WO2015178237A1 - 動脈壁肥厚の程度の検知方法 - Google Patents

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degree
wall thickening
arterial wall
blood
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次郎 人見
里百合 及川
昇 槇
泰博 菅又
久美子 飯田
千春 大植
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学校法人岩手医科大学
株式会社先端生命科学研究所
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the degree of arterial wall thickening that is useful for determining the event risk of atherothrombosis and the therapeutic effect on atherothrombosis.
  • Atherothrombosis which is a cause of cerebrovascular diseases such as cerebral infarction and cardiovascular diseases such as myocardial infarction, is caused by the progression of arterial wall thickening, resulting in atherosclerotic plaque (atheroma) inside the blood vessel. It is a well-known fact that it has increased significantly as a disease causing death in recent years because platelets are activated and blood clots are formed due to endothelial damage and plaque failure. It is a fact. Therefore, it is very important to accurately determine the event risk and to appropriately treat a high-risk patient in order to avoid the risk of life and the occurrence of serious dysfunction.
  • images such as ultrasound (echo), angiography, and MRI.
  • image diagnosis cannot be a gold standard because the quality of an image depends on the technique of the photographer.
  • search for a biomarker that is an index of atherothrombosis has been energetically performed (for example, Patent Document 1), but a biomarker that can be used as an index of the degree of arterial wall thickening has been found. The current situation is not.
  • the present invention aims to provide a method for detecting the degree of arterial wall thickening using a biomarker, which is useful for determining the event risk of atherothrombosis and determining the therapeutic effect on atherothrombosis.
  • each of arginine-deficient complement component C3a (C3a-desArg) and calcium-binding protein S100A12 detects the degree of arterial wall thickening.
  • C3a-desArg arginine-deficient complement component
  • S100A12 calcium-binding protein
  • the method for detecting the degree of thickening of the arterial wall according to the present invention based on the above findings is as described in claim 1, wherein the greater the amount of C3a-desArg and / or S100A12 present in the blood, the thicker the arterial wall is. By judging that the degree of is strong.
  • the method according to claim 2 is the method according to claim 1, wherein the amount of C3a-desArg in the blood is measured by an immunological technique using an antibody that specifically recognizes C3a-desArg. It depends.
  • the method according to claim 3 is the method according to claim 1, wherein the abundance of S100A12 in the blood is measured by an immunological technique using an antibody that specifically recognizes S100A12.
  • the present invention also provides the use of an antibody specifically recognizing C3a-desArg and / or an antibody specifically recognizing S100A12 for detecting the degree of arterial wall thickening. is there. Further, the present invention provides a method for detecting the degree of arterial wall thickening comprising at least an antibody that specifically recognizes C3a-desArg and / or an antibody that specifically recognizes S100A12, as described in claim 5. It is a kit.
  • a method using the abundance of S100A12 in the blood as an index can be provided.
  • FIG. 4 is a graph showing that the group of ATIS-related patients and the group of CEA patients can be distinguished based on the blood concentrations of C3a-desArg and S100A12 in Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing that the degree of carotid artery IMT can be stratified based on the blood concentrations of C3a-desArg and S100A12.
  • FIG. 6 is a graph showing that the group of ATIS-related patients and the group of CEA patients can be distinguished based on the blood concentration of C3a-desArg in Example 2 and that the degree of carotid artery IMT can be stratified. is there.
  • the method for detecting the degree of arterial wall thickening according to the present invention is based on determining that the greater the amount of C3a-desArg and / or S100A12 in the blood, the stronger the degree of arterial wall thickening. Detection of the degree of arterial wall thickening may be performed based on the abundance in one of C3a-desArg and S100A12, or may be performed in combination with the abundance in each blood.
  • C3a-desArg used as a biomarker for detecting the degree of arterial wall thickening is a degradation product of C3a, which is a complement component, and the C-terminal arginine of C3a is excised in blood. It is known that it is produced and stable and has lower biological activity than C3a (see, for example, JP 2010-210408 if necessary).
  • S100A12 belongs to the S100 protein family that is a calcium-binding protein and is also called a novel ligand EN-RAGE (extracellular newly identified RAGE-binding protein) to RAGE, which is a receptor for the glycation end product AGE.
  • EN-RAGE extracellular newly identified RAGE-binding protein
  • Measurement of the abundance of C3a-desArg and S100A12 in the blood is, for example, an immunological technique using antigen-antibody reaction, specifically, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method, Western blotting method, latex agglutination
  • the turbidimetric method, flow cytometry method and the like can be performed according to the standard protocol of each method.
  • the antibody used in such a method is preferably an antibody that specifically recognizes each of C3a-desArg and S100A12.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • a commercially available antibody a well-known antibody may be sufficient, and the antibody produced in-house may be sufficient.
  • the antibody may be kitted together with a washing solution so that the degree of arterial wall thickening can be detected easily and simply.
  • the artery to be detected in the method for detecting the degree of arterial wall thickening of the present invention may be an artery present in any part of the body as long as it is an artery that can cause wall thickening. Examples include the carotid artery.
  • the method of the present invention can be used as follows, for example.
