WO2015129263A1 - スフェロイド作製用デバイス、スフェロイドの回収方法及び製造方法 - Google Patents

スフェロイド作製用デバイス、スフェロイドの回収方法及び製造方法 Download PDF

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    • C12N2535/00—Supports or coatings for cell culture characterised by topography

Definitions

  • the present invention relates to a device suitable for culturing large-size and high-density spheroids of uniform size, and a method using the same.
  • Non-Patent Document 1 shows that the three-dimensional culture method can imitate the function of a living tissue more accurately than the two-dimensional culture method. Furthermore, Non-Patent Document 1 shows that the three-dimensional culture method is useful as one of methods for efficiently differentiating pluripotent stem cells and iPS cells. Attempts have been made to reconstruct / complement lost functions by returning a three-dimensionally cultured artificial tissue to the body using such a technique. Attempts have also been made to apply it to regenerative medicine that helps repair damaged tissue. Attempts have also been made to use it for drug toxicity and testing. In particular, for regenerative medicine and its research, it is necessary to produce a large amount of cell clusters having a uniform size and shape. In addition, a simpler and lower cost method than the current method is required.
  • Non-Patent Document 3 reports that the direction of differentiation changes depending on the size of the cell mass.
  • Non-Patent Document 4 discloses a method of culturing in a droplet called a hanging drop method. Also disclosed is a low adhesion plate with a U-shaped or V-shaped bottom. Furthermore, a mass culture method using a bioreactor is disclosed. The hanging drop method and the U-shaped plate are suitable for producing a cell mass having a uniform size and shape. On the other hand, even if these are used, only one cell mass can be produced per well, so that it is not suitable for mass culture. Although the hanging drop method is widely applied to research, it is not suitable for large-scale culture in which hundreds or thousands of cell masses are produced at a time.
  • Non-Patent Document 4 shows a method of using a low adhesion container.
  • a method using roller bottles has also been developed.
  • a method of suspension culture by immobilizing on a gel or bead has been developed.
  • these methods can produce several thousand cell clusters at high density, there is a problem that the prepared cell clusters become heterogeneous.
  • a low-rotation roller bottle that can produce a large amount of a relatively homogeneous cell mass has been developed.
  • both methods require complicated and large-scale devices.
  • even if the rotational speed of a roller bottle or the like is strictly controlled, arbitrary adjacent cells and cell masses may irregularly associate in the solution to form new cell masses. For this reason, it is difficult to obtain a cell cluster having a uniform size.
  • Patent Document 1 discloses an example of a method for producing a mass of cell clusters easily in large quantities. In such a population, the size and shape of the cell mass and the extracellular properties are uniform.
  • a culture solution containing cells is injected into a cavity of a structure having a cavity that is open at least at the lower end. At this time, a part of the culture solution is projected downward from the open end.
  • cells are cultured in the protruding portion of the culture solution.
  • This method has a problem of injecting the culture solution into the cavity when the upper end is closed.
  • there is a problem that the process of forming the protruding portion of the culture solution is complicated.
  • Patent Document 2 discloses a suspension plate that allows easier injection of a culture solution than Patent Document 1.
  • Patent Document 2 discloses a structure in which a culture solution communicates from a first surface to a second surface.
  • the number of injection operations increases in proportion to the number of cell clusters to be created. For this reason, the problem of the complexity of a process is inevitable.
  • the conventional culture method using the hanging drop container and the culture method using the rotary bottle have advantages and disadvantages. For this reason, it was difficult to produce a large amount of cell clusters having a uniform shape and size. In addition, it has been particularly difficult to produce such cell masses easily and in large quantities on the order of hundreds or thousands.
  • the present invention has been invented in view of such problems.
  • the inventors examined a physical phenomenon that occurs between a device for culturing cells and a medium. As a result, a device for producing spheroids by a simple technique was realized.
  • One aspect of the spheroid-producing device includes at least a first surface, a second surface, and a plurality of wall surfaces.
  • the second surface is a surface that is the back surface of the first surface.
  • Each wall surface forms a plurality of holes penetrating between the first surface and the second surface.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the opening on the first surface is larger than the equivalent diameter of the inscribed circle of the opening on the second surface.
  • the operation of the cell seeding process and the cell culture process becomes easy. Therefore, the time required for these operations can be reduced.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the opening formed by each hole is not less than the length of the equivalent diameter of the inscribed circle of the opening of the second surface.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the opening on the second surface is preferably in the range of 200 micrometers to 1 centimeter.
  • At least a portion of each wall surface preferably has an inclination of an angle greater than 1 degree and less than 90 degrees with respect to the second surface.
  • a hydrophobic material it is possible to determine the equivalent radius of the circumcircle of the opening on the second surface (half the equivalent diameter) in consideration of the contact angle between the device material and the medium. preferable.
  • a hydrophilic material it is preferable to determine the equivalent radius of the inscribed circle of the opening on the second surface in consideration of the contact angle between the device material and the culture medium.
  • the second surface of the spheroid production device is a solution selected from one of water, a medium, and a buffer solution. It is a method of collecting spheroids by contact. Or it is the method of collect
  • a medium containing cells in each hole is injected from the first surface, droplets are formed in each hole, and cells are formed in the droplets.
  • a method for producing spheroids In order to recover the spheroids produced by such a method, it is preferable to use the recovery method described above.
  • a spheroid production device suitable for producing a large amount of uniform spheroids in a simple manner, and a spheroid recovery method and a spheroid production method, which produce a large amount of uniform spheroids It is possible to provide a simple method suitable for doing this.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line II-II of the spheroid-producing device shown in FIG. It is a figure explaining the detail of the device for spheroid production. It is a figure which shows an example of the cell culture container using the device for spheroid production of one Embodiment. It is a figure explaining the force concerning a droplet. It is a figure explaining the contact angle of the material of a wall surface, and a culture medium. It is a figure explaining angle (theta) 0.
  • FIG. It is a figure explaining the relationship between a liquid level and water pressure.
  • FIG. 28 is a cross-sectional view taken along line XXVIII-XXVIII in FIG. 27. It is a figure explaining the structure of the cell culture container used in an Example.
  • FIG. 30 is a cross-sectional view taken along line XXX-XXX in FIG. 29. It is a photograph of the culture surface before spheroid collection of Example 1. It is the photograph which expanded FIG. It is a microscope picture of the spheroid after collection about Example 1 and Comparative Example 1. It is a photograph of the device surface after spheroid collection about Example 1. 2 is a photograph of a spheroid of Comparative Example 1. 3 is a graph showing the particle diameter distribution of Example 1 and Comparative Example 1. 4 is a graph showing a particle diameter distribution when the number of cells in Example 1 is changed.
  • FIG. 1 shows an example of a spheroid production device according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along the line II-II of the spheroid-producing device shown in FIG.
  • the spheroid-producing device 1 is a device that produces spheroids obtained by aggregating cells by culturing the cells in a medium formed in a droplet shape.
  • a spheroid is a three-dimensional aggregate of many cells.
  • the spheroid-producing device 1 includes at least a first surface 11, a second surface 12, and a wall surface 13.
  • FIG. 1 shows a view of the spheroid-producing device 1 viewed from the first surface 11 side.
  • the first surface 11 is an upper surface of the spheroid-producing device 1 and is an upper surface into which a medium or the like is injected when cells are cultured.
  • the second surface 12 is a surface facing the first surface 11.
  • the second surface 12 forms the bottom (bottom surface) of the spheroid-producing device 1 and is the back surface with respect to the top surface (first surface 11).
  • the wall surface 13 forms a hole (through hole) penetrating the first surface 11 and the second surface 12. Further, the wall surface 13 forms an opening in the first surface 11 and the second surface 12 and functions to communicate the first surface 11 and the second surface 12.
  • the hole formed by the wall surface 13 is formed closer to the second surface 12 than the opening formed closer to the first surface 11.
  • the opening is designed to be small. The size of the opening is compared using the equivalent diameter.
  • “Equivalent diameter” is used as a general term for the equivalent diameter of the inscribed circle and the equivalent diameter of the circumscribed circle.
  • the “equivalent diameter of the circumscribed circle” is the diameter of the circle circumscribing the opening, and is used as the diameter of the circumscribed circle drawn on a plane parallel to the second surface 12.
  • the equivalent diameter of the opening of the hole formed between the first surface 11 and the second surface 12 is the diameter when a circumscribed circle is drawn on a plane parallel to the second surface 12.
  • the “equivalent diameter of the inscribed circle” is the diameter of the circle inscribed in the opening, and means the diameter of the inscribed circle drawn on a plane parallel to the second surface 12.
  • the equivalent diameter of the opening of the hole formed between the first surface 11 and the second surface 12 the diameter when an inscribed circle is drawn on a plane parallel to the second surface 12 is used.
  • the length indicated by the symbol “D” is either the equivalent diameter Dout of the circumscribed circle or the equivalent diameter Din of the inscribed circle, and Dout and Din are shown without being strictly distinguished.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating details of the spheroid-producing device.
  • FIG. 3 the cross-sectional view shown in FIG. 2 is used, but hatching indicating the cross-section is omitted for ease of explanation.
  • the spheroid-producing device 1 includes an angle ⁇ i, an equivalent diameter Dout of a circumscribed circle of the opening of the second surface 12, or a diameter Din of an inscribed circle of the opening of the second surface 12, the material used for the device, and cell culture It is designed in consideration of at least the medium 8 used in the above. In addition, it is preferable to consider the thickness T, the width W of the upper surface, and the like.
  • the angle ⁇ i is an angle formed by the slope of the wall surface 13 with respect to the second surface 12.
  • the entire wall surface 13 forming the hole may not be a slope having a uniform angle ⁇ i.
  • the angle ⁇ i is preferably larger than 1 degree and smaller than 90 degrees, and more preferably in the range of 30 degrees to 80 degrees. This is to make it easier for the culture medium 8 to enter the hole.
  • all of the seeded cells do not stay on the wall surface 13 but settle down to the lower part of the droplet under their own weight. Thereby, a cell can be cultured efficiently.
  • the thickness T is the thickness of the spheroid-producing device 1 from the first surface 11 to the second surface 12.
  • the thickness T may be any thickness that can withstand the weight of the culture medium 8.
  • the equivalent diameter Dout of the circumscribed circle of the opening on the second surface 12 is the diameter of the circumscribed circle circumscribing the opening formed on the second surface 12.
  • the equivalent diameter Din of the inscribed circle of the opening on the second surface 12 is the diameter of the circle inscribed in the opening formed on the second surface 12.
  • the equivalent radius Rout of the circumscribed circle is half the length of the equivalent diameter Dout of the circumscribed circle.
  • the equivalent radius Rin of the inscribed circle is half the equivalent diameter Din of the inscribed circle.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the opening of the first surface 11 is designed to be larger than the equivalent diameter Din of the inscribed circle of the opening of the second surface 12.
  • the equivalent diameter Din of the inscribed circle in the opening of the second surface 12 is preferably 1 to 10 times the size of the desired spheroid (eg, 200 ⁇ m to 1 cm).
  • the diameter is 1 to 2 times the diameter of the desired cell mass.
  • the width W of the upper surface is a width between the wall surface 13 forming one hole and the wall surface 13 forming another adjacent hole.
  • the upper surface width W is the width at which the wall surface 13 forming the angle ⁇ i ends with respect to the second surface 12.
  • the two wall surfaces 13 that form adjacent holes have slopes from the second surface 12 to the first surface 11, where the width W of the top surface is the end that allows such slopes to have an angle ⁇ i. It can be said that it is the width of.
  • FIG. 3 shows that from the first surface 11 (from the opening of the first surface 11) until the height (depth) of the medium 8 reaches the height (depth) H, the holes and the upper part of the spheroid-producing device 1 are shown.
  • a state in which the culture medium 8 is injected into the space is schematically shown. As shown in FIG. 4, this space corresponds to the space in the well container 91.
  • the medium 8 is injected so that the medium 8 protrudes from the opening of the second surface 12.
  • a portion protruding from the second surface 12 is a droplet 81.
  • the culture medium 8 is injected into the spheroid-producing device 1 so that the droplet 81 is formed.
  • the droplet 81 functions as a three-dimensional cell culture vessel when cells are cultured to form spheroids.
