WO2015156367A1 - ８角柱の細胞培養用容器 - Google Patents

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cell culture
cells
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octagonal
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一博 長池
寿紀 鈴木
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株式会社アニマルステムセル
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    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/08—Flask, bottle or test tube
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/20—Material Coatings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/22—Transparent or translucent parts

Definitions

  • the present invention relates to a container for cell culture, and more specifically, a closed bottom end used for culturing and proliferating various cells including adherent cells such as mesenchymal cells and mesenchymal stem cells homogeneously and inexpensively.
  • the present invention relates to an octagonal cell culture vessel having a liquid opening at the upper end portion and the opposite end portion.
  • Various types of cells isolated from the living body are cultured in an artificial environment that mimics the living environment, and gene transfer is performed as necessary, and a large amount of these cells and various factors produced from the cells are introduced. And used for the treatment of various diseases.
  • adherence of fibroblasts, mesenchymal cells, mesenchymal stem cells, etc. that have the property of attaching and proliferating by the interaction of various molecules between the cells and the scaffolds
  • adherent cells can be proliferated by using a cell culture culture dish having a culture surface made adherent and a container for adherent cell culture such as a culture flask.
  • the cell culture vessel is usually composed of one flat plate-shaped culture surface, the area of the culture surface required for growing cells is limited.
  • the size of the cell culture vessel can be increased, and the number of cell culture vessels can be increased, the number of steps required for a series of cultures can be reduced. , Increase dramatically in proportion to the increase in container size and number of containers. For this reason, it takes a lot of time and effort to prepare a large amount of homogeneous cells, and the risk of contamination has increased, and there has been a need for ingenuity and proficiency in the work process.
  • the device has a substantially cylindrical shape, and the substantially cylindrical portion is
  • a roller bottle that is used by continuously rotating around an axis and using the entire inner surface of the substantially cylindrical portion as a culture surface.
  • a roller bottle having a structure having axial folds in a substantially cylindrical portion of the roller bottle has also been proposed (Patent Document 1). ).
  • the shape of the cross section of the roller bottle is a substantially circular shape, assuring both the maximum culture area and minimizing the difference in surface area between the culture surface and the culture liquid surface. From the shape of the Reuleaux polygon, i.e., the cylindrical part of the bottle was molded so as to be a structure with an odd number of rounded corners and curved sides. A cell culture bottle has also been proposed (Patent Document 2).
  • each of the roller bottles described above requires a curved culture surface in order to have a structure capable of culturing cells in large quantities
  • detailed information such as the number of cells and the shape of cells being cultured can be examined by microscopy.
  • the cell state during culture cannot be managed because it cannot be obtained by means of the above. Therefore, it is necessary to repeat the process of collecting the adherent cells that proliferated by stopping the culture halfway and confirming the number of cells and the cell quality many times before determining the optimal culture conditions. Because of this, many cells are wasted. This is a big problem especially when using cells with an extremely small number of initial cells or difficult to obtain, and it is extremely difficult to complete the condition setting for mass culture. Therefore, improvement of the technique was requested because it was not possible to enter the treatment which was the original purpose.
  • mesenchymal stem cells which are adherent cells used for disease treatment, must strictly maintain an undifferentiated state as stem cells. Therefore, in obtaining the necessary number of cells required for treatment, the mesenchymal system is strictly controlled and confirmed so that the number of cells, cell density, culture medium state, etc. are kept constant. Stem cells need to be cultured and expanded. In particular, in order to strictly maintain the undifferentiated state as stem cells, it is important to strictly control so that the number of cells attached to the culture surface and the cell density are constant at the start of culture.
  • roller bottles for mass culture are designed to have a cylindrical shape, a cylindrical shape with axial folds, or a polygonal shape of Roule as an essential structure. Therefore, since each bottle has a structure in which the culture surface is curved, a difference in water depth occurs from the culture solution surface of the culture solution to the culture surface inside the bottle. Therefore, at the start of culture, the cell concentration in the center of the bottle where the water depth from the culture surface of the culture medium to the culture surface inside the bottle becomes deeper, and the cells before adhesion gather at the lower part of the curved culture surface and become a cell mass It becomes easy to form.
  • cultivation start may become constant, and is not suitable for culture
  • Forming a cell mass is not preferable not only in mesenchymal stem cells but also in other adherent cells in order to obtain homogeneous cells.
  • the culture surface is curved, the state of cells during culture cannot be confirmed by microscopic examination. Until the cells are detached from the bottle and collected, the presence or absence of cell clumps, Neither the cell density nor the degree of uniformity can be confirmed.
  • the problem to be solved by the present invention is to strictly maintain and manage mesenchymal stem cells used for disease treatment while confirming the undifferentiated state as stem cells during culture, and the amount necessary for disease treatment can be obtained
  • the cells are cultured in a large amount until the cells are collected uniformly, inexpensively and efficiently.
  • the problem to be solved by the present invention is that the amount necessary for disease treatment is obtained while confirming the cell state during culture in order to obtain adherent cells used for disease treatment or factors produced by adherent cells. It is to culture in large quantities until it is obtained, and to recover the cells or the factors homogeneously, inexpensively and efficiently.
  • a further problem to be solved by the present invention is to eliminate the drastic increase in cost due to an increase in the amount of pipette and centrifuge tube used to collect cultured cells, which increases the required amount as the culture scale increases, and is inexpensive. It is to provide a mass culture means. In addition, it is possible to provide a container for mass culture that can meet a wide range of culture condition setting requirements, such as coating treatment of the culture surface during mass culture, and various combinations of cell types attached to the culture surface. It is a problem to be solved by the present invention.
  • the first means of the present invention for solving the above-mentioned problem is an octagonal cell culture vessel having a liquid opening at a closed lower end and an opposite upper end, and forms the octagonal column.
  • Each of the surfaces is a flat shape, and two opposing surfaces among the surfaces forming the octagonal column are horizontal.
  • the second means of the present invention for solving the above-mentioned problem is that a neck portion further extends from the liquid opening that opens at the upper end portion, and the neck portion receives a lid with an inner peripheral thread.
  • the cell culture vessel according to the first means having an outer peripheral thread.
  • the third means of the present invention for solving the above-mentioned problem is that a handle member or a perforated member for holding the cell culture vessel is fixed to the outer periphery of the base portion of the neck on the liquid opening side. It is a container for cell culture of the above-mentioned 1st or 2nd means which has a convex part for carrying out.
