WO2015185780A1 - Inhibidores polares simétricos de colina cinasa con actividad antitumoral - Google Patents

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WO2015185780A1
WO2015185780A1 PCT/ES2015/070437 ES2015070437W WO2015185780A1 WO 2015185780 A1 WO2015185780 A1 WO 2015185780A1 ES 2015070437 W ES2015070437 W ES 2015070437W WO 2015185780 A1 WO2015185780 A1 WO 2015185780A1
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dibromide
oxy
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PCT/ES2015/070437
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Antonio José Entrena Guadix
Luisa Carlota LÓPEZ CARA
Antonio Espinosa Ubeda
Santiago Schiaffino Ortega
Carmen Marco De La Calle
María Paz CARRASCO JIMÉNEZ
Pablo RÍOS MARCO
Giampietro Viola
Roberta BORTOLOZZI
Giussepe BASSO
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Universidad De Granada
Università Degli Studi Di Padova
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    • C07D453/02—Heterocyclic compounds containing quinuclidine or iso-quinuclidine ring systems, e.g. quinine alkaloids containing not further condensed quinuclidine ring systems

Definitions

  • the present invention is framed in the pharmaceutical field. Specifically, the invention relates to symmetric polar compounds of bispyridinium, bisquinuclidinium and bisquinolinium with a linker derived from 1,2-bis (p-tolyloxy) ethane choline kinase inhibitors, their synthesis and their use as an antitumor drug.
  • the first object of the present invention is a family of compounds with symmetrical structure of bispyridinium, bisquinolin or bisquinuclidinium salts, choline kinase enzyme (ChoK) inhibitors.
  • the second object of the present invention relates to a process for the synthesis of the compounds of the family mentioned above.
  • the third object of the present invention relates to the use of said compounds as inhibitors of choline kinase enzyme (ChoK).
  • the third object of the present invention relates to the use of said compounds as medicaments.
  • a fourth object of the invention is the preparation of medicaments, in particular, pharmaceutical compositions comprising an effective therapeutic amount of said compounds or any of their tautomers, stereoisomers, salts, solvates, hydrates or prodrugs thereof as we have defined before and at least a pharmacologically acceptable vehicle or adjuvant.
  • the fifth object of the present invention relates to the use of these compounds for the treatment of diseases or conditions mediated by ChoK, preferably cancer, more preferably, cervical cancer, adenocarcinoma of the colon, leukemia, breast carcinoma, prostate carcinoma, non-carcinoma. microcytic lung and human hepatoma.
  • ChoK preferably cancer, more preferably, cervical cancer, adenocarcinoma of the colon, leukemia, breast carcinoma, prostate carcinoma, non-carcinoma.
  • microcytic lung and human hepatoma preferably cancer, more preferably, cervical cancer, adenocarcinoma of the colon, leukemia, breast carcinoma, prostate carcinoma, non-carcinoma.
  • Choline kinase enzyme is the first enzyme in the CDP-choline route or Kennedy route, which allows the biosynthesis of phosphatidylcholine (PC), the majority phospholipid of cell membranes. This enzyme catalyzes phosphorylation of choline to phosphocholine (PCho) using ATP and Mg 2+ as a cofactor.
  • oncogenes such as src, mos [Hernández-Alcoceba, R .; Saniger, L; Campos, J .; N ⁇ ez, M. C; Khaless, F .; Gallo M. A .; Espinosa, A .; Lacal, J. C. Oncogene 1997, 15, 2289-2301], but mainly oncogene ras, causes an excess of ChoK activity [Macara, I. G. Mol. Cell Biol. 1989, 9, 325-328; Ratnam, S .; Kent, C. Arch. Biochem.
  • ChoK Due to the important role that ChoK and PCho play in human carcinogenesis, ChoK has become a perfect therapeutic target for the design of antitumor drugs, capable of selectively inhibiting the enzyme by preventing the production of PCho and, therefore, mitogenic activity. associated with this metabolite. ChoK inhibition causes a decrease in cell proliferation and prevents tumor growth in mice [Hernández-Alcoceba, R .; Fernández, F .; Lacal, JC Cancer Res. 1999, 59, 31 12-3118].
  • ChoK is present in other eukaryotic organisms such as Plasmodium falciparum, which causes 80% of malaria infections. In this parasite, ChoK catalyzes the biosynthesis of PCho, from which PC [Vial, H. J .; Ancelin, M. L. Subcell Biochem. 1992, 18, 259-306].
  • HDTAB hexadecyltrimethylammonium bromide
  • aliphatic hydrocarbon refers to a linear or branched hydrocarbon radical, cyclic or not, consisting of 1 to 6 carbon atoms and also of hydrogen atoms, which is attached to the rest of the molecule by a single bond, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, tere-butyl, n-pentyl etc.
  • Aliphatic hydrocarbons may be optionally unsaturated with double or triple bonds, or also substituted by one or more substituents such as halogen, hydroxy, alkoxy, carboxyl, cyano, carbonyl, acyl, alkoxycarbonyl, amino, nitro, mercapto and alkylthio
  • ChoK-mediated disease refers to any disease or condition in which modulation of the expression or activity of choline kinase (ChoK) may be beneficial for patients suffering from said disease or condition. This includes, but is not limited to those diseases or conditions that involve an alteration in the expression or activity of ChoK or that benefit from an inhibition of ChoK.
  • a disease or condition is cancer, more preferably leukemia, cervical cancer, colon adenocarcinoma, leukemia, breast carcinoma, prostate carcinoma, non-small cell lung carcinoma and human hepatoma.
  • Microwave preparation or “microwaving” means two or more compounds subjected to microwave radiation, preferably in a specific laboratory synthesis microwave.
  • transporter refers to the molecular entities or substances with which the active substance is administered.
  • vehicles, carriers or pharmaceutical adjuvants may be sterile liquids such as water and oils, including those of petroleum or of vegetable, animal or synthetic origin such as peanut oil, soybean oil, mineral oil, sesame oil and similar excipients. , disintegrants, wetting agents or diluents.
  • Conveyors, adjuvants and Pharmaceutical vehicles are described in "Remington's Pharmaceutical Sciences” by EW Martin.
  • prodrug includes any of the compounds that becomes the compound of Formula I, when administered to a patient, for example in the metabolic process of the prodrug.
  • prodrugs include, but are not limited to, acetate, formate, benzoate, carboxymethoxy, carboxy ethoxy and derivatives of functional groups (such as alcohol, carboxylic acid, ether, ester or amino groups) in the compounds of Formula I.
  • solvate refers to the compound formed by the interaction of a solvent and a compound. Suitable solvates are pharmaceutically acceptable solvates, such as solvates, hydrates including monosolvates, hydrates and hemisolvates hydrates.
  • hydrate refers to monosolvates, hydrates, dissolvates, hydrates and trisolvates, hydrates.
  • salt refers to a salt of a compound that possesses the desired pharmacological activity of the original compound.
  • Such salts include, but are not limited to only:
  • Acid addition salts formed with inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like; or formed by organic acids such as acetic acid, propionic acid, hexanoic acid, cyclopentanepropionic acid, glycolic acid, pyruvic acid, lactic acid, malonic acid, succinic acid, malic acid, maleic acid, fumaric acid, tartaric acid, citric acid, acid salicylic, benzoic acid, 3- (4-hydroxybenzoyl) benzoic acid, cinnamic acid, mandelic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid and the like.
  • inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid and the like
  • organic acids such as acetic acid, propi
  • a metal ion for example an alkali metal ion, an alkaline earth metal or an aluminum ion
  • an organic base such as ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, N-methylglucamine, dicyclohexylamine and the like.
  • the compounds object of this invention respond to the general formula (I), which have in common a spacer derived from 1,2-bis (p-tolyloxy) ethane (III). and two equal radicals.
  • Ri is selected from the group consisting of:
  • Ri is selected from the group consisting of:
  • F can be heads derived from the pyridine ring substituted in position for with residues of primary, secondary or tertiary amines of aliphatic type (cyclic or acyclic) or aromatic as substituents.
  • R 2 and R 3 are selected from the group consisting of H, aliphatic hydrocarbons of 1 to 8 carbons, cyclic aliphatic hydrocarbons, 5 to 8 carbons and aromatic rings.
  • the process of preparing the compounds that respond to the general formula (IA, IB and IC) comprises the following steps:
  • Spacer group II is understood as a derivative of 1,2-bis (p-tolyloxy) ethane III that acts as a link between the two groups of pyridinium, quinolinium or quinuclidinium present in the structures defined by the general formulas of Structures IA , IB
  • the spacer synthesis begins with the synthesis of 1,2-bis (p-tolyloxy) ethane (III) from 4-methoxyphenol and 1,2-dibromoethane, commercially available (Sigma-Aldrich®).
  • a microwave reactor 4-methoxyphenol is dissolved in ethanol and NaOH (1: 1 equivalents) is added, the reaction mixture is maintained for 20 to 30 min stirring at room temperature. After this time 0.5 equivalents of 1,2-dibromoethane are added and the reaction mixture is irradiated in a microwave at a temperature between 115 and 145 ° C, preferably at 130 ° C, for a period of 25 to 35 min, preferably 28 min.
  • the reaction is cooled and distilled water is added.
  • the precipitated solid is filtered and washed twice with water and once with EtOH, dried in vacuo to obtain an identifiable white solid.
  • 2-bis (4- (bromomethyl) phenoxy) ethane (IV) it is irradiated in a microwave at a temperature of between 1 10 and 130 ° C, preferably at 120 ° C, for a period of time from 20 to 30 min, preferably 21 min, a 1,2-bis (p-tolyloxy) ethane (III) solution, NBS and dibenzylperoxide (1: 2: 0.8 molar ratio) in CCI 4 .
  • the precipitate obtained is filtered and washed with diethylether, dried in vacuo and a yellow solid is obtained.
  • the procedure for obtaining 7-chloro-4- (substituted) quinoline (V) is detailed. It is irradiated in a microwave at a temperature between 165-195 ° C, preferably at 180 ° C, for a period of 20 to 30 min, preferably for 15 minutes, a mixture of 4,7-dichloroquinoline with the corresponding amino derivative , dissolved in acetic acid (when the amino derivative is an aniline analogue) or without solvent (if the amino derivative is an aliphatic cyclic amine).
