WO2015059338A1 - Péptidos derivados de gse24.2 para tratar enfermedades producidas por estrés oxidativo y daño al adn - Google Patents

Péptidos derivados de gse24.2 para tratar enfermedades producidas por estrés oxidativo y daño al adn Download PDF

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Rosario PERONA ABELLÓN
Leandro SASTRE GARZÓN
Laura PINTADO BERNINCHES
Jaime CARRILLO GARCÍA
Antonio MOLINA PACHÓN
Laura IRRADICCIO SILVA
Cristina MANGUAN GARCÍA
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic)
Universidad Autónoma de Madrid
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Centro De Investigación Biomédica En Red (Ciberer)
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    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal

Definitions

  • Peptides derived from GSE24.2 will have applications in the biotechnology and pharmaceutical sector to treat diseases and / or manifestations caused and / or related to oxidative stress and / or DNA damage, such as inflammation, or cell aging.
  • GSE24.2 is a peptide corresponding to the dyskerin protein which is part of the telomerase complex. GSE24.2 is able to reactivate telomerase in pathological and physiological situations; in diseases with telomerase defects the activity of GSE24.2 increases the viability of cells derived from patients.
  • WO2007 / 090911 A1 "Nucleotide and peptide sequence GSE24.2 of dyskerin, inducers of telomerase activity, method of obtaining, therapeutic compositions and their applications" the use of GSE24.2 to reactivate the Telomerase activity or in a drug or pharmaceutical composition.
  • a sequence of 55 amino acids is identified as the original functional unit.
  • new smaller peptides derived from the original sequence are described, as well as new uses and applications thereof, such as protection against oxidative stress and DNA damage, both processes closely related to inflammatory processes and cellular aging.
  • variants of said peptides derived from GSE24.2 are included in the present invention, which include nuclear localization sequences that allow greater and better access to the nucleus, which is where they must exert their biological activity, increasing their efficiency and reducing the need for encapsulation of the original 55 amino acid sequence.
  • the present invention provides a compound that reduces or decreases the production of free radicals and / or damage to the structure of the cellular DNA, wherein said compound is based on a fragment of the nucleotide or amino acid sequence of the GSE24.2 peptide of dyskerin, able to restore the normal redox balance of a cell and / or correct damage to its DNA.
  • the invention addresses the problem of providing new therapeutic tools for the treatment of diseases that involve an increase in cellular oxidative stress and / or damage to the structure of DNA, such as atherosclerosis, Parkinson's disease, myalgic encephalopathy , Alzheimer's disease, ataxia telangectasia, congenital dyskeratosis or aging.
  • GSE24.2 peptide SEQ ID No .: 1 having a greater biological activity than the complete sequence and the known fragments thereof are described in this patent;
  • nuclear transport sequences have been added that further improve the activity of the peptides by improving their internalization by the cells and increasing their presence in the cell nucleus.
  • the GSE24.2 peptide (with sequence SEQ ID No .: 1) and the derived peptides have biological activities not described above as the decrease in free radical content by the cells, and therefore has oxidative stress reducing activity, and the reduction of structural damage in DNA caused by mutations in the recognition machinery thereof; all this increases the viability of the cells exposed to various agents that cause the effects described above.
  • This activity has been tested in some pathologies such as ataxia telangiectasia and congenital dyskeratosis; but also allows its application in neurodegenerative diseases, muscle degeneration (Duchene dystrophy), progeny, hypersensitivity to light, genetic instability caused by mutations or external agents; all of them applications not previously described for this peptide.
  • the present invention is based on the fact that the inventors have tested the ability of the peptides derived from GSE24.2 to decrease the level of free radicals and DNA damage present in different human diseases or derived from exposure to agents such as radiation or genotoxic agents Therefore, peptides derived from GSE24.2 of this invention as well as GSE24.2 itself could be applied to all those diseases caused or that present with accumulation of DNA damage and increase of free radicals, such as: accelerated aging diseases such as Werner's syndrome and that of Hutchison Gilford; others where there is damage to DNA caused by mutations in the recognition and processing machinery thereof such as ataxia telangiectasia, xeroderma pigmentosum, Rothmund Thompson syndrome, "Nijmegen breakage" syndrome, among others; neurodegenerative diseases such as Huntington's disease, Alzheimer's, Parkinson's disease; diseases that occur with muscle degeneration such as Duchene muscular dystrophy; cardiovascular or pulmonary diseases such as pulmonary fibrosis or atherosclerosis; In addition to
  • the inventors have produced small-sized peptides derived from GSE24.2 (SEQ ID No .: 1), capable of entering the cell and having a greater biological activity than the original peptide, identifying them in bacterial lysates of bacteria that express the complete sequence of GSE24.2. These lysates were analyzed by HPLC prior to the identification of their sequences. In the lysate, 5 peptides were identified in addition to GSE24.2, and whose sequences correspond to SEQ ID No .: 2, SEQ ID No .: 3, SEQ ID No .: 4, SEQ ID No .: 5 and SEQ ID No. : 6.
  • the present invention identifies the minimum unit or minimum polypeptide with activity that is comprised in the GSE24.2 peptide of sequence SEQ ID No .: 1, and which consists of an 11 amino acid fragment of SEQ ID No .: 1 and comprising, at least, SEQ ID No .: 2.
  • Said peptide constitutes the minimum unit responsible for the activity of GSE24.2 for decreasing the production of free radicals and / or damaging the structure of a cell's DNA.
  • a first aspect of the invention relates to a polypeptide comprising at least one fragment of the GSE24.2 peptide sequence with SEQ ID No .: 1 capable of decreasing free radical production and / or structure damage of the DNA of a cell, and where said fragment comprises, at least, SEQ ID No .: 2, except when said polypeptide consists of peptide GSE24.2 (SEQ ID No .: 1), or a fragment thereof with sequence SEQ ID No .: 4 (GSE2).
  • the polypeptide has an amino acid sequence comprising a fragment of the GSE24.2 peptide selected from at least one of the group consisting of: SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 and SEQ ID No 6.
  • the polypeptides defined above When at least one of the polypeptides defined above is introduced or its expression is induced inside the cell, preferably inside a eukaryotic cell, such as a human cell, it is capable of causing a decrease in the production of free radicals and / or DNA damage in said cell.
  • a eukaryotic cell such as a human cell
  • the production of cell free radicals may decrease depending on the sequence of said polypeptide. until reaching physiological levels with respect to a cell of the same type to which its expression has not been introduced or induced.
  • said polypeptide apart from The GSE24.2 peptide fragment with activity may further comprise at least one nuclear localization sequence (NLS) linked at least one of the carboxyl or amino terminal ends of said fragment, and more preferably at the carboxyl terminal end.
  • nuclear location sequence is understood as a group of amino acids capable of directing the location of the peptide to which they are attached to the cell nucleus; said sequence can be both a transport sequence to the nucleus and a transport sequence to the nucleolus.
  • the nuclear localization sequence is a nuclear localization sequence found in the DKC1 gene from which the GSE24.2 sequence is derived, such as the transport sequences to the KRKR nucleus (NLS1) or transport to the KKEKKKSK nucleolus. (NLS2), and more preferably is the KRKR core transport sequence (NLS1).
  • polypeptide of this aspect of the invention when it comprises a nuclear localization sequence linked to the active fragment of GSE24.2, said polypeptide consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 1 1, SEQ ID No: 12, SEQ ID No .: 13 and SEQ ID No .: 14. And in one more embodiment preferred, said polypeptide consists of an amino acid sequence selected from the group consisting of: SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No .: 13 and SEQ ID No .: 14. And in one Even more preferred embodiment the polypeptide consists of a sequence that is selected from the group consisting of SEQ ID No .: 7 and SEQ ID No .: 8.
  • any of the polypeptides defined in this first aspect of the invention may also be referred to as a "polypeptide of the invention” or “peptide of the invention”.
  • polypeptides of the invention can be obtained through the usual procedures known in the art for peptide synthesis: by insertion into expression vectors or by chemical synthesis.
  • Chemical peptide synthesis methods comprise both solution or liquid phase synthesis and solid phase peptide synthesis (SPPS).
  • SPPS solid phase peptide synthesis
  • solid phase peptide synthesis will be used, using some of the methods known in the state of the art such as Fmoc and t-Boc.
  • Another aspect of the invention relates to a polynucleotide comprising a sequence encoding at least one of the polypeptides of the invention as any of the above defined.
  • Said polynucleotide referred to herein also as a polynucleotide of the invention, allows the expression of a polypeptide that is capable of decreasing the production of free radicals and / or damage to the structure of DNA in a eukaryotic cell, preferably a human cell. , and may refer to a DNA, cDNA or RNA polynucleotide.
  • said polynucleotide comprises a sequence encoding at least one active fragment of the GSE24.2 peptide sequence with SEQ ID No .: 1 and wherein said fragment comprises at least SEQ ID No .: 2, except when said polynucleotide encodes the peptide GSE24.2 (SEQ ID No .: 1), or a fragment thereof with sequence SEQ ID No .: 4 (GSE2).
  • the polynucleotide of the invention comprises a sequence encoding a fragment of the GSE24.2 peptide selected from at least one of the group consisting of: SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 and SEQ ID No: 6.
  • the polynucleotide sequence of the invention may further comprise the less a nuclear localization sequence (NLS) linked at least one of the 3 'or 5' ends of the GSE24.2 peptide fragment sequence, and more preferably linked at the 3 'end.
  • NLS nuclear localization sequence
  • the nuclear localization sequence chosen for the polypeptide of the invention is a nuclear localization sequence directed to the nucleus or nucleolus, and more preferably it is found in the DKC1 gene from which the GSE24.2 sequence derives.
  • Preferred examples of nucleus transport sequences of the DKC1 gene are the nucleus transport sequences encoding the KRKR peptide sequence (NLS1) or the nucleoli transport sequences encoding the KKEKKKSK peptide sequence (NLS2), and is preferably a core transport sequence encoding the KRKR peptide sequence (NLS1).
  • the polynucleotide of the invention comprises a nuclear localization sequence linked to the coding sequence of the active fragment of GSE24.2
  • said polynucleotide consists of a sequence encoding a polypeptide selected from the group consisting of: SEQ ID No. : 7, SEQ ID No .: 8, SEQ ID No .: 9, SEQ ID No .: 10, SEQ ID No .: 11, SEQ ID No .: 12, SEQ ID No .: 13 and SEQ ID No .: 14.
  • it consists of a sequence encoding a polypeptide selected from the group consisting of: SEQ ID No .: 7, SEQ ID No .: 8, SEQ ID No .: 9, SEQ ID No .: 13 and SEQ ID No .: 14. In an even more preferred embodiment, it consists of a sequence encoding a polypeptide selected from the group consisting of SEQ ID No .: 7 and SEQ ID No .: 8
  • polynucleotide of the invention as any of those described above can be obtained by an expert by employing techniques widely known in the state of the art (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual” 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 vol 1-3).
  • sequences of these polynucleotides can be integrated into a gene expression vector that allows regulation of the expression thereof under suitable conditions inside the cells.
  • another aspect of the invention relates to an expression vector comprising a polynucleotide of the invention or a polynucleotide sequence encoding a polypeptide of the invention, and allowing the expression of a polypeptide that is capable of decreasing the production of free radicals and / or damage to the structure of the DNA in a eukaryotic cell, preferably a human cell, hereinafter the vector of the invention.
  • the expression vector comprises, in addition to the polynucleotide described in the invention, a promoter that directs its transcription (for example, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ret, etc.), to which is operably linked, and other necessary or appropriate sequences that control and regulate said transcription and, where appropriate, the translation of the product of interest, for example, transcription initiation and termination signals (tlt2, etc.), polyadenylation signal, origin of replication, ribosome binding sequences (RBS), coding sequences of transcriptional regulators (enhancers), transcriptional silencers (silencers), repressors, etc.
