WO2015092104A1 - Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta - Google Patents

Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta Download PDF

Info

Publication number
WO2015092104A1
WO2015092104A1 PCT/ES2014/070930 ES2014070930W WO2015092104A1 WO 2015092104 A1 WO2015092104 A1 WO 2015092104A1 ES 2014070930 W ES2014070930 W ES 2014070930W WO 2015092104 A1 WO2015092104 A1 WO 2015092104A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plant
microorganism
cect
plants
seeds
Prior art date
Application number
PCT/ES2014/070930
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Diana RAMÍREZ ZAPATA
María Soledad SACRISTÁN BENAYAS
Evelin Elizeth Cueva Gonzalez
Angela Alonso Gonzalez
Marise BORJA Y TOME
Diego ANTÓN RODRÍGUEZ
Rosa María PÉREZ JIMÉNEZ
Original Assignee
Universidad Politécnica de Madrid
Plant Response Biotech Sl
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universidad Politécnica de Madrid, Plant Response Biotech Sl filed Critical Universidad Politécnica de Madrid
Priority to US15/104,138 priority Critical patent/US10201164B2/en
Priority to ES14835701T priority patent/ES2776162T3/es
Priority to MX2016008017A priority patent/MX2016008017A/es
Priority to CA2934162A priority patent/CA2934162C/en
Priority to EP14835701.5A priority patent/EP3085233B1/en
Priority to BR112016014334A priority patent/BR112016014334B8/pt
Priority to AU2014369737A priority patent/AU2014369737B2/en
Priority to PL14835701T priority patent/PL3085233T3/pl
Publication of WO2015092104A1 publication Critical patent/WO2015092104A1/es
Priority to AU2018274842A priority patent/AU2018274842B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the field of the present invention is the agronomic sector, in particular methods for increasing the production of flowers, seeds and / or fruits using the microorganism Colletotrichum tofieldiae.
  • the genus Colletotrichum (Ascomyceto, Teleomorpho Glomerella) comprises more than 60 species and species complexes. Morphologically it is characterized by having typically acervular conidiomas, which can carry sows or not, with unicellular hyaline conidia that can be straight or curved, of a size preferably larger than 12 ⁇ , typically granulated. Conidia can also be formed from mycelium or other conidia (microcyclic conidia). Conidia when germinating form apronic. Some species form stroma or sclerotia.
  • the Colletotrichum genus includes species that are important crop pathogens and, therefore, are the best known and best studied species. However, within the genus there are many species that have been cited as endophytes or epiphytes that do not cause any damage to the host plant (called diners) or that may even be beneficial to the plant (mutualists). In Hyde et al. (Fungal Diversity 39 (2009) 147-182) an exhaustive description is made of all the species of the genus Colletotrichum currently known, with the list of hosts of these species cited in the literature and specifying the type of interactions established with each host (pathogenic , commensal or mutual). The evidence cited in this publication indicates that, within species or complexes of species considered as pathogenic, asymptomatic strains may exist. There are even cases of strains that can behave as pathogens,
  • REPLACEMENT SHEET (RULE 26) diners or mutualists depending on the host in which they are inoculated.
  • An example of this case is C. orbiculare, which behaves as a pathogen in cucurbitaceae but can behave as a mutualist in tomatoes, conferring resistance to pathogens and drought and promoting the vegetative growth of the plant when inoculated by the root.
  • a preferred embodiment of the present invention is a method for increasing the production of flowers, seeds and / or fruits in a plant, characterized in that it comprises the step of contacting said plant with a composition comprising the microorganism Colletotrichum tofieldiae and / or extracts of said microorganism and / or filtered of said microorganism, hereinafter method of the invention.
  • microorganism of the invention refers to the microorganism of the species Colletotrichum tofieldiae.
  • the species Colletotricum tofieldiae is described in Damm et al. (Fungal Diversity 39 (2009) 45-87). This species is characterized by curved conidia and acévulos with bristles that can be brown or black. Conidia and sows can form directly on hyphae. The spores germinate forming apronons of varied morphology and coloration.
  • the species definition is also due to molecular characteristics with respect to sequences of the 5.8S subunit of the ribosome with the two spacing flanking regions (STIs), a 200-bp intron of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) gene ), a partial sequence of the actin gene (ACT), the chitin synthase 1 gene (CHS-1), the beta-tubulin gene (Tub2) and the histone 3 gene (HIS3).
  • the type isolates used to describe the species C. tofieldiae come from Tofieldia spp. (monocot), Lupinus polyphyllus and Dianthus sp.
  • C. tofieldiae has not been cited as a pathogen or mutualist of any host.
  • new isolates of Colletotr ⁇ chum tofieldiae have been isolated, identified and characterized that surprisingly have the ability to significantly increase the production of flowers, seeds and / or fruits in plants. Isolated from other species of fungi in the same area did not have this capacity.
  • the plants increase the production of flowers, seeds and / or fruits as a result of the contact of any part of the plant with the microorganism Colletotr ⁇ chum tofieldiae to establish a lasting relationship that induces the increase in production identified.
  • the C. tofieldiae microorganism translocates or disperses to the different organs of the treated plant, and can remain there for at least four months after treatment.
  • This characteristic means that the effect of the microorganism on the plant can be more lasting, prolonging during the cycle of the plant and improving the yield at the end of it.
  • This feature makes this microorganism more effective than other microorganisms used for similar purposes.
  • the method of the invention improves the production of flowers, fruits and seeds in a greater proportion than the increase in the vegetative growth of the plant. That is, the plant uses resources more efficiently, producing more and / or greater flowers, fruits and seeds in relation to the overall size of the plant.
  • the method of the invention produces an increase in the size and / or weight and / or number of flowers and / or fruits and / or seeds that may also be due to the better health or viability of the crop (for example due to the reduction in the application of irrigation, fertilizers and / or pesticides, increase in systemic resistance or increase in resistance to herbicides) and / or increase in the germination of seeds and / or bio-control characteristics such as the decrease in diseases due to the decrease in the sensitivity to pathogens and / or the improvement of previous infections.
  • An increase in the overall yield preferably indicates an increase in the yield of the harvested parts of the plant.
  • the increase in yield can be, for example, any type of increase such as the number of harvestable parts has increased and / or increased in weight and / or increased content of storage substances, interesting metabolites etc.
  • An increase in plant yield means that the harvested parts of the plant are at least 2%, preferably at least 25%, more preferably 70% and particularly preferred at least 500% higher when the plant is contacted with the composition comprising spores, mycelium and / or any other part of the microorganism of the invention, the culture medium or the filtrate according to the invention compared to untreated plants
  • An increase in quality preferably indicates an improvement in the desirable qualities of a plant. This increase in quality may differ from plant to plant. With respect to ornamental plants, for example, Petunia, an increase in quality can mean an increase in the number of flowers or leaves. Regarding cereals, an increase in quality can mean an increase in the amount of protein or starch content in the seeds or a desired alteration in the structure or composition of storage substances.
  • a plant is contacted with a composition comprising the microorganism Colletotrichum tofieldiae, the culture medium or the filtrate according to the invention.
  • the composition can be applied in the whole plant or in any of its parts, such as in the leaves, in the buds, in the flowers, in the fruits, in the ears, in seeds, in bulbs, in tubers, in roots and in seedlings.
  • the application of the composition to the plant can be done at any stage, and as an example it can be applied to the seed before sowing, during sowing, after sowing, and before or after the emergency, during the vegetative period , such as during seedling, or at the time of seedling transplantation, or at the time of cutting or rooting of cuttings, or at the time of growth in a plantation, or even in the reproductive period before flowering or during flowering or during the fruit ripening process. Therefore, another embodiment is the method of the invention, wherein said composition is applied to the seeds of said plant. Another embodiment is the method of the invention, wherein said composition is applied to the aerial parts of said plant. Another embodiment is the method of the invention, wherein said composition is applied to the roots of said plant or to other underground parts of said plant.
  • the method of the invention includes spray treatment or spraying on whole plants or any part thereof of a suitable dilution of the composition according to the invention, or immersion of whole plants or any part thereof in said dilution.
  • the method of the invention also includes the dry dusting treatment of whole plants or any of their parts of a composition according to the invention.
  • the method of the invention includes pelleting, or coating seeds with a thin film of a composition according to the invention.
  • the composition according to the invention can also be mixed with the irrigation liquid.
  • the method of the invention also includes the treatment by fragments of mycelium agar that comes into contact with a part of the plant, be it root, stem or leaves or even on the surface of the earth near the roots of the crop.
  • filtering means a liquid culture medium obtained from the culture of the microorganism of the invention. It is possible to obtain a liquid culture medium, free or essentially free of the microorganism of the invention.
  • This culture medium can be prepared first by culturing the microorganism of the invention in a liquid culture medium and then separating the liquid culture medium from the microorganism of the invention. The separation can be carried out by different methods known to the person skilled in the art, for example, by centrifugation or filtration. It is possible, for example, to heat the medium with the microorganism of the invention twice to about 80 ° C for 30 min and then remove the fungal material by centrifugation.
  • the filtrate is obtained by filtration of the culture medium through a filter with a pore size of not more than 2 ⁇ , preferably through a filter with a pore size of no more than 0.2 ⁇ .
  • the filtration step allows the extraction of essentially all the hyphae of the microorganism of the invention, more preferably the filtration would also eliminate the spores and even more preferably this should eliminate all types of fungal material.
  • the present invention also relates to plants that, according to the method of the invention, have been contacted with a composition comprising the microorganism Colletotrichum tofieldiae and / or extracts of said microorganism and / or filtrates of said microorganism, and products produced from harvested parts of these plants.
  • microorganism is a strain of Colletotrichum tofieldiae deposited with the deposit number CECT 20833, CECT 20834, CECT 20835 or CECT 20836.
  • the microorganism of the invention can be grown on a wide variety of natural or synthetic substrates.
  • it can be grown in different types of solid or liquid culture media, such as Potato Dextrose / Agar (PDA) or Broth (PDB) medium, and can be propagated by techniques per se known to experts. It can also grow on various natural sources, such as leaves of various plants, pollen grains, oatmeal, potatoes, carrots and cellulose. It can also grow on artificial sources such as paper or cardboard and polymers.
  • the culture medium can be constantly agitated during cultivation, for example with approximately 1 rps.
  • the culture temperature can be in the range between 20 and 30 ° C.
  • Another embodiment is the method of the invention, wherein said microorganism is in the form of spores, hyphae, mycelium or sclerotia.
  • Another embodiment is the method of the invention, wherein said composition is applied to the substrate for the cultivation of said plant.
  • the substrate is preferably treated so that the microorganism of the invention is cultured therein before the substrate is used for plant cultivation.
  • substrate treatment include perfusion of a liquid to the substrate (by irrigation, injection or drip), spraying, dusting or direct mixing with the substrate.
  • the method of the invention also comprises the treatment of a hydroponic medium, for hydroponics cultivation.
