WO2015163718A1 - 퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 - Google Patents

퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법 Download PDF

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양영렬
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant microorganism for producing putrescine and a method for producing putrescine using the same.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct containing all the elements necessary for its expression.
  • the expression cassette may include a promoter, a transcription termination signal, a ribosomal binding site, and a translation termination signal, which are typically operably linked to the polynucleotide.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self replication.
  • the polynucleotide may be introduced into the host cell in its own form and operably linked with a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • CM medium glucose 10 g / L, polypeptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, beef extract 5 g / L, NaCl 2.5 g / L, urea 2 g / L, pH 6.8
  • Shake culture (30 °C, 8 hours), and diluted sequentially from 10 -4 to 10 -10 , respectively, plated and cultured in X-gal-containing solid medium to form colonies.
  • Strains that lack the gene encoding NCgl2523 by secondary crossover were finally selected by selecting white colonies appearing at relatively low rates among the colonies formed.
  • NCgl2523 was deleted, and the Corynebacterium glutamicum mutant KCCM11138P ⁇ NCgl2523 and KCCM11240P ⁇ , respectively. It was named NCgl2523.
  • the cell-adsorbed filter was washed twice with 10 ml of cooling water, and then immersed in methanol containing 5 M morpholine ethanesulfonic acid and 5 M methionine sulfone for 10 minutes. After the same amount of chloroform and 0.4 times the volume of the well mixed with the extracted solution, only the aqueous phase (aqueous phase) was applied to the spin column (spin column) to remove protein contaminants. The filtered extract was analyzed using capillary electrophoresis mass spectrometry, and the results are shown in Table 3 below.

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Abstract

본 발명은 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 불활성화되어 고수율로 퓨트레신을 생산할 수 있는 재조합 미생물 및 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

퓨트레신 생산 변이주 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
본 발명은 퓨트레신을 생산하기 위한 재조합 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
바이오제닉 아민(biogenic amines, BAs)은 아미노산의 탈탄산 작용, 알데하이드와 케톤의 아미노화와 아미노기 전이 반응에 의해 주로 생성되는 질소 화합물이다. 이러한 바이오제닉 아민은 저분자량이며 미생물, 식물과 동물의 대사 과정에서 합성되므로 이들 세포에서 흔히 발견되는 구성요소로 알려져 있다. 특히, 스퍼미딘(spermidine), 스퍼민(spermine), 퓨트레신(putrescine 또는 1,4-butanediamine) 및 카다베린(cadaverine) 등과 같은 폴리아민(polyamine)은 대부분의 살아있는 세포 내에 존재하는 물질이다.
이 중 퓨트레신은 아디프산(adipic acid)과 반응하여 폴리아민 나일론-4,6을 합성하는 중요한 원료물질로서, 주로 프로필렌(propylene)으로부터 아크릴로니트릴(acrylonitrile) 및 숙시노니트릴(succinonitrile)을 거치는 화학 합성법으로 주로 생산된다.
또한, 대장균과 코리네박테리움 미생물을 형질전환하여 퓨트레신을 고농도로 생산하는 방법이 공개되었다(국제특허공개 WO06/005603; 국제특허공개 WO09/125924; Qian ZD et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4): 651-662, 2009; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 88(4): 859-868, 2010; Schneider et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 95: 169-178., 2012). 나아가, 퓨트레신 트랜스포터(transporter)에 관한 연구가 대장균, 효모, 식물 및 동물 세포를 대상으로 활발히 수행되고 있다(K Igarashi, Plant Physiol. Biochem. 48: 506-512, 2010).
한편, 본 발명자들은 퓨트레신 생산 경로를 포함한 코리네박테리움 속 미생물에서 NCgl2522를 코딩하는 막단백질이 퓨트레신의 배출 단백질로서 기능함을 밝히고 NCgl2522의 활성을 내재적 활성에 비해 강화시키면 퓨트레신을 고수율로 생산할 수 있음을 확인한 바 있다(대한민국 특허출원 제10-2013-0030020호)
또한, NCgl2523 유전자는 TetR 패밀리에 속하는 다약제 내성 관련 전사 인자(multidrug-resistance-related transcription factor)로서 NCgl2522의 발현 억제자로 작용한다고 알려져 있다(Hirochi et. al. J Biol. Chem. 280:46, 38711-38719. 2005).