  • a promoter that directs its transcription for example, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ret, etc.
  • a promoter that directs its transcription for example, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD,
  • Examples of appropriate expression vectors can be selected according to the conditions and needs of each specific case among expression plasmids, viral vectors (DNA or RNA), cosmids, artificial chromosomes, etc. which may also contain markers that can be used to select cells transfected or transformed with the gene or genes of interest.
  • the choice of the vector will depend on the host cell and the type of use to be performed. Therefore, according to a particular embodiment of the present invention said vector is a plasmid or a viral vector.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art as well as for the Transformation of microorganisms and eukaryotic cells can be used different widely known methods - chemical transformation, electroporation, microinjection, etc. - described in various manuals (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual” 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 vol 1-3).
  • the polypeptide of the invention, the polynucleotide of the invention and / or the gene expression vector defined in the present invention can be used as a medicament in a method of treatment and / or prevention of a human being affected by a disease caused by a disease.
  • increased oxidative stress and / or damage to cellular DNA preferably through its biological action in those cells affected by an increase in their levels of free radicals and / or damage to the structure of their DNA, preferably human cells; It can also be used as a biotechnological tool in cell culture or tissue engineering systems "in vitro" to improve their viability.
  • GSE24.2 peptide SEQ ID No .: 1
  • GSE24.2 peptide SEQ ID No .: 4
  • GSE24.2 peptide SEQ ID No .: 1
  • GSE24.2 peptide SEQ ID No .: 4
  • biotechnological, pharmaceutical tools, as well as therapy procedures are sufficiently known to a person skilled in the art in such a way that with the information described in the present invention they can be developed without undue effort.
  • another aspect of the invention relates to the use of a polypeptide, or of a polynucleotide or vector encoding said polypeptide, wherein said polypeptide comprises at least SEQ ID No .: 2 (GSE4) and which is a fragment of the GSE24 peptide .2 (SEQ ID No .: 1) and which is capable of reducing the production of free radicals and / or damage to the structure of a cell's DNA, in the preparation of a drug or pharmaceutical composition for the treatment of, at less, a disease caused by an alteration, preferably an increase, of oxidative stress and / or cell DNA damage.
  • GSE4 SEQ ID No .: 2
  • SEQ ID No .: 1 SEQ ID No peptide .2
  • said disease is one belonging to the following group: congenital dyskeratosis, a neurodegenerative disease (such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebellar ataxia or spinal cord degeneration).
  • a neurodegenerative disease such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, cerebellar ataxia or spinal cord degeneration.
  • cat meow syndrome (Cri du Chat), ataxia telangiectasia, "Nijmegen Breackage” syndrome, Bloom syndrome, Werner syndrome, Fanconi anemia, ulcerative colitis, vascular aging, atherosclerosis, preferably atherosclerosis, cancer, muscular dystrophy from Duchene, progeries, hypersensitivity to light, genetic instability caused by a mutations or an external agent, Hutchison Gilford syndrome; xeroderma pigmentosum, Rothmund Thompson syndrome, pulmonary fibrosis and a disease with chronic inflammation, such as rheumatoid arthritis.
  • the disease is at least one selected from the group consisting of: congenital dyskeratosis, a neurodegenerative disease (such as, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebellar ataxia or spinal cord degeneration), cat meow syndrome (Cri du Chat), ataxia telangiectasia, Nijmegen Breackage syndrome, Bloom syndrome, Werner syndrome, Fanconi anemia, ulcerative colitis, vascular aging, arteriosclerosis, preferably atherosclerosis, and cancer .
  • a neurodegenerative disease such as, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, cerebellar ataxia or spinal cord degeneration
  • cat meow syndrome Cri du Chat
  • ataxia telangiectasia Nijmegen Breackage syndrome
  • Bloom syndrome Werner syndrome
  • Fanconi anemia Fanconi anemia
  • ulcerative colitis vascular aging
  • arteriosclerosis preferably atherosclerosis
  • cancer cancer
  • the medicament or pharmaceutical composition comprises a polypeptide and / or a polynucleotide or expression vector encoding it, wherein said polypeptide comprises a sequence selected from at least one of the group consisting of: SEQ ID No. : 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No .: 5 and / or SEQ ID No .: 6.
  • the polypeptide consists of a sequence of sequence equal to or less than 25 amino acids preferably selected from at least one of the group consisting of: SEQ ID No .: 2, SEQ ID No .: 3, SEQ ID No .: 5 and SEQ ID No .: 6.
  • the medicament or pharmaceutical composition it comprises a polypeptide and / or a polynucleotide or expression vector that encodes it, wherein the polypeptide further comprises at least one nuclear localization sequence, preferably linked to its carboxyl terminus, preferably selected from at least one of the group f formed by: SEQ ID No .: 7, SEQ ID No .: 8, SEQ ID No .: 9, SEQ ID No .: 10, SEQ ID No .: 11, SEQ ID No .: 12, SEQ ID No .: 13, and SEQ ID No .: 14. Even more preferably the polypeptide sequence is chosen from the group consisting of SEQ ID No .: 7 and SEQ ID No.:8.
  • compositions or medicament preferably for the treatment of diseases, disorders or pathologies caused by an alteration of the content of free radicals inside the cell, causing an associated oxidative stress and / or caused by a damage of the structure of the cellular DNA
  • pharmaceutical composition of the present invention comprising at least one polypeptide, polynucleotide and / or expression vector capable of decreasing the production of free radicals and / or damage to the structure of the cellular DNA, in therapeutically effective amount together with, optionally, one or more pharmaceutically acceptable adjuvants and / or vehicles and which is capable of regulating and maintaining redox balance and correcting damage in the DNA
  • said pharmaceutical composition or medicament can also be referred to as "pharmaceutical composition or medicament of the invention”.
  • compositions are the adjuvants and vehicles known to those skilled in the art and commonly used in the elaboration of therapeutic compositions.
  • the term "therapeutically effective amount” refers to the amount of the polypeptide of the invention, or of a molecule or compound that allows the expression of a nucleotide sequence encoding said polypeptide, capable of decreasing the production of free radicals and / or damage to the structure of cellular DNA, calculated to produce the desired effect and which, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of the compounds, including age, patient's condition, severity of the alteration or disorder, and of the route and frequency of administration.
  • said therapeutic composition is prepared in the form of a solid form or aqueous suspension, in a pharmaceutically acceptable diluent.
  • the therapeutic composition provided by this invention may be administered by any appropriate route of administration, for which said composition will be formulated in the pharmaceutical form appropriate to the route of administration chosen.
  • the administration of the therapeutic composition provided by this invention is carried out parenterally, orally, intraperitoneally, subcutaneously, etc.
  • a review of the different pharmaceutical forms of drug administration and of the excipients necessary to obtain them can be found, for example, in the Treaty of Farmacia Galenica, C. Faul ⁇ i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Editions, Madrid.
  • the pharmaceutical composition or medicament comprises a polypeptide of the invention that is selected from at least one of the group consisting of: SEQ ID No .: 2, SEQ ID No .: 3, SEQ ID No .: 5, SEQ ID No .: 6, SEQ ID No .: 7, SEQ ID No .: 8, SEQ ID No .: 9, SEQ ID No .: 10, SEQ ID No .: 1 1, SEQ ID No .: 12, SEQ ID No .: 13 and SEQ ID No .: 14; or a polynucleotide or vector encoding said polypeptide.
  • the polypeptide comprising or encoding is selected from at least one of the group formed by: SEQ ID No .: 2, SEQ ID No .: 3, SEQ ID No .: 5, SEQ ID No .: 6, SEQ ID No .: 7, SEQ ID No .: 8, SEQ ID No .: 9 , SEQ ID No .: 13 and SEQ ID No .: 14; and more preferably among at least one of the group consisting of: SEQ ID No .: 2, SEQ ID No .: 3, SEQ ID No .: 5, SEQ ID No .: 6, SEQ ID No .: 7 and SEQ ID No .: 8.
  • the pharmaceutical composition or medicament comprises a polypeptide of the invention containing an active GSE24.2 peptide fragment that is selected from at least one of the group consisting of: SEQ ID No .: 2, SEQ ID No .: 3, SEQ ID No .: 5 and SEQ ID No .: 6; or a polynucleotide or vector encoding said polypeptide.
  • the pharmaceutical composition or medicament comprises a polypeptide of the invention containing the active GSE24.2 peptide fragment bound to a nuclear localization sequence, preferably attached to the carboxyl terminal end and selected from at least one of the group formed by: SEQ ID No .: 7 and SEQ ID No .: 8, or a polynucleotide or vector encoding said polypeptide.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in a treatment method in isolation or in conjunction with other pharmaceutical compounds.
  • Another aspect of the invention is therefore the use of the pharmaceutical composition of the invention, hereinafter use of the pharmaceutical composition of the invention, in a method of treatment or prevention of an individual, preferably a human being, affected by a disease , disorder or pathology caused by an alteration of the free radical content inside the cell, causing an associated oxidative stress and / or caused by a damage to the DNA structure.
  • the disease or pathology to be treated is one of those defined in the uses of the composition mentioned above.
  • Another aspect of the invention relates to the use of a polypeptide comprising a fragment of the GSE24.2 peptide sequence (SEQ ID No .: 1) with SEQ ID No .: 2 capable of decreasing the production of free radicals and / or the damage in the structure of the DNA of a cell, or of the polynucleotide or vector that encodes it, in tissue engineering and cell culture to improve their viability.
  • said polypeptide consists of at least one selected from the group consisting of: SEQ ID No .: 1, SEQ ID No .: 2, SEQ ID No .: 3, SEQ ID No .: 4, SEQ ID No .: 5, SEQ ID No .: 6, SEQ ID No .: 7, SEQ ID No .: 8, SEQ ID No .: 9, SEQ ID No .: 10, SEQ ID No .: 11, SEQ ID No .: 12, SEQ ID No .: 13, and SEQ ID No .: 14.
  • the word "comprises” and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps.
  • other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.
  • the following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
  • FIG. 1 Determination of DNA damage in AT cells: AT3784 AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2 or an empty GFP vector and 24 hours later set to be processed and hybridized with a phosphorylated H2AX histone antibody (Ser139). C-1787 control cells were used as a negative control. They were subsequently hybridized with a fluorescein-labeled antibody and stained with DAPI to locate the nuclei. The foci (foci) were stained with phosphorylated histone H2AX staining in 200 cells per type and the results were grouped between cells that had no foci, a number of foci between 5 and 20 and greater than 20.
  • FIG. 2 Determination of DNA damage in AT cells: AT3784 AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2 or an empty GFP vector and 24 hours later set to be processed and hybridized with an antibody against pCHK2thr68 kinase. C-1787 control cells were used as a negative control. They were subsequently hybridized with a fluorescein-labeled antibody and stained with DAPI to locate the nuclei. Foci were stained with pCHK2thr68 staining in 200 cells per type and the results were grouped between cells that had no foci, a number of foci between 5 and 20 and greater than 20.
  • FIG. 3 Determination of ROS levels in AT cells: AT3189-P AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2 or an empty GFP vector and three weeks later loaded with DHE reagent that detects ROS levels (from English Reactive Oxygen Species, or reactive oxygen species). As control, AT736C cells were used. The relative fluorescence of the three cell lines and the proportion of cells with maximum intensity were determined by flow cytometry using a wavelength: 518 absorption and 605 nm emission. The data has been represented as a relative percentage of cells emitting at this wavelength. FIG. 4.
  • AT719-P AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2 or an empty GFP vector and three weeks later protein extracts were obtained.
  • AT719-P AT cells infected with GSE24.2 were also used and the population with maximum fluorescence was selected using a sorter (AT719-P GSE24.2 sorter AT).