  • the method of the invention comprises treating the substrate or hydroponic medium with a composition comprising the appropriate concentration of mycelium and / or spores and / or any other part of the microorganism of the invention, the culture medium or the filtrate according to the invention in liquid form and / or in solid form as granulate or powder.
  • the method of the invention can be performed with a composition that includes the microorganism of the invention alone or formulated with inert ingredients.
  • inert ingredients include fine powders or granules such as minerals, such as clays, bentonite, calcite, diatoms and organic materials such as corn powder or nut skin powder, synthetic organic materials such as urea, salts such as calcium carbonate and ammonium sulfate, synthetic materials inorganic as silicone oxide; or liquid diluents such as aromatic hydrocarbons such as xylene, alkyl benzene, methyl naphthalene, alcohols such as 2-5 propanol, ethylene glycol, propylene glycol, and monoethyl ethylene glycol ether, ketones such as acetone, cyclohexanone and isophorone, vegetable oils such as soybean or cottonseed oil, petroleum-derived aliphatic hydrocarbons, esters, dimethyl sulfoxide, acetonitrile and water.
  • surfactants include anionic surfactants such as alkyl sulfate ester salts, alkaryl sulphonate salts, dialkyl sufosuccinate salts, polyoxyethylene alkaryl phosphate ether ester salts, lignosulfonate salts and formaldehyde polycondensates, and nonionic surfactants such as ethers of alkyl aryl polyoxyethylene, copolymer blocks of alkylpolyoxypropylene, polyoxyethylene and fatty acid esters, and cationic surfactants such as alkyl trimethylammonium salts.
  • anionic surfactants such as alkyl sulfate ester salts, alkaryl sulphonate salts, dialkyl sufosuccinate salts, polyoxyethylene alkaryl phosphate ether ester salts, lignosulfonate salts and formaldehyde polycondensates
  • nonionic surfactants such as ethers of alkyl aryl
  • auxiliary formulation agents examples include water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol or polyvinyl pyrrolidone, polysaccharides such as agar, gum arabic, alginic acid and its salts, carboxy methyl cellulose, xanthan gum, inorganic materials such as silicate. aluminum and magnesium, preservatives, coloring agents, stabilizing agents such as isopropyl phosphate acid and BHT.
  • water-soluble polymers such as polyvinyl alcohol or polyvinyl pyrrolidone
  • polysaccharides such as agar, gum arabic, alginic acid and its salts, carboxy methyl cellulose, xanthan gum
  • inorganic materials such as silicate.
  • preservatives coloring agents
  • stabilizing agents such as isopropyl phosphate acid and BHT.
  • compositions comprises minerals, organic materials, organic compounds, inorganic compounds, liquid diluents, alcohols, ketones, vegetable oils, aliphatic hydrocarbons, esters, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, water, surfactants anionic surfactants nonionic, cationic surfactants, water-soluble polymers, polysaccharides, preservatives, coloring agents, and / or stabilizing agents.
  • said minerals are selected from the group consisting of clays, bentonite, calcite and diatoms
  • said organic materials are selected from the group consisting of corn powder or walnut skin powder
  • said organic compound is urea
  • said inorganic compounds are selected from the group consisting of calcium carbonate, ammonium sulfate, silicone oxide, aluminum magnesium silicate
  • said liquid diluents are selected from the group consisting of aromatic hydrocarbons, aliphatic hydrocarbons, alcohols, ketones, vegetable oils, asters, dimethyl sulfoxide, acetonitrile and water
  • said anionic surfactants are selected from the group consisting of alkyl sulfate ester salts, aikilaryl sulphonate salts, diaikyl sulphosuccinate salts, polyoxyethylene aikylaryl ether phosphate ester salts, lignosulfonate salts and formaldehyde polycondensates
  • said nonionic surfactants they are
  • said aromatic hydrocarbons are selected from the group consisting of xylene, alkylene benzene, methyl naphthalene
  • said alcohols are selected from the group consisting of 2-5 propanol, ethylene glycol, propylene glycol and mono ethyl ethylene glycol ether
  • said ketones are selected from A group consisting of acetone, ciciohexanone and isophorone and said vegetable oils are soybean oil or cottonseed oil.
  • compositions comprises fertigation salts, fertilizers, insecticides, nematocides, fungicides, bactericides and / or herbicides.
  • composition is a liquid, a solid, a paste or a gel.
  • composition is a powder, tablet, tablet, granulate or emulsifiable concentrate.
  • composition is applied by spray, spray, immersion, irrigation or sprinkling.
  • plant is selected from the group consisting of gymnosperms, monocotyledons and dicotyledons.
  • said plant is a plant of the Brassicaceae family.
  • Another embodiment is the method of the invention, wherein said plant is a monocot plant.
  • Another embodiment is the method of the invention, wherein said plant is a barley plant (Hordeum vulgare).
  • Another embodiment is the method of the invention, wherein said plant is a corn plant (Zea mays).
  • the plant can be a natural or transgenic plant.
  • the method of the invention can be performed with all possible plants and cells or tissues derived from such plants.
  • they can be carried out with all Gymnosperms and Angiosperms (monocotyledonous or dicotyledonous) or plant material derived from such plants, including trees, shrubs, grasses and grasses.
  • the uses and processes are applied for use in useful plants or materials or cells of such plants, more preferably for agriculture, horticulture, forestry, ornamental plants, or any other commercial interest.
  • Another embodiment of the invention is a plant propagation material comprising the microorganism Colletotr ⁇ chum tofieldiae and / or extracts of said microorganism and / or filtrates of said microorganism.
  • said propagation material is selected from the group consisting of seeds, seedlings, young plants, cuttings, bulbs and tubers.
  • propagation material is understood as any type of cellular material from which a plant can germinate or develop.
  • propagation material include, but are not limited to: seeds, cuttings, cell suspensions, callus culture, tissue culture, protoorms, explants or germplasm.
  • the propagation material may have a different origin. For example, it may be freshly collected, or derived from a stock, such as a seed sample or a frozen cell stock.
  • Another embodiment of the invention is a substrate for the cultivation of plants comprising the microorganism Colletotrichum tofieldiae and / or extracts of said microorganism and / or filtrates of said microorganism.
  • the substrate for plant cultivation may comprise the spore, mycelium or any other part of the microorganism of the invention or the culture or filtration medium thereof or any of the possible combinations of some of these components.
  • the substrate can be liquid or solid.
  • substrates for plant cultivation are solidified natural or synthetic media and for plant cultivation, especially in vitro.
  • Other examples are earth, sand, humus or peat or mixtures of these.
  • Another embodiment of the invention is a strain of the microorganism Colletotrichum tofieldiae, deposited with the deposit number CECT 20833, CECT 20834, CECT 20835 and CECT 20836.
  • Another embodiment of the invention is the use of the Colletotrichum tofieldiae microorganism and / or extracts of said microorganism and / or filtrates of said microorganism to increase the production of flowers, seeds and / or fruits in a plant
  • Another embodiment of the invention is the use of the Colletotrichum tofieldiae microorganism and / or extracts of said microorganism and / or filtering means of said microorganism to increase the production of chlorophyll in a plant.
  • Another embodiment of the invention is the use of the Colletotrichum tofieldiae microorganism and / or extracts of said microorganism and / or filtration means of said microorganism to increase the production of flowers, seeds and / or fruits in a plant that is subject to drought conditions. or limited irrigation.
  • Another embodiment of the invention are the primers identified by the sequences SEQ ID NO: 1 and 2.
  • FIG. 1 Re-isolation of C. tofieldiae from non-inoculated organs of A. thaliana plants at 60 days post inoculation.
  • A. Isolated CECT 20834 reisolated from leaf (circle) and stems (arrows).
  • Example 1 Screening of fungi that increase plant productivity
  • Arabidopsis thaliana plants were collected growing under natural conditions. These plants lacked disease symptoms such as chlorosis, leaf spots and other types of pathogen-induced lesions. Fragments of the rosette leaves of the collected plants were disinfected by soaking them in 20% commercial bleach (1% active chlorine) and stirring gently for 5 minutes. The fragments were then rinsed twice in sterile water and placed in a humid chamber at room temperature (20-24 e C).
  • the fragments were periodically inspected, isolating the emerging mycelium in petri dishes with half a potato dextrose agar (PDA) with 200 mg / L chloramphenicol.
  • screening was performed to find fungi that were beneficial in producing an increase in seed production in the plant (Table 1).
  • Arabidopsis thaliana accession Col-0 superficially sterilized seeds were sown in sterile substrate (peat and vermiculite in 3: 1 ratio). They were stratified at 4 e C for 3 days and then kept in a controlled growth chamber at 23 e C. The plants were treated at 3 weeks of age (with 4-6 leaves) by applying a piece of mycelium from any of the isolates.
  • the mycelium had been obtained by subculturing the fungus mycelium, obtained from a plant of wild Arabidopsis thaliana without symptoms of disease, in PDA plates. No treatment was applied to the control plants and they were randomly placed among the treated plants. At the beginning of the dehiscence of leaf leaks, these were covered with paper bags to collect the seeds. When the plants dried, the seeds were collected and weighed. The rest of the aerial part of the plant was also weighed.
  • TREATMENT plant (mg) (mg) plant (mg) plant (mg)
  • Table 1 Weights (mean ⁇ standard error) of the seeds and dry weight of the rest of the plant of the plants treated or not with mycelium as described in Example 1. Different letters indicate significant differences between the treated plants and the control plants (P ⁇ 0.05) according to an ANOVA. Plants treated with isolate CECT 20833 of the genus Colletotrichum (in bold) had a significantly greater seed weight than control plants, while the dry weight of the rest of the plant was not significantly greater.
  • Example 2 Identification of isolates of Colletotrichum sp. of wild Arabidopsis thaliana plants such as Colletotrichum tofieldiae.
  • the CECT 20833 isolate of the Colletotrichum genus of the screening of Example 1 had a dark mycelium and conidial hyaline curves in dark-bristled fences.
  • Example 3 Colletotrichum tofieldiae isolates persisted in plants treated at least two months post inoculation and were translocated or dispersed to organs other than the inoculated leaf such as root, crown, other leaves and stems. Seeds of Arabidopsis thaliana accession Col-0 superficially sterilized were sown in sterile substrate (peat and vermiculite in 3: 1 ratio). They were stratified at 4 e C for 3 days and then kept in a controlled growth chamber at 23 e C, in a short cycle (10 hours a day of light).
  • the plants were treated at 3 weeks of age with isolates CECT 20833, CECT 20834 and CECT 20835 from Colletotrichum tofieldiae by applying three spores of a spore suspension drop at 10 6 spores / ml.
  • Whole plants were collected at 60 days post inoculation (dpi). Roots, rosette leaves and stems were separated and cut into fragments of approximately 25 mm 2 , disinfected as previously described and incubated in a humid chamber at room temperature.
  • Colletotr ⁇ chum tofieldiae was re-isolated from at least one sample of all inoculated plants.
  • the fungus was reisolated from different leaves of the inoculated, crown, roots and stem (Table 2, Figure 1). No growth of C. tofieldiae was observed in any of the control plants treated with distilled water.
  • Seeds of Arabidopsis thaliana accession Col-0 superficially sterilized were sown in sterile substrate (peat and vermiculite in 3: 1 ratio), stratified at 4 e C for 3 days and then kept in a controlled growth chamber at 23 e C.
  • the spores were obtained by re-suspending the spores obtained from the fungus culture in PDA medium in sterile distilled water.
  • the plants subjected to each of the treatments were arranged randomly. At the beginning of the dehiscence of leaf leaks, these were covered with paper bags to collect the seeds. When the plants dried, the seeds were collected and weighed. The rest of the aerial part of the plant was also weighed.
