WO2015137427A1 - 生体分子抽出用チップ、及び生体分子抽出用チップの製造方法 - Google Patents

生体分子抽出用チップ、及び生体分子抽出用チップの製造方法 Download PDF

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WO2015137427A1
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隆雄 安井
剛 柳田
範匡 加地
川合　知二
馬場　嘉信
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国立大学法人名古屋大学
国立大学法人大阪大学
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502753—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by bulk separation arrangements on lab-on-a-chip devices, e.g. for filtration or centrifugation
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    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Definitions

  • the present invention relates to a biomolecule extraction chip and a method for manufacturing a biomolecule extraction chip.
  • a part of the nanowire formed in the microchannel of the biomolecule extraction chip is embedded in the microchannel, so that the nanowire can be microchanneled even if the flow rate of the sample is increased.
  • the present invention relates to a biomolecule extraction chip that can efficiently extract biomolecules without peeling from the substrate, and a method for manufacturing the biomolecule extraction chip.
  • microRNA micro ribonucleic acid
  • miRNA micro ribonucleic acid
  • the analysis of the included miRNA is actively performed.
  • efficient extraction of exosomes from a small sample that is, a large amount of information obtained from a small amount of solution is important. is there.
  • an ultracentrifugation method As an existing exosome separation method, an ultracentrifugation method, an agglutination reagent method, and the like are known.
  • the most commonly used ultracentrifugation method requires a sample amount of several tens of mL and a separation time of 4 to 5 hours, and also efficiently separates exosomes with a recovery rate of about 5 to 25%. There is a problem that it is difficult.
  • the agglutination reagent method is a simple method in which the agglutination reagent is dropped onto the target sample and allowed to stand, but the separation requires a long period of time (0.5 hours to overnight), and centrifugation is performed.
  • problems such as use of a machine, change in particle size, decrease in the number of particles, and decrease in the amount of marker protein.
  • Non-Patent Document 1 A method for highly efficient extraction has been announced (see Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 nanowires are grown from the surface in the microchannel. Therefore, if the sample input speed is increased in order to improve the throughput of sample recovery, there is a problem that the nanowires are separated from the surface of the microchannel.
  • Non-Patent Document 2 is for producing a resin in which a part of the nanowire is embedded twice based on the resin in which a part of the nanowire is embedded. Therefore, at the time of the above-mentioned step “(5) producing the resin layer I and the resin layer II in which the nanowire is embedded by peeling the resin II so as to break the nanowire from the surface of the resin layer I”, The surfaces of the two obtained “resin layers I” and “resin layer II” must have the same shape, that is, flat surfaces. Therefore, the method described in Non-Patent Document 2 has a problem that it is difficult to design a microchannel or the like and embed a part of the nanowire in the microchannel.
  • the present invention has been made in order to solve the above-described conventional problems, and as a result of extensive research, a substrate including a stepped portion is produced by making full use of electron beam lithography and photolithography techniques.
  • the substrate on which nanowires are grown is used as a template and transferred to the substrate of the biomolecule extraction chip, the stepped portion becomes a microchannel, and a part of the transferred nanowire is embedded in the microchannel and embedded.
  • the inventors have newly found that a biomolecule extraction chip in which a part of the nanowire is embedded in a microchannel can be produced by growing the nanowire, and the present invention has been completed.
  • an object of the present invention may be described as a biomolecule extraction chip (hereinafter referred to as “chip”) in which a part of the nanowire formed in the microchannel is embedded in the microchannel. And a method of manufacturing the chip.
  • chip biomolecule extraction chip
  • the present invention relates to a chip and a method for manufacturing the chip, which will be described below.
  • a biomolecule extraction device including a substrate, a microchannel formed on the substrate, and a nanowire formed in the microchannel, and a part of the nanowire is embedded in the microchannel Chip.
  • the biomolecule extraction chip according to (1) wherein the surface of the nanowire is positively charged.
  • the biomolecule extraction chip according to (1) wherein the surface of the nanowire is formed of a material having an isoelectric point lower than the isoelectric point of nucleic acid.
  • a step of forming a step on the substrate to form a microchannel by transferring A step of growing a nanowire on the step and producing a mold; Transferring the template to the substrate of the biomolecule extraction chip; A step of growing nanowires embedded in a microchannel of a biomolecule extraction chip; A method for producing a biomolecule extraction chip in which a part of a nanowire is embedded in the microchannel.
  • a part of the nanowire formed in the microchannel is embedded in the microchannel, so that the nanowire is separated from the microchannel even if the inflow rate of the sample is increased. It becomes difficult. Therefore, the extraction time of the biomolecule can be shortened.
  • a substrate including a stepped portion produced using electron beam lithography and photolithography techniques is used as a mold. Accordingly, the stepped portion, that is, the shape such as the width and depth of the microchannel after transfer, the number, etc. can be arbitrarily designed.
  • nanowires can be repeatedly grown on the step portion of the mold used in the chip manufacturing method of the present invention. Therefore, the chip can be repeatedly manufactured using the same mold.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a conventional method for efficiently producing a resin in which a part of a nanowire is embedded.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the chip 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing an example of a manufacturing process of the chip 1 of the present invention.
  • 4 is a drawing-substituting photograph, and
  • FIG. 4 (1) is a field emission scanning electron microscope (FESEM) photograph of a nanowire grown on the step 14 of the substrate 11 which is a mold in Example 1.
  • FIG. 4 (2) is an enlarged photograph of FIG. 4 (1).
  • FIG. 5 is a drawing-substituting photograph, FIG.
  • FIG. 5 (1) is an FESEM photograph of the step 14 of the substrate 11 which is a mold after the polydimethylsiloxane 2 is peeled off in Example 1, and FIG. 5 (2) is FIG. ) Is an enlarged photo.
  • FIG. 6 is a drawing-substituting photograph
  • FIG. 6 (1) is a FESEM photograph of the microchannel 3 of polydimethylsiloxane 2 after the template is transferred in Example 1
  • FIG. 6 (2) is FIG. 6 (1).
  • FIG. 7 is a drawing-substituting photograph.
  • FIG. 7A is a FESEM photograph of the microchannel 3 after the nanowire 17 is grown for 3.5 hours after the polydimethylsiloxane 2 is peeled off in Example 1.
  • FIG. 7A is a FESEM photograph of the microchannel 3 after the nanowire 17 is grown for 3.5 hours after the polydimethylsiloxane 2 is peeled off in Example 1.
  • FIG. 8 is a drawing-substituting photograph
  • FIG. 8 (1) is an FESEM photograph of the microchannel 3 after the nanowire 17 is grown for 10 hours after the polydimethylsiloxane 2 is peeled off in Example 1.
  • FIG. ) Is an enlarged photograph of FIG.
  • a biomolecule extraction chip in which a part of the nanowire formed in the microchannel is embedded in the microchannel and a method for manufacturing the chip will be described in detail.
  • “a part of the nanowire is embedded in the microchannel” means that at least particles or a catalyst serving as a nucleus for growing the nanowire are placed on the surface in the microchannel. It means that it is embedded in the inner wall inside the microchannel.
  • FIG. 2 shows an example of the chip of the present invention.
  • 2 includes a substrate 2, a microchannel 3 formed on the substrate 2, a sample insertion portion 4 formed at one end of the microchannel 3, and a residue formed at the other end of the microchannel 3.