  • AT736C cells were used as control.
  • the proteins were resolved in polyacrylamide gels and transferred to nitrocellulose membranes. The membrane was hybridized with a polyclonal antibody against the phosphorylated p38 protein Thrl80 / Tyrl82 and without phosphorylation as a loading control.
  • the relative values between the phosphorylated and unphosphorylated protein obtained (by means of the NI hyimage program) for the control cell line were considered 1 and the others referred to it.
  • FIG. 5 Determination of viability in response to bleomycin in AT cells: AT719-P AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2 or an empty GFP vector and three weeks later treated with different doses of bleomycin. As control, AT736C cells were used. The cells were fixed after 72 hours of treatment and the viability determined with the MTS reagent. The values represent the result of the triplicate test and express the viability with respect to untreated cells.
  • FIG. 6 Western blotting of F9 and F9A353V cells 24 hours after transfecting chemically synthesized GSE24.2 derived peptides.
  • the peptides indicated in each gel line were transfected (15 ⁇ g of each peptide) in a 30mm plate.
  • the membrane was hybridized with an antibody against histone H2AX (Ser139) and subsequently with one against ⁇ -tubulin as a loading control.
  • FIG. 7 Quantification of the western blot of Figure 6, for this the signal obtained with histone H2AX (Ser139) was corrected with the ⁇ -tubulin signal considering as 1 the signal obtained with F9 cells transfected with betagalactosidase (as a control) using the NIH-IMAJE program.
  • FIG. 8 Western blotting of F9 and F9A353V cells 24 hours after transfecting the GSE4 peptide at increasing concentrations.
  • the synthetic GSE4 peptide was transfected at the concentrations indicated in each gel line.
  • the membrane was hybridized with an antibody against Histone H2AX (Ser139) and ⁇ -tubulin as a loading control.
  • FIG. 9. Quantification of the western blot of Figure 8, for this the signal obtained with histone H2AX (Ser139) was corrected with the ⁇ -tubulin signal considering as 1 the signal obtained with F9 cells transfected with betagalactosidase.
  • FIG. 10 Determination of telomerase activity in VA13 cells after transfection of GSE4 and GSE5 peptides.
  • FIG. 11 Determination of oxidative stress levels in ataxia telangiectasia cells, after expressing the GSE24.2 and GSE4 peptides.
  • AT719-P AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2, GSE4 or an empty GFP vector and three weeks later loaded with DHE reagent that detects ROS levels (Reactive Oxygen Species, or reactive oxygen species) ).
  • ROS levels reactive Oxygen Species, or reactive oxygen species
  • FIG. 12 Proinflammatory cytokine expression levels in ataxia telangiectasia cells, after expressing peptides GSE24.2 and GSE4. AT719-P AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2, GSE4 or an empty GFP vector and three weeks later RNA was extracted and after obtaining the corresponding cDNA the level of expression of IL6 e-inflammatory cytokines was determined. IL8. As control, AT736C cells were used.
  • FIG. 13 Determination of senescence in AT cells after expressing GSE24.2 and GSE4 peptides: AT2078 AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2, GSE4 or an empty GFP vector and 3 days or eight days later fixed to determine the expression of the senescence-associated acid ⁇ -galactosidase enzyme (senescence-associated ⁇ -galactosidase). C-1787 control cells were used as a negative control.
  • the percentage of cells expressing ⁇ -galactosidase of the total cells per field was determined. 200 cells were evaluated per cell type and the Results were grouped between cells that had no activity (pgal-, dividing) and senescent cells (p-gal +).
  • FIG. 14 Determination of DNA damage in AT cells after transfecting GSE4 and SGSE4 peptides: AT2078 AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE4, SGSE4 or an empty GFP vector and 24 hours later set to be processed and hybridized with an antibody against phosphorylated H2AX histone (Ser139). C-1787 control cells were used as a negative control. They were subsequently hybridized with a fluorescein-labeled antibody and stained with DAPI to locate the nuclei. The foci (foci) were stained with phosphorylated histone H2AX staining in 200 cells per type and the results were grouped between cells that had no foci, a number of foci between 5 and 20 and greater than 20.
  • FIG. 15 NLS1 and NLS2 sequences of the dyskerin sequence. Nuclear (NLS1) and nucleolar (NLS2) localization sequences contained in the DKC1 gene.
  • FIG. 16 Scheme of the constructions used to place the NLS1 or NLS2 nuclear location signals at positions 5 ⁇ 3 ' in the GSE24.2 sequence.
  • Four constructs were obtained by placing the NLS1 or NLS2 sequences in the 5 ⁇ 3 ' region of the GSE24.2 containing a Tag for myc in the pCDNA3myc expression vector.
  • FIG. 17 Expression of the NLS1 -3, NLS1 -5, NLS2-3 and NLS2-5 GSE24.2 and GSE24.2 constructs in HeLa cells. 24 hours after transfecting the plasmids (using lipofectamine) the expression and subcellular localization of the peptides were detected by immunofluorescence with an antibody against the c-myc Tag present in the constructs (see Fig. 16).
  • FIG. 18 Expression of the NLS1 -3 GSE24.2 and GSE24.2 constructs in HeLa cells. After 24 hours of transfecting the plasmids (using lipofectamine), the expression and subcellular localization of the peptides were detected by immunofluorescence with an antibody against the c-myc Tag found in the construction.
  • FIG. 19 Expression of the NLS2-3 GSE24.2 and GSE24.2 constructs in HeLa cells. After 24 hours of transfecting the plasmids (using lipofectamine) the expression and subcellular localization of the peptides by immunofluorescence, with an antibody against the c-myc Tag that is in the construction.
  • FIG. 20 Activity of the GSE24.2NLS1 -3 and GSE24.2NLS2-3 constructs on the c-myc promoter.
  • Expression vectors for the GSE24.2, GSE24.2NLS1-3 and GSE24.2NLS2-3 constructs were transfected (using lipofectamine) into 293T cells along with the reporter gene of the c-myc promoter, pXP1 and 24 hours later it was measured Luciferase activity using a commercial kit. The values are expressed as relative activity considering 1 the luciferase value with the empty pCDNA3myc expression vector.
  • FIG. 21 Transfection of GSE4 and GSE4NLS1 peptides into HeLa cells.
  • GSE4 and GSE4NLS1 (SEQ ID No .: 7) peptides labeled with fluorescein and obtained by chemical synthesis, were transfected into HeLa cells using the Proteojuice reagent and visualized in a confocal fluorescence microscope, 9, 24 and 48 hours after transfection.
  • FIG. 22 Internalization of GSE4 and GSE4NLS1 peptides in HeLa cells.
  • the GSE4 and GSE4NLS1 (SEQ ID No .: 7) peptides labeled with fluorescein and obtained by chemical synthesis, were added to the HeLa cell culture medium and visualized in a confocal fluorescence microscope, 9, 24 and 48 hours after transfection.
  • EXAMPLE 1 Ability of GSE24.2 to reverse DNA damage in cells of patients with ataxia telangiectasia.
  • telangiectasia (AT, from the Coriell repository) with mutation in the ATM gene and called AT3487 were used.
  • the C-1787 cell line was used as a control cell line.
  • the cells were infected with the bicistronic lentiviral vector pCMV-GFP-GSE24.2. After 48 hours after infection the cells were fixed with formaldehyde and subsequently permeabilized by treating them with Triton X-100. DNA damage was estimated by studying the signal after hybridization of the cells with an antibody against histone H2AX Ser139 and subsequent hybridization with a fluorescein-bound antibody.
  • the number of foci (foci) stained for histone H2AX / nucleus was determined using confocal microscopy in a total of 200 cells and the data represented as a percentage of cells with a certain number of foci.
  • EXAMPLE 2 Ability of GSE24.2 to decrease free radical levels in cells of patients with ataxia telangiectasia.
  • One of the characteristics of AT cells is an increase in free radical content. This is due to the lack of function of the ATM protein, which is able to maintain the redox balance in normal cells, when the cells are exposed to environmental stress such as in vitro culture.
  • One of the characteristics of the cells of AT patients is a greater activation of the p38 MAP kinase, due to the lack of ATM protein function. This increase in the activation of p38 triggers the process of cell death in AT cells and therefore a decrease in the number of neuronal cells. Therefore, it was verified if the expression of GSE24.2 was able to decrease the activation of p38 in the cell lines of AT patients.
  • AT719 AT cells were infected with a lentiviral vector expressing GSE24.2 pCMV-GFP-GSE24.2 or an empty vector expressing only GFP (GFP) and three weeks after infection protein extracts were obtained from both cell lines.
  • the AT736 normal lymphoblast cell line was used as a negative control.
  • the extracts were resolved in polyacrylamide gels and the proteins were transferred to nitrocellulose filters for subsequent hybridization with antibodies.
  • An antibody that detects phosphorylated p38 protein was used and subsequently re-inhibited with an antibody against non-phosphorylated p38 protein as a loading control.
  • the signal obtained in both hybridizations was quantified with the NIH-IMAJE program and the relative values between the phosphorylated and non-phosphorylated protein obtained for the control cell line considered 1.
  • Figure 4 it can be seen that the values increase greatly in the case of AT719 cells infected with the GFP virus, but decrease significantly to levels similar to control cells when infected with the GSE24.2 virus.
  • Bacterial lysates of RosettaGami2 bacteria were obtained by expressing the bacterial vector pGATEVGSE24-2.
  • the bacteria were sonicated in a saline medium with protease inhibitors and the fusion protein expressed by the bacterial plasmid was purified by columns of glutathione sepharose.
  • the lysates were subjected to HPLC to separate the peptides from the rest of dragged cell proteins using size and load separation columns.
  • the resulting fractions were sequenced using a sequencer that uses a method derived from the EDMA method and commercial use.
  • the different peptides found in bacterial lysates expressing GSE24.2 were obtained by chemical synthesis and were tested for DNA damage rescue activity using F9A353V cells that carry the most frequent mutation in patients with congenital dyskeratosis A353V.
  • the different peptides were lipofected using the Proteojuice reagent in F9A353V cells and F9 control cells were used as damage control (cells without damage).
  • An unrelated peptide was used as a negative control and the full GSE 24.2 as a positive control.
  • EXAMPLE 6 Measurement of increased telomerase activity after treatment with the GSE4 peptide.
  • the other way to quantify the activity of the GSE4 peptide has been to evaluate its ability to increase telomerase activity in VA13 cells. For this they were transfected these cells with 8 ⁇ g of the two GSE4 and GSE5 peptides. After 48 hours the cells were processed to test telomerase activity by the TRAP method.
  • the GSE5 peptide has a DNA damage rescue activity similar to GSE4, the latter has a much greater activity reactivating telomerase activity. Therefore the activity of the GSE4 peptide is the most efficient for the reactivation of telomerase activity.
  • EXAMPLE 7 Measurement of decreased oxidative stress, inflammation and senescence after treatment with the GSE4 peptide.
  • GSE4 As the peptide called GSE4, was the smallest among the peptides capable of rescuing telomerase activity, we studied whether it had the same activity as the GSE24.2 peptide to attenuate oxidative stress, proinflammatory cytokine expression and rescue senescence in cells of ataxia telangiectasia.
  • the GSE4 peptide is capable of decreasing free radical levels by up to 50% as does the GSE24.2 peptide in AT-719P cells. Furthermore, in these cells it is able to decrease the expression levels of IL6 and IL8 respectively by up to 80% and 90% ( Figure 12), these values are in the same range as the GSE24.2 peptide.
  • EXAMPLE 8 Measurement of DNA damage with the GSE4 peptide and one of similar sequence located in the TRUBII domain of the dyskein called SGSE4.
