WO2015125343A1 - 細胞分取方法 - Google Patents

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WO2015125343A1
WO2015125343A1 PCT/JP2014/077453 JP2014077453W WO2015125343A1 WO 2015125343 A1 WO2015125343 A1 WO 2015125343A1 JP 2014077453 W JP2014077453 W JP 2014077453W WO 2015125343 A1 WO2015125343 A1 WO 2015125343A1
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substrate
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staining
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森本　伸彦
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オリンパス株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving

Definitions

  • the present invention relates to a cell sorting method.
  • a section of living tissue is pasted on a substrate bonded on a sheet, the substrate is divided into a large number of chips together with the section by extending the sheet, and a part of the chips are collected from the sheet,
  • a cell sorting method for sorting cells in a specific region is known (see, for example, Patent Document 1).
  • the substrate has a lattice-like groove as a cutting line, and is configured to be easily disassembled at the position of the groove when the substrate is pulled by extension of the sheet. Then, when the substrate is disassembled by extending the sheet and the chips are separated from each other, the slice on the substrate is also pulled in the surface direction, so that the slice is also divided at substantially the same position as the substrate.
  • a robust tissue structure and a fragile tissue structure coexist in a section of a living tissue. Even within one section, the tensile strength varies greatly depending on the position. Therefore, when the section is pulled by extension of the sheet, the fragile part is cut at the groove position like the substrate, but the sturdy part is cut not at the groove position but at a fragile position such as the boundary of the tissue structure. The In particular, if the adhesive strength of the section to the substrate is not sufficient, the sturdy portion is peeled off from the substrate when pulled by the extension of the sheet, and is easily cut at a position different from the groove. Thus, there is a disadvantage that the cutting position of the section cannot be accurately controlled.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and a substrate on which a section of biological tissue is attached is divided into a large number of chips together with the section, and a section is obtained by collecting some chips. It is an object of the present invention to provide a cell sorting method that can cut a section accurately along a cutting line formed on a substrate.
  • One aspect of the present invention is a cell sorting method in which a section cut out from a biological tissue is divided into a plurality of fragments, and a part of the fragments is collected. Affixing the section on the surface of a substrate configured to be disassembled into chips, and cutting the section by bending and deforming the substrate and the section on the substrate along the predetermined cutting line. A breaking step, an extension step of applying a tensile force in the surface direction to the substrate after the braking step, disassembling the substrate at the position of the cutting line, and separating the chips from each other, and disassembling by the extension step And a collection step of collecting at least one of the plurality of chips.
  • the section pasted on the substrate in the pasting process is cut along the cutting line in the braking process, and then the section and the substrate are disassembled into chips in the extension process.
  • a chip to which a fragment of a desired region in the section is attached can be collected.
  • stains the said section may be included between the said braking process and the said extension process.
  • the staining step is preferably performed after the breaking step.
  • the staining process before the extension process it is possible to observe a stained image of the slices connected to one.
  • stains the said section may be included between the said extension process and the said collection process. After the staining process, the section is easily peeled off from the surface of the substrate by washing the section. Therefore, by performing an extension process in which a tensile force acts on the section before the dyeing process, the section is peeled off from the surface of the substrate in the extension process because, for example, the section was not sufficiently cut in the braking process. This can be prevented, and the section can be cut more precisely along the cutting line of the substrate.
  • a cell sorting method in which a substrate on which a section of biological tissue is affixed is divided into a large number of chips together with the section, and a part of the chips is collected to separate cells from the section. There is an effect that the slice can be accurately cut along the cutting line formed on the substrate.
  • FIG. 1 is a perspective view showing a squeegee used in Example 1.
  • Example 2 it is the image which image
  • the cell sorting method according to the present embodiment includes a pasting step S1 for pasting a section 1 cut out from a living tissue to a substrate 3 adhered on a sheet 2, and a section 1 with a predetermined section.
  • a breaking step S2 for cutting along the cutting line 4 an extension step S3 for extending the sheet 2 to decompose the substrate 3 together with the section 1 into a large number of chips 3a, and a package for removing the embedding agent from the section 1
  • the section 1 is prepared by a paraffin embedding method or a freeze embedding method from a living tissue fixed with a fixing agent such as formalin.
  • the back surface of the substrate 3 is bonded to one surface of the sheet 2 as shown in FIG. 2A.
  • the sheet 2 has extensibility that can be extended in the surface direction, and has adhesiveness on one side.
  • the adhesive strength of the sheet 2 is preferably controllable so that the desired chip 3a can be easily peeled from the sheet 2 in the sampling step S6.
  • a sheet 2 for example, as described in International Publication No. 2011/149909, an ultraviolet peelable adhesive whose adhesive strength is reduced by irradiation with ultraviolet rays is applied on one side, for a semiconductor process.
  • a dicing tape is preferably used.
  • the substrate 3 is configured to be disassembled into a large number of chips 3a along a predetermined cutting line 4 by a tensile force received from the sheet 2 when the sheet 2 is extended in the surface direction.
  • a lattice-like groove (hereinafter also referred to as a groove 4) serving as a cutting line 4 is formed on the substrate 3.
  • the groove 4 is formed by, for example, half-cutting or full-cutting the substrate 3 using a dicing apparatus used for cutting a semiconductor wafer, from the front surface or the back surface of the substrate 3 to at least a middle position of the thickness dimension, Preferably, it is formed from the front surface to the back surface.
  • the pitch of the grooves 4 corresponding to the side dimensions of the individual chips 3a can be designed to an arbitrary dimension as long as it is smaller than the section 1, and is preferably 1.0 mm or less, for example.
  • the substrate 3 may be created by such a method, and the cutting line 4 may be a linear boundary between the side surfaces of the chips 3a that are in close contact with each other, instead of the groove.
  • a method using a laser beam is known as described in Japanese Patent No. 4703983.
  • This method is a method of obtaining a cutting effect similar to that of dicing by modifying the substrate 3 into a linear shape with laser light to form a fragile portion.
  • the cutting line 4 formed by the laser beam is not a groove but a linear crack, and no gap is formed between the chips 3a.
  • the substrate 3 can be completely separated into chips 3a at the position of the crack.
  • a laser ablation method as another method using laser light. In the laser ablation method, a material is destroyed in a minute range by a laser beam, and the cutting line 4 formed by this method becomes a groove.
