JP6667898B2 - 動脈狭窄の程度を検知する方法 - Google Patents
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Description
また、請求項2記載の方法は、請求項1記載の方法において、2価の金属イオンがカルシウムイオンである。
また、本発明の動脈狭窄の程度を検知するための検体を調製する方法は、請求項3記載の通り、EDTA血漿検体に、2価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えることによる。
また、本発明は、請求項4記載の通り、EDTA血漿検体に、2価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えた検体の、動脈狭窄の程度を検知するための検体としての使用である。
(A)ハイブリドーマの作製
C3aとC3a−desArgの両方を認識するモノクローナル抗体を作製するため、マウスへの免疫を以下のようにして行った。免疫抗原はC3a−desArgのC末端11アミノ酸ペプチド(QHARASHLGLA:配列番号1)のKLHコンジュゲートとし、10μg(ペプチド相当)をアジュバントであるTiterMax Gold(TiterMax USA)とともにBALB/cマウスに腹腔内投与した。2〜4週間ごとに同様の追加免疫を行い、さらにPBSに溶解したペプチド10μgを最終免疫として尾静脈内に投与した。
(A)で樹立したハイブリドーマの1つ(クローン名:C3a−19)を、無血清培地(Hybridoma−SFM、GIBCO)を用い、37℃にて5%炭酸ガス中において72〜96時間培養した。培地中に産生されたモノクローナル抗体を精製するため、その培養液を、プロテインAセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
免疫抗原としてC3a−desArgのN端側16アミノ酸ペプチド(KRMDKVGKYPKELRKC:配列番号2)のKLHコンジュゲートを用いること以外は参考例1と同様にして、所望のハイブリドーマを樹立した。その1つ(クローン名:C3N−6)が産生するモノクローナル抗体について、参考例1と同様にしてサブクラスを同定した結果、IgG1であることがわかった。また、C3N−6が産生するモノクローナル抗体は、市販のヒトC3a精製物と市販のヒトC3a−desArg精製物の両方に反応することがわかった。
(実験方法)
頚動脈狭窄の程度が軽度(ECST法によるSRが60%未満)で血管イベントの既往がない48例(CAS SR<60% w/o events群)と、頸動脈狭窄の程度が重度(ECST法によるSRが60%以上)であることから頸動脈内膜剥離術の施行が必要と判断された75例(CAS SR≧60%群)について、それぞれの患者から同意を得てEDTA血漿検体を採取した。検体をリン酸緩衝液によりpH6.0に調整した後、CaCl2とへパリンNa(WAKO)を最終濃度がそれぞれ10mMと8Unit/mlになるように同時に加え(CaCl2の添加量はEDTAのモル数の2倍モル量)、37℃で1時間保温してから、後述するプロトコルに従ってELISAを行い、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定を行った。なお、採血してから血漿を分離するまでの時間や、血漿を分離してからC3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定を開始するまでの時間の経過の違いにより、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量が変化することはほとんどないことを予め確認していたので、これらの時間は特に定めなかった。
CAS SR<60% w/o events群の48例とCAS SR≧60%群の75例の両群の、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定結果を、Mann−Whitney検定により比較したところ、p<0.0001で両群を区分することができた(図1)。また、両群について、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量から予測したROC曲線のAUC(曲線下面積)は0.8963であり、頸動脈狭窄の程度の違いによって両群を区別する上において、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を測定することの有用性を確認することができた(図2)。ROC解析の結果から、暫定的に設定したカットオフ値(40.0nmol/l)を用いて両群を見極めることの可能性を評価すると、表1に示すように、感度84.0%(63/75)、特異度81.3%(39/48)、正診率82.9%(102/103)となり、頸動脈狭窄の程度の違いによる両群の見極めが可能であると考えられた。検体にCaCl2を加えるのと同時にヘパリンNaを加えたことで、例えばピペッティング操作の妨げとなるような血液凝固物の生成は認められなかった。