  • GSE4 As the peptide called GSE4, was the smallest among the peptides capable of inhibiting DNA damage, we studied whether another peptide with a similar sequence located within the GSE24.2 peptide sequence had the same activity or if the It was specific to GSE4.
  • the cells were infected with the bicistronic lentiviral vector pCMV-GFP-GSE4, SGSE4 or GFP. After 48 hours after infection the cells were fixed with formaldehyde and subsequently permeabilized by treating them with Triton X-100. DNA damage was estimated by studying the signal after hybridization of the cells with an antibody against histone H2AX Ser139 and subsequent hybridization with a fluorescein-bound antibody. The number of foci (foci) stained for histone H2AX / nucleus was determined using confocal microscopy in a total of 200 cells and the data represented as a percentage of cells with a given foci number.
  • NLS1 is a signal present in the DKC1 gene sequence that takes the protein to the nucleus and the NLS2 sequence mediates transport to the nucleolus.
  • Figure 15 shows the sequence of both nuclear location signals.
  • the eukaryotic cell expression plasmid, pCDNA3myc, containing a Tag of the c-myc gene in the 5 ' position has been used fused with the GSE24.2 sequence.
  • EXAMPLE 10 Activity of the GSE24.2NLS1 -3 and GSE24.2NLS2-3 constructs to activate the c-myc expression.

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Abstract

La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende elfragmento SEQ ID No.: 2 del péptido GSE24.2 (SEQ ID No.:1) y escapaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN de una célula, pudiendo opcionalmente comprender secuencias de localización nuclear.Además, la invención también se refiere a un polinucleótido y a un vector, los cuales comprenden secuencias que codifican dicho polipéptido, así como a una composición farmacéutica que comprenda el polipéptido, polinucleótido y/o vector anteriores. La presente invención también hace referencia a las aplicaciones del polipéptido, como son el uso para tratar y/o prevenir enfermedades provocadas por aumento del estrés oxidativo y/o del daño del ADN celular, tales como la ataxia telangectasia o la disqueratosis congénita, o el uso en ingeniería de tejidos y cultivo celular para mejorar la viabilidad de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
PÉPTIDOS DERIVADOS DE GSE24.2 PARA TRATAR ENFERMEDADES PRODUCIDAS POR ESTRÉS OXIDATIVO Y DAÑO AL ADN
Sector de la técnica
Los péptidos derivados de GSE24.2 tendrán aplicaciones el sector biotecnológico y farmacéutico para tratar las enfermedades y/o manifestaciones causadas y/o relacionadas con el estrés oxidativo y/o el daño al ADN, como pueden ser la inflamación, o el envejecimiento celular.
Estado de la técnica anterior GSE24.2 es un péptido correspondiente a la proteína disquerina la cual forma parte del complejo telomerasa. GSE24.2 es capaz de reactivar telomerasa en situaciones patológicas y fisiológicas; en enfermedades con defectos en telomerasa la actividad del GSE24.2 aumenta la viabilidad de las células derivadas de enfermos. En la solicitud patente internacional: WO2007/090911 A1 "Secuencia de nucleótidos y péptidos GSE24.2 de la disquerina, inductores de la actividad telomerasa, procedimiento de obtención, composiciones terapéuticas y sus aplicaciones" se divulga el uso del GSE24.2 para reactivar la actividad telomerasa o en un medicamento o composición farmacéutica. En dicha solicitud de patente internacional se identifica una secuencia de 55 aminoácidos como la unidad funcional original. En la presente invención se describen nuevos péptidos de menor tamaño derivados de la secuencia original, así como nuevos usos y aplicaciones de los mismos, como puede ser la protección frente al estrés oxidativo y el daño al ADN, ambos procesos íntimamente relacionados con procesos inflamatorios y envejecimiento celular. Además, en la presente invención se aportan variantes de dichos péptidos derivados de GSE24.2 que incluyen secuencias de localización nuclear que permiten un mayor y mejor acceso al núcleo que es donde deben ejercer su actividad biológica aumentando su eficacia y reduciendo la necesidad de encapsulación de la secuencia de 55 aminoácidos original. Descripción de la invención Breve descripción de la invención:
La presente invención proporciona un compuesto que reduce o disminuye la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN celular, donde dicho compuesto se basa en un fragmento de la secuencia nucleotídica o aminoacídica del péptido GSE24.2 de la disquerina, capaz de restablecer el equilibrio redox normal de una célula y/o de corregir un daño en su ADN. De este modo, la invención aborda el problema de proporcionar nuevas herramientas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades que involucran un incremento del estrés oxidativo celular y/o daños en la estructura del ADN, tales como la aterosclerosis, la enfermedad de Parkinson, la encefalopatía miálgica, la enfermedad de Alzheimer, la ataxia telangectasia, la disqueratosis congénita o el envejecimiento.
Se describen en esta patente secuencias internas del péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1) que tienen una mayor actividad biológica que la secuencia completa y los fragmentos ya conocidos de la misma; además, para mejorar su actividad se les han añadido secuencias de transporte nuclear que mejoran adicionalmente la actividad de los péptidos al mejorar su internalización por las células e incrementar su presencia en el núcleo celular.
El péptido GSE24.2 (con secuencia SEQ ID No.: 1) y los péptidos derivados presentan actividades biológicas no descritas anteriormente como la disminución del contenido en radicales libres por parte de las células, y por tanto tiene actividad reductora del estrés oxidativo, y la disminución del daño estructural en el ADN producido por mutaciones en la maquinaria de reconocimiento del mismo; todo ello aumenta la viabilidad de las células expuestas a diversos agentes causantes de los efectos antes descritos. Esta actividad se ha probado en algunas patologías como la ataxia telangiectasia y la disqueratosis congénita; pero además permite su aplicación en enfermedades neurodegenerativas, de degeneración muscular (distrofia de Duchene), progerias, hipersensibilidad a luz, inestabilidad genética causada por mutaciones o agentes externos; todas ellas aplicaciones no descritas previamente para este péptido.
Descripción detallada de la invención:
La presente invención se basa en que los inventores han ensayado la capacidad del péptidos derivados de GSE24.2 para disminuir el nivel de radicales libres y el daño en el ADN presentes en diferentes enfermedades humanas o derivadas de la exposición a agentes como la radiación o los agentes genotóxicos. Por tanto, los péptidos derivados de GSE24.2 de esta invención así como el propio GSE24.2 se podrían aplicar a todas aquellas enfermedades ocasionadas o que cursan con acumulación de daño al ADN y aumento de radicales libres, como: enfermedades de envejecimiento acelerado como el síndrome de Werner y el de Hutchison Gilford; otras donde hay daño al ADN causado por mutaciones en la maquinaria de reconocimiento y procesamiento del mismo como ataxia telangiectasia, xeroderma pigmentosum, síndrome de Rothmund Thompson, síndrome de "Nijmegen breakage", entre otros; enfermedades neurodegenerativas como por ejemplo la enfermedad de Huntington, Alzheimer, enfermedad de Parkinson; enfermedades que cursen con degeneración muscular como la distrofia muscular de Duchene; enfermedades cardiovasculares o pulmonares como la fibrosis pulmonar o la aterosclerosis; además de enfermedades que cursen con un componente inflamatorio importante en su patología como la artritis reumatoide. Entre las aplicaciones de estos péptidos también se encuentran las relacionadas con la ingeniería de tejidos y el cultivo celular, entre otras aplicaciones biotecnológicas. Estos péptidos además podrían tener aplicaciones en la industria cosmética, como por ejemplo en el tratamiento de los daños producidos por el envejecimiento en la piel.
Los inventores han producido péptidos de pequeño tamaño derivados del GSE24.2 (SEQ ID No.: 1), con capacidad de entrar en la célula y que tienen una mayor actividad biológica que el péptido original, identificándolos en lisados bacterianos de bacterias que expresan la secuencia completa de GSE24.2. Éstos lisados fueron analizados mediante HPLC previamente a la identificación de sus secuencias. En el lisado se identificaron 5 péptidos además del GSE24.2, y cuyas secuencias corresponden con SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 5 y SEQ ID No.: 6.
Un listado de las secuencias y las correspondencias con los péptidos descritos en esta invención puede hallarse en la Tabla 1 :
Nombre Secuencia N° Aminoácidos SEQ ID No.:
GSE24.2 GFINLDKPSNPSSHEWAWIRRILRVEKT 55 1
GHSGTLDPKVTGCLIVCIERATRLVK
GSE4 GFINLDKPSNP 11 2
GSE1 GFINLDKPSNPSSHEW 17 3
GSE2 GFINLDKPSNPSSHEWA 18 4
GSE3 GFINLDKPSNPSSHEWAW 19 5 Nombre Secuencia N° Aminoácidos SEQ ID No.:
GSE5 GFINLDKPSNPSSHEWAWIRRILR 25 6
GSE4NLS1-3 GFINLDKPSNPKRKR 15 7
GSE24.2NLS1-3 GFINLDKPSNPSSHEWAWIRRILRVEKTG 59 8
HSGTLDPKVTGCLIVCIERATRLVKKRKR
GSE24.2NLS2-3 GFINLDKPSNPSSHEWAWIRRILRVEKT 63 9
GHSGTLDPKVTGCLIVCIERATRLVKKKE KKKSK
GSE 24.2NLS1-5 KRKRGFINLDKPSNPSSHEWAWIRRILRV 59 10
EKTGHSGTLDPKVTGCLIVCIERATRLVK
GSE 24.2NLS2-5 KKEKKKSKGFINLDKPSNPSSHEWAWI 63 11
RRILRVEKTGHSGTLDPKVTGCLIVCIER ATRLVK
GSE4NLS1-5 KRKRGFINLDKPSNP 15 12
GSE4NLS2-3 GFINLDKPSNPKKEKKKSK 19 13
GSE4NLS2-5 KKEKKKSKG Fl N LDKPSN P 19 14
SGSE4 HSGTLDPKVTG 11 15
Tabla 1. Correspondencia entre la descripción de los péptidos y las secuencias empleadas en la descripción. Se ha estudiado la actividad biológica de los péptidos identificados en los lisados bacterianos en un ensayo de rescate de daño al ADN, de ellos el péptido GSE4 (SEQ ID No.: 2) que se encuentra comprendido en el dominio Trubl mejora sustancialmente la actividad del dominio completo (SEQ ID No.: 4, GSE2) y de GSE24.2 (SEQ ID No.: 1); dicha actividad es incluso mejorada aún más con la inserción de una secuencia de localización nuclear en posición carboxilo terminal (pero no en el N-terminal). Dado el pequeño tamaño de los péptidos identificados en la presente invención, no es necesario emplear sistemas de captación celular como son los liposomas para introducirlos en la célula, lo cual es una mejora sustancial respecto al empleo del péptido completo GSE24.2 (SEQ ID No.: 1) o del dominio Trubl (GSE2, SEQ ID No.: 4) que sí los precisa. Estos nuevos péptidos, por tanto, proporcionan un sistema más reproducible y estable para fines terapéuticos que los actuales. Además, dichos péptidos pueden obtenerse por síntesis química, simplificando el proceso de obtención de los mismos. Estos péptidos presentan funciones análogas a las de GSE24.2 y por tanto es posible emplearlos en aplicaciones equivalentes. En la presente invención se identifica la unidad mínima o polipéptido mínimo con actividad que se encuentra comprendida en el péptido GSE24.2 de secuencia SEQ ID No.: 1 , y que consiste en un fragmento de 11 aminoácidos de SEQ ID No.: 1 y que comprende, al menos, la SEQ ID No.: 2. Dicho péptido constituye la unidad mínima responsable de la actividad de GSE24.2 de disminución de la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN de una célula.