  • the slice 1 is attached to the front surface of the substrate 3.
  • the substrate 3 on which the section 1 is attached is allowed to stand at a temperature equal to or higher than the melting temperature of paraffin (for example, 50 ° C.) for a certain period (for example, 60 minutes) and then cooled to room temperature. To do. Thereby, the slice 1 is firmly fixed to the front surface of the substrate 3.
  • the section 1 When the section 1 is a frozen section, the section 1 is attached to the substrate 3 warmed from the back side with a finger or the like in the cryostat to dissolve the embedding agent, and then the section 1 is exposed to the section 1 with cold air for about 10 minutes. Dry. Thereby, the slice 1 is firmly fixed to the front surface of the substrate 3.
  • embedding agents for frozen sections include Tissue Tech O.D. manufactured by Sakura Finetech Japan. C. T.A. Compound is used.
  • the slice 1 is cut at the position of the groove 4 by bending the slice 1 and the substrate 3 at the position of the groove 4.
  • the substrate 3 is also completely cut at the position of the groove 4.
  • the bending deformation may be performed by any means as long as the section 1 can be bent at the position of the groove 4 without breaking the sheet 2.
  • the braking member 5 is pressed against the surface of the seat 2 opposite to the substrate 3, and the braking member 5 is moved in the direction in which the grooves 4 are arranged.
  • the braking member 5 is, for example, a squeegee, a ball, a roller, or a balloon.
  • the breaking member 5 is disposed at a position facing the groove 4, the section 1, the substrate 3, and the sheet 2 are bent so that the position of the groove 4 is a mountain.
  • the slice 1 is locally pulled at the position of the groove 4 in the surface direction, so that it breaks at the position of the groove 4.
  • the groove 4 is formed in the biaxial direction, the above operation is performed in the biaxial direction.
  • the slice 1 is divided into a number of pieces 1a having the same shape as the chip 3a.
  • the sheet 2 is extended in the surface direction.
  • the substrate 3 is disassembled into a large number of chips 3a along the grooves 4, and the chips 3a are arranged on the sheet 2 at intervals.
  • an expander used in a semiconductor process is preferably used for the extension of the sheet 2.
  • the sheet 2 can be easily extended uniformly in all directions.
  • the sheet 2 is maintained in the extended state shown in FIG. 2B using, for example, a grip ring.
  • an embedding agent removing step S4 for removing the embedding agent from the section 1 is performed.
  • the section 1 is a paraffin-embedded section
  • the section 1 is immersed in a deparaffinizing agent such as xylene or D-limonene. This is performed, for example, by dropping a deparaffinizing agent on the tip 3a using a pipette or the like.
  • a deparaffinizing agent it is sufficient that the section 1 and the deparaffinizing agent are in contact with each other for about 60 seconds. In such a short time, dissolution of the resin or pressure-sensitive adhesive constituting the sheet 2 in the deparaffinizing agent does not cause a problem.
  • the section 1 is a frozen section
  • the embedding agent is water-soluble
  • the section 1 is immersed in pure water, phosphate buffer, or the like.
  • the section 1 is easily peeled off from the chip 3a by containing moisture, it is preferable that the section 1 is sufficiently dried after removing the embedding agent and then transferred to the next staining step S5.
  • the staining step S5 when the section 1 is a fresh frozen section, since it is not fixed with formalin or the like, it is preferable to perform the staining step S5 after fixing with a 95% ethanol solution or the like after removing the embedding agent. . Thereby, a better staining result can be obtained.
  • the tissue structure contained in the section 1 is visualized by staining the section 1 with an appropriate dye.
  • an appropriate dye for example, toluidine blue or hematoxylin is used.
  • the dye is preferably used alone so that the cells are not affected by the long time required for the staining step S5.
  • the operator observes the stained image of the section 1 with an optical microscope, acquires the image of the section 1 as necessary, and specifies the position of the fragment 1a containing desired cells.
  • the chip 3a to which the identified fragment 1a is attached is peeled off and collected from the sheet 2.
  • the collection step S6 is performed using, for example, the cell sorting apparatus described in International Publication No. 2011/149909. Specifically, an operation for reducing the adhesive strength of the sheet 2 is performed as necessary (for example, irradiation of ultraviolet rays when using an ultraviolet peelable adhesive). Thereafter, the sheet 2 is horizontally arranged so that the chip 3a faces downward, and the back surface of the desired chip 3a is pierced with a needle through the sheet 2, thereby peeling and dropping the chip 3a from the sheet 2. The dropped chip 3 a is collected in a container that is previously arranged below the sheet 2.
  • the needle used at this time is suitably a push-up pin used in a semiconductor process in terms of size and durability.
  • an inverted microscope or a camera that can observe the chip 3a from below may be used to observe the fragment 1a attached to the chip 3a.
  • the direction in which the tip 3a is pierced by the needle may be from the bottom to the top, or may be the horizontal direction.
  • all the chips 3a on the sheet 2 may be dropped on a plane, and the desired chip 3a may be collected from the plane by suction or the like.
  • the breaking step S2 is performed before the embedding agent removing step S4, and the section 1 is firmly fixed to the front surface of the substrate 3 by the embedding agent. It is cut at.
  • the adhesive force of the section 1 to the substrate 3 is sufficiently larger than the tensile strength of the sturdy tissue structure included in the section 1. Therefore, when a tensile force is applied to the position of the cutting line 4 of the section 1 by bending deformation, the section 1 is surely broken at the position of the cutting line 4 without being peeled off from the front surface of the substrate 3.
  • the substrate 3 and the slice 1 are subsequently disassembled together by extending the sheet 2 in the surface direction, thereby obtaining a fragment 1a cut along the outline of the chip 3a.
  • the slice 1 is cut at a position different from that of the substrate 3, it becomes uncertain to which chip 3a the desired cell region specified based on the stained image is distributed after the extension step S3. As a result, there arises a problem that a desired cell is not attached to the chip 3a collected in the collecting step S6 or an unintended type of cell is attached to the chip 3a. On the other hand, according to the present embodiment, since the slice 1 is cut along the cutting line 4 of the substrate 3 accurately, the above problem does not occur.
