WO2015025967A1 - 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 - Google Patents

網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 Download PDF

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WO2015025967A1
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徳重 中野
親文 大曽根
Yoshiki Sasai (笹井 芳樹)
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住友化学株式会社
独立行政法人理化学研究所
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing retinal tissue and retinal related cells such as retinal progenitor cells and retinal layer-specific neurons.
  • a method for producing a three-dimensional retinal tissue from pluripotent stem cells uniform pluripotent stem cell aggregates are formed in a serum-free medium, and this is cultured in suspension in the presence of a basement membrane preparation, and then organs
  • a method of obtaining multi-layered retinal tissue by suspension culture in a culture solution Non-patent Documents 1 and 1), and uniform pluripotent stem cell aggregates in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitor
  • a method (Non-patent Document 2 and Patent Document 2) for forming a multi-layered retinal tissue by forming a suspension culture in the presence of a basement membrane preparation and then performing a suspension culture in a serum medium is shown. .
  • the present invention provides a method for producing retinal tissue and retinal related cells such as retinal progenitor cells and retinal layer-specific neurons from pluripotent stem cells. That is, the present invention provides: [1] (1) A first step in which pluripotent stem cells are suspended in a serum-free medium to form an aggregate of pluripotent stem cells, and (2) the aggregate formed in step (1) A retinal progenitor comprising a second step of suspension-cultured in a serum-free medium or serum medium containing no BMP signaling pathway activator without a sonic hedgehog signaling pathway activator to obtain an aggregate comprising retinal progenitor cells A method for producing cells (hereinafter sometimes referred to as the production method 1 of the present invention); [2] (1) a first step of forming an aggregate of pluripotent stem cells by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium; (2) The aggregates formed in the step (1) are suspended in a serum-free medium or serum medium containing no BMP signaling pathway activator but no sonic
  • a method for producing a retinal tissue comprising a third step of obtaining an aggregate containing a retinal tissue and substantially free of head non-neuronal ectoderm (hereinafter referred to as the present invention) May be referred to as invention production method 2); [3] (1) a first step of forming an aggregate of pluripotent stem cells by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium; (2) The aggregates formed in the step (1) are suspended in a serum-free medium or serum medium containing no BMP signaling pathway activator but no sonic hedgehog signaling pathway activator, and retinal progenitor cells And (3) the aggregate obtained in the step (2) is any one of a sonic hedgehog signaling pathway agonist, a BMP signaling pathway agonist and a Wnt signaling pathway agonist.
  • a method for producing a retinal layer-specific neuron cell comprising a third step for obtaining an aggregate substantially free of ectoderm (hereinafter also referred to as production method 3 of the present invention); [4] The production method according to any one of [1] to [3], wherein the pluripotent stem cell is a primate pluripotent stem cell; [5] The production method according to any one of [1] to [4], wherein the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell; [6] The production method according to any one of [1] to [5], wherein the step (1) and the step (2) are performed in the presence of a serum substitute; [7] The production method according to any one of [1] to [6], wherein the suspension culture is performed in the absence of a basement membrane preparation;
  • a reagent for evaluating toxicity / drug efficacy comprising retinal progenitor cells, retinal tissue or retinal layer-specific nerve cells produced by the method according to any one of [1] to [9]; [11] A test substance is brought into contact with a retinal progenitor cell, retinal tissue or retinal layer-specific nerve cell produced by the method according to any one of [1] to [9], and the substance is the cell or the retinal layer.
  • a method for evaluating the toxicity and efficacy of the substance including testing the influence on the tissue; [12] Treatment of a disease based on a disorder of retinal tissue, comprising retinal progenitor cells, retinal tissue or retinal layer-specific nerve cells produced by the method according to any one of [1] to [9] Agent; [13] An effective amount of retinal progenitor cells, retinal tissue or retinal layer-specific nerve cells produced by the method according to any one of [1] to [9] is transplanted into a subject in need of transplantation.
  • a method for treating a disease based on a disorder of retinal tissue and [14] a method according to any one of [1] to [9] for use in treating a disease based on a disorder of retinal tissue Retinal progenitor cells, retinal tissue or retinal layer-specific neurons; Etc.
  • retinal progenitor cells, retinal tissue or retinal layer-specific nerve cells can be produced with high efficiency.
  • a retinal progenitor cell, a retinal tissue or a retinal layer-specific nerve is cultured without adding a basement membrane preparation to the medium, that is, in the absence of a basement membrane preparation. Since cells can be obtained, the risk of contamination of heterogeneous components into the resulting cells or tissues is reduced.
  • FIG. 1 shows a bright-field image (A) and a fluorescence image on the 18th day from the start of suspension culture of an RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate cultured in suspension without adding a BMP signaling pathway agent to the medium ( B) Bright field image on the 18th day of suspension culture of the RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate that was added to the culture medium at a concentration of 100 ng / ml on the 3rd day from the beginning of suspension culture and suspended.
  • BMP4 was added to the medium to 1.5 nM on the third day from the start of suspension culture, and suspension culture of the RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate was started on the 18th day.
  • Bright field image (E) and fluorescence image (F) of eyes, and RAX GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregates added to the medium so that BMP7 would be 100 ng / ml on the third day of suspension culture
  • Bright field image (G) and fluorescence on the 18th day from the start of suspension culture (H) and the light on the 18th day from the start of the suspension culture of the RAX GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate that was added to the medium so that GDF7 was 100 ng / ml on the third day from the beginning of suspension culture.
  • FIG. 2 shows a bright field image (A) and a fluorescence image of the RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregates cultured in suspension without adding a BMP signal transduction pathway agent to the culture medium on the 26th day.
  • FIG. 6 is a bright field image (M), a fluorescence image (N), and a FACS histogram (O) on the 26th day from the start of suspension culture of RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregates added to the culture medium and suspended in suspension.
  • M bright field image
  • N fluorescence image
  • O FACS histogram
  • FIG. 3 shows a bright field image (A) and a fluorescence image on the 24th day from the start of suspension culture of RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregates cultured in suspension without adding a BMP4 signal transduction pathway agonist to the medium
  • B Bright field image of the 24th day from the start of suspension culture of the RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate that was suspended in culture by adding BMP4 to 1.5 nM on the 6th day.
  • Bright field image (E) and fluorescence image (F) of eyes, RAX GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate added to BMP4 to 1.5 nM in culture medium on the 12th day from the start of suspension culture
  • a bright field image (I) of the suspension culture of the RAX GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate that was suspended in culture by adding BMP4 to 1.5 nM on the 15th day.
  • a fluorescent image (J) J.
  • FIG. 4 shows a frozen section of a RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate that was added to the medium so that the concentration of BMP4 was 1.5 nM on the third day of suspension culture and suspended until the beginning of suspension culture on the 26th day.
  • FIG. 2 is a view showing a GFP fluorescence image (A), a fluorescence immunostaining image (B) using an anti-Chx10 antibody, and a Hoechst staining image (C).
  • FIG. 5 shows a frozen section of a RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cell-derived aggregate that was added to the medium so that BMP4 was 1.5 nM on the third day of suspension culture and suspended until the first day of suspension culture.
  • FIG. 6 shows a frozen section of an aggregate of RAX :: GFP knock-in human embryonic stem cells derived by adding BMP4 to the medium at 1.5 nM on the 6th day from the start of suspension culture and suspension culture until the 50th day of suspension culture.
  • Immunostaining image using anti-Chx10 antibody A
  • immunostaining image using anti-Pax6 antibody B
  • immunostaining image using anti-Crx antibody C
  • immunostaining using anti-Brn3b antibody It is a figure which shows an image (D).
  • the “vector” in the present invention means a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell.
  • examples of such vectors include vectors capable of autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, animal individuals or plant individuals, and integration into the host cell chromosome.
  • Possible vectors, vectors containing a promoter in a position suitable for polynucleotide transcription, and the like can be mentioned.
  • a vector suitable for cloning may be referred to as a “cloning vector”.
  • a cloning vector a vector containing a multiple cloning site usually containing a plurality of restriction enzyme sites can be mentioned. For example, “Molecular Cloning (3rd edition)” by Sambrook, J and Russell, DW, Appendix 3 (Volume 3) Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)).
  • “vector” also includes “expression vector” and “reporter vector”.
  • various regulatory elements may be linked to the “expression vector” in a state in which various regulatory elements can operate in the host cell.
  • various regulatory elements may be ligated to the “reporter vector” in a state where they can operate in the host cell. Examples of the “regulatory element” include a terminator or an enhancer.
  • the “expression vector” and “reporter vector” may further include a selection marker gene such as a drug resistance gene.
  • cloning vector examples include (a) a lambda FIX vector that is a phage vector for the preparation of a genomic library, (b) a lambda ZAP vector that is a phage vector for the preparation of a cDNA library, ( c) In order to clone genomic DNA, plasmid vectors such as pBluescript II SK +/-, pGEM, or pCR2.1 vector can be mentioned.
  • Examples of the “expression vector” include pSV2 / neo vector, pcDNA vector, pUC18 vector, pUC19 vector, pRc / RSV vector, pLenti6 / V5-Dest vector, pAd / CMV / V5-DEST vector, pDON-AI-2 /
  • a plasmid vector such as neo vector or pMEI-5 / neo vector can be mentioned.
  • reporter vector examples include pGL2 vector, pGL3 vector, pGL4.10 vector, pGL4.11 vector, pGL4.12 vector, pGL4.70 vector, pGL4.71 vector, pGL4.72 vector, pSLG vector, pSLO vector. , PSLR vector, pEGFP vector, pAcGFP vector, or pDsRed vector. Such vectors may be appropriately used with reference to the aforementioned Molecular Cloning magazine.
  • Examples of techniques for introducing nucleic acid molecules into cells include transformation, transduction, transfection, and the like. Such introduction techniques include, for example, Ausubel F. A. et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J. et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed ., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook J. et al.
  • “Floating culture” in the present invention means culturing under conditions that do not allow cells or cell masses to adhere to culture equipment or the like.
  • the incubator used for the suspension culture is not particularly limited as long as it can perform “suspension culture” and can be appropriately determined by those skilled in the art. Examples of such incubators include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, micro plates, micro well plates, micro pores, multi plates, multi well plates, chamber slides, A petri dish, a tube, a tray, a culture bag, or a roller bottle is mentioned.