  • amines used are detailed, methylaniline, 4-clomethylaniline, perhydroazepine, pyrrolidine commercially available (Sigma-Aldrich ®) (1: 2.66 molar ratio). After this time, the reaction is neutralized with NaOH and water, the organic phase is extracted with dichloromethane, dried over anhydrous magnesium sulfate, filtered and the solvent is evaporated. The crude is purified by flash chromatographic column using a mixture of CH 2 CI 2 : MeOH (9: 1 v / v) as eluent.
  • a solution of intermediate (IV) in dry acetonitrile is added dropwise to a solution of the corresponding substituted pyridine, quinuclidine or 4-substituted quinoline (1: 2 molar ratio) in dry acetonitrile.
  • the reaction mixture is heated at reflux under argon for three days. After this time, the precipitated biscathionic product is filtered and washed with diethylether, dried in vacuo and / or purified by flash chromatographic column using a mixture of CH 2 CI 2 : MeOH (9: 1 v / v) as eluent.
  • the compounds object of the invention show biological activity as inhibitors of the human ChoK enzyme, as well as the antiproliferative activity against tumor lines of human HeLa cervix carcinoma, HT-29 colon adenocarcinoma, Jurkat T-type human leukemia, leukemia promyelocytic HL-60, human leukemia type-B RS4; 11, MCF-7 breast carcinoma, PC-3 prostate carcinoma, non-small cell lung carcinoma A549 and the Hep G2 human drug-resistant cell line.
  • the invention also relates to a method of treating mammals, preferably humans, that need to inhibit ChoK, and which comprises administering to the affected individual a therapeutically effective amount of a compound of Formula I, as defined above, or any of the tautomers, stereoisomers, salts, solvates, hydrates or prodrugs thereof.
  • it is a method of treating diseases or conditions mediated by ChoK, preferably tumors, more preferably, cervical cancer, colon adenocarcinoma, leukemia, breast carcinoma, prostate carcinoma, non-small cell lung carcinoma and human hepatoma.
  • the compounds of the invention may be in crystalline form either as free compounds or as solvates (for example hydrates) and it is intended that both forms be included within the scope of the present invention. Solvation methods are generally known within the art.
  • prodrug Any compound that is a prodrug of a compound of Formula I is within the scope and spirit of the invention.
  • prodrug is used in its broadest sense and encompasses those derivatives that are converted in vivo into the compounds of the invention. Such derivatives will be apparent to those skilled in the art, and include, for example, compounds in which a free hydroxyl group is converted into an ester derivative.
  • the compounds mentioned herein may exist as geometric isomers (ie, cis and trans isomers), as tautomers, or as atropoisomers.
  • tautomer refers to one or more structural isomers of a compound that exist in equilibrium and are easily converted from one isomeric form to another. Common tautomeric pairs are amine-imine, amide-imide, keto-enol, lactam-lactime, etc.
  • any compound referred to herein is intended to represent hydrates, solvates, and polymorphs, and mixtures thereof when such forms They exist in the middle.
  • the compounds mentioned herein may exist in isotopically labeled forms. All geometric isomers, tautomers, atropisomers, hydrates, solvates, polymorphs, and isotopically labeled forms of the compounds referred to herein, and mixtures thereof, are considered within the scope of the present invention.
  • the compounds object of the invention show biological activity as inhibitors of the human ChoK enzyme, as well as the antiproliferative activity against tumor lines of human HeLa cervix carcinoma, HT-29 colon adenocarcinoma, Jurkat T-type human leukemia, leukemia promyelocytic HL-60, human leukemia type-B RS4; 11, MCF-7 breast carcinoma, PC-3 prostate carcinoma, non-small cell carcinoma of lung A549 and the drug-resistant cell line of human hepatoma Hep G2.
  • the ChoK enzyme has been obtained from the cytosolic fraction of HepG2 human hepatoma cells following the experimental method described previously [Jiménez-López, JM; Carrasco, MP; Segovia, JL; Marco, C. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 4649-4655].
  • the previously published experimental method has been followed [ES 2 148 092 B1].
  • These tests have been performed with the compounds EB-3D, EB-AC, EB-3CPY, EB-3Q, EB-3QO, EB-3CM, EB-3CC, EB-3DM, EB-3C, EB-3CA, EB- 3DC and EB-3P.
  • the results are expressed as the concentration ( ⁇ ) necessary to obtain 50% enzyme inhibition (Cl 50 ) and are summarized in Table V. Inhibition of purified choline kinase (ChKal)
  • ChoK choline kinase
  • Choline kinase activity was determined by measuring the percentage of incorporation of 14 C from [methyl- 14 C] choline to phosphocholine, both in the presence or absence of different concentrations of the inhibitor.
  • the final reaction mixture contained 100 mM Tris (pH 8.5), 10 mM MgCl 2 , 10 mM ATP, and 20 ng of purified ChoKal. Samples were pre-incubated at 37 ° C for 5 minutes. For the start of the reaction, 1 mM [methyl- 14 C] choline (4500 dpm / nmol) was started and incubated at 37 ° C for 10 minutes, the final reaction volume being 55 ⁇ . The reaction was stopped by immersing the reaction tubes in boiling water for 3 minutes.
  • the human hepatoma HepG2 cell line comes from the European Animal Cell Culture Collection (Salisbury, United Kingdom). The cells were grown in MEM containing 10% heat-inactivated FBS, supplemented with 2 mM L-glutamine, 1% non-essential amino acids, 100 U / mL penicillin and 100 mg / mL L streptomycin. The cells were grown in a humidified atmosphere with 5% C0 2 at 37 ° C and subcultured at a ratio of 1: 10 once a week.
  • HepG2 cells were seeded in triplicate in 96-well plates (10,000 cells / well) and kept in MEM containing 10% FBS for 24 h. Then, the fresh culture medium was replaced with medium / 10% FBS and the cells were incubated for 24 h in the absence or presence of different amounts of ChoK inhibitors dissolved in DMSO. In each experiment the control cells were incubated with the same concentration of DMSO as the treated cells. The concentration of DMSO never exceeded 0.3% to avoid cell lysis. The metabolic activity of the cells, indicative of cell proliferation, was measured after the addition of 10 (per 100 ⁇ of medium) of WST-1 reagent for 2-4 hours at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • Each sample was analyzed using an ELISA Bio-Tex-Instruments ELx800 microplate reader (Winooski, USA).
  • the wavelength for measuring the absorbance of the formazan product was 450 nm and a reference wavelength at 630 nm.
  • the 50% inhibitory concentration (Cl 50 ) was determined from the dose-response curves according to the inhibition ratio for each concentration using software v1.0 ED 50 plus.
  • RPMI-1640 culture medium Gibco, Milan, Italy
  • the DMEN culture medium was used (Gibco, Milan, Italy). Both culture media were supplemented with 1 15 units / mi ⁇ of penicillin G (Gibco, Milan, Italy), 1 15 ug / mL streptomycin (Invitrogen, Milan, Italy) and 10% fetal bovine serum (Invitrogen, Milan , Italy). Stock solutions (10 mM) of the different compounds were obtained by dissolving them in DMSO.
  • the individual wells of a 96-well culture plate were inoculated with 100 uL of complete medium, containing 8 x 10 3 cells.
  • the plates were incubated at 37 ° C in a humidified atmosphere incubator at 5% C0 2 for 18 h before the experiments. After removing the medium, 100 uL of fresh medium containing the compounds to be tested at different concentrations were added to each well and incubated at 37 ° C for 72 h. The percentage of DMSO in the medium never exceeded 0.25%.
  • the cell viability assay was carried out by the colorimetric assay based on the metabolic reduction of MTT ((3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl) tetrazoyl bromide) as previously described.
  • MTT ((3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl) tetrazoyl bromide) as previously described.
  • MTT ((3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl) tetrazoyl bromide) as previously described.
  • MTT ((3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl) tetrazoyl bromide) as previously described.
  • Cl 50 was defined as the concentration of compound required to inhibit cell proliferation by 50%, compared to cells treated with the maximum amount of DMSO (0.25%) and considered as 100% vi
  • cell viability was also determined by calculating the trypan blue values of positive blue cells (dead cells) and trypan blue negative cells (living cells) from a mixture of suspended cells with 0.4 % of trypan blue solution.
  • PBMC Peripheral mononuclear cells
  • Adherent cells were maintained in M200 medium, added with low serum growth supplement (LSGS), containing FBS, Hydrocortisone, hEGF, bFGF, heparin, gentamicin / amphotericin (Life technologies, Monza, Italy). Once confluent, the cells were detached using a trypsin-EDTA solution and used in the experiments from the first to the sixth pass.
  • LSGS low serum growth supplement
  • Example 2 1,1 '- Dibromide - [ethane-1,2-diylbis (oxy-4,1-phenyllemethylene)] bis [4- (pyrrolidino) pyridinium].
  • EB-3AC Brown solid (68%); Mp 129-130 ° C;
  • Example No. 3 1,1 '- [1,2-ethanediylbis (oxy-4,1-phenylemethylene)] bis ⁇ 4 - [(4-chlorophenyl) (methyl) amino] pyridinium ⁇ dibromide. (EB-3CYP).
  • Example No. 4 1,1 '- Dibromide - [ethane-1,2-diylbis (oxy-4,1-phenyllemethylene)] bis [4-quinuclidinium].
  • (EB-3Q) White solid (56%); Mp> 300 ° C;
  • Example 5 (SS / RR and RS) 1,1 '- [ethane-1,2-diylbis (oxy-4,1-phenyllemethylene) dibromide] bis [4- (3-hydroxy) quinuclidinium]. (EB-3QO).
  • Example No. 7 1,1 '- [1,2-ethanediylbis (oxy-4,1-phenylemethylene) dibromide] bis ⁇ 4 - [(4-chlorophenyl) (methyl) amino] quinolinium ⁇ . (EB-3CC).
  • Example 8 1,1'- [1,2-ethanediyl bis (oxy-4,1-phenylemethylene)] bis ⁇ 7-chloro-4- [methyl (phenyl) amino] quinolinium ⁇ dibromide. (EB-3DM).
