalidade ácida e o potencial de ionização dos sais de ácido perííico favorecem a obtenção de híbridos moleculares ou novas composições medicamentosas, abrindo a possibilidade de combinações que consolidem também seu uso como adjuvante e/ou como agente sinérgico nos tratamentos convencionais de câncer.

[028] A presente invenção compreende a obtenção de compostos derivados do ácido perílíco em forma de sal (Fórmula II), particularmente o perilato de sódio, aqui descrito como NAP (Fórmula Hl), tendo a atividade anticâncer e sendo solúvel em água. Esta molécula é obtida a partir do ácido perílíco, que por sua vez é proveniente da bioconversâo do limoneno

Processo de obtenção do acido perílíco e perilato de sódio

[029] Antes da obtenção do composto da presente invenção, o perilato de sódio (NAP), deve-se obter o ácido perííico por meio da bioconversâo do limoneno

[030] Através de um processo biológico, o rnonoterpeno limoneno é convertido em ácido perílíco pela açâo de micro-organismos, em especial as leveduras pertencentes aos géneros Anuía, Candkta e Yarmwia. O produto destas bioconversões, o ácido perílíco (AP), é extraído do meio biológico aquoso e em seguida, isoladamente transformado no sal correspondente, exemplificado pelo sal sódico NAP, que resultam da açâo da base apropriada em solvente compatível. O processo de obtenção ocorre em quatro etapas fundamentais, conforme representado no fluxograma da Figura 1. [031] O processo de obtenção do sal sodico, por exemplo; perilato de sódio (NAP) possui as seguintes etapas:

1) Crescimento celilurar

2) Bioconversáo do limoneno

3) Isolamento do ácido perílico do meio de cultura

4) Obtenção do sal sódica (NAP)

Etaoa 1 -.Crescimento celular

[032] Nessa etapa é realizada propagação celular a partir da cultura- estoque e a produção de biomassa.

[033] A etapa de crescimento celular utiliza a levedura seiecionada, tendo sido classificada como segura, segundo os critérios do GRAS - Generally Regarded as Safe, conforme preconizado pela US Food and Drug Administration (FDA), órgão responsável pelo registro de medicamentos nos Estados Unidos. Nesta etapa, as condições ideais de crescimento celular, para produzir biomassa suficiente e necessária para iniciar a bioconversáo foram otimtzadas por estudos que consideraram parâmetros influentes na cultura celular, como fonte de carbono e fonte de nitrogénio

Etapa 2 - Bioconversáo do limoneno

[034] Conforme o estado da técnica veriffca-se que a Yarrowta lipofytica é um microrganismo que produz enzimas específicas, as quais sao capazes de oxidar o limoneno para ácido perilico. A bioconversáo do limoneno para se obter ácido perillco (AP) ocorre em apenas uma etapa, a qual foi ensaiada para se obter rendimento máximo, apresentando os seguintes parâmetros: a) concentração da massa celular de levedura entre 5 a 20 g/L; b) quantidade de limoneno utilizada na reaçâo entre 0,1% a 0,5% v/v; c) adição do limoneno em porção única ou em porções intermitentes; d) pH do meio entre pH 5,7 a 7,4; e) temperatura entro 20 a 30 °C; e, f) tempo de reaçâo entre 24 a 48 h.

[035] A quantidade obtida de AP é comparável com o que se relata para bioconversoes similares do limoneno utilizando bactérias, ou seja, cerca de 1g/L Iimoneno, correspondendo à conversão de 30%, quando realizados na mesma escala.

[036] Uma das vantagens do processo de obtenção do ácido per ílico em relação ao do estado da técnica compreende a produção seletiva do AP pela bioconversáo, ou seja, os sub-produtos resultantes não contaminam o produto, tais como, o aldeído perílico, o álcool períiio e substâncias derivadas do iimoneno poli-hidroxilado.

[037] Além disso, na bioconversáo é empregado meio aquoso, eliminando dessa forma todos os componentes tóxicos, atendendo requisitos ambientais atuais.

Etapa 3 - Extração do ácido perílico do meio de cultura

[038] Nessa etapa, o AP é precipitado em meio ácido ou, alternativamente, extraído com solvente apropriado.