  • recovery part 5 is included.
  • the nanowire partially embedded in the flow path is provided.
  • the sample input unit 4 and the residue or sample recovery unit 5 may not be provided.
  • a sample solution containing exosomes (culture fluid, body fluid such as serum and urine) is sent from the sample input unit 4 using a syringe pump or the like. Then, the solution after separating the sample from the residue or the sample collection unit 5 is collected. Then, after the sample solution is flowed, the exosome adsorbed on the nanowire may be analyzed. Since the exosome is negatively charged, the surface of the nanowire is preferably positively charged. For example, a nanowire having a coating layer formed of a positively charged material such as ZnO nanowire or nickel oxide may be used. In addition, in the case of using nanowires whose surface is positively charged, biomolecules such as proteins that are positively charged can be extracted by applying an electric field so that the recovery part becomes negative.
  • a suspension in which the sample is suspended is loaded into the sample loading unit 4.
  • cells, viruses, and fungi include cells having a cell membrane structure.
  • viruses include norovirus, rotavirus, influenza virus, adenovirus, coronavirus, measles virus, rubella virus, hepatitis virus, herpes virus, HIV and the like.
  • fungi examples include mushrooms, molds, yeasts, etc., and specifically include ringworm fungi, Candida, Aspergillus, filing yeast, and the like.
  • ringworm fungi examples include mushrooms, molds, yeasts, etc.
  • Candida examples include Aspergillus, filing yeast, and the like.
  • mitochondria and extracellular vesicles can also be mentioned as samples.
  • a residue extraction unit is provided at the other end between the sample input unit 4 and the portion of the microchannel 3 provided with the nanowire (dotted line portion in FIG. 1). The nucleic acid may be taken out from the residue or the sample collection unit 5 and the crushed cell residue may be taken out from the residue extraction unit.
  • the surface of the nanowire has no isoelectric point lower than the isoelectric point of the nucleic acid because the nucleic acid leaked from the pores of the cells and the like is preferably not adsorbed to the nanowire by electrostatic interaction.
  • the surface of the nanowire may be covered with a material such as SiO 2 or TiO 2 .
  • an analyzer By incorporating the chip 1 of the present invention into a known analyzer, an analyzer can be configured. Moreover, by using together with a known analyzer, the extracted biomolecule can be analyzed as it is. Further, an analysis unit for analyzing the biomolecule extracted on the chip 1 may be formed. For example, when nucleic acid is extracted using the chip 1 of the present invention, the nucleic acid extracted from the sample elongates when flowing between nanowires, (1) By making the chip 1 into a shape that can be incorporated into a known nucleic acid sequencer, nucleic acid extraction and nucleic acid sequence analysis can be carried out with one apparatus. (2) The nucleic acid sequence can be analyzed by separately introducing the extended nucleic acid into a nucleic acid sequencer. (3) By forming an analysis unit such as an electrode for performing nucleic acid analysis on the chip 1, a new analysis device capable of performing nucleic acid extraction and nucleic acid sequence analysis with a single device can be produced.
  • the chip 1 of the present invention can be manufactured by transferring a template produced using electron beam lithography and photolithography technology onto a resin or the like, and further growing nanowires embedded in the transferred resin or the like.
  • FIG. 3 shows an example of a manufacturing process of the chip 1 of the present invention.
  • the Cr layer 12 is deposited on the mold substrate 11 by sputtering.
  • a positive photoresist 13 is applied with a spin coater.
  • a pattern corresponding to the microchannel 3 of the chip 1 when transferred is produced by photolithography.
  • the Cr layer 12 other than the pattern corresponding to the microchannel 3 is etched with a Cr etchant solution.
  • By etching the substrate 11 only selectively, the substrate 11 other than the pattern corresponding to the microchannel 3 is etched to form the step 14 corresponding to the microchannel 3.
  • the depth of the micro flow path 3 can be adjusted by adjusting the depth of the step 14.
  • the Cr layer 12 and the positive photoresist 13 on the step 14 are etched with a Cr etchant solution.
  • Particles or catalyst 15 for producing nanowires are applied on the substrate 11 by pulsed laser deposition (PLD).
  • PLD pulsed laser deposition
  • a resist 16 for electron beam lithography is applied, and a place where the nanowire is grown on the step 14 is drawn by electron beam lithography.
  • the drawing of electron beam lithography may be formed in a pattern in which nanowires are to be grown. When nanowires are grown at a predetermined interval, dots at predetermined intervals are used. When nanowires are to be grown at random, from any location on the step 14. All that is on the step 14 may be drawn so that the nanowire can grow.
  • the resist is developed and removed.
  • the nanowire 17 is grown from the place where the resist is removed and the particles or the catalyst 15 are exposed, and a template used for manufacturing the chip 1 of the present invention is manufactured.
  • a material for the substrate 2 of the chip 1 is applied to a mold.
  • the substrate 1 is peeled from the mold to form the chip 1 in which a part of the nanowire 17 is embedded in the microchannel 3.
  • the nanowire 17 embedded in the microchannel 3 is further grown.
  • the sample input unit 4, the residue or sample recovery unit 5, and a residue extraction unit as necessary are formed. Note that the sample input unit 4, the residue or sample recovery unit 5, and the residue extraction unit may be simultaneously designed when the microchannel 3 is designed by photolithography, and may be formed by transfer.
  • the above steps (8) to (11) may be repeated using the mold produced in the above step.
  • the above process is merely an example of the manufacturing process of the chip 1, and a step 14 is formed on the substrate 11, and the nanowires 17 grown on the step 14 are transferred to the substrate 2 of the chip 1.
  • the nanowire 17 can be embedded in the microchannel 3 of the chip 1.
  • the mold substrate 11 is not particularly limited as long as the step 14 can be formed by etching.
  • the step 14 is formed by dry etching, silicon, quartz glass, Pyrex (registered trademark) glass, or the like can be used.
  • step 14 when the step 14 is formed by wet etching, silicon, quartz glass, Pyrex (registered trademark) glass, or the like may be used as in dry etching.
  • the positive photoresist 13 is not particularly limited as long as it is generally used in the semiconductor manufacturing field, such as TSMR V50 and PMER. Further, a negative type photoresist may be used instead of the positive type, and there is no particular limitation as long as it is generally used in the semiconductor manufacturing field, such as SU-8 and KMPR.
  • the etchant solution for the Cr layer 12 is not particularly limited as long as it can etch Cr, such as H 2 O: Ce (NH 4 ) 2 (NO 3 ) 6 : HClO 4 . Further, the present invention is not limited to Cr, and a material other than Cr may be deposited and used in combination with an etchant that can etch the material.
  • a known dry method such as sulfur hexafluoride (SF 6 ), carbon tetrafluoride (CF 4 ), trifluoromethane (CHF 3 ), or the like.
  • An etching gas may be used.
  • hydrogen fluoride (HF) may be used when the substrate 11 is glass, and potassium hydroxide (KOH), sodium hydroxide (NaOH), or the like may be used when silicon is used.
  • Examples of the particles 15 for producing the nanowire 17 include ZnO.
  • Examples of the catalyst 15 for producing the nanowire 17 include gold, platinum, aluminum, copper, iron, cobalt, silver, tin, indium, zinc, and gallium.