본 발명자들은 지속적으로 연구를 수행하여 NCgl2522 오페론을 구성하고 있는 NCgl2523을 결손시키면, NCgl2522의 활성을 강화시킨 효과와 유사하게 퓨트레신 생산량이 향상되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 퓨트레신을 고수율로 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 미생물을 이용하여 퓨트레신을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 퓨트레신 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 불활성화되도록 변형되어 퓨트레신 배출 단백질로 추정되는 단백질, 구체적으로 NCgl2522의 활성 강화를 유도하고, 이로 인해 세포 외로 퓨트레신의 배출을 증가시킬 수 있으므로 퓨트레신의 생산에 효과적으로 활용될 수 있다.
도 1은 NCgl2523 주변 유전자의 조합 형태를 나타낸 모식도이다. 구체적으로, NCgl2523을 포함하는 미생물의 주변 유전자의 조합 형태인 NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524 조합 형태(Type 1); NCgl2522-NCgl2523 조합 및 NCgl2524 단독 형태(Type 2); 또는 NCgl2522-NCgl2523 조합 형태(Type 3)를 나타내는 모식도이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에서 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 불활성화되어 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 미생물이 추가로 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성이 도입된 것인, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 구체예는 상기 ODC가 서열번호: 10의 아미노산 서열을 가지는 것인, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 미생물이 추가적으로 아세틸트렌스퍼라아제의 활성이 불활성화된, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 아세틸트렌스퍼라아제가 서열번호: 15 또는 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 구체예는 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는
i) 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 불활성화되어 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
ii) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 구체예는 상기 코리네박테리움 속 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰인, 퓨트레신 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태는 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에서 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질, 즉 NCgl2523의 활성이 불활성화되어 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물에 대한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "NCgl2523"은 TetR 패밀리에 속하는 다약제 내성 관련 전사 인자(multidrug-resistance-related transcription factor)로서 NCgl2522의 발현 억제자로 작용하는 것으로 알려져 있다(Hirochi et. al., J Biol. Chem. 280(46): 38711-38719, 2005).
본 발명에서 NCgl2523은 서열번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 Ncgl2522의 발현 억제자로서의 활성을 가지는 단백질이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
또한, 미생물의 종 또는 균주에 따라 상기 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, 이에 한정되지 않는다. 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호: 2의 단백질과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다.
상기에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 발명의 NCgl2523을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 NCgl2523 단백질과 유사한 활성을 가지는 한, 서열번호: 2의 아미노산 서열 또는 상기 서열과 70% 이상, 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상, 보다 더욱 구체적으로는 95% 이상, 더욱더 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 특히, 서열번호: 1 또는 3의 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 NCgl2523을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호: 1 또는 3의 염기서열 또는 상기 염기서열로부터 유래된 프로브(probe)와 엄격한 조건(stringent conditions)에서 혼성화될 수 있고, 정상적으로 기능하는 NCgl2523을 코딩하는 변이형일 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 엄격한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다.
본 발명에서는 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물에서 NCgl2522 오페론을 구성하고 있는 NCgl2523을 결손시키면 NCgl2522의 활성을 강화시킨 경우와 유사하게 퓨트레신 생산량이 향상되는 것을 확인하였다. 이를 근거로 본 발명은 NCgl2523의 활성이 불활성화되어 NCgl2522의 발현 억제가 해제됨으로써 고수율의 퓨트레신 생산성을 나타내는 재조합 미생물을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시예에서 개시하고 있는 바와 같이 상기 NCgl2523과 이와 유사한 서열을 가지는 아미노산을 가지며 해당 아미노산이 NCgl2522와 오페론을 구성하는 미생물 또는 NCgl2523이 NCgl2522의 발현조절자로서 기능하는 것과 유사한 기능을 하는 미생물에서는 해당 NCgl2523과 이와 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 불활성화시킴으로써 퓨트레신 생산능이 향상될 수 있다.
본 발명에서 용어 "불활성화"란, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나, 유전자 발현에 있어 특정의 감소를 나타내거나, 발현되더라도 기능성이 있는 해당 폴리펩티드를 생산하지 않는 것을 의미한다.
