WO2015064441A1 - サンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法 - Google Patents

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antigen
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reaction
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貴紀 村山
淳夫 岩下
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コニカミノルタ株式会社
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    • G01N2021/7769—Measurement method of reaction-produced change in sensor
    • G01N2021/7786—Fluorescence

Definitions

  • the present invention relates to an antigen detection method capable of accurately detecting a target antigen in an antigen detection method using a sandwich-immunoassay method.
  • Biochemical reactions such as antigen-antibody reactions are used in biochemical tests. These biochemical tests are performed using a sensor chip in which a fine channel is formed.
  • an antigen-capturing antibody is fixed to the inner surface in the middle of the fine channel, and a sample liquid containing the target antigen is supplied into the fine channel, and the antigen and antigen-capturing antibody contained in the sample liquid Are combined.
  • liquids other than the sample solution such as washing solution and labeling solution (fluorescent labeling solution) are supplied to the fine channel. By doing so, it is measured by surface plasmon excitation fluorescence spectroscopy (SPFS).
  • SPFS surface plasmon excitation fluorescence spectroscopy
  • the liquid is discharged / sucked using a pipette via a liquid discharge / suction part provided on the upstream side of the fine channel.
  • a liquid mixing section is provided on the downstream side of the fine channel, and for example, a turbulent flow is generated in the liquid to ensure the binding of the antigen to the antigen-capturing antibody (for example, Patent Document 1). .
  • the amount of liquid remaining in the flow path is not always constant, and there is a high possibility that the amount of liquid remaining varies from measurement to measurement.
  • the amount of residual liquid varies from measurement to measurement, the amount of non-specific adsorption also varies from measurement to measurement, which has the problem of adversely affecting reproducibility, particularly in target measurements contained in low-concentration sample liquids. .
  • the present invention can reduce the influence of non-specific adsorption, improve the measurement accuracy of target measurement particularly contained in a low-concentration sample liquid, and increase the repeatability of target measurement.
  • An object of the present invention is to provide an antigen detection method using a sandwich-immunoassay method.
  • an antigen detection method using the sandwich-immunoassay method of the present invention has the following. At least in the middle of the fine flow path, a reaction region in which an antigen-capturing antibody is immobilized is provided, and a liquid discharge / suction unit is provided on the upstream side of the fine flow path, and a liquid mixing part is provided on the downstream side.
  • Preparing a sensor chip supplying a sample solution containing an antigen as a target to the reaction region of the sensor chip, and causing the antigen-capturing antibody to capture the target; and After the primary reaction step, a secondary reaction step of flowing a labeling solution containing a labeled antibody into the fine channel and labeling the target captured by the antigen capturing antibody; A signal measurement step of measuring a signal obtained from the labeled antibody labeled with the target in the secondary reaction step; An antigen detection method using a sandwich-immunoassay method having at least In the primary reaction step, When supplying the sample solution containing the target antigen to the reaction region, the sample solution is supplied until reaching the liquid mixing section provided on the downstream side of the fine channel, In the secondary reaction step, When supplying the labeling liquid to the reaction region where the target antigen is captured by the antigen-capturing antibody, the labeling liquid is supplied up to the liquid mixing section provided on the downstream side of the fine channel. Do not.
  • the amount of labeling liquid supplied to the reaction region is adjusted so that the labeling liquid does not reach the liquid mixing part, thereby reducing the influence of nonspecific adsorption.
  • an antigen detection method using a sandwich-immunoassay method capable of improving the measurement accuracy of target measurement contained in a low-concentration sample solution and increasing the reproducibility of target measurement.
  • FIG. 1 shows an SPFS device to which a sensor chip for performing the antigen detection method of the present invention is attached.
  • FIG. 2 shows a sensor chip for performing the antigen detection method of the present invention.
  • FIG. 3 is a longitudinal sectional view of the sensor chip shown in FIG.
  • FIG. 4 is an enlarged view of a main part showing an enlarged liquid mixing part in the longitudinal sectional view of the sensor chip shown in FIG.
  • FIG. 5 is a process diagram for explaining the antigen detection method of the present invention.
  • FIG. 6 is a process diagram for explaining the antigen detection method of the present invention.
  • FIG. 7 is a process diagram for explaining the antigen detection method of the present invention.
  • the present invention relates to an antigen detection method capable of accurately detecting a target antigen in an antigen detection method using a sandwich-immunoassay method.
  • the antigen detection method using the sandwich-immunoassay method of the present invention is: At least in the middle of the fine flow path, a reaction region in which an antigen-capturing antibody is immobilized is provided, and a liquid discharge / suction unit is provided upstream of the fine flow path, and a liquid mixing part is provided downstream.
  • Preparing a sensor chip supplying a sample solution containing an antigen as a target to the reaction region of the sensor chip, and causing the antigen-capturing antibody to capture the target; and After the primary reaction step, a secondary reaction step of flowing a labeling solution containing a labeled antibody into the fine channel and labeling the target captured by the antigen capturing antibody; A signal measurement step of measuring a signal obtained from the labeled antibody labeled with the target in the secondary reaction step; An antigen detection method using a sandwich-immunoassay method having at least In the primary reaction step, When supplying the sample solution containing the target antigen to the reaction region, the sample solution is supplied until reaching the liquid mixing section provided on the downstream side of the fine channel, In the secondary reaction step, When supplying the labeling liquid to the reaction region where the target antigen is captured by the antigen-capturing antibody, the labeling liquid is supplied up to the liquid mixing section provided on the downstream side of the fine channel. Do not.
  • the labeling liquid is not supplied to the liquid mixing part in the secondary reaction step, (1) the primary reaction that occurred when the labeling liquid was supplied to the liquid mixing part. Impurities in the sample liquid remaining in the liquid mixing part during the process may return to the reaction region from the liquid mixing part together with the labeling liquid and cause non-specific adsorption, or (2) during this secondary reaction process
  • the labeled antibody in the labeling liquid remaining in the liquid mixing part is supplied to the liquid mixture in the subsequent secondary reaction cleaning step and / or the measurement liquid in the secondary reaction measurement liquid filling step.
  • the non-specific adsorption is not caused by returning from the liquid mixing unit to the reaction region.
  • the cleaning liquid is delivered to the liquid mixing portion, so that the remaining impurities (non-specifically adsorbed) are very small.
  • the slight impurity greatly affects the measurement result.
  • the amount of the labeling liquid in the secondary reaction step can be reduced compared to the case where the labeling liquid is supplied to the liquid mixing part, and the cost required for the labeling liquid is reduced.
  • the time required for feeding the labeling solution can be shortened.
  • an antigen detection method using the sandwich-immunoassay method of the present invention includes: After the secondary reaction step, there is a secondary reaction cleaning step of cleaning the reaction region with a cleaning liquid, In the secondary reaction cleaning step, it is preferable that the cleaning liquid is not supplied until it reaches the liquid mixing section provided on the downstream side of the fine channel.
  • the cleaning liquid can remove and remove non-specifically adsorbed substances in the flow path by the surfactant contained in the cleaning liquid, there is a possibility that non-specific adsorption as described above will newly occur with the cleaning liquid. Although it is low, the possibility can be fundamentally excluded if the cleaning liquid is not supplied to the liquid mixing section.
  • the cleaning liquid is not supplied to the liquid mixing section, the amount of cleaning liquid can be reduced compared to the case where the cleaning liquid is supplied to the liquid mixing section, reducing the cost required for the cleaning liquid and reducing the time required for feeding the cleaning liquid.
  • an antigen detection method using the sandwich-immunoassay method of the present invention includes: After the secondary reaction cleaning step, a secondary reaction measurement liquid filling step for filling the reaction region with the measurement liquid, In the secondary reaction measurement liquid filling step, it is preferable that the measurement liquid is not supplied until it reaches the liquid mixing section provided on the downstream side of the fine channel.
  • the measurement liquid is not supplied to the liquid mixing part in this way, impurities in the sample liquid remaining in the liquid mixing part during the primary reaction step return from the liquid mixing part to the reaction region together with the measurement liquid. None will happen. In this way, by further reducing the influence of non-specific adsorption, it is possible to improve the measurement accuracy in the target measurement particularly contained in the low-concentration sample liquid and to improve the repeatability of the target measurement.
  • the measurement liquid is not supplied to the liquid mixing part, the amount of the measurement liquid can be reduced compared to the case where the measurement liquid is supplied to the liquid mixing part, and the cost required for the measurement liquid is reduced, and the measurement liquid is fed. It is possible to shorten the time required for the operation.