  • the resist 16 for electron beam lithography is not particularly limited as long as it is generally used in the semiconductor field, such as ZEP520 and PMMA.
  • the resist removing solution is not particularly limited as long as it is a common removing solution in the semiconductor field, such as dimethylformamide and acetone.
  • the nanowire 17 may be grown from the particles or the catalyst 15 by a known method.
  • ZnO fine particles when used as the particles 15, they can be produced using the hydrothermal synthesis method described in Non-Patent Document 3. Specifically, a heated substrate in a precursor solution in which zinc nitrate hexahydrate (Zn (NO 3 ) 2 .6H 2 O) and hexamethylenetetramine (C 6 H 12 N 4 ) are dissolved in deionized water. By immersing 11, the ZnO nanowire 17 can be grown from the portion where the ZnO particles 15 of the step 14 are exposed.
  • ZnO fine particles when ZnO fine particles are used as the particles 15, they can be produced using the hydrothermal synthesis method described in Non-Patent Document 3. Specifically, a heated substrate in a precursor solution in which zinc nitrate hexahydrate (Zn (NO 3 ) 2 .6H 2 O) and hexamethylenetetramine (C 6 H 12 N 4 )
  • the nanowire 17 can be produced by the following process.
  • a material such as SnO 2 , Sm 2 O 3 , or EuO
  • a core nanowire is formed by physical vapor deposition such as pulse laser deposition or VLS (Vapor-Liquid-Solid).
  • (B) A coating layer around the core nanowire by using a general vapor deposition method such as sputtering, EB (Electron Beam) vapor deposition, PVD (Physical Vapor Deposition), ALD (Atomic Layer Deposition) using SiO 2 , TiO 2 or the like.
  • a general vapor deposition method such as sputtering, EB (Electron Beam) vapor deposition, PVD (Physical Vapor Deposition), ALD (Atomic Layer Deposition) using SiO 2 , TiO 2 or the like.
  • the coating layer of said (b) is not essential, You may grow and transfer only a core nanowire.
  • the length of the nanowire embedded in the microchannel 3 after the transfer is determined according to the length of the nanowire 17 grown on the step 14. Therefore, when it is desired to increase the sample inflow rate, the growth of the nanowire 17 on the step 14 may be adjusted as appropriate so that the length of the embedded nanowire becomes longer. For example, when all of the electron beam lithography resist 16 on the step 14 is drawn, the nanowire-producing particles or the catalyst 15 are exposed on the step 14. When transferred to the substrate 2 for producing the chip 1 in this state, the particles on the step 14 or the catalyst 15 are transferred so as to be embedded in the microchannel 3. By growing the nanowire 17 from the embedded particle or catalyst 15, the nanowire 17 partially embedded in the microchannel 3 can also be produced.
  • the substrate 2 for producing the chip 1 of the present invention is not particularly limited as long as the template can be transferred.
  • thermoplastic resins such as polyethylene, polypropylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, polystyrene, polyvinyl acetate, polytetrafluoroethylene, ABS (acrylonitrile butadiene styrene) resin, AS (acrylonitrile styrene) resin, acrylic resin (PMMA), etc.
  • thermosetting resin such as phenol resin, epoxy resin, melamine resin, urea resin, unsaturated polyester resin, alkyd resin, polyurethane, thermosetting polyimide, silicone rubber;
  • a resin having light permeability and non-affinity with the biomolecule is desirable.
  • COP cycloolefin polymer
  • PDMS polydimethylsiloxane
  • PMMA Polymethyl methacrylate
  • PC polycarbonate
  • the growth of the nanowire 17 embedded in the microchannel 3 after peeling off the substrate 2 may be performed in the same procedure as described above.
  • the nanowire 17 when growing the nanowire 17 using the catalyst 15, the nanowire 17 may not have a branched chain and may have a branched chain.
  • the diameter of the nanowire 17 grown in the microchannel 3 may be adjusted as appropriate according to the purpose. For example, when adsorbing an exosome, if it is too thin, the exosome may be destroyed. Therefore, it may be larger than the exosome, for example, 100 nm or more. In the case of disrupting cells or the like, the diameter may be changed according to the size of cells, viruses, fungi, etc., the strength of the cell membrane or cell wall, etc., and the prokaryotic cells are 1 ⁇ m to 10 ⁇ m, true. Nucleus cells are 5 ⁇ m to 10 ⁇ m, viruses are several 10 nm to several 100 nm, and blood cells are 7 ⁇ m to 15 ⁇ m in size.
  • the diameter of the nanowire may be 10 nm or more, 15 nm or more, 20 nm or more, or 25 nm or more.
  • the diameter of the nanowire needs to be smaller than the cell or the like that is the object of crushing, for example, 200 nm or less, 150 nm or less, 100 nm or less, 90 nm or less, 80 nm or less, 70 nm or less, 60 nm or less, or 50 nm or less. Also good.
  • the diameter of the nanowire 17 can be appropriately adjusted by changing the size of the particle applied to the step 14 or by forming a coating layer on the produced nanowire 17 when formed using the particle 15.
  • the coating layer may be formed with the same material and coating method as the coating layer when the catalyst 15 is used, and the deposition time may be adjusted as appropriate.
  • a diameter can be suitably adjusted by changing the vapor deposition time at the time of forming a coating layer.
  • the length of the nanowire 17 may be appropriately adjusted in consideration of the depth of the microchannel 3 and the like.
  • the length of the nanowire 17 can be adjusted by changing the immersion time in the precursor solution when formed using the particles 15.
  • it can adjust suitably by changing the growth time by VLS after forming core nanowire.
  • the depth and width of the microchannel 3 formed on the chip 1 are not particularly limited and may be adjusted according to the target biomolecule. However, if the space volume of the microchannel 3 is too small, the pressure loss increases. Therefore, for example, the depth and width may be 1 ⁇ m or more. Further, the number of micro flow paths 3 formed on the chip 1 is not particularly limited, and a plurality of micro flow paths 3 may be provided on the chip 1. The width and depth of the microchannel 3 can be adjusted by the width and height of the step 14, and the number of the microchannel 3 can be adjusted by the number of the steps 14.
  • the template is transferred to the substrate 2 and then formed using a biopsy trepan, ultrasonic drill, or the like. Good.
  • the chip of the present invention was produced by the following procedure. (1) Using an RF (radio frequency) sputtering apparatus (SVC-700LRF, Sanyu Denshi), a 800 nm thick Cr layer 12 is deposited on a silicon (111) substrate 11 (Electronic End Materials Corporation). It was.
  • RF radio frequency
  • the substrate 11 other than the pattern corresponding to the microchannel 3 was etched by about 1 ⁇ m in depth with CF 4 gas.
  • a positive electron beam resist 16 (ZEP520A, Zeon Corp.) was applied to a thickness of about 500 nm by a spin coater.
  • ZEP520A Zeon Corp.
  • SPG-724 electron beam lithography
  • a pattern of spots on which nanowires 17 are grown (a circle with a diameter of about 500 nm, the distance between an arbitrary spot and the edge of an adjacent spot is about 1 ⁇ m) (Lattice).
  • the positive electron beam resist 16 was developed using ZEP 520 A7 to remove the spot type positive electron beam resist 16, thereby producing a spot pattern reaching the ZnO particle layer on the step 14.
