WO2014190871A1 - 人凝血因子轻链蛋白及其应用 - Google Patents

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宋旭
李灵
陈金武
廖东升
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    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention belongs to the field of biomedicine, and particularly relates to human coagulation factor light chain protein and its application in pharmacy.
  • Gram-negative bacteria generally refer to bacteria that exhibit red color in the Gram stain reaction. Due to the difference in cell wall structure, different dyes caused different staining with Gram-positive bacteria during the Gram staining process (positive bacteria were purple).
  • Gram-negative bacteria are represented by Escherichia coli, as well as Proteus, Shigella, Klebsiella, Brucella, Influenza (Humulus), Parainfluenza (Haemophilus), Kata (Mora), not Bacillus and so on.
  • the pathogenicity of such bacteria is often associated with lipopolysaccharide (also known as endotoxin), a special component of its cell wall.
  • lipopolysaccharide induces a large number of cytokines in the body and activates the immune system, ultimately forming an innate immune response to the pathogen. For example, redness is caused by the massive production and release of cytokines.
  • antibiotics are required in addition to the removal of the infection and the corresponding support for symptomatic treatment.
  • antibiotics such as aminoglycosides and ⁇ -lactams are mainly used. These antibiotics have a strong bactericidal effect on various Gram-negative bacteria, and have long-term antibiotics for common Gram-negative bacilli such as Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, and Escherichia coli. effect.
  • prostaglandin synthetase inhibitors, levamisole, phagopeptides, and the like are also used for the treatment of Gram-negative bacterial infections.
  • Antimicrobial peptides refer to short peptides with antibacterial activity. Most of these active peptides are characterized by thermal stability, strong alkalinity and broad-spectrum antibacterial properties. At present, more than 2,000 AMPs have been identified from different organisms. These AMPs are synthesized and induced to play an important role in the invasion of pathogens. They are considered to be important defense components of biological non-specific immune function. Therefore, the search for new APMs resistant to Gram-negative bacteria has become a hotspot and a difficult point in research.
  • Human Factor VK human factor VL hFVD is a naturally occurring protein in the human body with a molecular weight of approximately 50 kD. Its molecule contains four domains: a N-terminal membrane-bound gamma carboxyglutamate domain (Gla domain), two epidermal growth factor-like domains (EGF1, EGF2) and a C-terminal serine protease domain. It also has some analogues with higher sequence homology in the human body, such as human factor IX (hFlX), human factor X (human factor). Instruction manual
  • One of the objects of the present invention is to provide an artificially prepared human coagulation factor light chain protein, and another object of the present invention is to prove that the human coagulation factor light chain protein has an inhibitory effect on Gram-negative bacteria, thereby developing a class of treatments.
  • a novel drug for Gram-negative infection and a drug for treating endotoxemia caused by Gram-negative bacteria is provided.
  • the protein encoded by the human coagulation factor light chain gene of the present invention has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or 50% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of a protein having 50% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is as described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
  • the protein encoded by the human coagulation factor light chain gene of the present invention the amino acid sequence of which is described in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing or has 50% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence of a protein having 50% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing is as described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing.
  • the protein encoded by the human coagulation factor light chain gene of the present invention the amino acid sequence of which is described in SEQ ID NO: 3 of the Sequence Listing or has 50% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of a protein having 50% or more homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing is as described in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.
  • the human clotting factor light chain protein of the sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is named LhFVL.
  • the amino acid sequence is the human coagulation factor light chain protein according to SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, which is named LhFlX, amino acid sequence.
  • the human coagulation factor light chain protein described in SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing is named LhF X.
  • the protein encoded by the above human coagulation factor light chain gene is expressed by a prokaryotic recombinant plasmid, or expressed by an eukaryotic recombinant plasmid, or prepared by chemical synthesis.
  • the prokaryotic recombinant plasmid, eukaryotic recombinant plasmid of the human coagulation factor light chain of the present invention the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in the sequence listing or the nucleoside described in SEQ ID NO: 4 of the sequence listing
  • a gene having an acid sequence of 50% or more homology is constructed separately from a prokaryotic vector or a eukaryotic vector.
  • the nucleotide sequence of the gene having 50% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing is as described in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing.
  • the prokaryotic vector is a pET plasmid system, including pET-14b, pET-19b, pET-21a (x), pET-28a (+), pET-42a (+); the eukaryotic vector is pcDNA3.1 (+ ), pcD A3.1 ( - ).
  • the prokaryotic recombinant plasmid, eukaryotic recombinant plasmid of the human coagulation factor light chain of the present invention the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing or the nucleoside described in SEQ ID NO: 5 of the sequence listing
  • a gene having an acid sequence of 50% or more homology is constructed separately from a prokaryotic vector or a eukaryotic vector.
  • the nucleotide sequence of the gene having 50% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing is as described in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing.
  • the prokaryotic vector is a pET plasmid system, including pET-14b, pET-19b, pET-21a (+), pET-28a (+), pET-42a Instruction manual
  • the eukaryotic vector is pcDNA3.1 (+), pcD A3.1 (-).
  • the prokaryotic recombinant plasmid, eukaryotic recombinant plasmid of the human coagulation factor light chain of the present invention the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 in the sequence listing or the nucleoside described in SEQ ID NO: 6 of the sequence listing
  • a gene having an acid sequence of 50% or more homology is constructed separately from a prokaryotic vector or a eukaryotic vector.
