TR201809579T4 - Protransduzin B, bir gen transferi güçlendiricisi. - Google Patents

Abstract

Buluş X-Glu-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln dizisine (DİZİ İD NO1) sahip N-terminal olarak korunmuş bir peptide ilişkin olup, burada X peptidin N-terminalini koruyan bir gruptur.

Description

TARIFNAME PROTRANSDUZIN B, BIR GEN TRANSFERI GÜÇLENDIRICISI Açiklama Bu basvuru bir peptide, bu peptidi içeren bir ilaca, gen terapisinde kullaniin için bu peptide, genetik olarak tasarlanmis bir viral olusumla bir hücrenin enfeksiyonunu arttirmak için bir usule ve bu peptidin bir hücrenin bir virüsle enfeksiyonunun arttirilmasinda kullanimina iliskindir.

Uygulanan usullerdeki muazzam ilerleme nedeniyle son yillarda genetik mühendisliginin önemi artti, çünkü sadece protein/peptit etken maddelerinin üretiminin degil, ayni zamanda hücrelerin bir laboratuvar araci olarak stabil genlerle transfeksiyonunun ve sonuçta gen kusurlari için bir çare olarak genlerin hücrelere dâhil edilmesinin çok sayida hastaligin tedavisi için çok yararli olacagi öngörülebilmektedir.

Ilk beseri genlerin klonlanmasindan ve rekombinant üretimden bu yana, gen transferi usulleri artan veriinlilikle sürekli ilerledigi için spesifik hücre fonksiyonlarini degistirmek için genetik malzemenin dâhil edilmesi temel ve uygulamali biyolojik-tibbi arastirmanin vazgeçilmez bir araci haline geldi. Gen dâhil etmenin çok sayida usulü optimizasyona yol açti. Baslangiçta çok yavas olmakla birlikte, uzun yillar boyunca uygun deneyler toplandi. islevinin açiklanmasindan bile önce, F. Griffith 1920ilerin sonlarina dogru deneylerde apatoj enik Pneumococcus suslarini patoj enlere transforme etmeyi basardi. Bu transformasyon sansli bir durumdan kaynaklanmisti, çünkü pnömokoklar nadir bir DNA alimi kabiliyetine sahipti. DNA”nin spesifik bir sekilde prokaryotlar içine dâhil edilmesi, digerlerinin yani sira J. Lederberg, M. Delbrück ve S. Luria tarafindan fajlar vasitasiyla saglandi, buna transdüksiyon adi verildi. Hücre kültürünün saglanmasi, ökaryotik hücrelerin in vitro kosullar altinda kültürlenmesiyle birlikte, transfeksiyon için bir dizi fiziksel ve kimyasal usul gelistirildi. Daha sik kullanilan, ama daha pahali ekipman gerektiren fiziksel usuller arasinda, l980”lerde ve bugün hâlâ alisilageldik olan kalsiyum fosfat çökeltme usulü veya katyonik lipidlere ve katyonik polimerlere dayanan, 1990,larin baslarinda yaygin olan usuller gibi daha basit uygulanabilen kimyasal usullerle rekabet eden elektroporasyon ve mikroenj eksiyon yer alir. Ancak bu usullerin kullanimi her zaman hücrelere veya DNA°ya dayaniyordu. Ayrica hücrelere dâhil edilen DNA genellikle ekstrakromozomaldi (geçici transfeksiyon) ve dolayisiyla yavru hücrelere aktarilmiyordu. Ancak, fajlarin (örnegin lainbda faj) DNAllarini konakçi genomuna entegre ettigi biliniyordu (profaj, lizoj enik enfeksiyon yolu). Buradan, “Retrovirüslerin gen vektörleri olarak saptanmasi”na (Doehmer ve digerleri ve Tabin ve digerleri) sadece bir adim vardi (1981/1982). Virüsler türe spesifik ve organa/dokuya spesifiktir, bu nedenle bütün virüsler bütün (ökaryotik) hücreleri enfekte etmez. Viral zarftaki degisiklikler (glikoproteinlerin degisimi, psödotip virüsler) ve çogunlukla katyonik olan peptitlerin ilave edilmesinin transdüksiyon etkinligini arttirdi gi varsayilmaktadir.