  • FIG. 4 (1) is a FESEM photograph of nanowires grown on the step 14 of the substrate 11, and FIG. 4 (2) is an enlarged photograph of the photograph of FIG. 4 (1).
  • FIGS. 4A and 4B it was confirmed that the nanowires grew upward from the spot on the step 14. Note that the length of the nanowire shown in FIG. 4B was about 2 ⁇ m from the layer of the positive electron beam resist 16 on the step 14.
  • FIG. 5 (1) is a FESEM photograph of the step 14 of the substrate 11 after the polydimethylsiloxane 2 is peeled
  • FIG. 5 (2) is a photograph further enlarging the photograph of FIG. 5 (1).
  • the nanowire 17 after the polydimethylsiloxane 2 was peeled was cut from the root portion.
  • FIG. 6 (1) is a FESEM photograph of the microchannel 3 portion of the polydimethylsiloxane 2 to which the template has been transferred
  • FIG. 6 (2) is a photograph further enlarging the photograph of FIG. 6 (1).
  • a part of the nanowire 17 was embedded in the microchannel 3.
  • Nanowires 17 were further grown from the cross section of the nanowires 17 embedded in the polydimethylsiloxane 2 by the same procedure as in the above step (8).
  • FIG. 7 (1) is a FESEM photograph of the microchannel 3 after 3.5 hours
  • FIGS. 7 (2) and (3) are photographs obtained by further enlarging the photograph of FIG. 7 (1).
  • FIG. 8 (1) is a FESEM photograph of the microchannel 3 after 10 hours
  • FIG. 8 (2) is a photograph further enlarging the photograph of FIG. 8 (1).
  • the nanowires 17 transferred into the microchannel 3 of the polydimethylsiloxane 2 were further grown.
  • the diameter of each nanowire 17 shown in FIG. 8 (2) was about 100 nm.
  • the biomolecule extraction chip of the present invention since a part of the nanowire is embedded in the microchannel, it is difficult for the nanowire to be separated from the microchannel even if the inflow rate of the sample is increased. Therefore, since the speed of extracting biomolecules from a sample can be improved, it is useful for rapid biomolecule extraction in medical institutions, universities, companies, research institutions, and the like.

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Abstract

サンプルの流入速度を速くしても、マイクロ流路内のナノワイヤが剥離し難い生体分子抽出用チップを提供する。基板、該基板上に形成されたマイクロ流路、該マイクロ流路上に形成されたナノワイヤを含み、前記ナノワイヤの一部が前記マイクロ流路に埋め込まれている生体分子抽出用チップを提供することでマイクロ流路内のナノワイヤが剥離し難くなる。

Description

生体分子抽出用チップ、及び生体分子抽出用チップの製造方法
　本発明は、生体分子抽出用チップ、及び生体分子抽出用チップの製造方法に関する。特に、生体分子抽出用チップのマイクロ流路内に形成されたナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれていることで、サンプルの流入速度を速くしても、ナノワイヤがマイクロ流路から剥離せず、効率的に生体分子を抽出することができる生体分子抽出用チップ、及び生体分子抽出用チップの製造方法に関するものである。
　エクソソームは早期がん・疾病診断の新規バイオマーカーであるｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ；以下、「ｍｉＲＮＡ」と記載することがある。）を内包しており、体液中や培養上清液中のエクソソームに内包されるｍｉＲＮＡ解析が盛んに行われている。エクソソーム由来ｍｉＲＮＡの解析による効果的な未知のバイオマーカー探索や低侵襲診断を行うためには、少ないサンプルから効率的なエクソソームの抽出、つまり、少ない溶液量から得られる情報量の多さが重要である。
　既存のエクソソーム分離手法には、超遠心分離法や、凝集試薬法などが知られている。最も一般的に用いられている超遠心分離法は、数１０ｍＬのサンプル量及び４～５時間の分離時間が必要であり、また、回収率も５～２５％程度で効率的にエクソソームを分離することが難しいという問題がある。
　一方、凝集試薬法では、対象サンプルに凝集試薬を滴下し静置する簡便な手法ではあるが、分離には長時間の静置（０．５時間～１晩）が必要であり、また、遠心機の使用、粒径の変化や粒子数の減少、マーカータンパク量の減少が生じること等の問題点がある。
　上記問題点を解決するため、本発明者らは、チップのマイクロ流路内に形成したナノワイヤを用いて、少量の体液や培養上清液からエクソソームをナノワイヤに吸着させることで、エクソソーム由来ｍｉＲＮＡを高効率に抽出する方法を発表している（非特許文献１参照）。