  • the abundance of C3a-desArg and S100A12 in the blood collected from the subject is mild and severe (for example, the average abundance of each population determined by diagnosis by images such as ultrasound (echo), angiography, MRI, etc. ).
  • the subject's abundance is less than the standard abundance when the degree of wall thickening is mild, no treatment is required, and if it corresponds to the standard abundance in the mild case, pharmacotherapy is performed.
  • carotid endarterectomy (CEA) is performed, and the necessity of treatment is judged, or a treatment policy is formulated.
  • a treatment policy refers to the results of diagnosis using images such as ultrasound (echo), angiography, and MRI, which are currently used for the diagnosis of atherothrombosis. It may be.
  • the method of the present invention is a treatment for atherothrombosis in the carotid artery by comparing the abundance of C3a-desArg and S100A12 in the blood after treatment of the treated subject with the abundance before treatment. It is also used to determine the effect and the change over time of the risk of atherothrombosis in the carotid artery by comparing the amount of C3a-desArg or S100A12 in the blood of the subject with the previous amount. You can also
  • RNaseH (Invitrogen) was added to the obtained reaction solution and reacted at 37 ° C. for 30 minutes to decompose mixed RNA. A part of this reaction solution was used, and Takara EX Taq DNA polymerase (94 ° C) was prepared using Takara EX Taqse Polymer (94 ° C) in the presence of C3a-s primer (5'-gaattcccatcatcatcatcatcatcatcatcctgtgcagctcacgggagaagcgaatggac-3 ': SEQ ID NO: 2) and C3ad-as primer.
  • the C3a-desArg gene cDNA was amplified by performing polymerase chain reaction (PCR) by 30 thermal cycle reactions consisting of 30 seconds, 30 seconds at 55 ° C., and 30 seconds at 72 ° C.
  • the amplified fragments were separated by 1.2% agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 260 bp was recovered from the agarose gel using a QIAquick gel purification kit (QIAGEN) according to the method recommended by the manufacturer.
  • the recovered DNA fragment (C3a-desArg cDNA) was ligated with a pGEM-T easy vector (Promega) according to the method recommended by the manufacturer, and then the DH5 ⁇ strain was transformed with the obtained ligation reaction solution.
  • a transformant that is resistant to ampicillin and forms a white colony by plating on an agar medium supplemented with IPTG and X-gal was selected, and 2YT medium (1.6% tryptone, supplemented with ampicillin at 100 ⁇ g / ml) was selected. 1% yeast extract, 0.5% NaCl).
  • the plasmid was purified from the cultured cells using Wizard Plus SV Miniprep DNA Purification System (Promega).
  • the C3a-desArg cDNA sequence incorporated in the purified plasmid is reacted according to the method recommended by the manufacturer using CEQ DTCS Quick Start Kit (BECKMAN / COULTER) using primers suitable for the vector, and CEQ2000 XL DNA analysis.
  • the analysis was performed using a system (Software version 4.0.0, BECKMAN / COULTER). Based on the obtained data, sequence data was analyzed using Sequencer (Version 4.1.2, Gene Codes Corporation) to determine the base sequence of C3a-desArg cDNA.
  • TrpE-C3a-desArg fusion antigen expression plasmid 0.5 ⁇ g of the cloned C3a-desArg plasmid was added to 20 ⁇ l of a restriction enzyme reaction solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol. , 100 mM NaCl, 15 units of EcoRI and 15 units of BamHI enzyme] at 37 ° C. for 1 hour, followed by 1.2% agarose gel electrophoresis and about 260 bp EcoRI using a QIAquick gel purification kit. -The BamHI fragment was purified.
  • a restriction enzyme reaction solution [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl, 15 units of EcoRI and 15 units.
  • BamHI enzyme at 37 ° C. for 1 hour, followed by 1.2% agarose gel electrophoresis, and the EcoRI-BamHI fragment of the pATtrpE vector was purified using the QIAquick gel purification kit.
  • the ligation reaction between the EcoRI-BamHI fragment of the C3a-desArg plasmid and the EcoRI-BamHI fragment of the pATtrpE vector was performed using a 10 ⁇ ligase buffer [660 mM Tris-HCl (pH 7.5), 66 mM MgCl 2 , 100 mM dithiothreitol, 1 mM ATP]. ] Water was added to 5 ⁇ l and T4 ligase 1 ⁇ l (350 units / ⁇ l) to 50 ⁇ l, and the mixture was kept at 16 ° C. overnight.
  • Escherichia coli BL21 strain was transformed with the obtained ligation reaction solution.
  • a transformant resistant to ampicillin and grown by plating on an agar medium was selected and cultured in 2YT medium supplemented with ampicillin at 100 ⁇ g / ml.
  • plasmid DNA mini-preparation 1.5 ml of the bacterial culture was collected by centrifugation, and plasmid DNA mini-preparation was performed by the alkaline method [Manniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982)]. 1 ⁇ g of the obtained plasmid DNA was added at 37 ° C. in 20 ⁇ l of a restriction enzyme reaction solution (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 1 mM dithiothreitol, 100 mM NaCl, 15 units of EcoRI and 15 units of BamHI enzyme). Then, 1.2% agarose gel electrophoresis was performed, and a pATtrpE-C3a-desArg expression plasmid generating an approximately 260 bp EcoRI-BamHI fragment was selected.