  • Example No. 9 1,1 '- [1,2-ethanediolbis (oxy-4,1-phenylemethylene) dibromide] bis ⁇ 7-chloro-4 - [(4-chlorophenyl) (methyl) amino] quinolinium ⁇ . (EB-3C). Following the general procedure a reaction crude is obtained which is purified by flash chromatographic coluna using as eluent a mixture CH 2 CI 2 : MeOH (9: 1 v / v).
  • Example No. 10 1,1 '- [1,2-ethanediylbis (oxy-4,1 phenylemethylene) dibromide] bis [4- (1-azepanyl) quinolinium].
  • Example No. 11 1,1'- [1,2-ethanediylbis (oxy-4,1-phenylemethylene) dibromide] bis [-7-Chloro4- (1 azepanyl) quinolinium].
  • (EB-3DC) Following the general procedure a reaction crude is obtained which is purified by flash chromatographic coluna using as eluent a mixture CH 2 CI 2 : MeOH (9: 1 v / v).
  • Example No. 12 1,1 '- [1,2-ethanediylbis (oxy-4,1-phenylemethylene) dibromide] bis [4- (1-pyrrolidinyl) quinolinium].
  • EB-3P 1,1 '- [1,2-ethanediylbis (oxy-4,1-phenylemethylene) dibromide] bis [4- (1-pyrrolidinyl) quinolinium].
  • Compound 4- (A /, A / -dimethylamino) pyridine is commercial and supplied by Sigma-Aldrich®.
  • the 4-pyrrolidinopyridine compound is commercial and supplied by Sigma-Aldrich®.
  • Table V indicates, by way of example and not exclusively, the results obtained in the studies of enzymatic inhibition against human ChoK, in the antiproliferative studies against the tumor lines Hep-G2, HeLa, HT-29, Jurkat, HL-60, RS4; 11, MCF-7, PC-3 and A549
  • Table VI shows, by way of example and not exclusively, the results obtained in the cytotoxicity studies of some of the compounds object of this invention.

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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos polares simétricos de bispiridinio, bisquinuclidinio y bisquinolinio con un linker derivado del1,2-bis(p-toliloxi)etano inhibidores de colina cinasa, su síntesis y su uso como medicamento antitumoral.

Description

INHIBIDORES POLARES SIMÉTRICOS DE COLINA CINASA CON
ACTIVIDAD ANTITUMORAL
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se enmarca en el campo farmacéutico. Concretamente la invención se refiere a compuestos polares simétricos de bispiridinio, bisquinuclidinio y bisquinolinio con un linker derivado del 1 ,2-bis(p-toliloxi)etano inhibidores de colina cinasa, su síntesis y su uso como medicamento antitumoral.
OBJETO DE LA INVENCIÓN
El primer objeto de la presente invención es una familia de compuestos con estructura simétrica de sales de bispiridinio, bisquinolino o bisquinuclidinio, inhibidores de la enzima colina cinasa (ChoK).
El segundo objeto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la síntesis de los compuestos de la familia citada anteriormente.
El tercer objeto de la presente invención se refiere al uso de dichos compuestos como inhibidores de la enzima colina cinasa (ChoK).
El tercer objeto de la presente invención se refiere al uso de dichos compuestos como medicamentos.
Un cuarto objeto de la invención es la elaboración de medicamentos, en particular, composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéutica efectiva dichos compuestos o cualquiera de sus tautómeros, estereoisómeros, sales, solvatos, hidratos o profármacos de los mismos como hemos definido antes y al menos un vehículo o coadyuvante aceptable farmacológicamente.
El quinto objeto de la presente invención se refiere al uso de estos compuestos para el tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por ChoK, preferentemente cáncer, más preferentemente, cáncer de cérvix, adenocarcinoma de colon, leucemias, carcinoma mamario, carcinoma de próstata, carcinoma no microcítico de pulmón y hepatoma humano.
ESTADO DE LA TÉCNICA La enzima colina cinasa (ChoK) es la primera enzima de la ruta CDP-colina o ruta de Kennedy, que permite la biosíntesis de fosfatidilcolina (PC), fosfolipido mayoritario de las membranas celulares. Esta enzima cataliza la fosforilación de colina a fosfocolina (PCho) utilizando ATP y Mg2+ como cofactor.
En condiciones tumorales, diferentes oncogenes, como src, mos [Hernández- Alcoceba, R.; Saniger, L; Campos, J.; Núñez, M. C; Khaless, F.; Gallo M. A.; Espinosa, A.; Lacal, J. C. Oncogene 1997, 15, 2289-2301], pero fundamentalmente el oncogene ras, provoca un exceso de actividad de ChoK [Macara, I. G. Mol. Cell. Biol. 1989, 9, 325-328; Ratnam, S.; Kent, C. Arch. Biochem. Biophys. 1995, 323, 313-322] lo que se traduce en un incremento de los niveles intracelulares de PCho, sin que exista una cooperación con la biosíntesis de PC [Bhakoo, K. K.; Williams, S. R.; Florian, C. L; Land, H.; Noble, M. D. Cáncer Res. 1996, 56, 4630-4655]. El empleo de técnicas de resonancia magnética nuclear (RMN) aplicadas en diferentes tumores humanos (mama, pulmón, colon, colorrectal, próstata y linfoma hepático, entre otros) ha permitido corroborar que en todos ellos se produce un notable aumento de los niveles de PCho con respecto a los niveles existentes en los correspondientes tejidos sanos [Aboagye, E. O.; Bhujwalla, Z. M. Cáncer Res. 1999, 59, 80-84; de Certaines, J. D.; Larsen, V. A.; Podo, F.; Carpinelli, G.; Briot, O.; Henriksen, O. NMR Biomed. 1993, 6, 345-365; Ruiz-Cabello, J.; Cohén, J. S. NMR Biomed. 1992, 5, 226-233; Smith, T. A.; Bush, C; Jameson, C; Titley, J. C; Leach, M. O.; Wilman, D. E.; McCready, V. R. NMR Biomed. 1993, 6, 318-323].
Existen un gran número de estudios que avalan que el aumento de la concentración intracelular de PCho promueve la mitosis celular, permitiendo afirmar que el papel que en ChoK juega en la carcinogénesis humana se debe al incremento de la concentración del producto de catálisis, PCho [Cuadrado, A.;
Carnero, A.; Dolfi, F.; Jiménez, B.; Lacal, J. C. Oncogene 1993, 8, 2959-2968;
Kiss, Z. Cell Signal 1999, 11, 149-157], que actúa como segundo mensajero implicado en la transducción de la señal mitogénica.
Debido al importante papel que juegan ChoK y PCho en la carcinogénesis humana, la ChoK se ha convertido en una diana terapéutica perfecta para el diseño de fármacos antitumorales, capaces de inhibir selectivamente la enzima evitando la producción de PCho y, por tanto, la actividad mitogénica asociada a este metabolito. La inhibición de ChoK produce una disminución de la proliferación celular y previene el crecimiento tumoral en ratones [Hernández-Alcoceba, R.; Fernández, F.; Lacal, J. C. Cáncer Res. 1999, 59, 31 12-3118]. Además, la inhibición de ChoK mediante inhibidores específicos conduce a las células tumorales a la apoptosis, mientras que no afecta a las células normales [Rodríguez-González, A.; Ramírez de Molina, A.; Fernández, F.; Lacal, J. C. Oncogene 2004, 23, 8247- 8259].
La ChoK está presente en otros organismos eucariotas como es Plasmodium falciparum, causante del 80% de la infecciones de malaria. En este parásito, ChoK cataliza la biosíntesis de PCho, del que se obtiene a su vez PC [Vial, H. J.; Ancelin, M. L. Subcell Biochem. 1992, 18, 259-306].
La inhibición de la biosíntesis de PC como estrategia antimalárica ha sido ampliamente estudiada frente a P. falciparum. Se han obtenido un gran número de compuestos con estructura de sales de amonio mono, bis y triscuaternarias capaces de inhibir el crecimiento de P. falciparum in vitro [Ancelin, M. L.; Vial, H. J.; Philippot, J. R. Biochem. Pharmacol. 1985, 34, 4068-4071 ; Ancelin, M. L; Vial, H. J. Antimicrob. Agents Chemother. 1986, 29, 814-820; Ancelin, M. L; Calas, M.; Vidal-Sailhan, V.; Herbuté, S.; Ringwald, P.; Vial, H. J. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 2590-2597; Salom-Roig, X. J.; Hamzé, A.; Calas, M.; Vial, H. J. Comb Chem High Throughput Screen. 2005, 849-862] y en algunos casos, in vivo [Ancelin, M. L.; Calas, M.; Bonhoure, A.; Herbuté, S.; Vial, H. J. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 2598-2605], interfiriendo la biosíntesis de PC, incluso en cepas resistentes a múltiples fármacos [Ancelin, M. L; Calas, M.; Vidal-Sailhan, V.; Herbuté, S.; Ringwald, P.; Vial, H. J. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 2590-2597].
La identificación de la secuencia genética que codifica ChoK en P. falciparum [Choubey, V.; Guha, M.; Maity, P.; Kumar, S.; Raghunandan, R.; Maulik, P. R.; Mitra, K.; Halder, U. C; Bandyopadhyay, U. Biochim. Biophys. Acta 2006, 7760, 1027-1038], ha permitido obtener la enzima recombinante ChoK de P. falciparum (PfChoK). Estudios empleando bromuro de hexadeciltrimetilamonio (HDTAB) han permitido demostrar que la actividad antimalárica mostrada por este compuesto se debe a su capacidad de inhibir PfChoK, lo que provoca un descenso en la generación de PCho, lo que a su vez se traduce en una disminución de la biosíntesis de PC y por tanto, en la muerte del parásito [Choubey, V.; Maity, P.; Guha, M.; Kumar, S.; Srivastava, K.; Puri, S. K.; Bandyopadhyay, U. Antimicrob Agents Chemother. 2007, 51, 696-706].