Así, un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido que comprende al menos un fragmento de la secuencia del péptido GSE24.2 con SEQ ID No.: 1 capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN de una célula, y donde dicho fragmento comprende, al menos, la SEQ ID No.: 2, excepto cuando dicho polipéptido consiste en el péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1), o un fragmento del mismo con secuencia SEQ ID No.: 4 (GSE2). En una realización preferida, el polipéptido tiene una secuencia aminoacídica que comprende un fragmento del péptido GSE24.2 seleccionado entre al menos uno del grupo formado por: SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6.
Cuando al menos uno de los polipéptidos definidos anteriormente se introduce o se induce su expresión en el interior celular, preferentemente en el interior de una célula eucariota, como puede ser una célula humana, es capaz de provocar una disminución en la producción de radicales libres y/o el daño del ADN en dicha célula. De este modo, al cuantificar los niveles de radicales libres en una célula viva por alguno de los métodos conocidos, como por ejemplo mediante el compuesto Dihidroethidium (DHE, Hydroethidine), la producción de radicales libres celular puede disminuir dependiendo de la secuencia de dicho polipéptido hasta alcanzar niveles fisiológicos con respecto a una célula del mismo tipo a la que no se ha introducido o inducido su expresión. Del mismo modo, cuando se cuantifica el daño del ADN celular por alguno de los métodos existentes, como por ejemplo por el estudio de la señal de hibridación de las células con un anticuerpo contra la histona H2AX fosforilada en la posición Ser139 (γ-Η2ΑΧ), se observa que dicho daño del ADN puede reducirse dependiendo de la secuencia del polipéptido en un 50% con respecto a una célula del mismo tipo a la que no se ha introducido o inducido su expresión.
Teniendo en cuenta que la acción de los polipéptidos definidos en este aspecto de la invención puede llevarse a cabo en el núcleo celular, para facilitar su expresión o localización en el núcleo y/o mejorar la actividad de los mismos, dicho polipéptido aparte del fragmento del péptido GSE24.2 con actividad, puede comprender además al menos una secuencia de localización nuclear (NLS) unida en al menos uno de los extremos carboxilo o amino terminal de dicho fragmento, y más preferentemente en el extremo carboxilo terminal. En el ámbito de la presente invención se entiende por secuencia de localización nuclear a un grupo de aminoácidos capaz de dirigir la localización del péptido al que se hallan unido al núcleo celular; dicha secuencia puede ser tanto una secuencia de transporte al núcleo como una secuencia de transporte al nucléolo. Preferentemente, la secuencia de localización nuclear es una secuencia de localización nuclear que se encuentra en el gen DKC1 de donde deriva la secuencia del GSE24.2, como son por ejemplo las secuencias de transporte al núcleo KRKR (NLS1) o de transporte al nucléolo KKEKKKSK (NLS2), y más preferentemente es la secuencia de transporte al núcleo KRKR (NLS1).
Así, en una realización preferida del polipéptido de este aspecto de la invención, cuando comprende una secuencia de localización nuclear unida al fragmento activo del GSE24.2, dicho polipéptido consiste en una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo compuesto por: SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No: 10, SEQ ID No: 1 1 , SEQ ID No: 12, SEQ I D No.: 13 y SEQ ID No.: 14. Y en una realización más preferida, dicho polipéptido consiste en una secuencia aminoacídica seleccionada del grupo compuesto por: SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8, SEQ ID No: 9, SEQ ID No.: 13 y SEQ ID No.: 14. Y en una realización aún más preferida el polipéptido consiste en una secuencia que se selecciona del grupo compuesto por SEQ ID No.: 7 y SEQ ID No.: 8.
A lo largo del presente documento, cualquiera de los polipéptidos definidos en este primer aspecto de la invención, puede ser igualmente referido como un "polipéptido de la invención" o "péptido de la invención".
Los polipéptidos de la invención se pueden obtener a través de los procedimientos habituales conocidos en la técnica para la síntesis de péptidos: mediante la inserción en vectores de expresión o mediante su síntesis química. Los procedimientos de síntesis química de péptidos comprenden tanto la síntesis en solución o fase líquida como la síntesis peptídica en fase sólida (SPPS en sus siglas en inglés). Preferentemente se empleará la síntesis peptídica en fase sólida, empleando alguno de los métodos conocidos en el estado de la técnica como el Fmoc y el t-Boc. Otro aspecto de la invención se refiere a un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica al menos uno de los polipéptidos de la invención como cualquiera de los anteriormente definidos. Dicho polinucleótido, referido en la presente memoria igualmente como polinucléotido de la invención, permite la expresión de un polipéptido que es capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN en una célula eucariota, preferentemente una célula humana, y puede referirse a un polinucleótido de ADN, de ADNc o de ARN. Preferentemente, dicho polinucleótido comprende una secuencia que codifica al menos un fragmento activo de la secuencia del péptido GSE24.2 con SEQ ID No.: 1 y donde dicho fragmento comprende, al menos, la SEQ ID No.: 2, excepto cuando dicho polinucleótido codifica el péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1), o un fragmento del mismo con secuencia SEQ ID No.: 4 (GSE2).
En una realización preferida, el polinucleótido de la invención comprende una secuencia que codifica un fragmento del péptido GSE24.2 seleccionado entre al menos uno del grupo formado por: SEQ ID No: 2, SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6.
Teniendo en cuenta que la acción del polipéptido que codifica el polinucleótido de la invención, puede llevarse a cabo en el núcleo celular, de manera similar a como se indicó para el polipéptido de la invención, la secuencia del polinucleótido de la invención puede comprender además al menos una secuencia de localización nuclear (NLS) unida en al menos uno de los extremos 3' ó 5' de la secuencia del fragmento del péptido GSE24.2, y más preferentemente unida en el extremo 3'.
Preferentemente, la secuencia de localización nuclear escogida para el polipéptido de la invención es una secuencia de localización nuclear dirigida al núcleo o al nucléolo, y más preferentemente se encuentra en el gen DKC1 de donde deriva la secuencia del GSE24.2. Ejemplos preferidos de secuencias de transporte al núcleo del gen DKC1 son las secuencias de transporte al núcleo que codifican por la secuencia peptídica KRKR (NLS1) o las secuencias de transporte al nucléolo que codifican por la secuencia peptídica KKEKKKSK (NLS2), y preferentemente es una secuencia de transporte al núcleo que codifica la secuencia peptídica KRKR (NLS1).
En una realización preferida, cuando el polinucleótido de la invención comprende una secuencia de localización nuclear unida a la secuencia codificante del fragmento activo del GSE24.2, dicho polinucleótido consiste en una secuencia que codifica un polipéptido seleccionado del grupo compuesto por: SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11 , SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13 y SEQ ID No.: 14. En una realización más preferida, consiste en una secuencia que codifica un polipéptido seleccionado del grupo compuesto por: SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 13 y SEQ ID No.: 14. En una realización aún más preferida, consiste en una secuencia que codifica un polipéptido seleccionado del grupo compuesto por SEQ ID No.: 7 y SEQ ID No.: 8
El polinucleótido de la invención como cualquiera de los descritos anteriormente puede obtenerse por un experto mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual" 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol 1-3). Las secuencias de estos polinucleótidos pueden estar integradas en un vector de expresión génica que permite la regulación de la expresión de la misma en condiciones adecuadas en el interior de las células. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención o una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de la invención, y que permite la expresión de un polipéptido que es capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN en una célula eucariota, preferentemente una célula humana, de ahora en adelante vector de la invención.
En general, según la presente invención, el vector de expresión comprende, además del polinucléotido descrito en la invención, un promotor que dirige su transcripción (por ejemplo, pT7, plac, ptrc, ptac, pBAD, ret, etc.), al que está operativamente enlazado, y otras secuencias necesarias o apropiadas que controlan y regulan dicha transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés, por ejemplo, señales de inicio y terminación de transcripción (tlt2, etc.), señal de poliadenilación, origen de replicación, secuencias de unión a ribosomas (RBS), secuencias codificantes de reguladores transcripcionales (enhancers), silenciadores transcripcionales (silencers), represores, etc. Ejemplos de vectores de expresión apropiados pueden seleccionarse de acuerdo con las condiciones y necesidades de cada caso concreto entre plásmidos de expresión, vectores virales (ADN o ARN), cósmidos, cromosomas artificiales, etc. que pueden contener, además, marcadores utilizables para seleccionar las células transfectadas o transformadas con el gen o genes de interés. La elección del vector dependerá de la célula huésped y del tipo de uso que se quiera realizar. Por tanto, según un modo de realización particular de la presente invención dicho vector es un plásmido o un vector viral. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia al igual que para la transformación de microorganismos y células eucariotas se pueden utilizar diferentes métodos ampliamente conocidas - transformación química, electroporación, microinyección, etc. - descritos en diversos manuales (Sambrook et al. "Molecular cloning, a Laboratory Manual" 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 vol 1-3).
El polipéptido de la invención, el polinucléotido de la invención y/o el vector de expresión génica definido en la presente invención, pueden utilizarse como un medicamento en un procedimiento de tratamiento y/o prevención de un ser humano afectado por una enfermedad causada por un aumento del estrés oxidativo y/o un daño en el ADN celular, preferentemente a través de su acción biológica en aquellas células afectadas por un aumento en sus niveles de radicales libres y/o un daño en la estructura de su ADN, preferentemente células humanas; también puede emplearse como herramienta biotecnológica en sistemas de cultivo celular o de ingeniería de tejidos "in vitro" para mejorar la viabilidad de los mismos. No obstante, la presente invención también contempla que la secuencia completa del péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1) y/o de su fragmento de 18 aminoácidos SEQ ID No.: 4 (GSE2) pueden utilizarse también para esa misma finalidad. Debe entenderse que las herramientas biotecnológicas, farmacéuticas, así como los procedimientos de terapia son suficientemente conocidos por un experto del sector de la técnica de tal forma que con la información descrita en la presente invención pueden desarrollarse sin excesivo esfuerzo.
Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polipéptido, o de un polinucléotido o vector que codifica dicho polipéptido, donde dicho polipéptido comprende al menos la SEQ ID No.: 2 (GSE4) y que es un fragmento del péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1) y que es capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN de una célula, en la elaboración de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento de, al menos, una enfermedad causada por una alteración, preferentemente un aumento, del estrés oxidativo y/o del daño del ADN celular. A título ilustrativo y sin que limite el alcance de la invención, dicha enfermedad es una perteneciente al siguiente grupo: disqueratosis congénita, una enfermedad neurodegenerativa (tal como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, ataxia cerebelosa o degeneración de medula espinal), síndrome del maullido de gato (Cri du Chat), ataxia telangiectasia, síndrome de "Nijmegen Breackage", síndrome de Bloom, síndrome de Werner, anemia de Fanconi, colitis ulcerosa, envejecimiento vascular, arterosclerosis, preferentemente aterosclerosis, cáncer, distrofia muscular de Duchene, progerias, hipersensibilidad a luz, inestabilidad genética causada por una mutaciones o un agente externo, síndrome de Hutchison Gilford; xeroderma pigmentosum, síndrome de Rothmund Thompson, fibrosis pulmonar y una enfermedad con inflamación crónica, como por ejemplo la artritis reumatoide.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, la enfermedad es al menos una seleccionada del grupo compuesto por: disqueratosis congénita, una enfermedad neurodegenerativa (como son entre otras, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ataxia cerebelosa o degeneración de medula espinal), síndrome del maullido de gato (Cri du Chat), ataxia telangiectasia, síndrome de Nijmegen Breackage, síndrome de Bloom, síndrome de Werner, anemia de Fanconi, colitis ulcerosa, envejecimiento vascular, arteriesclerosis, preferentemente aterosclerosis, y cáncer.