  • a restriction enzyme reaction solution 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2
  • TrpE-C3a-desArg fusion antigen The E. coli BL21 strain carrying the pATtrpE-C3a-desArg expression plasmid was inoculated into 3 ml of 2YT medium containing 50 ⁇ g / ml ampicillin and cultured at 37 ° C. for 9 hours. . 1 ml of the obtained culture broth was added to 100 ml of M9-CA medium (0.6% Na 2 HPO 4 , 0.5% KH 2 PO 4 , 0.5% NaCl, 0.1% containing 50 ⁇ g / ml ampicillin.
  • the collected cells are suspended by adding 20 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.3) (PBS) containing 0.15 M NaCl, centrifuged again, and bacteria expressing the TrpE-C3a-desArg fusion antigen. About 2g of body was obtained. The obtained bacterial cells were resuspended in 10 ml of PBS, and the E. coli membrane was disrupted by ultrasonic disruption and then centrifuged to obtain a soluble fraction containing the TrpE-C3a-desArg fusion antigen.
  • PBS phosphate buffer
  • E. coli membrane was disrupted by ultrasonic disruption and then centrifuged to obtain a soluble fraction containing the TrpE-C3a-desArg fusion antigen.
  • TrpE-C3a-desArg fusion antigen was purified.
  • the spleen was aseptically removed from the mouse, the spleen was loosened into individual cells using scissors and a metal mesh, and washed three times with RPMI-1640 medium.
  • the mouse myeloma cell line Sp2 / 0-Ag14 in the logarithmic growth phase was washed three times with RPMI-1640 medium, and the cells and spleen cells were mixed at a cell number ratio of 1: 5.
  • RPMI-1640 medium containing 50% polyethylene glycol (PEG) 4000 (Merck) was slowly added while gently mixing the cell sputum, and RPMI- Cell fusion was performed by adding 10 ml of 1640 medium.
  • PEG polyethylene glycol
  • the obtained fused cells were centrifuged at 200 ⁇ g for 5 minutes to remove PEG, and then suspended in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum and hypoxanthine / aminopterin / thymidine (HAT) to obtain 96-well cells. Inoculated on culture plates. After culturing for about 10 days and growing only the hybridoma, a clone producing a monoclonal antibody that reacts specifically with the immunizing antigen is searched by ELISA to obtain the desired hybridoma, and a single clone is obtained by limiting dilution. And a hybridoma was established.
  • One of the hybridomas established in (A) (clone name: C3ad-5) was obtained using serum-free medium (Hybridoma-SFM, GIBCO), 37 The cells were cultured at 5 ° C. in 5% carbon dioxide gas for 72 to 96 hours. In order to purify the monoclonal antibody produced in the medium, the culture solution was subjected to affinity chromatography using a protein A sepharose column.
  • the monoclonal antibody produced by C3N-6 reacts with a commercially available human C3a-desArg purified product and a commercially available human C3a purified product, it can be used as a monoclonal antibody for detecting human C3a-desArg. all right.
  • Example 1 Stratification of the degree of carotid artery IMT based on the respective blood concentrations of C3a-desArg and S100A12 77 patients judged to have atherothrombosis and its risk factors due to the presence of carotid wall thickening Patients (ATIS-related patients) and 39 patients (CEA patients) who were judged to need carotid endarterectomy (CEA) due to severe carotid wall thickening With the consent of C3a-desArg and S100A12 in blood. The blood concentrations of C3a-desArg and S100A12 were measured by the ELISA method described later. The results are shown in Table 1.
  • the AUC (area under the curve) of the ROC curve predicted using ABI (ankle / upper arm index) as an explanatory variable was 0.636
  • C3a-desArg and The AUC of the ROC curve predicted using two variables of each blood concentration of S100A12 as an explanatory variable is 0.787, and the latter has higher prediction accuracy than the former, so that the degree of carotid artery wall thickening is detected.
  • the usefulness of combining blood concentrations of C3a-desArg and S100A12 Rukoto could be.
  • blocking solution 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.3) (hereinafter “blocking solution”) containing 0.5% casein-Na was added to each well, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 4 hours. After removing the blocking solution, 90 ⁇ l of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.3) containing 0.2 M NaCl, 1% BSA and 0.07% casein-Na was diluted with the measurement sample (serum) or stepwise. 10 ⁇ l of a standard substance (TrpE-C3a-desArg fusion antigen prepared in Reference Example 1) was added to each well to make 100 ⁇ l and reacted at room temperature for 1 hour.
  • a standard substance TrpE-C3a-desArg fusion antigen prepared in Reference Example 1 hour.
  • each well was washed 5 times with 0.35 ml of washing solution. Thereafter, a labeled antibody solution (0.2 M NaCl, 1% BSA, 0.07) prepared by peroxidase (POD) labeling of the monoclonal antibody (C3N-6) for detecting human C3a-desArg prepared in Reference Example 3 was used. 100 ⁇ l of 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.3) containing% casein-Na was added to each well and allowed to react at room temperature for 1 hour. Each well was washed 5 times with 0.35 ml of the washing solution, and then 100 ⁇ l of a substrate (orthophenylenediamine) solution was added and allowed to react for 30 minutes in the dark at room temperature.
