JP6687245B2 - 動脈壁肥厚の程度の検知方法 - Google Patents
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Description
また、請求項2記載の方法は、請求項1記載の方法において、C3a−desArgの血液中の存在量の測定を、C3a−desArgを特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行うことによる。
また、請求項3記載の方法は、請求項1記載の方法において、S100A12の血液中の存在量の測定を、S100A12を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行うことによる。
また、本発明は、請求項4記載の通り、C3a−desArgを特異的に認識する抗体、および/または、S100A12を特異的に認識する抗体の、頸動脈IMTの程度を階層化するための使用である。
また、本発明は、請求項5記載の通り、C3a−desArgを特異的に認識する抗体、および/または、S100A12を特異的に認識する抗体を少なくとも含む、頸動脈IMTの程度を階層化するためのキットである。
(A)C3a−desArg遺伝子のクローニング
ヒト肝癌細胞株であるHuh7細胞より、全RNAを、High Pure Viral Nucleic Acid Kit(Roche diagnostics corporation)を用いてメーカーの推奨する方法に従って精製した。得られた核酸にC3ad−asプライマー(5’−ggatccttaggccaggcccaggtggctggcccgcgc−3’:配列番号1)を加え、SuperSucript II reverse transcriptase(Invitrogen)により、メーカーの推奨する条件で、42℃で1時間逆転写反応を行い、cDNAを得た。
クローニングされたC3a−desArgプラスミド0.5μgを、制限酵素反応液20μl〔50mM Tris−HCl(pH7.5)、10mM MgCl2、1mMジチオスレイトール、100mM NaCl、15単位のEcoRIおよび15単位のBamHI酵素〕中、37℃で1時間消化し、その後、1.2%アガロースゲル電気泳動を行い、QIAquick gel purification kitを用いて、約260bpのEcoRI−BamHI断片を精製した。
pATtrpE−C3a−desArg発現プラスミドをもつ大腸菌BL21株を、50μg/mlのアンピシリンを含む3mlの2YT培地に接種し、37℃で9時間培養した。得られた培養液1mlを、50μg/mlのアンピシリンを含む100mlのM9−CA培地(0.6%Na2HPO4、0.5%KH2PO4、0.5%NaCl、0.1%NH4Cl、0.1mM CaCl2、2mM MgSO4、0.5%カザミノ酸、0.2%グルコース)に植え継ぎ、37℃で培養した。OD600=0.3の時に終濃度40mg/lになるようにインドールアクリル酸を加え、さらに16時間培養した。得られた培養液を5Krpmで10分間遠心して集菌した。
(A)ハイブリドーマの作製
抗ヒトC3a−desArg特異的モノクローナル抗体を作製するため、マウスへの免疫を以下のようにして行った。免疫抗原はC3a−desArgのC末端11アミノ酸ペプチド(QHARASHLGLA:配列番号3)のKLHコンジュゲートとし、10μg(ペプチド相当)をアジュバントであるTiterMax Gold(TiterMax USA)とともにBALB/cマウスに腹腔内投与した。2〜4週間ごとに同様の追加免疫を行い、さらにPBSに溶解したペプチド10μgを最終免疫として尾静脈内に投与した。
(A)で樹立したハイブリドーマの1つ(クローン名:C3ad−5)を、無血清培地(Hybridoma−SFM、GIBCO)を用い、37℃にて5%炭酸ガス中において72〜96時間培養した。培地中に産生されたモノクローナル抗体を精製するため、その培養液を、プロテインAセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
免疫抗原としてC3a−desArgのN端側16アミノ酸ペプチド(KRMDKVGKYPKELRKC:配列番号4)のKLHコンジュゲートを用いること以外は参考例2と同様にして、所望のハイブリドーマを樹立した。その1つ(クローン名:C3N−6)が産生するモノクローナル抗体について、参考例2と同様にしてサブクラスを同定した結果、IgG1であることがわかった。また、C3N−6が産生するモノクローナル抗体は、市販のヒトC3a−desArg精製物および市販のヒトC3a精製物に反応することから、ヒトC3a−desArgを検出するためのモノクローナル抗体として用いることができることがわかった。
頸動脈壁肥厚が認められることでアテローム血栓症およびその危険因子を持つと判断された77名の患者(ATIS関連患者)と、頸動脈壁肥厚の程度が重度であることから頸動脈内膜剥離術(CEA)の施行が必要と判断された39名の患者(CEA患者)について、それぞれの患者から同意を得て、C3a−desArgとS100A12の血中濃度を測定した。C3a−desArgとS100A12の血中濃度の測定は、それぞれ後述するELISA法により行った。結果を表1に示す。