  • These incubators are preferably non-cell-adhesive in order to enable suspension culture.
  • the non-cell-adhesive incubator those in which the surface of the incubator has not been artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion to cells can be used.
  • the medium used for cell culture can be prepared using a medium usually used for animal cell culture as a basal medium.
  • a basal medium for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, Ham Examples thereof include a medium that can be used for culturing animal cells, such as a medium, an RPMI 1640 medium, a Fischer's medium, or a mixed medium thereof.
  • serum-free medium means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum.
  • a medium containing purified blood-derived components or animal tissue-derived components is also included in the serum-free medium unless it contains unconditioned or unpurified serum.
  • the serum-free medium may contain a serum replacement.
  • serum substitutes include those containing albumin, transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace elements, 2-mercaptoethanol or 3 ′ thiolglycerol, or their equivalents as appropriate.
  • Such a serum replacement can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • a commercially available product may be used as a serum substitute.
  • examples of such commercially available serum substitutes include Knockout TM Serum Replacement (manufactured by Invitrogen: hereinafter referred to as KSR), Chemically defined lipid concentrate (manufactured by Gibco), and Glutamax TM (Gibco). It is done.
  • the serum-free medium used for suspension culture contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and the like. May be.
  • a serum-free medium for example, F-12 medium and IMDM medium 1: 1 to which an appropriate amount of commercially available KSR is added (for example, about 1% to about 20%) is added.
  • KSR commercially available KSR
  • a medium in which 10% KSR and 450 ⁇ M 1-monothioglycerol are added to one mixed solution may be used.
  • serum medium means a medium containing unadjusted or unpurified serum.
  • the medium contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, 1-monothioglycerol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc. May be.
  • the “basement membrane preparation” refers to epithelial cell-like cell morphology, differentiation, proliferation, motility, functional expression, etc. when seeded with desired cells having the ability to form a basement membrane. It includes a basement membrane component having a function of controlling.
  • the “basement membrane component” refers to a thin membrane-like extracellular matrix molecule that exists between an epithelial cell layer and a stromal cell layer in an animal tissue.
  • a basement membrane preparation removes cells having a basement membrane-forming ability adhered to a support through a basement membrane from the support using a solution or an alkaline solution having lipid-dissolving ability of the cells. Can be produced.
  • Basement membrane preparations include products that are commercially available as basement membrane preparations (for example, Matrigel TM (manufactured by Becton Dickinson: hereinafter, sometimes referred to as Matrigel)), and known extracellular matrix as a basement membrane component. Examples include molecules (for example, laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, entactin, etc.). Matrigel TM is a basement membrane preparation extracted from Engelbreth Holm Swarm (EHS) mouse sarcoma.
  • EHS Engelbreth Holm Swarm
  • Matrigel TM The main components of Matrigel TM are type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan and entactin, in addition to these naturally produced by TGF- ⁇ , fibroblast growth factor (FGF), tissue plasminogen activator and EHS tumor Growth factors are included.
  • Matrigel TM “growth factor reduced products” have lower concentrations of growth factors than normal Matrigel TM , with standard concentrations of EGF ⁇ 0.5 ng / ml, NGF ⁇ 0.2 ng / ml, PDGF ⁇ 5 pg / ml, IGF-1 at 5 ng / ml, and TGF- ⁇ at 1.7 ng / ml.
  • medium containing substance X means a medium to which exogenous substance X is added or a medium containing exogenous substance X
  • medium not containing substance X Means a medium to which no exogenous substance X is added or a medium not containing exogenous substance X.
  • exogenous substance X means substance X that is foreign to cells or tissues cultured in the medium, and includes endogenous substance X produced by the cells or tissues. I can't.
  • the “medium containing a BMP signal transduction pathway agent” is a medium supplemented with an exogenous BMP signal transduction pathway agent or a medium containing an exogenous BMP signal transduction pathway agent.
  • Sonic hedgehog signaling pathway agent-free medium refers to a medium to which exogenous sonic hedgehog signaling pathway agent is not added or exogenous sonic hedgehog signaling pathway agonist The medium does not contain.
  • primary refers to mammals belonging to the order of primates, and examples of primates include wild monkeys such as lemurs, loris and camellia, and monkeys such as monkeys, apes and humans.
  • the “stem cell” in the present invention is a cell that maintains the same differentiation ability even after cell division, and can contribute to regeneration of the tissue when the tissue is damaged.
  • Stem cells include embryonic stem cells (hereinafter also referred to as ES cells) or tissue stem cells (also called tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), or induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced) pluripotent stem cell). It is known that the above stem cell-derived tissue cells can be differentiated into normal cells close to a living body, as can be seen from the fact that tissue regeneration is possible. Stem cells can be obtained from a predetermined institution, and commercially available products can also be purchased.
  • human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2, and KhES-3 are available from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • EB5 cells both mouse embryonic stem cells, are available from RIKEN, and the D3 strain is available from ATCC.
  • Stem cells can be maintained and cultured by a method known per se.
  • human stem cells can be maintained by culturing in a medium supplemented with Knockout TM Serum Replacement (Invitrogen).
  • Mouse stem cells can be maintained by adding fetal calf serum (FCS) and Leukemia Inhibitory Factor (LIF) and culturing under feeder-free conditions.
  • FCS fetal calf serum
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • the “pluripotent stem cell” in the present invention can be cultured in vitro and all cells constituting the living body excluding the placenta (tissues derived from the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm)) Refers to a stem cell having the ability to differentiate into (pluripotency).
  • Embryonic stem cells ES cells
  • Pluripotent stem cells are obtained from fertilized eggs, cloned embryos, germline stem cells or stem cells in tissue. Cells that are artificially provided with pluripotency similar to embryonic stem cells by introducing several types of genes into somatic cells (also called induced pluripotent stem cells) are also included in “pluripotent stem cells”.
  • Pluripotent stem cells can be prepared by a method known per se.
  • a production method for example, in the case of an induced pluripotent stem cell, Cell, 2007, 131 (5) pp. 861-872, Cell, 2006, 126 (4) pp. The method described in 663-676 is mentioned.
  • the “embryonic stem cell (ES cell)” in the present invention is a stem cell having self-renewal ability and pluripotency (particularly pluripotency “pluripotency”), and a pluripotent stem cell derived from an early embryo Say. Embryonic stem cells were first established in 1981, and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine.
  • the “artificial pluripotent stem cell” in the present invention means that pluripotency is achieved by directly initializing differentiated cells such as fibroblasts by expression of several kinds of genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Myc, etc. Induced cells.
  • differentiated cells such as fibroblasts
  • genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Myc, etc. Induced cells.
  • Yamanaka et al. Established artificial pluripotent stem cells using mouse cells (Cell, 2006, 126 (4) pp.663-676).
  • Artificial pluripotent stem cells were also established in human fibroblasts in 2007 and have differentiation pluripotency similar to embryonic stem cells (Cell, 2007, 131 (5) pp.861-872; Science, 2007, 318 (5858) pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26 (1) pp. 101-106).
  • a genetically modified pluripotent stem cell can be prepared, for example, by using a homologous recombination technique.
  • genes on the chromosome to be modified include cell marker genes, histocompatibility antigen genes, and disease-related genes based on nervous system cell disorders. Modifications of target genes on chromosomes include Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pirc. 8. Gene targeting, production of mutant mice using ES cells, Yochisha (1995); and the like.
  • a genomic gene of a target gene to be modified eg, cell marker gene, histocompatibility antigen gene, disease-related gene, etc.
  • the target gene is homologous using the isolated genomic gene
  • a target vector for recombination is prepared.
  • genomic gene of the target gene can also be isolated by using a genomic DNA library screening system (manufactured by Genome Systems) or Universal GenomeWalker Kits (manufactured by CLONTECH).
  • target vectors for homologous recombination of target genes and efficient selection of homologous recombinants are described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting , Production of mutant mice using ES cells, Yodosha (1995); and the like.
  • the target vector can be either a replacement type or an insertion type.
  • methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, or poly A selection can be used. Examples of a method for selecting a target homologous recombinant from the selected cell lines include Southern hybridization method and PCR method for genomic DNA.
  • the “aggregate” in the present invention refers to a mass formed by aggregation of cells dispersed in a medium.
  • the “aggregate” in the present invention includes an aggregate formed by cells dispersed at the start of suspension culture and an aggregate already formed at the start of suspension culture.
  • “Aggregate formation” means that when cells are aggregated to form cell aggregates and suspension culture is performed, a qualitatively uniform cell is formed by “aggregating a certain number of dispersed cells rapidly”. It means forming an aggregate.
  • Experimental operations for forming aggregates include, for example, a method of confining cells in a small space using a plate with a small well (96-well plate) or a micropore, or a short centrifugation using a small centrifuge tube.
  • a method of aggregating cells is mentioned.
  • the formation of aggregates of pluripotent stem cells and the formation of epithelial structures in the cells forming the aggregates are microscopically determined by aggregate size and number of cells, macroscopic morphology, and tissue staining analysis. It is possible to make a judgment based on the target morphology and its uniformity, the expression and uniformity of differentiation and undifferentiation markers, the expression control and synchronization of differentiation markers, the reproducibility of the differentiation efficiency between aggregates, and the like.
  • tissue in the present invention refers to a structure of a cell population having a structure in which a plurality of types of cells having different forms and properties are three-dimensionally arranged in a certain pattern.
  • retinal tissue means at least cells such as photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal node cells, progenitor cells thereof, or retinal progenitor cells constituting each retinal layer in a living retina. It means multiple types of retinal tissues arranged in layers and three-dimensionally. Whether each cell constitutes which retinal layer can be confirmed by a known method, for example, the presence or absence of the expression of a cell marker or the degree thereof.
  • the “retinal layer” in the present invention means each layer constituting the retina. Specifically, the retinal pigment epithelium layer, photoreceptor layer, outer boundary membrane, outer granular layer, outer reticulated layer, inner granular layer, inner granular layer, Mention may be made of the reticular layer, the ganglion cell layer, the nerve fiber layer and the inner limiting membrane.
  • the “retinal layer-specific nerve cell” means a cell constituting the retinal layer and specific to the retinal layer.
  • retinal layer-specific neurons include bipolar cells, nodal cells, amacrine cells, horizontal cells, photoreceptor cells, pigment epithelial cells, rod cells, and cone cells.
