WO2016009971A1

WO2016009971A1 - 抗ホスホリパーゼａ２レセプター抗体の簡易測定

Info

Publication number: WO2016009971A1
Application number: PCT/JP2015/069961
Authority: WO
Inventors: 秋山　真一
Original assignee: Nagoya University NUC
Current assignee: Nagoya University NUC
Priority date: 2014-07-14
Filing date: 2015-07-10
Publication date: 2016-01-21
Anticipated expiration: 2017-01-14

Abstract

　抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体の新規測定手段を提供することを課題とする。トレハロース溶液で処理することによって抗原性を維持したホスホリパーゼＡ２レセプターを抗原として、検体中の抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体を検出する。

Description

抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体の簡易測定

　本発明は抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体の測定技術に関する。本出願は、２０１４年７月１４日に出願された日本国特許出願第２０１４－１４４５８３号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。

　ホスホリパーゼＡ２レセプター（Phospholipase A2 receptor: PLA2R）は、ヒト糸球体の足細胞に発現する分子量約180kDaのI型膜貫通タンパク質である。血中の抗PLA2R抗体は、ネフローゼ症候群の主たる原因疾患である特発性膜性腎症の唯一の病態鑑別用および病勢予測用バイオマーカーとして有望視されている（非特許文献１）。抗PLA2R抗体が発見されるまで特発性膜性腎症は除外診断によって確定されていた。即ち、膜性腎症には惹起因子が既知の二次性膜性腎症と惹起因子が不明な特発性膜性腎症があり、腎生検にて膜性腎症の腎病理像を得た患者が二次性膜性腎症の惹起因子（例えば、抗リウマチ薬服用、自己免疫疾患、腫瘍など）を持っていれば二次性膜性腎症と診断し、持っていなければ特発性膜性腎症と診断していた。抗PLA2R抗体が特発性膜性腎症の鑑別バイオマーカーとして利用できることが発見されたことで、患者の血中に抗PLA2R抗体があれば（場合によっては腎生検をせずに）特発性膜性腎症であると診断できるだけでなく、二次性膜性腎症と特発性膜性腎症とでは治療方法が全く異なるため、ネフローゼ症候群患者の病態鑑別作業において抗PLA2R抗体の測定、特に抗PLA2R抗体の有無確認（定性検査）、は非常に重要である。

　通常、抗PLA2R抗体の測定においては、抗原として提示したPLA2Rタンパク質に対し、一次抗体として患者血清検体を、二次抗体として化学標識済抗ヒトIgG抗体を順次反応させ、検体中に含まれる抗PLA2R抗体を検出する。抗PLA2R抗体は抗原であるPLA2Rの立体エピトープを認識しているため、その測定に際しては抗原となるPLA2Rタンパク質の立体構造を天然型（ネイティブフォーム）に保つ必要がある。PLA2Rの立体構造が崩れると抗PLA2R抗体はPLA2Rに結合できなくなることが解っているが（非特許文献１）、結晶構造解析などの詳細な研究は未だ無い。

　これまでに開発された抗PLA2R抗体測定法としてウエスタンブロット法、間接蛍光抗体法及びELISAが確立されている。間接蛍光抗体法とELISAについては、専用のキット（Euroimmun社）が市販されている。

　ウエスタンブロット法では、PLA2Rを含むヒト糸球体ライセート又は組換え（リコンビナント）PLA2Rをポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、PVDF膜に転写して膜表面に固相化したPLA2Rタンパク質を抗原として用いる（非特許文献１）。ウエスタンブロット法はコスト的に有利なことに加え、最も高感度の測定が可能であり、しかも定性性にも優れているものの、操作が煩雑であり、PVDF膜の保存ができないため効率的運用も難しい。また、既報のウエスタンブロット法では（非特許文献１）、アッセイ工程の最終段階であるシグナル取得工程において、二次抗体に標識したHRPを利用した化学ルミネスセンスを行うために高額なイメージャー（GE製LAS4000など）や煩雑な暗室操作が必要である。

　間接蛍光抗体法では、組換えPLA2Rが細胞膜上に発現するように調製した遺伝子組換え哺乳類細胞（例えばHEK293細胞）を96ウェルマイクロプレート又はチャンバー付スライドガラスなどに接着培養させた後、当該細胞ごとホルマリン固定することで細胞表層に固相化提示させたリコンビナントPLA2Rを抗原として用いる（非特許文献２）。間接蛍光抗体法も低コストで実施することができ、しかもウエスタンブロット法に比べると手技的に簡便である。その反面、ウエスタンブロット方に比べて定性性が著しく劣り、測定感度もそれほど良くない。その上、アッセイ工程の最終段階である検鏡において高価な蛍光顕微鏡が必要である。

　ELISAでは、96ウェルELISAプレートに固相化した高純度に精製したリコンビナントPLA2Rを抗原として用いる（Euroimmun社ウェブサイトhttp://www.euroimmun.com/index.php?id=aak_gegen_pla2r&L=1を参照）。ELISAは手技が簡便で定量性に優れている特徴を持つ反面、高純度組換えPLA2Rを必要とするためアッセイコストが著しく高額である。また、ウエスタンブロット法に比べて定性性及び測定感度に劣り、シグナル取得工程において高額なプレートリーダーが必要となる。

Beck L.H., Bonegio R.G.B., Lambeau G., et al. N Engl J Med 2009; 361:11-21. E. Hoxha et al. Nephrol. Dial. Transplant, 26: 2526-2532, 2011