  • a substrate orthophenylenediamine
  • washing solution 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.3)
  • blocking solution 20 mM HEPES buffer (pH 7.4)
  • a labeled antibody solution (20 mM HEPES buffer (pH 7.4 containing 0.15 M NaCl, 1% BSA and 1 mM CaCl 2 ) prepared by peroxidase (POD) labeling of a monoclonal antibody (hCF113) for detecting human S100A12. )
  • a labeled antibody solution 20 mM HEPES buffer (pH 7.4 containing 0.15 M NaCl, 1% BSA and 1 mM CaCl 2 ) prepared by peroxidase (POD) labeling of a monoclonal antibody (hCF113) for detecting human S100A12. )
  • POD peroxidase
  • Example 2 Stratification of degree of carotid artery IMT based on blood concentration of C3a-desArg (Part 2)
  • a commercially available kit for measuring C3a-desArg Human C3a ELISA Kit, BD Biosciences
  • ATIS-related 30 patients and 31 CEA patients.
  • FIG. 3 the group of ATIS-related patients and the group of CEA patients could be separated at p ⁇ 0.0001 even using a commercially available kit for measuring C3a-desArg.
  • the present invention is industrially useful in that it can provide a method for detecting the degree of arterial wall thickening, which is useful for determining event risk of atherothrombosis and determining therapeutic effects on atherothrombosis. Have potential.

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Abstract

　本発明の課題は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度の検知方法を提供することである。その解決手段としての本発明の動脈壁肥厚の程度の検知方法は、アルギニン欠損型補体成分Ｃ３ａ（Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ）、および／または、カルシウム結合性タンパク質であるＳ１００Ａ１２の血液中の存在量が多いほど、動脈壁肥厚の程度が強いと判断することによる。これらのタンパク質の血液中の存在量の測定は、例えばこれらのタンパク質を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行うことができる。

Description

動脈壁肥厚の程度の検知方法
　本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度の検知方法に関する。
　脳梗塞などの脳血管疾患や心筋梗塞などの心血管疾患の原因となるアテローム血栓症（ＡＴＩＳ：Ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）は、動脈壁肥厚が進行した結果、血管内部に動脈硬化性のプラーク（粥腫）が形成され、内皮の損傷やプラークの破綻などによって血小板が活性化されて血栓が形成されるに至った状態であり、近年、死亡原因となる疾患として著しく増加していることは一般にもよく知られた事実である。従って、そのイベントリスクの判定を正確に行い、リスクが高い患者に対して適切な治療を行うことは、生命の危険や重篤な機能障害の発生を回避する上で非常に重要である。現在、アテローム血栓症の診断は、超音波（エコー）、血管造影、ＭＲＩなどの画像に基づいて行われている。しかしながら、こうした画像による診断は、画像の良し悪しが撮影者の技術によって左右されるため、いずれもゴールドスタンダードになり得ない。こうした点に鑑み、アテローム血栓症の指標となるバイオマーカーの探索が精力的に行われているが（例えば特許文献１）、動脈壁肥厚の程度の指標として用いることができるバイオマーカーは見出されていないのが現状である。
特表２００８－５１２０９４号公報
　そこで本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、バイオマーカーを用いた動脈壁肥厚の程度の検知方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意検討を行った結果、アルギニン欠損型補体成分Ｃ３ａ（Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ）とカルシウム結合性タンパク質であるＳ１００Ａ１２のそれぞれが、動脈壁肥厚の程度を検知するためのタンパク質バイオマーカーとして有用であり、これらの血液中の存在量が多いほど動脈壁肥厚の程度が強く、これらの血液中の存在量に基づいて、現在、臨床現場において頸動脈硬化の進行度の指標として用いられている頸動脈ＩＭＴ（内膜中膜複合体厚）の程度を階層化することができることを見出した。
　上記の知見に基づいてなされた本発明の動脈壁肥厚の程度の検知方法は、請求項１記載の通り、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ、および／または、Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量が多いほど、動脈壁肥厚の程度が強いと判断することによる。
　また、請求項２記載の方法は、請求項１記載の方法において、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇの血液中の存在量の測定を、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行うことによる。
　また、請求項３記載の方法は、請求項１記載の方法において、Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量の測定を、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行うことによる。
　また、本発明は、請求項４記載の通り、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体、および／または、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体の、動脈壁肥厚の程度を検知するための使用である。
　また、本発明は、請求項５記載の通り、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体、および／または、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体を少なくとも含む、動脈壁肥厚の程度を検知するためのキットである。
　本発明によれば、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度を検知する方法として、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ、および／または、Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量を指標とする方法を提供することができる。