  • the downward liquid surface of the droplet 81 is formed as a curved surface having a predetermined radius of curvature.
  • ⁇ L is the surface tension [g / cm] of the liquid
  • r1 and r2 are the curvature radii orthogonal to each other.
  • r1 r2. Since the curved surface is convex downward, a droplet 81 is formed.
  • the height (depth) H of the culture medium 8 is higher than the above-described height (depth).
  • the injection can be adjusted to be lower.
  • the culture medium 8 stays in the middle of the slope (wall surface 13) connecting the opening of the second surface 12 to the opening of the first surface 11.
  • FIG. 14 which will be described later, schematically shows a state in which cells are cultured while the medium 8 is stopped in the middle of the slope.
  • the wall surface 13 is a surface that maintains the angle ⁇ i with respect to the second surface 12. Further, the slope between the first surface 11 and the wall surface 13 is sometimes referred to as the upper surface.
  • the first surface 11 may be broadly expressed, and the first surface 11 may be represented to include a surface (upper surface) that is not parallel to the second surface 12. If these are not essential features of one embodiment of the present invention, they are not strictly distinguished.
  • FIG. 4 shows an example of a cell culture container using the spheroid production device of one embodiment.
  • the cell culture container 9 is an example of the basic structure of the cell culture container.
  • the spheroid-producing device 1 is attached to the well container 91.
  • a petri dish 92 is disposed outside the well container 91.
  • the spheroid production device 1 and the well container 91 may be made of the same material or different materials. Since the well container 91 provides a space for containing the culture medium 8, any material may be used as long as it is not toxic to the cells. On the other hand, the petri dish 92 may have a shape that does not come into contact with the second surface 12 or the droplet 81 of the spheroid-producing device 1.
  • the container to which the spheroid-producing device 1 is attached is not limited to the structure shown in FIG.
  • the spheroid-producing device 1 may be mounted on a multiwell plate or a petri dish.
  • the spheroid-producing device 1 may be used by any method as long as the second surface 12 (bottom surface) and the droplet 81 do not contact the multiwell plate or the petri dish.
  • the details of the design of the spheroid production device will be described below.
  • the material and surface of the spheroid-producing device 1 and the equivalent diameter Din of the inscribed circle of the opening of the second surface 12 or the equivalent diameter Dout of the circumscribed circle the following physical phenomena should be taken into consideration. Is preferred.
  • the design of the spheroid-producing device 1 corresponding to the physical phenomenon related to the contact angle ⁇ c will be considered. Thereafter, other elements will be described.
  • FIG. 6 is a schematic diagram for explaining the contact angle ⁇ c between the material of the material appearing on the wall surface 13 and the culture medium 8.
  • the contact angle ⁇ c is the contact angle of the liquid with respect to the solid.
  • the contact angle ⁇ c is determined from the properties of the solid and liquid.
  • ⁇ S is the solid surface tension [g / cm]
  • ⁇ SL is the solid-liquid surface tension [g / cm]
  • ⁇ L is the liquid surface tension [g / cm].
  • the contact angle ⁇ c is determined from the properties of the solid and the liquid. Specifically, it is determined by the material used for the spheroid-producing device 1 (the material of the material appearing on the wall surface 13) and the properties of the culture medium 8.
  • the size of the droplet is not affected by the contact angle.
  • the angle ⁇ 0 90 degrees is an allowable range.
  • the spheroid-producing device 1 is a hydrophobic material.
  • the diameter Din of the inscribed circle of the opening of the second surface 12 is smaller than the diameter of the inscribed circle of the opening of the first surface 11.
  • the size of the equivalent diameter Dout of the circumscribed circle is important.
  • FIG. 5 shows a diagram for explaining the force applied to the droplet 81.
  • the shape of the droplet 81 is a hemisphere.
  • the second surface is assumed to be placed horizontally.
  • the droplet 81 is a continuous liquid that does not actually have a boundary with the culture medium 8.
  • the range that is defined as the droplet 81 is described using oblique lines that are different from the medium 8.
  • F0 to F2 exist as forces acting on the droplet 81 and working in parallel with gravity.
  • F0 is the force of gravity applied to the droplet 81 and is calculated by the following equation.
  • F1 is a force derived from the water pressure that the droplet 81 receives from the liquid (medium 8), and is calculated by the following equation.
  • F2 is a force derived from the surface tension of the liquid generated at the edge of the liquid surface, and is calculated by the following equation.
  • the surface tension ⁇ L of the liquid can be measured by various methods such as the Wilhelmy method. Or it is possible to obtain information from a vendor. Furthermore, the contact angle ⁇ c can be measured by using a liquid method or a gas-liquid method for the liquid (medium or buffer solution) and material to be used.
  • ⁇ SL is also involved in the condition for the water surface to stop at the wall surface.
  • ⁇ SL is not involved in the condition for holding the droplet in the case shown in FIG. At this time, ⁇ SL is assumed in the direction of the second surface.
  • the volume V is the volume [cm 3 ] of the droplet 81
  • the specific gravity ⁇ is the specific gravity of the medium 8
  • the height H is a height equal to the depth [cm] from the upper surface of the medium 8 to the lower end of the droplet 81.
  • the density ⁇ is the density [g / cm] of the medium 8.
  • the area S is the size of the area of the opening at the position where the droplet 81 is generated (position where the droplet is formed in the hole).
  • the area S is the area [cm 2 ] of the boundary in contact with the second surface 12, and is the same as the area of the opening of the second surface 12.
  • the water pressure p is the water pressure [g / cm 2 ] at the opening of the second surface 12.
  • the outer peripheral length L is the length [cm] of the boundary where the droplet contacts the second surface 12. L corresponds to the perimeter of the opening on the second surface.
  • the solid-liquid surface tension ⁇ SL is the surface tension (interface tension) [g / cm] between the wall surface 13 and the culture medium 8.
  • the angle ⁇ 0 is an angle formed by the tangent surface at the edge where the droplet 81 is in contact with the horizontal plane.
  • the angle ⁇ 0 is an angle formed by the tangent surface and the second surface 12 placed horizontally.
  • FIG. 7 is a diagram for explaining the angle ⁇ 0 .
  • F2 L ⁇ SL sin ⁇ i + L ⁇ L sin ⁇ 0 ( ⁇ i is the inclination angle of the wall surface.)
  • Formula 1 (F0 + F1 ⁇ F2) can be expressed by Formula 2 as follows. V ⁇ + pS ⁇ L ⁇ SL sin ⁇ i + L ⁇ L sin ⁇ 0 ... Formula 2
  • F2 L ⁇ L sin ⁇ 0
  • Formula 1 (F0 + F1 ⁇ F2) can be expressed by Formula 3 as follows.
  • Formula 2-2
  • the medium 8 is put to a height H using a material having a certain contact angle ⁇ c.
  • the droplet 81 starts to constrict, for example, it starts to protrude outward from the second surface 12.
  • F0 + F1 F2.
  • the volume of the droplet 81 is V
  • the equivalent radius of the circumscribed circle of the opening of the second surface 12 is Rout
  • the specific gravity is ⁇
  • F0 ((4/3) ⁇ Rout 3 ⁇ 2)
  • ⁇ ⁇ (2/3) ⁇ R 3 ⁇ ⁇
  • the volume V is [(sphere volume) / 2].
  • the equivalent radius Rout of the circumscribed circle of Formula 3 is the maximum equivalent radius of the opening of the second surface 12. Moreover, it is preferable to set the diameter of the opening part of the 2nd surface 12 to 2 Rout or less. It is more preferable to design in consideration of the force (Fc) that the cell mass receives from gravity.
  • the circumscribed circle of the opening of the second surface 12 Is preferably set to be equal to or less than twice the equivalent radius of the circumscribed circle calculated by Expression 3. According to this aspect, it is possible to maintain droplets on the spheroid-producing device 1.
  • the spheroid-producing device 1 is a hydrophilic material.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle is used.
  • FIG. 9 shows a case where the water pressure p2 is larger than that in FIG. 8 (p1 ⁇ p2).
  • FIG. 10 shows a case where the water pressure is higher than that in FIGS. 8 and 9 (p1 ⁇ p2 ⁇ p3).
  • FIG. 8 shows a state where the magnitude of the water pressure p1 is balanced with the liquid level, and the liquid stops without dropping.
  • FIG. 9 shows a state in which the liquid level is closer to the second surface 12 because the water pressure p2 is greater than the water pressure p1.
  • a balance is established between the magnitude of the water pressure p2 and the liquid level.
  • FIG. 12 is a diagram for explaining the surface tension at the opening of the second surface 12 when the liquid surface and the water pressure are balanced.
  • FIG. 11 shows a case where adjustment is made so that the state of FIG. 9 is obtained.
  • FIG. 6 is a schematic diagram for explaining the contact angle ⁇ c between the material of the wall surface 13 and the culture medium 8.
  • the contact angle ⁇ c is the contact angle of the liquid with respect to the solid, and is determined by the properties of the solid / liquid.
  • ⁇ S is the solid surface tension [g / cm]
  • ⁇ SL is the solid-liquid surface tension [g / cm]
  • ⁇ L is the liquid surface tension [g / cm].
  • the contact angle ⁇ c is determined by the properties of the solid and the liquid. Specifically, the contact angle ⁇ c is determined by the material of the spheroid-producing device 1 (the material of the second surface 12 and the wall surface 13) and the property of the culture medium 8.
  • the surface tension ⁇ SL of a solid can be obtained, for example, as information on the Internet (http://www.surface-tension.de/solid-surface-energy.htm etc.) or information obtained from the purchaser. preferable. Alternatively, it may be calculated using the Zisman method.
  • the surface tension ⁇ L of the liquid can be measured by various methods such as the Wilhelmy method. Or it is possible to obtain information from a vendor.
  • Equation 5 is expressed as ⁇ S ⁇ ⁇ L cos ⁇ c ⁇ S + ⁇ L cos ⁇ c.
  • ⁇ L is the surface tension [g / cm] of the liquid
  • r1 [cm] and r2 [cm] are the curvature radii orthogonal to each other at one point on the surface.
  • the diameter of the inscribed circle is smaller than this value.
  • the size of the opening of the second surface 12 is preferably set to a value of 20-80% of the maximum value of the derived equivalent radius R.
  • the amount of the medium can be adjusted by adjusting the height H of the medium 8 so that the water pressure derived from the height H of the medium 8 is in the range of 50-80% of the maximum water pressure p derived. More preferred.
  • the spheroid-producing device 1 can be designed and produced according to the material used for the spheroid-producing device 1 and the properties of the medium 8 used for cell culture.
  • the spheroid production device 1 is used to efficiently produce a large amount of spheroids.
  • the spheroid production device 1 is used to efficiently produce a large amount of spheroids.
  • the calculation formula used when designing the spheroid-producing device 1 according to the range of the contact angle ⁇ c is presented. This is because it is preferable to test a plurality of design methods according to the material of the spheroid-producing device 1 or the properties of the culture medium 8. This is because the spheroid-producing device 1 is designed and manufactured using a preferable calculation formula as appropriate.
  • the width W of the upper surface of the wall that partitions the space is preferably 5 mm or less. Moreover, 2 mm or less is more preferable in order to prevent cells from staying or standing on the upper surface (first surface 11 and its vicinity). In addition to the width W of the upper surface, it is preferable to consider the shape of the upper surface (the shape of the upper part from the first surface 11 to the width of the upper surface). This will be described later with reference to FIGS.
  • the spheroid-producing device 1 is an acrylic resin, polylactic acid, polyglycolic acid, styrene resin, acrylic / styrene copolymer resin, polycarbonate resin, polyester resin, polyvinyl alcohol resin, ethylene / vinyl alcohol copolymer.
  • a resin molded article made of one of a resin, a thermoplastic elastomer vinyl chloride resin, a silicone resin and a silicone resin, or a combination thereof is preferable. This is because a resin that can be molded is used in order to manufacture devices in large quantities at low cost.
  • the spheroid-producing device 1 is the resin molded product described above, at least the wall surface 13 is functionalized by a surface modification treatment method comprising one of plasma treatment, corona discharge, UV ozone treatment, or a combination thereof. It is preferable to form a group.
  • a functional group may be formed on the entire spheroid-producing device 1. This is because when the hydrophobicity is too high or the opening is small, the medium can be smoothly introduced into the opening by imparting hydrophilicity.