  • an antigen detection method using the sandwich-immunoassay method of the present invention includes: A secondary reaction cleaning step of cleaning the reaction region with a cleaning liquid after the secondary reaction step; A secondary reaction measurement liquid filling step for filling the reaction region with the measurement liquid after the secondary reaction washing step; In the secondary reaction measurement liquid filling step, it is preferable that the measurement liquid is not supplied until it reaches the liquid mixing section provided on the downstream side of the fine channel.
  • the measurement liquid is not supplied to the liquid mixing part in this way, the influence of non-specific adsorption is reduced from the above, and measurement accuracy in target measurement contained in a low concentration sample liquid is improved.
  • the repeatability of target measurement can be improved.
  • the measurement liquid is not supplied to the liquid mixing part, the amount of the measurement liquid can be reduced compared to the case where the measurement liquid is supplied to the liquid mixing part, and the cost required for the measurement liquid is reduced, and the measurement liquid is fed. It is possible to shorten the time required for the operation.
  • an antigen detection method using the sandwich-immunoassay method of the present invention includes: It is preferable that the sample liquid, the labeling liquid, the cleaning liquid, and the measurement liquid are supplied by reciprocating liquid using a pipette through the liquid discharge / suction unit. Use of a pipette in this way is preferable because it allows simple and accurate reciprocating liquid feeding.
  • an antigen detection method using the sandwich-immunoassay method of the present invention includes: It is preferable that the sample liquid, the labeling liquid, the cleaning liquid, and the measurement liquid supplied by the pipette are supplied to a predetermined position by adjusting the liquid amount.
  • the liquid can be reliably supplied to a predetermined position, the influence of non-specific adsorption can be reduced, and the target contained in a low concentration sample liquid in particular. While improving the measurement accuracy in measurement, it is possible to improve the repeatability of target measurement.
  • an antigen detection method using a SPFS apparatus equipped with a sensor chip for performing the antigen detection method of the present invention and a sandwich-immunoassay method will be described in detail.
  • the SPFS apparatus is an apparatus that can perform antigen detection or the like using surface plasmon excitation fluorescence spectroscopy (SPFS).
  • SPFS surface plasmon excitation fluorescence spectroscopy
  • the SPFS device 90 to which the sensor chip 10 for performing the antigen detection method of the present invention is attached first includes a dielectric member 12 and a metal formed on the upper surface of the dielectric member 12. It has at least a thin film 14 and a fine channel constituting member 20 provided on the metal thin film 14.
  • the sensor chip 10 has a fine flow path 22 formed on the metal thin film 14 by the fine flow path constituting member 20, and a liquid discharge is provided upstream of the fine flow path 22. / A suction unit 30 is provided, and a liquid mixing unit 40 is further provided on the downstream side.
  • the upper surfaces of the liquid discharge / suction unit 30 and the liquid mixing unit 40 are sealed by hermetic seals 32, 32.
  • the hermetic seal 32 is pierced by the tip of the pipette 70. It is comprised so that a liquid can be supplied to.
  • the material of the metal thin film 14 of the sensor chip 10 is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, more preferably gold, and an alloy of these metals. It consists of Such a metal is suitable for the metal thin film 14 because it is stable against oxidation and the electric field enhancement due to the dense wave (surface plasmon) becomes large.
  • examples of the method for forming the metal thin film 14 include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like.
  • the sputtering method and the vapor deposition method are preferable because the thin film formation conditions can be easily adjusted.
  • the thickness of the metal thin film 14 ranges from gold: 5 to 500 nm, silver: 5 to 500 nm, aluminum: 5 to 500 nm, copper: 5 to 500 nm, platinum: 5 to 500 nm, and alloys thereof: 5 to 500 nm. It is preferable to be within.
  • the thickness of the metal thin film 14 is within the above range, close-packed waves (surface plasmons) are easily generated, which is preferable.
  • the size (length ⁇ width) of the metal thin film 14 is not particularly limited as long as it is at least formed between the dielectric member 12 and the reaction region 16.
  • metal thin film 14 in a line shape from one end to the other end of the dielectric member 12 on at least a part of the upper surface of the dielectric member 12 makes it possible to easily form the metal thin film 14 with a uniform thickness. preferable.
  • the dielectric member 12 various optically transparent inorganic substances, natural polymers, and synthetic polymers can be used. From the viewpoint of chemical stability, manufacturing stability, and optical transparency, silicon dioxide (SiO 2). 2 ) or titanium dioxide (TiO 2 ).
  • the shape of the dielectric member 12 is not limited to a hexahedron having a substantially trapezoidal cross section (a truncated quadrangular pyramid shape).
  • a quadrangular pyramid, a cone, a triangular pyramid, a polygonal pyramid, etc. It may be a pyramid shape or a truncated pyramid shape. If the dielectric member 12 has a truncated quadrangular pyramid shape, the height of the sensor chip 10 can be kept low, which can contribute to the miniaturization of the SPFS device 90.
  • an adhesive having the same optical refractive index as that of the dielectric member 12, a matching oil, a transparent adhesive sheet, or the like it is preferable to use an adhesive having the same optical refractive index as that of the dielectric member 12, a matching oil, a transparent adhesive sheet, or the like.
  • the SPFS device 90 includes a light source 50 that is incident on the dielectric member 12 and irradiates the excitation light 56 toward the metal thin film 14 on the dielectric member 12 side of the sensor chip 10 thus configured.
  • a light receiving means 60 for receiving the reflected light 58 irradiated from the light source 50 and reflected by the metal thin film 14 is provided.
  • the excitation light 56 emitted from the light source 50 is preferably a laser beam, and an LD laser having a wavelength of 200 to 900 nm and 0.001 to 1,000 mW, or a semiconductor laser having a wavelength of 230 to 800 nm and 0.01 to 100 mW is suitable. .
  • the excitation light 56 emitted from the light source 50 is preferably polarized by the polarizing plate 54, and the polarized excitation light 56 is preferably applied to the metal thin film 14 via the mirror 52.
  • the polarizing plate 54 and the mirror 52 are not used, and the polarizing plate 54 and the mirror 52 may be appropriately selected according to the size and structure of the apparatus.
  • a light detection means 66 for receiving the fluorescence 62 generated in the reaction region 16 is provided on the fine flow path component 20 side of the sensor chip 10.
  • a light detection means 66 it is preferable to use an ultrasensitive photomultiplier tube or a CCD image sensor capable of multipoint measurement.
  • a wavelength selection function member 64 formed so as to select only the fluorescence 62 in the light is provided between the fine flow path constituting member 20 of the sensor chip 10 and the light detection means 66.
  • an optical filter As the wavelength selection function member 64, an optical filter, a cut filter, or the like can be used.
  • the optical filter include a neutral density (ND) filter and a diaphragm lens.
  • the cut filter includes external light (illumination light outside the device), excitation light (excitation light transmission component), stray light (excitation light scattering component in various places), and plasmon scattering light (excitation light originated from the sensor)
  • a filter that removes various types of noise light such as scattered light generated by the influence of adhered matter attached to the surface of the chip 10) and autofluorescence of the enzyme fluorescent substrate, such as an interference filter and a color filter.
  • an antigen-capturing antibody that specifically adsorbs to a target antigen is immobilized in advance on the reaction region 16 on the metal thin film 14 of the sensor chip 10.
  • a sample liquid 74 containing a target antigen is allowed to flow into the microchannel 22 to cause the antigen-capturing antibody to capture the target antigen (primary reaction).
  • the sample liquid 74 containing the target antigen include blood, serum, plasma, urine, nasal fluid, saliva, feces, body cavity fluid (spinal fluid, ascites, pleural effusion, and the like).
  • the target antigen is, for example, a nucleic acid (DNA, RNA, polynucleotide, oligonucleotide, PNA (peptide nucleic acid), etc., which may be single-stranded or double-stranded, or nucleoside, nucleotide and the like.
  • Modified molecules proteins (polypeptides, oligopeptides, etc.), amino acids (including modified amino acids), carbohydrates (oligosaccharides, polysaccharides, sugar chains, etc.), lipids, or their modified molecules, complexes, etc.
  • it may be a carcinoembryonic antigen such as AFP ( ⁇ -fetoprotein), a tumor marker, a signaling substance, a hormone, or the like, and is not particularly limited.
  • the inside of the fine channel 22 is further washed with the washing liquid 76, and the labeling solution 80 containing the labeled antibody captured by the target antigen is placed in the fine channel 22.
  • the target antigen captured by the antigen capturing antibody is labeled with the labeled antibody (secondary reaction).