  • the slice 1 is sufficiently firmly fixed to the substrate 3, for example, even if the thickness of the slice 1 is as thick as 5 ⁇ m to 20 ⁇ m, the pitch of the cutting lines 4 is 0. Even if it is as small as about 5 mm, the section 1 can be divided along the cutting line 4 accurately.
  • the embedding agent removing step S4 and the dyeing step S5 are performed after the extending step S3.
  • the dyeing step S5 may be performed before the extension step S3.
  • the embedding agent removing step S4 and the staining step S5 are not essential, and the embedding agent is used when the dye used for staining affects the analysis of the molecules in the section 1 or the molecules.
  • the removal step S4 and the staining step S5 may be omitted.
  • an image superposition method described in International Publication No. 2012/066827 can be used instead of staining. That is, two sections are cut out from positions adjacent to each other in the living tissue, and one section is used in steps S1 to S3 and S6 described above, and the other section is stained. These two sections have almost the same tissue structure. Therefore, by comparing one section on the substrate 3 with the other stained section, the tissue structure of the section on the substrate 3 can be clearly recognized without staining.
  • Example 1 In order to evaluate the accuracy of the cutting position of the section with and without the braking process, the following experiment was performed. First, a 20 ⁇ m-thick paraffin-embedded section was prepared from a formalin-fixed porcine large intestine and affixed on a substrate. As the substrate, a cover glass having a thickness of 0.15 mm was attached to a sheet, and a full cut dicing was performed in a lattice shape at a pitch of 0.5 mm to form a lattice-shaped cutting line. As the sheet, a dicing tape (manufactured by Nitto Denko Corporation, UE-111AJ) was used.
  • a dicing tape manufactured by Nitto Denko Corporation, UE-111AJ
  • the substrate on which the section was affixed was allowed to stand on a hot plate at 50 ° C. for 60 minutes and then cooled at room temperature, whereby paraffin was dissolved to firmly fix the section on the surface of the substrate.
  • Two samples A and B were prepared according to the above procedure. In these two samples A and B, two sections cut out from positions close to each other in the same porcine large intestine were used so that the tissue structures of the sections were almost the same.
  • a braking process was performed on only one sample A of the two prepared samples A and B using the squeegee shown in FIG.
  • the squeegee is made of chrome-plated iron, has a thickness of 1 mm, has an arc shape with a radius of curvature of 10 mm when viewed from the front, and has an edge 5 a that is flat when viewed from the side.
  • the edge 5a of the squeegee is pressed against the surface of the sheet opposite to the substrate at an angle of 45 ° to raise the sheet by 5 mm, and in the pushed position, the direction perpendicular to the cutting line 10 reciprocations. This was carried out in two directions along the cutting line of the substrate, whereby a force was applied to the substrate and the section to cause bending deformation, and the section was cut along the cutting line.
  • FIG. 6 is an image of sample A (with a braking process)
  • FIG. 7 is an image of sample B (without a braking process).
  • each chip is adjacent to four other chips and has four boundaries.
  • the total number of boundaries to be cut out of the region where the sections were placed was 478.
  • the number of boundaries that were cut was measured. Specifically, for example, when two chips are connected without being disassembled, it is determined that one boundary is not cut, and when four chips are connected without being disassembled, It was determined that the four boundaries were not cut.
  • Example 2 Next, the accuracy of the cutting position of the sections was compared between the case where the breaking process was performed before and after the staining process.
  • samples C and D were prepared in the same procedure as in Example 1. Also in this example, two sections cut out from positions close to each other in the same porcine large intestine were used as samples C and D.
  • FIG. 8 is an image of sample C (braking process before the dyeing process)
  • FIG. 9 is an image of sample D (braking process after the dyeing process).
  • Section includes mucous membrane, submucosa, proper muscle layer, serosa, lymph node.
  • the portion having any tissue structure in the section was cut along the outline of the chip.
  • a part of the muscle layer and the mucous membrane layer in particular was cut off at a position deviated from the surface of the substrate and deviated from the outline of the chip. This is thought to be due to the fact that the adhesive strength of the slice to the substrate surface weakens due to deparaffinization, and is easily peeled off from the substrate, and was peeled off in the braking process.
  • the sheet was irradiated with ultraviolet rays using a UV light source (ULEDN-102CT manufactured by NS Lighting Co., Ltd.) to weaken the adhesive strength of the sheet.
  • a UV light source ULEDN-102CT manufactured by NS Lighting Co., Ltd.
  • the back side of the chip was pushed through the sheet, and the chip was peeled off and collected from the sheet.
  • the chip to be collected was observed using a stereomicroscope (SZX-7, manufactured by Olympus Corporation), as shown in FIG. 10, the section of the slice was observed in another chip adjacent to the collected chip. Peeling was not confirmed, and it was confirmed that only the region corresponding to the desired chip could be collected from the section.
  • Example 3 the accuracy of the cutting position of the sections was compared between the case where the embedding agent removing step was performed before the breaking step and the case where it was performed after the extending step.
  • samples E and F were prepared using the same materials as in Examples 1 and 2 except that fresh frozen sections were used instead of paraffin-embedded sections.
  • the section attached to the substrate was firmly fixed to the surface of the substrate by drying at room temperature with a dryer for 5 minutes.
  • the embedding agent removal process was performed only on one sample F of the two prepared samples E and F. Specifically, 400 ⁇ L of PBS was dropped onto the section and allowed to stand for 2 minutes, after which PBS was removed and the section was dried overnight. Next, a braking process and an extension process were performed on both samples E and F.
  • the procedures of the braking process and the extension process are the same as the braking process and the extension process described in the first embodiment. Here, samples E and F were photographed between the braking process and the extension process to obtain images. After the extension process, a grip ring was attached to the sheet to fix the sheet in the extended state.
  • FIG. 11 and FIG. 12 are images of sample E (embedding agent removal step after the extension step), which were taken before the extension step and after the embedding agent removal step, respectively.
  • FIGS. 13 and 14 are images of Sample F (embedding agent removal process before the braking process), which were taken before and after the extension process.
  • the frozen section can be cut along the cutting line accurately when the breaking process is performed after the embedding agent removing process. It was confirmed that when the breaking step was performed before the embedding agent removing step, the section could be cut along the cutting line accurately without peeling off from the surface of the substrate.
  • Example 4 Next, the accuracy of the cutting position of the section when the embedding agent removing process was performed between the breaking process and the extending process was evaluated.