  • the wall surface 13 is made of one of inorganic materials, metals, synthetic polymers, dimers, trimers, tetramers, biopolymers, or a combination thereof. Is preferably coated with a material. Moreover, you may coat
  • the spheroid-producing device 1 is a molded product made of one of inorganic materials such as metal and glass, or a combination thereof.
  • the surface is modified on at least the wall surface 13 by a surface modification treatment method comprising one of plasma treatment, corona discharge, UV ozone treatment, or a combination thereof. It is preferable to do.
  • the entire surface of the spheroid-producing device 1 may be modified. This is for the same reason as above.
  • it is very effective to create a more hydrophobic surface by coating the surface with the materials described above. This is because even if the device has the same equivalent diameter of pores, when using a medium with low surface tension, the hydrophobic surface is more effective than the hydrophilic surface. is there.
  • the wall surface 13 is coated with a substance made of one of an inorganic substance, a metal, a polymer, a dimer, a trimer, and a tetramer, or a combination thereof. It is preferable. These materials may be coated on the entire spheroid-producing device 1. This is for the same reason as above. In addition, it is very effective to create a more hydrophobic surface by coating the surface with the materials described above. This is because even if the device has the same equivalent diameter of pores, when using a medium with low surface tension, the hydrophobic surface is more effective than the hydrophilic surface. is there.
  • At least the surface of the wall surface 13 or the spheroid-producing device 1 has a fine structure on the order of nanometers.
  • the fine structure is, for example, a structure in which the surface is processed into irregularities.
  • Material surface properties are not defined by the device material, but by the material surface properties. For this reason, any material can be used as the material of the device because the hydrophilicity / hydrophobicity of the surface can be controlled by post-treatment even with the same material.
  • ⁇ Spheroid collection method> An outline of a method for producing a spheroid using the above-described spheroid-producing device 1 and a method for collecting the produced spheroid will be described.
  • FIG. 13 shows a diagram for explaining a process of producing a spheroid using the cell culture container 9 shown in FIG.
  • a medium 8 containing cells is injected into each hole of the spheroid-producing device 1 from the first surface 11 side.
  • the culture medium 8 protrudes from the bottom (opening portion of the second surface) of the spheroid-producing device 1, and thus a medium droplet can be formed.
  • Cells contained in the medium 8 aggregate at the droplet portion to form spheroids 7.
  • the supernatant of the medium 8 is taken out and the medium 8 is replaced with a new medium.
  • FIG. 14 shows a diagram for explaining another example of the process of producing spheroids using the cell culture container 9 shown in FIG.
  • FIG. 14 is a diagram illustrating a state where the liquid droplet does not reach the opening of the second surface 12 and stops halfway.
  • a phenomenon occurs when a medium is added to a height lower than the design height H to the spheroid production device 1 appropriately designed as described above. Even in such a case, the cells contained in the culture medium 8 are aggregated to form spheroids 7 in the droplet portion.
  • the supernatant of the medium 8 can be taken out and replenished with a new medium to replace the medium 8.
  • the medium is added from the first surface 11 side to increase H, or by increasing the pressure on the first surface side, for example, the state shown in FIG. Thus, it can be collected by the method shown in FIG.
  • the produced spheroid 7 is collected by the method shown in FIGS. According to the method described below, the spheroid 7 can be recovered without being damaged.
  • FIG. 15 shows a method of collecting the spheroid 7 by putting the collection solution into the petri dish 92 and bringing it into contact with the second surface.
  • the solution for recovery can be selected from, for example, any one of the culture medium 8, water, and a buffer solution.
  • the spheroid 7 produced by culturing cells using the spheroid production device 1 is taken out by such a technique.
  • a preferred embodiment of such a technique is to collect spheroids by moving droplets to the collection solution side. When the droplet is moved, it is particularly preferable that the droplet formed on the second surface 12 side is brought into contact with the recovery solution.
  • FIG. 16 shows a method for recovering the spheroid 7 by applying pressure from the first surface 11 side after the cell culture vessel 9 is closed with the lid 93.
  • pressure is applied from the first surface 11 side
  • the droplet is broken.
  • the spheroid 7 can be collected by the medium 8 flowing out into the petri dish 92.
  • pressure may be applied from the first surface 11 side by any method.
  • the medium 8 may be added until the droplet breaks.
  • poured gas, and pressurized may be used.
  • the spheroid-producing device 1 of the present embodiment it is possible to produce spheroids by generating droplets in a plurality of holes, so that spheroids can be produced efficiently and in large quantities. .
  • a uniform spheroid can be produced by making the size of the plurality of holes the same.
  • the medium can be injected into the spheroid-producing device 1 from the first surface 11 (upper side). Furthermore, the medium can be exchanged from the first surface 11 side. For this reason, the operation of the spheroid-producing device 1 is easy.
  • the spheroid-producing device 1 based on a physical phenomenon, the structure can be simplified. Thereby, for example, compared with the suspension plate described in Patent Document 2, the spheroid-producing device 1 itself can be easily manufactured. As a result, the cost and work time for producing spheroids can be greatly reduced.
  • Embodiment 1 has described the spheroid-producing device 1 having a hole shape as shown in FIGS. 1 and 2, but the hole shape is not limited to this.
  • the spheroid-producing devices 1a to 1f having the cross section shown in FIGS. 17 to 22 instead of the cross section shown in FIG. 2 may be used.
  • the spheroid-producing devices 1a to 1c are examples in which the wall surface 13 is composed of a slope having an angle ⁇ i from the boundary with the second surface 12, as in FIG.
  • the spheroid-producing device 1 d shown in FIG. 20 is an example in which an inclined surface having an angle is formed in the middle of the wall surface 13.
  • the shape of the upper surface may be a shape of a part of a sphere (FIGS. 2, 20 to 22) or a flat shape (FIG. 19), as shown in FIGS. 2 and 17 to 22 as an example.
  • the shape of the upper surface may be a shape like a vertex of a cone or a polygonal pyramid (FIGS. 17 and 18).
  • the shape of the upper surface in order to prevent cells from staying or standing on the upper surface, is more preferably a spherical shape, a cone shape or a vertex shape of a polygonal pyramid.
  • the shape of the entrance from the opening portion of the first surface 11 to the hole may be vertical and inclined only around the opening portion of the second direction 12.
  • the equivalent diameter D and the angle ⁇ i are the equivalent diameter and angle at the position where the medium comes into contact with the medium at the opening of the second surface 12 of the device.
  • the shape of the device may be the shape of the device as shown in FIG. 20, FIG. 21, or FIG.
  • FIG. 20 is a diagram illustrating a case where the wall surface 13 from level 2 to level 3 has an angle.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the level 3 opening is the same as the equivalent diameter of the level 4 inscribed circle.
  • the level 4 position is a reference for the equivalent diameter Din and the angle ⁇ i of the inscribed circle.
  • 21 is a diagram illustrating an example of the case where the wall surface 13 from level 3 to level 4 has an angle.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the level 3 opening is larger than the equivalent diameter D of the level 4 inscribed circle.
  • the level 4 position is a reference for the equivalent diameter Din and the angle ⁇ i of the inscribed circle.
  • the inclination of the wall surface 13 from level 3 to level 4 that is, the angle ⁇ i is preferably smaller than the inclination of the wall surface 13 from level 2 to level 3.
  • the wall surface 13 from level 2 to level 3 may have an angle.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the level 4 opening is larger than the equivalent diameter of the inscribed circle of the level 3 opening.
  • the lowest level touched by the medium in the wall surface 13 is level 3. Therefore, the inclination from level 2 to level 3 is the angle ⁇ i, and the position of level 3 is the equivalent diameter Din of the inscribed circle.
  • the angle ⁇ i is an opening at the second surface (lower surface) or the second surface side and is a position at which the liquid level comes into contact.
  • Embodiment 1 has described the case where the openings formed in the first surface 11 and the second surface 12 as shown in FIGS.
  • the shape of the opening is not limited to this.
  • the spheroid-producing devices 1g to 1j having openings as shown in FIGS. 23 to 26 may be used.
  • the spheroid-producing device 1 includes a first surface 11 (upper surface), an opening of the first surface 11, and a second surface 12 (lower surface) as portions that contact the culture medium. It is preferable to provide an opening.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the opening of the first surface 11 is larger than the equivalent diameter Din of the inscribed circle of the opening of the second surface 12.
  • the shape of the hole may be a circle or a polygon such as a square or an octagon. Furthermore, the shape of the opening on the first surface 11 and the shape of the opening on the second surface 12 may be different. In each of FIGS. 23 to 26, the opening of the first surface 11 (or the shape of the opening at the position of the width W on the upper surface) is represented by a solid line. Moreover, the opening part of the 2nd surface is represented by the dotted line. These openings are represented as four holes when the spheroid-producing devices 1g to 1j are viewed from the first surface 11 side.
  • a thin sheet-like film may be punched with a punch, or a mold may be produced and a resin may be poured and molded.
  • the equivalent diameter of the inscribed circle of the opening on the upper surface is set to be larger than the equivalent diameter Din of the inscribed circle of the opening on the lower surface.
  • a test for producing spheroids was conducted. First, a spheroid-producing device 1x having the shape shown in FIGS. 27 and 28 was designed and manufactured. Next, the spheroid-producing device 1x was attached to a well container 91x shown in FIGS. A well container 91x shown in FIGS. 29 and 30 equipped with the spheroid-producing device 1x was attached to a 6-well plate (not shown). At this time, it was confirmed that the droplet 81 and the second surface 12 did not contact the bottom of the well plate.
  • FIG. 27 shows a view from the first surface.
  • FIG. 28 is a sectional view taken along line XXVIII-XXVIII in FIG.
  • FIG. 30 is a sectional view taken along line XXX-XXX in FIG.
  • the spheroid-producing device 1x was produced with a pitch PI of 1.00 mm and the following size.
  • Equivalent diameter D of second surface 12x 0.25 mm
  • Angle ⁇ i 67.5 degrees
  • Thickness T 0.74 mm
  • Upper surface width W 0.184 mm
  • the size of the well container 91x was as follows. Diameter of inner circumference of well container L1: 31mm Well container height L3: 1.5 cm
  • a material having a contact angle ⁇ c in the range of ⁇ 1 ⁇ cos ⁇ c ⁇ 0 was used.
  • Silicone manufactured by KCC, grade: SL7260
  • As the medium DMEM / F12 supplemented with 10% FBS was used. Hereinafter, it is referred to as medium A.
  • the surface tension ⁇ L of the liquid in the medium A can be measured by various methods such as the Wilhelmy method. Or it is possible to obtain information from a vendor.
  • the height H of the medium is designed to be within 1 cm.
  • the equivalent diameter Dout of the circumscribed circle was 285 ⁇ m, 23% of the calculated value. At this time, the reduction in hydrophobicity due to protein adsorption and the force received from the gravity of spheroids and the possibility that the liquid suitability could not be maintained due to vibration during medium exchange or transportation were considered.
  • the angle ⁇ i was 67.5 degrees.
  • the opening was set to 1 mm. As shown in FIG. 14, the device was designed so that the device could hold the droplet reliably by stopping the droplet in the middle of the side surface of the device.
  • the diameter of 91x in FIG. 30 was set to 31 mm.
  • the low-adhesion container used was a silicone resin (KE-1603 (A / B) manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) attached to the bottom of a glass petri dish with a diameter of 5 cm.
  • a cell suspension adjusted to contain 2.5 million mouse ES cells in 10 mL of the medium was added to the wells shown in FIG. Such cells were cultured for 2 days.
  • This cell suspension was used in both examples and comparative examples. By using this cell suspension, the number of cells that can be placed in one opening is 1250 / opening.
  • a cell suspension was prepared in which the number of cells entering one opening was adjusted to 1500, 1000, 500. In these examples, the culture was also performed for 2 days.
  • the second surface 12 was brought into contact with the culture medium, and the collected spheroids were observed.
  • the cell suspension was not transferred to another container, and the spheroids were observed using the cultured container.
  • FIGS. 31 and 32 show the microphotographs of the device and cells before recovery of spheroids in Example 1.
  • FIG. FIG. 32 is an enlarged view of FIG. In Example 1, spheroids were formed in each opening.