  • a fourth means of the present invention for solving the above problem is the cell culture vessel according to any one of the first to third means, wherein the closed lower end portion exhibits a conical shape or an octagonal pyramid. .
  • the fifth means of the present invention for solving the above problem is that the cell culture container according to any one of the first to fourth means, wherein the outer surface of the cell culture container is graduated. It is.
  • the sixth means of the present invention for solving the above-mentioned problems is the above-mentioned first to second aspects, in which each surface forming the octagonal column of the cell culture vessel is marked on the outer side of any surface. 5.
  • the seventh means of the present invention for solving the above problem is that the culture surface inside each surface forming the octagonal column of the cell culture container is modified with gelatin, an extracellular matrix or polycations.
  • An octagonal cell culture vessel having a liquid opening at the closed lower end and the opposite upper end of the means of the present invention, and each surface forming the octagonal column is planar,
  • a cell culture vessel in which two opposing surfaces are horizontal among the surfaces to be formed, it becomes possible to confirm the state of the cells while culturing, and the initial number of cells is extremely small or obtained.
  • mass culture conditions can be set, and the culture surface is flat, so that the cell density is uniform and mesenchymal stem cells used for disease treatment
  • Adherent cells that need to maintain specific cell properties such as maintaining such an undifferentiated state can be cultured and proliferated uniformly, in large quantities and at low cost.
  • the closed lower end has a conical shape or an octagonal pyramid, it becomes a cell culture container having the function of a centrifuge tube, and further cost reduction can be achieved.
  • FIG. 2 shows a photograph of a container in which gelatin coating is performed every other surface on the culture surface of the octagonal column cell culture container of the present invention.
  • the material used for forming the cell culture container and the lid member of the present invention is not particularly limited, and materials generally used in cell culture can be used.
  • the material may be, for example, a resin material and an inorganic material such as glass or quartz, or a metal, but considering the ease of production, cost reduction, and ease of grasping the cell culture state, preferably, Resin material is used.
  • a resin material such as an epoxy resin or a vinyl chloride resin, or a resin material containing at least one of the above-described surface hydrophilized treatments can be used.
  • polyethylene terephthalate resin or polystyrene resin is preferably used as the resin material.
  • the octagonal cell culture container 1 of the present invention has an octagonal cell culture container structure having a closed lower end 2 and a liquid opening 3 at the opposite upper end.
  • Each surface forming the octagonal prism is planar, and two opposing surfaces of the surfaces forming the octagonal prism have a substantially horizontal structure.
  • closed lower end 2 can have a conical or octagonal structure so that it can be used as a culture centrifuge container as a centrifuge tube in addition to cell culture. . (FIGS. 1 and 2).
  • the neck 4 further extends from the liquid opening 2 opened at the upper end, and the neck has an outer thread 6 for receiving a cover 5 with an inner thread.
  • the outer periphery of the base portion on the liquid opening side of the neck 4 holds the octagonal column cell culture container upward and horizontally.
  • the outer surface of the cell culture vessel 1 may be arbitrarily scaled so that the volume of the culture solution and the amount of cells in the culture vessel can be visually estimated using the scale. Can do. Further, a structure can be provided in which the culture surfaces can be distinguished from each other by marking the outside of any surface of each surface forming the octagonal prism of the cell culture vessel.
  • the cell culture vessel 1 must have a thickness that exhibits a wall pressure of sufficient strength when the culture medium is filled and cultured. Furthermore, when the lower end portion has a conical or octagonal pyramid structure and is used not only as a culture vessel but also as a centrifuge tube for cell recovery, it is necessary for the centrifugation required for cell recovery. It should be a cell culture vessel and centrifuge tube with a thickness that is strong enough to withstand.
  • the cell culture container of the present invention was manufactured using a mold prepared so as to be molded into the shape of the octagonal column cell culture container 1, and when using the resin material, it was integrally formed by blow molding. Can be.
  • the cells of the octagonal column of the present invention are subjected to mirror treatment on the culture surface forming portion of the mold.
  • the container can be manufactured after the culture surface of the culture container is in a state of less distortion suitable for spectroscopic examination using various microscopes such as an optical microscope, a fluorescence microscope, and a phase contrast microscope.
  • gelatin, extracellular matrix or polycations are added to the culture surface as a component for modifying the culture surface in order to enhance the adhesion of the cells to the culture surface of the octagonal column cell culture container 1 of the present invention. It may be applied to the surface.
  • the type of gelatin, extracellular matrix or polycation is not particularly limited as long as it is used for cell culture.
  • the extracellular matrix collagen, laminin, fibronectin and the like can be used, and as the polycation, polylysine, polyethyleneimine, polyortinin and the like can be used.
  • each of the above components can be applied to a site where it is desired to exhibit higher adhesion to the culture surface, and applied to all eight culture surfaces in the octagonal column cell culture container 1 of the present invention.
  • four surfaces may be applied every other surface, only the desired surface may be applied, or different components may be applied depending on the surface.
  • the octagonal column cell culture container 1 of the present invention has eight culture surfaces, so that each culture surface can be visually recognized from the outside or recognized by a device and can be distinguished.
  • a mark for distinguishing each surface may be attached to the outside of the container.
  • the mark can be selected and used, such as characters, symbols, barcodes, patterns, etc., and can be attached by printing with ink or engraving with laser or etching.
  • the container mold may be preliminarily marked with a desired mark, and the cell culture container surface may be marked.
  • the octagonal column cell culture container 1 of the present invention is marked with a necessary part outside the octagonal column cell culture container 1 and used in combination with a device for identifying the mark.
  • the processing apparatus that controls the rotation can accurately identify the culture container and the position of the culture surface in the container, thereby increasing the degree of freedom of the rotation control. Also, when the operator himself / herself controls the rotation of the octagonal column cell culture container of the present invention, the position of the culture surface in the container can be identified, and the accuracy of the work is improved.
  • the octagonal column cell culture container 1 of the present invention has a structure in which the lower part 2 of the container has a conical shape or an octagonal pyramid, and is peeled off from the surface of the container culture with a centrifuge.
  • a structure having a function as a centrifuge tube that can centrifuge cells can also be used. Therefore, in order to make it possible to visually discriminate the amount of cells and culture solution collected as pellets in the conical or octagonal pyramidal region at the bottom of the container after centrifugation, a scale is added to the outside of the conical or octagonal pyramidal region.
  • the scale can be marked by printing with ink or by engraving with laser or etching.
  • a scale mark may be attached to the container mold in advance, and the container surface may be manufactured as a scale.