또한, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 완전하게 불활성화되어 있는 것뿐만 아니라 그 발현 수준이 야생형에 비하여 약화되거나 현저하게 낮아 실질적으로 발현되지 않는 것도 포함되는 의미이다. 따라서, 유전자 불활성화는 완전(녹-아웃)하거나 부분적(예를 들면, 유전자가 정상의 발현 수준 미만을 나타내는 저차형 유전자(hypomorph)이거나 이것이 영향을 미치는 활성에 있어서 부분적인 감소를 나타내는 돌연변이체 유전자의 생성물)일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 NCgl2523의 불활성화는,
1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는
4) 이의 조합 등을 사용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 구체적으로는 1 내지 50개이다.
본 발명에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
이처럼 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 변이된 폴리뉴클레오티드로 교체시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 발명의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
다음으로, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은, 특별히 이에 한정되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 사용되는 용어 "퓨트레신 생산능을 갖는 미생물" 또는 "퓨트레신을 생산하는 미생물"이란, 자연적으로 퓨트레신 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 퓨트레신의 생산능이 없는 모균주에 퓨트레신의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다.
상기 퓨트레신을 생산하는 미생물은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 글루타메이트에서 오르니틴까지의 생합성 경로를 강화하기 위해 글루타메이트를 아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 아세틸오르니틴을 오르니틴으로 전환하는 오르니틴 아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트를 아세틸글루타밀 포스페이트(N-acetylglutamyl phosphate)로 전환하는 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 아세틸글루타밀 포스페이트를 아세틸글루타메이트 세미알데히드(N-acetylglutamate semialdehyde)로 전환하는 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 세미알데히드를 아세틸오르니틴(N-acetylornithine)으로 전환하는 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)의 활성을 내재적 활성에 비하여 증가시키도록 변형되어 퓨트레신의 생합성 원료로서 사용되는 오르니틴의 생산성이 향상된 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 오르니틴에서 아르기닌 합성에 관여하는 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransfrase, ArgF), 글루타메이트 엑스포터(glutamate exporter)(NCgl1221), 및/또는 퓨트레신을 아세틸화시키는 아세틸트랜스퍼라아제의 활성을 내재적 활성이 불활성화되도록 변이되고/되거나, 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성을 도입하도록 변형된 것일 수 있다.
이때, 상기 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF), 글루타메이트 엑스포터(NCgl1221), 오르니틴 디카르복실라아제(ODC), 아세틸 감마 글루타밀 포스페이트 리덕타아제(ArgC), 아세틸글루타메이트 신타아제 또는 오르니틴아세틸트랜스퍼라아제(ArgJ), 아세틸글루타메이트 키나아제(ArgB), 및 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(ArgD)는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 각각 서열번호: 8, 9, 10, 11, 12, 13 및 14로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 더욱 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 퓨트레신을 아세틸화시키는 아세틸트랜스퍼라아제는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 서열번호: 15 또는 16으로 기재되는 아미노산 서열 또는 이와 70% 이상, 더욱 구체적으로는 80% 이상, 더욱 구체적으로는 90% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 활성 증가는,
1) 상기 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형,
3) 상기 효소의 활성이 강화되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는
4) 이의 조합에 의해 강화되도록 변형하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리뉴클레오티드의 카피수 증가는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 벡터에 작동가능하게 연결된 형태로 수행되거나, 숙주세포 내의 염색체 내로 삽입됨으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있거나, 상기 폴리뉴클레오티드가 작동가능 하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 상기 숙주세포의 염색체 내 상기 폴리뉴클레오티드의 카피수를 증가하는 방법으로 수행될 수 있다.
다음으로, 2) 폴리뉴클레오티드의 발현이 증가하도록 발현조절 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 발현 단위의 상부에는 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터가 연결될 수 있는데, 상기 강력한 프로모터의 예로는 CJ7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 혹은 aceB 프로모터 등이 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 유래 프로모터인 lysCP1 프로모터(WO2009/096689) 혹은 CJ7 프로모터(대한민국 등록특허 제0620092호 및 WO2006/065095)와 작동가능하게 연결되어 상기 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현율을 향상시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다.