  • the labeled antibody for labeling the target antigen is preferably a fluorescent substance that emits fluorescence 62 by being excited by irradiating predetermined excitation light 56 or using a field effect.
  • the fluorescence 62 in the present specification includes various types of light emission such as phosphorescence.
  • the inside of the fine channel 22 is washed with the washing solution 82, and this time, the inside of the fine channel 22 is filled with the measuring solution 84.
  • the excitation light 56 enters the dielectric member 12 from the light source 50.
  • the excitation light 56 is incident on the metal thin film 14 at a specific angle (resonance angle ⁇ ), whereby a dense wave (surface plasmon) can be generated on the metal thin film 14.
  • an angle variable unit (not shown), a computer (not shown) for processing information input to the light detection means 66, and the like may be provided.
  • the angle variable unit (not shown) synchronizes the light receiving means 60 and the light source 50 in order to obtain the total reflection attenuation (ATR) condition with a servo motor, and allows an angle change of 45 to 85 °, with a resolution of It is preferable that it is 0.01 degree or more.
  • the dense wave (surface plasmon) efficiently excites the fluorescent substance (labeled antibody) in the reaction region 16 on the metal thin film 14, thereby increasing the amount of fluorescence 62 emitted from the fluorescent substance, and this increased fluorescence 62.
  • the light detection means 66 via the wavelength selection function member 64, so that an antigen serving as a target with a very small amount and / or an extremely low concentration can be detected.
  • washing solution and the measurement solution in the present specification are not particularly limited as long as they do not inhibit each step of the sandwich-immunoassay method.
  • both the washing solution and the measurement solution are the same buffer solution. Is used.
  • buffer solution for example, phosphate buffer solution, Tris buffer solution, citrate buffer solution, borate buffer solution, carbonate buffer solution and the like can be used.
  • a buffer containing a surfactant can be used.
  • 0.02% polyoxyethylene sorbitan monolaurate (trade name: Tween-20) -containing phosphate buffer (pH 7. 4) can be preferably used.
  • the SPFS device 90 of the present invention having such a configuration reduces the influence of non-specific adsorption by adjusting the supply amount of each liquid supplied to the reaction region 16 when using the sensor chip 10 described above. While improving the measurement accuracy in the target measurement contained in the low-concentration sample liquid 74, the repeatability of the target measurement is improved.
  • the antigen detection method using the sandwich-immunoassay method of the present invention will be described in detail.
  • the sensor chip 10 is provided with the liquid discharge / suction unit 30 on the upstream side of the microchannel 22 and the liquid mixing unit 40 on the downstream side. Further, a reaction region 16 is provided in the middle of the fine flow path 22, and an antigen capture antibody is fixed to the reaction region 16. The antigen-capturing antibody is fixed on the metal thin film 14 in the middle of the fine channel 22 in a state protected with a humectant (reagent). When the sensor chip 10 is used, the humectant ( The reagent is washed with the washing liquid 72 before use.
  • a humectant reagent
  • the liquid discharge / suction unit 30 provided on the upstream side of the micro flow path 22 has a hermetic seal 32 attached to the upper end, and when used, the hermetic seal 32 is pierced by the tip of the pipette 70, and the fine flow The liquid will be supplied into the passage 22. Therefore, the opening diameter of the liquid discharge / suction unit 30 is preferably set to be slightly larger than the outer diameter of the tip of the pipette 70 to be used.
  • a sample solution, a labeling solution, a cleaning solution, and a measuring solution are supplied by a reciprocating solution using the pipette 70 via the liquid discharge / suction unit 30.
  • a reciprocating solution using the pipette 70 is preferable because it allows simple and accurate reciprocating liquid feeding.
  • the liquid mixing unit 40 provided on the downstream side of the fine flow path 22 has a special form as shown in FIGS.
  • turbulent flow is generated in the liquid mixing unit 40, and when the sample liquid 74 containing the target antigen is supplied to the antigen capture antibody on the reaction region 16, the antigen-antibody reaction is favorably generated.
  • the detection of rare antigens contained in the sample liquid 74 at a low concentration it is important for improving detection accuracy.
  • the form of the liquid mixing unit 40 shown in FIGS. 3 and 4 is one of the embodiments, and the form is not particularly limited. In this embodiment, however, the gentle inclined surface 44 and the inclined surface 44 are used. A liquid mixing section 40 is formed on a standing surface 46 that stands continuously. When the liquid is supplied up to the liquid mixing unit 40, a good turbulent flow is generated.
  • a connection 42 is provided between the fine channel 22 and the liquid mixing unit 40, and the fine channel 22 and the liquid mixing unit 40 communicate with each other via the connection 42.
  • the connecting portion 42 has a structure in which turbulent flow does not occur even when liquid flows in. The antigen detection method using the sensor chip 10 having such a liquid mixing unit 40 is performed through the following steps.
  • the sensor chip 10 with the unsealed sealing seal 32 is prepared, and the sealing seal 32 on the liquid discharge / suction unit 30 side is pierced with the tip of the pipette 70.
  • the cleaning liquid 72 is supplied from the pipette 70 into the fine flow path 22.
  • the supply of the cleaning liquid 72 is for removing the humectant (reagent) protecting the antigen-capturing antibody in the reaction region 16.
  • it is not necessary to supply the cleaning liquid 72 until it reaches the liquid mixing section 40, and it may be supplied to the connection section 42. Note that when the cleaning liquid 72 is supplied into the fine flow path 22 by the pipette 70, reciprocal liquid feeding is performed via the liquid discharge / suction unit 30.
  • the cleaning liquid 72 is sucked with the pipette 70 to empty the fine flow path 22, and then, as shown in FIG. 5C, the sample liquid 74 containing the target antigen is discharged / aspirated. It supplies to the reaction area
  • the sample liquid 74 is supplied to the liquid mixing unit 40 so that the antigen-antibody reaction in the reaction region 16 is favorably performed.
  • the sample liquid 74 is reciprocated several times by the pipette 70, thereby generating turbulent flow in the liquid mixing unit 40, so that the target antigen is favorably applied to the antigen capture antibody in the reaction region 16 on the microchannel 22. Can be captured.
  • the cleaning liquid 76 is then pipetted through the liquid discharge / suction unit 30 as shown in FIG. 70 to the reaction zone 16 (primary reaction cleaning step).
  • the washing liquid 76 is reciprocated several times by the pipette 70 and supplied to the liquid mixing section 40, whereby non-specific adsorption remaining in the microchannel 22, the liquid mixing section 40, the connection section 42, etc.
  • the substance can be washed.
  • the measuring liquid 78 is then pipetted via the liquid discharge / suction unit 30 as shown in FIG.
  • the reaction region 16 is filled with the measurement liquid 78 by supplying the fine flow path 22 into the flow path 70. At this time, it is preferable to keep the measurement liquid 78 flowing into the connection portion 42 (primary reaction measurement liquid filling step).
  • the resonance angle ⁇ is scanned by irradiating the metal thin film 14 of the sensor chip 10 with the excitation light 56 from the light source 50 and adjusting the irradiation angle in a state where the measurement liquid 78 fills the reaction region 16. Further, in this state, the reaction region 16 is detected by the light detection means 66, whereby fluorescence measurement in a blank state before the secondary reaction is performed.
  • the pipette 70 sucks the measurement liquid 78 in the fine flow path 22 to empty the fine flow path 22, and this time, as shown in FIG.
  • the liquid 80 is supplied into the fine flow path 22 by the pipette 70 through the liquid discharge / suction unit 30, and the reaction region 16 is filled with the labeling liquid 80.
  • the target captured by the antigen-capturing antibody is labeled with the labeled antibody (secondary reaction step).
  • the labeling liquid 80 is not supplied to the liquid mixing unit 40 but to be connected to the connection unit 42.
  • impurities in the sample liquid 74 that may remain on the inclined surface 44 or the like of the liquid mixing unit 40 will flow back to the reaction region 16, and the labeled antibody in the labeling solution 80 will flow into the liquid mixing unit.
  • the remaining labeled antibody flows back to the reaction region 16. Can be prevented.
  • the labeling liquid 80 is not supplied to the connection portion 42 but is kept to the downstream end portion of the fine flow path 22, further to the reaction region 16.
  • bubbles may remain in the fine flow path 22 if it stays at the downstream end of the fine flow path 22 or the reaction region 16. It is desirable to make it reach.
  • the cleaning liquid 82 is then pipetted through the liquid discharge / suction unit 30 as shown in FIG. 70 is supplied into the fine flow path 22, the reaction region 16 is filled with the cleaning solution 82, and the reaction region 16 is cleaned by repeating the reciprocating solution multiple times with the pipette 70 (secondary reaction cleaning step).