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Definiciones
A lo largo de la presente memoria, "hidrocarburo alifático" se refiere a un radical hidrocarburo lineal o ramificado, cíclico o no, que consta de 1 a 6 átomos de carbono y también de átomos de hidrógeno, que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n- butilo, tere-butilo, n-pentilo etc. Los hidrocarburos alifáticos, pueden estar opcionalmente insaturados con dobles ó triples enlaces, o también sustituidos por uno o más sustituyentes tales como halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, ciano, carbonilo, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alquiltio
"Enfermedad mediada por ChoK", se refiere a cualquier enfermedad o afección en las que la modulación de la expresión o de la actividad de colina cinasa (ChoK) puede ser beneficiosa para los pacientes que sufran dicha enfermedad o afección. Esto incluye, pero no se limita a aquellas enfermedades o afecciones que implican una alteración en la expresión o actividad de ChoK o que se benefician de una inhibición de ChoK. Preferiblemente tal enfermedad o afección es el cáncer, más preferentemente leucemia, cáncer de cérvix, adenocarcinoma de colon, leucemia, carcinoma mamario, carcinoma de próstata, carcinoma no microcítico de pulmón y hepatoma humano.
Se entenderá por "preparar en microondas" o "preparar con el uso de microondas" a hacer reaccionar dos o más compuestos sometidos a radiación por microondas, preferentemente en un microndas específico de síntesis de laboratorio.
Los términos "transportador", "coadyuvante" y/o "vehículo" se refieren a las entidades moleculares o sustancias con las que se administran el principio activo. Tales vehículos, transportadores o coadyuvantes farmacéuticos, pueden ser líquidos estériles tales como agua y aceites, incluyendo éstos los de petróleo o de origen vegetal, animal o sintético tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y excipientes similares, disgregantes, agentes humectantes o diluyentes. Los transportadores, coadyuvantes y vehículos farmacéuticos se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin.
El término "profármaco", incluye cualquiera de los compuestos que se convierte en el compuesto de Fórmula I, cuando se administra a un paciente, por ejemplo en el proceso metabólico del profármaco. Ejemplos de profármacos incluyen, pero no se limitan solo a ellos, acetato, formiato, benzoato, carboximetoxi, carboxietoxi y derivados de grupos funcionales (tales como alcohol, ácido carboxílico, éter, éster o grupos amino) en los compuestos de Fórmula I.
El término "solvato" se refiere al compuesto formado por la interacción de un disolvente y de un compuesto. Los solvatos adecuados, son solvatos aceptables farmacéuticamente, tales como solvatos, hidratos incluyendo monosolvatos, hidratos y hemisolvatos hidratos. El término "hidrato" se refiere a monosolvatos, hidratos, disolvatos, hidratos y trisolvatos, hidratos.
El término "sar se refiere a una sal de un compuesto que posee la actividad farmacológica deseada del compuesto original. Tales sales incluyen, pero no se limitan sólo a ellos:
• Sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares; o formadas por ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido salicílico, ácido benzoico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil) benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico, ácido bencensulfónico, ácido p-toluensulfónico y similares.
• Sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto original es reemplazado por un ión metálico, por ejemplo un ión de un metal alcalino, un metal alcalinotérreo o un ión de aluminio; o se coordina con una base orgánica tales como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina, diciclohexilamina y similares. Algunas formas de sales pueden encontrarse como hidratos, de tal forma que el término sal se define generalmente para incluir las formas hidratadas y no hidratadas de la sal. Compuestos objeto de la invención
Los compuestos objeto de esta invención responden a la fórmula general (I), que tienen en común un espaciador derivado del 1 ,2-bis(p-toliloxi)etano (III). y dos radicales iguales.
Q
Figure imgf000007_0001
(ll)
En una realización particular, Ri se selecciona del grupo formado por:
• cabezas catiónicas derivadas del anillo de piridina
• cabezas catiónicas derivadas del anillo de quinolina; y
• restos de quinuclidina
En una realización aún más particular, Ri se selecciona del grupo formado por:
• cabezas catiónicas derivadas del anillo de piridina sustituido en posición para con restos de aminas primarias, secundarias o terciarias de tipo alifático (cíclicas o acíclicas) o aromático como sustituyentes.
• cabezas catiónicas derivadas del anillo de quinolina convenientemente sustituido en posición 4 con aminas primarias secundarias o terciarias alifáticas (cíclicas o acíclicas), y/o con restos aromáticos; y en posición 5, 6, 7 ó 8, con un sustituyentes R4 que podría ser H, halógeno, una amina (primaria, secundaria o teciaria) o un -OR donde R = H, alquilo ó aromático;
• restos de quinuclidina sustituido en posición 2, 3 ó 4 por R2 que podría ser H, un halógeno, un hidroxilo -OH o un éter -OR donde R = hidrocarburo alifático ó aromático. Estos compuetos se pueden dividir en 3 Familias A, B y C atentiendo a la naturaleza de F^ .
Familia A: F pueden ser cabezas derivadas del anillo de piridina sustituido en posición para con restos de aminas primarias, secundarias o terciarias de tipo alifático (cíclicas o acíclicas) o aromático como sustituyentes.
Figure imgf000008_0001
La estructura general de la Familia A correspondería a la Estructura IA
Θ
2X
Figure imgf000008_0002
(IA)
Donde R2 y R3 se seleccionan del grupo formado por H, hidrocarburos alifáticos de 1 a 8 carbonos, hidrocarburos alifáticos cíclicos, de 5 a 8 carbonos y anillos aromáticos.
Algunos ejemplos de cabezas se recogen a continuación:
Figure imgf000009_0001
En la Tabla I se contemplan a modo de ejemplo algunos posibles compuestos, petenecientes a esta familia
Tabla I
Figure imgf000009_0002
Familia B: pueden ser cabezas catiónicas derivadas del anillo de quinolina convenientemente sustituido en posición 4 con aminas primarias secundarias o terciarias alifáticas (cíclicas o acíclicas), y/o con restos aromáticos; y en posición 5, 6, 7 ó 8, con un sustituyentes R4 que podría ser H, halógeno, una amina (primaria, secundaria o teciaria) o un -OR donde R = H, alquilo ó aromático.
Figure imgf000010_0001
La estructura general de la Familia B correspondería a la Estructura IB
Estructura IB
Figure imgf000010_0002
En la Tabla II se contemplan a modo de ejemplo algunos posibles compuestos de esta Familia IB. Tabla II
Figure imgf000011_0004
Familia C: R<i que pueden ser restos de quinuclidina sustituido en posición 2, 3 ó 4 por R5 que podría ser H, un halógeno, un hidroxilo -OH o un éter -OR donde R = alquilo ó aromático.
Figure imgf000011_0001
La estructura general de la Familia C correspondería a la Estructura IC
Figure imgf000011_0002
Estructura IC
Algunos ejemplos de cabezas se recogen a continuación:
Figure imgf000011_0003
En la Tabla III se contemplan a modo de ejemplo algunos posibles compuestos pertencientes a esta familia
Tabla III
Figure imgf000012_0003
Método general de síntesis de los compuestos objeto de la invención.
El procedimiento de preparación de los compuestos que responden a la fórmula general (IA, IB y IC) comprende los siguientes pasos:
- Síntesis de precursores del espaciador y del espaciador
Figure imgf000012_0001
(ll)
Se entiende por grupo espaciador II un derivado del 1 ,2-bis(p-toliloxi)etano III que actúe como nexo de unión entre los dos grupos de piridinio, quinolinio o quinuclidinio presentes en las estructuras definidas por las fórmulas generales de las Estructuras IA, IB
Figure imgf000012_0002
(III)
La síntesis del espaciador comienza con la síntesis de 1 ,2-bis(p-toliloxi)etano (III) a partir 4-metoxifenol y 1 ,2-dibromoetano, asequibles comercialmente (Sigma-Aldrich ®). En un reactor de microndas se disuelve 4-metoxifenol en etanol y se añade NaOH (1 : 1 equivalentes), la mezcla de reacción se mantiene de 20 a 30 min agitando a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se añaden 0.5 equivalentes de 1 ,2-dibromoetano y la mezcla de reacción se irradia en un microondas a una temperatura de entre 115 y 145°C, preferentemente a 130°C, durante un perido de tiempo de 25 a 35 min, preferentemente 28 min. La reacción se enfría y se añade agua destilada. El solido precipitado se filtra y se lava dos veces con agua y una vez con EtOH, se seca a vacio para obtener un sólido blanco identific
Figure imgf000013_0001
(IV)
Para la obtención de 2-bis(4-(bromometil)fenoxi)etano (IV) se irradia en un microondas a una temperatura de entre 1 10 y 130°C, preferentemente a 120°C, durante un perido de tiempo de 20 a 30 min, preferentemente 21 min una disolución 1 ,2-bis(p-toliloxi)etano (III), NBS y dibenzilperoxido (Relación molar 1 :2:0.8) en CCI4. El precipitado obtenido se filtra y se lava con dietileter, se seca a vacio y se obtiene un solido amarillo.
Ambas reacciones han sido descritas previamente en bibliografía pero sin el uso de microondas, [Self-Complementary [2]catenanes and Their Related [3]Catenanes. Chem. Eur. J., 6 (2000) 2262-2273].
Para la obtención de III se empleaba un tiempo de reacción de 8 horas a reflujo, obteniendo un rendimiento del 21 %. Con el uso de microondas se ha mejorado mejorado considerablemente el tiempo y rendimiento (28 min y 35%).
Para la obtención de IV se empleba un tiempo de reacción de 5 horas a reflujo y obteniendo un rendimiento del 39%. Con el uso de microondas hemos mejorado considerablemente el tiempo y rendimiento (21 min y 65%).
- Síntesis de cabezas quinolínicas V y VI
En la estucura general IB, pueden ser cabezas derivadas de anillo de quinolina convenientemente sustituidas en posición 4 con aminas alifáticas primarias secundarias terciarias (cíclicas o aciclica), y/o con restos aromáticos; y en posición 5, 6, 7 ó 8, con un sustituyentes R5 que podría ser H, halógeno, una amina (primaria, secundaria o teciaria) o un -OR donde R = H, alquilo ó aromático.