  • the “retinal progenitor cell” in the present invention refers to a progenitor cell that can differentiate into any mature retinal cell of a photoreceptor cell, a horizontal cell, a bipolar cell, an amacrine cell, a retinal node cell, and a retinal pigment epithelial cell.
  • Visual cell progenitor cells, horizontal cell progenitor cells, bipolar cell progenitor cells, amacrine cell progenitor cells, retinal node cell progenitor cells, and retinal pigment epithelial progenitor cells, respectively, are photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and retinal nodes.
  • Cell a progenitor cell that has been determined to differentiate into retinal pigment epithelial cells.
  • Rax and PAX expressed in retinal progenitor cells As retinal cell markers, Rax and PAX expressed in retinal progenitor cells, Nkx2.1 that is expressed in progenitor cells of hypothalamic neurons but not in retinal progenitor cells, Sox1 that is expressed in hypothalamic neuroepithelium but not in the retina, visual Examples include Crx expressed in cell precursor cells.
  • Chx10 and L7 expressed in bipolar cells As markers for retinal layer-specific neurons, Chx10 and L7 expressed in bipolar cells, Tuj1 and Brn3 expressed in nodal cells, Calretinin expressed in amacrine cells, Calbindin expressed in horizontal cells, Rhodopsin expressed in photoreceptor cells and Recoverin, RPE65 and Mitf expressed in pigment epithelial cells, Nrl expressed in rod cells, Rxr-gamma expressed in cone cells, and the like.
  • the production method 1 of the present invention is a method for producing retinal progenitor cells including the following steps (1) and (2): (1) The first step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture in a serum-free medium, and (2) the aggregates formed in step (1) The second step of obtaining an aggregate containing retinal progenitor cells by suspension culture in a serum-free medium or serum medium containing a BMP signal transduction pathway agent but not containing a hedgehog signal transduction pathway agent.
  • the step (1) of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium will be described.
  • the serum-free medium used in step (1) is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum-free medium to which neither a BMP signal transduction pathway agonist nor a Wnt signal pathway inhibitor is added can be used.
  • a serum-free medium for example, 10% KSR, 450 ⁇ M 1-mono in a 1: 1 mixture of IMDM and F-12 added with a suitable amount of a commercially available serum substitute such as KSR). It is preferable to use a medium supplemented with thioglycerol and 1 ⁇ Chemically Defined Lipid Concentrate.
  • the amount of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 20%, preferably about 2% to about 20%.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in the step (1) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, from about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • the concentration of pluripotent stem cells in step (1) can be appropriately set so that aggregates of pluripotent stem cells are formed more uniformly and efficiently.
  • concentration of pluripotent stem cells in step (1) can be appropriately set so that aggregates of pluripotent stem cells are formed more uniformly and efficiently.
  • a solution prepared to be about 5 ⁇ 10 3 to about 3 ⁇ 10 4 cells, most preferably about 1.2 ⁇ 10 4 cells is added to the well, and the plate is allowed to stand to form an aggregate. .
  • the suspension culture time required to form aggregates can be determined as appropriate depending on the pluripotent stem cells used so that the cells can be aggregated uniformly, but as short as possible to form uniform aggregates. It is desirable to be time. For example, in the case of human ES cells, aggregates are preferably formed within about 24 hours, more preferably within about 12 hours. The time until the formation of the aggregates can be appropriately adjusted by adjusting tools for aggregating cells, centrifugation conditions, and the like.
  • the formation of aggregates of pluripotent stem cells is due to the size and number of the aggregates, the macroscopic morphology, the microscopic morphology and its homogeneity by tissue staining analysis, the expression and the homogeneity of differentiation and undifferentiation markers It is possible to make a judgment based on the expression control of the differentiation marker and its synchrony, the reproducibility between the aggregates of the differentiation efficiency, and the like.
  • the aggregate formed in the step (1) is suspended in a serum-free medium or a serum medium containing a BMP signal transduction pathway agent without containing a sonic hedgehog signal transduction pathway agent, and a coagulation containing a retinal progenitor cell.
  • the step (2) for obtaining the aggregate will be described.
  • the medium used in the step (2) is, for example, a serum-free medium or a serum medium to which a BMP signal transduction pathway agent is not added without adding a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist, There is no need to add.
  • the serum-free medium or serum medium used for such a medium is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum-free medium for example, 10% KSR, 450 ⁇ M 1-mono in a 1: 1 mixture of IMDM and F-12 added with a suitable amount of a commercially available serum substitute such as KSR. It is preferable to use a medium supplemented with thioglycerol and 1 ⁇ Chemically Defined Lipid Concentrate.
  • the amount of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 20%, preferably about 2% to about 20%.
  • the serum-free medium used in step (2) can be used as it is as long as the serum-free medium used in step (1) does not contain a sonic hedgehog signaling pathway agent. It can also be replaced with serum medium.
  • the BMP signal transduction pathway agent may be added to the medium.
  • a sonic hedgehog (hereinafter sometimes referred to as Shh) signaling pathway agent is a substance that can enhance signal transduction mediated by Shh.
  • substances that act on the Shh signal transduction pathway include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Purmorphamine, or SAG.
  • Sonic hedgehog signaling pathway agent free media includes media that are substantially free of sonic hedgehog signaling pathway agonists, such as selective differentiation into retinal progenitor cells and retinal tissue. Also included are media that do not contain sonic hedgehog signal transduction pathway agents at concentrations that have a significant impact.
  • “Sonic hedgehog signaling pathway agonist” medium is essentially free of sonic hedgehog signaling pathway agonist, eg selection for retinal progenitor cells and retinal tissue Also included is a medium to which no sonic hedgehog signaling pathway agent is added at a concentration that adversely affects sexual differentiation.
  • a substance acting on a BMP signal transduction pathway is a substance that can enhance a signal transduction pathway mediated by BMP.
  • substances that act on the BMP signaling pathway include BMP proteins such as BMP2, BMP4 and BMP7, GDF proteins such as GDF7, anti-BMP receptor antibodies, and BMP partial peptides.
  • BMP2 protein, BMP4 protein and BMP7 protein are available from, for example, R & D Systems, and GDF7 protein is available from, for example, Wako Pure Chemical Industries.
  • the concentration of the BMP signal transduction pathway agent may be any concentration that can induce differentiation of cells forming aggregates of pluripotent stem cells into retinal cells. For example, in the case of BMP4, it is added to the medium to a concentration of about 0.01 nM to about 1 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to about 100 nM, more preferably about 1.5 nM.
  • the BMP signal transduction pathway agent may be added after about 24 hours from the start of suspension culture in step (1), and may be added to the medium within several days (for example, within 15 days) after the start of suspension culture. Also good. Preferably, the BMP signal transduction pathway agent is added to the culture medium from the first day to the fifteenth day after the start of suspension culture, more preferably from the first day to the ninth day, most preferably the third day. To do. After the BMP signaling pathway agent is added to the medium and the induction of differentiation into cells that form aggregates of pluripotent stem cells is initiated, it is necessary to add the BMP signaling pathway agent to the medium. Alternatively, the medium may be changed using a serum-free medium or serum medium that does not contain a BMP signaling pathway agent.
  • the aggregate formed in the step (1) is used for the BMP at a concentration necessary for inducing differentiation into a retinal cell until cells expressing the Rax gene begin to appear.
  • the culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in the step (2) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • an aggregate containing retinal progenitor cells can be confirmed, for example, by detecting that cells expressing Rax or PAX6, which are markers for retinal progenitor cells, are contained in the aggregate.
  • the obtained aggregate containing retinal progenitor cells may be used as it is as a reagent for evaluating toxicity and drug efficacy.
  • High-purity retinal progenitor cells can also be obtained by dispersing aggregates containing retinal progenitor cells (for example, trypsin / EDTA treatment) and sorting the obtained cells using FACS.
  • the production method 2 of the present invention is a method for producing retinal tissue including the following steps (1), (2) and (3): (1) a first step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium; (2) The aggregates formed in the step (1) are suspended in a serum-free medium or serum medium containing no BMP signaling pathway activator but no sonic hedgehog signaling pathway activator, and retinal progenitor cells And (3) the aggregate obtained in the step (2) is any one of a sonic hedgehog signaling pathway agonist, a BMP signaling pathway agonist and a Wnt signaling pathway agonist.
  • step (1) and the step (2) of the production method 2 of the present invention can be performed in the same manner as the step (1) and the step (2) of the production method 1 of the present invention.
  • the aggregate obtained in the step (2) is suspended in a serum-free medium or serum medium containing neither a sonic hedgehog signaling pathway agent, a BMP signaling pathway agonist, or a Wnt signaling pathway agonist.
  • the step (3) for obtaining an aggregate containing retinal tissue and substantially free of the head non-neuronal ectoderm will be described.
  • the medium used in the step (3) is, for example, a serum-free medium or a serum medium to which neither a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist, a BMP signal transduction pathway agonist, or a Wnt signal pathway agonist is added.
  • "Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent, BMP Signaling Pathway Agent, and Wnt Signaling Pathway Agent” contains Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent, BMP Signaling Pathway Agent And a medium substantially free of any of the Wnt signaling pathway agonists, for example, a sonic hedgehog signaling pathway agonist, BMP signaling pathway at a concentration that adversely affects selective differentiation into retinal tissue
  • media that do not contain agents and Wnt signaling pathway agents are included.
  • “Sonic hedgehog signaling pathway agonist, BMP signaling pathway agonist and Wnt signaling pathway agonist are not added" medium contains sonic hedgehog signaling pathway agonist, BMP signaling pathway Medium to which neither the agent nor the Wnt signaling pathway agonist is substantially added, for example, a sonic hedgehog signaling pathway agonist at a concentration that adversely affects selective differentiation into retinal tissue, A medium to which a BMP signaling pathway agonist and a Wnt signaling pathway agonist are not added is also included.
  • the serum-free medium or serum medium used for such a medium is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum-free medium for example, 10% KSR, 450 ⁇ M 1-mono in a 1: 1 mixture of IMDM and F-12 added with a suitable amount of a commercially available serum substitute such as KSR. It is preferable to use a medium supplemented with thioglycerol and 1 ⁇ Chemically Defined Lipid Concentrate.
  • the amount of KSR added to the serum-free medium is usually about 1% to about 20%, preferably about 2% to about 20%.