  • the cleaning liquid 82 is allowed to flow into the connection portion 42 and not to the liquid mixing portion 40.
  • the cleaning liquid 82 can peel and remove the non-specifically adsorbed substance in the flow path by the surfactant contained therein, the non-specific adsorption as described above may newly occur together with the cleaning liquid 82. Although the performance is low, the possibility can be fundamentally excluded if the cleaning liquid 82 is not supplied to the liquid mixing section 40.
  • the cleaning liquid 82 is not supplied to the liquid mixing unit 40, the amount of the cleaning liquid 82 can be reduced compared with the case where the cleaning liquid 82 is supplied to the liquid mixing unit 40, and the cost required for the cleaning liquid 82 is reduced. The time required for liquid feeding can be shortened.
  • the measurement liquid 84 is then pipetted through the liquid discharge / suction unit 30 as shown in FIG.
  • the reaction area 16 is filled with the measurement liquid 84 by supplying the fine flow path 22 at 70. At this time, it is preferable to keep the measurement liquid 84 flowing into the connecting portion 42 (secondary reaction measurement liquid filling step).
  • the measurement liquid 84 is not supplied to the liquid mixing unit 40, impurities in the sample liquid 74 remaining in the liquid mixing unit 40 during the primary reaction step are transferred from the liquid mixing unit 40 together with the measurement liquid 84. There is no return to the reaction region 16. In this way, by further reducing the influence of non-specific adsorption, it is possible to improve the measurement accuracy in the target measurement particularly contained in the low-concentration sample liquid 74 and to improve the repeatability of the target measurement.
  • the measurement liquid 84 is not supplied to the liquid mixing unit 40, the amount of the measurement liquid 84 can be reduced and the cost required for the measurement liquid 84 can be reduced compared to the case where the measurement liquid 84 is supplied to the liquid mixing unit 40.
  • the time required for feeding the measurement liquid 84 can be shortened. Thereby, the preparation until the antigen detection by the SPFS device 90 is completed.
  • the fluorescence 62 in the reaction region 16 is measured by the light detection means 66, and the measured value in the blank state that has been measured in advance is subtracted from the actual measurement value, whereby the true antigen due to the target antigen is detected. Measurement values can be obtained with high accuracy.
  • the present antigen detection method adjusts the supply amount of the labeling liquid 80 supplied to the reaction region 16 particularly in the secondary reaction step so that the labeling liquid 80 does not reach the liquid mixing unit 40.
  • the influence of non-specific adsorption can be reduced, and the measurement accuracy of target measurement contained in a low concentration sample liquid can be improved.
  • the sample liquid 74, the labeling liquid 80, the cleaning liquids 72, 76, 82, and the measurement liquids 78, 84 performed by a pipette are supplied to a predetermined position by adjusting the liquid amount.
  • the capacity to the flow path (at least a part of the liquid discharge / suction part 30 and the fine flow path 22) + the connection part 42 is about 40 ⁇ l, and the flow path (at least a part of the liquid discharge / suction part 30 and the fine flow path 22).
  • the liquid supply amount suitable for the connection part 42 is 25 ⁇ l to 40 ⁇ l
  • the particularly suitable liquid supply amount is 33 ⁇ l
  • the liquid supply amount suitable for the liquid mixing unit 40 is adjusted to 50 ⁇ l to 300 ⁇ l, and the particularly suitable liquid supply amount is adjusted to 85 ⁇ l so that the liquid is supplied to these positions.
  • the liquid can be reliably supplied to the predetermined position, the influence of non-specific adsorption is reduced, and it is contained in the low concentration sample liquid 74 in particular. While improving the measurement accuracy in the target measurement, it is possible to improve the repeatability of the target measurement. Further, the operation of the pipette 70 is easy, and anyone can reliably supply the liquid to a predetermined position.
  • the labeling solution 80 is not supplied until reaching the liquid mixing unit 40, and thus occurs when the labeling solution 80 is supplied to the liquid mixing unit 40.
  • Impurities in the sample liquid 74 remaining in the liquid mixing unit 40 during the primary reaction step return to the reaction region 16 from the liquid mixing unit 40 together with the labeling solution 80 and cause nonspecific adsorption.
  • the labeled antibody in the labeling liquid 80 remaining in the liquid mixing unit 40 during the secondary reaction process supplies the cleaning liquid 82 to the liquid mixture 40 in the subsequent secondary reaction cleaning process.