[039] Portanto, após a finalização da etapa de bioconversáo do iimoneno, inicia-se a terceira etapa do processo que compreende a etapa de isolamento do ácido perílico (AP), que é estável o bastante nas condições ambientais normais. Dada a sua natureza de monoterpeno (possuindo 10 carbonos) e a presença de uma função carboxíiica, o AP pode ser isolado de várias maneiras, entre as quais duas delas foram eleitas:

(1) partição com solvente apropriado, o isolamento do AP pode ser efetuado por partição liquido-líquido, utilízando-se um solvente lipofilico imiscível com água, particularmente o acetato de etíla; ou,

(2) combinação de filtração com partição ácido-base: a extração pode ser efetuada por um conjunto idealizado de operações que incluem em alguma de suas etapas o aumento/abaixamento do pH do meio, com ácidos minerais e hidróxidos de metais alcalinos, pré- ou pós-filtraçáo em membranas adequadas; seguidas de recuperação do meio ácido final que provoca a precipitação do AP, que então é finalmente separado por filtração.

[040] Nesta etapa o AP foi isolado com duas finalidades: a primeira delas é para posterior obtenção do NAP ou outro sat derivado do ácido perílico; e a segunda para a obtenção de amostras que serão analisadas quantitativamente, de modo a ava!iar-se a eficiência ou náo da bio-oxidação do límoneno pela levedura e a qualidade/pureza do AP obtido

Etapa 4 - Obtenção do sal sódico (HAP)

[042] Após o isolamento do ácido perílico (AP) a quarta e última etapa do processo compreende a obtenção do sal periiato, através da substituição do hidrogénio do ácido carboxíNco por cátton proveniente de metais alcalinos ou alcalinos terrosos, como Na⁺ (sódio), K⁺ (potássio), Ca⁺² (cálcio), etc. Essa etapa tem a finalidade de aumentar a solubilidade de compostos em solventes hidrofificos, de modo a favorecer a solvataçâo, propiciando a estabilização da separação entre os ànions e cátions correspondentes. Dessa maneira, a modificação de moléculas covalentes em sais tem como finalidade facilitar os procedimentos farmacotécnicos e também a dispontbilidade biológica dos fármacos.

[043] No caso do ácido perílico (AP), verifíca-se a existência de duas formas enantioméncas, as quais podem ser obtidas das seguintes maneiras:

● (S)-AP (forma levogira) - comprado no mercado de reagentes; ou

● (R)-AP (forma dextrogíra) - produzido em laboratório, pela conversão do (R)-limoneno.

[044] Ambas as formas (tevogtra e dextrogíra) podem produzir os sais correspondentes, sem prejuízo da ativídade ôtica (enantiomerismo) inerente a cada forma, desde que a modificação do ácido perílico (AP) em seu sal correspondente não afete estas propriedades, Portanto, a despeito de se utilizar um ou outro enantiômero (R ou S) do ácido perílico (AP), a descrição de sua modificação em sal de ácido perílico, como por exemplo, o NAP não precisa especificar esta condição, pois o centro quiral da molécula, responsável por esta ativídade. náo será alterado por transformações desta natureza. Daí que o enantiomensmo original do AP será mantido integralmente, ou seja, o (R)~AP gerará apenas (R)-NAP, e o (S)-AP gerará apenas o (S)-NAP.

[045] A transformação do ácido AP em sal NAP foi realizada tanto para o reagente (S)-AP comercial, bem como para o reagente (R)-AP produzido no laboratório por bioconversâo do (R)-limoneno com Y. fypofítica.

[046] No presente caso, ambos os saís (R)-NAP e (S)-NAP foram obtidos pela açâo de um metóxido de metal alcalino, particularmente metóxido de sódio adquirido comercialmente, solubilizado no álcool correspondente, particularmente o metanol. O AP é relativamente solúvel e o NAP (dadas suas características iónicas) relativamente insolúvel em álcoois. Assim, a adição controlada de uma solução de metóxido de sódio em metanol (10% a 30%) a uma solução também metanóíica de AP, em concentrações adequadas, sob agitação e resfriamento com banho de gelo, promove a formação de um precipitado, conforme demonstrado no Exemplo 5.