  • a Wnt signal pathway agonist is a substance that can enhance signal transduction mediated by Wnt.
  • Wnt signaling pathway agonists include proteins belonging to the Wnt family (eg, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt receptors, Wnt receptor agonists, GSK3 ⁇ inhibitors (eg, 6-Bromoindirubin-3′-oxime (BIO ), CHIR99021, Kenpaullone) and the like.
  • Culture conditions such as the culture temperature, CO 2 concentration, and O 2 concentration in step (3) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, from about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • the O 2 concentration is about 18% or more, such as about 20% to about 70%, preferably about 20% to about 60%, more preferably about 20% to about 50%.
  • the culture time in the step (3) is not particularly limited, but is usually 48 hours or longer, preferably 7 days or longer.
  • the retinal tissue exists so as to cover the surface of the aggregate.
  • the aggregate is fixed using a fixative such as a paraformaldehyde solution, a frozen section is prepared, and then it is confirmed by immunostaining that a retinal tissue having a layer structure is formed.
  • retinal progenitor cells visual cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal node cells
  • retinal tissue uses antibodies against the above markers expressed in these cells, It can be confirmed that a layer structure is formed by immunostaining.
  • the tissue is a retinal tissue.
  • a RAX positive tissue is observed, and a RAX negative tissue is present on the outside thereof. Not observed.
  • retinal tissue can be obtained from human pluripotent stem cells with high efficiency. Since the retinal tissue obtained by the production method 2 of the present invention includes neurons specific to each retinal layer, photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, ganglion cells, or progenitor cells thereof, etc. It is also possible to obtain cells constituting the retinal tissue. Which cells are obtained from the obtained retinal tissue can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a cell marker. The obtained aggregate containing retinal tissue and substantially free of head non-neuronal ectoderm may be used as it is as a reagent for evaluating toxicity and drug efficacy.
  • High-purity retinal tissue is obtained by dispersing (for example, trypsin / EDTA treatment) an aggregate containing retinal tissue and substantially free of non-neural ectoderm of the head, and sorting the obtained cells using FACS. It is also possible to obtain constituent cells.
  • the production method 3 of the present invention is a method for producing retinal layer-specific nerve cells comprising the following steps (1), (2) and (3): (1) a first step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of pluripotent stem cells in a serum-free medium; (2) The aggregates formed in the step (1) are suspended in a serum-free medium or serum medium containing no BMP signaling pathway activator but no sonic hedgehog signaling pathway activator, and retinal progenitor cells And (3) the aggregate obtained in the step (2) is any one of a sonic hedgehog signaling pathway agonist, a BMP signaling pathway agonist and a Wnt signaling pathway agonist.
  • the suspension is cultured in suspension until the target retinal layer-specific neurons appear, and the retinal tissue contains the target retinal layer-specific neurons
  • a third step for obtaining an aggregate substantially free of ectoderm In a serum-free medium or serum medium that does not contain any retinal layer-specific neurons, the suspension is cultured in suspension until the target retinal layer-specific neurons appear, and the retinal tissue contains the target retinal layer-specific neurons
  • step (1) and the step (2) of the production method 3 of the present invention can be performed in the same manner as the step (1) and the step (2) of the production method 1 of the present invention.
  • the aggregate obtained in the step (2) is used in a serum-free medium or serum medium containing neither a sonic hedgehog signaling pathway agent, a BMP signaling pathway agent, or a Wnt signaling pathway agonist.
  • the medium used in the step (3) is, for example, a serum-free medium or a serum medium to which neither a sonic hedgehog signal transduction pathway agonist, a BMP signal transduction pathway agonist, or a Wnt signal pathway agonist is added. .
  • Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent, BMP Signaling Pathway Agent, and Wnt Signaling Pathway Agent contains Sonic Hedgehog Signaling Pathway Agent, BMP Signaling Pathway Agent And a sonic hedgehog signaling pathway at a concentration that has a detrimental effect on selective differentiation into retinal tissue and retinal layer specific neurons, substantially free of both Wnt and Wnt signaling pathway agents Also included are agents, BMP signaling pathway agonists, and media that do not contain Wnt signaling pathway agonists.
  • “Sonic hedgehog signaling pathway agonist, BMP signaling pathway agonist and Wnt signaling pathway agonist are not added” medium contains sonic hedgehog signaling pathway agonist, BMP signaling pathway Sonic hedges at concentrations that adversely affect selective differentiation into media that are substantially free of both agents and Wnt signaling pathway agents, such as retinal tissue and retinal layer-specific neurons Also included are media without added Hog signaling pathway agonists, BMP signaling pathway agonists and Wnt signaling pathway agonists.
  • the serum-free medium or serum medium used for such a medium is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum-free medium for example, IMDM and F-
  • a serum substitute such as KSR or the like commercially available in DMEM-F12 medium supplemented with 10% fetal bovine serum, N2 supplement, 100 ⁇ M taurine, 500 nM retinoic acid.
  • Culture conditions such as the culture temperature, CO 2 concentration, and O 2 concentration in step (3) can be appropriately set.
  • the culture temperature is, for example, about 30 ° C. to about 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, from about 1% to about 10%, preferably about 5%.
  • the O 2 concentration is about 18% or more, such as about 20% to about 70%, preferably about 20% to about 60%, more preferably about 20% to about 50%.
  • the culture time in step (3) varies depending on the target retinal layer-specific nerve cell, and is, for example, about 7 days to about 200 days.
  • retinal tissue containing retinal layer-specific nerve cells exists so as to cover the surface of the aggregate.
  • Confirmation of retinal tissue is the immunostaining method after the suspension culture is completed, the aggregates are fixed using a fixative such as paraformaldehyde solution, frozen sections are prepared, and retinal tissue having a layer structure is formed. It can be confirmed by such means. Since retinal progenitor cells (visual cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal node cells) that make up each layer are different from each other, retinal tissue uses antibodies against the above markers expressed in these cells, It can be confirmed that a layer structure is formed by immunostaining.
  • an immunostained image of the aggregate frozen section described above shows a RAX positive tissue. No RAX negative tissue is observed outside.
  • the retinal tissue obtained by the production method 3 of the present invention includes neurons specific to each retinal layer, retinal layer-specific nerves such as photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and ganglion cells. Cells can be obtained. Which cells are obtained from the obtained retinal tissue can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a cell marker.
  • the obtained aggregate containing retinal tissue containing retinal layer-specific nerve cells and substantially free of head non-neuronal ectoderm may be used as it is as a reagent for evaluating toxicity and drug efficacy.
  • Aggregates containing retinal tissue containing retinal layer-specific neurons and substantially free of non-neural ectoderm of the head are dispersed (eg, trypsin / EDTA treatment), and the resulting cells are selected using FACS By doing so, it is also possible to obtain highly pure retinal layer-specific neurons.
  • the obtained retinal layer-specific neurons can be further cultured as they are or after being subjected to a dispersion treatment (for example, trypsin / EDTA treatment).
  • a cell adhesive culture vessel for example, a culture vessel coated with an extracellular matrix or the like (eg, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • Culture conditions such as the culture temperature, CO 2 concentration, and O 2 concentration in adhesion culture can be determined as appropriate.
  • the culture may be performed in the presence of a known differentiation inducer or neurotrophic factor. Examples of such differentiation inducers and neurotrophic factors include NGF (Biochem. Biophys. Res.
  • the manufactured retinal tissue and retinal layer-specific nerve cells can be confirmed by combining the presence or absence of cell marker expression as an index, if necessary. By observing the cell morphology, the obtained retinal layer-specific nerve cells can be identified. Based on such a marker expression pattern and cell morphology, desired specific cells can also be isolated.
  • the retinal progenitor cells, retinal tissue or retinal layer-specific nerve cells produced by the production methods 1 to 3 of the present invention are used for screening for therapeutic agents for diseases based on disorders of retinal tissue or retinal related cells, and for cell damage caused by other causes. It can be used as a cell therapy transplant material, a disease research material, and a drug discovery material for therapeutic drugs in Japan. It can also be used for toxicity studies such as phototoxicity, toxicity tests, etc. in the evaluation of toxicity and drug efficacy of chemical substances.
  • diseases based on disorders of retinal tissue or retinal-related cells include organic mercury poisoning, chloroquine retinopathy, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, retinopathy of newborn, and the like. .
  • the retinal progenitor cells, retinal tissue or retinal layer-specific nerve cells produced by the production methods 1 to 3 of the present invention replenish the cells or the damaged tissue itself in a cell damage state (for example, for transplantation surgery). It can be used as a retina for transplantation used for, for example.
  • Example 1 Production Example of Aggregate Containing Retinal Progenitor Cells RAX : GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1; Cell Stem Cell, 2012, 10 (6) 771-785) were obtained from “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559 ”and cultured according to the method described in“ Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686 ”.
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knowout TM Serum Replacement
  • 0.1 mM 2-mercaptoethanol 2 mM L-glutamine
  • 1 ⁇ non-essential amino acid 5 ng / ml bFGF.
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the monodispersed ES cells are non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 1.2 ⁇ 10 4 cells per well were obtained, and the suspension was cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used.
  • Example 2 Retinal tissue production example 1 RAX :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1; Cell Stem Cell, 2012, 10 (6) 771-785) were designated as “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559” The cells were cultured according to the method described in Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686.
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knowout TM Serum Replacement
  • 0.1 mM 2-mercaptoethanol 2 mM L-glutamine
  • 1 ⁇ non-essential amino acid 5 ng / ml bFGF.
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the monodispersed ES cells are non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 1.2 ⁇ 10 4 cells per well were obtained, and the suspension was cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used.
  • suspension culture is performed by adding human recombinant BMP4 (R & D) with a final concentration of 1.5 nM at any time of suspension culture start day 1, suspension culture start day 2 or suspension culture start day 3. did.
  • the cells were cultured in the same manner even under conditions where no BMP signaling pathway agonist was added.
  • Half of the culture medium in the well was replaced every 3 days with the above medium without the addition of BMP signaling pathway agonist.
  • the aggregates were transferred from the 96-well plate to the suspension culture dish, and then 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ Chemically defined in a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium.