  • the reaction area from the liquid mixing section 40 6 is no longer would cause nonspecific adsorption back to.
  • the cleaning liquid 76 is delivered to the liquid mixing unit 40, so that the remaining impurities (non-specifically adsorbed) are In a measurement system such as SPFS that can measure a small amount of target with high sensitivity, a slight amount of impurities greatly affects the measurement result.
  • the labeling liquid 80 is not supplied to the liquid mixing unit 40, the amount of the labeling liquid 80 in the secondary reaction step can be reduced compared to the case where the labeling liquid 80 is supplied to the liquid mixing unit 40. It is possible to reduce the required cost and shorten the time required for feeding the labeling solution 80.
  • the present invention is not limited to the above-described embodiment.
  • the liquid mixing unit 40 and the connection unit 42 are different in form.
  • the cleaning liquid and the measurement liquid may be separate components.
  • the liquid may be supplied using a reciprocating pump (not shown) instead of the pipette 70.

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Abstract

抗原捕捉抗体が固定された反応領域を設けた微細流路、その上流側には液体吐出／吸引部、下流側には液体混合部を設けたセンサチップを用意し、試料液を供給して前記抗原捕捉抗体に前記ターゲットを捕捉させる１次反応工程と、前記１次反応工程の後、前記微細流路内に標識抗体を含有する標識液を流入させ、前記抗原捕捉抗体に捕捉された前記ターゲットを標識する２次反応工程を行い、該工程において反応領域に供給される標識液の送液量を調整して液体混合部に標識液が至らないようにすることによって、非特異吸着の影響を軽減し、特に低濃度の試料液中に含まれるターゲット測定の測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることのできるサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法を提供する。

Description

サンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法
　本発明は、サンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法においてターゲットとなる抗原を精度良く検出することのできる抗原検出方法に関する。
　生化学検査において抗原抗体反応などの生化学反応が利用される。これらの生化学検査は微細流路が形成されたセンサチップを用いて行われている。センサチップにおいては、例えば抗原捕捉抗体が微細流路途中の内面に固定され、ターゲットとなる抗原を含む試料液が、この微細流路内へ供給され、試料液に含まれる抗原と抗原捕捉抗体とが結合させられる。
　抗原捕捉抗体への抗原の結合有無や結合量などは、試料液が微細流路に供給された後、洗浄液，標識液（蛍光標識液）などの試料液以外の液体が微細流路内へ供給されることにより、表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）により計測される。
　なお多くの場合において、液体は微細流路の上流側に設けられた液体吐出／吸引部を介し、ピペットを用いて吐出／吸引される。また微細流路の下流側には液体混合部が設けられ、ここで例えば液体に乱流を生じさせるようにし、抗原捕捉抗体への抗原の結合などを確実なものとしている（例えば特許文献１）。
特開２０１３－１８５９６７号公報
　ところでこのような生化学反応においては、試料液中の不純物（ターゲットとなる抗原以外のタンパク質等）や標識液中の標識抗体などによる非特異吸着の影響により、正確な測定ができないことが知られており、特に低濃度の試料液において、この非特異吸着の影響を大きく受け、測定値の信頼性低下に繋がるおそれがある。
　センサチップを用いる生化学反応では、流路（液体吐出／吸引部，微細流路，液体混合部など）内に残存する液体を完全に回収することは難しく、特に液体混合部（液だまり）を有するような複雑な形状では尚更難しい。
　さらに、流路内に残存する液体の量は常に一定ではなく、測定毎に残存量が異なる可能性が高い。このように液体の残存量が測定毎に異なると、非特異吸着量も測定毎に異なり、特に低濃度の試料液中に含まれるターゲット測定において、繰り返し再現性に悪影響を与えてしまう問題がある。
　本発明はこのような現状に鑑み、非特異吸着の影響を軽減し、特に低濃度の試料液中に含まれるターゲット測定の測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることのできるサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法を提供することを目的とする。
　上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法は、以下を有する。
　少なくとも微細流路の途中に、抗原捕捉抗体が固定されてなる反応領域が設けられるとともに、前記微細流路の上流側には液体吐出／吸引部を備え、下流側には液体混合部が設けられたセンサチップを用意し、前記センサチップの前記反応領域にターゲットとなる抗原を含有する試料液を供給して前記抗原捕捉抗体に前記ターゲットを捕捉させる１次反応工程と、
　前記１次反応工程の後、前記微細流路内に標識抗体を含有する標識液を流入させ、前記抗原捕捉抗体に捕捉された前記ターゲットを標識する２次反応工程と、
　前記２次反応工程で前記ターゲットを標識した標識抗体より得られるシグナルを測定するシグナル測定工程と、
　を少なくとも有するサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法であって、
　前記１次反応工程において、
　前記反応領域にターゲットとなる抗原を含有する試料液を供給する際には、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記試料液を供給するようにし、
　前記２次反応工程において、
　前記抗原捕捉抗体に前記ターゲットとなる抗原が捕捉された反応領域に、前記標識液を供給する際には、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記標識液を供給しないようにする。
　本発明によれば、２次反応工程において、反応領域に供給される標識液の送液量を調整して液体混合部に標識液が至らないようにすることにより、非特異吸着の影響を軽減し、特に低濃度の試料液中に含まれるターゲット測定の測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることのできるサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法を提供することができる。
図１は、本発明の抗原検出方法を行うセンサチップが取り付けられたＳＰＦＳ装置である。 図２は、本発明の抗原検出方法を行うセンサチップである。 図３は、図２に示したセンサチップの縦断面図である。 図４は、図３に示したセンサチップの縦断面図の液体混合部を拡大して示した要部拡大図である。 図５は、本発明の抗原検出方法を説明するための工程図である。 図６は、本発明の抗原検出方法を説明するための工程図である。 図７は、本発明の抗原検出方法を説明するための工程図である。
　以下、本発明の実施の形態について、図面に基づいてより詳細に説明する。
　本発明は、サンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法においてターゲットとなる抗原を精度良く検出することのできる抗原検出方法に関するものである。
　なお、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法においては、実施例の一つとして、以下の方法を用いることができる。
　すなわち、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法は、
　少なくとも微細流路の途中に、抗原捕捉抗体が固定されてなる反応領域が設けられるとともに、前記微細流路の上流側には液体吐出／吸引部を備え、下流側には液体混合部が設けられたセンサチップを用意し、前記センサチップの前記反応領域にターゲットとなる抗原を含有する試料液を供給して前記抗原捕捉抗体に前記ターゲットを捕捉させる１次反応工程と、
　前記１次反応工程の後、前記微細流路内に標識抗体を含有する標識液を流入させ、前記抗原捕捉抗体に捕捉された前記ターゲットを標識する２次反応工程と、
　前記２次反応工程で前記ターゲットを標識した標識抗体より得られるシグナルを測定するシグナル測定工程と、
　を少なくとも有するサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法であって、
　前記１次反応工程において、
　前記反応領域にターゲットとなる抗原を含有する試料液を供給する際には、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記試料液を供給するようにし、
　前記２次反応工程において、
　前記抗原捕捉抗体に前記ターゲットとなる抗原が捕捉された反応領域に、前記標識液を供給する際には、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記標識液を供給しないようにする。