  • the turbidity of the culture solution in which the cells are suspended from the outside of the cell culture container is measured before centrifugation. Therefore, by extrapolating the measured value of turbidity, the number of cells in the culture medium in which the cells are suspended can be digitized. It becomes possible to roughly quantify the number of cells in the pellets measured and collected using an instrument.
  • the octagonal column cell culture vessel 1 of the present invention can be provided as sterilized.
  • a method for sterilizing the cell culture container is not particularly limited, and a method generally used as a method for sterilizing the cell culture container can be used.
  • the sterilization method include ⁇ -ray irradiation sterilization, electron beam sterilization, radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, ultraviolet irradiation sterilization, hydrogen peroxide sterilization, and ethanol sterilization.
  • electron beam sterilization or ⁇ -ray irradiation sterilization is preferably used as the sterilization method.
  • Electron beam sterilization is performed to such an extent that the cell culture container is not deteriorated, and the irradiation energy of ⁇ rays in the ⁇ -ray irradiation sterilization is about 5 kGy to 30 kGy so that the cell culture container can be sterilized without deterioration.
  • the range is preferably within the range, but a suitable sterilization method can be selected and used according to the cells to be used.
  • Example 1 The octagonal column cell culture container 1 of the present invention was produced.
  • a mold for molding the octagonal column cell culture container 1 and the lid 5 used in accordance therewith was produced.
  • the mold is mirror-finished so that the culture surface is smooth, and a scale is attached to the outside of the octagonal pyramid portion at the bottom of the octagonal column cell culture container 1 after molding. I made it.
  • the octagonal column cell culture vessel 1 was integrally molded by blow molding using the above mold using polyethylene terephthalate resin. In order to identify each culture surface, the outside of the culture circle of the container was marked with ink. The lid 5 was molded in the same manner. The manufactured octagonal column cell culture container 1 and a part of the lid 5 were sterilized by electron beam sterilization.
  • Example 2 A pigmented 2% gelatin solution was prepared.
  • the octagonal column cell culture container 1 was laid down so that one of the culture surfaces forming the octagonal column (the surface indicated by No. 1 in FIG. 4) was the bottom surface, and was placed on the upper end of the container. A 2% gelatin solution containing a dye is injected from the liquid opening 3 so as to cover the bottom surface, and left for a certain period of time. 1 was established on the culture surface. The coloring matter is added to easily determine from the outside that the coating treatment with gelatin has been uniformly performed.
  • the container With the octagonal column cell culture container 1 lying down sideways, the container is rotated clockwise around the axis of the octagonal column of the container, and the second clockwise from the culture surface that is first the bottom surface.
  • the culture surface (No. 3 surface in FIG. 4) was a new bottom surface.
  • a 2% gelatin solution containing a dye is injected from the liquid opening 3 provided at the upper end of the container so as to cover the bottom surface, and left for a certain period of time. 1 was established on the culture surface. The above operation was repeated until No. 1 in FIG. 5 and no.
  • the gelatin solution was also fixed on the 7th surface.
  • each culture surface forming an octagonal column is planar, and two opposing surfaces of the surfaces forming the octagonal column are substantially horizontal. It was revealed that the culture surface can be coated easily and arbitrarily. Further, as described above, since every other surface can be easily treated, the octagonal column cell culture container 1 of the present invention can be used to attach cells desired to be cultured only to a desired surface. It can be easily done.
  • Example 3 Adipose-derived mesenchymal stem cells were isolated and cultured from dog subcutaneous adipose tissue. All experiments and procedures were performed according to guidelines established by the institutional committee.
  • the dog was anesthetized to obtain subcutaneous adipose tissue.
  • the subcutaneous adipose tissue was treated with an enzyme, washed with 1 ⁇ PBS buffer (dilution ratio, 1: 1; v / v), redispersed in 1 ⁇ PBS buffer, and then passed through a syringe multiple times.
  • adipose-derived mesenchymal stem cells adhering to the inner wall of the syringe or the needle cavity were collected in the presence of 1 ⁇ PBS buffer containing new EDTA.
  • the collected adipose-derived mesenchymal stem cells were washed with 1 ⁇ PBS buffer, and then resuspended in a culture solution supplemented with FBS for culturing at a predetermined number of cells.
  • the culture solution 8 in which the fat-derived mesenchymal stem cells are suspended is gently injected into the container through the liquid opening 3 disposed at the upper end of the container.
  • a lid 5 was placed on the neck 4 of the head. The lid 5 was not too tightly closed so that the air permeability was sufficiently maintained when the octagonal column cell culture container 1 was allowed to stand in a cell culture incubator.
  • the octagonal column cell culture vessel 1 is tilted sideways so that one of the culture surfaces forming the octagonal column (the surface indicated by No. 1 in FIG. 4) is the bottom surface, and the fat-derived mesenchymal stem cells The cells were placed in an incubator for cell culture that had already been set to the temperature, humidity, oxygen, and carbon dioxide concentration.
  • the culture surface adjacent to the culture surface that previously became the bottom surface is the new bottom surface.
  • the work of rotating clockwise around the axis of the octagonal column of the container was performed. This is repeated at regular time intervals. 3 to No. It was rotated once to the 8th surface.
  • the fat-derived mesenchymal stem cells were uniformly attached to the culture surface for every eight culture surfaces in the octagonal cell culture container 1 of the present invention. And when rotating clockwise around the axis of the octagonal column, if the time for standing still is lengthened, the culture surface No. 1 is set. 1 to No. A trend of decreasing cell density over 8 was observed. However, when the standing time was shortened, although the number of cells adhering to each culture surface was small, no difference in cell density was confirmed.
  • the octagonal column cell culture container of the present invention optimizes the time during which the culture surface is allowed to stand in the clockwise direction around the axis of the octagonal column. It was found that the adhesion density of stem cells can be made almost constant.
  • the octagonal column cell culture vessel 1 having the above-mentioned fat-derived mesenchymal stem cells attached to each surface is allowed to stand in a cell culture incubator, and is further rotated around the axis of the octagonal column of the vessel at regular intervals. The culture was continued while rotating around, followed by microscopic examination. And after opening the lid
  • the container is tilted obliquely to leave a pellet of fat-derived mesenchymal stem cells, and unnecessary culture supernatant is decanted from the liquid opening 3 disposed at the upper end of the container. Threw away. Thereafter, a pellet of adipose-derived mesenchymal stem cells was collected.