  • FIG. 33 shows micrographs of the recovered spheroids for Example 1 and Comparative Example 1.
  • FIG. 34 shows a photograph of the device surface after spheroid recovery for Example 1. Almost all of the spheroids seen in FIG. 31 were recovered. However, some of the edges remained. The recovery rate was 95% or more. The recovery rate was determined by the formula (number of openings where no cells remained / total number of openings) ⁇ 100).
  • FIG. 35 shows a photograph of the spheroid of Comparative Example 1.
  • FIG. 36 shows a graph showing the particle diameter distribution of Example 1 and Comparative Example 1.
  • the spheroid image was captured by taking the x75 lens of FIG. 33 (the photo of Example 1 on the left, the photo of Comparative Example 1 on the right).
  • the captured images were arbitrarily selected by the number of data shown in Table 1 below, and the diameter of each spheroid was measured.
  • Table 1 shows the average value ( ⁇ m) of the cell mass diameter, the sample standard deviation (SD), and the variation (defined by dividing SD by the average value of the diameter). As can be seen from the value of SD / average diameter, the variation of Example 1 was 1/3 or less of the variation of Comparative Example 1.
  • FIG. 37 shows the particle diameter distribution when the number of cells in Example 1 is changed.
  • 1x device for producing spheroid 7 spheroid 8 medium 9 cell culture vessel 11, 11x first surface 12, 12x second surface 13, 13x wall surface 9 cell culture vessel 91, 91x well vessel 92 petri dish 93 lid

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Abstract

　本発明は簡易な手法で、均一なスフェロイドを、大量に作製するスフェロイド作製用デバイスを提供する。本発明のスフェロイド作製用デバイス（１）は、第一表面（１１）、第二表面（１２）、及び複数の壁面（１３）を少なくとも備える。第二表面（１２）は、第一表面（１１）に対向する面である。各壁面（１３）は、第一表面と第二表面とを貫通する複数の孔を形成する。加えて、第一表面（１１）の開口部の内接円の相当直径が第二表面（１２）の開口部の内接円の相当直径より大きい。

Description

スフェロイド作製用デバイス、スフェロイドの回収方法及び製造方法
　本発明は均一な大きさのスフェロイドを大量かつ高密度に培養するのに適したデバイス、およびそれを用いる方法に関する。
　三次元培養法は二次元培養方法よりもより正確に生体組織の機能を模倣できることが非特許文献１に示されている。さらに、多能性幹細胞やｉＰＳ細胞を効率的に分化させる方法のひとつとしても三次元培養法が有用であることが非特許文献１に示されている。このような技術を使って、三次元培養した人工組織を体内に戻して失われた機能を再建・補完する試みがなされている。また損傷した組織修復を助ける再生医療に応用する試みがなされている。また医薬品の毒性や検査に利用する試みがなされている。とりわけ、再生医療及びその研究のためには、大きさや形が均質な細胞塊を大量に作製する必要がある。これに加えて、現行の方法より簡便で低コストの方法が必要となる。
［大きさや形の均一な細胞塊を作製することの意義］
　肝細胞の場合には生体内の機能をｉｎ　ｖｉｔｒｏで再現できないといった問題がある。この問題の一例は、肝細胞の二次元培養の場合には肝細胞が本来有している薬物代謝機能が低下することである。この問題を解決する手段として、非特許文献２に挙げられているような細胞塊を形成させる方法がある。この方法で作製した細胞塊は二次元培養した細胞と比較して格段に機能が向上することが示されている。
　ｉｎ　ｖｉｔｒｏで胚性幹細胞や誘導性多能性幹細胞を目的細胞に分化させる場合について、胚様体、ｅｍｂｒｙｏｉｄ　ｂｏｄｙと呼ばれる細胞塊を形成するなどして発生分化のプログラムが起動し目的細胞に分化させることができる。非特許文献３には、細胞塊の大きさによって分化の方向性が変化することが報告されている。
［大きさや形の均一な細胞塊を大量に作製する技術について］
　非特許文献４には、ハンギングドロップ法と呼ばれる液滴中で培養する方法が開示されている。また底がＵ字またはＶ字の低接着プレートが開示されている。さらにバイオリアクターを用いた大量培養法が開示されている。ハンギングドロップ法やＵ字プレートは、均質な大きさや形の細胞塊を作製するのに適している。一方、これらを用いても１ウェルに１個の細胞塊しか作製できないため大量培養に適していない。ハンギングドロップ法は広く研究に応用されているが、数百、数千個以上のオーダの細胞塊を一度に作製するような大量培養には適していない。
　さらに非特許文献４には低接着容器を使用する方法が示されている。またローラーボトルを使用する方法も開発されている。さらにゲルやビーズに固定化して懸濁培養する方法も開発されている。これらの方法は高密度に数千個の細胞塊が作製できるものの、作製された細胞塊が不均質にとなるといった問題がある。低回転のローラーボトルであって比較的均質な細胞塊を大量に作製できるものが開発されている。しかしながら、いずれの方法も操作が複雑で大掛かりな装置が必要となる。さらに、ローラーボトルなどの回転数を厳密にコントロールしても、近接する任意の細胞及び細胞塊が溶液内で不規則に会合して新たな細胞塊を形成する場合もある。このため均一な大きさの細胞塊を得ることは困難である。
　例えば、特許文献１には、細胞塊の集団を、大量かつ簡便に生産する方法の一例を開示している。かかる集団では細胞塊の大きさや形などの形態と、細胞外の性質とが均一になっている。特許文献１に開示された方法では、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の空洞部内に、細胞を含む培養液を注入する。この時、前記培養液の一部を前記開口端より下側に突出させる。この方法では前記培養液の前記突出部分で細胞を培養する。この方法では、上方の一端が閉鎖されている場合に培養液の空洞部内への注入することの問題がある。また培養液の突出部分の形成の工程が煩雑であるという問題がある。またかかる工程においては注入量の精確な調整を要するという問題がある。また、かかる方法は両端が開口している場合は培養液の注入（吸引）は効率的に行える方法であるものの別の問題を有している。別の問題とは注入された培養液の状態を維持するために上端を閉鎖するか、あるいは吸引圧を維持する機構が別途必要なことである。さらに、この様式では細胞の代謝に関与できる培養液の量が空洞部の容積で規定されるため新たな制限が生じている。新たな制限の一つは用いる細胞の代謝活性に応じて細胞濃度や培養期間が制限されることである。かかる新たな制限により、作成可能な細胞塊の大きさや細胞の種類も制限を受ける。また、特許文献２には、特許文献１に比べ培養液の注入が容易な懸濁プレートが開示されている。特許文献２では、培養液が第１表面から第２表面に連通する構造が開示されている。しかしながら、特許文献２の様式では作成する細胞塊の数に比例して注入操作の回数が増加する。このため、なお工程の煩雑さの問題は免れない。
特許第５０７４３８２号公報 国際公開第２０１０／０３１１９４号
Kenneth M. Yamada、他著、"Modeling Tissue Morphogenesis and Cancer in 3D"、Cell　１３０、２００７年９月２４日、ｐｐ．６０１－６１０ Erik Eschbach、他著、"Microstructured Scaffolds for Liver Tissue Cultures of High Cell Density: Morphological and Biochemical Characterization of Tissue Aggregates"、Journal of Cellular Biochemistry ９５、２００５年、ｐｐ．２４３－２５５ CL Bauwens、他著、"Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories"、Stem Cells　２６、２００８年、ｐｐ．２３００－２３１０ Sasitorn Rungarunlert、他著、"Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors"、World Journal of Stem Cells 1(1)、２００９年１２月３１日、ｐｐ．１１－２１
　上述したように、従来のハンギングドロップ法用の容器を用いた培養方法、及びロータリーボトルを用いた培養方法には一長一短がある。このため形や大きさの均質な細胞塊を大量に作製することは困難であった。また、かかる細胞塊を数百、数千個オーダで簡便かつ大量に作製することは特に困難であった。
　本発明はこのような課題を鑑み発明されたものである。
　発明者らは、細胞を培養するデバイスと培地との間で生じる物理現象を検討した。その結果、簡易な手法でスフェロイドを作製するデバイスを実現させた。
　本発明にかかるスフェロイド作製用デバイスの一態様は、第一表面、第二表面、及び複数の壁面を少なくとも備える。第二表面は、第一表面の裏面となる面である。各壁面は、第一表面と第二表面との間を貫通する複数の孔を形成する。加えて、第一表面の開口部の内接円の相当直径が第二表面の開口部の内接円の相当直径より大きい。本態様によれば、スフェロイドを簡易にかつ大量に作製するのに適したデバイスを提供することができる。かかるデバイスは上側に配置される第一表面から培地を注入し、下側となる第二表面から作製したスフェロイドを回収することを可能とする。そのため、細胞の播種工程、及び細胞の培養工程の操作が容易になる。したがって、これらの作業に要する時間を削減することができる。加えて、スフェロイド作製用デバイスに、第二表面から第一表面へ向かって大きくなる孔を形成することには以下の長所がある。まず第一表面から第二表面へ向けて培養液が浸入し易すい。また落ち込んだ細胞の密度が第二表面近傍でより高くなるのでスフェロイド形成が助長される。これらに加え、デバイス自体の製造が容易になる。
　スフェロイド作製用デバイスの一態様において、各孔により形成される開口部の内接円の相当直径が前記第二表面の開口部の内接円の相当直径の長さ以上であることが好ましい。第二表面の開口部の内接円の相当直径が２００マイクロメートルから１センチメートルの範囲であることが好ましい。各壁面の少なくとも一部分は、前記第二表面に対して１度より大きく、９０度より小さい角度の傾斜を有することが好ましい。疎水性の材料を用いる場合には、デバイスの材質と培地との接触角を考慮して、第二表面の開口部の外接円の相当半径（相当直径の半分の長さ）を決定することが好ましい。親水性の材料を用いる場合には、デバイスの材質と培地との接触角を考慮して、第二表面の開口部の内接円の相当半径を決定することが好ましい。