  • a sample G using a paraffin-embedded section was prepared in the same procedure as in Examples 1 and 2. Further, Sample H using a frozen section was prepared in the same procedure as in Example 3.
  • the braking process was performed on both samples G and H in the same procedure as the braking process of Example 1.
  • only the sample G was subjected to the embedding agent removing step and the staining step according to the procedure described in Example 2.
  • the embedding agent removing step was performed only on sample H by the procedure described in Example 3.
  • FIG. 15 is an image of sample G (paraffin-embedded section)
  • FIG. 16 is an image of sample H (frozen section). In both FIG. 15 and FIG. 16, the section was cut along the outline of the chip, and peeling from the surface of the substrate was not observed.

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Abstract

その表面方向の引張力によって所定の切断線で複数のチップに分解可能に構成された基板の表面に、生体組織の切片を貼り付ける貼付工程（Ｓ１）と、基板と該基板上の切片とを所定の切断線に沿って曲げ変形させて切片を切断するブレーキング工程（Ｓ２）と、該ブレーキング工程（Ｓ２）の後に基板に表面方向の引張力を与えて基板を切断線の位置で分解する伸展工程（Ｓ３）と、該伸展工程（Ｓ３）によって分解された複数のチップのうち少なくとも１つを採取する採取工程（Ｓ６）とを含む細胞分取方法を提供する。

Description

細胞分取方法
　本発明は、細胞分取方法に関するものである。
　従来、シート上に接着された基板に生体組織の切片を貼り付け、シートの伸展によって基板を切片と一緒に多数のチップに分割し、一部のチップをシートから採取することで、切片内の特定領域の細胞を分取する細胞分取方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。基板は、切断線としての格子状の溝が形成されており、シートの伸展によって基板が引っ張られたときに溝の位置で容易に分解するように構成されている。そして、シートの伸展によって基板が分解してチップが互いに引き離されるときに基板上の切片も表面方向に引っ張られることによって、切片も基板とほぼ同じ位置で分割されるようになっている。
　一方、半導体分野において、半導体のウエハをチップに分割するブレーキングという技術が知られている（例えば、特許文献２参照。）。ウエハにダイアモンドカッタ等を使用して分割線となる傷を付けた後にこの傷の部分にスティックやローラ等の道具を押し当てて変形を与えることによって、ウエハを傷に沿って割ることができる。
国際公開第２０１１／１４９００９号 米国特許第３４４８５１０号明細書
　しかしながら、規則的な結晶構造を有し真っ直ぐに割れやすい半導体のウエハとは異なり、生体組織の切片内には頑丈な組織構造と脆い組織構造とが共存するため、特に切片が厚い場合には１つの切片内においても引張強度が位置によって大きく異なる。したがって、シートの伸展によって切片が引っ張られたときに、脆い部分は基板と同じく溝の位置で切断されるが、頑丈な部分は、溝の位置ではなく組織構造の境界等の脆い位置で切断される。特に、切片の基板への接着力が十分でないと、頑丈な部分は、シートの伸展によって引っ張られたときに基板から剥がれてしまい、溝とは異なる位置で切断されやすい。このように、切片の切断位置を正確に制御することができないという不都合がある。
　本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体組織の切片が貼り付けられている基板を切片と一緒に多数のチップに分割し、一部のチップを採取することで切片から細胞を分取する細胞分取方法において、切片を基板に形成した切断線に正確に沿って切断することができる細胞分取方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
　本発明の一態様は、生体組織から切り出した切片を複数の断片に分割し、一部の断片を採取する細胞分取方法であって、その表面方向の引張力によって所定の切断線で複数のチップに分解可能に構成された基板の表面に、前記切片を貼り付ける貼付工程と、前記基板と該基板上の前記切片とを前記所定の切断線に沿って曲げ変形させて前記切片を切断するブレーキング工程と、該ブレーキング工程の後に前記基板に前記表面方向の引張力を与えて前記基板を前記切断線の位置で分解し前記チップ同士を互いに離間させる伸展工程と、該伸展工程によって分解された前記複数のチップのうち少なくとも１つを採取する採取工程とを含む細胞分取方法である。
　本態様によれば、貼付工程において基板上に貼り付けた切片をブレーキング工程において切断線に沿って切断し、その後に伸展工程によって切片と基板とをチップ単位に分解することによって、採取工程において切片内の所望の領域の断片が付着したチップを採取することができる。
　この場合に、ブレーキング工程において、切片が切断線の位置で曲げられたときに、切片の溝に対応する位置に局所的に曲げ応力が作用する。このときに、切片は、貼付工程において基板の表面に強固に固着された状態のままであるので、基板の表面から剥がれてしまうことなく、基板の切断線の位置で破断する。これにより、切片を基板に形成された切断線に正確に沿って正確に切断することができる。