  • Comparative example As a comparative example, a culture solution in which the fat-derived mesenchymal stem cells were suspended was added to a conventional roller bottle, and rotational culture was performed. Since the culture surface of the roller bottle has a curved surface, observation of the entire culture surface with a microscope was not successful. Therefore, after detaching the cells, the number of cells was counted, the cell suspension was transferred to a centrifuge tube and subjected to a centrifugal separation treatment, and the fat-derived mesenchymal stem cells were collected as a pellet. As a result, the cell number increase rate was lower than that of the octagonal column cell culture container of the present invention.
  • An octagonal cell culture vessel having a liquid opening at the closed lower end and the opposite upper end of the means of the present invention, and each surface forming the octagonal column is planar,
  • the cell culture container in which two opposing surfaces are horizontal among the surfaces to be formed, and the cell culture container having a structure in which the closed lower end portion exhibits a conical shape or an octagonal pyramid, are attached cells. It is possible to confirm the state of cells while culturing, and even when using cells with a very small initial number of cells or difficult to obtain, You can set conditions.
  • the culture surface of the culture vessel is flat, it maintains specific cell properties such as maintaining uniformity of cell density and maintaining an undifferentiated state like mesenchymal stem cells used for disease treatment.
  • the necessary adherent cells can be cultured and propagated in a homogeneous, large-scale and inexpensive manner. Furthermore, it becomes possible to change the coating process and the cells to be attached for each culture surface, and it is possible to provide a large-scale culture container capable of meeting a wide range of culture condition setting requirements.

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Abstract

　間葉系幹細胞や付着性細胞を、培養中に細胞の状態を確認し、厳密に維持管理しながら疾患治療に必要な量が得られるよう大量培養し、該細胞を均質、安価、かつ効率よく回収する手段を提供すること、及び、培養面のコーティング処理や、培養面に付着させる細胞の種類を様々に組み合わせるなどの、幅広い培養条件の設定要求に応えることが可能な大量培養用容器を提供することを課題とし、当該課題を解決するものとして、閉塞した下端部および相対向する上端部に液体用開口を有する８角柱の細胞培養用容器であって、該８角柱を形成する各面が平面状であり、該８角柱を形成する各面のうち相対向する２面が水平である細胞培養用容器とし、さらに閉塞した下端部が円錐状又は８角錐を呈する構造のものを提供する。均質、安価、高効率の大量培養手段となる。

Description

８角柱の細胞培養用容器
　本発明は、細胞培養のための容器に関し、さらに詳細には、間葉系細胞や間葉系幹細胞など付着性細胞を含む各種細胞を、均質かつ安価に培養増殖するために用いる、閉塞した下端部および相対向する上端部に液体用開口を有する８角柱の細胞培養用容器に関する。
　生体から単離した様々な種類の細胞を、生体環境を模した人工的な環境下にて培養し、さらに必要に応じて遺伝子導入を行い、それら細胞や、細胞から産生される各種因子を大量に得て、各種の疾患治療に用いることが行われている。そのような細胞として、細胞と足場との間で各種分子による相互作用により、足場となる部位に付着し、増殖する性質を有する繊維芽細胞、間葉系細胞や間葉系幹細胞などの付着性細胞がある。それら付着性細胞は、付着性を有するようにした培養面を有する細胞培養用の培養皿や培養用フラスコのような付着性細胞培養用の容器を用いることで、増殖させることができる。
　上記治療に用いるためには、大量の細胞を培養し、細胞や、細胞から産生される因子などの成分を回収する必要がある。しかし、通常、細胞培養用の容器は１つの平板状の培養面からなるため、細胞を増殖させるために要する培養面の面積が限られている。
　そこで、大量の細胞を培養できるようにするために、使用する細胞培養用の容器サイズを上げ、さらに培養に用いる容器数を増やす対応が取り得る。しかしながら、一般に培養に充てることが可能なスペースには限りがあるため、培養にあたり、用いる容器数を十分に増やすことができないという問題が生じる。