  • Seed production per plant was measured as the weight of all seeds harvested from each plant at the end of the cycle. Seed production of plants treated with CECT 20834 was significantly higher than that of control plants (P ⁇ 0.001), with a 37% weight increase for mycelium treated plants and 56% for plants treated with spray spore suspension (Table 2). The increase in seed production is due in part to the production of higher weight seeds, since the weight of 100 seeds of plants treated with CECT 20834 showed a significant increase (P ⁇ 0.06) of up to 42% compared to Control plants The dry weight of the rest of the plant was not significantly different (P> 0.10). The fungus was reisolated, at 6 weeks after treatment, 75% of the plants inoculated with mycelium and 100% of the plants inoculated with spray. This example demonstrates that the ability to increase seed production is not exclusive to CECT 20833 isolate, but can be extended to other C. tofieldiae isolates and that spore treatment gives similar results to mycelium treatment.
  • Example 5 CECT 20835 and CECT 20836 isolates of Colletotrichum tofieldiae increase seed production (weight of seed per plant) in plants treated with a spore suspension spray applied. The increase is proportional to the persistence of the fungus in the plant.
  • Seeds of Arabidopsis thaliana accession Col-0 superficially sterilized were sown in sterile substrate (peat and vermiculite in 3: 1 ratio), stratified at 4 e C for 3 days and then kept in a controlled growth chamber at 23 e C.
  • a at three weeks of age, they underwent any of the following treatments a) Application of a spore suspension of the CECT 20835 isolate of Colletotrichum sp; b) Application of a spore suspension of isolate CECT 20836 of Colletotrichum sp; c) Control treatment consisting of the application of sterile distilled water. All treatments were sprayed throughout the plant and the soil under it.
  • the inoculum of treatments a, b and c comes from spore suspensions maintained in 30% glycerol at -80 e C and diluted in sterile distilled water at a concentration of 10 6 spores / ml. After the application of the treatment, the plants were kept at 25 e C, short cycle. Two weeks after treatment, the fungus was reisolated from 17% of the plants inoculated with CECT 20835, from 20% of the plants inoculated with CECT 20836 and from no plant treated only with water. At six weeks after treatment, the fungus was reisolated from 60% of plants treated with CECT 20835 and none of the plants treated with CECT 20836 or only water. At the beginning of the dehiscence of leaf leaks, these were covered with paper bags to collect the seeds. When the plants dried, the seeds were collected and weighed. The rest of the aerial part of the plant was also weighed.
  • Seed production per plant was measured as the weight of all seeds harvested from each plant at the end of the cycle.
  • the ANOVA of the seed weights indicates significant differences in the average weight of seeds per plant between plants undergoing different treatments (P ⁇ 0.0001, Table 4): Plants treated with CECT 20835 had the highest average weight of seeds per plant , with an increase of 550% with respect to the plants treated with only water and the plants treated with CECT 20836 had an increase of the average weight of seeds of 400% with respect to the plants treated only with water. No significant differences were found in the weight of the seedless plant (P> 0.10). This example shows that the effect of applying Colletotrichum tofieldiae can be proportional to the persistence of the fungus in the plant. Seed weight per dry weight of the plant without
  • Example 4 Weights (mean ⁇ standard error) of the seeds per plant and dry weight of the rest of the plant of the plants (seedless plant) treated as described in Example 5. * Different letters show significant differences according to ANOVA between the different treatments (P ⁇ 0.0001). The weight of the rest of the plant was not significantly different between the different treatments (P> 0.10). The increase in percentage, compared between plants treated with the different isolates and control plants, is indicated in parentheses.
  • Example 6 Colletotr ⁇ chum tofieldiae increased the number of fruits of plants treated with a spore suspension both in plants sown in sterile substrate and in plants sown in non-sterile substrate.
  • Seeds of Arabidopsis thaliana accession Col-0 superficially sterilized were sown in sterile and non-sterile substrate (peat and vermiculite in 3: 1 ratio). They were stratified at 4 e C for 3 days and then kept in a controlled growth chamber at 23 e C. At three weeks of age, they underwent any of the following treatments a) Application of a spore suspension of isolate CECT 20833 of C. tofieldiae; b) application of a spore suspension of CECT 20835 isolate of C. tofieldiae; c) application of sterile distilled water. All treatments were sprayed throughout the plant.
  • Inoculum treatments and b is from esporales suspensions maintained in 30% glycerol and at -80 C, washed and diluted in sterile distilled water at a concentration of 10 6 spores / ml. The plants were distributed randomly. The number of fruits per plant was counted at the time of the opening of the silicones. The results are shown in Table 5. Plants treated with isolates CECT 20833 and CECT 20835 of C. tofieldiae showed a significant increase in fruits of up to 39%. This experiment demonstrates that the increase in seed production is due in part to the production of higher Number of fruits per plant. This experiment demonstrates that the fungus effect is maintained in plants on a non-sterile substrate.
  • Example 5 Number of fruits (mean ⁇ standard error) per plant treated with a spore suspension of different C. tofieldiae isolates as described in Example 6. * Different letters indicate significant differences in an ANOVA (P ⁇ 0.08 for sterile substrate and P ⁇ 0.04 for the non-sterile substrate). The percentage increase, compared between treated and untreated plants, is indicated in parentheses.
  • Example 7 Colletotrichum tofieldiae increased the number of fruits of plants planted on substrates (sterile or non-sterile) treated with a spore suspension.
  • Seeds of Arabidopsis thaliana accession Col-0 superficially sterilized were sown in sterile and non-sterile substrate (peat and vermiculite in 3: 1 ratio). They were stratified at 4 e C for 3 days and then kept in a controlled growth chamber at 23 e C. When the plants were three weeks old they were deposited in the substrate, next to the plant, 200 ⁇ per plant a) a spore suspension of CECT 20833 isolate from C. tofieldiae; b) a spore suspension of CECT 20835 isolate from C. tofieldiae; c) sterile distilled water.
  • Inoculum treatments and b is from esporales suspensions maintained in 30% glycerol at -80 C and washed and diluted in sterile distilled water at a concentration of 10 6 spores / ml. The plants were distributed randomly. The number of fruits per plant was counted at the time of the opening of the silicones. The results are shown in Table 6. Plants treated with isolates CECT 20833 and CECT 20835 of C. tofieldiae have an increase in fruits of up to 27%.
  • Example 8 Colletotr ⁇ chum tofieldiae persisted in treated corn and rapeseed plants, at least 38 days post inoculation.
  • Corn seeds of the variety FAO700, and rapeseed seeds of the Westar variety superficially sterilized were sown in sterile substrate (peat and vermiculite in proportion 3: 1) and then kept in controlled growth chamber at 23 e C, in short cycle (10 hours a day of light).
  • the plants were treated at 3 weeks of age with CECT 20833 isolate of C. tofieldiae by spray application of 120 ml of a spore suspension at 10 6 spores / ml in the presence of 0.75% surfactant (alkyl polysaccharide).
  • the first and second sheets of seven plants were collected at 23 dpi, while the third and fourth sheets were collected at 38 dpi.
  • C. tofieldiae was re-isolated from at least 64.3% of the samples collected at 38 dps from seven inoculated corn plants and 7% of the samples collected from seven inoculated rapeseed plants (Table 7) . No growth of C. tofieldiae was observed in any of the control plants treated with distilled water.
  • Rapeseed 23 Sheet 1 7 100% 78.6%
  • Table 7 Number of corn or rapeseed leaves and percentage of which Colletotr ⁇ chum tofilediae was reisolated at 23 (first and second leaves) and at 38 days (third and fourth leaves) after treatment.
  • Example 9 Colletotr ⁇ chum tofieldiae can be inoculated by different methods in corn and barley, translocates from seeds and roots to leaves, and increases chlorophyll content.
  • Immersion treatment the seeds were inoculated by immersion for 2 h in a beaten mycelium suspension of the CECT 20833 isolate, grown in PDB for 10 days, at an optical density of 1.2 and seeded in a substrate mixed with peat and vermiculite in 3: 1 ratio
  • Peat treatment the seeds were sown in a substrate mixed with peat and vermiculite in a 3: 1 ratio to which a mixture of peat and bran (20 g / l substrate) was added which had been inoculated two weeks before with spores of the CECT 20833 insulated. A quantity of 1.5x10 4 spores / gram of peat and bran mixture
  • Spray treatment the seeds were seeded in a substrate mixture of peat and vermiculite in a 3: 1 ratio and at 3 weeks of age they were inoculated by spray application of 120 ml of a mycelium suspension of isolate CECT 20833, which had grown in PDB for 10 days, adjusted to an optical density of 1 .2, in the presence of 0.75% surfactant (alkyl polysaccharide). 5.
  • Irrigation treatment the seeds were seeded in a substrate mixture of peat and vermiculite in a 3: 1 ratio and inoculated by irrigation (5 ml) with a suspension of beaten mycelium of the isolate CECT 20833, which had grown in PDB for 10 days, adjusted to an optical density of 1 .2.
  • Peat control 32 0% 0% 0.15 ⁇ 0.02 a echoTurba 32 80% 10% 0.25 ⁇ 0.02 b
  • Spray control 32 0% 0% 0.42 ⁇ 0.02 a
  • Irrigation control 32 0% 0% 0.17 ⁇ 0.02 a
  • Example 10 Colletotr ⁇ chum tofieldiae can be inoculated as much as conidia as mycelium both in the substrate and in corn spray. It moves from the root to the leaves and vice versa, increasing the chlorophyll content.
  • Peat-mycelium treatment the seeds were sown on a peat substrate: vermiculite (3: 1) plus peat and bran mixture (20 g / l) inoculated with a beaten mycelium suspension of isolate CECT 20833 as described in example 9 .
  • Peat-spore treatment the seeds were sown in a peat substrate: vermiculite (3: 1) plus a peat and bran mixture (20 g / l) inoculated two weeks before with a spore suspension at 10 6 spores / ml of the CECT 20833 isolated.
  • Spray-spore treatment the seeds were sown in a peat substrate: vermiculite (3: 1) and the plants were inoculated at 3 weeks of age with the isolate CECT 20833 of C. tofieldiae by spray application of 120 ml of a spore suspension at 10 6 spores / ml in the presence of 0.5% surfactant (alkyl polysaccharide).
  • Spray-mycelium treatment the seeds were sown in a peat substrate: vermiculite (3: 1) and the plants were inoculated at 3 weeks of age with the isolate CECT 20833 of C. tofieldiae by spray application of 120 ml of a mycelium suspension at an optical density of 1.5 in the presence of 0.5% surfactant (alkyl polysaccharide).
  • Mycelium spray control 54 0% 0% 60 3.97 ⁇ 0.13 a
  • Example 1 1 Colletotr ⁇ chum tofieldiae increased the number of grains per ear and the weight per ear in corn plants treated with isolate CECT 20833 under conditions of normal irrigation and limited irrigation.
  • Corn seeds of the washed FAO700 variety were inoculated by immersion for 16 h in a spore suspension at 10 6 spores / ml, seeded in substrate (peat and vermiculite in 3: 1 ratio) and kept in a controlled growth chamber at 23 e C.
  • substrate peat and vermiculite in 3: 1 ratio
  • Control plants and plants inoculated with C. tofieldiae were planted in random blocks within each row. After a month with normal irrigation (100% water) two of the rows were subjected to a limited irrigation with 30% of the irrigation with respect to the control plants.
  • Example 12 Colletotrichum tofieldiae, by colonizing the plants, produces an increase in the number of grains per ear and the weight of the ears per corn plant treated with the isolate CECT 20833.
  • Corn seeds of the FAO700 washed variety were sown in the soil in four rows separated by 70 cm and with a distance of 25 cm between plants and plants within each row.
  • For inoculation with C. tofieldiae 200 ml / seed of vermiculite peat mixture was deposited at the bottom of the planting groove at a concentration of 10 6 CFU / ml which had been inoculated two weeks earlier with spores with a concentration of 10 6 spores / ml of isolate CECT 20833.
  • Control plants and plants inoculated with C. tofieldiae were planted in random blocks within each row. At the end of the crop cycle, the number of grains per ear was counted.
  • RT PCR real-time PCR
  • Table 1 Average production (ear weight per plant (mean ⁇ standard error) and number of grains per plant (mean ⁇ standard error)) of germinated seed plants treated with a spore suspension of C. tofieldiae under normal irrigation conditions. The percentage increase compared between colonized and non-colonized plants is indicated in parentheses. Different letters indicate significant differences in an ANOVA (P ⁇ 0.05)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta, que comprende la etapa de poner en contacto dicha planta con una composición que comprende el microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo. Dicho microorganismo puede ser una cepa de Colletotrichum tofieldiae depositada con el número de depósito CECT 20833, CECT 20834, CECT 20835 o CECT 20836.