또한, 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라아제(ArgF), 글루타메이트 엑스포터, 및 아세틸트랜스퍼라제의 불활성화는, 앞서 NCgl2523의 불활성화와 관련하여 전술한 바와 같은 방법, 예컨대
1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실,
2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현 조절서열의 변형,
3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 및
4) 이들의 조합으로부터 선택된 방법에 의해 달성될 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
한편, 본 발명의 미생물은 퓨트레신 생산능을 갖는 미생물로서, 상기 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 발현되는 원핵 미생물을 포함하며, 이의 예로는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 시겔라 속(Shigella sp.), 시트로박터 속(Citrobacter sp.), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 여시니아 속(Yersinia sp.), 크렙시엘라 속(Klebsiella sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.), 브레비박테리움 속(Brevibacterium sp.), 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.), 셀레노모나스 속(Selenomanas sp.), 비브리오 속(Vibrio sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 스트렙토마이시스 속(Streptomyces sp.), 아카노박테리아 속(Arcanobacterium sp.), 알칼리젠 속(Alcaligenes sp) 등에 속하는 미생물일 수 있다. 구체적으로 본 발명의 미생물은 코리네박테리움 속에 속하는 미생물일 수 있으며, 더욱 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 일 실시양태에서는, 글루타메이트에서 퓨트레신 생성 경로가 강화되어 고농도 퓨트레신 생산능을 갖는 균주로서 기탁번호 KCCM11138P의 코리네박테리움 속 미생물(대한민국 특허공개 제2012-0064046호)과 기탁번호 KCCM11240P의 코리네박테리움 속 미생물(대한민국 특허출원 제2012-0003634호)을 이용하였다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 기반의 퓨트레신 생산 균주인 KCCM11138P 및 KCCM11240P와 각각 동일한 유전형(genotype)을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산 균주 DAB12-a(대한민국 공개특허 제2013-0082478호) 및 DAB12-b(대한민국 공개특허 제2013-0082478호; DAB12-a △NCgl1469)를 이용하였다. ATCC13869 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 입수할 수 있다.
구체적으로, 본 발명자는 퓨트레신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11240P에서 NCgl2523의 활성이 불활성화되도록 변형되어 퓨트레신 생산성이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 Corynebacterium glutamicum CC01-0844으로 명명하고, 부다페스트 조약 하에 2014년 2월 25일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11520P를 부여받았다.
본 발명의 다른 양태는
i) 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 불활성화되어 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
ii) 상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160시간 동안 배양할 수 있다. 상기 배양에 의하여 생산된 퓨트레신은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 배양 단계에서 생산된 퓨트레신을 회수하는 방법은 배양방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: NCgl2523 결손 균주의 제작 및 이의 퓨트레신 생산능 확인
<1-1> ATCC13032 기반 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2523 결손 균주의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래 NCgl2523의 결손이 퓨트레신 생산능에 관여하는지 여부를 확인하기 위해, 상기 NCgl2523을 코딩하는 유전자를 결손하기 위한 벡터를 제작하였다.
구체적으로, 서열번호: 1로 기재되는 NCgl2523을 코딩하는 유전자의 염기서열을 근간으로 NCgl2523의 N-말단 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호: 4 및 5의 프라이머 쌍과, NCgl2523의 C-말단 부위의 상동재조합 단편을 얻기 위한 서열번호: 6 및 7의 프라이머 쌍을 하기 표 1과 같이 제작하였다.
표 1
NCgl2523-del-F1_BamHI(서열번호: 4) CGGGATCCATGACTACCTCGCAGCGTTTC
NCgl2523-del-R1_SalI(서열번호: 5) ACGCGTCGACCTAGTGCGCATTATTGGCTCC
NCgl2523-del-F2_SalI(서열번호: 6) ACGCGTCGACAGCCATGCTGGAAACAATTCTCG
NCgl2523-del-R2_XbaI(서열번호: 7) CTAGTCTAGAGAGAGCTGCGCATAGTACTG
상기 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 2쌍의 프라이머 각각을 이용한 PCR을 수행하여 NCgl2523 유전자의 N-말단 부위와 C-말단 부위의 PCR 단편을 각각 증폭한 후, 이를 전기영동하여 목적하는 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 N-말단 부위의 단편을 제한효소 BamHI 및 SalI으로, C-말단 부위의 단편을 제한효소 SalI 및 XbaI으로 처리하였으며, 처리된 단편을 제한효소인 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pDZ-1'NCgl2523(K/O)를 제작하였다.