　通常、患者血清は最適な濃度にまで希釈されるが、検体中のPLA2R濃度が低い場合には、測定に際して血清検体の希釈率を低くすることで抗PLA2R抗体濃度を測定可能なレンジまで高くして測定する必要がある。しかし、血清検体の希釈率を低くすると血清中の抗PLA2R抗体以外の抗体やタンパク質濃度も高くなる結果、非特異的なシグナルが増幅してくる。ウエスタンブロット法ではPLA2Rのバンド位置に抗PLA2R抗体のシグナルが得られるので、非特異的なシグナルの増幅が起こっても抗PLA2R抗体シグナルを選択的に測定することは可能であるが、間接蛍光抗体法とELISAでは測定原理的に非特異的なシグナルと抗PLA2R抗体シグナルを分けて測定することができない。そのため、元々の抗PLA2R抗体濃度が低い血清検体を測定したい場合に、非特異的シグナルが生じるような低希釈率条件下で抗PLA2R抗体を測定することができない。特発性膜性腎症の鑑別診断では血中濃度が低くても抗PLA2R抗体の有無が診断指標として非常に重要であるため、間接蛍光抗体法やELISAが低希釈率検体の定性検査に不向きなことは致命的な問題でもある。

　一方、特発性膜性腎症などの患者がもつ抗PLA2R自己抗体はPLA2Rの立体エピトープを認識していることから、PLA2Rタンパク質を転写した後のPVDF膜を保存すると保存中にPLA2Rの立体構造が崩れ、立体構造の変化依存的に抗原性が低下ないし喪失することが経験的に知られている。タンパク質保護剤として汎用されるグリセロールなどを共存させた液中に保存しても、PLA2Rの抗原性を保持したまま1週間以上保存することはできない。

　また、間接蛍光抗体法とELISAではアッセイを遂行するためには高額な機器と電源が必要である。既報のウエスタンブロット法（非特許文献１）においても同様の問題が存在する。

　そこで本発明は、操作が簡便であり、且つ低コストでの運用が可能な、抗PLA2R抗体の測定手段を提供することを課題とする。

　上記課題を解決すべく検討を進める中で本発明者は、ウエスタンブロット法の有用性、特に抗PLA2R抗体の測定において重要な定性性に着目し、ウエスタンブロット法における問題点、即ち、PLA2Rを転写した膜（典型的にはPVDF膜）の保存性が悪く、転写後数日でPLA2Rの立体構造が崩れて抗原性が無くなることを改善ないし克服することを目指した。具体的には、PLA2Rの立体構造を保ち抗原性を維持できる保存法を見出すべく、鋭意検討した。その結果、トレハロースによる処理がPLA2Rの立体構造の保護に極めて有効であることが明らかとなり、PLA2Rを転写（固相化）した膜をPLA2Rの抗原性を維持しつつ長期間保存することが可能になった。驚くべきことに、トレハロース含有の保存バッファーに浸漬した膜では、乾燥させても保存性が低下せず（即ち、大幅に保存期間が延長する）、しかも、室温での長期保存も可能であった。以上の知見によれば、PLA2Rを転写した膜を測定の都度、用意することが不要となり、大幅な操作の簡便化がもたらされるととともに、効率的な運用が可能となる。また、PLA2Rを転写（固相化）した膜を乾燥状態で保存できることは膜の加工性を格段に高めることから、例えば、PLA2Rが転写された乾燥後の膜を短冊上に裁断し、短冊の一枚一枚をスライドガラスなどの担体に接着固定すれば、操作性に優れ、長期保存も可能な抗PLA2R抗体簡易測定器具を実現できる。一方、トレハロース処理によってPLA2Rの抗原性の増強効果も得られるため、ウエスタンブロット法の最終工程であるシグナルの測定の際、超高感度な化学ルミネスセンス法を用いる必要がなくなり、発色基質（例えばTMB）を用いた発色法を適用可能となる（目視によるシグナルの測定が可能になる）。このことは、測定に特別な機器や電源が不要となることを意味し、非常に安価なコストでの測定を実現する。
　以下の発明は、主として上記の成果及び考察に基づく。
　［１］ホスホリパーゼＡ２レセプターをトレハロース溶液で処理する工程を含む、
　抗原性を維持したホスホリパーゼＡ２レセプターの調製法。
　［２］トレハロース溶液のトレハロース濃度が2％(w/v)～40％(w/v)である、［１］に記載の調製法。
　［３］トレハロース溶液のトレハロース濃度が2％(w/v)～40％(w/v)である、［１］に記載の調製法。
　［４］トレハロース溶液のトレハロース濃度が5％(w/v)～20％(w/v)である、［１］に記載の調製法。
　［５］前記工程の後、乾燥処理を行う、［１］～［４］のいずれか一項に記載の調製法。
　［６］乾燥処理が風乾又は凍結乾燥である、［５］に記載の調製法。
　［７］ホスホリパーゼＡ２レセプターが組換えタンパク質である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の調製法。
　［８］ホスホリパーゼＡ２レセプターが、PVDF又はニトロセルロース製の膜に固相化された状態である、［１］～［７］のいずれか一項に記載の調製法。
　［９］［８］に記載の調製法で得られる、ホスホリパーゼＡ２レセプターが固相化された膜。
　［１０］４℃～２８℃で保存される、［９］に記載の膜。
　［１１］［９］又は［１０］に記載の膜を含む、抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体測定器具。
　［１２］前記膜が不溶性支持体に固定化されている、［１１］に記載の測定器具。
　［１３］［１１］又は［１２］に記載の測定器具を含む、抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体測定キット。
　［１４］抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体を含むコントロール試薬、及び／又は抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体を含まないコントロール試薬を更に含む、［１３］に記載の測定キット。
　［１５］［１１］又は［１２］に記載の測定器具、或いは［１３］又は［１４］に記載の測定キットを用い、前記膜に固相化されたホスホリパーゼＡ２レセプターとの間の抗原抗体反応により、検体中の抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体を検出することを特徴とする、抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体の測定法。
　［１６］以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、［１５］に記載の測定法：
　（１）検体と前記膜とを接触させるステップ；及び
　（２）生成する抗原抗体複合体を検出するステップ。