　また、上述したスフェロイド作製用デバイスを用いて作製したスフェロイドを回収する方法の一態様は、スフェロイド作製用デバイスの前記第二表面を水、培地及び緩衝液のうちの１つから選択される溶液と接触させてスフェロイドを回収する方法である。あるいは、第一表面から圧力を加えることによってスフェロイドを第二表面の開口部から回収する方法である。これらのいずれかの回収方法によれば、スフェロイドをかつ損傷させることなく容易に回収することができる。
　さらに、上述したスフェロイド作製用デバイスを用いるスフェロイドの製造方法の一態様は、各孔に細胞を含む培地を、第一表面から注入し、各孔で液滴を形成させ、液滴の部分で細胞を培養し、スフェロイドを作製する方法である。かかる方法で作製したスフェロイドを回収するために、上述した回収方法を用いることが好ましい。
　本発明の一実施形態によれば、均一なスフェロイドを簡易な手法で大量に作製するのに適したスフェロイド作製用デバイス、並びにスフェロイド回収方法及びスフェロイド製造方法であって、均一なスフェロイドを大量に作製するのに適した簡易な方法を提供することができる。
一実施形態にかかるスフェロイド作製用デバイスの一例を示す図である。 図１に示すスフェロイド作製用デバイスのＩＩ－ＩＩ線に沿った断面図である。 スフェロイド作製用デバイスの詳細を説明する図である。 一実施形態のスフェロイド作製用デバイスを用いる細胞培養容器の一例を示す図である。 液滴にかかる力を説明する図である。 壁面の材質と培地との接触角を説明する図である。 角度θ０を説明する図である。 液面と水圧との関係を説明する図である。 図８より水圧が大きい場合の液面と水圧との関係を説明する図である。 図８及び図９より水圧が大きい場合の液面と水圧との関係を説明する図である。 液面と水圧の釣り合っているときの第二表面の開口部での表面張力を説明する図である。 気体と水圧の釣り合っているときの第二表面の開口部での表面張力を説明する図である。 スフェロイドを作製する工程を説明する図である。 スフェロイドを作製する工程の他の一例を説明する図である。 スフェロイドを回収する手法（培地の利用）を説明する図である。 スフェロイドを回収する他の手法（加圧）を説明する図である。 スフェロイド作製用デバイスの断面の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの断面の他の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの断面の他の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの断面の他の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの断面の他の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの断面の他の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの開口部の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの開口部の他の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの開口部の他の形状例を示す図である。 スフェロイド作製用デバイスの開口部の他の形状例を示す図である。 実施例で用いるスフェロイド作製用デバイスの形状を説明する図である。 図２７のＸＸＶＩＩＩ－ＸＸＶＩＩＩ線に沿った断面図である。 実施例で用いる細胞培養容器の構成を説明する図である。 図２９のＸＸＸ－ＸＸＸ線に沿った断面図である。 実施例１のスフェロイド回収前の培養面の写真である。 図３１を拡大した写真である。 実施例１及び比較例１について、回収後のスフェロイドの顕微鏡写真である。 実施例１について、スフェロイド回収後のデバイス表面の写真である。 比較例１のスフェロイドの写真である。 実施例１及び比較例１の粒径直径分布を表すグラフである。 実施例１の細胞数を変えた場合の粒径直径分布を表すグラフである。
　以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。
　実施形態１
　図１に一実施形態にかかるスフェロイド作製用デバイスの一例を示す。また、図２に図１に示すスフェロイド作製用デバイスのＩＩ－ＩＩ線に沿った断面図を示す。スフェロイド作製用デバイス１は、液滴形状に形成した培地の中で細胞を培養することで、細胞を凝集させて得られるスフェロイドを作製するデバイスである。スフェロイドは、細胞が多数凝集して三次元になったものである。
　スフェロイド作製用デバイス１は、第一表面１１、第二表面１２、及び壁面１３を少なくも備える。図１は、スフェロイド作製用デバイス１を第一表面１１側から見た図を示している。
　第一表面１１は、スフェロイド作製用デバイス１の上面であり、細胞を培養するときに培地等を注入する上側の面となる。
　第二表面１２は、第一表面１１と対向する面である。第二表面１２は、スフェロイド作製用デバイス１の底（底面）を形成し、上面（第一表面１１）に対する裏面となる。
　壁面１３は、第一表面１１と第二表面１２とを貫通する孔（貫通孔）を形成する。また、壁面１３は、第一表面１１と第二表面１２とに開口部を形成するとともに、第一表面１１と第二表面１２とを連通させる働きをする。
　加えて、一実施形態のスフェロイド作製用デバイス１において、壁面１３によって形成される孔は、第一表面１１に近い方に形成される開口部に比べ、第二表面１２に近い方に形成される開口部が小さくなるように設計される。開口部の大きさは、相当直径を用いて比較する。
　「相当直径」は内接円の相当直径と外接円の相当直径の総称として用いる。「外接円の相当直径」は、開口部に外接する円の直径であり、第二表面１２と平行な平面上に描いた外接円の直径として用いる。例えば、第一表面１１と第二表面１２との間に形成される孔の開口部の相当直径は、第二表面１２と平行な平面上に外接円を描いたときの直径を用いる。「内接円の相当直径」は開口部に内接する円の直径であり、第二表面１２と平行な平面上に描いた内接円の直径をいう。例えば第一表面１１と第二表面１２との間に形成される孔の開口部の相当直径は、第二表面１２と平行な平面上に内接円を描いたときの直径を用いる。図中、符号「Ｄ」で示す長さは、外接円の相当直径Ｄｏｕｔまたは内接円の相当直径Ｄｉｎとのいずれかであり、ＤｏｕｔとＤｉｎとを厳密に区別しないで示す。
　開口部の大きさの詳細については以下に図３を参照して説明する。
　ここで、図１、２に加え、図３を参照して、スフェロイド作製用デバイス１の構成をより詳細に説明する。図３は、スフェロイド作製用デバイスの詳細を説明する図である。図３では、図２に示す断面の図を用いて示すが、説明を容易にするため断面を示す斜線を省略する。
　スフェロイド作製用デバイス１は、角度θｉ、第二表面１２の開口部の外接円の相当直径Ｄｏｕｔまたは第二表面１２の開口部の内接円の直径Ｄｉｎ、デバイスに使用する材質、及び、細胞培養に用いる培地８を少なくとも考慮して設計される。加えて、厚みＴ、上面の幅Ｗなどを考慮することが好ましい。
　角度θｉは、壁面１３の斜面が、第二表面１２に対してなす角度である。壁面１３では、斜面の少なくとも一部分が第二表面１２に対して角度θｉを有すればよい。一方で孔を形成する壁面１３全体が一様な角度θｉの斜面でなくてもよい。角度θｉは、１度より大きく９０度より小さいことが好ましく、３０度から８０度の範囲がより好ましい。これは、孔に培地８が入りやすくするためである。あるいは、播種した細胞の全てが壁面１３に留まることなく液滴下部まで自重で沈降するようにするためである。これにより、効率よく細胞を培養することができる。
　厚みＴは、第一表面１１から第二表面１２までのスフェロイド作製用デバイス１の厚みである。厚みＴは、培地８の重さに耐えられる厚みであればよい。
　第二表面１２の開口部の外接円の相当直径Ｄｏｕｔは、第二表面１２に形成された開口部に外接する外接円の直径である。
　第二表面１２の開口部の内接円の相当直径Ｄｉｎは、第二表面１２に形成された開口部に内接する円の直径である。また、外接円の相当半径Ｒｏｕｔは、外接円の相当直径Ｄｏｕｔの半分の長さである。内接円の相当半径Ｒｉｎは、内接円の相当直径Ｄｉｎの半分の長さである。
　一実施形態では、第一表面１１の開口部の内接円の相当直径が第二表面１２の開口部の内接円の相当直径Ｄｉｎより大きくなるように設計される。
　加えて、第二表面１２の開口部の内接円の相当直径Ｄｉｎは、所望するスフェロイドの大きさの１倍から１０倍の相当直径（例えば、２００μｍ～１ｃｍ）であることが好ましい。さらに加えて、単位面積当たりの孔の数が多いほど、小さい面積で多くの細胞塊を作製できることから、所望の細胞塊の直径の１倍～２倍にすることがより好ましい。
　上面の幅Ｗは、一つの孔を形成する壁面１３と、隣接する別の孔を形成する壁面１３との間の幅である。また上面の幅Ｗは、第二表面１２に対して、角度θｉをなす壁面１３が終了する位置の幅である。言い換えると、隣接する孔を形成する二つの壁面１３は第二表面１２から第一表面１１へ向かう斜面を有するところ、上面の幅Ｗは、かかる斜面が角度θｉを有することを可能にする端部の幅であるともいえる。
　図３は、培地８の高さ（深さ）が高さ（深さ）Ｈとなるまで、第一表面１１から（第一表面１１の開口部から）、孔とスフェロイド作製用デバイス１上部の空間とに培地８を注入した状態を模式的に示す。図４に示すように、かかる空間はウェル容器９１内の空間に相当する。図３に示すスフェロイド作製用デバイス１の構成例では、第二表面１２の開口部から培地８が突出するように、培地８が注入される。第二表面１２から突出した部分は液滴８１である。言い換えると、液滴８１が形成されるように、培地８をスフェロイド作製用デバイス１へ注入する。液滴８１は、細胞を培養して、スフェロイドを形成する際に、三次元の細胞培養器として働く。ここで、液滴８１の下向きの液面は、所定の曲率半径を有する曲面で形成されている。液滴を囲んでいる空気及び液体の圧力差ΔＰ（Ｐ－Ｐａｉｒ）はヤング－ラプラスの関係式、ΔＰ＝Ｈρ＝γＬ（１／ｒ１＋１／ｒ２）で表される。ここでγＬは液体の表面張力［ｇ／ｃｍ］、ｒ１，ｒ２は直交する曲率半径である。液滴８１の表面を球面と想定した場合はｒ１＝ｒ２となる。かかる曲面は下に凸になるので、液滴８１が形成される。
　図３の変形例として、第一表面１１から（第一表面１１の開口部から）培地８を注入する際に、培地８の高さ（深さ）Ｈが上述の高さ（深さ）より低くなるように注入を調整することができる。この場合、図３に示すスフェロイド作製用デバイス１の構成例において、第二表面１２の開口部から第一表面１１の開口部を結んでいる斜面（壁面１３）の途中で培地８が留まるように、培地８を注入する。後述する図１４に、斜面の途中で培地８を留めて細胞を培養している状態を模式的に示している。
　デバイスに使用する材料の材質、細胞培養に用いる培地の性質、相当直径等の、スフェロイド作製用デバイスの設計に関する詳細事項については、図面を参照して後述する。
　なお、図３において、厳密には壁面１３を、第二表面１２に対して角度θｉを維持する面をいう。また第一表面１１と壁面１３とのあいだの斜面を、上面ということもある。あるいは、第一表面１１を広くとらえ、第一表面１１が、第二表面１２と平行とならない面（上面）も含むように表すこともある。これらが本発明の一態様にかかる本質ではない場合にはこれらを厳密に区別しない。
　図４に、一実施形態のスフェロイド作製用デバイスを用いる細胞培養容器の一例を示す。細胞培養容器９は細胞培養容器の基本構造の一例である。細胞培養容器９では、スフェロイド作製用デバイス１がウェル容器９１に装着される。さらにウェル容器９１の外側にシャーレ９２が配置される。
　スフェロイド作製用デバイス１とウェル容器９１とは、同じ材質であってもよいし、異なる材質であってもよい。ウェル容器９１は、培地８を入れる空間を提供するものであるため、細胞に対して毒性がなければどのような材質であっても良い。一方、シャーレ９２は、スフェロイド作製用デバイス１の第二表面１２や液滴８１と接触しないような形状であればよい。
　スフェロイド作製用デバイス１が装着される容器は図４に示す構成物に限られることはない。細胞をスフェロイド作製用デバイス１で培養する際には、マルチウェルプレートやシャーレなどにスフェロイド作製用デバイス１を装着して使用してもよい。スフェロイド作製用デバイス１は、第二表面１２（底面）や液滴８１がマルチウェルプレートやシャーレと接触しなければどのような方法で用いてもよい。
　以下に、スフェロイド作製用デバイスの設計の詳細について説明する。スフェロイド作製用デバイス１の材質及び表面と、第二表面１２の開口部の内接円の相当直径Ｄｉｎまたは外接円の相当直径Ｄｏｕｔとの設計にあたっては以下の物理現象を考慮して設計を行うことが好ましい。特に、壁面１３の材質と培地８との接触角θｃを考慮することが好ましい。その理由は、スフェロイド作製用デバイス１の接触角θｃが、デバイスに用いる材料の材質、培地の性質等により影響を受けるためである。以降の説明ではまず、接触角θｃに関係する物理現象に応じたスフェロイド作製用デバイス１の設計について検討する。その後、他の要素について説明する。