Según un aspecto de la invención, el medicamento o composición farmacéutica comprende un polipéptido y/o un polinucleótido o vector de expresión que lo codifica, donde dicho polipéptido comprende una secuencia seleccionada entre, al menos, una del grupo formado por: SEQ ID No.: 2, SEQ ID No. : 3, SEQ ID No.: 5 y/o SEQ ID No.: 6. No obstante, resultan preferidas aquellas realizaciones donde, el polipéptido consiste en una secuencia de secuencia igual o inferior a 25 aminoácidos preferentemente seleccionada entre al menos una del grupo formado por: SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5 y SEQ ID No.: 6. En otro aspecto de la invención, el medicamento o composición farmacéutica comprende un polipéptido y/o un polinucleótido o vector de expresión que lo codifica, donde el polipéptido además comprende, al menos, una secuencia de localización nuclear, unida de manera preferida a su extremo carboxilo terminal, seleccionada preferentemente entre al menos una del grupo formado por: SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11 , SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, y SEQ ID No.: 14. Aún más preferentemente la secuencia del polipéptido se escoge entre el grupo formado por SEQ ID No.: 7 y SEQ ID No.:8.
Otro objeto de la invención lo constituye una composición farmacéutica o medicamento, preferentemente para el tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías causadas por una alteración del contenido de radicales libres en el interior celular, causando un estrés oxidativo asociado y/o causadas por un daño de la estructura del ADN celular, en adelante composición farmacéutica de la presente invención, que comprende al menos un polipéptido, polinucleótido y/o vector de expresión capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN celular, en cantidad terapéuticamente efectiva junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables y que es capaz de regular y mantener el equilibrio redox y corregir un daño en el ADN. En el ámbito de la presente invención, dicha composición farmacéutica o medicamento pueden ser igualmente referidos como "composición farmacéutica o medicamento de la invención". Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los adyuvantes y vehículos conocidos por los técnicos en la materia y utilizados habitualmente en la elaboración de composiciones terapéuticas. A modo de ejemplo, pueden mencionarse las nanopartículas o liposomas, los cuales ayudan a la absorción e internalización de las moléculas.
En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad del polipéptido de la invención, o de una molécula o compuesto que permite la expresión de una secuencia nucleotídica que codifique por dicho polipéptido, capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN celular, calculada para producir el efecto deseado y que, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de los compuestos, incluyendo la edad, estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, y de la ruta y frecuencia de administración. En una realización particular, dicha composición terapéutica se prepara en forma de una forma sólida o suspensión acuosa, en un diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición terapéutica proporcionada por esta invención puede ser administrada por cualquier vía de administración apropiada, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. En una realización particular, la administración de la composición terapéutica proporcionada por esta invención se efectúa por vía parenteral, por vía oral, por vía intraperitoneal, por vía subcutánea, etc. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el Tratado de Farmacia Galénica, C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S.A. Ediciones, Madrid.
En una realización preferida, la composición farmacéutica o medicamento comprende un polipéptido de la invención que se selecciona entre al menos uno del grupo formado por: SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 1 1 , SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13 y SEQ ID No.: 14; o un polinucleótido o vector que codifica dicho polipéptido. Más preferentemente, el polipéptido que comprende o codifica se selecciona entre al menos uno del grupo formado por: SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 13 y SEQ ID No.: 14; y más preferentemente entre al menos uno del grupo formado por: SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7 y SEQ ID No.: 8.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica o medicamento comprende un polipéptido de la invención que contiene un fragmento del péptido GSE24.2 activo que se selecciona entre al menos uno del grupo formado por: SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5 y SEQ ID No.: 6; o un polinucleótido o vector que codifica dicho polipéptido.
En otra realización preferida, la composición farmacéutica o medicamento comprende un polipéptido de la invención que contiene el fragmento del péptido GSE24.2 activo unido a una secuencia de localización nuclear, preferentemente unida al extremo carboxilo terminal y se selecciona entre al menos uno del grupo formado por: SEQ ID No.: 7 y SEQ ID No.: 8, o un polinucleótido o vector que codifica dicho polipéptido.
La composición farmacéutica de la presente invención puede utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos. Otro aspecto de la invención lo constituye por tanto el uso de la composición farmacéutica de la invención, en adelante uso de la composición farmacéutica de la invención, en un método de tratamiento o prevención de un individuo, preferentemente un ser humano, afectado por una enfermedad, desorden o patología causada por una alteración del contenido de radicales libres en el interior celular, causando un estrés oxidativo asociado y/o causadas por un daño de la estructura del ADN. Preferentemente, la enfermedad o patología a tratar es una de las definidas en los usos de la composición anteriormente mencionados.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia del péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1) con SEQ ID No.: 2 capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN de una célula, o del polinucleótido o vector que lo codifica, en ingeniería de tejidos y cultivo celular para mejorar la viabilidad de los mismos. Preferentemente, dicho polipéptido consiste en al menos uno seleccionado del grupo compuesto por: SEQ ID No.: 1 , SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11 , SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, y SEQ ID No.: 14. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Breve descripción de las figuras FIG. 1. Determinación del daño al ADN en células AT: Las células AT AT3784 fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE24.2 o un vector vacío GFP y 24 horas más tarde fijadas para ser procesadas e hibridadas con un anticuerpo contra la histona H2AX fosforilada (Ser139). Como control negativo se utilizaron las células controles C-1787. Posteriormente se hibridaron con un anticuerpo marcado con fluoresceína y fueron teñidas con DAPI para localizar los núcleos. Se evaluaron los focos (foci) con tinción para la histona H2AX fosforilada en 200 células por tipo y los resultados se agruparon entre células que no presentaban focos, un número de focos entre 5 y 20 y mayor de 20.
FIG. 2. Determinación del daño al ADN en células AT: Las células AT AT3784 fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE24.2 o un vector vacío GFP y 24 horas más tarde fijadas para ser procesadas e hibridadas con un anticuerpo contra la quinasa pCHK2thr68. Como control negativo se utilizaron las células controles C-1787. Posteriormente se hibridaron con un anticuerpo marcado con fluoresceína y fueron teñidas con DAPI para localizar los núcleos. Se evaluaron los foci con tinción para pCHK2thr68 en 200 células por tipo y los resultados se agruparon entre células que no presentaban focos, un número de focos entre 5 y 20 y mayor de 20.
FIG. 3. Determinación de los niveles de ROS en células AT: Las células AT AT3189-P fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE24.2 o un vector vacío GFP y tres semanas después cargadas con el reactivo DHE que detecta niveles de ROS (del inglés Reactive Oxygen Species, o especies reactivas del oxígeno). Como control se utilizaron las células AT736C. Mediante citometría de flujo se determinaron las fluorescencias relativas de las tres líneas celulares y la proporción de células con intensidad máxima utilizando una longitud de onda: absorción 518 y emisión 605nm. Los datos se han representado como porcentaje relativo de células que emiten a esta longitud de onda. FIG. 4. Determinación de los niveles de fosforilación de p38 en células AT: Las células AT AT719-P fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE24.2 o un vector vacío GFP y tres semanas después se obtuvieron extractos proteicos. También se utilizaron células AT AT719-P infectadas con el GSE24.2 y seleccionada la población con máxima fluorescencia utilizando un sorter (AT AT719-P GSE24.2 sorter). Como control se utilizaron las células AT736C. Las proteínas se resolvieron en geles de poliacrilamida y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. La membrana se híbrido con un anticuerpo policlonal contra la proteína p38 fosforilada Thrl80/Tyrl82 y sin fosforilar como control de carga. Los valores relativos entre la proteína fosforilada y sin fosforilar obtenidos (mediante el programa NI hiIMAJE) para la línea celular control fueron considerados 1 y los demás referidos a ésta.
FIG. 5. Determinación de la viabilidad en respuesta a bleomicina en células AT: Las células AT AT719-P fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE24.2 o un vector vacío GFP y tres semanas después trataron con diferentes dosis de bleomicina. Como control se utilizaron las células AT736C. Las células se fijaron tras 72 horas de tratamiento y la viabilidad determinada con el reactivo MTS. Los valores representan el resultado del ensayo realizado en triplicado y expresan la viabilidad respecto a células sin tratar.
FIG. 6. Western blot de células F9 y F9A353V 24 horas después de transfectar los péptidos derivados del GSE24.2 sintetizados químicamente. Los péptidos indicados en cada línea del gel se transfectaron (15μg de cada péptido) en una placa de 30mm. Tras separar los extractos proteicos en geles de poliacrilamida y transferirlos a una membrana de nitrocelulosa la membrana se híbrido con un anticuerpo contra la histona H2AX (Ser139) y posteriormente con uno contra α-tubulina como control de carga.
FIG. 7. Cuantificación del western blot de la figura 6, para ello la señal obtenida con la histona H2AX (Ser139) se corrigió con la señal de α-tubulina considerando como 1 la señal obtenida con la células F9 transfectadas con betagalactosidasa (como control) utilizando el programa NIH-IMAJE.
FIG. 8. Western blot de células F9 y F9A353V 24 horas después de transfectar el péptido GSE4 a concentraciones crecientes. El péptido sintético GSE4 se transfectó a las concentraciones indicadas en cada línea del gel. La membrana se híbrido con un anticuerpo contra la Histona H2AX (Ser139) y α-tubulina como control de carga. FIG. 9. Cuantificación del western blot de la figura 8, para ello la señal obtenida con la histona H2AX (Ser139) se corrigió con la señal de α-tubulina considerando como 1 la señal obtenida con la células F9 transfectadas con betagalactosidasa. FIG. 10. Determinación de la actividad telomerasa en células VA13 tras la transfección de los péptidos GSE4 y GSE5. Para determinar el efecto de la expresión del los péptidos GSE4 y GSE5 se transfectaron en células VA13 mediante lipofección y 24 horas después se realizó un ensayo TRAP para la actividad telomerasa. FIG. 11. Determinación de los niveles de estrés oxidativo en células de ataxia telangiectasia, después de expresar los péptidos GSE24.2 y GSE4. Las células AT AT719-P fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE24.2, GSE4 o un vector vacío GFP y tres semanas después cargadas con el reactivo DHE que detecta niveles de ROS (del inglés Reactive Oxygen Species, o especies reactivas del oxígeno). Como control se utilizaron las células AT736C. Mediante citometría de flujo se determinaron las fluorescencias relativas de las cuatro líneas celulares y la proporción de células con intensidad máxima utilizando una longitud de onda: absorción 518 y emisión 605nm. Los datos se han representado como porcentaje relativo de células que emiten a esta longitud de onda. FIG 12. Niveles de expresión de citoquinas proinflamatorias en células de ataxia telangiectasia, después de expresar los péptidos GSE24.2 y GSE4. Las células AT AT719-P fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE24.2, GSE4 o un vector vacío GFP y tres semanas después se extrajo RNA y después de obtener el cDNA correspondiente se determinó el nivel de expresión de las citoquinas proinflamatorias IL6 e IL8. Como control se utilizaron las células AT736C. Como control de expresión se midieron los niveles de expresión del gen β-actina. Los resultados se expresan como el incremento en numero de veces de la expresión relativa de cada uno de los genes respecto a la β-actina considerando 1 , los nivles de expresión de las células AT736C. FIG. 13. Determinación de la senescencia en células AT después de expresar los péptidos GSE24.2 y GSE4: Las células AT AT2078 fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE24.2, GSE4 o un vector vacío GFP y 3 días u ocho días más tarde fijadas para determinar la expresión del enzima β-galactosidasa ácida asociada a senescencia (senescence-associated β-galactosidase). Como control negativo se utilizaron las células controles C-1787. Se determinó el porcentaje de células expresando β- galactosidasa del total de células por campo. Se evaluaron 200 células por tipo celular y los resultados se agruparon entre células que no presentaban actividad (pgal-, en división) y las células senescentes (p-gal+).