　このような抗原検出方法であれば、２次反応工程において、標識液を液体混合部に至るまで供給しないため、標識液を液体混合部まで供給した場合に生じていた、（１）１次反応工程の際に液体混合部に残存した試料液中の不純物が、標識液とともに液体混合部から反応領域に戻って非特異的吸着を起こしてしまうことや、（２）この２次反応工程の際に液体混合部に残存した標識液中の標識抗体が、続いて行われる、２次反応洗浄工程において洗浄液を液体混合物まで供給した場合、および／または２次反応測定液充填工程において測定液を液体混合部まで供給した場合に、それらの洗浄液および／または測定液とともに、液体混合部から反応領域に戻って非特異的吸着を起こしてしまうことがなくなる。
　特に（１）について、１次反応工程後に行われる１次反応洗浄工程では、洗浄液を液体混合部にまで送達させるため、そこに残存している（非特異的吸着している）不純物はわずかではあるが、少量のターゲットを高感度で測定することができるＳＰＦＳ等の測定系においては、そのわずかな不純物が測定結果に大きな影響を及ぼす。
　上記のようにして不純物や標識抗体の非特異吸着の影響を軽減することにより、抗原検出時における誤検出を生じさせるなどの信頼性低下を防止することができ、特に低濃度の試料液に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　また標識液を液体混合部まで供給しないため、標識液を液体混合部まで供給した場合に比べ、２次反応工程における標識液の液量を減らすことができ、標識液に要するコストを抑えるとともに、標識液の送液にかかる時間を短縮化することができる。
　また、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法は、
　前記２次反応工程の後、前記反応領域を洗浄液で洗浄する２次反応洗浄工程を有し、
　前記２次反応洗浄工程において、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記洗浄液を供給しないことが好ましい。
　このように洗浄液を液体混合部に至るまで供給しなければ、１次反応工程の際に液体混合部に残存した試料液中の不純物が、洗浄液とともに液体混合部から反応領域に戻って非特異的吸着を起こしてしまうことがなくなる。
　洗浄液はそこに含まれる界面活性剤等により流路内に非特異的に吸着した物質を剥離して除去することができるから、上記のような非特異的吸着が洗浄液とともに新たに起きる可能性は低いものの、洗浄液を液体混合部に至るまで供給しなければその可能性を根本的に排除することができる。
　このようにして非特異吸着の影響をより一層軽減することにより、特に低濃度の試料液に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　さらに洗浄液を液体混合部まで供給しないため、洗浄液を液体混合部まで供給した場合に比べ、洗浄液の液量を減らすことができ、洗浄液に要するコストを抑えるとともに、洗浄液の送液にかかる時間を短縮化することができる。
　また、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法は、
　前記２次反応洗浄工程の後、前記反応領域を測定液で満たす２次反応測定液充填工程を有し、
　前記２次反応測定液充填工程において、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記測定液を供給しないことが好ましい。
　このように測定液を液体混合部に至るまで供給しなければ、１次反応工程の際に液体混合部に残存した試料液中の不純物が、測定液とともに液体混合部から反応領域に戻ってしまうことがなくなる。このようにして非特異吸着の影響をより一層軽減することにより、特に低濃度の試料液に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　さらに測定液を液体混合部まで供給しないため、測定液を液体混合部まで供給した場合に比べ、測定液の液量を減らすことができ、測定液に要するコストを抑えるとともに、測定液の送液にかかる時間を短縮化することができる。
　また、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法は、
　前記２次反応工程の後、前記反応領域を洗浄液で洗浄する２次反応洗浄工程と、
　前記２次反応洗浄工程の後、前記反応領域を測定液で満たす２次反応測定液充填工程と、を有し、
　前記２次反応測定液充填工程において、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記測定液を供給しないことが好ましい。
　このように測定液を液体混合部に至るまで供給しなければ、前述したようなことから非特異吸着の影響を軽減し、特に低濃度の試料液に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　さらに測定液を液体混合部まで供給しないため、測定液を液体混合部まで供給した場合に比べ、測定液の液量を減らすことができ、測定液に要するコストを抑えるとともに、測定液の送液にかかる時間を短縮化することができる。
　また、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法は、
　前記試料液，前記標識液，前記洗浄液，前記測定液の供給が、前記液体吐出／吸引部を介してピペットを用いて往復送液により行われることが好ましい。
　このようにピペットを用いれば、簡単かつ精度良く往復送液ができ好ましい。
　また、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法は、
　前記ピペットによって行われる前記試料液，前記標識液，前記洗浄液，前記測定液の供給が、液量の調整により所定の位置まで供給されることが好ましい。
　このように液量の調整によって供給位置を変えるようにすれば、確実に液体を所定の位置に供給することができ、非特異吸着の影響を軽減し、特に低濃度の試料液に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　以下、本発明の抗原検出方法を行うセンサチップが取り付けられたＳＰＦＳ装置とサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法について詳細に説明する。
　まず、本発明の抗原検出方法を行うセンサチップが取り付けられたＳＰＦＳ装置について説明する。ＳＰＦＳ装置は、表面プラズモン励起蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いて抗原検出などを行うことのできる装置である。
＜ＳＰＦＳ装置９０＞
　図１に示したように、本発明の抗原検出方法を行うセンサチップ１０が取り付けられたＳＰＦＳ装置９０は、まずセンサチップ１０が誘電体部材１２と、誘電体部材１２の上面に形成された金属薄膜１４と、この金属薄膜１４上に設けられた微細流路構成部材２０と、を少なくとも有している。
　センサチップ１０は、図２に示したように、微細流路構成部材２０によって、金属薄膜１４上に微細流路２２を形成しており、またこの微細流路２２の上流側には、液体吐出／吸引部３０が設けられ、さらに下流側には液体混合部４０が設けられている。
　液体吐出／吸引部３０と液体混合部４０の上面は、密閉シール３２，３２によって封止されており、ＳＰＦＳ装置９０の使用に際して密閉シール３２をピペット７０の先端で突き破ることで微細流路２２内に液体を供給することができるよう構成されている。
　センサチップ１０の金属薄膜１４の材質としては、好ましくは金，銀，アルミニウム，銅，および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは金からなり、さらにこれら金属の合金からなることである。このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ粗密波（表面プラズモン）による電場増強が大きくなることから金属薄膜１４に好適である。
　また、金属薄膜１４の形成方法としては、例えばスパッタリング法，蒸着法（抵抗加熱蒸着法，電子線蒸着法など），電解メッキ，無電解メッキ法などが挙げられる。中でもスパッタリング法，蒸着法は、薄膜形成条件の調整が容易であるため好ましい。
　さらに金属薄膜１４の厚さとしては、金：５～５００ｎｍ、銀：５～５００ｎｍ、アルミニウム：５～５００ｎｍ、銅：５～５００ｎｍ、白金：５～５００ｎｍ、およびそれらの合金：５～５００ｎｍの範囲内であることが好ましい。
　電場増強効果の観点からは、金：２０～７０ｎｍ、銀：２０～７０ｎｍ、アルミニウム：１０～５０ｎｍ、銅：２０～７０ｎｍ、白金：２０～７０ｎｍ、およびそれらの合金：１０～７０ｎｍの範囲内であることがより好ましい。
　金属薄膜１４の厚さが上記範囲内であれば、粗密波（表面プラズモン）が発生し易く好適である。また、金属薄膜１４の大きさ（縦×横）は誘電体部材１２と反応領域１６との間に少なくとも形成されていれば特に限定されないものである。
　なお、誘電体部材１２の上面の少なくとも一部に、誘電体部材１２の一端から他端までライン状に金属薄膜１４を形成することが、金属薄膜１４を一様な厚さで簡易に形成でき好ましい。
　一方、誘電体部材１２としては、光学的に透明な各種の無機物，天然ポリマー，合成ポリマーを用いることができ、化学的安定性，製造安定性および光学的透明性の観点から、二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）または二酸化チタン（ＴｉＯ2）を含むことが好ましい。
　誘電体部材１２の形状は、図２に示したように、断面略台形形状の六面体（截頭四角錐形状）に限定されるものではなく、例えば四角錐，円錐，三角錐，多角錐などの角錐形状、または截頭角錐形状などであっても良いものである。誘電体部材１２が截頭四角錐形状であれば、センサチップ１０の高さを低く抑えることができ、ＳＰＦＳ装置９０の小型化に寄与することができる。
　さらに、金属薄膜１４上に微細流路構成部材２０を固定する方法としては、誘電体部材１２と同じ光屈折率を有する接着剤,マッチングオイル，透明粘着シートなどを用いることが好ましい。
　ＳＰＦＳ装置９０は、このようにして構成されるセンサチップ１０の誘電体部材１２側に、誘電体部材１２内に入射され、金属薄膜１４に向かって励起光５６を照射する光源５０を備え、さらに光源５０から照射され金属薄膜１４に反射した反射光５８を受光する受光手段６０が備えられている。
　光源５０から照射される励起光５６としてはレーザ光が好ましく、波長２００～９００ｎｍ、０．００１～１，０００ｍＷのＬＤレーザ、または波長２３０～８００ｎｍ、０．０１～１００ｍＷの半導体レーザが好適である。
　なお、光源５０から照射された励起光５６は偏光板５４によって偏光されることが好ましく、この偏光された励起光５６を、ミラー５２を介して金属薄膜１４に照射するようにすることが好ましい。但し、偏光板５４やミラー５２を用いなくとも機能的に問題はなく、これら偏光板５４やミラー５２は、装置の大きさや構造に合わせて適宜選択して設ければ良いものである。
　一方、センサチップ１０の微細流路構成部材２０側には、反応領域１６で生じた蛍光６２を受光する光検出手段６６が設けられている。
　このような光検出手段６６としては、超高感度の光電子増倍管、または多点計測が可能なＣＣＤイメージセンサを用いることが好ましい。
　ここで、センサチップ１０の微細流路構成部材２０と光検出手段６６との間には、光の内で蛍光６２のみを選択するように形成された波長選択機能部材６４を備えることが好ましい。