Ｓ．　Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，"ＮＡＮＯＷＩＲＥ　ＤＥＶＩＣＥＳ　ＦＯＲ　ＥＸＯＳＯＭＡＬ　ＭＩＣＲＯＲＮＡ　ＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ"，　１７ｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｎ　Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　２７－３１　Ｏｃｔｏｂｅｒ　２０１３，　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，ＧＥＲＭＡＮＹ，要旨集　ｐ１８８７－１８９９ Ｓｕ　Ｚｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，"Ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｄｅｒｅｄ　ＺｎＯ　ｎａｎｏｗｉｒｅ　ａｒｒａｙｓ　ｏｎ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｆｌｅｘｉｂｌｅ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ"，　Ｊ．　Ｍａｔｅｒ．　Ｃｈｅｍ．，　２０１０，　２０，　１０６０６－１０６１０ Ｊｕｎｇ　Ｋｉｍ　ｅｔ　ａｌ．，　"Ｎａｎｏｗｉｒｅ－ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ　ｄｅｖｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｆａｃｉｌｅ　ａｎｄ　ｒｅａｇｅｎｔ－ｆｒｅｅ　ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ　ｃｅｌｌ　ｌｙｓｉｓ"，　Ｌａｂ　Ｃｈｉｐ，２０１２，　１２，　２９１４－２９２１
　しかしながら、非特許文献１に記載されているチップは、マイクロ流路内の表面からナノワイヤを成長させている。したがって、サンプル回収のスループットを向上させるためにサンプルの投入速度を速くすると、ナノワイヤがマイクロ流路表面から剥離してしまうという問題がある。
　ところで、太陽電池、ＬＥＤ（ｌｉｇｈｔ　ｅｍｉｔｔｉｎｇ　ｄｉｏｄｅ）、ＵＶ（ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ）レザー等のチップに用いられるＺｎＯナノワイヤを効率よく複製するため、図１に示すように、（１）基板表面から成長したナノワイヤを埋め込むように樹脂Ｉを充填し、（２）基板表面から樹脂を剥離することで、ナノワイヤが埋め込まれた樹脂層Ｉを作製し、（３）該樹脂層Ｉに埋め込まれたナノワイヤを成長させ、（４）樹脂層Ｉの表面から成長したナノワイヤを埋め込むように樹脂ＩＩを充填し、（５）樹脂層Ｉの表面からナノワイヤを破断するようにして樹脂ＩＩを剥離することで、ナノワイヤが埋め込まれた樹脂層Ｉ及び樹脂層ＩＩを作製し、（６）前記樹脂層Ｉ及び樹脂層ＩＩを用いて上記（３）～（５）の手順を繰り返す、という工程により、ナノワイヤの一部が埋め込まれた樹脂を効率的に生産する方法が知られている（非特許文献２参照）。
　しかしながら、上記非特許文献２に記載されている方法は、ナノワイヤの一部が埋め込まれた樹脂を基に、倍々でナノワイヤの一部が埋め込まれた樹脂を生産するためのものである。したがって、上記工程「（５）樹脂層Ｉの表面からナノワイヤを破断するようにして樹脂ＩＩを剥離することで、ナノワイヤが埋め込まれた樹脂層Ｉ及び樹脂層ＩＩを作製し」の際には、得られた２つの「樹脂層Ｉ」及び「樹脂層ＩＩ」の表面は同じ形にすること、つまり、平面にする必要がある。そのため、非特許文献２に記載されている方法では、マイクロ流路等を設計し、且つマイクロ流路内にナノワイヤの一部を埋め込むことは難しいという問題がある。
　本発明は、上記従来の問題を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、電子線リソグラフィとフォトリソグラフィの技術を駆使することで段差部分を含む基板を作製し、当該段差部分にナノワイヤが成長した基板を鋳型にして生体分子抽出用チップの基板に転写すると、段差部分がマイクロ流路となり、且つ、転写したナノワイヤの一部がマイクロ流路内に埋め込まれ、そして埋め込まれたナノワイヤを成長させることで、ナノワイヤの一部がマイクロ流路内に埋め込まれた生体分子抽出用チップを作製できることを新たに見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明の目的は、マイクロ流路内に形成されたナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップ（以下、「チップ」と記載することがある。）、及び該チップの製造方法を提供することである。
　本発明は、以下に示す、チップ、及び該チップの製造方法に関する。
（１）基板、該基板上に形成されたマイクロ流路、該マイクロ流路内に形成されたナノワイヤを含み、前記ナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップ。
（２）前記ナノワイヤの表面が、プラスに帯電している上記（１）に記載の生体分子抽出用チップ。
（３）前記ナノワイヤの表面が、核酸の等電点より低い等電点の材料で形成されている上記（１）に記載の生体分子抽出用チップ。
（４）前記マイクロ流路の一端にサンプル投入部、他端に残渣又はサンプル回収部が形成され、前記サンプル投入部及び前記残渣又はサンプル回収部の間に前記ナノワイヤが形成されている上記（１）～（３）の何れか一に記載の生体分子抽出用チップ。
（５）転写することでマイクロ流路を形成するための段差を基板上に形成する工程、
　前記段差上にナノワイヤを成長させ、鋳型を作製する工程、
　前記鋳型を生体分子抽出用チップの基板に転写する工程、
　生体分子抽出用チップのマイクロ流路内に埋め込まれたナノワイヤを成長させる工程、
を含む、ナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップの製造方法。
　本発明のチップは、マイクロ流路内に形成されたナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれているので、サンプルの流入速度を速くしても、ナノワイヤがマイクロ流路から剥離し難くなる。したがって、生体分子の抽出時間を短縮することができる。
　また、本発明のチップの製造には、電子線リソグラフィとフォトリソグラフィの技術を用いて作製した段差部分を含む基板を鋳型として用いている。したがって、段差部分、つまり、転写後のマイクロ流路の幅及び深さ等の形状、並びに本数等を任意に設計することができる。
　更に、本発明のチップの製造方法に用いる鋳型の段差部分には、繰り返しナノワイヤを成長させることができる。したがって、同一の鋳型を用いて、チップを繰り返し製造することができる。
図１は、従来技術であって、ナノワイヤの一部が埋め込まれた樹脂を効率的に生産する方法を示す図である。 図２は、本発明のチップ１の一例を示す図である。 図３は、本発明のチップ１の作製工程の一例を示す図である。 図４は、図面代用写真で、図４（１）は実施例１において鋳型である基板１１の段差１４上で成長したナノワイヤの電界放射型走査電子顕微鏡（Ｆｉｅｌｄ　Ｅｍｉｓｓｉｏｎ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＦＥＳＥＭ）写真、図４（２）は図４（１）を拡大した写真である。 図５は、図面代用写真で、図５（１）は実施例１においてポリジメチルシロキサン２を剥離した後の鋳型である基板１１の段差１４のＦＥＳＥＭ写真、図５（２）は図５（１）を拡大した写真である。 図６は、図面代用写真で、図６（１）は実施例１において鋳型を転写した後のポリジメチルシロキサン２のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真、図６（２）は図６（１）を拡大した写真である。 図７は、図面代用写真で、図７（１）は実施例１においてポリジメチルシロキサン２を剥離した後に、ナノワイヤ１７を３．５時間成長させた後のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真、図７（２）及び（３）は図７（１）を拡大した写真である。 図８は、図面代用写真で、図８（１）は実施例１においてポリジメチルシロキサン２を剥離した後に、ナノワイヤ１７を１０時間成長させた後のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真、図８（２）は図８（１）を拡大した写真である。