PVDF膜の処理及び保存の条件ごとにリコンビナントPLA2Rの抗原性持続期間を比較した表。評価基準：＋＋＋明瞭なバンド、＋＋十分に認識可能なバンド、＋薄いバンド、－バンド無し。抗PLA2R抗体簡易測定器具の作製方法の例。抗PLA2R抗体簡易測定器具の使用方法の例。抗PLA2R抗体の測定結果。患者血清#3及び#4では、抗PLA2R抗体の存在を示す明瞭な二つのバンド（上：糖鎖付PLA2Rの位置、下：糖鎖無PLA2Rの位置）を認める。抗PLA2R抗体の測定結果。二次抗体をIgGサブクラス特異的な抗体へ変更し、サブクラス毎に患者血清中の抗PLA2R抗体を検出した。 ELISAプレートに固相化したPLA2Rの抗原性保護効果。 PVDF膜の処理及び保存の条件ごとにリコンビナントPLA2Rの抗原性持続期間を比較した表。評価基準：＋＋＋明瞭なバンド、＋＋十分に認識可能なバンド、＋薄いバンド、－バンド無し。

１．抗原性を維持したホスホリパーゼＡ２レセプター（PLA2R）の調製法
　本発明の第１の局面は、ホスホリパーゼＡ２レセプター（PLA2R）の抗原性を維持しつつ保存性を高める手段としてトレハロース溶液による処理が有効であるとの知見に基づき、PLA2Rをトレハロース溶液で処理する工程（以下、「トレハロース処理工程」と呼ぶ）を含む、抗原性を維持したPLA2Rの調製法を提供する。

　PLA2Rは、ヒト糸球体の足細胞（ポドサイト）表面に発現している1回膜貫通型のI型膜貫通タンパク質である。N末端からシステインリッチドメイン、フィブロネクチンドメイン、8個のC型レクチンドメイン、膜貫通ドメインで構成されており、内部に2箇所のN型糖鎖修飾と17箇所のジスルフィド結合をもつ。PLA2Rのアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_031392.3, DEFINITION secretory phospholipase A2 receptor isoform 1 precursor [Homo sapiens]）を配列番号１に示す。

　抗PLA2R抗体はPLA2Rのジスルフィド結合に支持された立体エピトープを認識していることが明らかになっており（非特許文献１）、抗PLA2R抗体を測定するためには、天然型立体構造（ネイティブフォーム）を維持したPLA2Rを抗原として用いる必要がある。尚、PLA2Rのアミノ酸配列（配列番号１）の内、２１番アミノ酸～６３３番アミノ酸が抗原性に重要であることが報告されている。

　本発明によれば、トレハロース溶液での処理によって、保存に伴う立体構造の崩壊を防止でき、長期間に亘ってPLA2Rの抗原性を維持させることができる。即ち、保存性に優れた、抗PLA2R抗体測定用の抗原を提供できることになる。尚、PLA2Rが抗原性を維持していか否かは、特発性膜性腎炎患者由来の抗PLA2R抗体を一次抗体に使用したウエスタンブロット法等によって確認することができる。

　トレハロース処理工程に供するPLA2Rとして、組換え（リコンビナント）PLA2R又はヒト糸球体ライセートから分離・精製したPLA2Rを用いることができる。組換えPLA2Rは、cDNA（一例を配列番号２に示す。この配列には、hPLA2R1をコードする配列にMycTag配列、HisTag配列及び終止コドンが連結されている。）を利用して、例えば、哺乳動物細胞（HEK293細胞等）を宿主にした生産方法で得ることができる。

　トレハロース処理工程では所定濃度のトレハロース溶液を使用する。トレハロース溶液中のトレハロース濃度は、好ましくは2％(w/v)～40％(w/v)、更に好ましくは2～20%、より一層好ましくは5～20%である。トレハロース濃度が低すぎれば、所望の効果（即ち、PLA2Rの立体構造の崩壊を防止すること）が十分に得られず、トレハロース濃度が高すぎればトレハロースが残存することによる測定への影響、コストの増大等が問題となる。トレハロース（物質名、一般名）はα-D-Glucopyranosyl (1,1)-α-D-Glucopyranosideで表される化合物である。トレハロースは株式会社林原等によって提供されている。

　トレハロース溶液は、トレハロースを生理的緩衝液（例えばPBS）や生理食塩水、蒸留水等に溶解することによって調製することができる。トレハロース溶液に界面活性剤（例えば0.2% Tween）、抗生物質、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）等を添加してもよい。