　培養に充てることが可能なスペースが確保でき、細胞培養用の容器サイズを上げ、細胞培養用の容器数を増やすことが可能な場合であっても、一連の培養に必要とされる工程数が、容器サイズや容器数の増大に比例して飛躍的に増える。そのため、均質の細胞を大量に調製するには大変に手間がかかるとともに、コンタミネーションのリスクも増大し、作業工程への工夫と習熟が求められていた。
　さらに、培養規模を大きくすると、培養液やそれに添加する血清や各種因子、ピペットや遠心チューブを含む各種培養器具も大量に必要となるため、コストが飛躍的に増大するという問題も生じていた。
　このように、治療現場や生産現場においては、大量培養に伴う上記各種問題の解決が要請されていた。
　上記問題を解決する工夫として、様々な工夫が提案されているが、装置等も用いた大量生産を志向した手段として、略円筒形状を有するものであって、該略円筒形状の部分を、その軸線回りに連続的に回転させて用い、該略円筒形状の部分の内面全体を培養面としたローラーボトルが提案されている。さらに、付着性細胞が接着可能となる培養面の表面積を増大させるため、該ローラーボトルの略円筒形状の部分において、軸方向のひだを有する構造にしたローラーボトルも提案されている（特許文献１）。
　しかし、上記構造のものは、培養液が円筒形状の部分の内面の下部に存在するため、培養面の表面積よりも培養液の液面の表面積が小さくなり、培養液上部の気層との空気交換が不十分になるという問題が生じる。
　そこで、培養面積を最大限に確保し、かつ、培養面と培養液の液面における表面積の差を最小にすることを両立させたものとして、ローラーボトルの断面の形状を、略円となる形状から、ルーローの多角形の形状、すなわち、丸みを帯びた角を奇数有し辺が湾曲した構造となるようにボトルの円筒形状の部分を成型したものであることを必須の構成要件とした、細胞培養用ボトルも提案されている（特許文献２）。
　しかしながら、上記の各ローラーボトルは、いずれも細胞の大量培養をなし得る構造とするために培養面を湾曲させることを要することから、培養中の細胞数や細胞形状などの詳細な情報を検鏡による手段により取得することが出来ないため、培養中の細胞状態を管理することができない。そのため、至適の培養条件を確定するまでに、培養を途中で止めて増殖した付着細胞を回収し、細胞数や細胞品質を確認することを何度も繰り返す必要が生じ、大量培養の条件設定のために、多くの細胞を無駄にすることになる。このことは、特に、初期細胞数が極めて少ない、もしくは、得ることが困難な細胞を用いる場合に大きな問題となり、大量培養のための条件設定を完了すること自体が極めて困難な状況となってしまい、本来の目的である治療に入れなくなるため、手法の改善が要請されていた。
　ところで、疾患治療に用いられる付着性細胞である間葉系幹細胞は、幹細胞としての未分化状態を厳密に維持する必要がある。そのため、治療に要する必要細胞数を得るにあたり、細胞数、細胞密度、及び、培養液の状態などが一定に保持されるように、培養中の状態を厳密に管理し確認しながら、間葉系幹細胞を培養し増殖させる必要がある。特に、幹細胞としての未分化状態を厳密に維持するためには、培養開始時に培養面に付着する細胞数及び細胞密度が一定となるように厳密にコントロールすることが重要である。
　しかし、従来の培養皿もしくは培養ボトルを用いて、幹細胞としての未分化状態を厳密に維持して培養増殖を行う場合には、上記段落で説明したように、培養規模を拡大する上で困難が生じ、コストもかかるため、培養手段への工夫が要請されている。
　そこで、上記各特許文献に記載の従来型の細胞の大量培養用ローラーボトルを用いようとしても、問題がある。それらの大量培養用ローラーボトルは、大量培養を達成するために、円筒形状、軸方向のひだを有する円筒形状、もしくはルーローの多角形の形状を必須構造として有するよう設計されている。そのために、いずれのボトルも、培養面が湾曲した構造となっているため、培養液の培養液表面からボトル内側の培養面までの水深の違いが生じるものとなっている。そのため、培養開始時に、培養液の培養液表面からボトル内側の培養面までの水深が深くなるボトル中央部における細胞濃度が濃くなるとともに、付着前の細胞が湾曲した培養面の下部に集まり細胞塊を形成しやすくなる。そうすると、培養開始時に培養面に付着する細胞数及び細胞密度が一定となるように厳密にコントロールすることが出来ないため、間葉系幹細胞の培養には適さない。細胞塊を形成することは、均質な細胞を得るためには、間葉系幹細胞のみならず、他の付着性細胞においても好ましくない。さらに、培養面が湾曲しているため、培養中の細胞状態を検鏡して確認することができず、ボトルから細胞を剥離し回収するまでは、細胞塊の形成の有無や、培養時における細胞密度やその均一性の程度を確認することもできない。
　そのため、従来、幹細胞としての未分化状態を厳密に維持した均質な間葉系幹細胞を、治療に要する量にまで増殖させ、臨床において使用することには困難があった。
　これを防止し、細胞を均一に接着しようとすると、細胞が不均一に沈降し細胞塊を形成しないよう、回転条件下にて培養を開始する必要がある。そうすると、回転時の培養液及び培養面の移動に基づく力が細胞にかかり、細胞が有している培養面への接着力が削がれるため、より強い接着力を有する細胞でなければ用いることができなくなり、治療に用いる細胞を選択するにあたり、自由度が減る。
　また、特定の性質を保持した細胞を得るために、他の細胞を共培養することが必要なものもあるが、治療に用いるためには共培養した細胞を除去するか、その混入をなるべく減らす工夫を要する場合がある。しかし、上記従来の培養皿、培養ボトル及びローラーボトルを用いる場合には、大量に増殖させた治療用細胞から共培養した細胞のみを除去することや、共培養した細胞の混入を抑制することは困難であった。また従来の共培養用容器は、容器のコストが大変高く、治療に用いる程に大量の細胞を培養するために従来の共培養用容器を数多く用いることには困難がある。
特公平６－６１２５６号公報
米国特許第５８６６４１９号明細書
　本発明が解決しようとする課題は、疾患治療に用いる間葉系幹細胞を、幹細細胞としての未分化状態を培養中に確認しながら厳密に維持管理し、疾患治療に必要な量が得られるまで大量培養し、該細胞を均質、安価、かつ効率よく回収することである。
　また、本発明が解決しようとする課題は、疾患治療に用いる付着性細胞又は付着性細胞により産生される因子を得るために、細胞状態を培養中に確認しながら、疾患治療に必要な量が得られるまで大量培養し、該細胞又は該因子を均質、安価、かつ効率よく回収することである。
　本発明が解決しようとするさらなる課題は、培養規模の拡大に伴い必要量が増大する、培養細胞を回収するためのピペットや遠心チューブの使用量増大によるコストの飛躍的増大を解消し、安価な大量培養手段を提供することである。