　以下に、マイクロ流路内に形成されたナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップ、及び該チップの製造方法について詳しく説明する。なお、本発明において「ナノワイヤの一部が、マイクロ流路内に埋め込まれている」とは、少なくとも、ナノワイヤを成長させるための核となる粒子又は触媒が、マイクロ流路内の表面に載っているのではなく、マイクロ流路の内部の内壁に埋め込まれていることを意味する。
　図２は、本発明のチップの一例を示している。図２に示すチップ１は、基板２、基板２上に形成されたマイクロ流路３、マイクロ流路３の一端に形成されたサンプル投入部４、マイクロ流路３の他端に形成された残渣又はサンプル回収部５を含んでいる。そして、サンプル投入部４及び残渣又はサンプル回収部５の間の流路内（図中の点線部分）に、一部が流路内に埋め込まれたナノワイヤが設けられている。なお、マイクロ流路３にサンプルを直接投入し、また、残渣又はサンプルをマイクロ流路３から直接回収する場合は、サンプル投入部４及び残渣又はサンプル回収部５を設けなくてもよい。
　本発明のチップ１を用いて、例えば、エクソソームを分離する場合は、シリンジポンプ等を用いてエクソソームを含有するサンプル溶液（培養液、血清・尿等の体液など）をサンプル投入部４から送液し、残渣又はサンプル回収部５からサンプルを分離後の溶液を回収する。そして、サンプル溶液を流し終わった後は、ナノワイヤに吸着したエクソソームを分析すればよい。エクソソームはマイナスに帯電しているので、ナノワイヤの表面はプラスに帯電していることが望ましく、例えば、ＺｎＯナノワイヤ、酸化ニッケル等のプラスに帯電する材料で被覆層を形成したナノワイヤを用いればよい。また、表面がプラスに帯電しているナノワイヤを用いる場合、回収部がマイナスとなるように電場をかけることで、プラスに帯電するタンパク質等の生体分子を抽出することができる。
　また、本発明のチップ１を用いて、例えば、細胞、ウイルス、菌から選ばれるサンプルから核酸を抽出する場合は、サンプルを懸濁した懸濁液をサンプル投入部４に投入する。なお、細胞、ウイルス、菌の具体例としては、細胞としては細胞膜構造を有するものが挙げられ、ブドウ球菌、枯草菌、大腸菌、サルモネラ菌、緑膿菌、コレラ菌、赤痢菌、炭疽菌、結核菌、ボツリヌス菌、破傷風菌、レンサ球菌等の細菌類、顆粒球、リンパ球、網赤血球、赤血球、白血球、血小板等の血球細胞、等が挙げられる。ウイルスとしては、ノロウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コロナウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ等が挙げられる。菌としてはキノコ、カビ、酵母などが挙げられ、具体的には、白癬菌、カンジダ、アスペルギルス、出願酵母等が挙げられる。また、エクソソーム以外にも、ミトコンドリア、細胞外小嚢もサンプルとして挙げられる。
　そして、サンプル投入部４をマイナス、残渣又はサンプル回収部５をプラスとなるように電場を印加することで、ナノワイヤでサンプルを破砕し、残渣又はサンプル回収部５から伸長した核酸を回収することができる。なお、本発明のチップ１を用いて核酸を回収する場合は、サンプル投入部４とマイクロ流路３のナノワイヤを設けた部分（図１中の点線部分）の間に、他端に残渣取出部を有するマイクロ流路を接続し、残渣又はサンプル回収部５からは核酸を取り出し、残渣取出部からは破砕した細胞の残渣を取り出せるようにしてもよい。核酸を抽出する場合、ナノワイヤの表面は細胞等の孔から漏出した核酸が静電的相互作用によりナノワイヤに吸着しない方が好ましいことから、ナノワイヤの表面は核酸の等電点より低い等電点の材料から形成されることが好ましい。後述するように、ナノワイヤを成長後、ナノワイヤ表面をＳｉＯ2、ＴｉＯ2等の材料で被覆すればよい。
　本発明のチップ１は公知の分析装置に組み込むことで分析装置を構成することができる。また、公知の分析装置と併用することで、抽出した生体分子をそのまま分析することもできる。更に、チップ１に抽出した生体分子を分析する分析部を形成してもよい。例えば、本発明のチップ１を用いて核酸を抽出する場合、サンプルから抽出した核酸はナノワイヤ間を流れる際に伸長することから、
（１）チップ１を公知の核酸シークエンサーに組み込める形状とすることで、核酸の抽出と核酸配列の解析を一つの装置で実施することができる。
（２）伸長した核酸を、別途核酸シークエンサーに導入することで核酸配列を解析できる。
（３）チップ１に更に核酸の分析を行う電極等の分析部を形成することで、核酸の抽出と核酸配列の解析を一つの装置で実施できる新たな分析装置を作製することができる。
　本発明のチップ１は、電子線リソグラフィ及びフォトリソグラフィ技術を用いて作製した鋳型を樹脂等に転写し、転写した樹脂等に埋め込まれたナノワイヤを更に成長させることで製造することができる。図３は、本発明のチップ１の作製工程の一例を示している。
（１）鋳型用の基板１１上にＣｒ層１２をスパッタで堆積する。
（２）ポジ型フォトレジスト１３をスピンコータで塗布する。次いで、転写した際にチップ１のマイクロ流路３に相当するパターンをフォトリソグラフィにより作製する。
（３）Ｃｒエッチャント液にてマイクロ流路３に相当するパターン以外のＣｒ層１２をエッチングする。
（４）基板１１のみを選択的にエッチングする手法によりにより、マイクロ流路３に相当するパターン以外の基板１１をエッチングして、マイクロ流路３に相当する段差１４を形成する。段差１４の深さを調整することで、マイクロ流路３の深さを調整することができる。
（５）Ｃｒエッチャント液にて、段差１４上のＣｒ層１２及びポジ型フォトレジスト１３をエッチングする。
（６）基板１１上に、ナノワイヤ作製用の粒子又は触媒１５をパルスレーザーデポジッション（ＰＬＤ）で塗布する。
（７）Ｏ2プラズマを実施後、電子線リソグラフィ用のレジスト１６を塗布し、段差１４上でナノワイヤを成長させる場所を電子線リソグラフィで描画する。電子線リソグラフィの描画は、ナノワイヤを成長させたいパターンで形成すればよく、所定間隔でナノワイヤを成長させる場合は所定間隔のドット、ナノワイヤをランダムに成長させたい場合は段差１４上の任意の箇所からナノワイヤが成長できるように段差１４上の全てを描画すればよい。電子線リソグラフィで描画した後は、レジストを現像・除去する。
（８）レジストが除去され、粒子又は触媒１５が露出した場所からナノワイヤ１７を成長させ、本発明のチップ１の製造に用いる鋳型を作製する。
（９）チップ１の基板２用の材料を、鋳型に塗布する。
（１０）基板２を鋳型から剥離することで、マイクロ流路３内にナノワイヤ１７の一部が埋め込まれたチップ１を形成する。
（１１）マイクロ流路３内に埋め込まれたナノワイヤ１７を更に成長させる。ナノワイヤ１７の成長後、サンプル投入部４、残渣又はサンプル回収部５、必要に応じて残渣取出部を形成する。なお、サンプル投入部４、残渣又はサンプル回収部５及び残渣取出部は、フォトリソグラフィでマイクロ流路３を設計する時に同時に設計し、転写により形成してもよい。
　チップ１を複数製造する場合は、上記工程で作製した鋳型を用いて、上記の（８）～（１１）の工程を繰り返せばよい。なお、上記の工程は単にチップ１の製造工程の一例を示したもので、基板１１上に段差１４を形成し、段差１４上に成長させたナノワイヤ１７をチップ１の基板２に転写することで、チップ１のマイクロ流路３内にナノワイヤ１７の一部を埋め込むことができれば特に制限は無い。
　上記工程において、鋳型用の基板１１としては、エッチングにより段差１４が形成できるものであれば特に制限はない。例えば、ドライエッチングで段差１４を形成する場合は、シリコン、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス等が挙げられる。