[047] A formação do precipitado de NAP em metanol e o consumo máximo de AP é garantido pelo uso de leve excesso estequiométrtco de metóxido de sódio. Este precipitado compreende um sólido de coloração entre branca e levemente amarelada e pode ser filtrado, lavado com acetona, purificado, seco e armazenado, visando os testes de atividade antitumoral.

[048] Para a obtenção do NAP podem ser utilizadas duas rotas distintas, a partir de: (1) a reaçáo do (S)-AP comercial com o metóxido de sódio, e (2) a síntese biológica do (R)-AP pela bioconversâo do (R)-limoneno com Yarrowia fipolytica, seguindo-se a reaçáo deste com metóxido de sódio para produzir o (R)-NAP, conforme descrito no esquema a seguir. >

[049] O NAP foi identificado por espectrometria convencional, em particular Ressonância Magnética de Próton (Ή-RMN) Esta identificação teve suporte de dados comparativos disponíveis para o ácido perílico, bem como para o fimoneno.

[050] Os rendimentos de (S)-NAP e (R)-NAP variaram de 44% a 76% conforme mensurados por cromatografia de gás (CG); também utilizada para determinar os respectivos graus de pureza Não há citações descrevendo este composto ou dados associados a ele; o que o caracteriza como inédito,

[051] Como exemplo, os dados de *H~NMR obtidos para o R-NAP estáo listados a seguir, de acordo com a Fórmula IV. Os valores assinalados para o composto R-NAP sáo idênticos aos do S-NAP, já que a técnica de RMN aplicada não diferencia enantiòmeros.

[052] A seguir são descritos exemplos de modo a detalhar a invenção. Exemplo 1

Obtenção de biomassa celular de Yãrrowia lipolytíca

[053] A linhagem de levedura empregada, V. lipolytica ATCC 18942, utilizada na bioconversào do limoneno, tem como procedência a coleção de culturas do exterior (American Type Cultura Cdlection), náo havendo qualquer caracterização de acesso a recursos do patrimônio genético do território brasileiro. A origem da cepa utilizada de V, tipolytica é a coleçáo institucional de microrganismos da Fundação Oswaldo Cruz, cujo depósito encontra-se no Instituto Nacional de Controle da Qualidade em Saúde (INCQS/FIOCRUZ), sob registro n° 40149.

[054] A melhor condição de cultivo da levedura envolveu seu crescimento em meio YMB (Yeast Maft Broth) (10 g/L de glicose, 3,0 g/L de extrato de levedura, 3,0 g/L de extraio de malte e 5,0 g/L de peptona) num agitador rotativo (250 rpm) a 25 °C durante 48 h. O cultivo foi realizado em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meto de cultura e as células foram incubadas a 28 °C com agitação a 250 rpm durante 48 h em agitador rotativo. A concentração de massa celular foi determinada em OD«», com referência a uma curva de calibração Uma unidade em ODwo correspondeu a uma concentração de célula seca de 0,444 g/L de Y. lipolyttca.

Exemplo 2

Bioconversâo do limoneno usando Y. lipotytica

[055] A massa celular da levadura Y, lipolytica obtida como descrito no Exemplo 1 foi centrtfugada a 3000 g e utilizada para a bkxonversâo de R-(+)- limoneno (96% - Fluka, Buchs, Suíça). As condições de reaçâo para a bíoconversáo de limoneno foram como se segue: (i) temperatura entre 20 e 30 °C; (ii) pH entre 5,7 e 7,4 em tampáo fosfato (50 mM); (tii) concentração de massa celular entre 5 g/L e 20 g/L; e (iv) concentração de limoneno de 0,1 a 0,5 % (v/v). A mistura de reaçâo foi incubada com agitação a 250 rpm, e as células foram separadas do sobrenadante (contendo AP) por centrifugação a 3000 g. De acordo com a análise por GC-FID (ver abaixo), a bioconversâo de limoneno resultou na formação de 1 g/L de ácido perílico.

[056] A produção de ácido perílico na bioconversâo foi mensurada por cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (GC-FID). Para tal, as amostras foram analisadas segundo duas preparações distintas, conforme descrito nos Exemplos 3A e 38.