Virüs parçaciklari aliminin ilk güçlendiricileri HIV çalismasinda dikkat çekti. Bir spesifik hücre testi vasitasiyla in vitro enfeksiyon analizleri sirasinda, HIV füzyonunun kan filtrat peptitleriyle inhibisyonu gözlemlendi (Münch ve digerleri, VIRIP).

Proteinlerin, sasirtici bir sekilde dogal olarak olusan bu fragmanlarinin insan sperminde, amiloid fibriller olarak karakterize edilen güçlendiriciler olarak lifli yapilar - “Virüs Enfeksiyonunun Sperm türevli Güçlendiricisi” (SEVI) - olusturdugu gözlemlendi. Bu nanofibriller virüslerin hedef hücrelerine kenetlenmesini destekleyerek, viral enfeksiyon hizini onun birkaç kati arttirir.

Bu, temel arastirma ve gelecekteki muhtemel terapötik uygulamalar için retroviral gen transferini gelistirmek için kullanildi. Böylece, gen terapisi için kullanilan lentiviral ve gama-retroviral vektörlerin beseri T hücreleri, servikal karsinom hücreleri, lösemi hücreleri, hematopoietik kök hücreler ve embriyonik kök hücreler gibi farkli hücre tipleri için SEVI proteinin varliginda çok daha yüksek gen transferi hizi gösterdigi ortaya SEVl ve seminogelin gibi baska güçlendiricilerin gelistirilmesine yönelik çalismalar, viral zarf proteinlerinden peptitlerin de transfeksiyon güçlendiricileri olarak uygun olabilecegi varsayiinina yol açti ve bu varsayim sasirtici bir sekilde beklenmedik ölçüde büyük bir basari kazandi (Maral Yolamanova, Nature Nanotechnology, Cilt 8, No. 2, sayfa 130-136).

Böylece, örnegin farkli konsantrasyonlarda (1-100 ug/m1)pr0transduzin A (es anlamlisi EF-C) ile önceden inkübe edilen HIVllerin raportör hücrelerle onun birkaç kati artan bir enfeksiyon gösterdigi ortaya konulabildi. Etki mekanizmasi olarak, EF-C”nin virüsleri baglayabilen ve konsantre edebilen ve dolayisiyla virüslerin hücre içine girisini arttirabilen fibriler yapilar olusturdugu varsayildi. Viral parçaciklarla enfeksiyonun yani sira, EF-C gen terapisinde uygulanan çok çesitli beseri hücre tiplerinde (T hücreleri, gliyal hücreler, fibroblastlar, hematopoietik kök hücreler) yüksek verimlilikle lentiviral ve retroviral parçaciklarin transdüksiyonunu arttirmaktadir (Jan Münch ve digerleri, Nature iliskindir.

Yukarida açiklandigi gibi gen teknolojisinin artan Önemi nedeniyle, gen transferinin daha etkili güçlendiricileri istenmektedir. Bulusun amaci gelistirilmis bir gen transferi güçlendiricisi sunmaktir.