　トレハロース処理工程ではPLA2Rをトレハロース溶液に接触させる。本発明の一態様では、ウエスタンブロットやドットブロットなどに適した膜、即ち、PVDF又はニトロセルロース製の膜に固相化された状態のPLA2Rが用いられる。このようなPLA2Rは、PLA2Rを含むサンプルの電気泳動による分離、及びそれに続く膜への転写（ウエスタンブロッティング）によって調製することができる。或いは、PLA2Rを膜（例えば、PVDF製膜、ニトロセルロース製膜）に滴下し、浸潤させることによって調製することができる。この場合には純度の高いPLA2Rを用いることが好ましい。

　PLA2Rを固相化したPVDF膜など各種担体については、以後の免疫反応における非特異的な抗原抗体結合を防止するためにブロッキング処理を行うことが好ましい。ブロッキングは例えば次のように行う。即ち、PLA2Rを固相化した担体をブロッキング剤（例えば、ナカライ社製Blocking One solution、5%スキムミルク水溶液、等）に室温または4℃で所定時間（例えば、30分から16時間）浸漬してブロッキング処理を行う。尚、トレハロース処理はブロッキング処理の前でも後でもよい。

　事前に標識したPLA2Rを使用することにしてよい。この態様によれば、例えば、イムノクロマトグラフィーに適するPLA2R固相化膜を得ることができる（詳細は後述する）。標識物質には呈色物質、酵素、放射線同位体などが用いられる。中でも、測定結果を肉眼で観察でき、迅速且つ簡便な判定が可能となることから、呈色物質を採用することが好ましい。呈色物質の例は金属コロイド（金コロイド、白金コロイド等）、顔料などで着色した合成ラテックス、天然ラテックスである。

　トレハロース処理工程における処理時間は例えば1秒間～14日間、好ましくは1秒間～1分間である。また、処理時の温度条件は例えば、4℃～40℃、好ましくは20℃～25℃である。最適な処理条件は予備実験を通して設定すればよい。尚、PLA2R固相化膜を使用する場合、典型的には、当該膜をトレハロース溶液に浸漬することによって、PLA2Rとトレハロース溶液との接触が行われる。

　トレハロース処理工程の後、乾燥処理を行うことにしてもよい。この処理によって保存性の向上が望める。また、取り扱いも容易となる。乾燥処理として、風乾、真空乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥など、一般的な乾燥処理方法を採用できる。凍結乾燥処理では一般に、沸点が約-20℃（107 Pa、0.8 Torr）～約-50℃（4 Pa、0.03 Torr）となるような低い気圧環境（真空）において、凍結固化状態の試料（例えば約-40℃で凍結させたもの）から昇華によって水分が除去される。凍結乾燥処理によれば内部からも均一に脱水でき、また高い乾燥度が実現されることから本来の機能及び形態を高度に保持したままで乾燥させることができる。また、凍結乾燥処理は、1．処理中の劣化が少ない、２．無菌化が容易にできる、３．復元性に優れた乾燥体が得られる、４．保存性に優れた乾燥体が得られる、などの特徴を有する。凍結乾燥処理は、真空室、冷却・加熱装置、排気装置（コールドトラップ及び真空ポンプ）を備えた凍結乾燥機によって行うことができる。数多くの凍結乾燥装置が市販されており、これらの中から任意に選択したものを用いて乾燥処理を実施することができる。尚、処理条件は、使用する装置に添付の使用説明書に基づいて設定することができる。その際には乾燥処理に供する試料の大きさ、乾燥度などを考慮することができる。

　膜に固相化したPLA2Rを用いて本発明の調製法を実施する場合には、トレハロース処理工程の前又は後に当該膜を成形（例えば短冊状等、所定の形状に裁断）することにしてもよい。トレハロース処理工程の後に上記の乾燥処理を行う場合においては、このような成形はトレハロース処理工程の前、トレハロース処理工程と乾燥処理の間、乾燥処理工程の後のいずれかに行うことができる。

　膜に固相化したPLA2Rは抗原性を維持した状態で長期間の保存が可能である。例えば4℃～28℃の条件で保存される。抗原性の低下を防ぐためには低温（例えば4℃～25℃、好ましくは4℃～15℃）で保存することが好ましい。

２．抗PLA2R抗体の測定法
　上記調製法によれば、抗原性を維持したPLA2Rが得られる。当該PLA2Rは抗PLA2R抗体の測定に適した抗原となる。膜に固相化されたPLA2Rを用いた場合には、保存性が向上したPLA2Rが固相化された膜（PLA2R固相化膜）が得られる。当該膜はウエスタンブロット法やドットブロット法を利用した抗PLA2R抗体の測定に適する。一方、標識したPLA2Rを用いて上記調製法を実施した場合に得られる標識PLA2R固相化膜は、イムノクロマトグラフィーを利用した抗PLA2R抗体の測定に適する。このように、上記調製法によれば、抗PLA2R抗体の測定に適した「PLA2R固相化膜」が得られる。そこで本発明は別の局面として、上記調製法で得られる膜（以下、「PLA2R固相化膜」と呼ぶ）を用いた測定法を提供する。上記調製法で得られた膜を平板ないし棒状の不溶性支持体（ポリスチレン樹脂、ポリカーボネート樹脂、シリコン樹脂、ナイロン樹脂等の樹脂や、ガラス等の物質。具体例としてスライドガラスを利用することができる）に固定したもの（抗PLA2R抗体測定器具の一態様）を用いて本発明の測定法を実施することにしてもよい。