　また、大量培養時の培養面のコーティング処理や、培養面に付着させる細胞の種類を様々に組み合わせるなどの、幅広い培養条件の設定要求に応えることが可能な大量培養用容器を提供することも、本発明が解決しようとする課題である。
　上記の課題を解決するための本発明の第１の手段は、閉塞した下端部および相対向する上端部に液体用開口を有する８角柱の細胞培養用容器であって、該８角柱を形成する各面が平面状であり、該８角柱を形成する各面のうち相対向する２面が水平である、細胞培養用容器である。
　上記の課題を解決するための本発明の第２の手段は、上記上端部に開口する液体用開口からはさらに首部が延在し、該首部には、内周ねじ付きの蓋を受けるための外周ねじ山を有する、上記第１の手段の細胞培養用容器である。
　上記の課題を解決するための本発明の第３の手段は、上記首部の液体用開口側の根元部の外周には、上記細胞培養用容器を保持するための把手部材もしくは穴空き部材を固定するための凸状部を有している、上記第１又は第２のいずれか１の手段の細胞培養用容器である。
　上記の課題を解決するための本発明の第４の手段は、上記閉塞した下端部が円錐状又は８角錐を呈する、上記第１～第３のいずれか１の手段の細胞培養用容器である。
　上記の課題を解決するための本発明の第５の手段は、上記細胞培養用容器の外側面に目盛りが付されている、上記第１～第４のいずれか１の手段の細胞培養用容器である。
　上記の課題を解決するための本発明の第６の手段は、上記細胞培養用容器の８角柱を形成する各面の、任意の面の外側に印が付されている、上記第１～第５のいずれか１の手段の細胞培養用容器である。
　上記の課題を解決するための本発明の第７の手段は、上記細胞培養用容器の該８角柱を形成する各面の内側の培養面が、ゼラチン、細胞外基質又はポリカチオン類で修飾され、細胞接着性が高められているものである、上記第１～第６のいずれか１の手段の細胞培養用容器である。
　本発明の手段の閉塞した下端部および相対向する上端部に液体用開口を有する８角柱の細胞培養用容器で、かつ、該８角柱を形成する各面が平面状であり、該８角柱を形成する各面のうち相対向する２面が水平である、細胞培養用容器を採用することで、細胞の状態を培養しながら確認することが可能となり、初期細胞数が極めて少ない、もしくは、得ることが困難な細胞を用いる場合であっても、大量培養条件を設定でき、かつ、培養面が平面状であることから、細胞密度の均一性を保ち、疾患治療に用いられる間葉系幹細胞のような未分化状態を維持するなど、特定の細胞性状を維持する必要がある付着性細胞を、均質、大量かつ安価に培養し増殖できるものとなった。さらに、閉塞した下端部が円錐状又は８角錐を呈する構造とすることで、遠心チューブの機能を併せ持つ細胞培養用容器となり、更なるコスト低減を図ることが可能になった。
本発明の８角柱の細胞培養用容器の一例を示した図である。 本発明の８角柱の細胞培養用容器の一例における断面図である。 本発明の８角柱の細胞培養用容器に蓋を閉めた状態の一例を示す図である。 本発明の８角柱の細胞培養用容器を用い培養する状態を説明する図である。 本発明の８角柱の細胞培養用容器の培養面にゼラチンコート処理を１面おきに行った状態の容器を撮影したものを図示して示す。
　本発明を実施するための形態について、適宜図面を参照しつつ以下に説明する。
　（素材について）
　本発明の細胞培養容器及び蓋の部材を形成するために用いる材料は特に限定されないが、細胞培養において一般的に用いられる材料を使用することができる。
　上記材料は、例えば、樹脂材料、及び、ガラスや石英等の無機材料、金属を用いることができるが、製造の容易性、コスト低減、細胞培養状態の把握の容易性を考慮し、好ましくは、樹脂材料を用いる。
　そして、上記樹脂材料としては、ポリエチレンテレフタレート樹脂、ポリスチレン樹脂、ポリエステル樹脂、ポリエチレン樹脂、ポリプロピレン樹脂、ＡＢＳ樹脂、ナイロン、アクリル樹脂、フッ素樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリウレタン樹脂、メチルペンテン樹脂、フェノール樹脂、メラミン樹脂、エポキシ樹脂、塩化ビニル樹脂等の樹脂材料、表面親水化処理を施した上記の少なくとも１種を含む樹脂材料を用いることができる。そして、製造の容易性、コスト低減、細胞培養状態の把握の容易性を考慮し、該樹脂材料として、好ましくは、ポリエチレンテレフタレート樹脂又はポリスチレン樹脂を用いる。
　（８角柱の細胞培養用容器の形状について）
　本発明の８角柱の細胞培養用容器１は、閉塞した下端部２および相対向する上端部に液体用開口３を有する８角柱の細胞培養用容器の構造を有している。そして、上記８角柱を形成する各面が平面状であり、８角柱を形成する各面のうち相対向する２面は、ほぼ水平となっている構造を有している。
　また、培養遠心容器として、細胞培養に加えて遠心分離用チューブとしても用いることが可能になるよう、上記閉塞した下端部２については、円錐状又は８角錐の形状を呈する構造を有するものにできる。（図１及び図２）。
　そして、上端部に開口する液体用開口２からはさらに首部４が延在しており、該首部は、内周ねじ付きの蓋５を受けるための外周ねじ山６を有している。
　さらに、回転培養を機械制御により行うことを容易とするための構造として、上記首部４の液体用開口側の根元部の外周は、該８角柱の細胞培養用容器を上向きに保持、横向きに保持、並びに、液体用開口２を斜め下向きにし、容器内部に満たした培養液をデカンテーションにて排出するように保持するための、把手部材もしくは穴空き部材を固定するための凸状部７をを有している。
　また、上記細胞培養用容器１の外側面には、任意に目盛りを付して、該目盛りにより、培養用容器内の培養液量及び細胞量を目視で概算することが可能な構造とすることができる。そして、さらに、上記細胞培養用容器の８角柱を形成する各面の、任意の面の外側に印を付して、培養面をそれぞれ区別することが可能な構造とすることができる。
　なお、上記細胞培養用容器は１、培養液を満たし培養する際に十分な強度を持つ程度の壁圧を発揮する厚みを有したものとなるようにする必要がある。さらに、下端部が円錐状又は８角錐の形状を呈する構造となり、培養容器としてのみならず、遠心分離用チューブとして細胞回収に用いるようにする場合には、細胞を回収するために要する遠心分離に十分耐えることが可能な強度を持つ厚みを有した細胞培養用容器兼遠心チューブとなるようにするべきである。
　（製造工程について）
　本発明の細胞培養容器は、上記８角柱の細胞培養用容器１の形状に成型できるように調製した金型を用いて製造し、上記樹脂材料を用いる場合には、吹き込み成形により一体成形されたものとすることができる。
　培養する細胞の種類により、培養途中にて、位相差顕微鏡などを利用して検鏡し培養中の細胞状態を詳細に確認する必要が生じる場合がある。そこで、良好な状態で検鏡し培養中の細胞状態を詳細に確認することができるようにするため、金型の培養面形成部分に鏡面処理を施すなどして、本発明の８角柱の細胞培養用容器の培養面が、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡など各種の顕微鏡による検鏡に適した、ひずみの少ない状態となるようにしてから、容器を製造することができる。