상기 플라스미드 pDZ-1'NCgl2523(K/O)를 KCCM11138P(대한민국 등록특허 제10-1348461호) 및 KCCM11240P(대한민국 공개특허 제2013-0082478호)에 각각 전기천공법(electroporation)으로 도입하여 형질전환체를 수득하고, 상기 형질전환체를 카나마이신(25 ㎍/㎖)과 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolin--D-galactoside)이 함유된 BHIS 평판 배지(Braine heart infusion 37 g/L, 소르비톨 91 g/L, 한천 2%)에 도말하여 배양함으로써 콜로니를 형성시켰다. 이로부터 형성된 콜로니 중에서 푸른색의 콜로니를 선택함으로써 상기 플라스미드 pDZ-1'NCgl2523(K/O)가 도입된 균주를 선발하였다.
상기 선발된 균주를 CM 배지(glucose 10 g/L, polypeptone 10 g/L, yeast extract 5 g/L, beef extract 5 g/L, NaCl 2.5 g/L, urea 2 g/L, pH 6.8)에서 진탕 배양(30℃, 8시간)하고, 각각 10-4부터 10-10까지 순차적으로 희석한 후 X-gal 함유 고체 배지에 도말하고 배양하여 콜로니를 형성시켰다. 형성된 콜로니 중에서 상대적으로 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선택함으로써 2차 교차(crossover)에 의해 NCgl2523을 코딩하는 유전자가 결손된 균주를 최종 선발하였다.
최종 선발된 균주를 대상으로 서열번호: 4 및 7의 프라이머 쌍을 이용해 PCR을 수행하여 NCgl2523을 코딩하는 유전자가 결손되었음을 확인하였고, 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 각각 KCCM11138P △NCgl2523 및 KCCM11240P △NCgl2523으로 명명하였다.
<1-2> ATCC13869 기반 퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2523 결손 균주의 제작
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 기반의 퓨트레신 생산 균주인 DAB12-a(대한민국 공개특허 제2013-0082478호) 및 DAB12-b(대한민국 공개특허 제2013-0082478호; DAB12-a △NCgl1469)를 대상으로 NCgl2523 결손 균주를 제작하였다.
구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl2523을 코딩하는 유전자 및 그로부터 발현되는 단백질 서열을 확인하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호: 4 및 7의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 1분 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 PCR 산물을 전기영동으로 분리한 후 서열분석을 수행한 결과, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래의 NCgl2523를 코딩하는 유전자는 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열을 포함하였다. 또한, 상기 유전자로부터 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 NCgl2523의 아미노산 서열(서열번호: 2)과 비교한 결과, 서로 100% 일치함을 확인하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869 유래 NCgl2523을 코딩하는 유전자를 결손하기 위해 상기 실시예 <1-1>에서와 같이 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13869의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 표 1에 기재된 2쌍의 프라이머 각각을 이용한 PCR을 수행하여 NCgl2523 유전자의 N-말단 부위와 C-말단 부위의 PCR 단편을 각각 증폭한 후, 이를 전기영동하여 목적하는 단편을 수득하였다. 이때, PCR 반응은 95℃에서 30초의 변성, 55℃에서 30초의 어닐링 및 72℃에서 30초의 신장 과정을 30회 반복하였다. 이로부터 수득된 N-말단 부위의 단편을 제한효소 BamHI 및 SalI으로, 수득된 C-말단 부위의 단편을 제한효소 SalI 및 XbaI으로 처리하였으며, 처리된 단편을 제한효소인 BamHI과 XbaI으로 처리된 pDZ 벡터에 클로닝하여 플라스미드 pDZ-2'NCgl2523(K/O)를 제작하였다.
상기 플라스미드 pDZ-2'NCgl2523(K/O)를 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 코리네박테리움 글루타미쿰 DAB12-a 및 DAB12-b에 각각 형질전환하여 NCgl2523을 코딩하는 유전자가 결손된 균주를 선발하였다. 이로부터 선발된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 DAB12-a △NCgl2523 및 DAB12-b △NCgl2523으로 명명하였다.
<1-3> NCgl2523 결손 균주의 퓨트레신 생산능 평가
퓨트레신 생산 균주에서 NCgl2523 결손이 퓨트레신 생산에 미치는 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 <1-1> 및 <1-2>에서 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주를 대상으로 퓨트레신 생산능을 비교하였다.