　本発明の測定法では、PLA2Rと抗PLA2R抗体との間の抗原抗体反応を利用する。採用する測定原理によって具体的な操作手順は異なるが、本発明の測定法では大別して以下の２つのステップ（１）及び（２）が実施される。
　（１）検体と、PLA2R固相化膜とを接触させるステップ
　（２）生成する抗原抗体複合体を検出するステップ

　ステップ（１）における検体には血液検体（血清、血漿等）が使用される。検体の由来、即ち被検者は特に限定されない。しかしながら、本発明の測定法により得られる情報（測定結果）は特発性膜性腎症の判定・診断に有用であることから、好ましい一態様では、特発性膜性腎症の判定・診断が必要な者が被検者となる。典型的な被検者は、ネフローゼ症候群の患者、特発性膜性腎症の既往歴を有する者である。これらの者についての測定結果は、より適切な治療方針の決定に役立ち、治療効果の向上、患者のＱＯＬ（Quality of Life、生活の質）の向上を促す。一方、健常者を被検者にしてもよく、この場合の測定結果は、特発性膜性腎症の早期発見や予防に役立つ。尚、ここでの「健常者」とは、本発明の測定方法を適用する時点において、特発性膜性腎症に罹患しているとの判断が行われていない者のことをいう。尚、検体は必要に応じて前処理に供される。前処理として例えば検体の希釈、フィルターろ過や遠心による夾雑物の除去などを行うことができる。

　検体とPLA2R固相化膜との接触は、検体をPLA2R固相化膜へ滴下又は展開させることや、検体中にPLA2R膜を浸漬すること等によって行われる。接触の具体的な態様や接触の条件などは、採用する測定原理に応じて適宜設定できる。

　ステップ（２）では、ステップ（１）によって生成する抗原抗体複合体を検出する。検出操作は、採用する測定原理に依存する。例えば、酵素免疫測定法（EIA法）の原理を利用する場合には、酵素の基質の発色を指標として抗原抗体複合体を検出することになる。

　本発明の測定法では、抗原抗体反応を利用した様々な検出手段を採用することができる。例えば、酵素免疫測定法（EIA法）、イムノクロマトグラフィー、蛍光免疫測定法（FIA法）、放射免疫測定法（RIA法）等を採用することができる。特に簡便性の点から、EIA法及びイムノクロマトグラフィーが好ましい。EIA法では、酵素標識した二次抗体（通常は抗ヒトIgG抗体）を用い、酵素反応に基づく基質の発色又は発光をシグナルとして免疫複合体を検出する。標識に使用する酵素の例はペルオキシダーゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリフォスファターゼ、グルコース-6-リン酸脱水素酵素である。また、基質の例は3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）、ジアミノベンジジン（DAB）、3-アミノ-9-エチルカルバゾール（AEC）、ルミノールである。

　イムノクロマトグラフィーは簡便性の点で特に優れた手法といえる。イムノクロマトグラフィーを利用した測定には通常、テストストリップが用いられる。典型的なテストストリップの構成では支持体の一端上に標識化PLA2R（抗原）が含浸した抗原含浸部材を挟んで検体添加部（サンプルパッド）が形成され、他端上には検体吸収部材（吸収パッド）が形成される。検体添加部と検体吸収部の間には、捕捉用抗体（抗ヒトIgG抗体）を固相化した判定部（テストライン）が設けられる。判定部の先には、抗原の展開を確認するためのコントロールライン（抗原を認識する抗体が固相化されている）を設けるのが一般的である。以上の構成のテストストリップを用いた場合、検体を検体添加部に添加すると、抗原含浸部材内で抗原との接触が生ずる。検体内に検出対象（即ち抗PLA2R抗体）が存在していると、検出対象と抗原の複合体が形成される。当該複合体は毛細管現象により展開し、判定部において捕捉用抗体に捕捉される。その結果、抗原の標識に呈色物質を用いておれば判定部が発色する。一方、検体中の検出対象の有無にかかわらず、毛細管現象で移動した抗原はコントロールライン上で捕捉され、その結果、コントロールラインが発色する。検体中に検出対象が存在しない場合には、コントロールラインのみが発色することになる。このように判定部とコントロールラインの発色を調べることによって、検体中の検出対象の有無を判定できる。

　本発明の測定法の具体例（ウエスタンブロットで作製したPLA2R固相化膜を使用した酵素免疫測定法）について図３を参照しつつ説明する。まず、PLA2R固相化膜を平板状の不溶性支持体（例えばスライドガラス）に固定した測定器具を用意する。所定の希釈率（例えば×1～×1/1000）の検体（患者血清）を所定量（例えば5～100μl）PLA2R固相化膜に滴下する。37℃で所定時間（例えば5分～2時間）静置した後、洗浄する。洗浄液には例えば所定濃度の界面活性剤（例えば0.2%Tween）含有のPBSを使用する。続いて、HRP標識抗ヒトIgG抗体をPLA2R固相化膜に滴下し、37℃で所定時間（例えば5分～8時間）静置する。洗浄後、HRPの基質（例えばTMB）をPLA2R固相化膜に滴下し、室温で静置する（例えば5分～30分）。最後に発色の有無を確認する。検体中に抗PLA2R抗体が存在する場合には抗PLA2R抗体シグナルが認められる（図４を参照）。TMBを使用した場合、目視で確認することが可能である。尚、図４に示した測定結果では、糖鎖の除去も、糖鎖の有無に基づく分離も行わずに調製した組換えPLA2Rを使用しているため、二つのシグナル（上が糖鎖付PLA2Rに対応するもの、下が糖鎖無PLA２Rに対応するもの）が観察されている。