　上記態様においては、前記ブレーキング工程と前記伸展工程との間に、前記切片を染色する染色工程を含んでいてもよい。
　通常、切片を染色するためには、切片から包埋剤を除去するために洗浄する必要がある。切片の洗浄によって切片の基板への接着力が弱くなることがあるので、染色工程は、ブレーキング工程の後に行うことが好ましい。また、染色工程を伸展工程の前に行うことで、１つにつながっている状態の切片の染色像を観察することができる。
　上記態様においては、前記伸展工程と前記採取工程との間に、前記切片を染色する染色工程を含んでいてもよい。
　染色工程後は、切片の洗浄によって切片が基板の表面から剥がれ易くなる。したがって、切片に引張力が作用する伸展工程を染色工程の前に行うことによって、例えば、ブレーキング工程での切片の切断が不十分であったために伸展工程において切片が基板の表面から剥がれてしまうことを防止することができ、切片を基板の切断線にさらに正確に沿って切断することができる。
　本発明によれば、生体組織の切片が貼り付けられている基板を切片と一緒に多数のチップに分割し、一部のチップを採取することで切片から細胞を分取する細胞分取方法において、切片を基板に形成された切断線に正確に沿って切断することができるという効果を奏する。
本発明の一実施形態に係る細胞分取方法を示すフローチャートである。 図１の細胞分取方法において使用される基板およびシートの一例を示す平面図であり、シートの伸展前を示している。 伸展後の図２Ａのシートを示す平面図である。 図１のブレーキング工程における切片の切断方法を説明する図である。 本発明のもう１つの実施形態に係る細胞分取方法を示すフローチャートである。 実施例１で使用したスキージを示す斜視図である。 実施例１で取得したサンプルＡの画像であり、ブレーキング工程を実施したときのパラフィン包埋切片の切断結果を示している。 実施例１で取得したサンプルＢの画像であり、ブレーキング工程を省略したときのパラフィン包埋切片の切断結果を示している。 実施例２で取得したサンプルＣの画像であり、染色工程の前にブレーキング工程を実施したときのパラフィン包埋切片の切断結果を示している。 実施例２で取得したサンプルＤの画像であり、染色工程の後にブレーキング工程を実施したときのパラフィン包埋切片の切断結果を示している。 実施例２において、一部のチップを採取した後のシート上のチップおよび切片を撮影した画像である。 実施例３で取得したサンプルＥの画像であり、伸展工程前のパラフィン包埋切片を示している。 実施例３で取得したサンプルＥの画像であり、伸展工程の後に包埋剤除去工程を行ったときのパラフィン包埋切片の切断結果を示している。 実施例３で取得したサンプルＦの画像であり、ブレーキング工程の前に包埋剤除去工程を実施したときの、伸展工程前のパラフィン包埋切片を示している。 実施例３で取得したサンプルＦの画像であり、ブレーキング工程の前に包埋剤除去工程を実施したときのパラフィン包埋切片の切断結果を示している。 実施例４で取得したサンプルＧの画像であり、ブレーキング工程と伸展工程との間で包埋剤除去工程を行ったときのパラフィン包埋切片の切断結果を示している。 実施例４で取得したサンプルＨの画像であり、ブレーキング工程と伸展工程との間で包埋剤除去工程を行ったときの凍結切片の切断結果を示している。
　本発明の一実施形態に係る細胞分取方法について、図面を参照して以下に説明する。
　本実施形態に係る細胞分取方法は、図１に示されるように、生体組織から切り出した切片１を、シート２上に接着された基板３に貼り付ける貼付工程Ｓ１と、切片１を所定の切断線４に沿って切断するブレーキング工程Ｓ２と、シート２を伸展させて基板３を切片１と一緒に多数のチップ３ａに分解する伸展工程Ｓ３と、切片１から包埋剤を除去する包埋剤除去工程Ｓ４と、切片１を染色する染色工程Ｓ５と、シート２から所望のチップ３ａを採取する採取工程Ｓ６とを含んでいる。
　切片１は、ホルマリン等の固定剤で固定された生体組織からパラフィン包埋法または凍結包埋法によって作成される。
　基板３の裏面は、図２Ａに示されるように、シート２の片面に接着されている。シート２は、その表面方向に伸展可能な伸展性を有し、かつ、片面に粘着性を有している。シート２の粘着力は、採取工程Ｓ６において所望のチップ３ａをシート２から容易に剥離することができるように、制御可能であることが好ましい。このようなシート２としては、例えば、国際公開第２０１１／１４９００９号に記載されているように、紫外線の照射によって粘着力が低下する紫外線剥離型粘着剤が片面に塗布された、半導体プロセス用のダイシングテープが好適に使用される。
　また、基板３は、シート２が表面方向に伸展されたときにシート２から受ける引張力によって、所定の切断線４に沿って多数のチップ３ａに分解可能に構成されている。具体的には、基板３には、図２Ａに示されるように、切断線４となる格子状の溝（以下、溝４ともいう。）が形成されている。溝４は、例えば、半導体ウエハの裁断に使用されるダイシング装置を用いて基板３をハーフカットまたはフルカットすることによって、基板３のおもて面または裏面から厚さ寸法の少なくとも途中位置まで、好ましくはおもて面から裏面まで形成される。これにより、基板３は、その表面方向の引張力が加えられたときに、図２Ｂに示されるように、溝４に沿って容易に多数のチップ３ａに分解し、チップ３ａ同士が互いに離間するようになっている。個々のチップ３ａの辺寸法に相当する溝４のピッチは、切片１よりも小さければ任意の寸法に設計可能であり、例えば、１．０ｍｍ以下であることが好ましい。
　この他に、国際公開第２０１２／１６１０６９号に記載されているように、チップ３ａを隙間なくシート２上に配列する方法が考案されている。このような方法で基板３を作成しても良く、切断線４が、溝ではなく、互いに密着したチップ３ａの側面同士の線状の境界であってもよい。
　切断線４を形成する別の方法として、特許第４７０３９８３号公報に記載されているように、レーザ光を用いた方法が知られている。この方法は、基板３をレーザ光によって線状に改質して脆弱な箇所を形成することで、ダイシングと同様な切断効果を得る方法である。ガラス基板の場合、レーザ光によって形成される切断線４は、溝ではなく、線状の亀裂となり、チップ間３ａに隙間は形成されない。亀裂を形成した基板３にブレーキング操作を施すことで、基板３を亀裂の位置で完全にチップ３ａに分離することができる。