　波長選択機能部材６４としては、光学フィルタ，カットフィルタなどを用いることができる。光学フィルタとしては、減光（ＮＤ）フィルタ，ダイアフラムレンズなどが挙げられる。さらにカットフィルタとしては、外光（装置外の照明光），励起光（励起光の透過成分），迷光（各所での励起光の散乱成分），プラズモンの散乱光（励起光を起源とし、センサチップ１０の面に付着した付着物などの影響で発生する散乱光），酵素蛍光基質の自家蛍光などの各種ノイズ光を除去するフィルタであって、例えば干渉フィルタ，色フィルタなどが挙げられる。
　このようにして構成されるＳＰＦＳ装置９０は、その使用において、まずセンサチップ１０の金属薄膜１４上の反応領域１６にターゲットとなる抗原と特異的に吸着する抗原捕捉抗体を予め固定しておき、この状態でターゲットとなる抗原を含有してなる試料液７４を微細流路２２内に流入させて抗原捕捉抗体にターゲットとなる抗原を捕捉させる（１次反応）。
　ここでターゲットとなる抗原を含有する試料液７４としては、血液，血清，血漿，尿，鼻孔液，唾液，便，体腔液（髄液，腹水，胸水等）などが挙げられる。
　また、ターゲットとなる抗原は、例えば、核酸（一本鎖であっても二本鎖であってもよいＤＮＡ，ＲＮＡ，ポリヌクレオチド，オリゴヌクレオチド，ＰＮＡ（ペプチド核酸）等、またはヌクレオシド，ヌクレオチドおよびそれらの修飾分子），タンパク質（ポリペプチド、オリゴペプチド等），アミノ酸（修飾アミノ酸も含む。），糖質（オリゴ糖，多糖類，糖鎖等），脂質，またはこれらの修飾分子，複合体などが挙げられ、具体的には、ＡＦＰ（αフェトプロテイン）等のがん胎児性抗原や腫瘍マーカー，シグナル伝達物質，ホルモンなどであってもよく、特に限定されない。
　抗原捕捉抗体にターゲットとなる抗原を捕捉させた後、さらに微細流路２２内を洗浄液７６で洗浄し、ターゲットとなる抗原に捕捉される標識抗体を含有する標識液８０を微細流路２２内に流入させることにより、抗原捕捉抗体に捕捉されたターゲットとなる抗原が、標識抗体で標識された状態とする（２次反応）。
　ターゲットとなる抗原を標識する標識抗体としては、所定の励起光５６を照射するか、または電界効果を利用することで励起し、蛍光６２を発する蛍光物質であることが好ましい。なお本明細書でいう蛍光６２とは、燐光など各種の発光も含まれるものである。
　この標識液８０を排出した後、微細流路２２内を洗浄液８２で洗浄し、今度は微細流路２２内を測定液８４で満たし、この状態で光源５０より誘電体部材１２内に励起光５６を照射し、この励起光５６が特定の角度（共鳴角θ）で金属薄膜１４に入射することで、金属薄膜１４上に粗密波（表面プラズモン）を生ずるようにすることができる。
　なお、金属薄膜１４上に粗密波（表面プラズモン）が生ずる際には、励起光５６と金属薄膜１４中の電子振動とがカップリングし、反射光５８のシグナルが変化（光量が減少）することとなるため、受光手段６０で受光される反射光５８のシグナルが変化（光量が減少）する地点を見つければ良い。
　ここで共鳴角θの調整のために、角度可変部（図示せず）や光検出手段６６に入力された情報を処理するためのコンピュータ（図示せず）などを有しても良い。なお、角度可変部（図示せず）は、サーボモータで全反射減衰（ＡＴＲ）条件を求めるために受光手段６０と光源５０とを同期し、４５～８５°の角度変更を可能とし、分解能が０．０１°以上であることが好ましい。
　そしてこの粗密波（表面プラズモン）により、金属薄膜１４上の反応領域１６の蛍光物質（標識抗体）が効率良く励起され、これにより蛍光物質が発する蛍光６２の光量が増大し、この増大した蛍光６２を、波長選択機能部材６４を介して光検出手段６６で収集することで、極微量および／または極低濃度のターゲットとなる抗原を検出することができる。
　なお、本明細書中の洗浄液および測定液は、サンドイッチ－イムノアッセイ法の各工程を阻害しないものであれば特に限定されないものであるが、本実施形態では、洗浄液および測定液のいずれも同じ緩衝液が用いられる。
　緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸塩緩衝液、炭酸塩緩衝液等を用いることができる。洗浄効果を高めるために、界面活性剤を含有した緩衝液を用いることができ、例えば、０．０２％ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート(商品名：Ｔｗｅｅｎ－２０)含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を好適に用いることができる。
　このような構成を有する本発明のＳＰＦＳ装置９０は、上記したセンサチップ１０を用いる際、反応領域１６に供給する各液体の供給量を調整することで、非特異吸着の影響を軽減し、特に低濃度の試料液７４に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めるようにしている。
　以下、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法について詳細に説明する。
＜サンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法＞
　本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法においては、図２および図３に示したセンサチップ１０が用いられる。
　センサチップ１０は、上述したように微細流路２２の上流側に液体吐出／吸引部３０が設けられ、下流側に液体混合部４０が設けられている。また微細流路２２の途中には反応領域１６が設けられ、この反応領域１６に、抗原捕捉抗体が固定されている。なお、この抗原捕捉抗体は保湿剤（試薬）で保護された状態で予め微細流路２２の途中の金属薄膜１４上に固定されてなり、センサチップ１０を使用する際には、この保湿剤（試薬）を洗浄液７２で洗浄してから使用するようになっている。
　微細流路２２の上流側に設けられた液体吐出／吸引部３０は、上端に密閉シール３２が貼着されており、使用の際には、密閉シール３２をピペット７０の先端で突き破り、微細流路２２内に液体を供給することとなる。したがって、液体吐出／吸引部３０の開口径は、使用するピペット７０の先端部の外径よりも一回り大径に設定することが好ましい。
　本実施形態では、後述する試料液，標識液，洗浄液，測定液の供給が、液体吐出／吸引部３０を介して、ピペット７０を用いて往復送液により行われる。ピペット７０を用いれば、簡単かつ精度良く往復送液ができ好ましい。
　一方、微細流路２２の下流側に設けられた液体混合部４０は、図３および図４に示したように特殊な形態を有している。この形態は、液体混合部４０内で乱流を生じさせ、反応領域１６上の抗原捕捉抗体にターゲットとなる抗原を含む試料液７４を供給した際に、抗原抗体反応を良好に生じさせるためのものであり、特に試料液７４中に低濃度で含まれる希少な抗原の検出などにおいては検出精度を向上させる上で重要である。
　図３および図４に示した液体混合部４０の形態は実施形態の一つであり、特に形態が限定されるものではないが、本形態においては、なだらかな傾斜面４４とこの傾斜面４４から連続して立設する立設面４６において、液体混合部４０が形成されている。この液体混合部４０に至るまで液体が供給された際に良好な乱流が生ずるようになっている。
　なお、微細流路２２と液体混合部４０の間は接続部４２であり、この接続部４２を介して微細流路２２と液体混合部４０とが連絡するようになっている。なお、この接続部４２は、液体が流入しても乱流が生じない構造を有している。
　このような液体混合部４０を有するセンサチップ１０を用いた抗原検出方法は、以下の工程を経て行われる。
　まず、図５（ａ）に示したように、密閉シール３２が未開封のセンサチップ１０を用意し、液体吐出／吸引部３０側の密閉シール３２をピペット７０の先端で突き破る。
　そして図５（ｂ）に示したように、ピペット７０から洗浄液７２を微細流路２２内へ供給する。この洗浄液７２の供給は、反応領域１６の抗原捕捉抗体を保護している保湿剤（試薬）を除去するためのものである。このとき洗浄液７２は、液体混合部４０に至るまで供給する必要はなく、接続部４２まで供給すれば良い。なお、ピペット７０による微細流路２２内への洗浄液７２の供給時には、液体吐出／吸引部３０を介して往復送液が行われる。
　次いでこの洗浄液７２をピペット７０で吸引して微細流路２２内を空にした後、今度は図５（ｃ）に示したように、ターゲットとなる抗原を含有する試料液７４を液体吐出／吸引部３０を介してピペット７０で反応領域１６へ供給し、反応領域１６の抗原捕捉抗体にターゲットとなる抗原を捕捉させる（１次反応工程）。
　この際、反応領域１６での抗原抗体反応が良好に行われるよう、試料液７４は液体混合部４０まで供給される。試料液７４は、ピペット７０によって複数回往復送液されることにより、液体混合部４０で乱流を生じ、微細流路２２上の反応領域１６の抗原捕捉抗体に、ターゲットとなる抗原を良好に捕捉させることができる。
　次いで、この試料液７４をピペット７０で吸引して微細流路２２内を空にした後、今度は図６（ａ）に示したように、洗浄液７６を液体吐出／吸引部３０を介してピペット７０で反応領域１６へ供給する（１次反応洗浄工程）。
　この際、洗浄液７６はピペット７０によって複数回往復送液され、液体混合部４０に至るまで供給されることにより、微細流路２２内，液体混合部４０，接続部４２などに残存する非特異吸着物質を洗浄することができる。
　そして、この洗浄液７６をピペット７０で吸引して微細流路２２内を空にした後、今度は図６（ｂ）に示したように、測定液７８を液体吐出／吸引部３０を介してピペット７０で微細流路２２内へ供給し、反応領域１６を測定液７８で満たす。この時、測定液７８は、接続部４２まで流入させるに留めることが好ましい（１次反応測定液充填工程）。
　次いで、この測定液７８が反応領域１６を満たした状態で、センサチップ１０の金属薄膜１４に光源５０より励起光５６を照射し、照射角度を調整することにより、共鳴角θをスキャンする。
　さらにこの状態で、反応領域１６を光検出手段６６で検出することにより、２次反応前のブランク状態での蛍光測定が行われる。
　その後、ピペット７０にて、微細流路２２内の測定液７８を吸引して微細流路２２内を空にした後、今度は図６（ｃ）に示したように、標識抗体を含有する標識液８０を液体吐出／吸引部３０を介してピペット７０で微細流路２２内へ供給し、反応領域１６を標識液８０で満たす。これにより、抗原捕捉抗体に捕捉されたターゲットを標識抗体により標識する（２次反応工程）。
　なおこの際、標識液８０は、液体混合部４０に至るまで供給せず、接続部４２までに留めることが必要である。これにより、液体混合部４０の傾斜面４４などに残存している可能性のある試料液７４中の不純物が反応領域１６まで逆流してしまうこと、および標識液８０中の標識抗体が液体混合部４０の傾斜面４４などに残存してしまうこと（後の工程で洗浄液８２や測定液８４を液体混合部４０まで送達させる実施形態にした場合に、残存した標識抗体が反応領域１６まで逆流してしまうこと）を防止することができる。
　ここで、上記のような逆流や残存の防止のみを考慮すれば、標識液８０を接続部４２までも供給せず、微細流路２２の下流端部まで、さらに言えば反応領域１６までに留めておいても良いと考えられるが、微細流路２２の下流端部や反応領域１６までに留めてしまうと微細流路２２内に気泡が残存してしまうおそれがあるため、敢えて接続部４２まで到達するようにすることが望ましい。