　また、ウェットエッチングにより段差１４を形成する場合も、ドライエッチングと同様、シリコン、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス等を用いればよい。
　ポジ型フォトレジスト１３としては、ＴＳＭＲ　Ｖ５０、ＰＭＥＲ等、半導体製造分野で一般的に使用されているものであれば特に制限はない。また、ポジ型に代え、ネガティブ型のフォトレジストを用いてもよく、ＳＵ－８、ＫＭＰＲ等、半導体製造分野で一般的に使用されているものであれば特に制限はない。
　Ｃｒ層１２のエッチャント液は、Ｈ2Ｏ：Ｃｅ（ＮＨ4）2（ＮＯ3）6：ＨＣｌＯ4等、Ｃｒをエッチングできるものであれば特に制限はない。また、本発明はＣｒに限定されるのではなく、Ｃｒ以外の材料を堆積し、該材料をエッチングできるエッチャント液と組み合わせて用いてもよい。
　基板１１のみを選択的にエッチングする手法として、基板１１をドライエッチングする場合は、六フッ化硫黄（ＳＦ6）、四フッ化炭素（ＣＦ4）、トリフルオロメタン（ＣＨＦ3）等の公知のドライエッチング用のガスを用いればよい。また、基板１１をウェットエッチングする場合、基板１１がガラスの場合はフッ化水素（ＨＦ）、シリコンの場合は水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）等を用いればよい。
　ナノワイヤ１７作製用の粒子１５としては、例えば、ＺｎＯが挙げられる。また、ナノワイヤ１７作製用の触媒１５としては、例えば、金、プラチナ、アルミニウム、銅、鉄、コバルト、銀、錫、インジウム、亜鉛、ガリウム等が挙げられる。
　電子線リソグラフィ用のレジスト１６としては、ＺＥＰ５２０、ＰＭＭＡ等、半導体分野で一般的に用いられているものであれば特に制限はない。また、レジストの除去液としては、ジメチルホルムアミドとアセトン等、半導体分野で一般的な除去液であれば特に制限はない。
　段差１４上において、ナノワイヤ１７は、粒子又は触媒１５から公知の方法で成長させればよい。例えば、粒子１５としてＺｎＯ微粒子を用いた場合は、非特許文献３に記載されている水熱合成方法を用いて作製することができる。具体的には、硝酸亜鉛六水和物（Ｚｎ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ）、ヘキサメチレンテトラミン（Ｃ6Ｈ12Ｎ4）を脱イオン水に溶解した前駆体溶液に、加熱した基板１１を浸漬させることで、段差１４のＺｎＯ粒子１５が露出している部分から、ＺｎＯナノワイヤ１７を成長させることができる。
　触媒１５を用いる場合は、次の工程でナノワイヤ１７を作製することができる。
（ａ）ＳｉＯ2、Ｌｉ2Ｏ、ＭｇＯ、Ａｌ2Ｏ3、ＣａＯ、ＴｉＯ2、Ｍｎ2Ｏ3、Ｆｅ2Ｏ3、ＣｏＯ、ＮｉＯ、ＣｕＯ、ＺｎＯ、Ｇａ2Ｏ3、ＳｒＯ、Ｉｎ2Ｏ3、ＳｎＯ2、Ｓｍ2Ｏ3、ＥｕＯ等の材料を用い、パルスレーザーデポジション、ＶＬＳ（Ｖａｐｏｒ－Ｌｉｑｕｉｄ－Ｓｏｌｉｄ）法等の物理蒸着法でコアナノワイヤを形成する。
（ｂ）ＳｉＯ2、ＴｉＯ2等を用い、スパッタリング、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｂｅａｍ）蒸着、ＰＶＤ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｖａｐｏｒ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ＡＬＤ（Ａｔｏｍｉｃ　Ｌａｙｅｒ　Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）等の一般的な蒸着法により、コアナノワイヤの周囲に被覆層を形成する。なお、段差１４上で触媒１５を用いてナノワイヤを成長する場合、上記（ｂ）の被覆層は必須ではなく、コアナノワイヤのみを成長させ転写させてもよい。
　本発明では、段差１４上で成長させるナノワイヤ１７の長さに応じて、転写後のマイクロ流路３内に埋め込まれるナノワイヤの長さが決まる。したがって、サンプル流入速度を速くしたい場合は、埋め込まれるナノワイヤの長さが長くなるように、段差１４上でのナノワイヤ１７の成長を適宜調整すればよい。なお、例えば、段差１４上の電子線リソグラフィ用レジスト１６を全て描画した場合は、ナノワイヤ作製用の粒子又は触媒１５が段差１４上に露出した状態になる。この状態でチップ１を作製するための基板２に転写すると、段差１４上の粒子又は触媒１５の少なくとも１部がマイクロ流路３内に埋め込まれるように転写される。この埋め込まれた粒子又は触媒１５からナノワイヤ１７を成長させることで、一部がマイクロ流路３内に埋め込まれたナノワイヤ１７を作製することもできる。
　本発明のチップ１を作製するための基板２としては、鋳型を転写できるものであれば特に制限はない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリルブタジエンスチレン）樹脂、ＡＳ（アクリロニトリルスチレン）樹脂、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、シリコーンゴム等の熱硬化性樹脂が挙げられる。なお、チップ１をそのまま使用して目的とする生体分子を分析する場合は光透過性があり生体分子と非親和性の樹脂が望ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、硬質ポリエチレン製等のプラスチック、シリコン等が挙げられる。
　基板２を剥離後のマイクロ流路３に埋め込まれたナノワイヤ１７の成長は、上記と同様の手順で行えばよい。なお、触媒１５を用いてナノワイヤ１７を成長させる場合、ナノワイヤ１７は、分岐鎖を有していなくてもよいし、分岐鎖を有していてもよい。
　マイクロ流路３内で成長させるナノワイヤ１７の直径は、目的に応じて適宜調整すればよい。例えば、エクソソームを吸着させる場合は、あまり細すぎるとエクソソームを破壊する恐れがあることから、エクソソームより大きくすればよく、例えば、１００ｎｍ以上とすればよい。また、細胞等を破砕する場合は、破砕する目的である細胞、ウイルス、菌等の大きさ、細胞膜又は細胞壁の強度等に応じて直径を変えればよく、例えば、原核細胞は１μｍ～１０μｍ、真核細胞は５μｍ～１０μｍ、ウイルスは数１０ｎｍ～数１００ｎｍ、血球細胞は７μｍ～１５μｍの大きさであることから、ナノワイヤの直径は、１０ｎｍ以上、１５ｎｍ以上、２０ｎｍ以上、又は２５ｎｍ以上であってもよい。また、ナノワイヤの直径は、破砕する目的である細胞等よりは小さい必要があり、例えば、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、又は５０ｎｍ以下であってもよい。
　ナノワイヤ１７の直径は、粒子１５を用いて形成する場合は、段差１４に塗布する粒子のサイズを変更する、または、作製したナノワイヤ１７に被覆層を形成することで適宜調整することができる。被覆層は、触媒１５を用いた場合の被覆層と同じ材料及び被覆方法で形成されてもよく、蒸着時間を適宜調整すればよい。また、触媒１５を用いて成長させる場合も、被覆層を形成する際の蒸着時間を変えることで直径を適宜調整することができる。
　ナノワイヤ１７の長さは、マイクロ流路３の深さ等を考慮して、適宜調整すればよい。ナノワイヤ１７の長さは、粒子１５を用いて形成する場合は、前駆体溶液への浸漬時間を変えることで調整することができる。また、触媒１５を用いて形成する場合は、コアナノワイヤを形成した後のＶＬＳによる成長時間を変えることで適宜調整することができる。
　チップ１に形成するマイクロ流路３の深さ及び幅は特に制限は無く、目的とする生体分子に併せて調整すればよいが、マイクロ流路３の空間体積を小さくし過ぎると圧力損失が大きくなるので、例えば、深さ及び幅を１μｍ以上としてもよい。また、チップ１に形成するマイクロ流路３の本数も特に制限は無く、チップ１上に複数のマイクロ流路３を設けてもよい。マイクロ流路３の幅、深さは、段差１４の幅及び高さで調整することができ、マイクロ流路３の本数は、段差１４の本数で調整することができる。