Description

METODO PARA INCREMENTAR LA PRODUCCION DE FLORES, SEMILLAS Y/O
FRUTOS EN UNA PLANTA
DESCRIPCION
CAMPO DE LA INVENCION
El campo de la presente invención es el sector agronómico, en particular métodos para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos utilizando el microorganismo Colletotrichum tofieldiae.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las plantas en la naturaleza establecen asociaciones simbióticas con microorganismos llamados mututalistas que les confieren beneficios en su crecimiento, supervivencia y multiplicación. Estos microorganismos se pueden aislar, y utilizar sus propiedades beneficiosas en cultivos para mejorar su rendimiento.
El género Colletotrichum (Ascomyceto, teleomorpho Glomerella) comprende más de 60 especies y complejos de especies. Morfológicamente se caracteriza por tener conidiomas típicamente acervulares, que pueden llevar cerdas o no, con conidias unicelulares hialinas que pueden ser rectas o curvadas, de un tamaño preferentemente mayor de 12 μ, típicamente granuladas. Las conidias pueden formarse también a partir del micelio u otras conidias (conidias microcíclicas). Las conidias al germinar forman apresónos. Algunas especies forman estromas o esclerocios.
El género Colletotrichum comprende especies que son patógenos importantes de cultivos y que, por ello, son las especies más conocidas y mejor estudiadas. Sin embargo, dentro del género existen muchas especies que han sido citadas como endófitos o epífitos que no causan ningún daño a la planta huésped (llamadas comensales) o que incluso pueden ser beneficiosas para la planta (mutualistas). En Hyde y col. (Fungal Diversity 39 (2009) 147- 182) se hace una descripción exhaustiva de todas las especies del género Colletotrichum actualmente conocidas, con la lista de huéspedes de estas especies citados en la literatura y especificando el tipo de interacciones establecidas con cada huésped (patogénica, comensal o mutualista). La evidencia citada en esta publicación indica que, dentro de las especies o complejos de especies consideradas como patógenas, pueden existir cepas asintomáticas. Incluso se dan casos de cepas que se pueden comportar como patógenos,
HOJA DE REEMPLAZO (REGLA 26) comensales o mutualistas dependiendo del huésped en el que se inoculen. Un ejemplo de este caso es C. orbiculare, que se comporta como patógeno en cucurbitáceas pero se puede comportar como mutualista en tomate, confiriendo resistencia a patógenos y a sequía y promoviendo el crecimiento vegetativo de la planta cuando es inoculada por la raíz.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Una realización preferida de la presente invención es un método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta, caracterizado por que comprende la etapa de poner en contacto dicha planta con una composición que comprende el microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo, en adelante método de la invención.
De aquí en adelante el término "microorganismo de la invención" hace referencia al microorganismo de la especie Colletotrichum tofieldiae.
Se entiende por incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta tratada según el método de la invención como el aumento de número, tamaño y/o peso de flores, semillas y/o frutos de esa planta en relación con una planta que no haya sido tratada según el método de la invención.
La especie Colletotricum tofieldiae se describe en Damm y col. (Fungal Diversity 39 (2009) 45-87). Esta especie se caracteriza por tener conidias curvadas y acévulos con cerdas que pueden ser de color marrón o negro. Las conidias y las cerdas se pueden formar directamente sobre las hifas. Las esporas germinan formando apresónos de variada morfología y coloración. La definición de la especie también se debe a características moleculares con respecto a secuencias de la subunidad 5.8S del ribosoma con las dos regiones flanqueantes espaciadoras (ITS), un intrón de 200-bp del gen de la gliceraldehído- 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), una secuencia parcial del gen de la actina (ACT), el gen de la quitina sintasa 1 (CHS-1 ), el gen de la beta-tubulina (Tub2) y el gen de la histona 3 (HIS3). Los aislados tipo utilizados para describir la especie C. tofieldiae proceden de Tofieldia spp. (monocotiledónea), Lupinus polyphyllus y Dianthus sp. (ambas dicotiledóneas), por lo que esta especie es capaz de colonizar distintas especies de huéspedes tanto de mono como de dicotiledóneas. C. tofieldiae no ha sido citado como patógeno ni mutualista de ningún huésped. En la presente invención se han aislado, identificado y caracterizado unos nuevos aislados de Colletotríchum tofieldiae que sorprendentemente tienen la capacidad de aumentar significativamente la producción de flores, semillas y/o frutos en plantas. Aislados de otras especies de hongos de la misma zona no presentaban esta capacidad. Las plantas incrementan la producción de flores, semillas y/o frutos como consecuencia del contacto de cualquier parte de la planta con el microorganismo Colletotríchum tofieldiae para establecer una relación duradera que induce el incremento de producción identificado. En la presente invención se muestra que el microorganismo C. tofieldiae se trasloca o dispersa a los distintos órganos de la planta tratada, y puede permanecer en ella al menos cuatro meses tras el tratamiento. Esta característica hace que el efecto del microorganismo sobre la planta pueda ser más duradero, prolongándose durante el ciclo de la planta y mejorando el rendimiento al final del mismo. Esta característica hace que este microorganismo sea más efectivo que otros microorganismos utilizados para fines similares. El método de la invención mejora la producción de flores, frutos y semillas en una mayor proporción que el aumento del crecimiento vegetativo de la planta. Es decir, la planta utiliza los recursos de una manera más eficiente, produciendo más y/o mayores flores, frutos y semillas en relación con el tamaño global de la planta. Es la primera vez que se describe esta característica en las cepas de Colletotríchum tofieldiae de la invención. Se trata de un fenómeno general a la especie Colletotríchum tofieldiae porque se han obtenido efectos similares con distintas cepas de esta especie.
El método de la invención produce un aumento del tamaño y/o peso y/o número de flores y/o frutos y/o semillas que puede ser también debido a la mejor salud o viabilidad del cultivo (por ejemplo debida a la reducción en la aplicación de riego, abonos y/o pesticidas, aumento de la resistencia sistémica o aumento de la resistencia a herbicidas) y/o al aumento de la germinación de semillas y/o características de bio-control como la disminución de enfermedades por la disminución de la sensibilidad a patógenos y/o la mejora de infecciones previas.
El método de la invención produce al menos uno de los efectos siguientes:
- un aumento en el rendimiento global de la planta;
- un aumento en la calidad del material de la planta;
- un aumento del número y/o tamaño de flores
- un aumento del número, tamaño y/o peso de frutos - un aumento del número, tamaño, y/ o peso de semillas.
Un aumento en el rendimiento global indica preferiblemente un aumento en el rendimiento de las partes cosechables de la planta. El aumento en el rendimiento puede ser, por ejemplo, cualquier tipo de aumento como que el número de partes cosechables haya aumentado y/o aumento de su peso y/o aumento del contenido de sustancias de almacenamiento, metabolitos interesantes etc. Un aumento del rendimiento de las plantas significa que las partes cosechables de la planta son al menos un 2%, preferiblemente al menos un 25%, más preferiblemente un 70% y particularmente preferido al menos un 500% mayor cuando la planta se pone en contacto con la composición que comprende esporas, micelio y/o cualquier otra parte del microorganismo de la invención, el medio de cultivo o el filtrado de acuerdo a la invención en comparación con las plantas no tratadas
Un aumento en calidad preferiblemente indica una mejora de las cualidades deseables de una planta. Este aumento de la calidad puede diferir de planta a planta. Respecto a las plantas ornamentales, por ejemplo, Petunia, un aumento en la calidad puede significar un aumento en el número de flores u hojas. Respecto a los cereales un aumento de la calidad puede significar un aumento en la cantidad de proteínas o contenido de almidón en las semillas o una alteración deseada en la estructura o composición de sustancias de almacenamiento.
En el método de la invención, se pone en contacto una planta con una composición que comprende el microorganismo Colletotrichum tofieldiae, el medio de cultivo o el filtrado de acuerdo a la invención. La composición se puede aplicar en la totalidad de la planta o en cualquiera de sus partes, como en las hojas, en los brotes, en las flores, en los frutos, en las mazorcas, en semillas, en bulbos, en tubérculos, en raíces y en plántulas. La aplicación de la composición a la planta se puede realizar en cualquier estadio, y como ejemplo se puede aplicar a la semilla antes de la siembra, durante la siembra, después de la siembra, y antes o después de la emergencia, durante el periodo vegetativo, como durante el cultivo en semillero, o en el momento del transplante de las plántulas, o en el momento del esquejado o enraizado de esquejes, o en el momento de crecimiento en una plantación, o incluso en el periodo reproductivo antes de la floración o durante la floración o durante el proceso de maduración del fruto. Por tanto, otra realización es el método de la invención, donde dicha composición se aplica a las semillas de dicha planta. Otra realización es el método de la invención, donde dicha composición se aplica a las partes aéreas de dicha planta. Otra realización es el método de la invención, donde dicha composición se aplica a las raíces de dicha planta o a otras partes subterráneas de dicha planta.
El método de la invención incluye el tratamiento por spray o pulverización sobre plantas completas o cualquiera de sus partes de una dilución adecuada de la composición de acuerdo a la invención, o la inmersión de plantas completas o de cualquiera de sus partes en dicha dilución. El método de la invención también incluye el tratamiento por espolvoreado en seco de plantas completas o de cualquiera de sus partes de una composición de acuerdo a la invención. El método de la invención incluye el peleteado, o recubrimiento de semillas con una película fina de una composición de acuerdo a la invención. La composición de acuerdo a la invención también puede mezclarse con el líquido de irrigación. El método de la invención también incluye el tratamiento mediante fragmentos de agar con micelio que se pone en contacto con una parte de la planta, ya sea raíz, tallo u hojas o incluso sobre la superficie de la tierra cerca de las raíces del cultivo. En la presente memoria, se entiende por "filtrado" a un medio de cultivo líquido obtenido del cultivo del microorganismo de la invención. Es posible obtener un medio de cultivo líquido, libre o esencialmente libre del microorganismo de la invención. Este medio de cultivo puede ser preparado primero cultivando el microorganismo de la invención en un medio de cultivo líquido y después separando el medio de cultivo líquido del microorganismo de la invención. La separación puede ser llevada a cabo por diferentes métodos conocidos por la persona experta en la materia, por ejemplo, por centrifugación o filtración. Es posible, por ejemplo, calentar el medio con el microorganismo de la invención dos veces hasta alrededor de 80 °C durante 30 min y después eliminar el material fúngico por centrifugación. Preferiblemente, el filtrado se obtiene por filtración del medio de cultivo a través de un filtro con un tamaño de poro de no más de 2 μηι, preferiblemente a través de un filtro con un tamaño de poro de no más de 0,2 μηι. El paso de filtración permite la extracción de esencialmente todas las hifas del microorganismo de la invención, más preferiblemente la filtración también eliminaría las esporas e incluso más preferiblemente esto debería eliminar todo tipo de material fúngico. La presente invención también se refiere a las plantas que, según el método de la invención, se han puesto en contacto con una composición que comprende el microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo, y a los productos producidos a partir de las partes cosechadas de dichas plantas.
Otra realización es el método de la invención, donde dicho microorganismo es una cepa de Colletotrichum tofieldiae depositada con el número de depósito CECT 20833, CECT 20834, CECT 20835 o CECT 20836.
Las cepas de Colletotrichum tofieldiae han sido depositadas el 30/05/2013 (cepas con números de depósito CECT 20833, CECT 20834 y CECT 20835) y el 7/05/2013 (cepa con número de depósito CECT 20836) en la autoridad internacional de depósito Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) con dirección Pare Cientific Universitat de Valencia, Catedrático Agustín Escardino, 9. 46980, Paterna, (Valencia), España, por Universidad Politécnica de Madrid, con dirección en el Ramiro de Maeztu, 7, 28040 Madrid, España.
El microorganismo de la invención puede ser cultivado sobre una amplia variedad de sustratos naturales o sintéticos. Por ejemplo, puede ser cultivado en diferentes tipos de medios de cultivo sólidos o líquidos, tales como medio Patata Dextrosa/Agar (PDA) o Caldo (PDB), y puede ser propagada por técnicas per se conocidas por expertos. También puede crecer sobre varias fuentes naturales, tales como hojas de varias plantas, granos de polen, harina de avena, patata, zanahoria y celulosa. También puede crecer sobre fuentes artificiales como papel o cartón y polímeros.