[057] As análises em CG foram realizadas em um cromatógrafo de gás (modelo Network HP 6890N) com uma coluna de capilaridade HP-Innowax (30m x 0,25 mm x 0,25 mm de espessura de filme), uma taxa de fluxo de 2,0 mL/min e um modo de taxa de divisão de fluxo 1/15 (injetor "splrt/spiítiess"). O programa de temperatura foi como se segue: temperatura inicial de 50°C, mantida durante 2 minutos, temperatura final de 25Q°C, mantida durante 8 minutos e uma taxa de aquecimento de 10°C min. Foi usado hélio como gás de transporte. A temperatura do injetor foi ajustada para 270 °C. A detecção foi realizada com um detector de ionização de chama (DIC), a 270 °C. Para a quantificação do AP formado, foi construída uma curva de calibração utilizando ácido (S)-perílico comercial

[058] O ácido perílíco obtido na bioconversáo teve sua estrutura confirmada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa com detecção por impacto de elétrons (GC-E ). As análises foram realizadas nas mesmas condições utilizadas na análise CG-DJC, com exceçào da utilização de uma coluna HP-5 MS. Nesta coiuna, o ácido perílico eluiu em 13,03 minutos, resultando numa fragmentação de massas idêntico ao do composto comercial [m/z 166 (M⁺), 121 ( ⁺ - CO₂H), 105, 93, 79, 68J.

Exemplo 3

Isolamento do ácido perílíco do meio reacional

Exemplo 3A: Extração por solvente

[059] A fase aquosa proveniente da bioconversáo do limoneno foi transferida para um extrator de 1L, adicionando-se NaCI (75 g/L) com agitação até a completa solubilizaçáo do sal. A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (trés porções de 325 mL/L) e separada da fase orgânica em um funil de separação. Após reuni as fases orgânicas, foi adicionado o agente secante Na₂SO₄ (10 a 15 g/t). A filtração e a concentração do solvente em evaporador rotatório conduziram à obtenção de um sólido levemente amarelado, que em seguida foi seco sob alto vácuo. O rendimento médio do processo situou-se na faixa de 80 a 90% e a pureza média das amostras, na faixa de 80 a 85%, conforme determinada por CG. Uma vez efetuado em menor escala, este procedimento também foi utilizado para preparar amostras para análise por CG do AP obtido.

Exemplo 3B: Precipitação do AP com adição de ácido [060] Uma alíquota (1 ml) da fase aquosa proveniente da bioconversâo do límoneno foi transferida para um tubo de centrífuga, ao qual adiconararn-se 50 μL de HCI 0,6 M para induzir a precipitação. Após centrifugação a 10.000 rpm durante 10 minutos e descarte do sobrenadante, o precipitado foi dissolvido em 2 ml de acetato de etila, para análise em CG. O método de preparação da amostra foi avaliado utilizando uma preparação artificial de ácido perilico comercial, obtendo-se 98,1% de recuperação Uma vez efetuado em maior escala, este procedimento também foi utilizado para extrair o AP do meio de bioconversâo.

Exemplo 4

Preparação de perilato de sódio (NAP)

[061] Em uma solução de ácido perílico (580 a 702 mg; 3,5 a 4,2 mmol ) em MeOH (5,3 a 7,3 mt) foi adicionada, com resfriamento (10 a 0 °C), uma solução comercial de MeONa (30%, Vetec) até ocorrer precipitação completa. 0 precipitado foi filtrado e purificado por lavagem com acetona gelada (8,5 a 10,5 mL) fornecendo, após secagem a vácuo, um sólido levemente amarelado que corresponde ao NAP (480 a 722 mg, rendimento 73 a 91%) Este processo foi realizado tanto para o reagente (S)-AP comercial, bem como para o (R)-AP produzido no laboratório por bioconversâo do (RHímoneno; obtendo-se o (S)~ NAP e o (R)-NAP, respectivamente. O produto obtido foi identificado por espectrometria convencional, em particular H-RMN.