Figure imgf000014_0001
V VI
A modo de ejemplo se detalla el procedimiento para la obtención de 7-cloro-4- (sustituida) quinolina (V). Se irradia en un microondas a una temperatura de entre 165-195°C, preferentemente a 180°C, durante un periodo de tiempo de 20 a 30 min, preferentemente durante 15 minutos, una mezcla de 4,7- dicloroquinolina con el aminoderivado correspondiente, disueltos en ácido acético (cuando el amino derivado es un análogo de anilina) o sin disolvente (si el amino derivado es una amina cíclica alifática). A modo de ejemplo se detallan algunas aminas utilizadas, metilanilina, 4-clometilanilina, perhidroazepina, pirrolidina asequibles comercialmente (Sigma-Aldrich ®) (Relación molar 1 :2.66). Transcurrido dicho tiempo, la reacción se neutraliza con NaOH y agua, se extrae la fase orgánica con diclorometano, se seca sobre sulfato magnésico anhidro, se filtra y se evapora el disolvente. El crudo se purifica mediante columna cromatografica flash usando una mezcla de CH2CI2: MeOH (9: 1 v/v) como eluyente.
Para la obtención de 4-(sustituida) quinolina (VI) se irradia en el microondas la 4- hidroxiquinolina con cloruro de fosforilo (Relación molar 1 :5) asequibles comercialmente (Sigma-Aldrich ®), a 150° durante 30 minutos. Transcurrido dicho tiempo, se añade sobre el reactor cerrado 3 equivalentes del aminoderivado correspondiente (a modo de ejemplo: perhidroazepina, pirrolidina, metlilanilina, 4-clometilanilina) asequible comercialmente (Sigma-Aldrich ®), y se irradia en el microndas a 180°C durante 8 minutos. La reacción se neutraliza con NaOH y agua, se extrae la fase orgánica con diclorometano, se seca sobre sulfato magnésico anhidro, se filtra y se evapora el disolvente. El crudo se purifica mediante columna cromatografica flash usando una mezcla de CH2CI2: MeOH (9: 1 v/v) como eluyente.
Ambas reacciones han sido descritas previamente en bibliografía pero sin el uso de microondas en la patente ES200400072. Para la obtención de V empleaba un tiempo de reacción de 12 horas a reflujo, obteniendo un rendimiento del 85% al 93%. Con el uso de microondas hemos mejorado considerablemente el tiempo de reacción y el rendimiento ha permanecido prácticamente invariable (15 min y 78%).
Para la obtención de VI empleaba un tiempo de reacción de 12 horas a reflujo, obteniendo un rendimiento del 72%. Con el uso de microondas hemos mejorado considerablemente el tiempo de reacción y el rendimiento ha permanecido prácticamente invariable (38 min y 79%). - Síntesis de los productos finales biscatiónicos.
Una disolución del producto intermedio (IV) en acetonitrilo seco se añade gota a gota a una disolución de la correspondiente piridina sustituida, quinuclidina o quinolina 4-sustituida (relación molar 1 :2) en acetonitrilo seco. La mezcla de reacción se calienta a reflujo bajo atmósfera de argón durante tres días. Transcurrido dicho tiempo, el producto biscatiónico precipitado se filtra y se lava con dietileter, se seca a vacio y/o se purifica mediante columna cromatográfica flash usando una mezcla de CH2CI2: MeOH (9: 1 v/v) como eluyente.
Actividad biológica de los compuestos objeto de la invención.
Los compuestos objeto de la invención muestran actividad biológica como inhibidores de la enzima ChoK humana, así como también la actividad antiproliferativa frente a las líneas tumorales de carcinoma de cérvix humano HeLa, adenocarcinoma de colon HT-29, Leucemia Humana tipo-T Jurkat, leucemia promielocítica HL-60, Leucemia humana tipo-B RS4; 11 , carcinoma mamario MCF-7, carcinoma de próstata PC-3, carcinoma no microcítico de pulmón A549 y la linea celular resistente a fármacos de hepatoma humano Hep G2.
Así, la invención también se refiere a un método de tratamiento de mamíferos, preferiblemente seres humanos, que necesiten inhibir ChoK, y que comprende la administración al individuo afectado de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de Fórmula I, como se ha definido anteriormente, o cualquiera de los tautómeros, estereoisómeros, sales, solvatos, hidratos o profármacos de los mismos. En particular, es un método de tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por ChoK, preferentemente tumores, más preferentemente, cáncer de cérvix, adenocarcinoma de colon, leucemia, carcinoma mamario, carcinoma de próstata, carcinoma no microcítico de pulmón y hepatoma humano
Los compuestos de la invención pueden estar en forma cristalina bien como compuestos libres o como solvatos (por ejemplo hidratos) y se pretende que ambas formas se incluyan dentro del alcance de la presente invención. Los métodos de solvatación son generalmente conocidos dentro la técnica.
Cualquier compuesto que es un profármaco de un compuesto de Fórmula I está dentro del alcance y espíritu de la invención. El término " profármaco " se utiliza en su sentido más amplio y abarca aquellos derivados que se convierten in vivo en los compuestos de la invención. Tales derivados serán evidentes para aquellos expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, compuestos en los que un grupo hidroxilo libre se convierte en un derivado de éster.
Además, los compuestos mencionados en este documento pueden existir como isómeros geométricos (es decir, isómeros cis y trans), como tautómeros, o como atropoisómeros. Específicamente, el término "tautómero" se refiere a uno o más isómeros estructurales de un compuesto que existen en equilibrio y se convierten fácilmente de una forma isomérica a otra. Pares tautoméricos comunes son amina-imina, amida-imida, ceto-enol, lactama-lactima, etc Además, cualquier compuesto que se refiere el presente documento está destinado a representar hidratos, solvatos, y polimorfos, y mezclas de los mismos cuando tales formas existan en el medio. Además, los compuestos mencionados en este documento pueden existir en formas marcadas isotópicamente. Todos los isómeros geométricos, tautómeros, atropisómeros, los hidratos, solvatos, polimorfos, y las formas marcadas isotópicamente de los compuestos a que se refiere el presente documento, y mezclas de los mismos, se consideran dentro del alcance de la presente invención.
Los compuestos objeto de la invención muestran actividad biológica como inhibidores de la enzima ChoK humana, así como también la actividad antiproliferativa frente a las líneas tumorales de carcinoma de cérvix humano HeLa, adenocarcinoma de colon HT-29, Leucemia Humana tipo-T Jurkat, leucemia promielocítica HL-60, Leucemia humana tipo-B RS4; 11 , carcinoma mamario MCF-7, carcinoma de próstata PC-3, carcinoma no microcítico de pulmón A549 y la linea celular resistente a fármacos de hepatoma humano Hep G2.
Inhibición de la colina cinasa citosólica
La enzima ChoK se ha obtenido de la fracción citosólica de células de hepatoma humano HepG2 siguiendo el método experimental descrito previamente [Jiménez-López, J.M.; Carrasco, M.P.; Segovia, J.L.; Marco, C. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 4649-4655]. Para el estudio de la actividad inhibitoria frente a ChoK humana se ha seguido el método experimental previamente publicado [ES 2 148 092 B1]. Estos ensayos se han realizado con los compuestos EB-3D, EB- AC, EB-3CPY, EB-3Q, EB-3QO, EB-3CM, EB-3CC, EB-3DM, EB-3C, EB-3CA, EB- 3DC y EB-3P. Los resultados se expresan como la concentración (μΜ) necesaria para obtener un 50% de inhibición enzimática (Cl50) y se resumen en la tabla V. Inhibición de la colina cinasa purificada (ChKal )
Los efectos de los diferentes inhibidores sobre la colina cinasa (ChoK) se ensayaron utilizando la ChKal purificada, que fue clonada y purificada según la literatura previamente descrita [Sahún-Roncero, M.; Rubio-Ruiz, B; Conejo- García, A.; Velazquez-Campoy, A.; Entrena, A.; Hurtado-Guerrero, R. ChemBioChem 2013, 14, 1291-1295]. Para cada ensayo se hicieron, en paralelo, ensayos control con la misma cantidad que presentaban los distintos inhibidores sintéticos. La cantidad de DMSO nunca excedió una concentración de 0.1 %, para evitar la posible inespecificidad en la inhibición de la ChoK.
La actividad de la colina cinasa se determinó midiendo el porcentaje de incorporación de 14C a partir de [metil-14C]colina a fosfocolina, ambos en presencia o ausencia de diferentes concentraciones del inhibidor. La mezcla final de reacción contenía 100 mM Tris (pH 8.5), 10 mM MgCI2, 10 mM ATP, y 20 ng de ChoKal purificada. Las muestras se preincubaron a 37°C durante 5 minutos. Para el inicio de la reacción se partió de 1 mM [metil-14C]colina (4500 dpm/nmol) y se incubó a 37°C durante 10 minutos, siendo el volumen final de la reacción de 55 μΙ. La reacción se paró mediante la inmersión de los tubos de reacción en agua hirviendo durante 3 minutos. Las muestras de la mezcla de reacción se desarrollaron en placas cromatográficas de Silica Gel, en presencia de fosfocolina (0.1 mg) y colina (0.1 mg), utilizando metanol/0.6% NaCI/ 28% NH4OH en agua (50:50:5, v/v/v) como líquido de desarrollo. Para la visualización de la fosfocolina se expusieron las placas a una atmósfera de vapor de iodo. Posteriormente se rasparon las muestras y se transfirieron a viales de centelleo para medir la radioactividad, utilizando como soporte técnico un contador de centelleo líquido Beckman 6000-TA (Madrid, España). Al menos se hicieron tres réplicas para cada ensayo realizado. La concentración inhibitoria 50% (Cl50) se determinó a partir del % de actividad de la enzima frente a las diferentes concentraciones de los inhibidores sintéticos ensayados, usando una curva sigmoidal dosis-respuesta (ED50plus v1.0 software).
Ensayos de Antiproliferación en células tumorales
La línea celular HepG2 de hepatoma humano procede de la Colección Europea de Cultivos de Células Animales (Salisbury, Reino Unido). Las células se cultivaron en MEM que contiene 10 % de FBS inactivado por calor, suplementado con 2 mM de L-glutamina, 1 % de aminoácidos no esenciales, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/ mlL de estreptomicina. Las células fueron cultivadas en una atmósfera humidificada con 5 % de C02 a 37°C y se subcultivaron a una relación de 1 : 10 una vez a la semana.