El medio de cultivo puede ser constantemente agitado durante el cultivo, por ejemplo con aproximadamente 1 rps. Además, la temperatura de cultivo se puede situar en el rango entre 20 y 30 °C. Otra realización es el método de la invención, donde dicho microorganismo está en forma de esporas, hifas, micelio o esclerocios.
Otra realización es el método de la invención, donde dicha composición se aplica al sustrato para el cultivo de dicha planta. El sustrato es preferiblemente tratado de modo que el microorganismo de la invención se cultiva en él antes que el sustrato se use para el cultivo de plantas. Ejemplos de tratamiento del sustrato incluyen perfusión de un líquido al sustrato (por riego, inyección o goteo), pulverización, espolvoreo o mezcla directa con el sustrato. El método de la invención también comprende el tratamiento de un medio hidropónico, para el cultivo en hidroponía. El método de la invención comprende el tratamiento del sustrato o medio hidropónico con una composición que comprenda la concentración adecuada de micelio y/o esporas y/o cualquier otra parte del microorganismo de la invención, el medio de cultivo o el filtrado de acuerdo a la invención en forma líquida y/o en forma sólida como granulado o polvo.
El método de la invención puede realizarse con una composición que incluye el microorganismo de la invención solo o formulado con ingredientes inertes. Ejemplos de ingredientes inertes incluyen polvos finos o gránulos como minerales, como arcillas, bentonita, calcita, diatomeas y materiales orgánicos como polvo de maíz o polvo de piel de nuez, materiales orgánicos sintéticos como urea, sales como carbonato cálcico y sulfato amónico, materiales sintéticos inorgánicos como óxido de silicona; o diluyentes líquidos como hidrocarbonos aromáticos como xileno, alkil benceno, metil naftaleno, alcoholes como el 2-5 propanol, etilenglicol, glicol propileno, y éter mono etil etilen glicol, cetonas como la acetona, la ciclohexanona e isoforona, aceites vegetales como aceite de soja o aceite de algodón, hidrocarbonos alifáticos derivados del petróleo, ésteres, dimetil sulfóxido, acetonitrilo y agua. Ejemplos de surfactantes incluyen surfactantes aniónicos como sales de ésteres de alkil sulfato, sales de alkilaril sulfonato, sales de dialkil sufosuccinato, sales de ésteres de éter fosfato de alkilaril de polioxietileno, sales de lignosulfonato y policondensados de formaldehido, y surfactantes no iónicos como éteres de alkil aril polioxietileno, bloques de copolímeros de alkilpolioxipropileno, polioxietileno y ésteres de ácidos grasos, y surfactantes cationicos como sales de alkil trimetilamonio. Ejemplos de otros agentes de formulación auxiliares incluyen polímeros hidrosolubles como el alcohol de polivinilo o la polivinilpirrolidona, polisacáridos como el agar, la goma arábiga, el ácido alginico y sus sales, la carboxi metil celulosa, la goma xantano, materiales inorgánicos como el silicato de aluminio y magnesio, preservantes, agentes colorantes, agentes estabilizadores como el ácido isopropil fosfato y el BHT.
Por tanto, otra realización es el método de la invención, donde dicha composición comprende minerales, materiales orgánicos, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos, diluyentes líquidos, alcoholes, cetonas, aceites vegetales, hidrocarburos alifáticos, ésteres, dimetil sulfóxido, acetonitrilo, agua, surfactantes aniónicos, surfactantes no iónicos, surfactantes catiónicos, polímeros hidrosolubles, polisacáridos, preservantes, agentes colorantes, y/o agentes estabilizadores. De forma particular, dichos minerales están seleccionados del grupo compuesto por arcillas, bentonita, calcita y diatomeas, dichos materiales orgánicos están seleccionados del grupo compuesto por polvo de maíz o polvo de piel de nuez, dicho compuesto orgánico es urea, dichos compuestos inorgánicos están seleccionados del grupo compuesto por carbonato cálcico, sulfato amónico, óxido de silicona, silicato de aluminio y magnesio, dichos diluyentes líquidos están seleccionados del grupo compuesto por hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, alcoholes, cetonas, aceites vegetales, ásteres, dimetil sulfóxido, acetonitrilo y agua, dichos surfactantes aniónicos están seleccionados del grupo compuesto por sales de ásteres de alkil sulfato, sales de aikilaril sulfonato, sales de diaikil sulfosuccinato, sales de ásteres de éter fosfato de aikilaril de polioxietileno, sales de lignosulfonato y policondensados de formaldehido, dichos surfactantes no iónicos están seleccionados del grupo compuesto por éteres de alkil aril polioxietileno, bloques de copolímeros de alkilpolioxipropileno, polioxietileno y ásteres de ácidos grasos, dichos surfactantes catiónicos son sales de alkil trimetilamonio, dichos polímeros hidrosolubles son alcohol de polivinilo o polivinilpirrolidona, dichos polisacáridos están seleccionados del grupo compuesto por agar, goma arábiga, ácido alginico, sales de ácido alginico, carboxi metil celulosa y goma xantano y dichos agentes estabilizadores son ácido isopropil fosfato o BHT. De forma particular, dichos hidrocarburos aromáticos están seleccionados del grupo compuesto por xileno, alkil benceno, metil naftaleno, dichos alcoholes están seleccionados del grupo compuesto por 2-5 propanol, etilenglicol, glicol propileno y éter mono etil etilen glicol, dichas cetonas están seleccionadas del grupo compuesto por acetona, ciciohexanona e isoforona y dichos aceites vegetales son aceite de soja o aceite de algodón.
Otra realización es el método de la invención, donde dicha composición comprende sales de fertirrigación, fertilizantes, insecticidas, nematocidas, fungicidas, bactericidas y/o herbicidas.
Otra realización es el método de la invención, donde dicha composición es un líquido, un sólido, una pasta o un gel.
Otra realización es el método de la invención, donde dicha composición es un polvo, pastilla, comprimido, granulado o concentrado emulsionable. Otra realización es el método de la invención, donde dicha composición se aplica por spray, pulverización, inmersión, irrigación o espolvoreado. Otra realización es el método de la invención, donde dicha planta está seleccionada del grupo compuesto por gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. De forma particular, dicha planta es una planta de la familia Brassicaceae.
Otra realización es el método de la invención, donde dicha planta es una planta monocotiledónea.
Otra realización es el método de la invención, donde dicha planta es una planta de cebada (Hordeum vulgare).
Otra realización es el método de la invención, donde dicha planta es una planta de maíz (Zea mays). En la presente invención, la planta puede ser una planta natural o transgénica.
El método de la invención puede ser realizado con todas las posibles plantas y células o tejidos derivados de tales plantas. En particular, pueden ser llevados a cabo con todas las Gimnospermas y Angiospermas (monocotiledóneas o dicotiledóneas) o material de planta derivado de tales plantas, incluyendo árboles, arbustos, hierbas y céspedes. Preferiblemente, los usos y procesos se aplican para usar en plantas útiles o materiales o células de tales plantas, más preferiblemente para la agricultura, horticultura, plantas forestales, ornamentales, o de cualquier otro interés comercial. Entre otras, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de la presente invención: arroz, trigo, cebada, maíz, soja, colza, tomate, judía, así como diferentes especies frutales (naranjo, limonero, etc.) y de ornamentales.
Otra realización de la invención es un material de propagación de una planta que comprende el microorganismo Colletotríchum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo. De forma particular, dicho material de propagación está seleccionado del grupo compuesto por semillas, plántulas, plantas jóvenes, esquejes, bulbos y tubérculos.
En la presente memoria se entiende por "material de propagación" a cualquier tipo de material celular del cual pueda germinar o desarrollarse una planta. Ejemplos de material de propagación incluyen, pero no están limitados a: semillas, esquejes, suspensiones celulares, cultivo de callos, cultivo de tejidos, protocormos, explantes o germoplasma. El material de propagación puede tener distinto origen. Por ejemplo, puede estar recién recolectado, o derivar de un stock, como una muestra de semillas o un stock de células congeladas. Otra realización de la invención es un sustrato para el cultivo de plantas que comprende el microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo.
El sustrato para el cultivo de plantas puede comprender la espora, el micelio o cualquier otra parte del microorganismo de la invención o el medio de cultivo o filtrado de los mismos o alguna de las posibles combinaciones de algunos de estos componentes. El sustrato puede ser líquido o sólido.
Ejemplos de sustratos para el cultivo de plantas son medios naturales o sintéticos solidificados y para el cultivo de las plantas, especialmente in vitro. Otros ejemplos son tierra, arena, humus o turba o mezclas de éstos.
Otra realización de la invención es una cepa del microorganismo Colletotrichum tofieldiae, depositada con el número de depósito CECT 20833, CECT 20834, CECT 20835 Y CECT 20836.
Otra realización de la invención es el uso del microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta
Otra realización de la invención es el uso del microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o medios de filtrado de dicho microorganismo para incrementar la producción de clorofila en una planta. Otra realización de la invención es el uso del microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o medios de filtrado de dicho microorganismo para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta que esté sometida a condiciones de sequía o riego limitado. Otra realización de la invención son los cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 . Reaislamiento de C. tofieldiae de órganos no inoculados de plantas de A. thaliana a los 60 días post inoculación. A. Aislado CECT 20834 reaislado de hoja (círculo) y tallos (flechas). B. Aislado CECT 20833 reaislado de raíz (flecha) y cuello (círculo).
MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE
Ejemplo 1 : Cribado de hongos que aumentan la productividad de las plantas
Se recolectaron plantas de Arabidopsis thaliana creciendo en condiciones naturales. Estas plantas carecían de síntomas de enfermedad tales como clorosis, manchas foliares y otros tipos de lesiones inducidas por patógenos. Fragmentos de las hojas de la roseta de las plantas recolectadas se desinfectaron sumergiéndolas en 20% de lejía comercial (1 % cloro activo) y agitando suavemente durante 5 minutos. Después, los fragmentos se aclararon dos veces en agua estéril y se pusieron en cámara húmeda a temperatura ambiente (20-24eC).
Los fragmentos se inspeccionaron periódicamente, aislando el micelio emergente en placas petri con medio patata dextrosa agar (PDA) con 200 mg/L de cloranfenicol. De entre los aislados obtenidos, se realizó un cribado para encontrar hongos que fueran beneficiosos al producir un aumento de producción de semilla en la planta (Tabla 1 ). Para realizar los ensayos del cribado, semillas de Arabidopsis thaliana accesión Col-0 esterilizadas superficialmente se sembraron en sustrato estéril (turba y vermiculita en proporción 3:1 ). Se estratificaron a 4 eC durante 3 días y después se mantuvieron en cámara de crecimiento controlado a 23 eC. Las plantas se trataron a las 3 semanas de edad (con 4-6 hojas) aplicando un trozo de micelio de alguno de los aislados de 3 mm de diámetro sobre una hoja. El micelio se había obtenido subcultivando el micelio del hongo, obtenido de una planta de Arabidopsis thaliana silvestre sin síntomas de enfermedad, en placas PDA. A las plantas control no se les aplicó ningún tratamiento y se dispusieron aleatoriamente entre las plantas tratadas. Al comenzar la dehiscencia de los escapos foliares, estos se cubrieron con bolsas de papel para recoger las semillas. Cuando las plantas se secaron, se recogieron las semillas y se pesaron. También se pesó el resto de la parte aérea de la planta. De entre todos los analizados, seleccionamos el aislado CECT 20833 del género Colletotrichum, ya que las plantas tratadas con este aislado aumentaron significativamente (P<0.04) su producción de semilla, siendo el peso de las semillas de las plantas tratadas tres veces mayor que el de las plantas sin tratar (Tabla 1 ). El peso del resto de la planta no fue significativamente distinto (P>0.05, Tabla 1 ).
Plantas control Plantas tratadas
Peso de Peso seco Peso de
semillas por resto planta semillas por Peso seco resto
TRATAMIENTO planta (mg) (mg) planta (mg) planta (mg)
Alternaría sp. 28.0 ± 2.9a 177.9 ± 12.1 a 21 .6 ± 2.2b 151 .1 ± 5.8b
Colletotrichum sp.
2.8 ± 1.1 a 85.1 ± 7.7 8.8 ± 1.7b 90.7 ± 4.1
CECT 20833
Plectosphaerella sp. 30.3 ± 5.8 218.9 ± 17.2 27.8 ± 4.1 233.6 ± 12.1
Tríchoderma sp. 14.9 ± 1 .6 143.8 ± 10.1 a 16.5 ± 1 .5 184.8 ± 1 1 .6b
Tríchoderma sp. 15.2 ± 1 .8 101 .5 ± 1 1 .7 16.2 ± 1 .6 126.3 ± 10.2
Ulocladium sp. 20.3 ± 3.1 169.7 ± 10.4 19.6 ± 1 .8 166.0 ± 7.2
Tabla 1 . Pesos (media ± error estándar) de las semillas y peso seco del resto de la planta de las plantas tratadas o no con micelio según se describe en el Ejemplo 1 . Diferentes letras indican diferencias significativas entre las plantas tratadas y las plantas control (P<0.05) según un ANOVA. Las plantas tratadas con el aislado CECT 20833 del género Colletotrichum (en negrita) tuvieron un peso de semilla significativamente mayor que las plantas control, mientras que el peso seco del resto de la planta no fue significativamente mayor.
Ejemplo 2: Identificación de aislados de Colletotrichum sp. de plantas silvestres de Arabidopsis thaliana como Colletotrichum tofieldiae.