　図６に壁面１３に表れる材料の材質と培地８との接触角θｃを説明する模式図を示す。接触角θｃは固体に対する液体の接触角である。接触角θｃはかかる固体及び液体の性質から定まる。γＳは固体の表面張力［ｇ／ｃｍ］、γＳＬは固液表面張力［ｇ／ｃｍ］、γＬは液体の表面張力［ｇ／ｃｍ］である。
　接触角θｃは、固体と液体との性質から定まる。具体的には、スフェロイド作製用デバイス１に用いる材料材質（壁面１３に表れる材料の材質）と培地８の性質で決まることになる。
＜接触角θｃの検討＞
（１）接触角θｃが－１＜ｃｏｓθｃ≦０の範囲に含まれる場合
　この場合、液滴の大きさは接触角に影響されることがない。角度θ０＝９０度が許容範囲になる。
　接触角θｃが、－１＜ｃｏｓθｃ≦０の範囲に含まれる場合には、一般にはスフェロイド作製用デバイス１が疎水性の材質であるといえる。このときの第二表面１２の開口部の内接円の直径Ｄｉｎは第一表面１１の開口部の内接円の直径よりも小さい。これに加えて、外接円の相当直径Ｄｏｕｔの大きさが重要となる。
　図５に液滴８１にかかる力を説明する図を示す。図５では液滴８１の形状が半球であることを前提とする。第２表面は水平に置かれているものとする。また、液滴８１は、実際には培地８との境界がない連続する液体である。ここでは説明を容易にするため、図５では液滴８１と定義して説明する範囲を培地８とは異なる斜線を用いて表す。
　液滴８１にかかる力であって、重力と並行に働いている力として、Ｆ０からＦ２が存在する。
　Ｆ０は、液滴８１にかかる重力の力であり、以下の式により算出する。
Ｆ０＝体積×比重
　　＝Ｖ・α
　Ｆ１は、液滴８１が液（培地８）から受ける水圧に由来する力であり、以下の式により算出する。
Ｆ１＝水圧×面積＝ｐＳ
大気圧の場合は
Ｆ１＝液上面から液滴までの深さ×液体の密度×面積
　　＝ＨρＳ
　Ｆ２は、液面の辺縁で発生する液体の表面張力に由来する力であり、以下の式により算出する。
Ｆ２＝外周×液体表面張力×角度
　　＝ＬγＬｓｉｎθ０
　液体の表面張力γＬは、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ法など様々な方法で測定することができる。または販売元から情報を入手することが可能である。さらに、接触角θｃは使用する液体（培地や緩衝液）と材料を、液適法や気液法よって測定することができる。
　図８の場合、水面が壁面で止まるための条件にはγＳＬも関与してくる。一方、図９のような場合に液滴が保持されるための条件にはγＳＬは関与しない。この時γＳＬは第２表面の方向に想定される。
　上記各式において、体積Ｖは液滴８１の体積［ｃｍ３］、比重αは培地８の比重、高さＨは培地８の上面から液滴８１の下端までの深さ［ｃｍ］に等しい高さ、密度ρは、培地８の密度［ｇ／ｃｍ］である。
　面積Ｓは液滴８１が発生する位置（孔の中で液滴が形成される位置）の開口部の面積の大きさである。ここでは、面積Ｓは第二表面１２と接する境界の面積［ｃｍ２］であり、第二表面１２の開口部の面積と同じである。
　水圧ｐは第二表面１２の開口部での水圧［ｇ／ｃｍ２］である。外周の長さＬは液滴が第二表面１２と接する境界の長さ［ｃｍ］である。Ｌは第二表面の開口部の周囲の長さと一致する。固液表面張力γＳＬは、壁面１３と培地８との表面張力（界面張力）［ｇ／ｃｍ］である。角度θ０は、液滴８１の表面が水平面あるいは水平に置いた第二表面１２となす角度である。図５で液滴８１を半球とした場合は角度θ０＝ｓｉｎ９０°＝１となる。角度θ０は液滴８１が接している辺縁部における接面と、水平面とのなす角である。あるいは角度θ０は該接面と、水平に置いた第二表面１２とのなす角である。図７に角度θ０を説明する図を示す。
　そして、以下の式１の関係が成り立つときに液滴８１がスフェロイド作製用デバイス１に保持される。
Ｆ０＋Ｆ１＜Ｆ２・・・・式１
　さらに、図８に示すように液滴が壁面１３に留まる場合、上述した計算式により、Ｆ２は以下の式で表すことができる。
Ｆ２＝ＬγＳＬｓｉｎθｉ＋ＬγＬｓｉｎθ０
（θｉは壁面の傾斜角である。）
よって式１（Ｆ０＋Ｆ１＜Ｆ２）は次のように式２で表すことができる。
Ｖα＋ｐＳ＜ＬγＳＬｓｉｎθｉ＋ＬγＬｓｉｎθ０・・・式２
　また、図９に示すように液滴が第２表面１２と連続する場合、Ｆ２は以下の式で表すことができる。
Ｆ２＝ＬγＬｓｉｎθ０
よって式１（Ｆ０＋Ｆ１＜Ｆ２）は次のように式３で表すことができる。
Ｖα＋ｐＳ＜ＬγＬｓｉｎθ０　・・・式２－２
　ここで、ある接触角θｃをもつ素材を用いて、培地８を高さＨまで入れるとする。液滴８１がくびれ始めるときは例えば、第二表面１２から外側に突出し始める。このときＦ０＋Ｆ１＝Ｆ２となる。このときの角度θ０は９０度（ｓｉｎ９０＝１）となる。
　液滴８１の体積をＶ、第二表面１２の開口部の外接円の相当半径をＲｏｕｔ、比重をαとすると、以下の式のように表すことができる。
Ｆ０＝（（４／３）πＲｏｕｔ３÷２）×α＝（２／３）πＲ３・α
ただし、液滴８１が半球であるとして、体積Ｖを［（球の体積）÷２］とする。
　さらに、開口部の面積Ｓ及び外周の長さＬを相当半径Ｒで表すと、以下のように表すことができる。
Ｓ＝πＲｏｕｔ２、Ｌ＝２πＲｏｕｔ
　式３より
（２／３）πＲｏｕｔ３・α＋ｐπＲｏｕｔ２
＝２πＲｏｕｔＬγＬｓｉｎ９０　
ただし、ｓｉｎ９０＝１。
よって、
　（２／３）αＲｏｕｔ２＋ｐＲｏｕｔ＝２γＬ・・・式３
　即ち、式３の外接円の相当半径Ｒｏｕｔが第二表面１２の開口部の最大相当半径であることが好ましい。また第二表面１２の開口部の直径は２Ｒｏｕｔ以下に設定することが好ましい。細胞塊が重力から受ける力（Ｆｃ）も考慮して設計することがより好ましい。
　上述したように、接触角θｃが－１＜ｃｏｓθｃ＜０（接触角９０°以上、θ０はθｃを超えられない）の範囲に含まれる場合には、第二表面１２の開口部の外接円の相当直径Ｄｏｕｔを、式３で算出した外接円の相当半径の２倍以下にすることが好ましい。かかる態様によりスフェロイド作製用デバイス１に液滴を維持することができる。
（２）接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１の範囲の場合
　接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１の範囲である場合には、一般にはスフェロイド作製用デバイス１が親水性の材質であるといえる。このような材料を用いる場合の第二表面の開口部１２の大きさの設計に際しては、内接円の相当直径を用いる。
　図８乃至９を用いて液面と水圧との関係を説明する。図８の水圧ｐ１を基準にすると、図９は図８より水圧ｐ２が大きい場合（ｐ１＜ｐ２）を示す。図１０は、図８及び図９より水圧が大きい場合（ｐ１＜ｐ２＜ｐ３）を示す。図８は、水圧ｐ１の大きさと液面とが釣り合っていて、液体は落下せず停止する状態を示す。図９は、水圧ｐ２が水圧ｐ１より大きいため、液面がより第二表面１２に近くなっている状態を表す。図９では水圧ｐ２の大きさと液面との間でバランスが成立している。図５に示す高さＨを高くすればするほど（培地８の量を多くすればするほど）水圧が大きくなる。その結果、θ０が接触角θｃを超えた時点で図１０に示すように液体とデバイスおよび空気が接する三重線が移動する。したがって液面が第二表面１２の開口部からまわり込み、第二表面１２上に付着する。図１０のような状態になると、スフェロイド作製用デバイス１の上部から液体が持続的に供給される。この結果、液滴が増大して滴下し、各孔に１個の液適を安定的に保持することが困難となる。即ち、図８または図９で表す状態にあることが好ましい。
　そこで、以下のような条件となるようにスフェロイド作製用デバイス１を設計することが好ましい。図１２は、液面と水圧の釣り合っているときの第二表面１２の開口部での表面張力を説明する図である。図１１は、図９の状態となるように調整した場合を示す。
　図１０の状態にならないときの条件は、固体の表面張力γＳが固液界面張力γＳＬと液面の表面張力（γＬｃｏｓθ０）の和を超えない時となる。即ち、
γＳ≦γＳＬ＋γＬｃｏｓθ０・・・式５
これをＹｏｕｎｇの式（γＳ＝γＳＬ＋γＬｃｏｓθｃ）と比較すると、θ０≦θｃのとき、液滴は安定に維持される。
　図６に壁面１３の材質と培地８との接触角θｃを説明する模式図を示す。接触角θｃは固体に対する液体の接触角であり、固体・液体の性質で決まる。γＳは固体の表面張力［ｇ／ｃｍ］、γＳＬは固液表面張力［ｇ／ｃｍ］、γＬは液体の表面張力［ｇ／ｃｍ］である。
　接触角θｃは、固体と液体との性質で決まり、具体的には、スフェロイド作製用デバイス１の材質（第二表面１２や壁面１３の材質）と培地８の性質で決まることになる。
　固体の表面張力γＳLは、例えば、インターネット上の情報（http://www.surface-tension.de/solid-surface-energy.htmなど）、あるいは購入元などから得られる情報として入手することが好ましい。あるいは、Ｚｉｓｍａｎ法を用いて算出してもよい。液体の表面張力γＬは、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ法など様々な方法で測定することができる。または販売元から情報を入手することが可能である。さらに、接触角θｃは使用する液体（培地や緩衝液）と材料を、液滴法や気液法よって測定することができる。よって、γＳＬについては、γＬとγＳの値を用いて、γＳＬ＝γＬｃｏｓθｃ－γＳの式に代入して導き出すことができる。
よって式５は
γＳ≦γＬｃｏｓθｃ－γＳ＋γＬｃｏｓθｃ
γＬｃｏｓθｃ－γＳ≧０・・・式６
　さらに、図１２に示すように、液滴８１の下向きの液面は、ヤングーラプラスの式に従って、液滴を囲んでいる空気と液体の圧力差ΔＰ（Ｐ－Ｐａｉｒ）は
ΔＰ　＝　ｐ＝γＬ（１／ｒ１＋１／ｒ２）・・・式７
ただし大気圧の場合は
ΔＰ＝Ｈρ＝γＬ（１／ｒ１＋１／ｒ２）・・・式７－２
の関係式で表され、曲面を形成して下に凸になり、液滴を形成する。ここでγＬは液体の表面張力［ｇ／ｃｍ］、ｒ１［ｃｍ］，ｒ２［ｃｍ］は表面の１点で直交する曲率半径である。
　液滴８１の表面を球面と想定した場合はｒ１＝ｒ２となる。よって
ｐ＝γＬ×（２／ｒ）・・・式８
大気圧の場合は
Ｈρ＝γＬ×（２／ｒ）・・・式８－２
　また、上述したように、第二表面１２に液滴がまわりこみ始めた瞬間に液滴を保持することが困難になる。このことを踏まえ、接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１の範囲のにおいて、θ０＝θｃとなった状態での諸条件と第二表面１２の開口部の内接円の相当直径Ｄｉｎとの関係を、図１２を参照して考察する。
　大気圧下について、培地が、ρ、γＬで、γＳの値の材料を用い高さＨ［ｃｍ］まで培地を入れる場合について、
式６からｃｏｓθｃ＞γＳ／γＬを満たす材質を選択する。
曲率半径から想定される円の中心から下に垂直な補助線を引くと、
Ｄｉｎ＝２ｒ・ｓｉｎθ０
ここで、式８－２より、ｒ＝２ＨργＬであるから、
Ｄｉｎ＝４・γＬ・ｓｉｎθ０／Ｈρ・・・式９
これに、液適が第二表面１２にまわりこみ始める限界、すなわちθ０＝θｃを代入すると、液滴を保持できる内接円の最大直径Ｄｉｎ（ｍａｘ）は、
Ｄｉｎ（ｍａｘ）＝４・γＬ・ｓｉｎθｃ／Ｈρ・・・式９－２
となる。
　すなわち、この値よりも小さい内接円の直径となるように設計することが好ましい。
　このような条件で設計する際に、接触角θｃに関わらず（言い換えるとデバイスの材料が疎水性であるか親水性であるかに関わらず）、培地中のタンパク質の材質への吸着を考慮することが好ましい。このため、第二表面１２の開口部の大きさは、導き出された相当半径Ｒの最大値の２０－８０％の値にすることが好ましい。さらに、培地８の高さＨに由来する水圧が、導き出された最大の水圧ｐの５０－８０％の範囲になるように培地８の高さＨを調節して、培地量を調整することがより好ましい。
　上述したように、接触角θｃに応じて内接円の相当直径Ｄｉｎまたは外接円の相当直径Ｄｏｕｔを設計することにより、液滴が適切に形成されるスフェロイド作製用デバイス１を作製することが可能になる。言い換えると、スフェロイド作製用デバイス１に用いる材質と、細胞培養に使用する培地８の性質とに応じたスフェロイド作製用デバイス１を設計・作製することが可能になる。これにより、スフェロイド作製用デバイス１によって細胞培養に適する液滴が形成されるので、スフェロイド作製用デバイス１を用いてスフェロイドを効率よく、大量に作製することが期待できる。加えて、スフェロイド作製用デバイス１を用いて適切な液滴を形成させることにより、均一なスフェロイドを作製することが期待できる。