Las células HepG2 se sembraron por triplicado en placas de 96 pocilios (10 000 células/pocilio) y se mantuvieron en MEM que contenía 10 % de FBS durante 24 h. Entonces, se reemplazó el medio de cultivo fresco con medium/10 % de FBS y las células se incubaron durante 24 h en ausencia o presencia de diferentes cantidades de inhibidores de la ChoK disueltos en DMSO. En cada experimento las células controles se incubaron con la misma concentración de DMSO que las células tratadas. La concentración de DMSO no superó nunca el 0,3 % para evitar la lisis celular. La actividad metabólica de las células, indicativa de la proliferación celular, se midió después de la adición de 10 (por 100μί de medio) de reactivo WST-1 durante 2-4 horas a 37°C y 5 % de C02. Cada muestra se analizó usando un lector de microplacas de ELISA Bio-Tex- Instrumentos ELx800 (Winooski, EE.UU). La longitud de onda para la medición de la absorbancia del producto de formazano era 450 nm y una longitud de onda de referencia a 630 nm. La concentración inhibitoria del 50 % (Cl50) se determinó a partir de las curvas de dosis-respuesta de acuerdo con la relación de inhibición para cada concentración utilizando el software v1.0 ED50plus. Para el crecimiento de las líneas celulares tumorales humanas de linfocitos T (Jurkat), linfocitos B (RS4; 11) y leucemia promielocítica (HL-60), se utilizó el medio de cultivo RPMI-1640 (Gibco, Milán, Italia). Para el crecimiento de las líneas celulares tumorales humanas de adenocarcinoma mamario (MCF-7), carcinoma no microcítico de pulmón (A549), carcinoma de cervix uterino (HeLa) y adenocarcinoma de colon (HT-29) se utilizó el medio de cultivo DMEN (Gibco, Milán, Italia). Ambos medios de cultivo se suplementaron con 1 15 unidades/mi¬ de penicilina G (Gibco, Milán, Italia), 1 15 ug/mL de estreptomicina (Invitrogen, Milán, Italia) y un 10% de suero fetal bovino (Invitrogen, Milán, Italia). Las soluciones Stock (10 mM) de los diferentes compuestos se obtuvieron disolviendo los mismos en DMSO. Los pocilios individuales de una placa de cultivo de 96 pocilios se inocularon con 100 uL de medio completo, conteniendo 8 x 103 células. Las placas se incubaron a 37°C, en un incubador con atmósfera humidificada al 5% de C02 durante 18 h antes de los experimentos. Después de remover el medio, se añadieron a cada pocilio 100 uL de medio fresco conteniendo los compuestos a ensayar a diferentes concentraciones y se incubó a 37°C durante 72 h. El porcentaje de DMSO en el medio nunca excedió del 0,25%. El ensayo de viabilidad celular se llevó a cabo mediante el ensayo colorimétrico basado en la reducción metabólica del MTT (bromuro de (3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil)tetrazoilo) como se describió previamente [Romagnoli, Baraldi P.G.,Lopez-Cara C, Preti D., Aghazadeh Tabrizi M., Balzarini J., Bassetto M., Brancale A., Xian-Hua Fu, Yan Gao, Jun Li, Su-Zhan Zhang R., Hamel E. Bortolozzi R., Basso G., Viola G. J. Med. Chem. 2013, 56, 9296-9309]. La Cl50 se definió como la concentración de compuesto requerida para inhibir la proliferación celular en un 50%, en comparación con las células tratadas con la máxima cantidad de DMSO (0,25%) y consideradas como el 100% de viabilidad.
En experimentos adicionales la viabilidad celular también se determinó mediante el cálculo de los valores de azul de tripán de células azules positivas (células muertas) y células azul de tripán negativas (células vivas) procedentes de una mezcla de células en suspensión con un 0,4% de solución de azul de tripán.
Estos ensayos se han realizado con los compuestos EB-3D, EB-AC, EB-3CPY, EB-3Q, EB-3QO, EB-3CM, EB-3CC, EB-3DM, EB-3C, EB-3CA, EB-3DC y EB-
3P. Los resultados se expresan como la concentración (μΜ) necesaria para obtener un 50% de inhibición del crecimiento celular (Cl50) y se resumen más adelante en la tabla V.
Ensayos de Antiproliferación en células no tumorales.
Células mononucleares periféricas (PBMC) procedentes de donantes sanos se obtuvieron mediante la separación en gradiente de un Linfopreparado (Fresenius KABI Norge AS). Después de un lavado extensivo, las células se resuspendieron (1.0 x 106 células/mL) en RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino y se incubaron toda la noche. Para las evaluaciones de citotoxicidad en cultivos de proliferación PBL, se resuspendieron células no adherentes a una concentración de 5 x 105 células/mL en medio de crecimiento conteniendo 2.5 μg/mL PHA (Irvine Scientific).
Se añadieron diferentes concentraciones de los compuestos a ensayar y se determinó la viabilidad celular 72 h más tarde mediante un ensayo de MTT. Para evaluar la citotoxicidad en los cultivos PBL restantes, se resuspendieron las células no adherentes (5 x 105 células/mL) y se trataron durante 72 h con los compuestos a ensayar, como fue descrito previamente [Dall'Acqua F., Linardi M.A., Innocenti G., Basso G., Viola G. Bioorg. Med. Chem. 201 1 , 19, 5876-5885]. Se prepararon células madre de la vena del cordón umbilical humanas (HUVEC), como se ha descrito previamente [Porcu E., Viola G. Bortolozzi R., Mitola S., Ronca R., Presta M., Persano L, Romagnoli R., Baraldi P.G., Basso G. Angiogenesis, 2013, 76, 647-662].
Las células adherentes se mantuvieron en medio M200, adicionado con suplemento de crecimiento bajo en suero (LSGS), conteniendo FBS, Hydrocortisona, hEGF, bFGF, heparina, gentamicina/anfotericina (Life technologies, Monza, Italia). Una vez confluentes, las células fueron despegadas utilizando una solución de tripsina-EDTA y usadas en los experimentos desde el primero hasta el sexto pase.
Los fibroblastos humanos procedentes de prepucio se aislaron como se describe previamente [Rheinwald JG, Green H. Cell 1975, 6: 331-343] y cultivados en DMEN con 10% de FBS. Estos ensayos se han realizado con los compuestos EB-3D, EB-AC, EB-3CM, EB-3CC, EB-3DM, EB-3CA, EB-3DC y EB-3P. Los resultados se expresan como como la concentración (μΜ) necesaria para obtener un 50% de inhibición del crecimiento celular (Cl50) y se resumen más adelante en la Tabla VI. MODOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
A título de ejemplo ilustrativo, pero no limitativo, se representan en la Tabla IV algunos de los compuestos objeto de esta invención.
Tabla IV
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Los ejemplos preparativos se proponen, a continuación, a modo ilustrativo u orientativo, sin que estos sean limitativos:
Ejemplo n° 1 : Dibromuro de 1 ,1 '-[etano-1,2-diilbis(oxi-4,1 - fenillenometileno)]bis[4-(dimetillamino)piridinio]. (EB-3D). Sólido de color amarillo (42%); P.f. 62-63°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 3.24 (s, 12H), 4.33 (s, 4H), 5.30 (s, 4H), 6.99 (d, J = 7.86 Hz, 4H), 7.02 (d, J = 8.73 Hz, 4H), 7.35 (d, J = 8.73 Hz, 4H), 8.20 (d, J = 7.86 Hz, 4H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 41.20 x 4, 62.22 x 2, 68.86 x 2, 109.93 x 4, 117.30 x 4, 129.20 x 2, 131.98 x 4, 143.76 x 4, 158.87 x 2, 161.80 x 2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C30H36N4O2: 242.1419, encontardo: 242.1409.
Ejemplo n° 2: Dibromuro de 1 ,1'-[etano-1,2-diilbis(oxi-4,1 -fenillenometileno)] bis[4-(pirrolidino)piridinio]. (EB-3AC). Sólido de color marrón (68%); P.f. 129- 130°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 2.1 1 (t, J = 6.86 Hz, 8H), 3.54 (t, J = 6.84 Hz, 8H), 4.32 (s, 4H), 5.28 (s, 4H), 6.84 (d, J = 7.77 Hz, 4H), 7.01 (d, J = 8.73 Hz, 4H), 7.34 (d, J = 8.73 Hz, 4H), 8.17 (d, J = 7.77 Hz, 4H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 26.98 x 4, 50.28 x 4, 62.26 x 2, 68.86 x 2, 110.51 x 4, 117.29 x 4, 129.31 x 2, 131.92 x 4, 143.68 x 4, 156.05 x 2, 161.79 x 2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C34H40N4O2: 2681576, encontrado: 268.1568.
Ejemplo n° 3: Dibromuro de 1 ,1 '-[1,2-etanodiilbis(oxi-4,1 - fenilenometileno)]bis{4-[(4-clorofenil)(metil)amino]pyridinio}. (EB-3CYP).
Sólido de color blanco (30%); P.f. > 300°C; 1H RMN (600 MHz, CD3OD): <5= 3.53 (s, 6H), 4.33 (s, 4H), 5.35 (s, 4H), 6.92 (m, 4H), 7.02 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 7.37 (m, 8H); 7.58 (d, J = 8.5 Hz, 4H). 8.28(d, J = 8.5 Hz, 4H).13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 30.55 x 2, 61.64 x 2, 67.81 x 2, 1 10.27 x 2, 116.27 x 8, 127.95 x 2, 129.28 x 4, 131.13 x 4, 131.94 x 4, 135.52 x 2, 143.52 x 4, 158. 31 x 160.85 x 2. HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C2oH19N2OCI: 338.1186, encontrado: 338.1 194.