３．抗PLA2R抗体測定器具及びキット
　本発明の更なる局面として、上記調製法で得られたPLA2R固相化膜を用いた抗PLA2R抗体測定器具及びキットが提供される。本発明の器具は、その構成要素としてPLA2R固相化膜を含む。一態様では、取り扱いが容易になるように、PLA2R固相化膜は不溶性支持体に固定されている。別の一態様は、PLA2R固相化膜を利用したテストストリップである。テストストリップの構成は上記の通りである。

　本発明の測定器具は、その主要成分であるPLA2Rの抗原性を維持した状態で長期間の保存が可能である。但し、抗原性の低下を防ぐためには低温（例えば4℃～25℃、好ましくは4℃～15℃）で保存することが好ましい。しかし、室温でも長期間（典型的には５ヶ月間以上）の保存が可能である。

　本発明のキットは主要構成要素として本発明の測定器具を含む。測定法を実施する際に使用する試薬（酵素の基質、発色試薬、緩衝液など）やその他の器具や装置（容器、反応装置など）をキットに含めてもよい。キットを用いることにより、より簡便な測定が可能となる。好ましくは、抗PLA2R抗体を含むコントロール試薬（ポジティブコントロール）をキットに含める。また、抗PLA2R抗体を含まないコントロール試薬（ネガティブコントロール）をキットに含めるとよい。コントロール試薬の使用により、より信頼性の高い測定結果を得ることが可能になる。尚、通常、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。

　従来の抗PLA2R抗体測定法の課題を克服すべく検討を行うことにした。具体的には、ウエスタンブロット法の有用性（特に抗PLA2R抗体の測定において重要な定性性）に着目し、ウエスタンブロット法における問題点（PLA2Rを転写した膜の保存性が悪く、転写後数日でPLA2Rの立体構造が崩れて抗原性が無くなること）を改善ないし克服することを目指し、以下の検討を行った。

１．PLA2Rの立体構造を保ち抗原性を維持できる保存法についての検討１
　一般的なタンパク質の場合、転写後の膜を乾燥させたり、凍結保存することによって長期の保存が可能である。しかしながら、これらの方法ではPLA2Rの抗原性を維持したまま長期間保存することはできなかった。タンパク質保護効果のあるグリセロールを保存バッファー（0.2%Tween含有のリン酸緩衝液）に添加して冷蔵保存を試みたが、PLA2Rの抗原性を維持する期間の延長は認められなかった。そこで、ある種の糖質にはタンパク質の立体構造を保護する効果があることに注目し、保存バッファーに各種濃度のトレハロースを添加して冷蔵保存を試みることにした。

（１）方法
　まず、組換えPLA2Rを調製した。調製法を簡潔に説明すると、HEK293細胞にPLA2R cDNAを導入してPLA2Rタンパク質を発現させ、HEK293細胞ライセートからPLA2Rタンパク質を調製した。すなわち、pcDNAベクター（Lifetechnologies社）をバックボーンとする哺乳類細胞用遺伝子発現プラスミドベクター内に、CMVプロモーター、human PLA2RのcDNAおよびタンパク質精製用タグのcDNAを順に連結して挿入し、human PLA2R発現用プラスミドベクターを構築した。タンパク質精製用のタグとしてヒスチジンタグを用い、組換えPla2rタンパク質はヒスチジンタグとの融合タンパク質として発現する。このベクターをトランスフェクション試薬（Promega社）を用いてHEK293細胞に遺伝子導入して形質転換し、G418 sulfate（SIGMA aldrich社）、10% ウシ胎仔血清（Biowest社）、ペニシリンストレプトマイシン混合液（SIGMA aldrich社）を含むDMEM（SIGMA aldrich社）を用いて継代培養して、組換えPLA2Rを恒常的に発現するHEK293細胞を取得した。この遺伝子組換えHEK293細胞は凍結保存しておいて、組換えPLA2Rが必要な時に適宜融解して上記培地からG418 sulfateを除いた培地を用いて培養・増殖することができる。培養後の本遺伝子組換えHEK293細胞をシャーレから剥離後、リン酸緩衝液（SIGMA aldrich社）にて洗浄後、RIPA buffer（和光純薬社）で溶解しライセート液を調製した。ウエスタンブロット法で抗PLA2R抗体を検出する用途では、このライセート液を抗原として利用することができる。高純度な組換えPLA2Rタンパク質が必要な場合は、このライセート液中から組換えPLA2Rタンパク質を精製するために、ヒスチジンタグとNiレジンによる親和性を利用したアフィニティカラム精製を実施して、高純度な組換えPLA2Rとヒスチジンタグの融合タンパク質を調製した。次に、調製した組換えPLA2Rをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、PVDF膜（Lifetechnologies社）へ転写した。転写後のPDVF膜をブロッキング剤（ナカライ社製Blocing One Solution）原液に浸漬して37℃で30分間ブロッキング処理した後、以下に示す所定の条件で処理及び保存した。
　条件１：0.2%Tween20/PBS中4℃保存
　条件２：風乾して4℃保存
　条件３：4%パラフォルムアルデヒド固定後、0.2%Tween20/PBS中4℃保存
　条件４：25%グリセロール/0.2%Tween20/PBS中で4℃保存
　条件５：50%グリセロール/0.2%Tween20/PBS中で4℃保存
　条件６：10%トレハロース/0.2%Tween20/PBS中で4℃保存
　条件７：10%トレハロース/0.2%Tween20/PBSに浸漬後、風乾して室温保存