参考例2で作製したモノクローナル抗体(C3N−6)を、終濃度が5μg/mlになるように0.15M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)で希釈し、96ウエルマイクロプレート(ヌンク社)1ウエルにつき100μlづつ分注した。4℃で一晩静置した後、0.15M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)0.35mlを用いてそれぞれのウエルを2回洗浄した。その後、0.5%カゼイン−Naを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)(以下「ブロッキング液」)0.35mlをそれぞれのウエルに添加し、さらに室温で4時間静置した。ブロッキング液を除去した後、0.2M NaClと1%BSAと0.07%カゼイン−Naを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)90μlと、検体または段階的に希釈した標準物質(特許文献1に記載の方法で調製したTrpE−C3a−desArg融合抗原)10μlを、それぞれのウエルに添加して100μlとし、室温で1時間反応させた。反応後、0.15M NaClと0.05% Tween20を含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3)(以下「洗浄液」)0.35mlを用いてそれぞれのウエルを5回洗浄した。その後、参考例1で作製したモノクローナル抗体(C3a−19)をペルオキシダーゼ(POD)標識して調製した標識抗体液(0.2M NaClと1%BSAと0.07%カゼイン−Naを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.3))100μlをそれぞれのウエルに添加し、室温で30分間反応させた。洗浄液0.35mlを用いてそれぞれのウエルを5回洗浄した後、基質(オルトフェニレンジアミン)溶液100μlを添加し、室温暗所で30分間反応させた。反応後、2N硫酸溶液100μlをそれぞれのウエルに添加し、波長630nmの吸光度を対照として波長490nmにおける吸光度(OD490)を測定することで、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を測定した。
Rodriguezらの方法(JBC 290,2334−2350,2015)に従い、市販のヒトC3精製物(Calbiochem)を、200mMヒドラジンと0.15M NaClを含む10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0)中、37℃で2時間反応させ、C3の加水化物であるC3(H2O)を産生させた。反応終了後の試料について、実施例1に記載したプロトコルに従ってELISAを行ったところ、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量は775.8nmol/lであった。これに対し、ヒドラジンを加えないこと以外は同じ条件で実験を行って得た試料のC3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量は75.3nmol/lであったことから、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体によってC3の加水化物であるC3(H2O)が検出されることがわかった。血液中にはC3(H2O)とともにC3a−desArgが存在し、C3a−desArgも、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出されることと、血液中にC3aが存在したとしてもすぐさまカルボキシペプチダーゼNによってC3a−desArgに変換されることを考えれば、本発明の方法においてC3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される血液中の物質は、C3(H2O)とC3a−desArgの2者であり、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量は、両者の存在量の合計量であると推察された。C3(H2O)とC3a−desArgの存在量の合計量の違いが、動脈狭窄の程度の違いを反映するのは、C3カスケードの第2経路の進行に関与する酵素、とりわけ、C3が加水化されることによるC3(H2O)への構造変換に関与する酵素の量や活性の違いによるものではないかと本発明者らは考察している。
EDTA血漿検体をリン酸緩衝液によりpH6.0に調整した後、CaCl2とへパリンNaを最終濃度がそれぞれ10mMと1,4,8,12Unit/mlになるように同時に加え、37℃で1時間保温してから、実施例1と同様にしてELISAを行い、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定を行った。CAS SR≧60%群のEDTA血漿検体3例についての結果を表3に示す。表3には、CaCl2とへパリンNaを加えない、リン酸緩衝液によりpH6.0に調整したEDTA血漿検体について、実施例1と同様にしてELISAを行い、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量の測定を行った結果をあわせて示す(「無処理」のカラム)。表3から明らかなように、EDTA血漿検体にCaCl2とへパリンNaを同時に加えて37℃で1時間保温することで、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量が増加した。へパリンNaの最終濃度が1Unit/mlの場合でも、例えばピペッティング操作の妨げとなるような血液凝固物の生成は認められなかった。検体にCaCl2だけを加えてヘパリンNaを加えなかった場合、例えばピペッティング操作の妨げとなるような血液凝固物の生成が認められた。
Claims (4)
- EDTA血漿検体に、2価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えた検体中の、C3aとC3a−desArgの両方を認識する抗体で検出される物質の存在量を指標とすることによる動脈狭窄の程度を検知する方法。
- 2価の金属イオンがカルシウムイオンである請求項1記載の方法。
- EDTA血漿検体に、2価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えることによる動脈狭窄の程度を検知するための検体を調製する方法。
- EDTA血漿検体に、2価の金属イオンと、抗凝固剤としてヘパリンまたはその塩を加えた検体の、動脈狭窄の程度を検知するための検体としての使用。
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