구체적으로, 4종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주(KCCM11138P △NCgl2523, KCCM11240P △NCgl2523, DAB12-a △NCgl2523 및 DAB12-b △NCgl2523)와 4종의 모균주(KCCM11138P, KCCM11240P, DAB12-a 및 DAB12-b)를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 평판 배지(glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100 ㎕, agar 2%, pH 6.8, 1 L 기준)에 도말하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이로부터 배양된 각 균주를 25 ㎖의 역가 배지(Glucose 8%, 대두단백질 0.25%, 옥수수 고형물 0.50%, (NH4)2SO4 4%, KH2PO4 0.1%, MgSO4ㆍ7H2O 0.05%, urea 0.15%, 바이오틴 100 g, 티아민 염산염 3 mg, 칼슘-판토텐산 3 mg, 니코틴아미드 3 mg, CaCO3 5%, 1 L 기준)에 한 백금이 정도로 접종한 후 이를 30℃에서 200 rpm으로 98시간 동안 진탕 배양하였다. 모든 균주의 배양 시 배지에 1 mM 아르기닌을 첨가하였다. 각 배양물로부터 생산된 퓨트레신 농도를 측정하고 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
Strain Putrescine(g/L)
KCCM11138P 9.8
KCCM11138P △NCgl2523 11.8
KCCM11240P (-) 12.4
KCCM11240P △NCgl2523 14.9
DAB12-a 10.2
DAB12-a △NCgl2523 12.2
DAB12-b 13.1
DAB12-b △NCgl2523 15.2
상기 표 2에 나타난 바와 같이, NCgl2523이 결손된 4종의 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주의 퓨트레신 생산량이 증가하였음을 확인하였다.
실시예 2: NCgl2523 결손 균주의 세포 내 퓨트레신 농도 측정
NCgl2523 활성이 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주에서 세포 내 퓨트레신의 농도 변화를 확인하기 위해, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11240P △NCgl2523 및 모균주 KCCM11240P를 대상으로 유기용매를 이용한 추출방법으로 세포 내 퓨트레신 농도를 측정하였다. 세포 내 대사물질(intracellular metabolite) 분석은 문헌(Nakamura J et al., Appl. Environ. Microbiol., 73(14): 4491-4498, 2007)에 기재된 방법에 따라 수행하였다.
먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11240P △NCgl2523 및 모균주 KCCM11240P를 각각 1 mM 아르기닌 함유 CM 액상 배지(glucose 1%, polypeptone 1%, yeast extract 0.5%, beef extract 0.5%, NaCl 0.25%, urea 0.2%, 50% NaOH 100 ㎕, pH 6.8, 1 L 기준) 25 ㎖에 접종한 후 30℃에서 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 도중 세포 성장이 지수증식기(exponential phase)에 도달하면 급속 진공 여과(rapid vacuum filtration, Durapore HV, 0.45 m; Millipore, Billerica, MA)를 통해 배양액으로부터 세포를 분리하였다. 세포가 흡착된 필터를 10 ㎖의 냉각수로 2회 세척한 후, 5 M 모르폴린 에탄설폰산(morpholine ethanesulfonic acid) 및 5 M 메티오닌 설폰(methionine sulfone)을 함유한 메탄올에 10분간 담가두었다. 이로부터 얻은 추출액에 동량의 클로로포름과 0.4배 부피의 물을 잘 혼합한 후, 수층(aqueous phase)만을 스핀 칼럼(spin column)에 적용하여 단백질 오염물을 제거하였다. 여과된 추출액을 모세관 전기영동 질량분석기(capillary electrophoresis mass spectrometry)를 사용하여 분석하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3
Strain Putrescine(mM)
KCCM11240P 7
KCCM11240P △NCgl2523 1
상기 표 3에 나타난 바와 같이, 모균주 KCCM11240P에 비해 NCgl2523 활성이 불활성화된 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11240P △NCgl2523에서 세포 내 퓨트레신 농도가 현저하게 감소하였음을 확인하였다.
이는 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 변이주 KCCM11240P에서 NCgl2523을 결손시키면 NCgl2522의 발현 억제가 해제되면서 이의 활성이 강화되고, 그로 인해 퓨트레신 배출능이 향상됨에 따라 세포 내에서 생성된 퓨트레신이 세포 외로 원활히 배출되는 것으로 예측된다.