Ejemplo n° 4: Dibromuro de 1 ,1 '-[etano-1,2-diilbis(oxi-4,1 - fenillenometileno)]bis[4-quinuclidinio]. (EB-3Q). Sólido de color blanco (56%); P.f. > 300°C ; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 2.01 (dt, J = 8.23, 3.23 Hz, 12H), 2.18 (dt, J = 6.44, 3.23 Hz, 2H), 3.48 (m, 12H), 4.35 (s, 4H), 4.43 (s, 4H), 7.13 (d, J = 8.78 Hz, 4H), 7.47 (d, J = 8.78 Hz, 4H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 22.33 x2, 25.81 x6, 56.39x6, 68.87x2, 69.52x2, 117.14x4, 121.54x2, 136.48x4, 162.80 x 2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C30H42N2O2: 231.1623, encontrado: 231.1628. Ejemplo n° 5: (SS/RR y RS) Dibromuro de 1,1'-[etano-1,2-diilbis(oxi-4,1- fenillenometileno)]bis[4-(3-hidroxi)quinuclidinio]. (EB-3QO). Sólido de color blanco (63%); P.f. 268-270°C; 1H RMN (300 MHz, DMSO-d6): <5= 4.08, 3.64, 3.35, 3.04, 2.27, 2.10 (6m, 26H), 4.41 (s, 4H), 4.43 (s, 4H), 7.13 (d, J = 8.66 Hz, 4H), 7.48 (d, J = 8.66 Hz, 4H); 13C RMN (75 MHz, DMSO-d6): δ = 17.29, 20.87, 26.83, 52.52, 53.46, 62.26 x 4, 63.27, 65.61 x 4, 66.37, 114.77 x 8 , 119.63 x 4, 134.43 x 8, 159.52 x 4; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C30H42N2O4: 247.1572, encontrado: 247.1565.
Ejemplo n° 6: Dibromuro de 1,1'-[1,2-etanodiilbis(oxi-4,1- fenilenometileno)]bis{4-[metil(fenil)amino]quinolinio}. (EB-3CM). Sólido de color amarillo (64%); P.f. 169-170°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 3.84 (s, 6H), 4.33 (s, 4H), 5.89 (s, 4H), 8.86 (d, J = 7.44 Hz, 2H), 7.81 (dt, J = 5.57, 1.43 Hz, 2H), 7.62 (dd, J = 8.8, 1.3 Hz, 2H), 7.03 (d, J = 8.76 Hz, 4H), 7.40-7.29 (m, 12H), 7.53 (m, 4H), 7.46 (t, J = 7.36 Hz, 2H), 8.13 (d, J = 8.37 Hz); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): δ= 46.75 x 2, 59.94 x 2, 68.85 x 2, 107.73 x 2, 117.30 x 4, 120.97 x 2, 122.29 x 2, 127.73 x 4, 127.85 x 2, 128.64 x 2, 130.15 x 2, 130.28 x 2, 130.63x4, 132.75x4, 135.51 x 2, 141.68x2, 148.54x2, 150.14x2, 160.80 x 2, 161.47 x 2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C48H44N4O2: 354.1732, encontrado: 354.1736.
Ejemplo n° 7: Dibromuro de 1,1'-[1,2-etanodiilbis(oxi-4,1- fenilenometileno)]bis{4-[(4clorofenil)(metil)amino]quinolinio}. (EB-3CC).
Sólido de color amarillo (70%); P.f.178-180°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 3.82 (s, 6H), 4.33 (s, 4H), 5.91 (s, 4H), 7.03 (d, J= 8.77 Hz, 4H), 7.33 (d, J= 8.77 Hz, 4H), 7.41-7.37 (m, 8H), 7.52 (d, J = 8.91 Hz, 4H), 7.67 (dd, J = 8.8, 1.2 Hz, 2H), 7.84 (dt, J = 5.64, 1.36 Hz, 2H), 8.16 (dd, J = 8.9, 0.6 Hz, 2H), 8.90 (d, J = 7.40 Hz, 2H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 46.53 x 2, 60.09 x 2, 68.84 x 2, 108.36x2, 117.30x4, 121.13x2, 122.41 x 2, 128.20x2, 128.52x2, 129.28 x 4, 130.00x2, 130.69x4, 132.72x4, 135.58x2, 135.68x2, 141.68x2, 148.77 x 2, 148.81 x 2, 160.92 x 2, 161.48 x 2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C48H42N4O2CI2: 388.1342, encontrado: 388.1338.
Ejemplo n° 8: Dibromuro de 1,1'-[1,2-etanodiil bis(oxi-4,1- fenilenometileno)]bis{7-cloro-4-[metil(fenil)amino]quinolinio}. (EB-3DM).
Siguiendo el procedimento general se obtiene un crudo de reacción que se purifica mediante coluna cromatográfica flash usando como eluyente una mezcla CH2CI2: MeOH (9:1 v/v). Se obtiene un sólido de color marrón-amarillento (61%); P.f.181-183°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 3.82 (s, 6H, CH3); 4.34 (s, 4H), 5.85 (s, 4H), 7.06-7.03 (d, J = 8.70 Hz, 4H), 7.29 (dd, J = 9.3, 1.9 Hz, 2H), 7.34- 7.31 (m, 6H), 7.41-7.40 (d, J = 7.48 Hz, 4H), 7.47 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.56-7.53 (m, 6H), 8.15 (d, J = 1.89 Hz, 2H), 8.82 (d, J = 7.50 Hz, 2H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 46.87 x 2, 59.91 x 2, 68.86 x 2, 107.93 x 2, 117.41 x 4, 120.45 x 2, 120.68x2, 128.24x2, 127.72x4, 128.24x2, 128.35x2, 130.59x2, 130.77 x 4, 131.80x2, 132.92x4, 141.90x2, 142.51 x2, 148.95x2, 149.76x2, 160.51 x 2, 161.58 x 2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C48H42N4O2CI2: 388.1342, encontrado: 388.1331.
Ejemplo n° 9: Dibromuro de 1,1'-[1,2-etanodiolbis(oxi-4,1- fenilenometileno)]bis{7-cloro-4-[(4-clorofenil)(metil)amino]quinolinio}. (EB- 3C). Siguiendo el procedimento general se obtiene un crudo de reacción que se purifica mediante coluna cromatográfica flash usando como eluyente una mezcla CH2CI2: MeOH (9:1 v/v). Se obtiene un sólido de color marrón-amarillento (39%); P.f.185-186°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 3.82 (s, 6H, CH3), 4.35 (s, 4H), 5.88 (s, 4H), 7.06 (d, J= 8.73 Hz, 4H, H-2), 7.35 (d, J= 8.73 Hz, 4H), 7.38 (d, J = 7.47 Hz, 2H), 7.40 (d, J = 1.96 Hz, 2H), 7.42 (d, J = 8.78 Hz, 4H), 7.55 (d, J = 8.78 Hz, 4H), 7.63 (d, J = 9.31 Hz, 2H), 8.20 (d, J = 1.93 Hz, 2H), 8.87 (d, J = 7.46 Hz, 2H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 46.69 x 2, 60.05 x 2, 68.85 x 2, 108.57x2, 117.40x4, 120.61 x2, 120.82x2, 128.15x2, 128.71 x2, 129.33 x 4, 130.85x4, 131.68x2, 132.88x4, 135.92x2, 142.06x2, 142.50x2, 148.45 x 2, 149.22 x 2, 160.65 x 2, 161.59 x 2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C48H40N4O2CI4 : 422.0953, encontrado: 422.0952. Ejemplo n° 10: Dibromuro de 1,1'-[1,2-etanodiilbis(oxi-4,1 fenilenometileno)]bis[4-(1-azepanil)quinolinio]. (EB-3CA). Sólido de color amarilo (67%); P.f.75-77°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 1.75 (dt, J = 5.40, 2.54 Hz, 8H), 8.54 (d, J= 7.73 Hz, 2H), 2.09 (m, 8H), 4.09 (m, 8H), 4.30 (s, 4H), 5.74 (s, 4H), 7.00 (d, J= 8.80 Hz, 4H), 7.10 (d, J= 7.74 Hz), 7.27 (d, J= 8.80 Hz, 4H), 7.66 (dt, J= 5.77, 1.15 Hz, 2H), 7.90 (dt, J = 5,67, 1,33 Hz, 2H), 8.05 (dd, J = 8.83, 1.05 Hz, 2H), 8.42 (dd, J = 8.62, 1.28 Hz, 2H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 29.23 x 4, 29.37 x 4, 56.06 x 4, 58.99 x 2, 68.84 x 2, 104.55 x 2, 117.22 x 4, 120.33x2, 121.41 x 2, 127.04x2, 128.98x2, 130.44x2, 130.48x 4, 135.52x2, 142.10x2, 146.48x2, 161.34x2, 161.91 x2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C46H52N4O2 : 346.6700, encontrado 346.2039.
Ejemplo n° 11: Dibromuro de 1,1'-[1,2-etanodiilbis(oxi-4,1- fenilenometileno)]bis[-7-Cloro4-(1 azepanil)quinolinio]. (EB-3DC). Siguiendo el procedimento general se obtiene un crudo de reacción que se purifica mediante coluna cromatográfica flash usando como eluyente una mezcla CH2CI2: MeOH (9:1 v/v). Se obtiene un sólido de color blanco (41%); P.f.87-88°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 1.74 (m, 8H), 2.08 (m, 8H), 4.08 (m, 8H), 4.33 (s, 4H), 5.72 (s, 4H), 7.03 (d, J = 8.64 Hz, 4H), 7.11 (d, J= 7.78 Hz, 2H), 7.65 (dd, J = 9.2, 1.9 Hz, 2H), 7.29 (d, J = 8.64 Hz, 4H), 8.07 (d, J = 1.82 Hz, 2H), 8.40 (d, J = 9.21 Hz, 2H), 8.51 ppm (d, J = 7.75 Hz, 2H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 29.16 x 4, 29.28 x 4, 56.12 x 4, 59.00 x 2, 68.85 x 2, 105.00 x 2, 117.32 x 4, 119.78x2, 119.88x2, 127.45x2, 128.57x2, 130.59x4, 132.31 x2, 141.82 x 2, 142.95 x 2, 146.77 x 2, 161.44 x 2, 161.56 ppm x 2; HRMS (m/e): [M-Br]+ calculado para C^Hsol^OaC Br : 839.24949, encontrado: 839.2494.