El aislado CECT 20833 del género Colletotrichum del cribado del Ejemplo 1 presentaba un micelio oscuro y conidias curvas hialinas en acervulos con cerdas oscuras. Otros aislados obtenidos de la misma manera, identificados como CECT 20834, CECT 20835, y CECT 20836, presentaban una morfología similar. Todos estos aislados se identificaron como Colletotrichum tofieldiae según la morfología y las secuencias de varios loci descritos en Damm y col. (Fungal Diversity 39 (2009) 45-87) que se compararon con secuencias de aislados tipo depositados en la base de datos accesible en http://www.cbs.knaw.nl/Colletotrichum/, albergada en la Oficina Central de Cultivos de Hongos (CBS, Centraalbureau voor Schimmelcultures).
La morfología de estos aislados coincide con la descrita en Damm y col. (Fungal Diversity 39 (2009) 45-87) para C. tofieldiae, añadiendo que el cultivo en medio PDA (agar dextrosa patata) o equivalente, o en papel de filtro o en hojas de A. thaliana produce colonias muy oscuras, que el micelio en cultivo se oscurece y endurece con el tiempo y que puede presentar estructuras engrosadas tipo clamidosporas y/o tipo microesclerocios. Las similitudes de secuencia (ne de nucleótidos idénticos/ne de nucleótidos solapantes) de las secuencias comparadas entre los aislados CECT 20833, CECT 20834, CECT 20835 y CECT 20836 y los aislados tipo CBS 168.49, CBS 495. 85 y IMI 288810 de la Oficina Central de Cultivos de Hongos, utilizados en Damm y col. (Fungal Diversity 39 (2009) 45- 87) para definir la especie C. tofieldiae, fueron superiores al 92%. Las secuencias comparadas fueron las de la subunidad 5.8S del ribosoma con las dos regiones flanqueantes espaciadoras (ITS, similitud > 95%), un intrón de 200-bp del gen de la gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, similitud >92%), una secuencia parcial del gen de la actina (ACT, similitud >99%), y el gen de la histona 3 (HIS3, similitud > 98%). Estas comparaciones se han realizado con la herramienta MycoID de alineamientos pareados de secuencias albergada en la página web MycoBank (ww'A .m^co.bjn.k^,^) de la Asociación Internacional de Micología.
El conjunto de estas características define la especie o especies de Colletotrichum correspondiente al microorganismo de la presente invención.
Ejemplo 3: Aislados de Colletotrichum tofieldiae persistieron en plantas tratadas al menos dos meses post inoculación y se traslocaron o dispersaron a otros órganos diferentes de la hoja inoculada tales como raíz, corona, otras hojas y tallos. Semillas de Arabidopsis thaliana accesión Col-0 esterilizadas superficialmente se sembraron en sustrato estéril (turba y vermiculita en proporción 3:1 ). Se estratificaron a 4 eC durante 3 días y después se mantuvieron en cámara de crecimiento controlado a 23 eC, en ciclo corto (10 horas diarias de luz). Las plantas se trataron a las 3 semanas de edad con los aislados CECT 20833, CECT 20834 y CECT 20835 de Colletotrichum tofieldiae mediante la aplicación en tres hojas de una gota de suspensión de esporas a 106 esporas/ml. Las plantas completas se recolectaron a los 60 días post inoculación (dpi). Raíces, hojas de la roseta y tallos se separaron y cortaron en fragmentos de 25 mm2 aproximadamente, se desinfectaron según se ha descrito previamente y se incubaron en cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de una semana, Colletotríchum tofieldiae fue reaislado de al menos una muestra de todas las plantas inoculadas. El hongo se reaisló de hojas diferentes de las inoculadas, de la corona, de las raíces y del tallo (Tabla 2, Figura 1 ). No se observó crecimiento de C. tofieldiae en ninguna de las plantas control tratadas con agua destilada.
Porcentaje de reaislamiento
Aislado Hoias Tallo Cuello Raíz Total1
CECT 20833 80% 0% 67% 33% 100%
CECT 20834 100% 17% 50% 83% 100%
CECT 20835 100% 8% 75% 67% 100%
Tabla 2. Porcentaje de plantas de las que reaisló C. tofilediae de órganos distintos a los inoculados (hojas, tallos, cuello o raíz) a los 60 días tras el tratamiento. 1 Porcentaje de plantas de las que se ha reaislado C. tofieldiae en al menos una muestra de un órgano no inoculado. Ejemplo 4: El aislado CECT 20834 de Colletotríchum tofieldiae incrementó la producción de semillas y el peso de semillas por planta en plantas tratadas con micelio o esporas
Semillas de Arabidopsis thaliana accesión Col-0 esterilizadas superficialmente se sembraron en sustrato estéril (turba y vermiculita en proporción 3:1 ), se estratificaron a 4 eC durante 3 días y después se mantuvieron en cámara de crecimiento controlado a 23 eC. A las tres semanas de edad, se sometieron a alguno de los siguientes tratamientos a) Tratamiento con un trozo de micelio del aislado CECT 20834 de la misma forma que en el ejemplo 1 ; b) Aplicación de una suspensión de esporas del aislado CECT 20834 en agua destilada estéril a una concentración de 106 esporas/ml aplicada en spray sobre toda la planta y el sustrato debajo de la misma; c) Tratamiento control consistente en la aplicación de agua destilada estéril en spray sobre toda la planta y el sustrato debajo de la misma.
En el caso del tratamiento b, las esporas se obtuvieron resuspendiendo en agua destilada estéril las esporas obtenidas del cultivo del hongo en medio PDA. Las plantas sometidas a cada uno de los tratamientos se dispusieron de manera aleatorizada. Al comenzar la dehiscencia de los escapos foliares, estos se cubrieron con bolsas de papel para recoger las semillas. Cuando las plantas se secaron, se recogieron las semillas y se pesaron. También se pesó el resto de la parte aérea de la planta.
La producción de semilla por planta se midió como el peso de todas las semillas cosechadas de cada planta al final del ciclo. La producción de semilla de las plantas tratadas con CECT 20834 fue significativamente mayor que la de las plantas control (P<0.001 ), con un incremento de peso del 37% para las plantas tratadas con micelio y del 56% para las plantas tratadas con la suspensión de esporas en spray (Tabla 2). El incremento de la producción de semilla se debe en parte a la producción de semillas de mayor peso, ya que el peso de 100 semillas de las plantas tratadas con CECT 20834 mostró un incremento significativo (P<0.06) de hasta el 42% respecto a las plantas control. El peso seco del resto de la planta no fue significativamente distinto (P>0.10). El hongo se reaisló, a las 6 semanas tras el tratamiento, del 75% de las plantas inoculadas con micelio y del 100% de las plantas inoculadas con spray. Este ejemplo demuestra que la capacidad de incrementar la producción de semillas no es exclusiva del aislado CECT 20833, sino que se puede extender a otros aislados de C. tofieldiae y que el tratamiento con esporas da resultados similares al tratamiento con micelio.
Peso de 100 Peso seco de la
Peso de semillas semillas por planta planta sin semillas
TRATAMIENTO por planta (mg)* (mg)* (mg)*
Spray con agua
35.0 ± 3.6a 1 .17 ± 0.1 1 a 213.9 ± 12.0
destilada
Micelio 47.5 ± 3.7b (37%) 1 .66 ± 0.13b (42%) 249.3 ± 15.3 (16%)
Spray con suspensión
56.1 ± 2.9b (56%) 1 .65 ± 0.19b (41 %) 239.6 ± 16.9 (12%) de esporas
Tabla 3. Pesos (media ± error estándar) de las semillas por planta y de 100 semillas por cada planta y peso seco del resto de la planta (planta sin semillas) de las plantas tratadas con micelio o suspensión de esporas del aislado CECT 20834 o spray de agua destilada según se describe en el Ejemplo 4. *Diferentes letras muestran diferencias significativas según un ANOVA (P<0.001 , para el peso de semillas por planta y P<0.06 para el peso de 100 semillas). No se encontraron diferencias significativas en el peso de la planta sin semilla (P>0.10). El incremento en porcentaje, comparando plantas tratadas y no tratadas, se indica entre paréntesis. Ejemplo 5: Los aislados CECT 20835 y CECT 20836 de Colletotrichum tofieldiae incrementan la producción de semillas (peso de semilla por planta) en plantas tratadas con una suspensión de esporas aplicadas en spray. El incremento es proporcional a la persistencia del hongo en la planta.
Semillas de Arabidopsis thaliana accesión Col-0 esterilizadas superficialmente se sembraron en sustrato estéril (turba y vermiculita en proporción 3:1 ), se estratificaron a 4 eC durante 3 días y después se mantuvieron en cámara de crecimiento controlado a 23eC. A las tres semanas de edad, se sometieron a alguno de los siguientes tratamientos a) Aplicación de una suspensión de esporas del aislado CECT 20835 de Colletotrichum sp; b) Aplicación de una suspensión de esporas del aislado CECT 20836 de Colletotrichum sp; c) Tratamiento control consistente en la aplicación de agua destilada estéril. Todos los tratamientos se aplicaron en spray por toda la planta y el suelo debajo de la misma. El inoculo de los tratamientos a, b y c procede de suspensiones esporales mantenidas en glicerol al 30% a -80eC y diluidas en agua destilada estéril a una concentración de 106 esporas/ml. Tras la aplicación del tratamiento, las plantas se mantuvieron a 25 eC, ciclo corto. A las dos semanas tras el tratamiento, el hongo se reaisló del 17% de las plantas inoculadas con CECT 20835, del 20% de las plantas inoculadas con CECT 20836 y de ninguna planta tratada sólo con agua. A las seis semanas tras el tratamiento, el hongo se reaisló del 60% de las plantas tratadas con CECT 20835 y de ninguna de las plantas tratadas con CECT 20836 o sólo agua. Al comenzar la dehiscencia de los escapos foliares, estos se cubrieron con bolsas de papel para recoger las semillas. Cuando las plantas se secaron, se recogieron las semillas y se pesaron. También se pesó el resto de la parte aérea de la planta.
La producción de semilla por planta se midió como el peso de todas las semillas cosechadas de cada planta al final del ciclo. El ANOVA de los pesos de las semillas indica diferencias significativas en el peso medio de semillas por planta entre plantas sometidas a los distintos tratamientos (P<0.0001 , Tabla 4): Las plantas tratadas con CECT 20835 tuvieron el mayor peso medio de semillas por planta, con un incremento del 550% respecto a las plantas tratadas con sólo agua y las plantas tratadas con CECT 20836 tuvieron un incremento del peso medio de semillas del 400% respecto a las plantas tratadas sólo con agua. No se encontraron diferencias significativas en el peso de la planta sin semilla (P>0.10). Este ejemplo muestra que el efecto de aplicar Colletotrichum tofieldiae puede ser proporcional a la persistencia del hongo en la planta. Peso de semillas por Peso seco de la planta sin
TRATAMIENTO planta (mg)* semillas (mg)
Spray con agua destilada 5.7 ± 2.7a 273.6 ± 14.9
Spray con suspensión de esporas de
38.7 ± 2.5b (550%) 266.2 ± 20.7
CECT 20835
Spray con suspensión de esporas de
30. ± 2.7C (400%) 232.9 ± 15.5
CECT 20836
Tabla 4. Pesos (media ± error estándar) de las semillas por planta y peso seco del resto de la planta de las plantas (planta sin semillas) tratadas según se describe en el Ejemplo 5. * Diferentes letras muestran diferencias significativas según un ANOVA entre los distintos tratamientos (P<0.0001 ). El peso del resto de la planta no fue significativamente distinto entre los distintos tratamientos (P>0.10). El incremento en porcentaje, comparado entre plantas tratadas con los distintos aislados y las plantas control, se indica entre paréntesis. Ejemplo 6: Colletotríchum tofieldiae incrementó el número de frutos de las plantas tratadas con una suspensión de esporas tanto en plantas sembradas en sustrato estéril como en plantas sembradas en sustrato no estéril.
Semillas de Arabidopsis thaliana accesión Col-0 esterilizadas superficialmente se sembraron en sustrato estéril y no estéril (turba y vermiculita en proporción 3:1 ). Se estratificaron a 4 eC durante 3 días y después se mantuvieron en cámara de crecimiento controlado a 23eC. A las tres semanas de edad, se sometieron a alguno de los siguientes tratamientos a) Aplicación de una suspensión de esporas del aislado CECT 20833 de C. tofieldiae; b) aplicación de una suspensión de esporas del aislado CECT 20835 de C. tofieldiae; c) aplicación de agua destilada estéril. Todos los tratamientos se aplicaron en spray por toda la planta. El inoculo de los tratamientos a y b procede de suspensiones esporales mantenidas en glicerol al 30% a -80eC, lavadas y diluidas en agua destilada estéril a una concentración de 106 esporas/ml. Las plantas se distribuyeron al azar. El número de frutos por planta se contó en el momento del inicio de la apertura de las silicuas. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Las plantas tratadas con los aislados CECT 20833 y CECT 20835 de C. tofieldiae presentaron un incremento significativo de frutos de hasta un 39%. Este experimento demuestra que el incremento en la producción de semillas se debe en parte a la producción de un mayor número de frutos por planta. Este experimento demuestra que el efecto del hongo se mantiene en plantas sobre sustrato no estéril.
Ne de frutos
Sustrato estéril Sustrato no estéril
Spray con agua destilada 53.3 ± 6.5a 1 1 .3 ± 0.7a
C. tofieldiae CECT 20833 73.9 ± 7.0b (39%) 14.7 ± 1 .4b (31 %)
C. tofieldiae CECT 20835 60.4 ± 5.8b (13%) 14.3 ± 0.8b (27%)
Tabla 5. Número de frutos (media ± error estándar) por planta tratadas con una suspensión de esporas de diferentes aislados de C. tofieldiae según se describe en el Ejemplo 6. *Letras distintas indican diferencias significativas en un ANOVA (P<0.08 para el sustrato estéril y P<0.04 para el sustrato no estéril). El incremento en porcentaje, comparado entre plantas tratadas y no tratadas, se indica entre paréntesis. Ejemplo 7: Colletotrichum tofieldiae incrementó el número de frutos de las plantas sembradas en sustratos (estéril o no estéril) tratados con una suspensión de esporas.