실시예 3: NCgl2523 유전자의 상동성 탐색 및 gene context analysis
KEGG, MetaCyc Database와 NCBI blastP를 통해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래 NCgl2523의 상동성 유전자 탐색(Ortholog Search)을 실시하였으며, Gene cluster를 통해 각 미생물의 genome상에 NCgl2523과 오페론을 구성하는 NCgl2522, NCgl2524과의 조합의 형태를 확인하였다.
NCgl252의 유전자명은 cgmA로 DHA2 family에 속하는 major facilitator superfamily permease이며 NCgl2523의 유전자명은 cgmR로 TetR-family transcriptional regulator이며, NCgl2524는 아직 기능이 부여되지 않았지만 UMF1 family에 속해있는 major facilitator superfamily permease이다.
상기 분석한 결과, NCgl2522와 NCgl2523의 경우, 대부분 같은 오페론을 구성하고 있으며, 미생물에 따라 NCgl2524는 같은 오페론에 있기도 하며 (Type 1), 게놈상 다른 위치에 존재하기도 하며(Type 2), 게놈상에 없기도 하다(Type 3).
이에 분석한 각 미생물을 NCgl2523 주변 유전자의 조합 형태를 3가지 타입으로 분류하였다. 구체적으로, NCgl2523을 보유하고 있는 것으로 예상되는 미생물 중에 NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524 조합 형태(Type 1); NCgl2522-NCgl2523 조합 및 NCgl2524 단독 형태(Type 2); 또는 NCgl2522-NCgl2523 조합 형태(Type 3)로 미생물을 나누어 분류하였다(도 1). 상기 분류 결과는 하기 표 4와 같다.
표 4
Type 유전자 조합 형태 해당 미생물
NCgl2523 포함 미생물 Acidovorax avenae, Actinobaculum sp., Actinomyces sp., Actinomyces vaccimaxillae, Actinoplanes missouriensis, Actinosynnema mirum, Agrobacterium tumefaciens, alpha proteobacterium, Amycolatopsis mediterranei, Amycolatopsis orientalis, Arcanobacterium haemolyticum, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter sp., Bdellovibrio bacteriovorus, Beutenbergia cavernae, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Brachybacterium paraconglomeratum, Clavibacter michiganensis subsp., Corynebacterium atypicum, Corynebacterium callunae, Corynebacterium casei, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium glutamicum AR1, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium glutamicum ATCC 21831, Corynebacterium glutamicum K051, Corynebacterium glutamicum MB001, Corynebacterium glutamicum R, Corynebacterium glutamicum SCgG1, Corynebacterium glutamicum SCgG2, Corynebacterium glycinophilum, Corynebacterium maris, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium sp. ATCC 6931, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Corynebacterium variabile, Corynebacterium vitaeruminis, Dermabacter sp. HFH0086, Enterobacter cloacae EcWSU1, Enterobacter sp. R4-368, Gammaproteobacteria, Granulicoccus phenolivorans, Hafnia alvei, Ilumatobacter coccineus, Isoptericola variabilis, Janthinobacterium agaricidamnosum, Ketogulonicigenium vulgare, Microbacterium sp., Microbacterium testaceum, Micrococcus luteus, Micromonospora aurantiaca, Micromonospora sp., Mycobacterium gilvum, Nakamurella multipartita, Nesterenkonia alba, Nesterenkonia sp., Nocardia brasiliensis, Nocardia cyriacigeorgica, Nocardia farcinica, Nocardiopsis dassonvillei, Nocardiopsis , kunsanensis, Nocardiopsis sp., Nocardiopsis valliformis, Nocardiopsis xinjiangensis, Ochrobactrum anthropi, Ochrobactrum intermedium, Paracoccus aminophilus, Paracoccus sp. 5503, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PCC21, Promicromonospora sukumoe, Propionibacterium acidipropionici, Propionibacterium freudenreichii, Proteobacteria, Providencia stuartii ATCC 33672, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cremoricolorata, Pseudomonas geniculata, Pseudomonas stutzeri, pseudonocardia dioxanivorans, Renibacterium salmoninarum, Rhodococcus equi, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus jostii, Rhodococcus opacus B4, Rhodococcus opacus PD630, Rhodococcus pyridinivorans, Saccharomonospora viridis, Saccharopolyspora erythraea, Salinispora, Salinispora arenicola, Salinispora pacifica, Salinispora tropica, Sanguibacter keddieii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia sp., Sodalis sp. HS1, Sphingobium chinhatense, Stenotrophomonas maltophilia, Stenotrophomonas sp., Streptococcus anginosus, Streptomyces, Streptomyces alboviridis, Streptomyces albus, Streptomyces atroolivaceus, Streptomyces baarnensis, Streptomyces cyaneofuscatus, Streptomyces fulvissimus, Streptomyces globisporus, Streptomyces griseus, Streptomyces mediolani, Streptomyces scopuliridis, Streptomyces sp., Xanthomonas citri pv. citri, Xenorhabdus nematophila, Yaniella halotolerans, Yersinia enterocolitica