FIG. 14. Determinación del daño al ADN en células AT después de transfectar los peptidos GSE4 y SGSE4: Las células AT AT2078 fueron infectadas con un vector lentiviral expresando el GSE4, SGSE4 o un vector vacío GFP y 24 horas más tarde fijadas para ser procesadas e hibridadas con un anticuerpo contra la histona H2AX fosforilada (Ser139). Como control negativo se utilizaron las células controles C-1787. Posteriormente se hibridaron con un anticuerpo marcado con fluoresceína y fueron teñidas con DAPI para localizar los núcleos. Se evaluaron los focos (foci) con tinción para la histona H2AX fosforilada en 200 células por tipo y los resultados se agruparon entre células que no presentaban focos, un número de focos entre 5 y 20 y mayor de 20.
FIG. 15. Secuencias NLS1 y NLS2 de la secuencia de disquerina. Secuencias de localización nuclear (NLS1) y nucleolar (NLS2) contenidas en el gen DKC1.
FIG. 16. Esquema de las construcciones utilizadas para colocar las señales de localización nuclear NLS1 o NLS2 en las posiciones 5Ό 3'en la secuencia del GSE24.2. Se obtuvieron 4 construcciones colocando las secuencias NLS1 o NLS2 en la región 5Ό 3' del GSE24.2 conteniendo un Tag para myc en el vector de expresión pCDNA3myc.
FIG. 17 Expresión de las construcciones NLS1 -3, NLS1 -5, NLS2-3 y NLS2-5 GSE24.2 y GSE24.2 en células HeLa. 24 horas después de transfectar los plásmidos (utilizando lipofectamina) se detectaron la expresión y localización subcelular de los péptidos mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo contra el Tag de c-myc presente en las construcciones (ver Fig. 16).
FIG. 18. Expresión de las construcciones NLS1 -3 GSE24.2 y GSE24.2 en células HeLa. Tras 24 horas de transfectar los plásmidos (utilizando lipofectamina), se detectaron la expresión y localización subcelular de los péptidos mediante inmunofluorescencia con un anticuerpo contra el Tag de c-myc que se encuentra en la construcción.
FIG. 19. Expresión de las construcciones NLS2-3 GSE24.2 y GSE24.2 en células HeLa. Tras 24 horas de transfectar los plásmidos (utilizando lipofectamina) se detectaron la expresión y localización subcelular de los péptidos mediante inmunofluorescencia, con un anticuerpo contra el Tag de c-myc que se encuentra en la construcción.
FIG. 20. Actividad de las construcciones GSE24.2NLS1 -3 y GSE24.2NLS2-3 sobre el promotor de c-myc. Los vectores de expresión para las construcciones GSE24.2, GSE24.2NLS1-3 y GSE24.2NLS2-3 se transfectaron (utilizando lipofectamina) en células 293T junto con el gen reportero del promotor de c-myc, pXP1 y 24 horas después se midió la actividad luciferasa utilizando un kit comercial. Los valores se expresan como actividad relativa considerando 1 el valor de luciferasa con el vector de expresión pCDNA3myc vacío.
FIG. 21. Transfección de los péptidos GSE4 y GSE4NLS1 en células HeLa. Los péptidos GSE4 y GSE4NLS1 (SEQ ID No.: 7) marcados con fluoresceína y obtenidos por síntesis química, fueron transfectados en células HeLa utilizando el reactivo Proteojuice y visualizadas en un microscopio de fluorescencia confocal, 9, 24 y 48 horas tras la transfección.
FIG. 22. Internalización de los péptidos GSE4 y GSE4NLS1 en células HeLa. Los péptidos GSE4 y GSE4NLS1 (SEQ ID No.: 7) marcados con fluoresceína y obtenidos por síntesis química, fueron añadidos al medio de cultivo de células HeLa y visualizadas en un microscopio de fluorescencia confocal, 9, 24 y 48 horas tras la transfección.
Ejemplos
EJEMPLO 1. Capacidad del GSE24.2 de revertir daño al ADN en células de pacientes con ataxia telangiectasia.
Para realizar este ensayo se utilizaron líneas celulares de pacientes con ataxia telangiectasia (AT, del repositorio Coriell) con mutación en el gen ATM y denominada AT3487. La línea celular C-1787 se utilizó como línea celular control. Las células se infectaron con el vector lentiviral bicistrónico pCMV-GFP-GSE24.2. Tras 48 horas después de la infección las células fueron fijadas con formaldehído y posteriormente permeabilizadas tratándolas con Tritón X-100. El daño al ADN se estimó estudiando la señal tras la hibridación de las células con un anticuerpo contra la histona H2AX Ser139 y posterior hibridación con un anticuerpo ligado a fluoresceína. El número de focos (foci) con tinción para histona H2AX/núcleo se ha determinado utilizando microscopía confocal en un total de 200 células y los datos representados como porcentaje de células con un determinado número de foci.
En la figura 1 , se puede observar que la expresión del GSE24.2 corrige totalmente el daño global en el ADN en un 20% de las células AT y disminuye los niveles del daño al ADN en un 25% de las células AT por lo tanto se observa una corrección global del daño al ADN del 40%.
Posteriormente se realizó un experimento similar al anterior pero determinando el daño al ADN mediante la hibridación con un anticuerpo que reconoce la proteína pCHK2 fosforilada en la Thr68, y los datos indican que en este caso un 25% menos de células AT, presentan daño basal tras expresar el GSE24.2 y se disminuyen los niveles altos de daño al ADN en un 13% (Figura 2). Por tanto la expresión del GSE24.2 es capaz de corregir el daño en el ADN en un 28% de las células, confirmando los datos obtenidos con la histona H2AX fosforilada.
EJEMPLO 2. Capacidad del GSE24.2 de disminuir los niveles de radicales libres en células de pacientes con ataxia telangiectasia. Una de las características de las células AT es un aumento en el contenido de radicales libres. Esto se debe a la falta de función de la proteína ATM, la cual es capaz de mantener el equilibrio redox en las células normales, cuando las células están expuestas a estrés ambientales como son el cultivo in vitro. Para verificar si la expresión del GSE24.2 tenía algún impacto sobre la regulación de los niveles de radicales libres, utilizamos el compuesto Dihydroethidium (Hydroethidine), el cual permite cuantificar los niveles de radicales libres en células vivas. Para este experimento utilizamos linfoblastos controles AT736C y una línea de linfoblastos AT AT3189-P. Estas últimas se infectaron con el vector lentiviral expresando el GSE24.2 pCMV-GFP-GSE24.2 o un vector vacío expresando solo GFP (GFP). Tres semanas después de la infección las células se cargaron con el reactivo DHE durante 30 minutos y mediante citometría de flujo se determinó la proporción de células con diferente contenido en radicales libres. Los resultados mostraron (Figura 3) que el nivel de radicales libres en las células AT736C era menor que las células AT3189-P, expresando el vector vacío (GFP). En cambio los niveles de ROS disminuían en las células AT3189-P GSE24.2 hasta valores comparables a los encontrados en células controles AT736C. EJEMPLO 3. Capacidad del GSE24.2 de disminuir los niveles la quinasa p38 fosforilada en células de pacientes con ataxia telangiectasia.
Una de las características de las células de pacientes AT, es una mayor activación de la MAP quinasa p38, debido a la falta de función de la proteína ATM. Este aumento en la activación de p38, desencadena el proceso de muerte celular en las células AT y por tanto una disminución en el número de células neuronales. Por tanto se comprobó si la expresión del GSE24.2 era capaz de disminuir la activación de p38 en las líneas celulares de pacientes AT. Para ello, las células AT AT719 se infectaron con un vector lentiviral expresando el GSE24.2 pCMV-GFP-GSE24.2 o un vector vacío expresando solo GFP (GFP) y tres semanas tras la infección se obtuvieron extractos proteicos de ambas líneas celulares. Como control negativo se utilizó la línea celular de linfoblastos normales AT736. Los extractos se resolvieron en geles de poliacrilamida y las proteínas se transfirieron a filtros de nitrocelulosa para su posterior hibridación con anticuerpos. Se empleó un anticuerpo que detecta la proteína p38 fosforilada y posteriormente se rehibridaron con un anticuerpo contra la proteína p38 no fosforilada, como control de carga. La señal obtenida en ambas hibridaciones se cuantificó con el programa NIH-IMAJE y los valores relativos entre la proteína fosforilada y sin fosforilar obtenidos para la línea celular control considerados 1. En la Figura 4 se puede observar que los valores aumentan mucho en el caso de las células AT719 infectadas con el virus GFP, pero disminuyen de forma relevante a niveles similares a las células controles cuando se infectan con el virus GSE24.2. Estos datos indican que una de las consecuencias de la falta de activación de ATM y el estrés oxidativo asociado, la activación de p38, se revierte tras la expresión del GSE24.2 EJEMPLO 4. Capacidad del GSE24.2 de aumentar la viabilidad tras el tratamiento con un fármaco radiomimético en células de pacientes con ataxia telangiectasia.
Las mutaciones en el gen ATM, sensibilizan las células de pacientes AT al tratamiento con radiación ionizante o drogas radiomiméticas como la bleomicina. Con el fin de verificar si el efecto protector inducido por el GSE24.2 en células de pacientes AT, se extendía también a los agentes radiomiméticos, células de pacientes AT719 expresando el pCMV-GFP- GSE24.2 o un vector vacío expresando solo GFP (GFP) fueron tratadas con concentraciones crecientes de bleomicina durante 72 horas, tras las cuales la viabilidad celular se evaluó utilizando el reactivo MTS. Como control se utilizaron las células AT736C. Los resultados mostraron que la expresión del GSE24.2 era capaz de aumentar la viabilidad de las células AT719 hasta niveles similares a las células control, mientras que de acuerdo con lo descrito, las células AT719 o AT719GFP eran más sensibles que las controles (Figura 5). Estos resultados demuestran que la expresión del GSE24.2 es capaz de proteger de la muerte celular inducida por agentes radiomiméticos. EJEMPLO 5. Ensayo de la actividad de los péptidos descritos. Rescate del daño al ADN.
Se obtuvieron lisados bacterianos de bacterias RosettaGami2 expresando el vector bacteriano pGATEVGSE24-2. Para ello las bacterias se sonicaron en un medio salino con inhibidores de proteasas y la proteína de fusión expresada por el plásmido bacteriano fue purificada por columnas de glutation sepharosa. Los lisados se sometieron a HPLC para separar los péptidos del resto de proteínas celulares arrastradas utilizando columnas de separación por tamaño y carga. Las fracciones resultantes fueron secuenciadas utilizando un secuenciador que utiliza un método derivado del método de EDMA y de uso comercial. Los diferentes péptidos encontrados en los lisados bacterianos de bacterias expresando el GSE24.2 fueron obtenidos por síntesis química y se ensayaron para la actividad de rescate del daño al ADN utilizando las células F9A353V que portan la mutación más frecuente en pacientes con disqueratosis congénita A353V. Para ello los diferentes péptidos se lipofectaron utilizando el reactivo Proteojuice en células F9A353V y como control de daño (células sin daño) se utilizaron las células control F9. Se utilizó un péptido no relacionado como control negativo y el GSE 24.2 completo como control positivo. Tras cuantificar los western blot (Figura 6) se encontró que el GSE4 es el péptido de menor tamaño capaz de rescatar el daño al ADN medido por magnitud de fosforilación de la histona H2AX Ser319, que aparece en las células A353V (Figura 7).
Con el fin de optimizar las condiciones de funcionamiento del péptido GSE4, se transfectaron diferentes cantidades del péptido GSE4 en las células F9A353V y se determinó la magnitud del daño al ADN utilizando un anticuerpo específico tal como se realizó en la Figura 6 (Figura 8). Tras la cuantificación del western blot (Figura 9) se observa que la máxima inhibición del daño al ADN se obtiene transfectando 8μgs del péptido GSE4.