（培養面の修飾について）
　さらに、本発明の８角柱の細胞培養用容器１の培養面への細胞の付着性を高めるために培養面を修飾するための成分として、ゼラチン、細胞外基質又はポリカチオン類を、培養面の表面に塗布されたものとしても良い。ゼラチン、細胞外基質又はポリカチオン類は、細胞培養に用いられているものであればその種類を特に限定しない。細胞外基質としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンなど、ポリカチオン類としては、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリオルチニンなどを用いることができる。
　また、上記の各成分は、培養面へのより高い付着性を発揮させることを望む部位に塗布することができ、本発明の８角柱の細胞培養用容器１に８面ある培養面全てに塗布しても良く、１面おきに４面塗布しても良く、所望の面のみに塗布しても良く、また、面によって異なる成分を塗布したものとしても良い。
（細胞培養用容器外面へ印をつける工程について）
　本発明の８角柱の細胞培養用容器１は、培養面が８面存在することから、各々の培養面を外部から視認もしくは機器にて認識し、区別することが可能となるようにするため、容器の外側に、各面を区別するための印を付したものとすることができる。印は、文字、記号、バーコード、模様などの任意のものを選択して用いることができ、インクを用いて印刷するか、レーザーやエッチングで刻入することで付すことができる。また、該容器金型に予め所望の印をつけ、細胞培養用容器表面に印が付されたものとして製造されるようにしても良い。
　上記のようにして本発明の８角柱の細胞培養用容器１の外部の必要な部位に印をつけ、該印を識別する装置を併用することで、本発明の８角柱の細胞培養用容器を回転制御する処理装置にて培養用容器並びに該容器における培養面の位置を正確に識別させることができるようになり、回転制御の自由度が高まる。また、作業者が自ら本発明の８角柱の細胞培養用容器を回転制御する際にも、該容器における培養面の位置をそれぞれ識別することが可能となり、作業の正確性が高まる。
　また、本発明の８角柱の細胞培養用容器１は、容器下部２が円錐状又は８角錐を呈した構造を有したものとすることで、遠心分離機にて、容器培養面から剥離させた細胞を遠心分離することが可能となる、遠心分離用チューブとしての機能も併せ持つ構造のものとすることができる。そこで、遠心分離用後に、容器下部の円錐状又は８角錐部位にペレットとして集まる細胞や、培養液の量を目視により判別できるようにするため、円錐状又は８角錐部位の外側に目盛りを付したものとすることができる。目盛りは、インクを用いて印刷するか、レーザーやエッチングで刻入することで付すことができる。また、容器金型に予め目盛り印をつけ、容器表面に目盛りが付されたものとして製造されるようにしても良い。
　細胞培養容器に、透明性のある樹脂材料、及び、ガラスや石英等の無機材料などを用いることで、遠心前に、細胞培養容器外部から細胞が懸濁された培養液の濁度を測定することができるため、測定した濁度の数値を外挿することにより細胞が懸濁された培養液中の細胞数を数値化することができ、さらに、遠心後にはペレット量を目視もしくはカメラやセンサー機器を用いて計測し、回収したペレット中の細胞数を大まかに数値化することができるようになる。
　（滅菌工程について）
　本発明の８角柱の細胞培養容器１は、滅菌されたものとして提供され得る。細胞培養容器を滅菌する方法は特に限定されないが、細胞培養容器を滅菌する方法として一般に用いられる方法を用いることができる。該滅菌方法としては、例えば、γ線照射滅菌、電子線滅菌、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、紫外線照射滅菌、過酸化水素滅菌、エタノール滅菌の方法を用いることができる。そして、製造の容易性やコスト低減を考慮し、細胞培養容器を大量かつ簡便に製造するため、該滅菌方法として、好ましくは、電子線滅菌又はγ線照射滅菌を用いる。電子線滅菌は細胞培養容器を劣化させない程度にて行い、また、γ線照射滅菌におけるγ線の照射エネルギーは、細胞培養容器を劣化させない程度にて滅菌することができるよう、５ｋＧｙ～３０ｋＧｙ程度の範囲までとすることが好ましいが、使用する細胞に合わせて、好適な滅菌方法を選択し用いることができる。
　以下に、本発明の８角柱の細胞培養用容器１を製造し使用した実施例を示す。本発明はこれらの記載に何ら制限を受けるものではない。
　（実施例１）
　本発明の８角柱の細胞培養用容器１を製造した。８角柱の細胞培養用容器１及びそれに合わせて用いる蓋５を成形するための金型を作製した。該金型には、培養面が平滑となるよう、鏡面処理を施し、また、成形後の８角柱の細胞培養用容器１の下部の８角錐部位の外側に目盛りが付されたものとなるようにした。
　ポリエチレンテレフタレート樹脂を用い、上記金型を用いて吹き込み成形により、８角柱の細胞培養用容器１を一体成形した。各培養面を識別できるよう、容器の培養円外側にインクを用いて印を付した。蓋５についても同様に成形した。製造した８角柱の細胞培養用容器１及び蓋５の一部については、電子線滅菌処理により滅菌した。
　（実施例２）
　色素入りの２％ゼラチン溶液を調製した。
　８角柱の細胞培養用容器１を横に倒し、８角柱を形成する培養面のうちの１面（図４におけるＮｏ．１で表示した面）が底面となるようにし、容器上端部に配した液体用開口３より、色素入りの２％ゼラチン溶液を、該底面を覆う程度の量注入した後、一定時間放置し、ゼラチン溶液をＮｏ．１の培養面上に定着させた。なお、色素は、ゼラチンによるコーティング処理が均一に施されたことを容易外側から簡便に判別するために加えたものである。
　８角柱の細胞培養用容器１を横に倒したまま、該容器の８角柱の軸線回りに時計回りに回転させる作業を行い、先に底面となるようにした培養面から時計回りに２つ目の培養面（図４におけるＮｏ．３の面）が新たな底面となるようにした。そして、容器上端部に配した液体用開口３より、色素入りの２％ゼラチン溶液を、該底面を覆う程度の量注入し、一定時間放置し、ゼラチン溶液をＮｏ．１の培養面上に定着させた。上記作業を繰り返し、図４におけるＮｏ．５及びＮｏ．７の面にも、ゼラチン溶液を定着させた。
　上記作業により、８角柱を形成する培養面のうち、１面おきに合計４面の培養面を、コーティング処理することができた（図５）。
　本発明の、８角柱を形成する各培養面が平面状であり、８角柱を形成する各面のうち相対向する２面がほぼ水平である、８角柱の細胞培養用容器１については、各培養面を任意かつ容易に、コーティング処理することが可能であることが明らかとなった。
　さらに、上記のように、１面おきに容易に処理できたことから、本発明の８角柱の細胞培養用容器１は、所望の面のみに、培養させることを希望する細胞を付着させる作業も、容易になし得ることが明らかとなった。