　さらに、レーザ光を使用したもう１つの方法として、レーザアブレーション法がある。レーザアブレーション法は、レーザ光によって材料を微小な範囲で破壊するもので、この方法によって形成された切断線４は、溝となる。
　本実施形態に係る細胞分取方法においては、まず、貼付工程Ｓ１において、図２Ａに示されるように、基板３のおもて面に切片１を貼り付ける。切片１がパラフィン包埋切片である場合、切片１が貼り付けられた基板３をパラフィンの溶解温度以上の温度（例えば５０℃）で一定期間（例えば６０分間）静置し、その後に室温まで冷却する。これにより、切片１が基板３のおもて面に強固に固着する。切片１が凍結切片である場合、指等で裏面から温めた基板３に切片１をクリオスタット内で貼り付けて包埋剤を溶解し、その後に切片１に冷風に１０分間程度当てて切片１を乾燥させる。これにより、切片１が基板３のおもて面に強固に固着する。凍結切片用の包埋剤として、例えば、サクラファインテックジャパン社製のティシュー・テック　Ｏ．Ｃ．Ｔ．　コンパウンドが用いられる。
　次に、ブレーキング工程Ｓ２において、切片１と基板３とを溝４の位置で曲げ変形させることによって、切片１を溝４の位置で切断する。このときに、溝４が基板３の厚さ寸法の一部分のみに形成されていてチップ３ａ同士がつながっている場合には、基板３も溝４の位置で完全に切断される。曲げ変形は、シート２を破ったりすることなく切片１を溝４の位置で折り曲げることができる手段であればどのような手段を用いて行われてもよい。
　例えば、ブレーキング工程Ｓ２は、図３に示されるように、シート２の基板３とは反対側の面にブレーキング部材５を押し当てて、該ブレーキング部材５を溝４の配列方向に移動させることによって行われる。ブレーキング部材５は、例えば、スキージ、ボール、ローラまたは風船である。ブレーキング部材５が溝４と対向する位置に配されたときに、溝４の位置が山となるように切片１、基板３およびシート２が曲げられる。このときに、切片１が、溝４の位置で局所的に表面方向に引っ張られることにより、溝４の位置で破断する。本実施形態においては、溝４は、２軸方向に形成されているので、以上の操作を２軸方向において行う。このブレーキング工程Ｓ２によって、切片１が、チップ３ａと同じ形状を有する多数の断片１ａに分割される。
　次に、伸展工程Ｓ３において、シート２をその表面方向に伸展させる。これにより、図２Ｂに示されるように、基板３が溝４に沿って多数のチップ３ａに分解し、チップ３ａが間隔を空けてシート２上に配列する。シート２の伸展には、半導体プロセスで用いられるエキスパンダが好適に用いられる。エキスパンダを用いることによって、シート２を容易に全方向に均一に伸展することができる。この後、シート２は、例えばグリップリングを用いて図２Ｂに示される伸展状態に維持される。
　次に、切片１を染色するための前処理として、切片１から包埋剤を除去する包埋剤除去工程Ｓ４を行う。具体的には、切片１がパラフィン包埋切片である場合には、切片１をキシレンまたはＤ－リモネン等の脱パラフィン剤に浸漬する。これは、例えば、チップ３ａの上にピペット等を用いて脱パラフィン剤を滴下することによって行われる。なお、脱パラフィンのためには、切片１と脱パラフィン剤とが約６０秒間接触していれば十分である。このような短時間では、シート２を構成する樹脂や粘着剤の脱パラフィン剤への溶解は問題にはならない。パラフィンを除去した後、水溶液である染色液が切片１へ浸透し易くするために、脱パラフィン剤をエタノールで置換することが好ましい。
　一方、切片１が凍結切片である場合には、包埋剤が水溶性であるので、切片１を純水やリン酸バッファ等に浸漬する。このときに、水分を含むことによって切片１がチップ３ａから剥がれ易くなるので、包埋剤の除去後に切片１を十分に乾燥させてから次の染色工程Ｓ５に移ることが好ましい。さらに、切片１が新鮮凍結切片である場合には、ホルマリン等による固定が行われていないので、包埋剤の除去後に９５％エタノール液等によって固定を行ってから染色工程Ｓ５を行うことが好ましい。これにより、より良好な染色結果を得ることができる。
　次に、染色工程Ｓ５において、切片１を適切な色素で染色することによって、切片１に含まれる組織構造を可視化する。色素としては、例えば、トルイジンブルーやヘマトキシリンが用いられる。色素は、染色工程Ｓ５に長時間を要することによって細胞が影響を受けることがないように、単独で用いられることが好ましい。操作者は、切片１の染色像を光学顕微鏡で観察し、必要に応じて切片１の画像を取得し、所望の細胞を含む断片１ａの位置を特定する。
　次に、採取工程Ｓ６において、特定した断片１ａが付着しているチップ３ａをシート２から剥離および採取する。採取工程Ｓ６は、例えば、国際公開第２０１１／１４９００９号に記載の細胞分取装置を用いて行われる。具体的には、必要に応じてシート２の粘着力を低下させる操作（例えば、紫外線剥離型粘着剤を使用している場合には紫外線の照射）を行う。その後、チップ３ａが下側を向くようにシート２を水平に配置し、所望のチップ３ａの裏面をシート２を介して針で突くことによって、チップ３ａをシート２から剥離および落下させる。落下したチップ３ａは、予めシート２の下方に配置された容器内に回収される。
　このときに使用する針は、寸法および耐久性の点から、半導体プロセスで利用される突き上げピンが適切である。採取工程Ｓ６においては、チップ３ａに貼り付いている断片１ａを観察するために、チップ３ａを下側から観察可能な倒立型顕微鏡やカメラを使用してもよい。また、針でチップ３ａを突く方向は、下から上であってもよく、水平方向であってもよい。さらに、シート２上の全てのチップ３ａを平面上に落下させ、所望のチップ３ａを吸引等によって平面上から採取してもよい。
　このように、本実施形態によれば、包埋剤除去工程Ｓ４の前にブレーキング工程Ｓ２が行われ、切片１が包埋剤によって基板３のおもて面に強固に固着している状態で切断される。この状態における切片１の基板３への接着力は、切片１に含まれる頑丈な組織構造の引張強度よりも十分に大きい。したがって、曲げ変形によって切片１の切断線４の位置に引張力が作用したときに、切片１は、基板３のおもて面から剥がれることなく、確実に切断線４の位置で破断する。これにより、その後にシート２の表面方向の伸展によって基板３と切片１とを一緒に分解することによって、チップ３ａの輪郭に正確に沿って切断された断片１ａが得られる。