EJEMPLO 6. Medida de aumento de actividad telomerasa tras el tratamiento con el péptido GSE4. La otra forma de cuantificar la actividad del péptido GSE4 ha sido evaluar la capacidad del mismo de aumentar la actividad telomerasa en las células VA13. Para ello se transfectaron estas células con 8μg de los dos péptidos GSE4 y GSE5. Tras 48 horas las células se procesaron para ensayar la actividad telomerasa por el método TRAP.
Tal como se puede apreciar en la figura 10 (A y B), a pesar de que el péptido GSE5 tiene una actividad de rescate del daño al ADN similar al GSE4, este último tiene una actividad mucho mayor reactivando la actividad telomerasa. Por tanto la actividad del péptido GSE4 es la más eficiente para la reactivación de la actividad telomerasa.
EJEMPLO 7. Medida de disminución de estrés oxidativo, inflamación y senescencia tras el tratamiento con el péptido GSE4.
Como el péptido denominado GSE4, era el de menor tamaño entre los péptidos con capacidad de rescatar actividad telomerasa, estudiamos si tenía la misma actividad que el péptido GSE24.2 para atenuar el estrés oxidativo, la expresión de citoquinas proinflamatorias y rescatar la senescencia en células de ataxia telangiectasia. Tal como se puede apreciar en la figura 1 1 , el péptido GSE4 es capaz de disminuir hasta en un 50% los niveles de radicales libres al igual que lo hace el péptido GSE24.2 en células AT-719P. Además en estas células es capaz de disminuir hasta en un 80% y 90% respectivamente los niveles de expresión de IL6 e IL8 (Figura 12), estos valores están en el mismo rango que el péptido GSE24.2. Finalmente dado que el aumento en la expresión de las interlequinas IL6 e IL8 están asociadas a un fenotipo secretor ligado a senescencia en ataxia telangiectasia, evaluamos la capacidad de ambos péptidos GSE24.2 y GSE4 de disminuir la senescencia, mediante la evaluación de la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia SApgal (Figura 13). Los datos mostraron que la expresión de ambos péptidos, disminuye el porcentaje de células positivas para actividad pgal de una forma progresiva en el tiempo. Los resultados de estos experimentos demuestran que la secuencia del péptido GSE4 conserva la región necesaria para además de la disminución del daño al ADN y aumento de actividad telomerasa, para disminuir el estrés oxidativo, los niveles de interleuquinas proinflamatorias y la senescencia.
EJEMPLO 8. Medida del daño al ADN con el péptido GSE4 y uno de secuencia similar localizado en el dominio TRUBII de la disquerina denominado SGSE4.
Como el péptido denominado GSE4, era el de menor tamaño entre los péptidos con capacidad de inhibir el daño en el ADN, estudiamos si otro péptido con secuencia similar localizado dentro de la secuencia del peptido GSE24.2 tenía la misma actividad o si la misma era específica del GSE4. El péptido SGSE4 (SEQ ID No.15) utilizando similar al GSE4 en secuencia (los aminoácidos LDPK/LDKP que constituyen una secuencia consenso para pseudouridina sintasas) y tamaño se encuentra en el dominio TRUBII de la disquerina. Para realizar este ensayo se utilizaron líneas celulares de pacientes con ataxia telangiectasia AT2078. La línea celular C-1787 se utilizó como línea celular control. Las células se infectaron con el vector lentiviral bicistrónico pCMV-GFP-GSE4, SGSE4 o GFP. Tras 48 horas después de la infección las células fueron fijadas con formaldehído y posteriormente permeabilizadas tratándolas con Tritón X-100. El daño al ADN se estimó estudiando la señal tras la hibridación de las células con un anticuerpo contra la histona H2AX Ser139 y posterior hibridación con un anticuerpo ligado a fluoresceína. El número de focos (foci) con tinción para histona H2AX/núcleo se ha determinado utilizando microscopía confocal en un total de 200 células y los datos representados como porcentaje de células con un determinado número de foci.
En la figura 14, se puede observar que la expresión del GSE4 corrige el daño global en el ADN en un 38% de las células AT por lo tanto se observa una corrección global del daño al ADN del 60%. El peptido SGSE4, no es capaz de corregir el daño al ADN en las mismas condiciones. Por tanto solo la secuencia GSE4 y no otra similar es capaz de rescatar el daño en el ADN en células AT. EJEMPLO 9. Ensayo de la capacidad de entrar en las células de los péptidos GSE24.2 con y sin señal de localización nuclear.
Un aspecto relevante a investigar del péptido GSE24.2 es su localización subcelular una vez expresado. Por tanto se obtuvieron diferentes construcciones colocando en la región 5' y 3' del GSE 24.2 dos señales de localización nuclear NLS1 y NLS2. NLS1 es una señal presente en la secuencia del gen DKC1 que lleva a la proteína al núcleo y la secuencia NLS2 media el transporte al nucléolo. En la figura 15 se presenta la secuencia de ambas señales de localización nuclear. Se ha utilizado el plásmido de expresión en células eucariotas, pCDNA3myc, que contiene un Tag del gen c-myc en la posición 5' fusionado con la secuencia GSE24.2. Se han obtenido varias construcciones que se representan en la figura 16, colocando las secuencias NLS1 y NLS2 tanto en las posiciones 5' como 3'en la secuencia del GSE24.2. Las construcciones denominadas NLS1-3, NLS1-5, NLS2-3 y NLS2-5 de GSE24.2 se han transfectado en células HeLa. Estas construcciones llevan la secuencia Tag de c-myc reconocido con el anticuerpo 9E10, para localizar la expresión en las construcciones. En la figura 17 se puede observar como las construcciones con la señal de localización NLS1 o NLS2 en la posición 3' del GSE24.2 son las que preferentemente facilitan la expresión en núcleo del GSE24.2. En las figuras 18 y 19 se puede observar un detalle de la localización subcelular de las construcciones NLS1-3 y NLS2-3.
EJEMPLO 10. Actividad de las construcciones GSE24.2NLS1 -3 y GSE24.2NLS2-3 para activar la expresión de c-myc.
Con el objeto de evaluar la actividad biológica de las construcciones conteniendo las señales NLS1-3 y NLS2-3, se transfectaron en células 293T junto con el gen reportero del promotor de c-myc y se evaluó la actividad luciferasa activada por ambas construcciones GSE24.2NLS1-3 y GSE24.2NLS2-3 en relación al GSE24.2. Como se puede observar en la figura 20 tanto los vectores GSE24.2NLS1-3 como GSE24.2NLS2-3 activan la expresión del promotor de c-myc con mayor eficiencia que el GSE24.2. Estos datos están de acuerdo con una mayor capacidad de ambas construcciones de expresarse en el núcleo celular. De entre las dos construcciones la más eficiente ha sido la construcción con la señal NLS1 en la posición 3'.
EJEMPLO 11. Capacidad del GSE4 de entrar en las células.
Dada la capacidad de la secuencia NLS1 de contribuir a la actividad del GSE24.2, se encargó un péptido sintético en el cual se colocó esta secuencia en la región 3' del péptido GSE4, ya que éste era el péptido para el cual se obtuvo una mayor activación de la telomerasa. Los péptidos obtenidos por síntesis química fueron marcados con fluoresceína para facilitar su visualización en un microscopio de fluorescencia. Se realizaron dos experimentos en paralelo, por una parte los péptidos se transfectaron utilizando el reactivo Proteojuice o se añadieron directamente al medio de cultivo. Los resultados han mostrado que tanto el GSE4 y el GSE4NLS1 (SEQ ID No.7) entran en la célula utilizando el reactivo Proteojuice (Figura 21) o simplemente añadiéndolo al medio de cultivo (Figura 22). Una diferencia importante observada es que cuando se añaden los péptidos directamente al medio de cultivo hay un mayor número de células en las cuales entra el péptido, que cuando se utiliza Proteojuice. Con el reactivo, hay una mayor eficiencia de internalización pero a un menor número de células.

Claims

REIVINDICACIONES
1- Polipéptido caracterizado por que comprende un fragmento de la secuencia del péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1) con SEQ ID No.: 2 capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN de una célula, excepto cuando dicho polipéptido consiste en el péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1), o un fragmento del mismo con secuencia SEQ ID No.: 4 (GSE2).
2- Polipéptido según la reivindicación 1 caracterizado por que comprende al menos un fragmento del péptido GSE24.2 seleccionado entre al menos uno del grupo formado por:
SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5 y SEQ ID No.: 6.
3- Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que además de dicho fragmento, comprende al menos una secuencia de localización nuclear unida en al menos uno de los extremos carboxilo o amino terminal de su secuencia de aminoácidos.
4- Polipéptido según la reivindicación 3 caracterizado por que la secuencia de localización nuclear se encuentra unida al extremo carboxilo terminal de dicho fragmento.
5- Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, caracterizado por que la secuencia de localización nuclear es la secuencia KRKR y/o KKEKKKSK.
6- Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado por que consiste en una secuencia seleccionada del grupo compuesto por: SEQ ID No.: 7, SEQ ID
No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 1 1 , SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13 y SEQ ID No.: 14.
7- Polinucleótido caracterizado por que codifica un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8- Vector de expresión caracterizado por que comprende una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. 9- Composición farmacéutica caracterizada por que comprende al menos un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y/o un polinucleótido según la reivindicación 7 y/o un vector de expresión según la reivindicación 8. 10- Composición farmacéutica según la reivindicación 9 caracterizada por que comprende además al menos un adyuvante y/o vehículo farmacéuticamente aceptable.
1 1- Uso de un polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia del péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1) con SEQ ID No.: 2 capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN de una célula, para la preparación de una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o de un trastorno provocado por un aumento del estrés oxidativo y/o del daño del ADN celular. 12- Uso según la reivindicación 11 caracterizado por que el polipéptido se escoge entre al menos uno del grupo compuesto por: SEQ ID No.: 1 , SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 1 1 , SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, y SEQ ID No.: 14. 13- Uso de un polinucleótido definido en la reivindicación 7 para la preparación de una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o de un trastorno provocado por un aumento del estrés oxidativo y/o del daño del ADN celular. 14- Uso de un vector de expresión definido en la reivindicación 8 para la preparación de una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad y/o de un trastorno provocado por un aumento del estrés oxidativo y/o del daño del ADN celular. 15- Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 1 a 14 caracterizado por que la enfermedad o trastorno se selecciona entre al menos uno del grupo compuesto por: disqueratosis congénita, una enfermedad neurodegenerativa, síndrome del maullido de gato (Cri du Chat), ataxia telangiectasia, síndrome de "Nijmegen Breackage", síndrome de Bloom, síndrome de Werner, anemia de Fanconi, colitis ulcerosa, envejecimiento vascular, arteriesclerosis, preferentemente aterosclerosis, cáncer, distrofia muscular de Duchene, progeria, hipersensibilidad a luz, inestabilidad genética causada por una mutación o un agente externo, síndrome de Hutchison Gilford, xeroderma pigmentosum, síndrome de Rothmund Thompson, , fibrosis pulmonar, artritis reumatoide, y una enfermedad con inflamación crónica. 16- Uso según la reivindicación 15 caracterizado por que la enfermedad neurodegenerativa se selecciona entre al menos una del grupo compuesto por: enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, ataxia cerebelosa y degeneración de medula espinal. 17- Uso de un polipéptido que comprende un fragmento de la secuencia del péptido GSE24.2 (SEQ ID No.: 1) con SEQ ID No.: 2 capaz de disminuir la producción de radicales libres y/o el daño en la estructura del ADN de una célula, o del polinucleótido o vector que lo codifica, en ingeniería de tejidos y cultivo celular para mejorar la viabilidad de los mismos.
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