Semillas de Arabidopsis thaliana accesión Col-0 esterilizadas superficialmente se sembraron en sustrato estéril y no estéril (turba y vermiculita en proporción 3:1 ). Se estratificaron a 4 eC durante 3 días y después se mantuvieron en cámara de crecimiento controlado a 23eC. Cuando las plantas tenían tres semanas de edad se depositaron en el sustrato, al lado de la planta, 200 μΙ por planta de a) una suspensión de esporas del aislado CECT 20833 de C. tofieldiae; b) una suspensión de esporas del aislado CECT 20835 de C. tofieldiae; c) agua destilada estéril. El inoculo de los tratamientos a y b procede de suspensiones esporales mantenidas en glicerol al 30% a -80eC lavadas y diluidas en agua destilada estéril a una concentración de 106 esporas/ml. Las plantas se distribuyeron al azar. El número de frutos por planta se contó en el momento del inicio de la apertura de las silicuas. Los resultados se muestran en la Tabla 6. Las plantas tratadas con los aislados CECT 20833 y CECT 20835 de C. tofieldiae presentan un incremento de frutos de hasta un 27%.
Ne de frutos*
Sustrato estéril Sustrato no estéril Spray con agua destilada 53.8 ± 6.0 16.6 ± 1 .5
C. tofieldiae CECT 20833 64.8 ± 7.0 (20%) 17.9 ± 1 .5 (8%)
C. tofieldiae CECT 20835 68.4 ± 7.3 (27%) 17.6 ± 5.1 (6%)
Tabla 6. Número de frutos (media ± error estándar) por planta tratadas con una suspensión de esporas de diferentes aislados de Colletotríchum aplicada directamente en el sustrato según se describe en el Ejemplo 7. * El incremento en porcentaje, comparado entre plantas tratadas y no tratadas, se indica entre paréntesis.
Ejemplo 8: Colletotríchum tofieldiae persistió en plantas de maíz y de colza tratadas, al menos 38 días post inoculación. Semillas de maíz de la variedad FAO700, y semillas de colza de la variedad Westar esterilizadas superficialmente se sembraron en sustrato estéril (turba y vermiculita en proporción 3:1 ) y después se mantuvieron en cámara de crecimiento controlado a 23eC, en ciclo corto (10 horas diarias de luz). Las plantas se trataron a las 3 semanas de edad con el aislado CECT 20833 de C. tofieldiae mediante la aplicación por spray de 120 mi de una suspensión de esporas a 106 esporas/ml en presencia de un 0,75% de surfactante (alkyl polisacárido). La primera y la segunda hoja de siete plantas se recolectaron a los 23 dpi, mientras que la tercera y la cuarta hoja se recolectaron a los 38 dpi.
Las hojas se separaron y cortaron en fragmentos de 25 mm2 aproximadamente, se desinfectaron según se ha descrito previamente y se incubaron en cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de una semana, C. tofieldiae fue reaislado de al menos un 64,3% de las muestras recolectadas a los 38 dps de siete plantas inoculadas de maíz y un 7% de las muestras recolectadas de siete plantas inoculadas de colza (Tabla 7). No se observó crecimiento de C. tofieldiae en ninguna de las plantas control tratadas con agua destilada.
Cultivo Días post Hoja Número de Porcentaje Porcentaje de re-
. . . . . . aislamiento por spray muestreada hojas de maíz de re- . . . . .
^ 1 J hoja de la misma
(siete que presentan aislamiento planta
plantas) acérvulos (siete por hoja
hojas) Maíz 23 Hoja 1 1 14.3 % 42.8 %
Hoja 2 5 71 .4 %
38 Hoja 3 5 71 .4 % 64.3 %
Hoja 4 4 57.1 %
Colza 23 Hoja 1 7 100 % 78.6 %
Hoja 2 4 57,14 %
38 Hoja 3 0 0 %
Hoja 4 1 14,28 % 7 %
Tabla 7. Número de hojas de maíz o de colza y porcentaje de las que se reaisló Colletotríchum tofilediae a los 23 (primera y segunda hojas) y a los 38 días (tercera y cuarta hojas) tras el tratamiento.
Ejemplo 9: Colletotríchum tofieldiae se puede inocular mediante distintos métodos en maíz y en cebada, se trasloca de las semillas y raíces a las hojas, e incrementa el contenido en clorofilas.
Semillas de maíz de la variedad FAO700 lavadas y semillas de cebada de la variedad Arturio se sometieron a distintos tratamientos (36 plantas por tratamiento):
1 . Tratamiento inmersión: se inocularon las semillas mediante inmersión durante 2 h en una suspensión de micelio batido del aislado CECT 20833, crecido en PDB durante 10 días, a una densidad óptica de 1 .2 y se sembraron en un sustrato mezcla de turba y vermiculita en proporción 3:1 .
2. Tratamiento centeno: se sembraron las semillas en un sustrato mezcla de turba y vermiculita en proporción 3:1 al que se añadió semillas de centeno (35 g/l sustrato) que habían sido inoculadas 8 días antes con discos micelio del aislado CECT 20833
3. Tratamiento turba: se sembraron las semillas en un sustrato mezcla de turba y vermiculita en proporción 3:1 a la que se añadió una mezcla de turba y salvado (20 g/l sustrato) que había sido inoculada dos semanas antes con esporas del aislado CECT 20833. Una cantidad de 1 ,5x104 esporas/gramo de mezcla de turba y salvado
4. Tratamiento spray: se sembraron las semillas en sustrato mezcla de turba y vermiculita en proporción 3:1 y a las 3 semanas de edad se inocularon mediante la aplicación por spray de 120 mi de una suspensión de micelio del aislado CECT 20833, que había crecido en PDB durante 10 días, ajustado a una densidad óptica de 1 .2, en presencia de un 0,75% de surfactante (alkyl polisacárido). 5. Tratamiento riego: se sembraron las semillas en sustrato mezcla de turba y vermiculita en proporción 3:1 y se inocularon mediante riego (5 mi) con una suspensión de micelio batido del aislado CECT 20833, que había crecido en PDB durante 10 días, ajustado a una densidad óptica de 1 .2.
Una vez sembradas las plantas se mantuvieron en invernadero a 23eC, en ciclo corto (10 horas diarias de luz). Pasados 25 días, las hojas se separaron y cortaron en fragmentos de 25 mm2 aproximadamente, se desinfectaron según se ha descrito previamente y se incubaron en cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de una semana, C. tofieldiae fue re-aislado de todos los tratamientos de cebada y de todos los tratamientos de maíz excepto el de inmersión de semilla (Tabla 8). No se observó crecimiento de C. tofieldiae en ninguna de las plantas control tratadas con agua destilada. Además, pasados tres meses, las plantas se muestrearon y se tomó tejido de hoja que se mantuvo durante 18 horas en etanol al 80%. Pasado este tiempo se midió la absorbancia de la suspensión (D0663) como indicador de la concentración en clorofila a. Se observó que en los tratamientos centeno y turba la absorbancia fue significativamente superior que en las plantas control sin inocular (Tabla 9).
Maíz: Cebada: Maíz:
Tratamiento N porcentaje de porcentaje de absorbancia
re-aislamiento re-aislamiento D0663 (clorofila a)*
Control inmersión 32 0 % 0 % -
Inmersión 32 0 % 20 % -
Control centeno 32 0 % 0 % 0,24 ± 0,02a
Centeno 32 90% 40 % 0,33 ± 0,03b
Control turba 32 0 % 0 % 0,15 ± 0,02a echoTurba 32 80% 10 % 0,25 ± 0,02b
Control spray 32 0 % 0 % 0,42 ± 0,02a
Spray 32 30% 50 % 0,37 ± 0,02a
Control riego 32 0 % 0 % 0,17 ± 0,02a
Riego 32 70% 50 % 0,16 ± 0,02a
Tabla 8. Porcentaje de re-aislamiento del aislado CECT 20833 de plantas de maíz y cebada tras los diferentes tratamientos y absorbancia de muestras de maíz D0663 (clorofila *Letras distintas indican diferencias significativas en un ANOVA (P<0.05) Ejemplo 10: Colletotríchum tofieldiae se puede inocular tanto como conidias como micelio tanto en el substrato como en spray en maíz . Se moviliza de la raíz a las hojas y viceversa, incrementando el contenido en clorofilas.
Semillas de maíz de la variedad FAO700 lavadas se sometieron a distintos tratamientos (54 plantas por tratamiento):
1 . Tratamiento turba-micelio: se sembraron las semillas en un sustrato turba:vermiculita (3:1 ) más mezcla turba y salvado (20 g/l) inoculada con una suspensión de micelio batido del aislado CECT 20833 según se ha descrito en el ejemplo 9.
2. Tratamiento turba-esporas: se sembraron las semillas en un sustrato turba:vermiculita (3:1 ) más una mezcla turba y salvado (20 g/l) inoculada dos semanas antes con una suspensión de esporas a 106 esporas/ml del aislado CECT 20833.
3. Tratamiento spray-esporas: se sembraron las semillas en un sustrato turba:vermiculita (3:1 ) y las plantas se inocularon a las 3 semanas de edad con el aislado CECT 20833 de C. tofieldiae mediante la aplicación por spray de 120 mi de una suspensión de esporas a 106 esporas/ml en presencia de un 0,5% de surfactante (alkyl polisacárido).
4. Tratamiento spray-micelio: se sembraron las semillas en un sustrato turba:vermiculita (3:1 ) y las plantas se inocularon a las 3 semanas de edad con el aislado CECT 20833 de C. tofieldiae mediante la aplicación por spray de 120 mi de una suspensión de micelio a una densidad óptica de 1 .5 en presencia de un 0,5% de surfactante (alkyl polisacárido).
Una vez sembradas las plantas se mantuvieron en invernadero a 23eC, en ciclo corto (10 horas diarias de luz) durante ocho semanas. Las hojas o las raíces se separaron y cortaron en fragmentos de 25 mm2 aproximadamente, se desinfectaron según se ha descrito previamente y se incubaron en cámara húmeda a temperatura ambiente. Después de 30 días, C. tofieldiae fue re-aislado de todos los tratamientos (Tabla 9). No se observó crecimiento de C. tofieldiae en ninguna de las plantas control tratadas con un spray de agua destilada o sembradas con turba. Además, se midió el índice de contenido de clorofilas (ICC) utilizando el medidor opti-sciences CCM 200. Se observó que en todos los tratamientos las plantas inoculadas tenían un mayor ICC que las plantas control sin inocular, excepto para el tratamiento spray esporas (Tabla 9). Raíz: Hoja: N ICC*
Tratamiento N porcentaje de porcentaje de (número de
re-aislamiento re-aislamiento medidas)
Control turba micelio 54 0 % 0 % 50 2,82 ± 0,09a
Turba micelio 54 67 % 20 % 38 3,57 ± 0,12b
Control turba esporas 54 0 % 0 % 56 3,27 ± 0,14a
Turba esporas 54 67 % 25 % 34 3,78 ± 0,16b
Control spray micelio 54 0% 0 % 60 3,97 ± 0,13a
Spray micelio 54 33 % 45 % 48 5,84 ± 0,44b
Control spray esporas 0 % 70 3,46 ± 0,10a
Spray esporas 54 42% 35 % 64 2,99 ± 0,10b
Tabla 10. Porcentaje de re-aislamiento en raíz y hojas de plantas de maíz y contenido de clorofila (ICC) (media ± error estándar) tras los diferentes tratamientos. *Letras distintas indican diferencias significativas en un ANOVA (P<0.05). Ejemplo 1 1 : Colletotríchum tofieldiae incrementó el número de granos por mazorca y el peso por mazorca en plantas de maíz tratadas con el aislado CECT 20833 en condiciones de riego normal y riego limitado.
Semillas de maíz de la variedad FAO700 lavadas se inocularon mediante inmersión durante 16 h en una suspensión de esporas a 106 esporas/ml, se sembraron en sustrato (turba y vermiculita en proporción 3:1 ) y se mantuvieron en cámara de crecimiento controlado a 23eC. Cuando las plantas tenían tres semanas de edad se llevaron a campo, donde se trasplantaron a suelo en cuatro hileras separadas por 70 cm y con una distancia de 25 cm entre planta y planta dentro de cada hilera. Las plantas control y las plantas inoculadas con C. tofieldiae se plantaron en bloques al azar dentro de cada hilera. Después de un mes con riego normal (100% agua) dos de las hileras fueron sometidas a un riego limitado con el 30% del riego con respecto a las plantas control. Al final del ciclo de cultivo se contabilizó el número de granos por mazorca y el peso de cada mazorca. Los resultados se muestran en la Tabla 10. Las plantas tratadas con C. tofieldiae presentaron un incremento de granos de hasta un 47% y de peso medio por mazorca de hasta un 70% cuando las plantas estuvieron sometidas a riego limitado.
Número de granos Peso medio
Tratamiento N por mazorca P-value por mazorca P-value
Rieao normal (100 %)
Control 19 439 ± 51 - 169 ± 19 -
Inoculación C. tofieldiae 28 450 ± 36 (2%)* 0,866 21 1 ± 17 (25%) 0,1 19
Rieao limitado (30 %)
Control 17 267 ± 27 - 102± 24 -
Inoculación C. tofieldiae 20 393 ± 56 (47%) 0,063 173 ± 22 (70%) 0,034 * Tabla 10. Producción media del número de granos (media ± error estándar) y peso por mazorca (media ± error estándar) de plantas germinadas de semillas tratadas con una suspensión de esporas de C. tofieldiae en condiciones de riego normal y de riego limitado. * El incremento del porcentaje comparado entre plantas tratadas y no tratadas se indica entre paréntesis. Letras distintas indican diferencias significativas en un ANOVA (P<0.05)
Ejemplo 12: Colletotrichum tofieldiae, al colonizar las plantas, produce un incremento del número de granos por mazorca y del peso de las mazorcas por planta de maíz tratadas con del aislado CECT 20833.
Semillas de maíz de la variedad FAO700 lavadas se sembraron en el suelo en cuatro hileras separadas por 70 cm y con una distancia de 25 cm entre planta y planta dentro de cada hilera. Para la inoculación con C. tofieldiae se depositó en el fondo del surco de siembra 200 ml/semilla de mezcla turba vermiculita a una concentración de 106 UFC/ml que había sido inoculada dos semanas antes con esporas con una concentración de 106 esporas/ml del aislado CECT 20833. Las plantas control y las plantas inoculadas con C. tofieldiae se plantaron en bloques al azar dentro de cada hilera. Al final del ciclo de cultivo se contabilizó el número de granos por mazorca. Paralelamente se realizó una PCR a tiempo real (RT PCR) del tejido de las raíces de anclaje de las plantas de maíz con los cebadores CT_RTPCR_L (SEQ ID NO: 1 ) y CT_RTPCR_R (SEQ ID NO: 2) específicos de C. tofieldiae. Los resultados se muestran en la Tabla 1 1 . Las plantas colonizadas con C. tofieldiae presentan un incremento de producción de mazorcas de hasta un 43% y un aumento de producción de semillas de hasta un 35% cuando las plantas están sometidas a riego limitado con el 30% del riego con respecto a las plantas control.
Figure imgf000025_0001
Tabla 1 1 . Producción media (peso de mazorca por planta (media ± error estándar) y número de granos por planta (media ± error estándar)) de plantas germinadas de semillas tratadas con una suspensión de esporas de C. tofieldiae en condiciones de riego normal. El incremento del porcentaje comparado entre plantas colonizadas y no colonizadas se indica entre paréntesis. Letras distintas indican diferencias significativas en un ANOVA (P<0.05)