実施例１における、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度に基づいて、ＡＴＩＳ関連患者の群とＣＥＡ患者の群を区別することができることを示すグラフである。 同、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度に基づいて、頸動脈ＩＭＴの程度を階層化することができることを示すグラフである。 実施例２における、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇの血中濃度に基づいて、ＡＴＩＳ関連患者の群とＣＥＡ患者の群を区別することができることと、頸動脈ＩＭＴの程度を階層化することができることを示すグラフである。
　本発明の動脈壁肥厚の程度の検知方法は、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ、および／または、Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量が多いほど、動脈壁肥厚の程度が強いと判断することによる。動脈壁肥厚の程度の検知は、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のいずれか一方の血液中の存在量に基づいて行ってもよいし、それぞれの血液中の存在量を併用して行ってもよい。
　本発明において、動脈壁肥厚の程度を検知するためのバイオマーカーとして用いるＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇは、補体成分であるＣ３ａの分解産物であり、血液中でＣ３ａのＣ末端のアルギニンが切除されることで生成し、Ｃ３ａよりも安定かつ生物活性が低いことが知られている（必要であれば例えば特開２０１０－２１０４０８号公報を参照のこと）。
　また、Ｓ１００Ａ１２は、カルシウム結合性タンパク質であるＳ１００タンパク質ファミリーに属し、終末糖化産物ＡＧＥの受容体であるＲＡＧＥへの新規リガンドＥＮ－ＲＡＧＥ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｎｅｗｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ＲＡＧＥ－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれ、好中球が産生することが知られている（必要であれば例えばＡ．ＫＯＳＡＫＩ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２００４，８９（１１）：５４２３－５４２８を参照のこと）。
　Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血液中の存在量の測定は、例えば抗原抗体反応を利用する免疫学的手法、具体的には、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法、ウエスタンブロッティング法、ラテックス凝集比濁法、フローサイトメトリー法などにより、それぞれの方法の標準的なプロトコルに従って行うことができる。こうした方法に用いる抗体は、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれを特異的に認識する抗体が好適である。抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよい。また、市販の抗体や公知の抗体であってもよいし、自家作製した抗体であってもよい。抗体は、容易かつ簡便に動脈壁肥厚の程度を検知することができるように、洗浄液などとともにキット化してもよい。
　本発明の動脈壁肥厚の程度の検知方法において検知対象とする動脈は、壁肥厚が起こりうる動脈であれば体内のどの部位に存在する動脈であってもよいが、検知対象とする好適な動脈としては頸動脈が挙げられる。検知対象とする動脈が頸動脈の場合、本発明の方法は、例えば次のようにして利用することができる。健康診断などにおいて頸動脈におけるアテローム血栓症のイベントリスクの判定を行うために、頸動脈壁肥厚の程度を知ることを目的として、対象者から採取した血液中のＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇやＳ１００Ａ１２の存在量を、頸動脈壁肥厚の程度が軽度と重度のそれぞれの場合の予め定めた標準存在量（例えば超音波（エコー）、血管造影、ＭＲＩなどの画像による診断によって確定されたそれぞれの集団の平均存在量）と比較する。比較の結果、対象者の存在量が、壁肥厚の程度が軽度の場合の標準存在量よりも少なければ治療の必要なし、軽度の場合の標準存在量に相当すれば薬物療法を実施する、重度の場合の標準存在量に相当すれば頸動脈内膜剥離術（ＣＥＡ）を施行するといったように、治療の必要性の有無を判断したり、治療方針を策定したりする。こうした治療の必要性の有無の判断や治療方針の策定を行う際、現在、アテローム血栓症の診断に利用されている、超音波（エコー）、血管造影、ＭＲＩなどの画像による診断の結果を参考にしてもよい。また、本発明の方法は、治療を行った対象者の治療後のＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇやＳ１００Ａ１２の血液中の存在量を、治療前の存在量と比較することによる、頸動脈におけるアテローム血栓症に対する治療効果の判定や、対象者のＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇやＳ１００Ａ１２の血液中の存在量を、以前の存在量と比較することによる、頸動脈におけるアテローム血栓症のイベントリスクの経時的変化の判定などにも利用することもできる。
　以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
参考例１：標準物質として用いるＴｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ融合抗原の調製
（Ａ）Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ遺伝子のクローニング
　ヒト肝癌細胞株であるＨｕｈ７細胞より、全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ　Ｐｕｒｅ　Ｖｉｒａｌ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてメーカーの推奨する方法に従って精製した。得られた核酸にＣ３ａｄ－ａｓプライマー（５’－ｇｇａｔｃｃｔｔａｇｇｃｃａｇｇｃｃｃａｇｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃｃｇｃｇｃ－３’：配列番号１）を加え、ＳｕｐｅｒＳｕｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、メーカーの推奨する条件で、４２℃で１時間逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。
　得られた反応液にＲＮａｓｅＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、３７℃で３０分反応させ、混在するＲＮＡを分解した。この反応液の一部を用い、Ｃ３ａ－ｓプライマー（５’－ｇａａｔｔｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｔｃｃｇｔｇｃａｇｃｔｃａｃｇｇａｇａａｇｃｇａａｔｇｇａｃ－３’：配列番号２）とＣ３ａｄ－ａｓプライマーの存在下で、Ｔａｋａｒａ　ＥＸ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（宝酒造）を用い、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒からなる３０回のサーマルサイクル反応によるポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うことにより、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ遺伝子のｃＤＮＡの増幅を行った。