　なお、上記（１）から（３）では、接触角θｃの値がとる範囲に応じて、スフェロイド作製用デバイス１を設計するときに用いる計算式を提示した。これは、スフェロイド作製用デバイス１の材質、または培地８の性質に応じて、複数の設計手法を試験することが好ましいためである。また、これは、適宜好ましい計算式を用いてスフェロイド作製用デバイス１を設計、製造するためである。
＜上面の幅＞
　空間と空間を仕切る壁の上面の幅Ｗは５ｍｍ以下が好ましい。また上面（第一表面１１及びその近傍）に細胞が滞留または静置しないようにするために２ｍｍ以下がより好ましい。上面の幅Ｗとあわせて、上面の形状（第一表面１１から上面の幅までの上部の形状）についても考慮することが好ましい。これについては、図１７乃至２２を参照して後述する。
＜スフェロイド作製用デバイスの材質＞
　スフェロイド作製用デバイス１は、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマ塩化ビニル系樹脂、シリコーン樹脂及びシリコン樹脂のうちの１つ、またはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることが好ましい。これは、安価かつ大量にデバイスを製造するためには、成形加工が可能な樹脂を使用するためである。
　また、スフェロイド作製用デバイス１が上述した樹脂成形品である場合に、少なくとも壁面１３に、プラズマ処理、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のうちの１つ、またはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により官能基を形成させることが好ましい。スフェロイド作製用デバイス１全体に官能基を形成させてもよい。これは、疎水性が高すぎる場合や開口部が小さい場合は親水性を付与することで、開口部への培地の流入をスムーズに行うことができるからである。
　さらに、スフェロイド作製用デバイス１が上述した樹脂成形品である場合に、少なくとも壁面１３に、無機物、金属、合成ポリマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、生体由来ポリマーのうちの１つ、またはこれらの組合せからなる物質が被覆されていることが好ましい。またスフェロイド作製用デバイス１全体にこれらの物質を被覆してもよい。これは、上記と同じ理由による。加えて、表面を上述した材料でコートすることで、より疎水性の表面を作成することは非常に有効である。これは同じ相当直径の孔を有するデバイスであっても、表面張力の小さい培地を使用する場合には、表面が疎水性であることが、表面が親水性であることよりも有効となるからである。
　また、スフェロイド作製用デバイス１が、金属、ガラスなどの無機物のうちの１つ、またはこれらの組み合わせからなる成形品であることが好ましい。スフェロイド作製用デバイス１が上述した成形品である場合に、少なくとも壁面１３に、プラズマ処理、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のうちの１つ、またはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により表面を改質することが好ましい。スフェロイド作製用デバイス１全体の表面を改質してもよい。これは、上記と同じ理由による。加えて、表面を上述した材料でコートすることで、より疎水性の表面を作成することは非常に有効である。これは同じ相当直径の孔を有するデバイスであっても、表面張力の小さい培地を使用する場合には、表面が疎水性であることが、表面が親水性であることよりも有効となるからである。
　あるいは、スフェロイド作製用デバイス１が上述した成形品である場合に、少なくとも壁面１３に、無機物、金属、ポリマー、ダイマー、トリマー、テトラマーのうちの１つ、またはこれら組合せからなる物質が被覆されていることが好ましい。スフェロイド作製用デバイス１全体に、これらの物質が被覆されていてもよい。これは、上記と同じ理由による。加えて、表面を上述した材料でコートすることで、より疎水性の表面を作成することは非常に有効である。これは同じ相当直径の孔を有するデバイスであっても、表面張力の小さい培地を使用する場合には、表面が疎水性であることが、表面が親水性であることよりも有効となるからである。
　さらに加えて、上述した加工に加え、少なくとも壁面１３の表面、あるいはスフェロイド作製用デバイス１全体に、ナノメートルオーダの微細構造を有することが好ましい。微細構造は、例えば表面を凹凸に加工した構造である。材料表面の性質はデバイスの材料によって既定されるのではなくて、材料表面の性質によって既定される。このため、同じ材料であっても表面の親疎水性を後処理によってコントロールすることができるので、どんな材料をデバイスの材料として使用してもよい。
＜スフェロイドの回収方法＞
　上述したスフェロイド作製用デバイス１を用いてスフェロイドを作製する方法の概略及び作製したスフェロイドの回収方法について説明する。
　図１３に、図４に示す細胞培養容器９を用いてスフェロイドを作製する工程を説明する図を示す。スフェロイド作製用デバイス１の各孔に、細胞を含む培地８を、第一表面１１の側から各孔へ注入する。上述したように適切にスフェロイド作製用デバイス１を設計することで、培地８がスフェロイド作製用デバイス１の底（第二表面の開口部）から突出するので、培地の液滴を形成することができる。培地８に含まれる細胞は、液滴部分で凝集してスフェロイド７を形成する。細胞培養中は、例えば、培地８の上澄みを取り出し、新たな培地を補充して培地８を交換する。
　図１４に図４に示す細胞培養容器９を用いてスフェロイドを作製する工程の他の一例を説明する図を示した。図１４は、液滴が第二表面１２の開口部に到達せず途中で停止している状態を表す図である。上述したように適切に設計されたスフェロイド作製用デバイス１に、設計時の高さＨよりも低い高さまで培地を添加した場合にはこのような現象が起きる。このような場合であっても、培地８に含まれる細胞は、液滴部分で、凝集してスフェロイド７を形成する。細胞培養中は、例えば、培地８の上澄みを取り出し、新たな培地を補充して培地８を交換することができる。スフェロイドを回収する際は、培地を第一表面１１側から添加しＨを大きくする、または第一表面側の圧力を高くすることにより、例えば、以下に示した図１４のような状態にすることで、図１５または図１６の手法で回収可能となる。
　作製したスフェロイド７は、例えば、図１５、１６に表す手法で回収する。以下に述べる方法によれば、スフェロイド７を損傷することなく回収することが可能になる。
　図１５は、シャーレ９２に回収用溶液を入れ、第二表面と接触させてスフェロイド７を回収する手法を表す。回収用溶液は、例えば、培地８、水、または緩衝液のいずれかから選択することができる。スフェロイド作製用デバイス１を用いて細胞を培養することで作製したスフェロイド７は、かかる手法により取り出す。かかる手法の好ましい態様は、液滴を回収用溶液側に移動させることで、スフェロイドを回収するものである。液滴を移動する際には、第二表面１２側に形成されている液滴を回収用溶液と接触させることが特に好ましい。
　図１６は、細胞培養容器９を蓋９３で閉じた上で第一表面１１側から圧力を加えてスフェロイド７を回収する手法を表す。第一表面１１側から圧力を加えると、液滴が破壊される。その結果、培地８がシャーレ９２に流れ出すことにより、スフェロイド７を回収できる。スフェロイド作製用デバイス１を用いて培養したスフェロイドを取り出す際は、このように液滴を破壊するのが好ましい。液滴を破壊する際にはどのような方法で第一表面１１側から圧力をかけてもよい。例えば培地８を液滴が破断するまで添加する方法でもよい。また第一表面１１側を密閉し気体を流しこんで加圧する方法などであってもよい。
　以上説明したように、本実施形態のスフェロイド作製用デバイス１によれば、複数の孔に液滴を発生させ、スフェロイドを作製することができるため、スフェロイドを効率よく、大量に作製することができる。その際、複数の孔の大きさを同じにすることにより、均一なスフェロイドを作製することができる。加えて、スフェロイド作製用デバイス１には、培地を第一表面１１（上側）から注入することが可能である。さらに培地を第一表面１１側から交換することが可能である。このためスフェロイド作製用デバイス１の操作は容易である。さらに加え、スフェロイド作製用デバイス１を物理現象に基づいて設計することにより、その構造を簡易なものとすることができる。これにより、例えば、特許文献２に記載の懸濁プレートに比べ、スフェロイド作製用デバイス１自体を容易に製造することができる。その結果、スフェロイドを作製するコスト、作業時間を大幅に削減することができる。
実施形態２
　実施形態１では、図１，２に示すような孔の形状を有するスフェロイド作製用デバイス１を説明したが、孔の形状はこれに限られるものではない。例えば、図２に示す断面ではなく、図１７乃至２２に表される形状の断面を有するスフェロイド作製用デバイス１ａ～１ｆであってもよい。スフェロイド作製用デバイス１ａ～１ｃは、図２と同様に、壁面１３が、第二表面１２との境界から、角度θｉを有する斜面で構成されている例である。一方、図２０に示すスフェロイド作製用デバイス１ｄは、角度を有する斜面が壁面１３の途中から形成されている例である。
　また、上面の形状は、図２、図１７乃至２２に一例として示すように、球の一部の形状（図２、２０乃至２２）や平坦（図１９）であってもよい。あるいは上面の形状は、円錐または多角錐の頂点のような形状（図１７，１８）であってもよい。スフェロイド作製用デバイスの一態様において、細胞が上面に滞留または静置することを防止するために、上面の形状は球形、円錐または多角錐の頂点の形状であることがより好ましい。加えて、図には示していないが、第一表面１１の開口部から孔へ入り口は垂直で第二方面１２の開口部周辺だけ傾いているような形状でも良い。
　ここで、図２０～図２２に示すスフェロイド作製用デバイス１ｄについて説明する。相当直径Ｄ及び角度θｉはデバイスの第二表面１２の開口部において培地と触れる位置における相当直径及び角度である。ここでデバイスの形状は図２０、図２１または図２２のようなデバイスの形状であっても良い。図２０は、レベル２からレベル３までの壁面１３が角度を有している場合を表す図である。図中ではレベル３の開口部の内接円の相当直径がレベル４の内接円の相当直径と同じである。この場合にはレベル４の位置が内接円の相当直径Ｄｉｎ及び角度θｉの基準となる。図２１は、レベル３からレベル４までの壁面１３が角度を有する場合の一例を表す図である。図中ではレベル３の開口部の内接円の相当直径がレベル４の内接円の相当直径Ｄより大きい。この場合にはレベル４の位置が内接円の相当直径Ｄｉｎ及び角度θｉの基準となる。このとき、レベル３からレベル４までの壁面１３の斜度、すなわち角度θｉは、レベル２からレベル３までの壁面１３の斜度よりも小さいことが好ましい。
　さらに、図２２に示すようにレベル２からレベル３までの壁面１３が角度を有していてもよい。かかる場合、レベル３の開口部の内接円の相当直径よりレベル４の開口部の内接円の相当直径が大きい。このとき、壁面１３の中で培地が触れる最も下のレベルはレベル３である。したがってレベル２からレベル３の斜度が角度θｉとなり、レベル３の位置が内接円の相当直径Ｄｉｎとなる。図２０乃至２２において、角度θiは、第二表面（下面）または第二表面側の開口部であって、液面が触れる位置の角度となる。
　実施形態１では、図１，２に示すような第一表面１１及び第二表面１２に形成される開口部が円形である場合を説明した。しかしながら、開口部の形状はこれに限られるものではない。例えば、開口部が、図２３乃至２６に示すような形状を有するスフェロイド作製用デバイス１ｇ～１ｊであってもよい。図１、２で説明したように、スフェロイド作製用デバイス１は、培地と接触する部分として、第一表面１１（上面）と、第一表面１１の開口部と、第二表面１２（下面）の開口部とを備えることが好ましい。さらに第一表面１１の開口部の内接円の相当直径が第二表面１２の開口部の内接円の相当直径Ｄｉｎよりも大きいことが好ましい。そのため、孔の形状は、スフェロイド作製用デバイス１ｇ～１ｊに示すように、円でもよく四角、八角形のような多角形であってもよい。さらに、第一表面１１の開口部の形状と第二表面１２の開口部の形は異なっていてもよい。図２３乃至２６の各図では、第一表面１１の開口部（または、上面の幅Ｗの位置の開口部の形状）を実線で表している。また、第二表面の開口部を点線で表している。これらの開口部は、スフェロイド作製用デバイス１ｇ～１ｊを第一表面１１側から見たときの４つの孔として表されている。
　加えて、スフェロイド作製用デバイスの一態様では、例えば、薄いシート状のフィルムにポンチで穴を開けてもよく、金型を作製して樹脂を流し込み成形してもよい。このとき、上面の開口部の内接円の相当直径が下面の開口部の内接円の相当直径Ｄｉｎよりも大きい空間となるようにする。さらに、培地の重量を支えるために、フィルムや樹脂を補強するための支えをつけても良い。フィルムや樹脂の厚くするような場合、軽量化を図るために中を空洞にしてもよい。