Exemplo 5

Efeito tumoricída da molécula (S)-NAP em células de adenocarcinoma de cólon humano com alto grau de malignidade - HCT-116

[062] Esse exemplo foi executado de modo a comprovar a capacidade tumoricida do perilato de sódio. Primeiramente avaliou-se o efeito do (S)-NAP sobre a viabilidade de células de adenocarcinoma de cólon humano com graus crescentes de malignidade. Caco2, HT-29 e HCT-116 e uma célula controle normal MDCK, uma célula de rim de dálmatas. Ensaios de proliferação

(i) Cultura de células Foram utilizadas linhagens de células de adenocarcinoma de cólon humano com níveis de malignidade decrescente HCT 116, HT-29 e Caco-2. Como controle de modelo de célula epitelial foi usada uma linhagem celular normal de epitélio de ralo (IEC-6). Estas células foram cultivadas de acordo com especificações da ATCC e mantidas em meio D EM em estufa de CO₂ 5% a 37°C até atingir a semiconfiuênda

(íi) Tratamentos Inicialmente foram testadas concentrações de perilato de sódio (1,0, 1.8, 2,6, 3,4, 4,2 e 5,0 mM) para determinai o IC» da droga Monoca adas de células semiconfluentes foram depletadas de soro por 24 horas antes do tratamento com (S)-NAP e durante o tratamento por 24h.

(<«) leste de viabilidade: As linhagens foram semeadas em placas de fundo chato com 96 poços com meto de cultura DMEM contendo as diferentes concentrações de (S)-NAP descritas acima. A incubação das células com (S)- NAP aconteceu por 24 h a 37 °C, após o qual as placas foram incubadas por 2 h com MTT [3-(4,5-dirmethylthiazol-2- l)-2,5dirmethylthiazolium bromíde] 2,5 mg/ml, na concentração final de 250 pg/ml. As placas foram centrrfugadas a 4°C, 1200 RPM por 5 min, vertidas para remover o sobrenadante, pois os cristais se depositam no interior das células. Os cristais de formazan foram dissolvidos em 100 μΙ de DMSO e homogeneizado manualmente e pelo aparelho. As absorbáncias foram determinadas em 538 nm em leitor de placas (Spectra Max 190). Controles 100% de viabilidade, sem adição da droga, e 0% de viabilidade, utilizando formaldeído, foram conduzidos simultaneamente com o experimento.

Resultados

[063] As células CaCo2 demonstraram ser refratárias ao tratamento e a célula mais agressiva, a HCT-116, foi a mais afetada. Por isso, HCT-116 foi usada para o prosseguimento dos testes e a CaCo2 como controle negativo. O efeito tumoricida de (S)- AP está apresentado nas Figuras 2 e 3 e na Tabela 1. Tabela 1 - Ensaios in vitro com (S)-NAP

^* Concentração limitada pela solubilidade do NAP acima deste valor.

Exemplo 6 - Efeito antiproliferativo usando (R)-AP, (S)-AP, (R)-NAP e (S)- NAP

[064] O Exemplo 6 foi conduzido para determinar a atividade biológica das seguintes amostras: álcool (S)-perílico, (S)-AP, (R)-AP, (S)-NAP e (R)-NAP sobre linhagens tumorais humanas. O álcool (S)-perílico foi testado em conjunto com as amostras de ácidos e de saís sódicos, pois se trata de uma substância considerada com alguma eficácia clínica estabelecida.

Ensaio de Proliferação

[065] As amostras (R)-AP, (S)-AP, (R)-NAP, (S)-NAP e álcool períiíco (POH) foram recebidas e solubilízadas em DMSO ou solução salina (NaCI 0,9%) e conservadas a -20 °C até o dia do experimento quando foram diluídas imediatamente antes do uso, em meio de cultivo celular DMEM, suplementado com 10% soro bovino fetal, 100 U/l penicilina e 0,1 mg/mt estreptomicina e 0,05 mg/ml gentamicina (meio DMEM completo). Os experimentos foram conduzidos conforme Procedimento Operacional Padrão do Laboratório de Farmacologia Molecular FARMO1003 versão 00, os quais de forma resumida são apresentados a seguir. [066] Células K562 (leucemia), LUCENA (leucemia multidroga- resistente), SKMEL28 (melanoma) e CF7 (tumor de mama), foram cultivadas em meio de cultura D EM completo, e mantidas em fase tog de crescimento. Vinte e quatro horas antes do tratamento com as amostras, 100 μl da suspensão celular (5x10⁴ células/ml) foram adicionados a poços de placas de 96 poços e mantidas em estufa com atmosfera 5% CO₂ a 37° C.