　増幅した断片を１．２％アガロースゲル電気泳動によって分離し、アガロースゲルから、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、メーカーの推奨する方法に従って約２６０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片（Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ　ｃＤＮＡ）を、メーカーの推奨する方法に従ってｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）と連結反応させた後、得られた連結反応液を用いてＤＨ５α株を形質転換した。アンピシリン耐性で、ＩＰＴＧとＸ－ｇａｌを加えた寒天培地上での平板培養で白色コロニーを形成する形質転換体を選び、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌとなるよう加えた２ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）にて培養した。培養した菌体からＷｉｚａｒｄ　Ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプラスミドを精製した。
　精製したプラスミドに組み込まれているＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ　ｃＤＮＡの配列は、ベクターに適合したプライマーを用い、ＣＥＱ　ＤＴＣＳ　Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｋｉｔ（ＢＥＣＫＭＡＮ・ＣＯＵＬＴＥＲ）により、メーカーの推奨する方法に従って反応を行い、ＣＥＱ２０００　ＸＬ　ＤＮＡ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　４．０．０、ＢＥＣＫＭＡＮ・ＣＯＵＬＴＥＲ）により解析した。得られたデータを基に、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｖｅｒｓｉｏｎ　４．１．２、Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて配列データの解析を行い、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ　ｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
（Ｂ）ＴｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ融合抗原発現プラスミドの構築
　クローニングされたＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇプラスミド０．５μｇを、制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中、３７℃で１時間消化し、その後、１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて、約２６０ｂｐのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ断片を精製した。
　次に、発現ベクターであるｐＡＴｔｒｐＥのプラスミド０．５μｇを、制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中、３７℃で１時間消化し、その後、１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔを用いて、ｐＡＴｔｒｐＥベクターのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ断片を精製した。
　Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇプラスミドのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ断片とｐＡＴｔｒｐＥベクターのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ断片の連結反応を、１０×リガーゼ用緩衝液〔６６０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１００ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ〕５μｌとＴ４リガーゼ１μｌ（３５０単位／μｌ）に水を加えて５０μｌとし、１６℃で一晩保温して行なった。ｐＡＴｔｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ発現プラスミドを得るために、得られた連結反応液を用いて大腸菌ＢＬ２１株を形質転換した。アンピシリン耐性で、寒天培地上での平板培養で生育した形質転換体を選び、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌとなるよう加えた２ＹＴ培地にて培養した。
　１．５ｍｌの菌培養液を遠心して集菌し、プラスミドＤＮＡのミニプレパレーションをアルカリ法〔Ｍａｎｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２）〕により行なった。得られたプラスミドＤＮＡ１μｇを、制限酵素反応液２０μｌ〔５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１５単位のＥｃｏＲＩおよび１５単位のＢａｍＨＩ酵素〕中、３７℃で１時間消化し、その後、１．２％アガロースゲル電気泳動を行い、約２６０ｂｐのＥｃｏＲＩ－ＢａｍＨＩ断片が生じるｐＡＴｔｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ発現プラスミドを選別した。
（Ｃ）ＴｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ融合抗原の発現および精製
　ｐＡＴｔｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ発現プラスミドをもつ大腸菌ＢＬ２１株を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む３ｍｌの２ＹＴ培地に接種し、３７℃で９時間培養した。得られた培養液１ｍｌを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＭ９－ＣＡ培地（０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．５％ＫＨ２ＰＯ４、０．５％ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．５％カザミノ酸、０．２％グルコース）に植え継ぎ、３７℃で培養した。ＯＤ６００＝０．３の時に終濃度４０ｍｇ／ｌになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに１６時間培養した。得られた培養液を５Ｋｒｐｍで１０分間遠心して集菌した。
　集めた菌体に、２０ｍｌの０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．３）（ＰＢＳ）を加えて懸濁し、再び遠心して、ＴｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ融合抗原の発現している菌体を約２ｇ得た。得られた菌体をＰＢＳ１０ｍｌ中に再懸濁し、超音波破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心し、ＴｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ融合抗原を含む可溶性画分を得た。得られた可溶性画分に、尿素とジチオスレイトールを、それぞれ最終濃度が６Ｍと２ｍＭになるように添加した後、Ｈｉｓ　ＧｒａｖｉＴｒａｐカラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用い、メーカーの推奨する方法に従ってアフィニティークロマトを行い、ＴｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ融合抗原を精製した。
参考例２：抗ヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体の作製
（Ａ）ハイブリドーマの作製