　（実施例３）
　イヌ皮下脂肪組織から脂肪由来間葉系幹細胞を分離培養した。全ての実験及び術式は、研究施設内委員会が定めた指針に基づき実施された。
　イヌを麻酔処置し、皮下脂肪組織を得た。皮下脂肪組織を、酵素処理し、１ｘＰＢＳ緩衝液（希釈倍率，１：１；ｖ／ｖ）で洗浄後、１ｘＰＢＳ緩衝液に再分散させたのち、シリンジ中を複数回通す作業を行った。緩衝液を捨てた後、新たなＥＤＴＡを含有させた１ｘＰＢＳ緩衝液を存在下にて、シリンジ内壁や針腔に付着した脂肪由来間葉系幹細胞を回収した。回収した脂肪由来間葉系幹細胞を１ｘＰＢＳ緩衝液で洗浄後、培養用のＦＢＳ添加培養液に所定の細胞数にて再懸濁した。
　本発明の８角柱の細胞培養用容器１中に、上記の脂肪由来間葉系幹細胞を懸濁した培養液８を、容器上端部に配した液体用開口３より容器内部へそっと注入し、容器の首部４に蓋５をした。蓋５はきつく閉めすぎないようにし、細胞培養用インキュベーター中に８角柱の細胞培養用容器１を静置した際に、通気性を十分保てる程度となるようにした。
　８角柱の細胞培養用容器１を横に倒し、８角柱を形成する培養面のうちの１面（図４におけるＮｏ．１で表示した面）が底面となるようにし、脂肪由来間葉系幹細胞用の温度、湿度、酸素及び二酸化炭素濃度に設定済みの細胞培養用インキュベーター中に静置した。
　一定時間毎に、８角柱の細胞培養用容器１を横に倒したまま、先に底面となるよにした培養面に隣接した培養面（図４におけるＮｏ．２の面）が新たな底面となるように、該容器の８角柱の軸線回りに時計回りに回転させる作業を行った。これを、一定時間毎に繰り返し、Ｎｏ．３～Ｎｏ．８の面まで１回転させた。
　８角柱の細胞培養用容器の８角柱の軸線回りに時計回りに１回転した後、８面ある培養面全てを位相差顕微鏡にて検鏡し、細胞の付着量、分布の程度を確認した。
　その結果、本発明の８角柱の細胞培養用容器１には、８面ある培養面毎に、均一に脂肪由来間葉系幹細胞が培養面に付着していることが確認された。そして、８角柱の軸線回りに時計回りに回転させるにあたり、静置する時間を長めにすると、培養面Ｎｏ．１からＮｏ．８にかけて細胞密度が減少する傾向が観察された。しかし、静置時間を短めにすると、各培養面に付着する細胞数は少ないものの、細胞密度に差は確認されなかった。
　このように、本発明の８角柱の細胞培養用容器は、８角柱の軸線回りに時計回りに回転させるにあたり、培養面を静置する時間を好適化することで、初期の脂肪由来間葉系幹細胞の付着密度をほぼ一定にすることができるものであることが判明した。
　上記の脂肪由来間葉系幹細胞を各面に付着させた８角柱の細胞培養用容器１を、細胞培養用インキュベーター中に静置し、さらに一定時間毎に該容器の８角柱の軸線回りに時計回りに回転させながら、培養を続けた後、検鏡した。そして、蓋５を開け、培養面に付着した脂肪由来間葉系幹細胞の剥離処理を行った後、懸濁液の液量並びに懸濁液中の細胞数を計測した。
　そして、更に遠心分離処理を行い、該容器を斜めに傾けて、脂肪由来間葉系幹細胞のペレットを残し、不要な培養上清を、該容器上端部に配した液体用開口３よりデカンテーションにより捨てた。その後、脂肪由来間葉系幹細胞のペレットを回収した。
　その結果、脂肪由来間葉系幹細胞数が良好に増加したことが確認できた。
（比較例）
　比較例として、従来のローラーボトルに上記脂肪由来間葉系幹細胞を懸濁した培養液を加え、回転培養を行った。ローラーボトルは培養面が曲面状となっているため、顕微鏡による培養面全体の観察は上手くできなかった。そこで、細胞を剥離させた後、細胞数を計測し、細胞懸濁液を遠心チューブに移して遠心分離処理を行い、脂肪由来間葉系幹細胞をペレットとして回収した。その結果、本発明の８角柱の細胞培養用容器より、細胞数増加率は低かった。
　本発明の手段の閉塞した下端部および相対向する上端部に液体用開口を有する８角柱の細胞培養用容器で、かつ、該８角柱を形成する各面が平面状であり、該８角柱を形成する各面のうち相対向する２面が水平である、細胞培養用容器、及び、さらに、閉塞した下端部が円錐状又は８角錐を呈する構造を有する上記細胞培養用容器を、付着性細胞の大量培養用容器に採用することで、細胞の状態を培養しながら確認することが可能となり、初期細胞数が極めて少ない、もしくは、得ることが困難な細胞を用いる場合であっても、大量培養条件を設定できる。
　また、培養容器の培養面が平面状であることから、細胞密度の均一性を保ち、疾患治療に用いられる間葉系幹細胞のような未分化状態を維持するなど、特定の細胞性状を維持する必要がある付着性細胞を、均質、大量かつ安価に培養し増殖できるものとなった。
　さらに、各培養面毎に、コーティング処理や、付着させる細胞を換えることが可能となり、幅広い培養条件の設定要求に応えることが可能な大量培養用容器を提供することができるようになった。
　１　８角柱の細胞培養用容器
　２　下端部
　３　液体用開口
　４　首部
　５　内周ねじ付きの蓋
　６　外周ねじ山
　７　凸状部
　８　細胞を懸濁した培養液

Claims (8)

  1. 閉塞した下端部および相対向する上端部に液体用開口を有する８角柱の細胞培養用容器であって、該８角柱を形成する各面が平面状であり、該８角柱を形成する各面のうち相対向する２面が水平である、細胞培養用容器。
  2. 上記上端部に開口する液体用開口からはさらに首部が延在し、該首部には、内周ねじ付きの蓋を受けるための外周ねじ山を有する、請求項１に記載の細胞培養用容器。
  3. 上記首部の液体用開口側の根元部の外周には、上記細胞培養用容器を保持するための把手部材もしくは穴空き部材を固定するための凸状部を有している、請求項１又は請求項２のいずれか１項に記載の細胞培養用容器。
  4. 上記閉塞した下端部が円錐状又は８角錐を呈する、請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養用容器。
  5. 上記細胞培養用容器の外側面に目盛りが付されている、請求項１～請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養用容器。
  6. 上記細胞培養用容器の８角柱を形成する各面の、任意の面の外側に印が付されている、請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養用容器。
  7. 上記細胞培養用容器の８角柱を形成する各面が、透明性を有する、樹脂材料、ガラス又は石英からなる、請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養用容器。
  8. 上記細胞培養用容器の該８角柱を形成する各面の内側の培養面が、ゼラチン、細胞外基質又はポリカチオン類で修飾され、細胞接着性が高められているものである、請求項１～請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養用容器。
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