　もし、切片１が、基板３とは異なる位置で切断された場合、染色像に基づいて特定した所望の細胞の領域が、伸展工程Ｓ３の後にどのチップ３ａに分配されるかが不確かとなる。その結果、採取工程Ｓ６において採取したチップ３ａに所望の細胞が付着していなかったり、あるいは、意図していない種類の細胞がチップ３ａに付着していたりする問題が生じる。これに対し、本実施形態によれば、基板３の切断線４に正確に沿って切片１が切断されるので、上記の問題は生じない。
　また、本実施形態によれば、切片１が基板３に十分に強固に固着しているので、例えば、切片１の厚さが５μｍから２０μｍと厚くても、また、切断線４のピッチが０．５ｍｍ程度と小さくても、切断線４に正確に沿って切片１を分割することができる。
　なお、本実施形態においては、包埋剤除去工程Ｓ４および染色工程Ｓ５を伸展工程Ｓ３の後に行うこととしたが、これに代えて、図４に示されるように、包埋剤除去工程Ｓ４および染色工程Ｓ５を伸展工程Ｓ３の前に行ってもよい。
　このようにすることで、切断線４に沿って切断された切片１が１つにつながっている状態でこの切片１の染色像を観察することができる。この状態においては、伸展工程Ｓ３後の多数の断片１ａが間隔を空けて配列した状態よりも、切片１内の、細胞や組織の分布等の組織構造を容易に把握することができる。
　また、本実施形態において、包埋剤除去工程Ｓ４および染色工程Ｓ５は必須ではなく、染色に使用する色素が切片１内の分子や分子の解析に影響を与えたりする場合には、包埋剤除去工程Ｓ４および染色工程Ｓ５を省略してもよい。
　この場合には、染色に代えて、国際公開第２０１２／０６６８２７号に記載されている画像重ね合わせ法を用いることができる。すなわち、生体組織の互いに近接する位置から２つの切片を切り出し、一方の切片を上述したステップＳ１からＳ３，Ｓ６に使用し、他方の切片に染色を施す。これらの２つの切片は、互いにほぼ同一の組織構造を有する。したがって、基板３上の一方の切片と染色された他方の切片とを見比べることによって、染色せずとも基板３上の切片の組織構造を明確に認識することができる。
　次に、本発明に係る細胞分取方法の有用性を確認するために行った実施例１から４について説明する。
（実施例１）
　ブレーキング工程の有無による切片の切断位置の精度を評価するために、以下の実験を行った。
　まず、ホルマリン固定したブタ大腸から厚さ２０μｍのパラフィン包埋切片を作成し、基板上に貼り付けた。基板としては、厚さ０．１５ｍｍのカバーガラスをシートに貼り付け、０．５ｍｍピッチで格子状にフルカットダイシングすることにより格子状の切断線を形成したものを使用した。シートとしては、ダイシングテープ（日東電工株式会社製、ＵＥ－１１１ＡＪ）を使用した。
　次に、切片を貼り付けた基板を５０℃のホットプレート上に６０分間静置した後に室温で冷却することによって、パラフィンを溶解させて切片を基板の表面に強固に固着させた。
　以上の手順に沿って２つのサンプルＡ，Ｂを準備した。これら２つのサンプルＡ，Ｂには、切片が有する組織構造が互いにほぼ同一であるように、同一のブタ大腸の互いに近接した位置から切り出した２つの切片を使用した。
　準備した２つのサンプルＡ，Ｂのうち一方のサンプルＡのみに対して、図５に示されるスキージを用いてブレーキング工程を行った。スキージは、クロムめっきを施した鉄製であり、１ｍｍの厚さを有し、正面から見たときに曲率半径１０ｍｍの円弧形状であり、側方から見たときに平坦であるエッジ５ａを有する。このスキージのエッジ５ａを、図３に示されるように、シートの基板とは反対側の面に４５°の角度で押し当ててシートを５ｍｍだけ押し上げ、その押し上げ位置において、切断線に垂直な方向に１０往復させた。これを、基板の切断線の２方向について実施することにより、基板および切片に力を加えて曲げ変形させ、切片を切断線に沿って切断した。
　次に、両方のサンプルＡ，Ｂに対して伸展工程を行った。具体的には、直径４ｃｍの平坦な円形のステージを基板とは反対側からシートに押し当て、シートを、その自然状態から１．１５倍にまで表面方向に伸展させた。伸展後、シートにグリップリングを取り付け、シートを伸展状態に固定した。次に、サンプルＡ，Ｂを撮影して画像を取得した。図６は、サンプルＡ（ブレーキング工程有り）の画像、図７は、サンプルＢ（ブレーキング工程無し）の画像である。
　各チップは、４個の他のチップと隣接しており、４個の境界を有している。本実施例のサンプルＡ，Ｂにおいて、切片が載置されている領域のうち切断すべき境界は、合計で４７８個であった。これら４７８個の境界のうち、切断されていた境界の数を計測した。具体的には、例えば、２個のチップが分解せずにつながっている場合は、１個の境界が切断されていないと判断し、４個のチップが分解せずにつながっている場合は、４個の境界が切断されていないと判断した。
　計測の結果、ブレーキング工程を実施したサンプルＡについては、４７８個全ての境界で切片が切断されていた。一方、ブレーキング工程を省いたサンプルＢについては、２２個の未切断の境界が存在した。図７において四角で囲まれている部分は、分離していなかったチップを示している。以上の結果から、ブレーキング工程を実施することによって、従来の方法では切断することができなかった部分も確実に切断可能であることが確認された。
（実施例２）
　次に、ブレーキング工程を、染色工程の前に行った場合と後に行なった場合とで、切片の切断位置の精度を比較した。
　まず、実施例１と同様の手順でサンプルＣ，Ｄを準備した。本実施例においても、同一のブタ大腸の互いに近接した位置から切り出した２つの切片をサンプルＣ，Ｄに使用した。
　次に、準備した２つのサンプルＣ，ＤのうちサンプルＤのみに対して、パラフィンを除去する包埋剤除去工程と、トルイジンブルーによる染色工程とを行った。具体的には、斜めに立て掛けた切片にピペットを用いて１回当たり３００μＬのレモゾール（和光純薬製）を１分間に１０回かけることによって脱パラフィンを行った。次に、同様にして切片に１回当たり３００μＬの９５％エタノールを１０回かけることによって、レモゾールをエタノールに置換した。次に、０．０５％トルイジンブルー水溶液を切片上に載せて３０秒間静置した後、切片を水で１分間洗浄して乾燥させた。
　次に、両方のサンプルＣ，Ｄに対して、ブレーキング工程と伸展工程とを行った。ブレーキング工程および伸展工程の手順は、実施例１において説明したブレーキング工程および伸展工程と同じである。伸展工程の後、シートにグリップリングを取り付けてシートを伸展状態に固定した。