  • Suspension culture was performed in a serum-free medium supplemented with lipid concentrate. On the 26th day from the start of suspension culture, observation with a fluorescence microscope and measurement of the percentage of GFP positive cells by FACS were performed. It shows that retinal progenitor cells were induced under conditions where no BMP signaling pathway agonist was added (FIGS. 2A, B, C) and conditions where BMP4 was added simultaneously with the start of suspension culture (FIGS. 2D, E, F) No GFP expressing cells were observed. In comparison, either the first day of suspension culture (FIG. 2G, H, I), the second day of suspension culture (FIG. 2J, K, L), or the third day of suspension culture start (FIG.
  • Example 3 Retinal tissue production example 2 RAX :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1; Cell Stem Cell, 2012, 10 (6) 771-785) were designated as “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559” The cells were cultured according to the method described in Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686.
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knowout TM Serum Replacement
  • 0.1 mM 2-mercaptoethanol 2 mM L-glutamine
  • 1 ⁇ non-essential amino acid 5 ng / ml bFGF.
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the monodispersed ES cells are non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 1.2 ⁇ 10 4 cells per well were obtained, and the suspension was cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used.
  • Example 4 Retinal tissue production example 3
  • the aggregate containing the GFP-expressing cells obtained in Example 1 was transferred from the 96-well plate to the suspension culture dish on the 18th day from the start of suspension culture, followed by 1: 1 mixing of F-12 medium and IMDM medium.
  • Suspension culture was carried out in a medium in which 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol and 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate were added to the solution.
  • the aggregates were fixed with a 4% paraformaldehyde solution, frozen sections were prepared, and the tissue structure was confirmed by immunostaining.
  • RAX GFP positive and the outer layer was Chx10 positive, which is a marker for retinal stem cells (FIGS. 4A, B, C).
  • RAX GFP positive epithelium
  • the retinal tissue can be produced from human ES cells with high efficiency by the production method of the present invention.
  • Example 5 Example of production of retinal layer-specific neurons RAX :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1; Cell Stem Cell, 2012, 10 (6) 771-785) were obtained from “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559 ”and cultured according to the method described in“ Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686 ”.
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knowout TM Serum Replacement
  • 0.1 mM 2-mercaptoethanol 2 mM L-glutamine
  • 1 ⁇ non-essential amino acid 5 ng / ml bFGF.
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the monodispersed ES cells are non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 1.2 ⁇ 10 4 cells per well were obtained, and the suspension was cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used.
  • Example 6 Example of production of retinal layer-specific nerve cells RAX :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1; Cell Stem Cell, 2012, 10 (6) 771-785) were prepared as "Ueno, M. et al PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559 ”and cultured according to the method described in“ Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686 ”.
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 8 ng / ml bFGF.
  • KSR Knowout TM Serum Replacement; Invitrogen
  • 0.1 mM 2-mercaptoethanol 2 mM L-glutamine
  • 1 ⁇ non-essential amino acid 8 ng / ml bFGF.
  • the cultured ES cells are monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and the monodispersed ES cells are non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.)
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 1.2 ⁇ 10 4 cells per well were obtained, and the suspension was cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium prepared by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used.
  • the culture after the 18th day from the start of suspension culture was carried out under 40% O 2 .
  • the aggregates were fixed with a 4% paraformaldehyde solution, frozen sections were prepared, and the tissue structure was confirmed by immunostaining.
  • all the layers are RAX :: GFP positive, Chx10 which is a marker of retinal progenitor cells and bipolar cells (FIG. 6A), Pax6 which is a marker of ganglion cells and nerve cells. Positive cells (FIG. 6B) were present, indicating that multi-layered retinal nerve tissue was formed.
  • Example 7 Example of production of aggregates including retinal progenitor cells, retinal tissue, and retinal layer-specific neurons from induced pluripotent stem cells (iPS cells) Human iPS cell line 201B7 (RIKEN BioResource Center) Or available from iPS Academia Japan Co., Ltd.) to “Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103 (25), 9554-9559” “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686” Incubate according to the method described.
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • the medium is a DMEM / F12 medium (Sigma) supplemented with 20% KSR (Knockout TM Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 1 ⁇ non-essential amino acid, 5 ng / ml bFGF.
  • KSR Knockout TM Serum Replacement
  • the cultured iPS cells were monodispersed using TrypLE Express (Invitrogen), and then 1.2 ⁇ 10 4 per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite).
  • the cells are suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so as to become cells, and suspended in culture at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium obtained by adding 10% KSR, 450 ⁇ M 1-monothioglycerol, 1 ⁇ Chemically defined lipid concentrate, 20 ⁇ M Y27632 to a 1: 1 mixture of F-12 medium and IMDM medium is used. .
  • retinal progenitor cell markers (Rax, Chx10) was confirmed by immunostaining. .
  • the remaining aggregates are transferred from the 96-well plate to a suspension culture dish, and suspension culture is continued using a medium in which 10% fetal bovine serum, N2 supplement, 100 ⁇ M taurine, and 500 nM retinoic acid are added to DMEM-F12 medium.
  • Culture after the 18th day from the start of suspension culture is performed under 40% O 2 .
  • the aggregates were fixed with a 4% paraformaldehyde solution, and frozen sections were prepared.
  • retinal layer-specific neurons Nrl, RXR-gamma, Recoverin, (Chx10, Calretinin, Calbindin) is confirmed.
  • retinal progenitor cells as well as retinal tissue composed of various differentiated retinal layer-specific nerve cells, can be produced from human iPS cells.
  • retinal progenitor cells, retinal tissue or retinal layer-specific nerve cells can be produced with high efficiency.
  • the risk of contamination of heterogeneous components into the resulting cells or tissues is reduced.
  • the production method of the present invention efficiently produces a cell group (photocell, optic nerve, etc.) constituting a retinal tissue for the purpose of evaluating toxicity and drug efficacy of a chemical substance, cell therapy, etc., and a retina having a tissue structure.
  • Very useful from the viewpoint of efficiently producing retinal tissue which is a "tissue material" for use in testing and treatment, for the purpose of evaluating toxicity and drug efficacy using tissue and applying it to transplantation materials for retinal tissue transplantation treatment It is.

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Abstract

本発明は、 （１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び （２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMP シグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程を含む、網膜前駆細胞の製造方法を提供する。

Description

網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法
　本発明は、網膜組織、並びに網膜前駆細胞及び網膜層特異的神経細胞等の網膜関連細胞の製造方法等に関する。
　多能性幹細胞から立体的な網膜組織を製造する方法として、均一な多能性幹細胞の凝集体を無血清培地中で形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、器官培養液中で浮遊培養することにより、多層の網膜組織を得る方法（非特許文献１及び特許文献１）、均一な多能性幹細胞の凝集体をＷｎｔシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養した後、血清培地中で浮遊培養することにより、多層の網膜組織を得る方法（非特許文献２及び特許文献２）が示されている。
国際公開第2011/055855号 国際公開第2013/077425号
Nature, 472, 51-56 (2011) Cell Stem Cell, 10(6), 771-785 (2012)
　多能性幹細胞から網膜組織を製造する方法の更なる開発が望まれている。
　本発明は、網膜組織、並びに網膜前駆細胞及び網膜層特異的神経細胞等の網膜関連細胞を多能性幹細胞から製造する方法等を提供する。
　即ち、本発明は：
［１］（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程
を含む、網膜前駆細胞の製造方法（以下、本発明製造方法１と記すこともある。）；
［２］（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程
を含む網膜組織の製造方法（以下、本発明製造方法２と記すこともある。）；
［３］（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で、目的とする網膜層特異的神経細胞が出現するまで浮遊培養し、目的とする網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程
を含む網膜層特異的神経細胞の製造方法（以下、本発明製造方法３と記すこともある。）；
［４］前記多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である前記［１］から［３］のいずれかに記載の製造方法；
［５］前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である前記［１］から［４］のいずれかに記載の製造方法；
［６］前記工程（１）及び工程（２）が、血清代替物存在下で行われる前記［１］から［５］のいずれかに記載の製造方法；
［７］浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる前記［１］から［６］のいずれかに記載の製造方法；
［８］前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選ばれる１以上の蛋白質である前記［１］から［７］のいずれかに記載の製造方法；
［９］前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、工程（１）の浮遊培養開始から１日目から１５日目までの間に培地に添加される前記［１］から［８］のいずれかに記載の製造方法；
［１０］前記［１］から［９］のいずれかに記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を含有してなる、毒性・薬効評価用試薬；