　サンプル投入部４、残渣又はサンプル回収部５、残渣取出部をマイクロ流路３と一緒に設計しない場合は、鋳型を基板２に転写後に、生検トレパン、超音波ドリル等を用いて形成すればよい。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
〔チップの作製〕
　本発明のチップは以下の手順により作製した。
（１）ＲＦ（ｒａｄｉｏ　ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）スパッタ装置（ＳＶＣ－７００ＬＲＦ、Ｓａｎｙｕ　Ｄｅｎｓｈｉ）を用いて、シリコン（１１１）基板１１上（株式会社エレクトロニクスエンドマテリアルズコーポレーション）に８００ｎｍの厚さのＣｒ層１２を堆積させた。
（２）ポジ型フォトレジスト１３（ＴＳＭＲ　Ｖ５０、Ｔｏｋｙｏ　Ｏｈｋａ　Ｋｏｇｙｏ　Ｃｏ．）をスピンコータにより塗布した。その後、フォトリソグラフィにより幅約１ｍｍ、両端部に直径約２ｍｍの円を有する長さ約１１ｍｍのマイクロ流路３に相当するパターンを作製した。パターン作製後は、ＳＭＲ－Ｖ５０　ＥＬ（Ｔｏｋｙｏ　Ｏｈｋａ　Ｋｏｇｙｏ　Ｃｏ．）でレジストを現像した。
（３）Ｃｒエッチャント液（Ｈ２Ｏ：Ｃｅ（ＮＨ4）2（ＮＯ3）6：ＨＣｌＯ4＝８５：１０：５（質量％比））にて、マイクロ流路３に相当するパターン以外のシリコン上のＣｒ層をエッチングした。
（４）反応性イオンエッチング装置（ＲＩＥ－１０ＮＲ、Ｓａｍｃｏ　Ｃｏ．）を用いてＣＦ4ガスにより、マイクロ流路３に相当するパターン以外の基板１１を深さ約１μｍエッチングした。
（５）上記（３）と同様のＣｒエッチャント液を用いて、マイクロ流路３に相当するパターン上のＣｒ層１２及びポジ型フォトレジスト１３を除去することで、深さ約１μｍの段差１４（転写後のマイクロ流路３に相当）を作製した。
（６）ＺｎＯペレット（純度４Ｎ、株式会社高純度化学研究所製）を用いて、シリコン基板１１上に、パルスレーザーデポジション装置（ＰＬＤ－ＹＡ－８６７０、湘南工業株式会社製）を用いて約１００ｎｍの厚さとなるように塗布した。
（７）ポジ型電子線レジスト１６（ＺＥＰ５２０Ａ、Ｚｅｏｎ　Ｃｏｒｐ．）をスピンコータにより約５００ｎｍとなるように塗布した。次に、電子線リソグラフィ（ＳＰＧ－７２４、Ｓａｎｙｕ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｃｏ．）により、ナノワイヤ１７を成長させるスポットのパターン（直径約５００ｎｍの円、任意のスポットと隣接するスポットの端部との間隔は約１μｍの格子状）を描画した。描画後、ＺＥＰ　５２０　Ａ７を用いてポジ型電子線レジスト１６を現像してスポット部分のポジ型電子線レジスト１６を除去することで、段差１４上にＺｎＯ粒子層まで到達するスポットパターンを作製した。
（８）硝酸亜鉛六水和物（Ｚｎ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ、９８％、シグマ・アドリッチ社製）を０．０４４６１ｇ、ヘキサメチレンテトラミン（（Ｃ6Ｈ12Ｎ4）、９９＋％、シグマ・アドリッチ社製）を０．０２１０３ｇ、脱イオン水５０ｍＬに加えて、硝酸亜鉛六水和物とヘキサメチレンテトラミンが３ｍＭの前駆体溶液を作成した。次に、基板１１を前駆体溶液に入れ、９５°Ｃのオーブンに１０時間浸漬させることで、ＺｎＯ粒子層からナノワイヤ１７を成長させることで鋳型を作製した。図４（１）は、基板１１の段差１４上で成長したナノワイヤのＦＥＳＥＭ写真で、図４（２）は、図４（１）の写真を更に拡大した写真である。図４（１）及び（２）の写真から明らかなように、段差１４上のスポットからナノワイヤが上方に向かって成長していることが確認された。なお、図４（２）に示すナノワイヤの長さは、段差１４上のポジ型電子線レジスト１６の層から約２μｍであった。
（９）チップ１の基板２となるポリジメチルシロキサン２（ＰＤＭＳ、Ｓｉｌｐｏｔ　１８４，　Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｔｏｒａｙ）は、プレポリマー（Ｓｉｌｐｏｔ　１８４，　Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｔｏｒａｙ）と硬化剤（Ｃａｔａｌｙｓｔ　Ｓｏｌｐｏｔ　１８４，　Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｔｏｒａｙ）を重量比１０：１で混合し、５分間静置後、真空中にて３０分間脱泡した。その後、作製したＰＤＭＳを上記（８）で作製した鋳型に流し込み、真空中にて１時間脱泡、７５℃で２時間加熱した。
（１０）鋳型から上記（９）で流し込んだポリジメチルシロキサン２を手で剥離した。図５（１）は、ポリジメチルシロキサン２を剥離した後の基板１１の段差１４のＦＥＳＥＭ写真で、図５（２）は、図５（１）の写真を更に拡大した写真である。図５（１）及び（２）の写真から明らかなように、ポリジメチルシロキサン２を剥離した後のナノワイヤ１７は根元部分から切断されていた。一方、図６（１）は、鋳型が転写されたポリジメチルシロキサン２のマイクロ流路３部分のＦＥＳＥＭ写真で、図６（２）は、図６（１）の写真を更に拡大した写真である。図６（１）及び（２）の写真から明らかなように、ナノワイヤ１７の一部がマイクロ流路３内に包み込まれるように埋設されていた。
（１１）上記工程（８）と同様の手順で、ポリジメチルシロキサン２に埋め込まれているナノワイヤ１７の断面から、更にナノワイヤ１７を成長させた。図７（１）は、３．５時間後のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真で、図７（２）及び（３）は、図７（１）の写真を更に拡大した写真である。図８（１）は、１０時間後のマイクロ流路３のＦＥＳＥＭ写真で、図８（２）は、図８（１）の写真を更に拡大した写真である。図６～図８に示す写真から明らかなように、ポリジメチルシロキサン２のマイクロ流路３内に転写したナノワイヤ１７が更に成長したことが確認できた。なお、図８（２）に示す、個々のナノワイヤ１７の直径は約１００ｎｍであった。
　本発明の生体分子抽出用チップは、ナノワイヤの一部がマイクロ流路内に埋め込まれていることから、サンプルの流入速度を速くしても、ナノワイヤがマイクロ流路から剥離し難くなる。したがって、サンプルから生体分子を抽出する速度を向上することができるので、医療機関、大学、企業、研究機関等において、生体分子迅速な抽出に有用である。

Claims (5)

  1. 　基板、該基板上に形成されたマイクロ流路、該マイクロ流路内に形成されたナノワイヤを含み、前記ナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップ。
  2. 　前記ナノワイヤの表面が、プラスに帯電している請求項１に記載の生体分子抽出用チップ。
  3. 　前記ナノワイヤの表面が、核酸の等電点より低い等電点の材料で形成されている請求項１に記載の生体分子抽出用チップ。
  4. 　前記マイクロ流路の一端にサンプル投入部、他端に残渣又はサンプル回収部が形成され、前記サンプル投入部及び前記残渣又はサンプル回収部の間に前記ナノワイヤが形成されている請求項１～３の何れか一項に記載の生体分子抽出用チップ。
  5. 　転写することでマイクロ流路を形成するための段差を基板上に形成する工程、
    　前記段差上にナノワイヤを成長させ、鋳型を作製する工程、
    　前記鋳型を生体分子抽出用チップの基板に転写する工程、
    　生体分子抽出用チップのマイクロ流路内に埋め込まれたナノワイヤを成長させる工程、
    を含む、ナノワイヤの一部が、前記マイクロ流路内に埋め込まれている生体分子抽出用チップの製造方法。
     
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