参考例2で作製した抗ヒトC3a−desArg特異的モノクローナル抗体(C3ad−5)を、終濃度が5μg/mlになるように0.5M NaClを含む100mM炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9.6)で希釈し、96ウエルマイクロプレート(ヌンク社)1ウエルにつき100μlづつ分注した。4℃で一晩静置した後、0.15M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)(以下「洗浄液」)0.35mlを用いてそれぞれのウエルを2回洗浄した。その後、0.5%カゼイン−Naを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)(以下「ブロッキング液」)0.35mlをそれぞれのウエルに添加し、さらに室温で4時間静置した。ブロッキング液を除去した後、0.2M NaClと1%BSAと0.07%カゼイン−Naを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)90μlと、測定試料(血清)または段階的に希釈した標準物質(参考例1で調製したTrpE−C3a−desArg融合抗原)10μlを、それぞれのウエルに添加して100μlとし、室温で1時間反応させた。反応後、洗浄液0.35mlを用いてそれぞれのウエルを5回洗浄した。その後、参考例3で作製したヒトC3a−desArgを検出するためのモノクローナル抗体(C3N−6)をペルオキシダーゼ(POD)標識して調製した標識抗体液(0.2M NaClと1%BSAと0.07%カゼイン−Naを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3))100μlをそれぞれのウエルに添加し、室温で1時間反応させた。洗浄液0.35mlを用いてそれぞれのウエルを5回洗浄した後、基質(オルトフェニレンジアミン)溶液100μlを添加し、室温暗所で30分間反応させた。反応後、2N硫酸溶液100μlをそれぞれのウエルに添加し、波長630nmの吸光度を対照として波長490nmにおける吸光度(OD490)を測定することで、C3a−desArgの血中濃度を測定した。
A.KOSAKI et al.,J Clin Endocrinol Metab,November 2004,89(11):5423−5428に記載のELISA法を改変して行った。具体的には、次のようにして行った。抗ヒトS100A12特異的モノクローナル抗体(hCF128)を、終濃度が0.3μg/mlになるように0.5M NaClとBSA1μg/mlを含む100mM炭酸水素ナトリウム緩衝液(pH9.6)で希釈し、96ウエルマイクロプレート(ヌンク社)1ウエルにつき100μlづつ分注した。4℃で一晩静置した後、0.15M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)(以下「洗浄液」)0.35mlを用いてそれぞれのウエルを2回洗浄した。その後、0.15M NaClと1%BSAを含む20mM HEPES緩衝液(pH7.4)(以下「ブロッキング液」)0.35mlをそれぞれのウエルに添加し、さらに室温で4時間静置した。ブロッキング液を除去した後、0.15M NaClと1%BSAと1mM EDTA−3Naを含む20mM HEPES緩衝液(pH7.4)90μlと、測定試料(血清)または段階的に希釈した標準物質(組換えS100A12抗原)10μlを、それぞれのウエルに添加して100μlとし、室温で30分間反応させた。反応後、洗浄液0.35mlを用いてそれぞれのウエルを4回洗浄した。その後、ヒトS100A12を検出するためのモノクローナル抗体(hCF113)をペルオキシダーゼ(POD)標識して調製した標識抗体液(0.15M NaClと1%BSAと1mM CaCl2を含む20mM HEPES緩衝液(pH7.4))100μlをそれぞれのウエルに添加し、室温で30分間反応させた。洗浄液0.35mlを用いてそれぞれのウエルを4回洗浄した後、基質(オルトフェニレンジアミン)溶液100μlを添加し、室温暗所で20分間反応させた。反応後、2N硫酸溶液100μlをそれぞれのウエルに添加し、波長630nmの吸光度を対照として波長490nmにおける吸光度(OD490)を測定することで、S100A12の血中濃度を測定した。
C3a−desArgの血中濃度の測定のために、市販のC3a−desArg測定用キット(Human C3a ELISA Kit、BD Biosciences)を用いること以外は、実施例1と同様の実験を行った(但しATIS関連患者は30例でCEA患者は31例)。結果を図3に示す。図3から明らかなように、市販のC3a−desArg測定用キットを用いても、ATIS関連患者の群とCEA患者の群をp<0.0001で区分することができた。また、左右の総頸動脈の遠位壁の最大IMTの合計値が3mm未満の群と3mm以上の群をp<0.0001で区分することができた。
Claims (5)
- アルギニン欠損型補体成分C3a(C3a−desArg)、および/または、カルシウム結合性タンパク質であるS100A12の血液中の存在量が多いほど、頸動脈IMT(内膜中膜複合体厚)の程度が強いことを示す、頸動脈IMTの程度を階層化するための方法。
- C3a−desArgの血液中の存在量の測定を、C3a−desArgを特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行う、請求項1記載の方法。
- S100A12の血液中の存在量の測定を、S100A12を特異的に認識する抗体を用いて免疫学的手法によって行う、請求項1記載の方法。
- C3a−desArgを特異的に認識する抗体、および/または、S100A12を特異的に認識する抗体の、頸動脈IMTの程度を階層化するための使用。
- C3a−desArgを特異的に認識する抗体、および/または、S100A12を特異的に認識する抗体を少なくとも含む、頸動脈IMTの程度を階層化するためのキット。
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