［１１］前記［１］から［９］のいずれかに記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞に被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法；
［１２］前記［１］から［９］のいずれかに記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤；
［１３］前記［１］から［９］のいずれかに記載の方法により製造される、有効量の網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法；及び
［１４］網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための前記［１］から［９］のいずれかに記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞；
等を提供する。
　本発明の製造方法によれば、網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を高効率に製造することが可能となる。本発明の製造方法においては、基底膜標品を培地中に添加することなく、すなわち基底膜標品非存在下に凝集体を浮遊培養して、網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を得ることが可能であるので、得られた細胞または組織への異種由来成分の混入のリスクが低減される。本発明の製造方法によれば、化学物質等の毒性または薬効評価や移植治療などを目的として、網膜組織、又は網膜前駆細胞もしくは網膜層特異的神経細胞等の網膜関連細胞を効率よく提供することが可能となる。
図１は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地に添加せずに浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始１８日目の明視野像（A）と蛍光像（B）、浮遊培養開始３日目にＢＭＰ２を１００ｎｇ／ｍｌとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始１８日目の明視野像（C）と蛍光像（D）、浮遊培養開始３日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始１８日目の明視野像（Ｅ）と蛍光像（Ｆ）、浮遊培養開始３日目にＢＭＰ７を１００ｎｇ／ｍｌとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始１８日目の明視野像（Ｇ）と蛍光像（Ｈ）、及び、浮遊培養開始３日目にＧＤＦ７を１００ｎｇ／ｍｌとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始１８日目の明視野像（Ｉ）と蛍光像（Ｊ）を示す図である。 図２は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地に添加せずに浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２６日目の明視野像（A）、蛍光像（B）及びFACSヒストグラム（Ｃ）、浮遊培養開始（０日目）と同時にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２６日目の明視野像（Ｄ）、蛍光像（Ｅ）及びFACSヒストグラム（Ｆ）、浮遊培養開始1日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２６日目の明視野像（Ｇ）、蛍光像（Ｈ）及びFACSヒストグラム（Ｉ）、浮遊培養開始2日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２６日目の明視野像（Ｊ）、蛍光像（Ｋ）及びFACSヒストグラム（Ｌ）、並びに、浮遊培養開始３日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２６日目の明視野像（Ｍ）、蛍光像（Ｎ）及びFACSヒストグラム（Ｏ）である。 図３は、ＢＭＰ４シグナル伝達経路作用物質を培地に添加せずに浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２４日目の明視野像（A）と蛍光像（B）、浮遊培養開始６日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２４日目の明視野像（C）と蛍光像（D）、浮遊培養開始９日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２４日目の明視野像（Ｅ）と蛍光像（Ｆ）、浮遊培養開始１２日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２４日目の明視野像（Ｇ）と蛍光像（Ｈ）、及び、浮遊培養開始１５日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始２４日目の明視野像（Ｉ）と蛍光像（Ｊ）を示す図である。 図４は、浮遊培養開始３日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養開始２６日目まで浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の凍結切片の、ＧＦＰ蛍光像（Ａ）、抗Chx10抗体を用いた蛍光免疫染色像（Ｂ）及びＨｏｅｃｈｓｔ染色像（Ｃ）を示す図である。 図５は、浮遊培養開始３日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養開始１１７日目まで浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の凍結切片の、抗Recoverin抗体を用いた免疫染色像（Ａ）、抗Ｎｒｌ抗体を用いた免疫染色像（Ｂ）、抗ＲＸＲ－ｇａｍｍａ抗体を用いた免疫染色像（Ｃ）、抗Ｃｈｘ１０抗体を用いた免疫染色像（Ｄ）、抗Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ抗体を用いた免疫染色像（Ｅ）、及び、抗Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ抗体を用いた免疫染色像（Ｆ）を示す図である。 図６は、浮遊培養開始６日目にＢＭＰ４を１．５ｎＭとなるよう培地に添加して浮遊培養開始５０日目まで浮遊培養したRAX::GFPノックインヒト胚性幹細胞由来凝集体の凍結切片の、抗Chx10抗体を用いた免疫染色像（Ａ）、抗Pax6抗体を用いた免疫染色像（Ｂ）、抗Crx抗体を用いた免疫染色像（Ｃ）、及び、抗Brn3b抗体を用いた免疫染色像（Ｄ）を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
　本発明における「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターを意味する。このようなベクターとしては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体又は植物個体等の宿主細胞において自律複製が可能であるベクター、宿主細胞の染色体中への組込みが可能であるベクター、及びポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているベクター等を挙げることができる。
　このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」と記すこともある。クローニングベクターとしては、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含むベクターを挙げることができ、例えば、「Molecular Cloning（3rd edition）」 by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3)， Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)）に記載されたベクターを挙げることができる。
　本発明における「ベクター」は、「発現ベクター」及び「レポーターベクター」も含む。「発現ベクター」には、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて、種々の調節エレメントが宿主細胞の中で作動し得る状態で連結されていてもよい。「レポーターベクター」には、レポーター遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて、種々の調節エレメントが宿主細胞の中で作動し得る状態で連結されていてもよい。「調節エレメント」としては、例えば、ターミネーター、又は、エンハンサーを挙げることができる。「発現ベクター」及び「レポーターベクター」には、さらに薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー遺伝子が含まれ得る。
　「クローニングベクター」としては、例えば、（ａ）ゲノムライブラリーの作製のためにはファージベクターであるラムダFIXベクター、（ｂ）cDNAライブラリーの作製のためにはファージベクターであるラムダZAPベクター、（ｃ）ゲノムＤＮＡをクローニングするためには、pBluescript II SK＋/－, pGEM，又はpCR2.1ベクター等のプラスミドベクターを挙げることができる。「発現ベクター」としては、例えば、pSV2/neoベクター、pcDNAベクター、pUC18ベクター、pUC19ベクター、pRc/RSVベクター、pLenti6/V5-Destベクター、pAd/CMV/V5-DESTベクター、pDON-AI-2/neoベクター、又はpMEI-5/neoベクター等のプラスミドベクターを挙げることができる。「レポーターベクター」としては、例えば、pGL2ベクター、pGL3ベクター、pGL4.10ベクター、pGL4.11ベクター、pGL4.12ベクター、pGL4.70ベクター、pGL4.71ベクター、pGL4.72ベクター、pSLGベクター、pSLOベクター、pSLRベクター、pEGFPベクター、pAcGFPベクター、又はpDsRedベクターを挙げることができる。このようなベクターは、前述のMolecular Cloning誌を参考にして適宜利用すればよい。
　核酸分子を細胞内に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等を挙げることができる。このような導入技術としては、例えば、Ausubel F. A.ら編（１９８８）、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J.ら（１９８７）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；Sambrook J.ら（２００１）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY；又は別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７；等に記載される方法を挙げることができる。遺伝子が細胞内に導入されたことを確認する技術としては、例えば、ノーザンブロット分析又はウェスタンブロット分析を挙げることができる。
　本発明における「浮遊培養」とは、細胞または細胞塊を培養器材等に接着させない条件で培養することをいう。
　浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。
　本発明において細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ－１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
　本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
　無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ＫｎｏｃｋｏｕｔTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社製）、ＧｌｕｔａｍａｘTM（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
　浮遊培養で用いる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えば、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ及び４５０μＭ１－モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。
　本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、１－モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
　本発明における「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品（例えば、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製：以下、マトリゲルと記すこともある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
　ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された基底膜調製物である。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンであり、これらに加えてＴＧＦ－β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組織プラスミノゲン活性化因子及びＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭの「ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ製品」は、通常のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はＥＧＦが＜０．５ｎｇ／ｍｌ、ＮＧＦが＜０．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦが＜５ｐｇ／ｍｌ、ＩＧＦ－１が５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ－βが１．７ｎｇ／ｍｌである。
　本発明において、「物質Ｘを含む培地」とは、外因性（exogeneous）の物質Ｘが添加された培地または外因性の物質Ｘを含む培地を意味し、「物質Ｘを含まない培地」とは、外因性の物質Ｘが添加されていない培地または外因性の物質Ｘを含まない培地を意味する。ここで、「外因性の物質Ｘ」とは、その培地で培養される細胞または組織にとって外来の物質Ｘを意味し、その細胞または組織が産生する内在性（endogenous）の物質Ｘはこれに含まれない。
　例えば、「BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外因性のBMPシグナル伝達経路作用物質が添加された培地または外因性のBMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地である。「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地」とは、外因性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地または外因性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地である。
　本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。
　本発明における「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織の再生に寄与することができる。幹細胞としては、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と記すこともある。）もしくは組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる）、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）が挙げられる。上記の幹細胞由来の組織細胞は、組織再生が可能なことから分かるように、生体に近い正常な細胞に分化できることが知られている。
　幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、ＥＢ５細胞は独立行政法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡＴＣＣより、入手可能である。
　幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、ヒト幹細胞は、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Invitrogen社）を添加した培地で培養することにより維持できる。マウス幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びＬｅｕｋｅｍｉａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を添加し無フィーダー下に培養することにより維持できる。
　本発明における「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。胚性幹細胞（ES細胞）も「多能性幹細胞」に含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞又は組織内幹細胞から得られる。体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞とも呼ばれる）も「多能性幹細胞」に含まれる。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作製することが可能である。作製方法としては、例えば人工多能性幹細胞であれば、Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５）ｐｐ．８６１－８７２や、Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４） ｐｐ．６６３－６７６に記載される方法が挙げられる。
　本発明における「胚性幹細胞（ES細胞）」とは、自己複製能を有し、多分化能（特に多能性「pluripotency」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。
　本発明における「人工多能性幹細胞」とは、線維芽細胞等の分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等の数種類の遺伝子の発現により直接初期化するなどして多分化能を誘導した細胞である。2006年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Cell, 2006, 126(4) pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に分化多能性を有する（Cell, 2007, 131(5) pp.861-872；Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106）。
　遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法を用いて行うことができる。
　具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
　標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ　Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
　標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリＡ選択などの方法を用いることができる。 
　選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
　本発明における「凝集体」とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成した塊をいう。本発明における「凝集体」には、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成した凝集体と浮遊培養開始時に既に形成されていた凝集体とが含まれる。
　「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
　本発明においては、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させることが好ましい。このように多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。
　凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。