　そして、この標識液８０をピペット７０で吸引して微細流路２２内を空にした後、今度は図７（ａ）に示したように、洗浄液８２を液体吐出／吸引部３０を介してピペット７０で微細流路２２内へ供給し、反応領域１６を洗浄液８２で満たし、ピペット７０で往復送液を複数回繰り返すことで、反応領域１６の洗浄を行う（２次反応洗浄工程）。
　この時、洗浄液８２は、接続部４２まで流入させるに留め、液体混合部４０までは流入させないようにする。
　このように洗浄液８２を液体混合部４０に至るまで供給しなければ、１次反応工程の際に液体混合部４０に残存した試料液７４中の不純物が、洗浄液８２とともに液体混合部４０から反応領域１６に戻って非特異的吸着を起こしてしまうことがなくなる。
　洗浄液８２はそこに含まれる界面活性剤等により流路内に非特異的に吸着した物質を剥離して除去することができるから、上記のような非特異的吸着が洗浄液８２とともに新たに起きる可能性は低いものの、洗浄液８２を液体混合部４０に至るまで供給しなければその可能性を根本的に排除することができる。
　このようにして非特異吸着の影響をより一層軽減することにより、特に低濃度の試料液７４に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　さらに洗浄液８２を液体混合部４０まで供給しないため、洗浄液８２を液体混合部４０まで供給した場合に比べ、洗浄液８２の液量を減らすことができ、洗浄液８２に要するコストを抑えるとともに、洗浄液８２の送液にかかる時間を短縮化することができる。
　そして、この洗浄液８２をピペット７０で吸引して微細流路２２内を空にした後、今度は図７（ｂ）に示したように、測定液８４を液体吐出／吸引部３０を介してピペット７０で微細流路２２内へ供給し、反応領域１６を測定液８４で満たす。この時、測定液８４は、接続部４２まで流入させるに留めることが好ましい（２次反応測定液充填工程）。
　このように測定液８４を液体混合部４０に至るまで供給しなければ、１次反応工程の際に液体混合部４０に残存した試料液７４中の不純物が、測定液８４とともに液体混合部４０から反応領域１６に戻ってしまうことがなくなる。このようにして非特異吸着の影響をより一層軽減することにより、特に低濃度の試料液７４に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　さらに測定液８４を液体混合部４０まで供給しないため、測定液８４を液体混合部４０まで供給した場合に比べ、測定液８４の液量を減らすことができ、測定液８４に要するコストを抑えるとともに、測定液８４の送液にかかる時間を短縮化することができる。
　これによりＳＰＦＳ装置９０による抗原検出までの準備が終了する。
　そして、この状態で光検出手段６６にて反応領域１６内の蛍光６２を測定し、この実測値から前もって測定しておいたブランク状態での測定値を減ずることにより、ターゲットとなる抗原による真の計測値が高精度に得られることとなる。
　このように本抗原検出方法は、特に２次反応工程において、反応領域１６に供給される標識液８０の供給量を調整して液体混合部４０に標識液８０が至らないようにすることにより、非特異吸着の影響を軽減し、特に低濃度の試料液中に含まれるターゲット測定の測定精度を向上させることができる。
　なお、本抗原検出方法において、ピペットによって行われる試料液７４、標識液８０、洗浄液７２，７６，８２、測定液７８，８４の供給は、液量の調整により所定の位置まで供給される。
　例えば、流路（少なくとも液体吐出／吸引部３０の一部と微細流路２２）＋接続部４２までの容量が約４０μｌ、流路（少なくとも液体吐出／吸引部３０の一部と微細流路２２）＋接続部４２＋液体混合部４０までの容量が約３５０μｌのセンサチップ１０であれば、接続部４２までに適した送液量が２５μｌ～４０μｌ、特に適した送液量が３３μｌであり、また液体混合部４０までに適した送液量が５０μｌ～３００μｌ、特に適した送液量が８５μｌに調整されることにより、これらの位置まで供給されるようにしている。
　このように液量の調整によって供給位置を変えるようにすれば、確実に液体を所定の位置に供給することができ、非特異吸着の影響を軽減し、特に低濃度の試料液７４に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　また、ピペット７０の操作も容易であり、誰でも確実に所定の位置へ液体を供給することができる。
　このように本発明の抗原検出方法によれば、２次反応工程において、標識液８０を液体混合部４０に至るまで供給しないため、標識液８０を液体混合部４０まで供給した場合に生じていた、（１）１次反応工程の際に液体混合部４０に残存した試料液７４中の不純物が、標識液８０とともに液体混合部４０から反応領域１６に戻って非特異的吸着を起こしてしまうことや、（２）この２次反応工程の際に液体混合部４０に残存した標識液８０中の標識抗体が、続いて行われる、２次反応洗浄工程において洗浄液８２を液体混合物４０まで供給した場合、および／または２次反応測定液充填工程において測定液７８を液体混合部４０まで供給した場合に、それらの洗浄液８２および／または測定液８４とともに、液体混合部４０から反応領域１６に戻って非特異的吸着を起こしてしまうことがなくなる。
　特に（１）について、１次反応工程後に行われる１次反応洗浄工程では、洗浄液７６を液体混合部４０にまで送達させるため、そこに残存している（非特異的吸着している）不純物はわずかではあるが、少量のターゲットを高感度で測定することができるＳＰＦＳ等の測定系においては、そのわずかな不純物が測定結果に大きな影響を及ぼす。
　上記のようにして不純物や標識抗体の非特異吸着の影響を軽減することにより、抗原検出時における誤検出を生じさせるなどの信頼性低下を防止することができ、特に低濃度の試料液７４に含まれるターゲット測定における測定精度を向上させるとともに、ターゲット測定の繰り返し再現性を高めることができる。
　また標識液８０を液体混合部４０まで供給しないため、標識液８０を液体混合部４０まで供給した場合に比べ、２次反応工程における標識液８０の液量を減らすことができ、標識液８０に要するコストを抑えるとともに、標識液８０の送液にかかる時間を短縮化することができる。
　以上、本発明のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法について説明したが、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、例えば液体混合部４０や接続部４２の形態が異なっていても良く、また洗浄液と測定液とを別々の成分としても良いものである。さらには、液体の供給をピペット７０の替わりに往復ポンプ（図示せず）を用いて行っても良いなど本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能なものである。
１０・・・センサチップ
１２・・・誘電体部材
１４・・・金属薄膜
１６・・・反応領域
２０・・・微細流路構成部材
２２・・・微細流路
３０・・・液体吐出／吸引部
３２・・・密閉シール
４０・・・液体混合部
４２・・・接続部
４４・・・傾斜面
４６・・・立設面
５０・・・光源
５２・・・ミラー
５４・・・偏光板
５６・・・励起光
５８・・・反射光
６０・・・受光手段
６２・・・蛍光
６４・・・波長選択機能部材
６６・・・光検出手段
７０・・・ピペット
７２・・・洗浄液
７４・・・試料液
７６・・・洗浄液
７８・・・測定液
８０・・・標識液
８２・・・洗浄液
８４・・・測定液
９０・・・ＳＰＦＳ装置
　θ・・・共鳴角

Claims (6)

  1. 　少なくとも微細流路の途中に、抗原捕捉抗体が固定されてなる反応領域が設けられるとともに、前記微細流路の上流側には液体吐出／吸引部を備え、下流側には液体混合部が設けられたセンサチップを用意し、前記センサチップの前記反応領域にターゲットとなる抗原を含有する試料液を供給して前記抗原捕捉抗体に前記ターゲットを捕捉させる１次反応工程と、
    　前記１次反応工程の後、前記微細流路内に標識抗体を含有する標識液を流入させ、前記抗原捕捉抗体に捕捉された前記ターゲットを標識する２次反応工程と、
    　前記２次反応工程で前記ターゲットを標識した標識抗体より得られるシグナルを測定するシグナル測定工程と、
    　を少なくとも有するサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法であって、
    　前記１次反応工程において、
    　前記反応領域にターゲットとなる抗原を含有する試料液を供給する際には、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記試料液を供給するようにし、
    　前記２次反応工程において、
    　前記抗原捕捉抗体に前記ターゲットとなる抗原が捕捉された反応領域に、前記標識液を供給する際には、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記標識液を供給しないようにする、サンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法。
  2. 　前記２次反応工程の後、前記反応領域を洗浄液で洗浄する２次反応洗浄工程を有し、
    　前記２次反応洗浄工程において、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記洗浄液を供給しないようにする、請求項１に記載のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法。
  3. 　前記２次反応洗浄工程の後、前記反応領域を測定液で満たす２次反応測定液充填工程を有し、
    　前記２次反応測定液充填工程において、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記測定液を供給しないようにする、請求項２に記載のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法。
  4. 　前記２次反応工程の後、前記反応領域を洗浄液で洗浄する２次反応洗浄工程と、
    　前記２次反応洗浄工程の後、前記反応領域を測定液で満たす２次反応測定液充填工程と、を有し、
    　前記２次反応測定液充填工程において、前記微細流路の下流側に設けられた液体混合部に至るまで前記測定液を供給しないようにする、請求項１に記載のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法。
  5. 　前記試料液，前記標識液，前記洗浄液，前記測定液の供給が、前記液体吐出／吸引部を介してピペットを用いて往復送液により行われる、請求項１～４のいずれかに記載のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法。
  6. 　前記ピペットによって行われる前記試料液，前記標識液，前記洗浄液，前記測定液の供給が、液量の調整により所定の位置まで供給される、請求項５に記載のサンドイッチ－イムノアッセイ法を用いた抗原検出方法。
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