　処理・保存後の膜を使用し、ウエスタンブロット法で抗PLA2R抗体の測定を試みた。一次抗体には、抗PLA2R抗体を含む特発性膜性腎症患者血清、二次抗体にはHRP標識抗ヒトIgG-Fcマウス抗体（Abcam社）、HRP基質にはTMB（3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine、アプロサイエンス社）を使用した。

（２）結果（図１）
　トレハロース処理によって保存性が格段に向上した。トレハロース処理した場合には、乾燥処理によって抗原性は失われず、保存中も抗原性を維持した。尚、PVDF膜の処理に使用するトレハロース溶液の濃度を変更して同様の実験を行った結果、トレハロース濃度2%(w/v)～20%(w/v)の溶液で同等の効果が認められた。

（３）考察
　トレハロース処理がPLA2Rの立体構造の保護に極めて有効であることが明らかとなり、PLA2Rを転写（固相化）した膜をPLA2Rの抗原性を維持しつつ長期間保存することが可能になった。驚くべきことに、トレハロース含有の保存バッファーに浸漬した膜では、乾燥させても保存性が低下せず（即ち、大幅に保存期間が延長する）、しかも、室温での長期保存も可能であった。以上の知見は、PLA2Rを転写した膜を測定の都度、用意することを不要とし、大幅な操作の簡便化をもたらすととともに、効率的な運用を可能にする。また、PLA2Rを転写（固相化）した膜を乾燥状態で保存できることは膜の加工性を格段に高めることから、図２に示すように、PLA2Rが転写された乾燥後の膜を短冊上に裁断し、短冊の一枚一枚をスライドガラスなどの担体に接着固定すれば、長期保存が可能な抗PLA2R抗体簡易測定器具を実現できる。尚、図２は、抗PLA2R抗体簡易測定器具の作製方法の一例を示すものであり、以下の手順からなる。
　(i) リコンビナントPLA2Rをポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離
　(ii) PVDF膜へ転写
　(iii) 転写後のPVDF膜をトレハロース液に浸漬
　(iv) PVDF膜を風乾
　(v) PVDF膜を短冊状に裁断
　(vi) PVDF膜の短冊を担体に接着剤で固定
　(vii) 4℃の乾燥条件下で保存

２．抗PLA2R抗体簡易測定器具を用いた測定
　図２の方法で作製した抗PLA2R抗体簡易測定器具を用いた測定法の一例を図３に示す。この測定法では以下の操作を行う。
　(i) 抗PLA2R抗体簡易測定器具を用意し、患者血清（10μl）を滴下
　(ii) 37℃で60分静置
　(iii) 洗浄（1分）
　(iv) 二次抗体希釈液を添加し、37℃で45分静置
　(v) 洗浄（1分）
　(vi) HRPの基質（例えばTMB）を添加し、発色するまで室温で静置
　(vii) 結果を目視で確認

　以上の測定法によって臨床検体（ネフローゼ症候群患者血清#1～#4）中の抗PAL2R抗体を測定した。血清の希釈率は1/10とした。また、陰性対照（ネガティブ・コンロール）として健常人血清を使用し、陽性対象として（ポジティブ・コントロール）として抗PLA2R IgGを含むことが判っている特発性膜性腎症患者の血清を使用した。測定結果を図４に示す。患者血清#3及び#4では、抗PLA2R抗体の存在を示す明瞭な二つのバンドが観察された。尚、二次抗体を抗ヒトIgG-Fc抗体からIgGサブクラス特異的な抗体へ変更して、サブクラス毎に患者血清中の抗PLA2R抗体を検出した（図５）。

　抗PLA2R抗体簡易測定器具を用いた測定法を、従来のウエスタンブロット法、市販ELISAキット（Euroimmun社製）を用いた測定法と比較評価した。具体的には、患者血清をサンプルとして、各方法で抗PLA2R抗体を測定し、検出感度及び特異度を比較した。その結果、抗PLA2R抗体簡易測定器具を用いた測定法では、ウエスタンブロット法と同等の感度（52.7%）と特異度（95.5%）が得られた。感度は、市販ELISAキットよりも優れていた（市販ELISAキットでの感度は39.7%）。

　以上の通り、簡便な方法にもかかわらず、感度よく検体中の抗PLA2R抗体を検出可能であった。また、トレハロース処理によって、PLA2Rを固定化した膜の保存性が大幅に高まり、簡易型の測定器具を実現できることが裏づけられた。