　多能性幹細胞の凝集体が形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
　本発明における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
　本発明における「網膜組織」とは、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、これらの前駆細胞、または網膜前駆細胞などの細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無若しくはその程度等により確認できる。
　本発明における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。
　本発明における「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞、色素上皮細胞、杆体細胞及び錐体細胞を挙げることができる。
　本発明における「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、網膜色素上皮細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
　視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
　網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲaｘ及びＰＡＸ６，視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないNkx2.1、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないＳｏｘ１、視細胞の前駆細胞で発現するＣｒｘなどが挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するＣｈｘ１０及びＬ７、節細胞で発現するＴｕｊ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ及びＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、色素上皮細胞で発現するＲＰＥ６５及びＭｉｔｆ、杆体細胞で発現するNrl、錐体細胞で発現するRxr-gammaなどが挙げられる。
　本発明製造方法１は、下記工程（１）及び（２）を含む網膜前駆細胞の製造方法である：
（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程。
　多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程（１）について説明する。
　工程（１）において用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＷｎｔシグナル経路阻害物質がいずれも添加されていない無血清培地を使用することができる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ－１２の１：１の混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ１－モノチオグリセロール及び１ｘChemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
　工程（１）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
　工程（１）における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０３から約1×１０５細胞、好ましくは約３×１０３から約５×１０４細胞、より好ましくは約５×１０３から約３×１０４細胞、最も好ましくは約１．２×１０４細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
　凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を均一に凝集させるように、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。例えば、ヒトES細胞の場合には、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内に凝集体を形成させる。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
　多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
　工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程（２）について説明する。
　工程（２）において用いられる培地は、例えば、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されておらずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地であり、基底膜標品を添加する必要は無い。
　かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ－１２の１：１の混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ１－モノチオグリセロール及び１ｘChemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
　工程（２）で用いられる無血清培地は、工程（１）で用いた無血清培地がソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない限り、当該培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。工程（１）で用いた、ＢＭＰシグナル伝達経路物質を含まない無血清培地をそのまま工程（２）に用いる場合、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。
　ソニック・ヘッジホッグ（以下、Ｓｈｈと記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Shhにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Shhシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Shh）、Shh受容体、Shh受容体アゴニスト、Purmorphamine、又はSAGなどが挙げられる。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等のＢＭＰ蛋白、ＧＤＦ７等のＧＤＦ蛋白、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチドなどが挙げられる。ＢＭＰ２蛋白、ＢＭＰ４蛋白及びＢＭＰ７蛋白は例えばＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓから、ＧＤＦ７蛋白は例えば和光純薬から入手可能である。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＢＭＰ４の場合は、約０．０１nMから約１μM、好ましくは約０．１nMから約１００nM、より好ましくは約１．５nMの濃度となるように培地に添加する。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（１）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後１日目から１５日目までの間、より好ましくは１日目から９日目までの間、最も好ましくは３日目に培地に添加する。
　ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化誘導が開始された後は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。これにより、培地に掛かる経費を抑えることができる。網膜細胞への分化誘導が開始された細胞は、例えば、当該細胞におけるＲaｘ遺伝子の発現を検出することにより確認することができる。ＧＦＰ等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がＲaｘ遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を用いて工程（１）により形成された凝集体を、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。工程（２）の実施態様の一つとして、工程（１）で形成された凝集体を、Ｒaｘ遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含みソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。
　工程（２）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
　網膜前駆細胞を含む凝集体が得られたことは、例えば、網膜前駆細胞のマーカーであるＲaｘ又はＰＡＸ６を発現する細胞が凝集体に含まれていることを検出することにより確認することができる。
　得られた網膜前駆細胞を含む凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜前駆細胞を含む凝集体を分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、得られた細胞をFACSを用いて選別することにより、高純度な網膜前駆細胞を得ることも可能である。
　本発明製造方法２は、下記工程（１）、（２）及び（３）を含む網膜組織の製造方法である：
（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程。
　本発明製造方法２の工程（１）及び工程（２）は、本発明製造方法１の工程（１）及び工程（２）と同様に実施することができる。
　工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る工程（３）について説明する。
　工程（３）において用いられる培地は、例えば、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが添加されていない無血清培地又は血清培地である。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも実質的に含まない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが実質的に添加されていない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
　かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ－１２の１：１の混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ１－モノチオグリセロール及び１ｘChemically Defined Lipid Concentrateを添加した培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
　Wntシグナル経路作用物質とは、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Wntシグナル経路作用物質としては、例えば、Wntファミリーに属するタンパク質（例えば、Wnt1、Wnt3a、Wnt7a）、Wnt受容体、Wnt受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤（例えば、6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）、CHIR99021、Kenpaullone）等を挙げることができる。
　工程（３）における培養温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。Ｏ２濃度は、約１８％以上、例えば約２０％から約７０％、好ましくは約２０％から約６０％、より好ましくは約２０％から約５０％である。
　工程（３）の培養時間は特に限定されないが、通常４８時間以上であり、好ましくは７日間以上である。
　このようにして浮遊培養された凝集体において、網膜組織は凝集体の表面を覆うように存在する。浮遊培養終了後、凝集体をパラホルムアルデヒド溶液等の固定液を用いて固定し、凍結切片を作製した後、層構造を有する網膜組織が形成されていることを免疫染色法などにより確認すればよい。網膜組織は、各層を構成する網膜前駆細胞（視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞）がそれぞれ異なるため、これらの細胞に発現している上述のマーカーに対する抗体を用いて、免疫染色法により、層構造が形成されていることを確認することができる。
　凝集体の表面に存在する網膜組織をピンセット等を用いて、凝集体から物理的に切り出すことも可能である。この場合、各凝集体の表面には、網膜組織以外の神経組織が形成される場合もあるため、凝集体から切り出した神経組織の一部を切り取り、これを用いて後述の免疫染色法等により確認することにより、その組織が網膜組織であることを確認することが出来る。
　網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体では、例えば、上述の凝集体凍結切片の免疫染色像において、ＲＡＸ陽性の組織が観察され、その外側にＲＡＸ陰性の組織が観察されない。
　本発明製造方法２により、ヒト多能性幹細胞から高効率で網膜組織を得ることができる。本発明製造方法２により得られる網膜組織には、網膜層のそれぞれに特異的なニューロンが含まれることから、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞または、これらの前駆細胞など網膜組織を構成する細胞を入手することも可能である。得られた網膜組織から入手した細胞がいずれの細胞であるかは、自体公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。
　得られた網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、得られた細胞をFACSを用いて選別することにより、高純度な網膜組織構成細胞を得ることも可能である。
　本発明製造方法３は、下記工程（１）、（２）及び（３）を含む網膜層特異的神経細胞の製造方法である：
（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で、目的とする網膜層特異的神経細胞が出現するまで浮遊培養し、目的とする網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程。
　本発明製造方法３の工程（１）及び工程（２）は、本発明製造方法１の工程（１）及び工程（２）と同様に実施することができる。
　工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中、目的とする網膜層特異的神経細胞が出現するまで浮遊培養し、目的とする網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る工程（３）について説明する。
　工程（３）において用いられる培地は、例えば、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが添加されていない無血清培地又は血清培地である。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも実質的に含まない培地、例えば、網膜組織及び網膜層特異的神経細胞への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
　「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれもが実質的に添加されていない培地、例えば、網膜組織及び網膜層特異的神経細胞への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
　かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地に１０％ウシ胎児血清、Ｎ２サプリメント、１００μＭタウリン、５００ｎＭ レチノイン酸を添加した血清培地、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ－１２の１：１の混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ１－モノチオグリセロール及び１ｘChemically Defined Lipid Concentrateを添加した培地）等を挙げることができる。
　工程（３）における培養温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。Ｏ２濃度は、約１８％以上、例えば約２０％から約７０％、好ましくは約２０％から約６０％、より好ましくは約２０％から約５０％である。
　工程（３）の培養時間は、目的とする網膜層特異的神経細胞によって異なり、例えば約７日間から約２００日間である。
　このようにして浮遊培養された凝集体において、網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織は凝集体の表面を覆うように存在する。網膜組織の確認は、浮遊培養終了後、凝集体をパラホルムアルデヒド溶液等の固定液を用いて固定し、凍結切片を作製した後、層構造を有する網膜組織が形成されていることを免疫染色法などにより確認すればよい。網膜組織は、各層を構成する網膜前駆細胞（視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞）がそれぞれ異なるため、これらの細胞に発現している上述のマーカーに対する抗体を用いて、免疫染色法により、層構造が形成されていることを確認することができる。
　網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体では、例えば、上述の凝集体凍結切片の免疫染色像において、ＲＡＸ陽性の組織が観察され、その外側にＲＡＸ陰性の組織が観察されない。
　本発明製造方法３により得られる網膜組織には、網膜層のそれぞれに特異的なニューロンが含まれることから、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞などの網膜層特異的神経細胞を入手することが可能である。得られた網膜組織から入手した細胞がいずれの細胞であるかは、自体公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。
　得られた網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、得られた細胞をFACSを用いて選別することにより、高純度な網膜層特異的神経細胞を得ることも可能である。
　得られた網膜層特異的神経細胞は、そのまま、あるいは分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）した後、接着条件下でさらに培養することもできる。接着培養する場合、細胞接着性の培養器、例えば細胞外マトリクス等（例えば、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度等の培養条件は、適宜決定できる。この際、既知の分化誘導物質や神経栄養因子の存在下で培養してもよい。このような分化誘導物質、神経栄養因子としては、例えば、ＮＧＦ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９，５５２（１９９４））、レチノイン酸（Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６８，３４２（１９９５）；Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６，１０５６（１９９６））、ＢＭＰ阻害因子（Ｎａｔｕｒｅ，３７６，３３３－３３６（１９９５））、ＩＧＦ（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５，３０２３－８（２００３））、BDNF、NT3、または、NT4などが挙げられる。
　製造された網膜組織や網膜層特異的神経細胞は、細胞マーカーの発現の有無等を指標として、必要に応じてそれらを組み合わせることにより確認することができる。細胞の形態を観察することによって、得られた網膜層特異的神経細胞を特定することもできる。このようなマーカー発現パターンや細胞の形態に基づき、所望の特定の細胞を単離することもできる。
　本発明製造方法１ないし３により製造された網膜前駆細胞、網膜組織又は網膜層特異的神経細胞は、網膜組織又は網膜関連細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬に対しての細胞治療用移植用材料や疾患研究材料、創薬材料として利用可能である。また化学物質等の毒性・薬効評価においても、光毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用可能である。