Ejemplo n° 12: Dibromuro de 1,1'-[1,2-etanodiilbis(oxi-4,1- fenilenometileno)]bis[4-(1-pirrolidinil)quinolinio]. (EB-3P). Siguiendo el procedimento general se obtiene un crudo de reacción que se purifica mediante coluna cromatográfica flash usando como eluyente una mezcla CH2CI2: MeOH (9:1 v/v). Se obtiene un sólido de color blanco (48%); P.f. 118-120°C; 1H RMN (300 MHz, CD3OD): <5= 2.20 (m, 8H), 4.02 (m, 8H), 4.32 (s, 4H), 5.71 (s, 4H), 6.90 (d, J = 7.69 Hz, 2H), 7.27 (d, J = 8.75 Hz, 4H), 7.66 (dd, J = 9.2, 2.0 Hz, 2H), 7.01 (d, J = 8.75 Hz, 4H), 8.04 (d, J = 2.02 Hz, 2H), 8.51 (d, J = 7.69 Hz, 2H), 8.63 ppm (d, J = 9.23 Hz, 2H); 13C RMN (75 MHz, CD3OD): <5= 24.64 x 4, 55.43 x 4, 59.06 x 2, 68.83 x 2, 104.64 x 2, 117.29 x 4, 119.73 x 2, 120.16 x _ 127.71 x 2, 128.68 x 2, 130.45 x 4, 131.76 x 2, 141.76 x 2, 142.45 x 2, 146.91 2, 157.92 x 2, 161.37 ppm x 2; HRMS (m/e): [M]2+ calculado para C42H42N4O2CI 352.1337, encontrado: 352.1353.
Preparación de reactivos
El compuesto 4-(A/,A/-dimetilamino)piridina es comercial y suministrado por Sigma-Aldrich®.
Figure imgf000026_0001
El compuesto 4-pirrolidinopiridina es comercial y suministrado por Sigma- Aldrich®.
Figure imgf000026_0002
El compuesto 4-(4-cloro-/ -metilanilino)piridina se preparó siguiendo la metodología descrita en P201400072.
Figure imgf000026_0003
La Tabla V indica, a título de ejemplo y no con carácter excluyente, los resultados obtenidos en los estudios de inhibición enzimática frente a ChoK humana, en los estudios antiproliferativos frente a la líneas tumorales Hep-G2, HeLa, HT-29, Jurkat, HL-60, RS4; 11 , MCF-7, PC-3 y A549
Tabla V
Figure imgf000027_0001
La Tabla VI indica a título de ejemplo y no con carácter excluyente, los resultados obtenidos en los estudios de citotoxicidad de algunos de los compuestos objeto de esta invención.
Tabla VI
PBL Fibroblastos
Código PBL (+Pha) HUVEC
(quiescentes) Humanos
EB-3D 1.5±0.64 0.034±0.007 5.8±1.3 5.1 ±0.43
EB-3AC 34.8±15.6 1.88±0.71 30.5±9.6 n.d.
EB-3CM 1.4±0.6 0.10±0.03 9.8±2.5 n.d.
EB-3CC 0.98±0.25 0.55±0.1 1 7.4±2.4 10.4±3.5
EB-3DM 1.0±0.42 0.32±0.03 3.7±0.43 16.0±6.6
EB-3CA 2.0±0.24 0.095±0.021 14.3±1.2 n.d.
EB-3DC 2.1 ±0.80 0.034±0.007 3.2±0.86 n.d.
EB-3P 3.8±0.55 0.49±0.15 9.6±1.3 1 1.4±5.9

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Compuesto de fórmula general (I) que comprende el compuesto de fórmula general (III) como espaciador y dos radicales, iguales
Θ
Figure imgf000029_0001
(l)
Figure imgf000029_0002
2. - Compuesto según reivindicación anterior donde Ri se selecciona del grupo formado por:
• cabezas catiónicas derivadas del anillo de piridina
• cabezas catiónicas derivadas del anillo de quinolina; y
• restos de quinuclidina
3. - Compuesto según reivindicación anterior donde Ri se selecciona del grupo formado por:
• cabezas cartiónicas derivadas del anillo de piridina sustituido en posición para con restos de aminas primarias, secundarias o terciarias de tipo alifático (cíclicas o acíclicas) o aromático como sustituyentes.
• cabezas catiónicas derivadas del anillo de quinolina convenientemente sustituido en posición 4 con aminas primarias secundarias o terciarias alifáticas (cíclicas o acíclicas), y/o con restos aromáticos; y en posición 5, 6, 7 ó 8, con un sustituyentes R4 que podría ser H, halógeno, una amina (primaria, secundaria o teciaria) o un -OR donde R = H, alquilo ó aromático; y
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) • restos de quinuclidina sustituido en posición 2, 3 ó 4 por R5 que podría ser H, un halógeno, un hidroxilo -OH o un éter -OR donde R = hidrocarburo alifático ó aromático sustituido o no.
Compuesto según reivindicación anterior con fórmula general (IA)
Θ
Figure imgf000030_0001
Donde R2 y R3 se seleccionan del grupo formado por H, hidrocarburos acíclicos de 1 a 8 carbonos, hidrocarburos acíclicos de 5 a 8 carbonos y cabezas aromáticas. R2 puede ser igual o diferente a R3 en cada cabeza.
5.- Compuesto según reivindicación 3 con fórmula general (IB)
Figure imgf000030_0002
Donde R2 y R3 se seleccionan del grupo formado por H, hidrocarburos alifáticos de 1 a 8 carbonos, hidrocarburos alifáticos cíclicos de 5 a 8 carbonos y cabezas aromáticas.
6.- Compuesto según reivindicación 3 con fórmula general (IC)
Figure imgf000030_0003
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) (IC)
Dónde R5 podría ser hidrógeno- H, un halógeno -X, un hidroxilo -OH o un éter - OR donde R = hidrocarburo alifático ó aromático sustituido o no.
7.- Un compuesto según la reivindicación 4 seleccionado del grupo formado por:
• Dibromuro de 1 , 1'-[etano-1 ,2-diilbis(oxi-4,1- fenillenometileno)]bis[4-(dimetillamino)piridinio]. (EB-3D).
• Dibromuro de 1 , T-[etano-1 ,2-diilbis(oxi-4,1-fenillenometileno)] bis[4-(pirrolidino)piridinio]. (EB-3AC).
Un compuesto según la reivindicación 5 seleccionado del grupo formado por:
• Dibromuro de 1 , 1 '-[1 ,2-etanodiilbis(oxi-4,1-fenilenometileno)]bis{4- [metil(fenil)amino]quinolinio}. (EB-3CM).
• Dibromuro de 1 , 1 '-[1 ,2-etanodiilbis(oxi-4,1-fenilenometileno)]bis{4- [(4-clorofenil)(metil)amino]quinolinio}. (EB-3CC).
• Dibromuro de 1 , 1'-[1 ,2-etanodiil bis(oxi-4,1-fenilenometileno)]bis{7- cloro-4-[metil(fenil)amino]quinolinio}. (EB-3DM).
• Dibromuro de 1 , 1'-[1 ,2-etanodiolbis(oxi-4, 1- fenilenometileno)]bis{7-cloro-4-[(4
clorofenil)(metil)amino]quinolinio}. (EB-3C).
• Dibromuro de 1 , 1 '-[1 ,2-etanodiilbis(oxi-4,1-fenilenometileno)]bis[-7- Cloro4-(1azepanil)quinolinio]. (EB-3DC).
• Dibromuro de 1 , 1 '-[1 ,2-etanodiilbis(oxi-4,1-fenilenometileno)]bis[4- (l-pirrolidinil)quinolinio]. (EB-3P).
Un compuesto según la reivindicación 6 seleccionado del grupo formado por:
• Dibromuro de 1 , 1'-[etano-1 ,2-diilbis(oxi-4,1- fenillenometileno)]bis[4-quinuclidinio]. (EB-3Q).
• (SS/RR y RS) Dibromuro de 1 , 1 '-[etano-1 ,2-diilbis(oxi-4, 1 - fenillenometileno)]bis[4-(3-hidroxi)quinuclidinio]. (EB-3QO).
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
10.- Procedimiento de preparación de compuestos según reivindicaciones 2 a 9 que comprende la preparación de una disolución del producto intermedio (IV) y la correspondiente piridina, quinolina 4-sustituida o quinucidina en acetonitrilo. 1 1.- Procedimiento de preparación del compuesto de la fórmula general (III) que comprende hacer reaccionar una mezcla en de p-hidroxitolueno, 1 ,2- dibromoetano, NaOH y Etanol utilizando el microondas.
12. - Procedimiento de preparación del compuesto de la fórmula general (IV) que comprende hacer reaccionar 1 ,2-bis(p-toliloxi)etano (III), NBS y dibenzilperoxido con en CCI4 utilizando el microondas.
13. - Procedimiento de preparación del compuesto de la fórmula general (V) que comprende hacer reaccionar 4,7-dicloroquinolina y el aminoderivado utilizando el microondas.
14. - Procedimiento de preparación del compuesto de la fórmula general (VI) que comprende hacer reaccionar 4-hidroxiquinolina, cloruro de fosforilo y el aminoderivado correspondiente utilizando el microondas.
15. - Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la elaboración de un medicamento.
16. - Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la elaboración de un medicamento antitumoral.
17. -. Uso de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o afecciones mediadas por la enzima colina cinasa (ChoK).
18. - Uso de un compuesto, según la reivindicación anterior, donde la enfermedad o afección sea cáncer.
19. - Uso del compuesto según reivindicación anterior para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de cáncer de cérvix.
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
20.- Uso del compuesto según reivindicación 18, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de adenocarcinoma de colon. 21.- Uso del compuesto según reivindicación 18, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de Leucemia
22. - Uso del compuesto según reivindicación 18, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de carcinoma mamario
23. - Uso del compuesto según reivindicación 18, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de carcinoma de próstata
24. - Uso del compuesto según reivindicación 18, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de carcinoma no microcítico de pulmón.
25. - Uso del compuesto según reivindicación 18, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de hepatoma humano 26.- Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente aceptable de al menos uno de los compuestos de Fórmula general (I) o cualquiera de sus tautomeros, estereoisómeros, sales, solvatos, hidratos o profármacos según reivindicaciones 1 a 9 y al menos un transportador, coadyuvante o vehículo aceptable farmacológicamente.
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26)
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