Claims

Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta, caracterizado por que comprende la etapa de poner en contacto dicha planta con una composición que comprende el microorganismo Colletotríchum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo.
Método según la reivindicación 1 , caracterizado por que dicho microorganismo es una cepa de Colletotríchum tofieldiae depositada con el número de depósito CECT 20833, CECT 20834, CECT 20835 o CECT 20836.
Método según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado por que dicho microorganismo está en forma de esporas, hifas, micelio o esclerocios.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha composición se aplica a las semillas de dicha planta.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha composición se aplica a las partes aéreas de dicha planta.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha composición se aplica a las raíces de dicha planta o a otras partes subterráneas de dicha planta.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que dicha composición se aplica al sustrato para el cultivo de dicha planta.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que dicha composición comprende minerales, materiales orgánicos, compuestos orgánicos, compuestos inorgánicos, diluyentes líquidos, alcoholes, cetonas, aceites vegetales, hidrocarburos alifáticos, ésteres, dimetil sulfóxido, acetonitrilo, agua, surfactantes aniónicos, surfactantes no iónicos, surfactantes catiónicos, polímeros hidrosolubles, polisacáridos, preservantes, agentes colorantes, y/o agentes estabilizadores.
Método según la reivindicación 8, caracterizado por que dichos minerales están seleccionados del grupo compuesto por arcillas, bentonita, calcita y diatomeas, dichos materiales orgánicos están seleccionados del grupo compuesto por polvo de maíz o polvo de piel de nuez, dicho compuesto orgánico es urea, dichos compuestos inorgánicos están seleccionados del grupo compuesto por carbonato cálcico, sulfato amónico, óxido de silicona, silicato de aluminio y magnesio, dichos diluyentes líquidos están seleccionados del grupo compuesto por hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos alifáticos, alcoholes, cetonas, aceites vegetales, ésteres, dimetil sulfóxido, acetonitrilo y agua, dichos surfactantes aniónicos están seleccionados del grupo compuesto por sales de ésteres de alkil sulfato, sales de alkilaril sulfonato, sales de dialkil sulfosuccinato, sales de ásteres de éter fosfato de alkilaril de polioxietileno, sales de lignosulfonato y policondensados de formaldehido, dichos surfactantes no iónicos están seleccionados del grupo compuesto por éteres de alkil aril polioxietileno, bloques de copolímeros de alkilpolioxipropileno, polioxietileno y ésteres de ácidos grasos, dichos surfactantes catiónicos son sales de alkil trimetilamonio, dichos polímeros hidrosolubles son alcohol de polivinilo o polivinilpirrolidona, dichos polisacáridos están seleccionados del grupo compuesto por agar, goma arábiga, ácido alginico, sales de ácido algínico, carboxi metil celulosa y goma xantano y dichos agentes estabilizadores son ácido isopropil fosfato o BHT.
10. Método según la reivindicación 9, caracterizado por que dichos hidrocarburos aromáticos están seleccionados del grupo compuesto por xileno, alkil benceno, metil naftaleno, dichos alcoholes están seleccionados del grupo compuesto por 2-5 propanol, etilenglicol, glicol propileno y éter mono etil etilen glicol, dichas cetonas están seleccionadas del grupo compuesto por acetona, ciclohexanona e isoforona y dichos aceites vegetales son aceite de soja o aceite de algodón.
1 1 . Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que dicha composición comprende sales de fertirrigación, fertilizantes, insecticidas, nematocidas, fungicidas, bactericidas y/o herbicidas.
12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 1 , caracterizado por que dicha composición es un líquido, un sólido, una pasta o un gel.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por que dicha composición es un polvo, pastilla, comprimido, granulado o concentrado emulsionable.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que dicha composición se aplica por spray, pulverización, inmersión, irrigación o espolvoreado.
15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que dicha planta es una planta gimnosperma o dicotiledónea.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que dicha planta es una planta de la familia Brassicaceae.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que dicha planta es una planta monocotiledónea.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que dicha planta es una planta de cebada (Hordeum vulgare).
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado por que dicha planta es una planta de maíz (Zea mays).
20. Material de propagación de una planta que comprende el microorganismo Colletotríchum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo.
21 . Material de propagación según la reivindicación 20, que está seleccionado del grupo compuesto por semillas, plántulas, plantas jóvenes, esquejes, bulbos y tubérculos.
22. Sustrato para el cultivo de plantas que comprende el microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o filtrados de dicho microorganismo.
23. Cepa del microorganismo Colletotrichum tofieldiae, depositada con el número de depósito CECT 20833, CECT 20834, CECT 20835 o CECT 20836.
24. Uso del microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o medios de filtrado de dicho microorganismo para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta.
25. Uso del microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o medios de filtrado de dicho microorganismo para incrementar la producción de clorofila en una planta.
26. Uso del microorganismo Colletotrichum tofieldiae y/o extractos de dicho microorganismo y/o medios de filtrado de dicho microorganismo para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta que esté sometida a condiciones de sequía o riego limitado.
27. Cebadores identificados por las secuencias SEQ ID NO: 1 y 2.
PCT/ES2014/070930 2013-12-17 2014-12-17 Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta WO2015092104A1 (es)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/104,138 US10201164B2 (en) 2013-12-17 2014-12-17 Method for increasing the production of flowers, seeds and/or fruit of a plant
ES14835701T ES2776162T3 (es) 2013-12-17 2014-12-17 Método para aumentar la producción de flores, semillas y/o frutas en una planta
MX2016008017A MX2016008017A (es) 2013-12-17 2014-12-17 Metodo para incrementar la produccion de flores, semillas y/o frutos en una planta.
CA2934162A CA2934162C (en) 2013-12-17 2014-12-17 Method for increasing the production of flowers, seeds and/or fruits in a plant
EP14835701.5A EP3085233B1 (en) 2013-12-17 2014-12-17 Method for increasing the production of flowers, seeds, and/or fruits in a plant
BR112016014334A BR112016014334B8 (pt) 2013-12-17 2014-12-17 Método para incrementar a produção de flores, sementes e/ou frutas de uma planta, uso do micro-organismo colletotrichum tofieldiae e/ou meios de filtrado do dito micro-organismo
AU2014369737A AU2014369737B2 (en) 2013-12-17 2014-12-17 Method for increasing the production of flowers, seeds and/or fruit of a plant
PL14835701T PL3085233T3 (pl) 2013-12-17 2014-12-17 Sposób zwiększenia wytwarzania kwiatów, nasion i/lub owoców w roślinie
AU2018274842A AU2018274842B2 (en) 2013-12-17 2018-11-30 Method for increasing the production of flowers, seeds and/or fruit of a plant

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP201331839 2013-12-17
ES201331839A ES2439393B2 (es) 2013-12-17 2013-12-17 Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015092104A1 true WO2015092104A1 (es) 2015-06-25

Family

ID=49943635

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2014/070930 WO2015092104A1 (es) 2013-12-17 2014-12-17 Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta

Country Status (12)

Country Link
US (1) US10201164B2 (es)
EP (1) EP3085233B1 (es)
AR (1) AR098805A1 (es)
AU (2) AU2014369737B2 (es)
BR (1) BR112016014334B8 (es)
CA (1) CA2934162C (es)
ES (2) ES2439393B2 (es)
HU (1) HUE049772T2 (es)
MX (1) MX2016008017A (es)
PL (1) PL3085233T3 (es)
PT (1) PT3085233T (es)
WO (1) WO2015092104A1 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2439393B2 (es) 2013-12-17 2014-07-30 Universidad Politécnica de Madrid Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta
ES2969994A1 (es) * 2022-10-18 2024-05-23 Univ Madrid Politecnica Metodo para reducir el estres vegetal, hongos, y micotoxinas

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2439393A1 (es) * 2013-12-17 2014-01-22 Universidad Politécnica de Madrid Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69106842T2 (de) * 1990-11-08 1995-05-18 Shell Int Research VA-Mykorrhizapilze enthaltende wasserdispergierbare Granulate, ihre Herstellung und ihre Verwendung.
JPH06343459A (ja) * 1993-06-03 1994-12-20 Japan Tobacco Inc コレトトリカム属菌、それを含有するスズメノカタビラ防除剤及びスズメノカタビラ防除方法
DE69812697T2 (de) * 1997-12-05 2004-03-04 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Pilze der gattung piriformospora
US9642371B2 (en) * 2013-10-30 2017-05-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Compositions and methods comprising colletotrichum for controlling plant species

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2439393A1 (es) * 2013-12-17 2014-01-22 Universidad Politécnica de Madrid Método para incrementar la producción de flores, semillas y/o frutos en una planta

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAMM ET AL., FUNGAL DIVERSITY, vol. 39, 2009, pages 45 - 87
GANG TAO ET AL: "Endophytic Colletotrichum species from Bletilla ochracea (Orchidaceae), with descriptions of seven new speices", FUNGAL DIVERSITY, vol. 61, no. 1, 1 July 2013 (2013-07-01), pages 139 - 164, XP055114742, ISSN: 1560-2745, DOI: 10.1007/s13225-013-0254-5 *
HYDE ET AL., FUNGAL DIVERSITY, vol. 39, 2009, pages 147 - 182
P.W P.F U J.H.C CROUS CANNON DAMM WOUDENBERG ET AL: "Colletotrichum species with curved conidia from herbaceous hosts", FUNGAL DIVERSITY, 1 January 2009 (2009-01-01), pages 45, XP055114671, Retrieved from the Internet <URL:http://library.wur.nl/WebQuery/wurpubs/387803> [retrieved on 20140425] *
R. RODRIGUEZ ET AL: "More than 400 million years of evolution and some plants still can't make it on their own: plant stress tolerance via fungal symbiosis", JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY, vol. 59, no. 5, 16 February 2008 (2008-02-16), pages 1109 - 1114, XP055114681, ISSN: 0022-0957, DOI: 10.1093/jxb/erm342 *
REDMAN R S ET AL: "CONVERSION OF THE PATHOGENIC FUNGUS COLLETOTRICHUM MAGNA TO A NONPATHOGENIC, ENDOPHYTIC MUTUALIST BY GENE DISRUPTION", MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS, APS PRESS, vol. 12, no. 11, 1 November 1999 (1999-11-01), pages 969 - 975, XP009034000, ISSN: 0894-0282 *

Also Published As

Publication number Publication date
AR098805A1 (es) 2016-06-15
ES2776162T3 (es) 2020-07-29
CA2934162C (en) 2023-02-14
BR112016014334A8 (pt) 2019-04-16
BR112016014334A2 (es) 2015-06-25
AU2014369737A1 (en) 2016-08-04
CA2934162A1 (en) 2015-06-25
BR112016014334B1 (pt) 2021-07-06
ES2439393B2 (es) 2014-07-30
PT3085233T (pt) 2020-04-22
AU2018274842B2 (en) 2020-05-21
PL3085233T3 (pl) 2020-07-13
EP3085233A1 (en) 2016-10-26
MX2016008017A (es) 2017-05-12
EP3085233B1 (en) 2020-02-12
US20160309724A1 (en) 2016-10-27
BR112016014334B8 (pt) 2023-03-07
AU2018274842A1 (en) 2018-12-20
ES2439393A1 (es) 2014-01-22
US10201164B2 (en) 2019-02-12
HUE049772T2 (hu) 2020-10-28
ES2776162T8 (es) 2020-08-07
AU2014369737B2 (en) 2018-11-15
AU2014369737A2 (en) 2017-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2714873T3 (es) Cepa aislada de Clonostachys rosea para su uso como agente de control biológico
AU2013308476B2 (en) Method of increasing abiotic stress resistance of a plant
JP2016534737A5 (es)
KR101419703B1 (ko) 병원균에 대한 식물의 보호
AU2018274842B2 (en) Method for increasing the production of flowers, seeds and/or fruit of a plant
WO2019207822A1 (ja) 植物生育促進剤
JP5854517B2 (ja) 新菌株、該新菌株を用いた根頭がんしゅ病防除剤及び／又は植物種子発芽率向上剤
RU2736340C1 (ru) Средство для стимуляции роста сельскохозяйственных культур
Stefanova et al. The plum cultivar'Jojo'grown under the conditions of the Central Balkan Mountains in Bulgaria
Fascella et al. Distribution, habitats, characterization and propagation of Sicilian rose species
ES2907599B2 (es) Cepa de rutstroemia calopus, composiciones y usos
JP2011168532A (ja) 植物芽発酵液と枯草菌からなる植物栽培用組成物、および植物栽培方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14835701

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014835701

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014835701

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15104138

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2934162

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: MX/A/2016/008017

Country of ref document: MX

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014369737

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20141217

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112016014334

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112016014334

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20160617