　網膜組織又は網膜関連細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症、などが挙げられる。
　本発明製造方法１ないし３により製造された網膜前駆細胞、網膜組織又は網膜層特異的神経細胞は、細胞損傷状態において、当該細胞や、障害を受けた組織自体を補充する（例えば、移植手術に用いる）ためなどに用いる移植用網膜として用いることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：網膜前駆細胞を含む凝集体の製造例
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来；Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地（Ｓｉｇｍａ）に20%ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μM Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２（Ｒ＆Ｄ）、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ）、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ７（Ｒ＆Ｄ）のうちの何れかを添加して浮遊培養した。前記BMPシグナル伝達経路作用物質をいずれも添加していない条件でも同様に培養した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質をいずれも添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始１８日目に蛍光顕微鏡観察を実施した。BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件で培養した場合では網膜前駆細胞が誘導されたことを示すGFP発現細胞がほとんど認められなかった（図１Ａ,Ｂ）。それと比べて、ＢＭＰ２（図１C，D）、ＢＭＰ４（図１Ｅ，Ｆ）、ＢＭＰ７（図１Ｇ，Ｈ）、ＧＤＦ７（図１Ｉ，Ｊ）のいずれかを添加して培養した条件ではGFP発現細胞が明らかに増加した。
実施例２：網膜組織の製造例１
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来；Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地（Ｓｉｇｍａ）に20%ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μM Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始と同時、浮遊培養開始１日目、浮遊培養開始２日目、浮遊培養開始３日目のいずれかの時点で終濃度１．５ｎＭのヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を添加して浮遊培養した。BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件でも同様に培養した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始18日目に９６wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、引き続きＦ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地中で浮遊培養を行った。浮遊培養開始２６日目に蛍光顕微鏡による観察およびFACSによるGFP陽性細胞の割合の測定を行った。
　BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件（図２Ａ,Ｂ,Ｃ）および浮遊培養開始と同時にＢＭＰ４を添加した条件（図２Ｄ,Ｅ,Ｆ）では網膜前駆細胞が誘導されたことを示すGFP発現細胞は認められなかった。それと比べて、浮遊培養開始１日目（図２Ｇ,Ｈ,Ｉ）、浮遊培養開始２日目（図２Ｊ,Ｋ,Ｌ）、浮遊培養開始３日目（図２Ｍ,Ｎ,Ｏ）のいずれかの時点でＢＭＰ４を添加した条件では、GFP発現細胞が明らかに増加した。いずれの条件においても、形成されたＲＡＸ：：ＧＦＰ陽性の組織の外側にＲＡＸ：：ＧＦＰ陰性の組織は観察されなかった。FACSによる測定の結果では、浮遊培養開始３日目にＢＭＰ４を添加した条件では８５％以上の細胞がＧＦＰ陽性であった（図２Ｏ）。以上の結果から、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体の製造には、BMPシグナル伝達経路作用物質を浮遊培養開始１日目以降、好ましくは３日目に添加することが有効であることが示された。
実施例３：網膜組織の製造例２
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来；Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地（Ｓｉｇｍａ）に20%ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μM Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始６日目、浮遊培養開始９日目、浮遊培養開始１２日目、浮遊培養開始１５日目のいずれかの時点で終濃度１．５ｎＭのヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を添加して浮遊培養した。BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件でも同様に培養した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始18日目に、９６wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、引き続きＦ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地で浮遊培養を行った。浮遊培養開始２４日目に、蛍光顕微鏡観察を実施した。
　その結果、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない条件では網膜前駆細胞が誘導されたことを示すGFP発現細胞は認められなかった（図３Ａ,Ｂ）。それと比べて、浮遊培養開始６日目（図３C，D）、浮遊培養開始９日目（図３Ｅ，Ｆ）、浮遊培養開始１２日目（図３Ｇ，Ｈ）のいずれかの時点でＢＭＰ４を添加した条件では明らかにGFP発現細胞が増加した。浮遊培養開始１５日目にＢＭＰ４を添加した条件でもGFP発現細胞が誘導されたものの、効率は低かった（図３Ｉ，Ｊ）。いずれの条件においても、形成されたＲＡＸ：：ＧＦＰ陽性の組織の外側にＲＡＸ：：ＧＦＰ陰性の組織は観察されなかった。以上の結果から、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体の製造には、BMPシグナル伝達経路作用物質を浮遊培養開始１５日目以前に添加することが有効であることが示された。
実施例４：網膜組織の製造例３
　実施例１で得られたGFP発現細胞を含む凝集体を、浮遊培養開始18日目に９６wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、引き続きＦ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した培地で浮遊培養を実施した。浮遊培養開始２６日目に凝集体を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製した後、免疫染色法により組織構造の確認を行った。
　浮遊培養開始２６日目において、全層がＲＡＸ::ＧＦＰ陽性であり、外層が網膜幹細胞のマーカーであるChx10陽性であった（図４A, B, C）。ＲＡＸ：：ＧＦＰ陽性の上皮の外側には非神経外胚葉等のいかなる組織も存在しなかった。本発明製造方法により、ヒトES細胞から高効率に網膜組織が製造可能であることが示された。
実施例５：網膜層特異的神経細胞の製造例
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来；Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地（Ｓｉｇｍａ）に20%ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μM Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を添加した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始１８日目に９６wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地に１０％ウシ胎児血清、Ｎ２サプリメント、１００μＭタウリン、５００ｎＭ レチノイン酸を添加した培地を用いて浮遊培養を継続した。浮遊培養開始１８日目以降の培養は４０％Ｏ２下で実施した。浮遊培養開始１１７日目に凝集体を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製した後、免疫染色法により組織構造の確認を行った。浮遊培養開始１１７日目において、全層がＲＡＸ::ＧＦＰ陽性であり、視細胞マーカーであるＲｅｃｏｖｅｒｉｎが陽性の細胞が存在した（図５A）。くわえて、網膜組織外層に、棹体視細胞マーカーであるＮｒｌが陽性の細胞（図５B）と、錐体視細胞マーカーであるＲＸＲ－ｇａｍｍａが陽性の細胞（図５C）が存在し、棹体、錐体視細胞への分化が生じていることが示された。さらに、網膜前駆細胞及び双極細胞のマーカーであるＣｈｘ１０が陽性の細胞（図５Ｄ）、アマクリン細胞マーカーであるＣａｌｒｅｔｉｎｉｎが陽性の細胞（図５ Ｅ）、水平細胞マーカーであるＣａｌｂｉｎｄｉｎが陽性の細胞（図５Ｆ）が存在していた。この結果から、本発明製造方法により、各種の分化した網膜層特異的神経細胞から構成される網膜組織を、ヒトES細胞から高効率に製造可能であることが示された。
実施例６：網膜層特異的神経細胞の製造例
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来；Cell Stem Cell, 2012, 10(6) 771-785）を、「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。培地にはDMEM/F12 培地（Ｓｉｇｍａ）に20%ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ　非必須アミノ酸、8ng/ml bFGFを添加した培地を用いた。培養された前記ES細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、単一分散されたES細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μM Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に、前記無血清培地を５０μｌ加えた（合計１５０μｌ）。浮遊培養開始６日目に終濃度１．５ｎＭのヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）を添加した。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に3日おきに交換した。浮遊培養開始１８日目に９６wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと凝集体を移し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地に１０％ウシ胎児血清、Ｎ２サプリメント、１００μＭタウリン、５００ｎＭ レチノイン酸を添加した培地を用いて浮遊培養を継続した。浮遊培養開始１８日目以降の培養は４０％Ｏ２下で実施した。浮遊培養開始５０日目に凝集体を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製した後、免疫染色法により組織構造の確認を行った。浮遊培養開始５０日目において、全層がRAX::GFP陽性であり、網膜前駆細胞及び双極細胞のマーカーであるＣｈｘ１０が陽性の細胞（図６A）、神経節細胞及び神経細胞のマーカーであるPax６陽性の細胞（図６B）が存在し、多層の網膜神経組織が形成されていることが示された。くわえて、視細胞マーカーであるCrxが陽性の細胞（図６C）、及び、神経節細胞のマーカーであるBrn3b陽性の細胞（図６D）が存在した。この結果から、本発明製造方法により、各種の分化した網膜層特異的神経細胞から構成される網膜組織を、ヒトES細胞から高効率に製造可能であることが示された。
実施例７：人工多能性幹細胞（iPS細胞）からの網膜前駆細胞を含む凝集体、網膜組織、及び網膜層特異的神経細胞の製造例
　ヒトiPS細胞株201B7（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター又はiPSアカデミアジャパン株式会社から入手可能）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養する。培地にはDMEM/F12 培地（Ｓｉｇｍａ）に20%ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔTM Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１ｘ 非必須アミノ酸、5ng/ml bFGFを添加した培地を用いる。培養された前記iPS細胞を、ＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養する。その際の無血清培地には、Ｆ－１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ　１－モノチオグリセロール、１ｘ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　ｄｅｆｉｎｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μM Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いる。浮遊培養開始１日目から１５日目の何れかの時点に、終濃度１．５ｎＭのヒト組み換えＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ）、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ２（Ｒ＆Ｄ）、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ）、終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＧＤＦ７（Ｒ＆Ｄ）のうちの何れかを添加して浮遊培養を行う。ウェル内の培養液の半量を、BMPシグナル伝達経路作用物質をいずれも添加していない上記培地に3日おきに交換する。浮遊培養開始１８日目に凝集体を一部回収し、４％パラホルムアルデヒドで固定処理を実施し凍結切片を作製した後、免疫染色法により網膜前駆細胞マーカー（Ｒａｘ、Ｃｈｘ１０）の発現を確認する。残りの凝集体を９６wellプレートから浮遊培養用ディッシュへと移し、ＤＭＥＭ－Ｆ１２培地に１０％ウシ胎児血清、Ｎ２サプリメント、１００μＭタウリン、５００ｎＭ レチノイン酸を添加した培地を用いて浮遊培養を継続する。浮遊培養開始１８日目以降の培養は４０％Ｏ２下で実施する。浮遊培養開始１１７日目に凝集体を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製した後、免疫染色法により組織構造と網膜層特異的神経細胞のマーカー（Ｎｒｌ、ＲＸＲ－ｇａｍｍａ、Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ、Ｃｈｘ１０、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ、Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）の発現の確認を行う。
　このようにして、網膜前駆細胞、更には、各種の分化した網膜層特異的神経細胞から構成される網膜組織を、ヒトiPS細胞から製造可能である。
　本出願は、2013年8月23日付で日本国に出願された特願2013-173285を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
　本発明の製造方法によれば、網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を高効率に製造することが可能となる。本発明の製造方法においては、基底膜標品を培地中に添加することなく凝集体を浮遊培養して、網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を得ることが可能であるので、得られた細胞または組織への異種由来成分の混入のリスクが低減される。本発明の製造方法は、化学物質等の毒性・薬効評価や細胞治療などを目的として、網膜組織を構成する細胞群（視細胞、視神経など）を効率よく製造することや、組織構造を有する網膜組織を用いた毒性・薬効評価や網膜組織移植治療用移植材料への応用を目的として、試験や治療に使用するための「組織材料」となる網膜組織を効率よく製造するという観点から非常に有用である。
 

Claims (14)

  1. （１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び
    （２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程
    を含む、網膜前駆細胞の製造方法。
  2. （１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
    （２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
    （３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程
    を含む網膜組織の製造方法。
  3. （１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
    （２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
    （３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で、目的とする網膜層特異的神経細胞が出現するまで浮遊培養し、目的とする網膜層特異的神経細胞を含有する網膜組織を含み頭部非神経外胚葉を実質的に含まない凝集体を得る第三工程
    を含む網膜層特異的神経細胞の製造方法。
  4. 　前記多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である請求項１から３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である請求項１から４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記工程（１）及び工程（２）が、血清代替物存在下で行われる請求項１から５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる請求項１から６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選ばれる１以上の蛋白質である請求項１から７のいずれか１項に記載の製造方法。
  9. 　前記BMPシグナル伝達経路作用物質が、工程（１）の浮遊培養開始から１日目から１５日目までの間に培地に添加される請求項１から８のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を含有してなる、毒性・薬効評価用試薬。
  11. 　請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞に被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
  12. 　請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤。
  13. 　請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により製造される、有効量の網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法。
  14. 　網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための請求項１から９のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜前駆細胞、網膜組織または網膜層特異的神経細胞。
     
     
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