[067] O tratamento para cada das cinco amostras foi realizado em dose resposta (0,01 a 100 μΜ; 5 pontos), cada concentração em triplicata

[068] Decorridas 48 horas, foi adicionado o azul de ttazolii (MTT; SIGMA código 5655) e a placa mantida em estufa de CO₂ por 4 horas. Finalizado o tempo de incubação, o sobrenadante foi aspirado e os cristais de formazan, formados pela atividade celular, foram solubilizados com álcool ísopropílico e, após completa solu ilizaçao, foi realizada a determinação da densidade óptica em leitor de microplacas a 570nm (VictorXS; Perkin Élmer USA).

Resujjadps

[069] A partir da Figura 4 pode ser observado que o tratamento com a amostra R-NAP (perilato de sódio forma R) apresentou o melhor desempenho, com IC₅₀ de 1 ,24 μΜ. As outras amostras testadas não apresentaram inibição que tomasse necessário o cálculo da IC₅₀.

[070] A partir da Figura 5 pode ser observado que o tratamento com as cinco amostras (R)-AP, (S)-AP, (R)-NAP, (S)-NAP e (POH) nâo apresentaram inibição que tornasse necessário o cálculo da IC».

[071] A partir da Figura 6 foi observado que o tratamento com a amostra (R)-NAP (perilato de sódio forma R) apresentou melhor performance com IC₅₀ de 0,013 μ . As outras amostras testadas náo apresentaram inibição que tomasse necessário o cálculo da ICso, no intervalo de doses utilizado.

[072] A partir da Figura 7 foi observado que o tratamento com as amostras (S)- AP (perilato de sódio forma S) e (R)-NAP (perilato de sódio forma R) nao apresentaram inibição que tornasse necessário o cálculo da ICso, no intervalo de doses utilizado

[073] Dentre as amostras testadas a amostra (R)-NAP (perilato de sódio forma R) apresentou o melhor desempenho apresentando atividade sobre as linhagens K562 e LUCENA, apresentando IC50 de 1,240 e 0,013 μ , respectivamente, enquanto que as outras amostras testadas não apresentaram atividade relevante sobre nenhuma das linhagens testadas no intervalo de doses utilizado.

[074] Com base nos resultados anteriores, fica demonstrado que o sal sódico de ácido perilico, i.e., perilato de sód*o, é um produto com aplicação no tratamento do câncer, podendo, inclusive, ser empregado como adjuvante sinérgico dos tratamentos convencionais.

[075] A composição farmacêutica da presente invenção compreende o perilato de sódio obtido a partir do ácido perííico, este último produzido no processo de bioconversão de limoneno utilizando a levedura Yarrowiaiipolytica, como ingrediente único ou em combinação com um agente anti-câncer, dita composição formulada em um veículo tarmaceuticamente aceitável, adjuvante e/ou excip*ente adequados para uso em humanos, de acordo com técnicas convencionais para preparo de composições farmacêuticas.

[076] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados na presente composição compreendem veículos farmacêuticos convencionais, tais corno uma solução salina tamponada com fosfato, água, e emulsões, tais como emulsões de óleo água ou uma emulsão água óleo. As composições podem adicionalmente conter excipientes farmacêuticos sólidos tais como amido, celulose, talco, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de magnésio, estearato de sódio, glicerol monoestearato, cloreto de sódio, leite em pó desnatado e semelhantes.