1 NCgl2522-NCgl2523-NCgl2524 조합 형태 Corynebacterium callunae, Corynebacterium casei, Corynebacterium glutamicum AR1, Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium glutamicum ATCC 13869, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067, Corynebacterium glutamicum ATCC 21831, Corynebacterium glutamicum K051, Corynebacterium glutamicum MB001, Corynebacterium glutamicum R, Corynebacterium glutamicum SCgG1, Corynebacterium glutamicum SCgG2, Corynebacterium vitaeruminis
2 NCgl2522-NCgl2523 조합; NCgl2524 단독 형태 Actinoplanes missouriensis, Actinosynnema mirum, Amycolatopsis mediterranei, Amycolatopsis mediterranei, Amycolatopsis orientalis, Arcanobacterium haemolyticum, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter sp., Bordetella bronchiseptica, Bordetella parapertussis, Bordetella pertussis, Clavibacter michiganensis, Corynebacterium glycinophilum, Corynebacterium maris, Corynebacterium terpenotabidum, Corynebacterium variabile, Isoptericola variabilis, Microbacterium testaceum, Micromonospora aurantiaca, Micromonospora sp. L5, Mycobacterium gilvum, Nakamurella multipartita, Nocardia brasiliensis, Nocardia cyriacigeorgica, Nocardia cyriacigeorgica, Nocardia farcinica, Nocardiopsis dassonvillei, Nocardiopsis dassonvillei, Ochrobactrum anthropi, Paracoccus aminophilus, Propionibacterium acidipropionici, Pseudonocardia dioxanivorans, Renibacterium salmoninarum, Rhodococcus equi, Rhodococcus pyridinivorans, Saccharomonospora viridis, Saccharopolyspora erythraea, Salinispora tropica, Streptomyces albus, Streptomyces fulvissimus, Streptomyces griseus
3 NCgl2522-NCgl2523 조합 형태 Acidovorax avenae, Bdellovibrio bacteriovorus, Beutenbergia cavernae, Corynebacterium atypicum, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium ulcerans, Corynebacterium urealyticum, Enterobacter cloacae, Enterobacter sp., Hafnia alvei, Ilumatobacter coccineus, Janthinobacterium agaricidamnosum, Ketogulonicigenium vulgare, Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PCC21, Providencia stuartii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas cremoricolorata, Pseudomonas stutzeri, Sanguibacter keddieii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia sp., Sodalis sp. HS1, Stenotrophomonas maltophilia, Xenorhabdus nematophila, Yersinia enterocolitica
이와 같은 결과로부터 상기 NCgl2523과 이와 유사한 서열을 가지는 아미노산을 가지며 상기 분류와 같이 NCgl2522과 같이 퓨트레신 배출 단백질로 추정되는 단백질과 오페론을 구성하는 미생물의 경우, 해당 NCgl2523과 이와 유사한 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 불활성화시키면 본 발명과 같이 퓨트레신 생산능이 향상됨을 예상할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2015004087-appb-I000001

Claims (8)

  1. 퓨트레신 생산능을 가지는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에서 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 불활성화된, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 추가로 오르니틴 디카르복실라아제(ornithine decarboxylase, ODC)의 활성이 도입된, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 ODC가 서열번호: 10의 아미노산 서열을 가지는, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 추가적으로 아세틸트렌스퍼라아제의 활성이 불활성화된, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 아세틸트렌스퍼라아제가 서열번호: 15 또는 16으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물.
  7. 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 활성이 불활성화되어 퓨트레신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
    상기 단계에서 수득되는 미생물 또는 배지로부터 퓨트레신을 분리하는 단계를 포함하는, 퓨트레신 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰인, 퓨트레신 생산 방법.
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