Sasirtici bir sekilde asagidaki diziye sahip bir peptidin bulusun amacina ulastigi tespit edilmistir: X-Glu-Cys-Lys-lle-Lys-Gln-Ile-lle-Asn-Met-Trp-Gln (DIZI ID NO: 1), burada X-Glu grubu amino asit piroglutamik asidi temsil eder Sasirtici bir sekilde sulu çözeltide protransduzinin stabilitesindeki büyük bir artisa yol açanin, in vitro (hücresel etkiler, özellikle enzimlerin varligi olmadan) piroglutamik asitle N-terminal ucun modifikasyonu oldugu tespit edildi. Bu, Sekil 1”de gösterilen sonuçlardan açikça görülmektedir. depolama üzerine protransduzin A için sonuçlar, ayni kosullar altinda protransduzin B için sonuçlarla karsilastirilmaktadir. Protransduzin A”nin 13 gün 4°C3de depolama sonucunda yarisina kadar bozundugu açiktir, protransduzin B ise ayni depolama kosullari altinda hemen hemen hiç bozunmadi (piklerin yüksekligi numunede bulunan bilesenlerin konsantrasyonuna karsilik gelmektedir). digerleri amiloid peptitlere, özellikle piroglutamatla modifiye edilmis amiloid polipeptitlere iliskin son durumu bildirmektedirler. Bu amiloid polipeptitler çok sayida ainino aside sahiptir ve temel olarak, bulusa uygun olanlarin da dâhil oldugu kisa zincirlerle karsilastirilabilir degildir. Bu arada, bu kisa inceleme, protransduzinin stabilitesinin bulusa göre gelistirildigi kosullarla, yani in vitro kosullarla hiçbir sekilde karsilastirilabilir olmayan bir sekilde, enzimlerin varliginda in Vivo kosullar altinda gerçeklesen hücresel olaylara iliskindir, Bulusa uygun peptit bir ilaç olarak da kullanilabilir.

Bulus ayrica bulusa uygun peptidin, gen terapisiyle tedavi edilebilen hastaliklari tedavi etmek için gen terapisinde kullanimina iliskindir.

Bulus ayrica bir hücrenin bir virüs tarafindan enfeksiyonunu arttirmak için, asagidaki asamalari içeren bir usule iliskindir: - bir organik çözücü içinde erimis olarak istem lie uygun peptidi temin etmek; - peptidin çözünmez yigisimlarini olusturmak için peptidi sulu bir çözeltiye ilave etmek; - yukaridaki son asamada elde edilen çözeltiyi karistirmak; ve - hücreleri kültürleinek.

Bu bulus ayrica bulusa uygun peptidin bir hücrenin bir virüsle enfeksiyonunu arttirmak için kullanimina iliskindir. Son olarak, bulusa uygun peptidi içeren bir kit de sunulmaktadir.

Bulusa uygun peptit (protransduzin B) Merrifieldie uygun usulle Fmoc korumali amino asitlerle hazirlanabilir.

Bu usul Fmoc korumali türevlerle, yani (9-Ilorenilmetoksikarbonil) korumali amino asitlerle, Merrifield prensibine göre asamali bir kati faz sentezinde, özellikle sentezleyici ABI-433 üzerindeki bir kati destek olarak önceden Fmoc-L-glutamin (0.59 mmol/g, 100- 200 elek numarasi) yüklenmis bir Wang reçinesi üzerinde isler.

Tipik olarak on kat molar fazlalikta kullanilan Fmoc-L-amino asitlerin aktivasyonu oda sicakliginda N-metil-Z-pirolidinon (NMP) içinde ve 2 M diizopropiletilamin (DIEA) ilaveleriyle [(2-( 1H-benzotriazol-1-il)-l,1,3,3- tetrametiluronyuin heksaflorofosfat] (HBTU, 100 mmol/l) ile yapilir.

Münferit açilasyon reaksiyonlari 45 dakika sürer ve %20 piperidinle Fmoc korumasinin kaldirilmasi 15 dakika sürer.

Sentez için asagidaki amino asit türevleri ve iliskili ortogonal asitle yarilabilir yan zincir koruyucu gruplari kullanilir: Fmoc-L-Asn(Trt), Fmoc-L-Cys(Trt), L-pGlu, Fmoc-L-Gln(Trt), Fmoc-L-Ile, Fmoc-L- Lys(Boc), Fmoc-L-Met ve Fmoc-L-Trp(Boc).

Reçine desteginin %94 trifloroasetik asit (TF A), %3 etanditiol (EDT) ve %3 minerali giderilmis suyla peptidil reçineden yarilmasindan sonra, islenmemis peptit soguk ter-bütil metil eter içinde çökeltilir, islenmemis peptit santrifujden geçirilerek bir pelet elde edilir ve üst faz atilir.