　抗ヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体を作製するため、マウスへの免疫を以下のようにして行った。免疫抗原はＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇのＣ末端１１アミノ酸ペプチド（ＱＨＡＲＡＳＨＬＧＬＡ：配列番号３）のＫＬＨコンジュゲートとし、１０μｇ（ペプチド相当）をアジュバントであるＴｉｔｅｒＭａｘ　Ｇｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭａｘ　ＵＳＡ）とともにＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内投与した。２～４週間ごとに同様の追加免疫を行い、さらにＰＢＳに溶解したペプチド１０μｇを最終免疫として尾静脈内に投与した。
　最終免疫後３日目にマウスから脾臓を無菌的に摘出し、ハサミおよび金属メッシュを用いて脾臓を個々の細胞にほぐし、ＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄した。対数増殖期のマウス骨髄腫細胞株Ｓｐ２／０－Ａｇ１４をＲＰＭＩ－１６４０培地で３回洗浄後、この細胞と脾臓細胞を１：５の細胞数比で混合した。２００×ｇで５分間遠心した後、上清を除去し、細胞隗を緩やかに混合しながら５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４０００（Ｍｅｒｃｋ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地１ｍｌをゆっくりと加え、さらにＲＰＭＩ－１６４０培地１０ｍｌを加えて細胞融合させた。
　得られた融合細胞を、２００×ｇで５分間遠心してＰＥＧを除いた後、１０％ウシ胎児血清およびヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地に懸濁し、９６ウエル細胞培養プレートに播種した。約１０日間培養してハイブリドーマのみを増殖させた後、免疫抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するクローンをＥＬＩＳＡ法により検索し、所望のハイブリドーマを得、限界希釈法により単一クローン化を行い、ハイブリドーマを樹立した。
（Ｂ）抗ヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体の作製および解析
　（Ａ）で樹立したハイブリドーマの１つ（クローン名：Ｃ３ａｄ－５）を、無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ－ＳＦＭ、ＧＩＢＣＯ）を用い、３７℃にて５％炭酸ガス中において７２～９６時間培養した。培地中に産生されたモノクローナル抗体を精製するため、その培養液を、プロテインＡセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
　Ｃ３ａｄ－５が産生するモノクローナル抗体について、抗マウスＩｇ各アイソタイプ抗体を用いたアイソタイプタイピングキット（Ｚｙｍｅｄ）により、サブクラスを同定した結果、ＩｇＧ２ａであることがわかった。また、Ｃ３ａｄ－５が産生するモノクローナル抗体は、市販のヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ精製物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に反応するが、市販のヒトＣ３ａ精製物（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）に反応しないことから、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体であることがわかった。
参考例３：ヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを検出するためのモノクローナル抗体の作製
　免疫抗原としてＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇのＮ端側１６アミノ酸ペプチド（ＫＲＭＤＫＶＧＫＹＰＫＥＬＲＫＣ：配列番号４）のＫＬＨコンジュゲートを用いること以外は参考例２と同様にして、所望のハイブリドーマを樹立した。その１つ（クローン名：Ｃ３Ｎ－６）が産生するモノクローナル抗体について、参考例２と同様にしてサブクラスを同定した結果、ＩｇＧ１であることがわかった。また、Ｃ３Ｎ－６が産生するモノクローナル抗体は、市販のヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ精製物および市販のヒトＣ３ａ精製物に反応することから、ヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを検出するためのモノクローナル抗体として用いることができることがわかった。
実施例１：Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度に基づく頸動脈ＩＭＴの程度の階層化
　頸動脈壁肥厚が認められることでアテローム血栓症およびその危険因子を持つと判断された７７名の患者（ＡＴＩＳ関連患者）と、頸動脈壁肥厚の程度が重度であることから頸動脈内膜剥離術（ＣＥＡ）の施行が必要と判断された３９名の患者（ＣＥＡ患者）について、それぞれの患者から同意を得て、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２の血中濃度を測定した。Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２の血中濃度の測定は、それぞれ後述するＥＬＩＳＡ法により行った。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＡＴＩＳ関連患者の７７例とＣＥＡ患者の３９例の両群のＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度の測定結果を、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により比較したところ、それぞれｐ＜０．０００１とｐ＝０．０１０２で両群を区分することができた（図１）。さらに、頸動脈ＩＭＴの測定を行っているＡＴＩＳ関連患者の７７例とＣＥＡ患者の３１例の合計１０８例について、左右の総頸動脈の遠位壁（ｆａｒ　ｗａｌｌ）の最大ＩＭＴ（ＩＭＴ－Ｃｍａｘ）の合計値で２群（壁肥厚が３ｍｍ未満の軽度な群と３ｍｍ以上の重度な群）に分け、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度の測定結果を、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により比較したところ、それぞれｐ＜０．０００１とｐ＝０．０２５４で両群を区分することができた（図２）。この結果は、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ検定による検討においても確認することができた。以上の結果から、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度が高いほど頚動脈壁肥厚の程度が強く、これらの血中濃度に基づいて、頸動脈ＩＭＴの程度を階層化することができることがわかった。また、上記の２群（肥厚が３ｍｍ未満の軽度な群と３ｍｍ以上の重度な群）の区別の、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度からの予測可能性を、ロジスティック回帰モデルを用いて１０－ｆｏｌｄ　ｃｒｏｓｓ－ｖａｌｉｄａｔｉｏｎで検証したところ、ＡＢＩ（足関節／上腕インデックス）を説明変数として予測したＲＯＣ曲線のＡＵＣ（曲線下面積）が０．６３６であるのに対して、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度の２変数を説明変数として予測したＲＯＣ曲線のＡＵＣは０．７８７であり、前者よりも後者の方が予測精度が高いことから、頚動脈壁肥厚の程度を検知する上において、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇとＳ１００Ａ１２のそれぞれの血中濃度を併用することの有用性を確認することができた。
（Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇの血中濃度の測定のためのＥＬＩＳＡ法のプロトコル）