[077] Os excipientes líquidos e semi-sólidos podem ser selectonados a partir de glicerol, propileno glicol, água, etanol e vários óleos, incluindo os de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo, dentre outros. Os suportes líquidos, particularmente para soluções in etáveis, incluem água, solução salina, dextrose aquosa, e glicóis. Para exemplos de veiculo farmaceuticamente aceitável, adjuvante e/ou excíptente adequados, ver Remington Pharmaceutical Sciences, editado por E.W. Martin (Mack Publíshing Company, 18^a ed,, 1, 90) As composições também podem incluir estabilizantes e conservantes

[078] Com relação ao termo "quantidade terapeuticamente eficaz" nas reivindicações, deve ser entendido que a quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade suficiente para tratar um distúrbio ou doença específica ou, em alternativa, para obter uma resposta farmacológica ao tratamento de uma desordem ou doença. Os métodos de determinação dos meios mais eficazes e dosagem de administração podem variar com a composição utilizada para terapia, o obietivo da terapia, a célula alvo a ser tratada, e o paciente a ser tratado. As dosagens de tratamento geralmente pode ser tituladas para otimizar a segurança e eficácia. As administrações única ou múltipla podem ser realizadas com o nível de dosagem e padrão se!eoonados pelo médic As formulações de dosagem apropriadas e métodos de administração dos agentes podem ser prontamente determinadas pelos peritos na arte. Por exemplo, a composição é administrada a cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg kg, ou cerca de 0,5 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, Quando os compostos aqui descritos são ^administrados com outro agente ou terapia, a quantidade eficaz pode ser menor do que quando o agente é utilizado isoladamente. Ou seja, a dita composição pode ser utilizada em combinação com outro composto que também atua como agente anti-cáncer.

[079] A composição farmacêutica da presente invenção compreender um composto derivado do ácido perílico em forma de sal, de acordo com a Fórmula II, em uma quantidade terapeuticamente eficaz e um veículo fanrnaceuticamente aceitável, adjuvante e/ou excipíente adequados para uso em humanos.

[080] De acordo com a presente invenção os compostos derivados do ácido periiico em forma de sal, de acordo com a Fórmula li onde onde o contra- fon ⁺ compreende metais alcalinos ou alcalinos terrosos, como Na⁺ (sódio), K⁺ (potássio). Ca⁺² (cálcio), etc. e, particularmente, o penlato de sódio (NAP), representado pela Fórmula IH são empregados na fabricação de um medicamento para uso no tratamento, prevenção ou inibição da formação de carcinomas. O composto de Fórmula II também pode ser usado no tratamento de doenças relacionadas a tumores náo sólidos tais como leucemia, mteloma múltiplo, maltgnidades hematológicas ou línfoma e a tumores sólidos e suas metástases tais como melenoma, câncer pulmonar de célula náo pequena, glioma, carcinoma hepatoceluíaf , glioblastoma, carcinoma da tireóide, tumores do duto biliar, ósseo, gástrico, cerebral/CNS, cabeça e pescoço, hepático, estomacal, prostático, mamário, renal, testicular, ovariano, pele, cervical, pulmonar, uterino, vulvar, endometrial, renal, colorretal, pancreático, membranas pleurais/pefítooeais, glândula salivar e epidermóíde.

[081] De acordo com a presente invenção os compostos derivados do ácido perílico em forma de sal, da fórmula (II), podem ser usados na fabricação de um medicamento para uso na produção de um efeito anti -câncer em um animal de sangue quente tal como o ser humano

[082] De acordo com a presente invenção a composição farmacêutica compreendendo os compostos derivados do ácido perílico em forma de sal, de acordo com a Fórmula H onde onde o contra-íon * compreende metais alcalinos ou alcalinos terrosos, como Ha^* (sódio), K⁺ (potássio), Ca*² (cálcio), etc, e, particularmente, o penlato de sódio (NAP), representado pela Fórmula Hl, é empregada na fabricação de um medicamento para uso no tratamento, prevenção ou inibição da formação de carcinomas. [083] A invenção também compreende métodos de tratamento de câncer por compreender o composto de fórmuía (II), particularmente o composto de fórmula (III) (perílato de sódio) como ingrediente único ou em combinação com um agente antí-cancer.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composto caracterizado por possuir a fórmula (II)

onde o cootra-íon ⁺ compreende metais alcalinos ou alcalinos terrosos.

2. Composto da acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o contra-íon ⁺ ser Na⁺ (sódio), K⁺ (potássio) ou Ca⁺²/2 (cálcio).

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por o composto compreender o periiato de sódio (MAP). de fórmula IH.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o composto ser obtido pela reaçáo do ácido peníico com metóxido de sódio ( eONa), onde o solvente é o metanol.