　スフェロイドを作製する試験を実施した。まず図２７、２８に示す形状のスフェロイド作製用デバイス１ｘを設計・製造した。次にスフェロイド作製用デバイス１ｘを図２９、３０に示すウェル容器９１ｘに装着した。スフェロイド作製用デバイス１ｘを備えた、図２９、３０に示すウェル容器９１ｘを６ウェルプレート（図示しない）に装着した。このとき、液滴８１及び第２表面１２がウェルプレートの底に接触しないことを確認した。
　図２７に第一表面から見た図を示す。また図２８に、図２７のＸＸＶＩＩＩ－ＸＸＶＩＩＩ線に沿った断面図を示す。また、図２９に第一表面から見た図を示す。また図３０に、図２９のＸＸＸ－ＸＸＸ線に沿った断面図を示す。
　スフェロイド作製用デバイス１ｘは、一ピッチＰＩを１．００ｍｍとし、以下の大きさで作製した。
第二表面１２ｘの相当直径Ｄ：０．２５ｍｍ
角度θｉ：６７．５度
厚みＴ：０．７４ｍｍ
上面の幅Ｗ：０．１８４ｍｍ　
　ウェル容器９１ｘについては、以下の大きさとした。
ウェル容器の内周の直径Ｌ１：３１ｍｍ
ウェル容器の高さＬ３：１．５ｃｍ
１．培養容器
［実施例１］
　接触角θｃが－１＜ｃｏｓθｃ＜０の範囲にある材料を使用した。スフェロイド作製用デバイスの材質としてシリコーン（メーカー：ＫＣＣ、グレード：ＳＬ７２６０）を用いた。培地として、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２を用いた。以降では、培地Ａと記載する。
＜スフェロイド作製用デバイスの設計＞
上述した式３（以下に再掲）を用いる。
（２／３）αＲ２＋ｐＲ＝２γＬ・・・式３
本実施例では、純水の条件で設計を行った。
・純水の密度及び比重：１．００（文献値）
・液体の表面張力γＬ：７×１０－２［ｇ／ｃｍ］
　培地Ａの液体の表面張力γＬは、Ｗｉｌｈｅｌｍｙ法など様々な方法で測定することができる。または販売元から情報を入手することが可能である。純水のデバイスの材質に対する接触角θｃを液滴法により測定したところ、９１度度（ｃｏｓ９１度＝－０．０１７）であった。なお、本実施例で使用した培地と純水は、この接触角θｃについて、近傍の値を示すものである。
・培地の高さＨは、１ｃｍ以内になるように設計する。
　培地Ａを使うとき、式３に上述した値を代入して外接円の相当半径Ｒｏｕｔを求める。
（２／３）×１．００×Ｒ２＋１×１．００×Ｒ＝２×７×１０－２
Ｒ＝０．１２３、－１．６２９
　ここで、外接円の相当半径Ｒｏｕｔは正の値であるため、以下の値が決まる。
Ｒ＝０．１２３ｃｍ＝１２３０μｍ
　外接円の相当直径Ｄｏｕｔを算出値の２３％の２８５μｍとした。この際、タンパク質の吸着による疎水性の低下やスフェロイドの重力から受ける力と、培地交換や運搬の際の振動により液適が保持できなくなる可能性とを考慮した。角度θiは６７．５度とした。また開口部が１ｍｍとなるようにした。図１４に示すように、液滴がデバイスの側面の途中で止まることで、デバイスが確実に液滴を保持することができるように設計した。図３０の９１ｘの直径が３１ｍｍとなるようにした。
［比較例１］
　低接着性容器は直径５ｃｍのガラスシャーレの底に、信越化学社製のシリコーン樹脂（ＫＥ－１６０３（Ａ／Ｂ）を貼り付けたものを使用した。
２．培養方法
（１）培地１０ｍＬ中にマウスＥＳ細胞を２５０万個含むように調整した細胞懸濁液を図３０に示すウェルに添加した。かかる細胞を２日間培養した。この細胞懸濁液は実施例及び比較例の両方で使用した。尚、この細胞懸濁液を用いることで、１つの開口部に入れることのできる細胞数は１２５０個／開口部である。さらに他の実施例では、１つの開口部あたりに入る細胞数の量を１５００、１０００、５００個となるように調整した細胞懸濁液を調整した。これらの実施例でも同じく２日間培養を行った。
（２）実施例では第二表面１２を培地に接触させて、スフェロイドを回収したものを観察した。比較例は細胞懸濁液を他の容器に移さず、培養している容器を使ってスフェロイドを観察した。
（３）倒立顕微鏡で観察し、得られた画像を用いて直径を計測した。
３．結果
　図３１，３２に実施例１について、スフェロイド回収前のデバイスと細胞の顕微鏡写真を示す。図３２は、図３１の拡大図である。実施例１では、各開口部内にスフェロイドが形成されていた。
　図３３に、実施例１及び比較例１について、回収後のスフェロイドの顕微鏡写真を示した。
　図３４に、実施例１について、スフェロイド回収後のデバイス表面の写真を示した。図３１で見られたスフェロイドがほぼ全数回収されていた。ただし、端については残存しているものも見受けられた。回収率は９５％以上であった。回収率は、式（細胞が残存していない開口部の数／開口部の総数）×１００）により求めた。
　図３５に比較例１のスフェロイドの写真を示す。
　また、図３６に実施例１及び比較例１の粒径直径分布を表すグラフを示す。図３６のグラフ作成においては、図３３（左側の実施例1の写真、右側の比較例1の写真、）の×７５のレンズで撮影し、スフェロイドの画像を取り込んだ。取り込んだ画像を任意に下記表１のデータ数だけ選択し、各々のスフェロイドの直径を計測した。
　このときの細胞塊の直径の平均値（μｍ）と、標本標準偏差（ＳＤ）と、ばらつき（ＳＤを直径の平均値で除したもので定義される）を表１に示した。ＳＤ／平均直径の値から分かるように、実施例１のばらつきは比較例１のばらつきの１／３以下であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図３７に実施例１の細胞数を変えた場合の粒子直径分布を示す。
　さらに、細胞数を変えた場合であっても、均一な直径の細胞塊を形成させることができるかを検討した。表２に検討結果を示す。今回設計した相当直径Ｄでは１５００、１０００細胞／開口部の時に比較例と比較と比較して１０％程度低いばらつきとなった。５００細胞／開口部の場合には、比較例と同等のばらつきとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。
　この出願は、２０１４年２月２５日に出願された日本出願特願２０１４－０３４５７７を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１、１ａ～１ｈ、１ｘ　スフェロイド作製用デバイス
７　スフェロイド
８　培地
９　細胞培養容器
１１、１１ｘ　第一表面
１２、１２ｘ　第二表面
１３、１３ｘ壁面
９　細胞培養容器
９１、９１ｘ　ウェル容器
９２　シャーレ
９３　蓋

Claims (19)

  1. 　第一表面と、
    　前記第一表面の裏面となる第二表面と、
    　前記第一表面と前記第二表面との間を貫通する複数の孔を形成する複数の壁面と、を備え、
    　前記第一表面の開口部の内接円の相当直径が前記第二表面の開口部の内接円の相当直径より大きい、
    　スフェロイド作製用デバイス。
  2. 　前記第二表面の内接円の開口部の相当直径が２００マイクロメートルから１センチメートルの範囲である請求項１記載のスフェロイド作製用デバイス。
  3. 　各壁面の少なくとも一部分は、前記第二表面に対して１度より大きく、９０度より小さい角度の傾斜を有する請求項１または２記載のスフェロイド作製用デバイス。
  4. 　前記各孔には前記第一表面から培地が注入され、
    　前記各壁面を構成する材質の表面と前記培地との接触角θｃが、－１＜ｃｏｓθｃ≦０の範囲であるとき、前記第二表面の外接円の開口部の相当直径の半分である外接円の相当半径Ｒｏｕｔ（ｃｍ）が、
    計算式　（２／３）αＸ２＋ｐＸ＝２γＬ、
    　ただし、ｐは前記第二表面の開口部での水圧［ｇ／ｃｍ２］、αは前記培地の比重、γＬは液体の表面張力［ｇ／ｃｍ］、
    で定義される変数Ｘの値以下である請求項１乃至３のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイス。
  5. 　前記各孔には前記第一表面から培地が注入され、
    　前記各壁面を構成する材質の表面と培地の接触角θｃが０＜ｃｏｓθｃ＜１の範囲であるとき
    計算式　γＬｃｏｓθｃ－γＳ＞０
    であって、かつｐ＝γＬ×（２／ｒ）、
    　ただし、ｐは前記第二表面の開口部での水圧［ｇ／ｃｍ２］、γＬは液体の表面張力［ｇ／ｃｍ］、ｒは曲率半径［ｃｍ］、γＬは液体の表面張力［ｇ／ｃｍ］、
    をみたすように内接円の相当直径を設計することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイス。
  6. 　一つの孔を形成する壁面と、隣接する別の孔を形成する壁面との間の幅であって、二つの壁面が前記第二表面に対して前記角度θｉの傾斜を有する前記第一表面に近い端部の幅が５ミリメートル以下である請求項３記載のスフェロイド作製用デバイス。
  7. 　前記スフェロイド作製用デバイスが、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマ塩化ビニル系樹脂、シリコーン樹脂及びシリコン樹脂のうちの１つ、またはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品である請求項１乃至６のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイス。
  8. 　前記複数の壁面に、プラズマ処理、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のうちの１つ、またはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により官能基を形成させた請求項７記載のスフェロイド作製用デバイス。
  9. 　前記複数の壁面に、無機物、金属、合成ポリマー、ダイマー、トリマー、テトラマー、生体由来ポリマーのうちの１つ、またはこれらの組合せからなる物質が被覆されている請求項７記載のスフェロイド作製用デバイス。
  10. 　前記複数の壁面の表面に、ナノメートルオーダの微細構造を有する請求項８乃至９のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイス。
  11. 　前記スフェロイド作製用デバイスが、金属、ガラスなどの無機物のうちの１つ、またはこれらの組み合わせからなる成形品である請求項１乃至６のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイス。
  12. 　前記複数の壁面に、プラズマ処理、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のうちの１つ、またはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により表面を改質した請求項１１記載のスフェロイド作製用デバイス。
  13. 　前記複数の壁面に、無機物、金属、ポリマー、ダイマー、トリマー、テトラマーのうちの１つ、またはこれら組合せからなる物質が被覆されている請求項１１または１２に記載のスフェロイド作製用デバイス。
  14. 　前記複数の壁面の表面に、ナノメートルオーダの微細構造を有する請求項１１乃至１３のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイス。
  15. 　請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイスの前記第二表面を水、培地及び緩衝液のうちの１つから選択される溶液と接触させてスフェロイドを回収する、スフェロイド回収方法。
  16. 　請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイスの前記第一表面から圧力を加えることによってスフェロイドを前記第二表面の開口部から流し出すスフェロイド回収方法。
  17. 　請求項１乃至１４のいずれか一項に記載のスフェロイド作製用デバイスを用いるスフェロイド製造方法であって、
    　前記各孔に細胞を含む培地を、前記第一表面から注入し、
    　前記各孔で液滴を形成させ、
    　前記液滴の部分で前記細胞を培養し、スフェロイドを作製するスフェロイド製造方法。
  18. 　前記第二表面を水、培地及び緩衝液のうちの１つから選択される溶液と接触させてスフェロイドを回収する、請求項１７記載のスフェロイド製造方法。
  19. 　前記第一表面から圧力を加えることによって、前記液滴を破壊してスフェロイドを前記第二表面の開口部から流し出す、請求項１７記載のスフェロイド製造方法。
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