　参考例２で作製した抗ヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ特異的モノクローナル抗体（Ｃ３ａｄ－５）を、終濃度が５μｇ／ｍｌになるように０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）１ウエルにつき１００μｌづつ分注した。４℃で一晩静置した後、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（以下「洗浄液」）０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを２回洗浄した。その後、０．５％カゼイン－Ｎａを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（以下「ブロッキング液」）０．３５ｍｌをそれぞれのウエルに添加し、さらに室温で４時間静置した。ブロッキング液を除去した後、０．２Ｍ　ＮａＣｌと１％ＢＳＡと０．０７％カゼイン－Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）９０μｌと、測定試料（血清）または段階的に希釈した標準物質（参考例１で調製したＴｒｐＥ－Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ融合抗原）１０μｌを、それぞれのウエルに添加して１００μｌとし、室温で１時間反応させた。反応後、洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを５回洗浄した。その後、参考例３で作製したヒトＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを検出するためのモノクローナル抗体（Ｃ３Ｎ－６）をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識して調製した標識抗体液（０．２Ｍ　ＮａＣｌと１％ＢＳＡと０．０７％カゼイン－Ｎａを含む１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３））１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、室温で１時間反応させた。洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを５回洗浄した後、基質（オルトフェニレンジアミン）溶液１００μｌを添加し、室温暗所で３０分間反応させた。反応後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９０）を測定することで、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇの血中濃度を測定した。
（Ｓ１００Ａ１２の血中濃度の測定のためのＥＬＩＳＡ法のプロトコル）
　Ａ．ＫＯＳＡＫＩ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２００４，８９（１１）：５４２３－５４２８に記載のＥＬＩＳＡ法を改変して行った。具体的には、次のようにして行った。抗ヒトＳ１００Ａ１２特異的モノクローナル抗体（ｈＣＦ１２８）を、終濃度が０．３μｇ／ｍｌになるように０．５Ｍ　ＮａＣｌとＢＳＡ１μｇ／ｍｌを含む１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）で希釈し、９６ウエルマイクロプレート（ヌンク社）１ウエルにつき１００μｌづつ分注した。４℃で一晩静置した後、０．１５Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）（以下「洗浄液」）０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを２回洗浄した。その後、０．１５Ｍ　ＮａＣｌと１％ＢＳＡを含む２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）（以下「ブロッキング液」）０．３５ｍｌをそれぞれのウエルに添加し、さらに室温で４時間静置した。ブロッキング液を除去した後、０．１５Ｍ　ＮａＣｌと１％ＢＳＡと１ｍＭ　ＥＤＴＡ－３Ｎａを含む２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）９０μｌと、測定試料（血清）または段階的に希釈した標準物質（組換えＳ１００Ａ１２抗原）１０μｌを、それぞれのウエルに添加して１００μｌとし、室温で３０分間反応させた。反応後、洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを４回洗浄した。その後、ヒトＳ１００Ａ１２を検出するためのモノクローナル抗体（ｈＣＦ１１３）をペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識して調製した標識抗体液（０．１５Ｍ　ＮａＣｌと１％ＢＳＡと１ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４））１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、室温で３０分間反応させた。洗浄液０．３５ｍｌを用いてそれぞれのウエルを４回洗浄した後、基質（オルトフェニレンジアミン）溶液１００μｌを添加し、室温暗所で２０分間反応させた。反応後、２Ｎ硫酸溶液１００μｌをそれぞれのウエルに添加し、波長６３０ｎｍの吸光度を対照として波長４９０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４９０）を測定することで、Ｓ１００Ａ１２の血中濃度を測定した。
実施例２：Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇの血中濃度に基づく頸動脈ＩＭＴの程度の階層化（その２）
　Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇの血中濃度の測定のために、市販のＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ測定用キット（Ｈｕｍａｎ　Ｃ３ａ　ＥＬＩＳＡ　Ｋｉｔ、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いること以外は、実施例１と同様の実験を行った（但しＡＴＩＳ関連患者は３０例でＣＥＡ患者は３１例）。結果を図３に示す。図３から明らかなように、市販のＣ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ測定用キットを用いても、ＡＴＩＳ関連患者の群とＣＥＡ患者の群をｐ＜０．０００１で区分することができた。また、左右の総頸動脈の遠位壁の最大ＩＭＴの合計値が３ｍｍ未満の群と３ｍｍ以上の群をｐ＜０．０００１で区分することができた。
　本発明は、アテローム血栓症のイベントリスクの判定や、アテローム血栓症に対する治療効果の判定などを行うために有用な、動脈壁肥厚の程度の検知方法を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims (5)

  1. 　アルギニン欠損型補体成分Ｃ３ａ（Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇ）、および／または、カルシウム結合性タンパク質であるＳ１００Ａ１２の血液中の存在量が多いほど、動脈壁肥厚の程度が強いと判断する、動脈壁肥厚の程度の検知方法。
  2. 　Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇの血液中の存在量の測定を、Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行う、請求項１記載の方法。
  3. 　Ｓ１００Ａ１２の血液中の存在量の測定を、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行う、請求項１記載の方法。
  4. 　Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体、および／または、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体の、動脈壁肥厚の程度を検知するための使用。
  5. 　Ｃ３ａ－ｄｅｓＡｒｇを特異的に認識する抗体、および／または、Ｓ１００Ａ１２を特異的に認識する抗体を少なくとも含む、動脈壁肥厚の程度を検知するためのキット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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