5. Composto de acordo com a reivindicação 4 caracterizado por o ácido perílico ser obtido por um processo de bioconversáo de limoneno utilizando a levedura Yarrowta tipotytica.

6. Processo para obtenção de um composto conforme definido nas reivindicações 1 a 5 caracterizado por o sal periiato ser obtido em apenas uma única etapa, de acordo com a rota 1 , onde ó adicionado ao ácido perílico adquirido comercialmente um composto de metóxído de metal alcalino, particularmente metóxído de sódio, solubilizado no álcool correspondente, particularmente o metanol.

7. Processo para obtenção de um composto de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a solução de metóxído de sódio em solução metanólica 10% a 30%) ser adicionada a uma solução metanol ica de ácido perílico (AP), sendo a adição efetuada de forma controlada, em concentrações adequadas, sob agitação e resfriamento com banho de gelo.

8. Processo para obtenção de um composto de acordo com a reivindicação 6 ou 7 caracterizado por o composto obtido compreender o perilato de sódio (NAP), de f rmula III

9. Processo para obtenção de um composto conforme definido nas reivindicações 1 a 5 onde dito composto ser obtido em quatro etapas, de acordo com a rota 2, estas consistindo de: etapa 1 que compreende o crescimento da cultura celular e a produção de biomassa suficiente e necessária para iniciar a bioconversáo; etapa 2 que trata da bioconversáo do limoneno utilizando uma levedura para produzir derivados oxigenados específicos, entre eles o álcool perílico e/ou o ácido perílico; a etapa 3 que consiste do isolamento do ácido perílico (AP), por precipitação no meio de cultura pela adição de ácidos minerais seguida de separação e purificação do solido; ou através da extraçâo por solvente Itpofílico imiscívei com água, ou por combinação de filtração com partição ácido-base após o isolamento do ácido períltco (AP) caracterizado por a etapa 4 compreender a obtenção do sal perilato, através da substituição do hidrogénio do ácido carboxílico por cátion proveniente de metais alcalinos ou alcalinos terrosos pela reaçâo de um metóxido de metal alcalino, particularmente metóxido de sódio, solubtlizado no álcool correspondente, particularmente o metanol.

10. Processo para obtenção de um composto de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por na etapa 4 uma solução de metóxido de sódio em solução metanólíca (10% a 30%) ser adicionada a uma solução metanólíca de ácido períltco (AP) e essa adição ser efetuada de forma controlada, em concentrações adequadas, sob agitação e resfriamento com banho de gelo.

11. Processo para obtenção de um composto de acordo com as reivindicaç es 9 ou 10 caracterizado por o composto obtido compreender o perílato de sódio (NAP), de fórmula III.

12. Composição farmacêutica caracterizado por compreender um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em uma quantidade terapeuticamente eficaz e um veículo farmaceutlcamente aceitávef, adjuvante e/ou excipèente adequados para uso em humanos.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12 caracterizado por a dita composição ser utilizada em combinação com outro composto que também atua como agente anti-cáncer.

14. Uso do composto da fórmula (II), como definido nas reivindicações 1 a 5 caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para uso na produção de um efeito antt-câncer em um animal de sangue quente tal como o ser humano.

15. Uso do composto, como definido nas reivindicações 1 a 5 caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de doenças relacionadas a tumores náo sólidos tais como leucemia, mieloma múltiplo, malignidades hematológicas ou Itnfoma e a tumores sólidos e suas metástases tais como rneianorna, câncer pulmonar de célula não pequena, glioma, carcinoma hepatocelular, gliobfastoma, carcinoma da tireóide, tumores do duto biliar, ósseo, gástrico, cerebral CNS, cabeça e pescoço, hepático, estomacal, prostático, mamário, renal, testiaiar, ovariano, pele, cervical, pulmonar, uterino, vulvar, endometrial, renal, co forreta!, pancreático, membranas pleurais/peritoneais, glândula salivar e epidermóide.

16. Uso do composto, como definido nas reivindicações 1 a 5 caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para uso no tratamento, prevenção ou inibição da formação de carcinomas.

17 Método de tratamento de câncer caracterizado por empregar o composto conforme definido nas reivindicações de 1 a 5 como ingrediente único ou em combinação com outro agente anti-câncer distinto.