Islenmemis peptidin sonraki kromatografik saflastirilmasi gradyan elüsyonuyla preparatif bir sekilde yapilir.

EP 2 452 947 A1”e uygun protransduzin A ile protransduzin B arasindaki fark, sentetik L- piroglutamik asidin (pGlu) protransduzin Blde sentetik L- glutamin (Gln) yerine N-terminal olarak sokulmasinda yatar. Orijinal glutamin bir laktam olusturmak için halka kapanisiyla modifiye edilir.

Saflastirma: Preparatif ayirma: Saflastirma Gilson company,den bir HPLC üzerinde uygulanir. UV/VlS detektörü Kronwald companyidendir ve ayrilina 230 nm dalga uzunlugunda saptanir. Akis hizi 40 ml/dakikadir.

Kolon bir Waters Prep-Pak C18 kartustur (47 x 300 mm).

Elüsyon maddesi A: Minerali giderilmis su içinde %01 TFA; elüsyon maddesi B: %80 asetonitril ve %20 minerali giderilmis su içinde %0.] TFA.

Protransduzin B için gradyan 40 dakikada %3 5-%55 elüsyon maddesi B, yani dakikada Protransduzin B %40 elüsyon maddesi B”de elute olur ve 0.5 ila 1 dakikalik birkaç fraksiyon halinde toplanir. Analitik olarak temiz fraksiyonlar havuzlanir ve liyofilize edilir.

Uygulama için islem: Liyofilizasyon: Dondurarak kurutma için, teknik verileri asagidaki gibi belirlenen, Christ company,nin kondansatör performansi maksimum 45 kg/24 saat; vakum pompasinin nihai kismi basinci, gaz dengeleyici kullanilarak/kullanilmadan 1 x 10-3/10'4 mbar; dondurarak kurutma verileri (birim gaz dengeleyiciyle manuel olarak çalistirilir): nihai kismi basinç 1 x 10*2 mbar; buz kondansatör sicakligi -50°C; raf sicakligi +15°C; raf isitmasinin çalisma noktasi 0.5 mbar; dondurarak kurutma süresi 3 güne kadar.

Hücrelerin protransduzin B ile transdüksiyonu 0.5 mg protransduzin B,yi 50 ul DMSO içinde eritin. Daha sonra çözeltiye 450 ul PBS ilave edin, 3 dakika içinde Iibriller olusur. Bu stok çözeltisini (l mg/ml) vektörlere ilave ederek 25 ug/ml protransduzin B konsantrasyonu elde edin. Çözeltiyi 1 dakika vorteksledikten sonra 5 dakika 5000 g°yle santrifüjden geçirin. Üst fazi atin ve peleti biraz PBS içinde süspansiyon haline getirin ve hücrelere ilave ediln. Hücreler 2 gün bir inkübatörde inkübe edilir.

Transdüksiyon hizi protransduzin B ile önemli ölçüde artar. Hücrelerin %96`ya kadari protransduzin B ile transdüksiyondan geçirilebilir.

Claims (6)

ISTEMLER

1. Asagidaki diziye sahip bir peptit:

X-Glu-Cys-Lys-Ile-Lys-Gln-Ile-Ile-Asn-Met-Trp-Gln, burada X-Glu grubu amino asit piroglutamik asittir. 5 2. Istem l,e uygun bir peptidi içeren bir ilaç.

3. Gen terapisiyle tedavi edilebilen hastaliklari tedavi etmeye yönelik gen terapisinde kullanim için istem l,e uygun peptit.

4. Bir hücrenin bir virüs tarafindan enfeksiyonunu arttirmak için bir usul olup, asagidaki asamalari içerir: - peptidin çözünmez yigisimlarini olusturmak için peptidi sulu bir çözeltiye ilave etmek; - yukaridaki asamada elde edilen çözeltiyi karistirmak; ve - hücreleri kültürlemek.

5. Istem 'l ,e uygun peptidin, bir hücrenin bir virüsle enfeksiyonunu arttirmak için in vitro 15 kullanimi.

6. Istem l'e uygun bir peptidi içeren bir kit.