３．ELISAプレートに固相化したPLA2Rの抗原性保護効果
　ポリスチレン製96ウェルELISAプレートに固相化したリコンビナントPLA2Rタンパク質の乾燥保存に対する抗原性の保護効果を調べた。まず、ポリスチレン製96ウェルELISAプレートの各ウェルに、1μg/mlのリコンビナントPLA2Rを含む炭酸塩バッファー（pH 8.2）を100μlずつ分注し、室温で120分間インキュベートし、ウェル底面にリコンビナントPLA2Rを吸着させた。その後、炭酸塩バッファーを捨て、代わりに5％ (w/v)のトレハロースを含むPBSを各ウェルに100μlずつ加えて室温で30分間インキュベートした後、ウェル内のトレハロース液を捨てて、ウェル内を風乾させた。対照区となる未処理ウェルでは、リコンビナントPLA2Rを吸着させるためのインキュベーションが終わった後、直ちにウェル内を風乾させた。

　以上のようにして調製したELISAプレートを室温にて一晩放置した後に、一次抗体として患者血清を、二次抗体としてHRP標識抗ヒトIgGマウスモノクローナル抗体を各々用いて、ウェル底面に固相化したリコンビナントPLA2Rの検出を試みた結果、トレハロース処理区では固相化したリコンビナントPLA2Rの抗原性に基づくシグナルが観察されたのに対して、未処理区ではシグナルは観察されなかった（図６）。即ち、ELISAプレートに固相化した場合においても、乾燥保存に対するPLA2Rの抗原性の保護効果が認められた。

４．PLA2Rの立体構造を保ち抗原性を維持できる保存法についての検討２
　以上の検討によって、トレハロース処理がPLA2Rの立体構造の保護に有効であることが明らかとなった。トレハロース処理の効果を検証するために、トレハロース濃度、乾燥の方法・有無、保存温度を変えて、PLA2Rタンパク質の抗原性保存試験を行った。

（１）方法
　特発性膜性腎症患者が有する抗PLA2R抗体に対して抗原性をもったリコンビナントPLA2Rタンパク質を、非還元条件下でポリアクリルアミドゲル電気泳動し、PVDF膜に転写してから、Blocking One（ナカライ社製）でブロッキング処理したものを、各種保護剤を含んだPBSTに浸漬してから、各種条件で保存した。所定の期間が経過後に、PLA2Rタンパク質の立体エピトープを認識する特発性膜性人症患者由来抗PLA2R抗体を用いて免疫反応を行い、抗原性を評価した。免疫反応の手順等、特に言及しない操作については１．の方法に準じた。

（２）結果（図７）
　トレハロース（2～20%(w/v））処理後に低温（4℃）で保存すると、PLA2Rの抗原性を維持しつつ長期間の保存が可能であった（＃１～３、１２）。一方、トレハロース（2～40%(w/v））処理後に風乾することによって、PLA2Rの抗原性を維持しつつ長期間の保存が可能であった（＃５～７、１３、１４）。室温で保存したにもかかわらず、抗原性が維持されたことは注目に値する。トレハロース（2～20%(w/v））処理後に凍結乾燥した場合もPLA2Rの抗原性を維持しつつ、室温で長期間の保存が可能であった（＃８、９）。

　本発明によれば保存性に優れたPLA2R抗原が得られる。当該PLA2R抗原は、簡便且つ低コストでの抗PLA2R抗体の測定を可能にする。また、ウエスタンブロット法の原理を利用することにより、定性性にも優れた測定が可能となる。血中の抗PLA2R抗体は特発性膜性腎症の唯一の病態鑑別用および病勢予測用バイオマーカーとして有望視されており、本発明は特発性膜性腎症の診断技術の発展及び確立に貢献する。

　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

　ホスホリパーゼＡ２レセプターをトレハロース溶液で処理する工程を含む、
　抗原性を維持したホスホリパーゼＡ２レセプターの調製法。
　トレハロース溶液のトレハロース濃度が2％(w/v)～40％(w/v)である、請求項１に記載の調製法。
　トレハロース溶液のトレハロース濃度が2％(w/v)～20％(w/v)である、請求項１に記載の調製法。
　トレハロース溶液のトレハロース濃度が5％(w/v)～20％(w/v)である、請求項１に記載の調製法。
　前記工程の後、乾燥処理を行う、請求項１～４のいずれか一項に記載の調製法。
　乾燥処理が風乾又は凍結乾燥である、請求項５に記載の調製法。
　ホスホリパーゼＡ２レセプターが組換えタンパク質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の調製法。
　ホスホリパーゼＡ２レセプターが、PVDF又はニトロセルロース製の膜に固相化された状態である、請求項１～７のいずれか一項に記載の調製法。
　請求項８に記載の調製法で得られる、ホスホリパーゼＡ２レセプターが固相化された膜。
　４℃～２８℃で保存される、請求項９に記載の膜。
　請求項９又は１０に記載の膜を含む、抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体測定器具。
　前記膜が不溶性支持体に固定化されている、請求項１１に記載の測定器具。
　請求項１１又は１２に記載の測定器具を含む、抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体測定キット。
　抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体を含むコントロール試薬、及び／又は抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体を含まないコントロール試薬を更に含む、請求項１３に記載の測定キット。
　請求項１１又は１２に記載の測定器具、或いは請求項１３又は１４に記載の測定キットを用い、前記膜に固相化されたホスホリパーゼＡ２レセプターとの間の抗原抗体反応により、検体中の抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体を検出することを特徴とする、抗ホスホリパーゼＡ２レセプター抗体の測定法。
　以下のステップ（１）及び（２）を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の測定法：
　（１）検体と前記膜とを接触させるステップ；及び
　（２）生成する抗原抗体複合体を検出するステップ。