　次に、サンプルＣのみに対して、包埋剤除去工程と染色工程とを行った。このときの包埋剤除去工程および染色工程の手順は、サンプルＤに対して行ったそれらと同じである。
　次に、サンプルＣ，Ｄを撮影して画像を取得した。図８は、サンプルＣ（染色工程の前にブレーキング工程）の画像、図９は、サンプルＤ（染色工程の後にブレーキング工程）の画像である。
　切片には、粘膜、粘膜下層、固有筋層、漿膜、リンパ小節が含まれる。図８のサンプルＣにおいては、切片内のいずれの組織構造を有する部分も、チップの輪郭に沿って切断されていた。一方、図９のサンプルＤにおいては、矢印で示されるように、特に筋層および粘膜層の一部分が、基板の表面から剥がれてチップの輪郭からずれた位置で切断されていた。これは、脱パラフィンを行ったことで切片の基板表面に対する接着力が弱まって基板から剥がれやすい状態になり、ブレーキング工程において剥がれたものと考えられる。
　次に、ＵＶ光源（エヌエスライティング（株）製　ＵＬＥＤＮ－１０２ＣＴ）を用いてシートに紫外線を照射し、シートの粘着力を弱めた。次に、直径０．５ｍｍの針を用いて、チップの裏側をシートを介して突き、チップをシートから剥離および採取した。このときに、採取対象のチップを実体顕微鏡（オリンパス（株）製　ＳＺＸ－７）を用いて観察すると、図１０に示されるように、採取されたチップに隣接していた他のチップにおいて切片の剥がれは確認されず、所望のチップに対応する領域のみを切片から採取することができたことが確認された。
　以上の結果から、パラフィン包埋切片を０．５ｍｍのピッチで分割して採取するときに、包埋剤除去工程と染色工程とをブレーキング工程よりも後に行うことによって、切片を切断線に正確に沿って切断可能であることが確認された。
（実施例３）
　次に、包埋剤除去工程を、ブレーキング工程の前に行った場合と伸展工程の後に行った場合とで、切片の切断位置の精度を比較した。
　本実施例においては、パラフィン包埋切片に代えて新鮮凍結切片を使用したことを除き、実施例１，２と同じ材料を用いてサンプルＥ，Ｆを準備した。基板に貼り付けた切片は、ドライヤーで室温の風を５分間当てて乾燥させることにより、基板の表面に強固に固着させた。
　次に、準備した２つのサンプルＥ，Ｆのうち一方のサンプルＦのみに対し、包埋剤除去工程を行った。具体的には、切片上に４００μＬのＰＢＳを滴下して２分間静置し、その後にＰＢＳを除去し、切片を１晩乾燥させた。
　次に、両方のサンプルＥ，Ｆに対して、ブレーキング工程および伸展工程を行った。ブレーキング工程および伸展工程の手順は、実施例１において説明したブレーキング工程および伸展工程と同じである。ここで、ブレーキング工程と伸展工程との間でサンプルＥ，Ｆを撮影して画像を取得した。伸展工程の後、シートにグリップリングを取り付けてシートを伸展状態に固定した。
　次に、サンプルＥのみに対して、包埋剤除去工程を行った。このときの包埋剤除去工程の手順は、サンプルＦに対して行ったそれと同じである。
　次に、サンプルＥ，Ｆを撮影して画像を取得した。
　図１１および図１２は、サンプルＥ（伸展工程の後に包埋剤除去工程）の画像であり、伸展工程前と包埋剤除去工程後にそれぞれ撮影したものである。図１３および図１４は、サンプルＦ（ブレーキング工程の前に包埋剤除去工程）の画像であり、伸展工程前と伸展工程後にそれぞれ撮影したものである。
　図１２のサンプルＥにおいて、切片は、チップの輪郭に沿って切断されており、切片の基板からの剥がれも確認されなかった。一方、図１４のサンプルＦにおいて、切片がチップの輪郭に沿って切断されずに基板の表面から剥がれている個所が多数認められた。
　以上の結果から、凍結切片に関しても、包埋剤除去工程の後にブレーキング工程を行った場合には、切片が基板の表面から剥がれて切断線に正確に沿って切断することができないのに対し、包埋剤除去工程の前にブレーキング工程を行った場合には、切片が基板の表面から剥がれることがなく切断線に正確に沿って切断することができることが確認された。
（実施例４）
　次に、ブレーキング工程と伸展工程との間で包埋剤除去工程を行った場合の、切片の切断位置の精度を評価した。
　まず、実施例１，２と同様の手順で、パラフィン包埋切片を使用したサンプルＧを準備した。また、実施例３と同様の手順で、凍結切片を使用したサンプルＨを準備した。
　次に、両方のサンプルＧ，Ｈに対して、実施例１のブレーキング工程と同じ手順でブレーキング工程を行った。次に、サンプルＧのみに対して、実施例２で説明した手順で包埋剤除去工程および染色工程を行った。一方、サンプルＨのみに対して、実施例３で説明した手順で包埋剤除去工程を行った。
　次に、両方のサンプルＧ，Ｈに対して伸展工程を行い、シートを伸展状態に固定し、サンプルＧ，Ｈを撮影して画像を取得した。
　図１５は、サンプルＧ（パラフィン包埋切片）の画像、図１６は、サンプルＨ（凍結切片）の画像である。
　図１５および図１６のいずれにおいても、切片はチップの輪郭に沿って切断され、基板の表面からの剥がれは認められなかった。
１　切片
１ａ　断片
２　シート
３　基板
３ａ　チップ
４　切断線
５　ブレーキング部材
５ａ　エッジ
Ｓ１　貼付工程
Ｓ２　ブレーキング工程
Ｓ３　伸展工程
Ｓ４　包埋剤除去工程
Ｓ５　染色工程
Ｓ６　採取工程

Claims (3)

  1. 　生体組織から切り出した切片を複数の断片に分割し、一部の断片を採取する細胞分取方法であって、
    　その表面方向の引張力によって所定の切断線で複数のチップに分解可能に構成された基板の表面に、前記切片を貼り付ける貼付工程と、
    　前記基板と該基板上の前記切片とを前記所定の切断線に沿って曲げ変形させて前記切片を切断するブレーキング工程と、
    　該ブレーキング工程の後に前記基板に前記表面方向の引張力を与えて前記基板を前記切断線の位置で分解し前記チップ同士を互いに離間させる伸展工程と、
    　該伸展工程によって分解された前記複数のチップのうち少なくとも１つを採取する採取工程とを含む細胞分取方法。
  2. 　前記ブレーキング工程と前記伸展工程との間に、前記切片を染色する染色工程を含む請求項１に記載の細胞分取方法。
  3. 　前記伸展工程と前記採取工程との間に、前記切片を染色する染色工程を含む請求項１に記載の細胞分取方法。
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