  • the nucleotide sequence of the gene having 50% or more homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing is as set forth in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 in the Sequence Listing.
  • the prokaryotic vector is a pET plasmid system, including pET-14b, pET-19b, pET-21a (x), pET-28a (+), pET-42a (+); the eukaryotic vector is pcDNA3.1 (+ ), pcD A3.1 ( - ).
  • the prokaryotic vector is a pET plasmid system, and the pET plasmid system comprises a prokaryotic expression plasmid such as pET-14b, pET-19b, pET-21a(+) pET-28a (+) ⁇ pET-42a +);
  • the vector is pcDNA3.1 (+), pcDNA3.1 (-) and the like.
  • the chemical synthesis of the human coagulation factor light chain protein is usually commissioned by a specialist company.
  • the LhFVIK LhFlX and LhFX proteins of the present invention are capable of hydrolyzing lipopolysaccharide of Gram-negative bacteria (also known as endotoxin, which is a main component of the outer membrane of Gram-negative bacteria), destroying the stability of the cell structure, and thereby sterilizing. effect.
  • Gram-negative bacteria also known as endotoxin, which is a main component of the outer membrane of Gram-negative bacteria
  • light chain proteins have strong binding to tissue factor. When the organism is traumatized, the tissue factor is exposed to the wound in a large amount, so that the light chain protein accumulates at the wound, and plays a targeted bacteriostatic action on the wound.
  • LhFVII, LhFlX, LhF X protein bodies have obvious inhibitory effects on Gram-negative bacteria, they are against Escherichia coli DH50 E. coli BL21, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae , Enterobacter cloacae, Aeromonas hydrophila, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Serratia Instruction manual
  • the minimum inhibitory concentration (MIC) of the bacillus is as follows:
  • LhFVIL LhFlX and LhF X protein have obvious inhibitory effect on Gram-negative bacteria in animals, and can induce mice infected with lethal dose of Pseudomonas aeruginosa.
  • the survival rate of 100% was maintained for 14 days, and the mice that were not infected with Pseudomonas aeruginosa survived after the injection of the protein, indicating that the LhFW, LhFlX, and LhF X proteins of the present invention have low immunogenicity and low toxicity.
  • the LhFVH, LhFlX, and LhF X proteins of the present invention are capable of hydrolyzing lipopolysaccharide of Gram-negative bacteria (also known as endotoxin, see Examples 12 and 13), and lipopolysaccharide is the main cause of endotoxemia.
  • the LhFVIL LhF IX, LhF X protein of the present invention can be used in the preparation of a medicament for treating endotoxemia caused by Gram-negative bacteria.
  • the artificially prepared human coagulation factor light chain protein provided by the invention can hydrolyze the outer membrane of Gram-negative bacteria, destroy the stability of the cell structure, and has obvious inhibitory effect on Gram-negative bacteria, thus A new class of therapeutic drugs is provided for diseases caused by gram-negative bacteria infection.
  • the artificially prepared human coagulation factor light chain protein provided by the present invention is capable of hydrolyzing lipopolysaccharide (also known as endotoxin) of Gram-negative bacteria, thereby providing endotoxinemia caused by Gram-negative bacteria.
  • lipopolysaccharide also known as endotoxin
  • the artificially prepared human coagulation factor light chain protein provided by the invention can be targeted and positioned in the wound part of the organism by binding with TF, and has a good targeted bactericidal effect on the Gram-negative bacteria in the wound site, and is expected to be used for Preparation of novel targeted antibacterial drugs.
  • Human Coagulation Factor VII, IX, and X light chain proteins are natural components inherent in the human body, and the present invention can effectively reduce the immunogenicity of the drug by using the antibacterial domain.
  • Figure 1 is a PCR amplification electrophoresis map of the recombinant protein LhFVE gene sequence of Example 1, wherein, Lane 1, DNA molecular weight marker (Markerl, purchased from Tiangen); Lane 2: Sequence encoding LhFW.
  • Figure 2 is a diagram showing the PCR amplification of the LhFlX gene encoding the recombinant protein of Example 2, wherein, Lane 1, DNA molecular weight marker (Markerl, purchased from Tiangen); Lane 2: Sequence encoding LhFlX.
  • Figure 3 is a PCR amplification electrophoresis map of the recombinant protein LhF X gene sequence of Example 3, wherein, Lane 1, DNA molecular weight marker (Markerl, purchased from Tiangen); Lane 2: Sequence encoding LhF X.
  • Figure 4 is a schematic diagram of the prokaryotic recombinant plasmid pET19blhfW of Example 4, wherein the counterclockwise sequence is a forward gene fragment and the clockwise is a reverse gene fragment.
  • Figure 5 is a schematic representation of the prokaryotic recombinant plasmid pET19blhfIX of Example 4, wherein the counterclockwise sequence is a forward gene fragment and the clockwise is a reverse gene fragment.
  • Figure 6 is a schematic representation of the prokaryotic recombinant plasmid pET19blhfX of Example 4, wherein the counterclockwise sequence is a forward gene fragment and the clockwise is a reverse gene fragment.
  • Figure 7 is a restriction endonuclease fragment electrophoresis pattern of the recombinant plasmid pET19blh in Example 4, wherein: Lane 1: DNA molecular weight marker (Markerl+1 kb Marker, purchased from Tiangen); 2 lane: restriction The pET19b vector fragment obtained by digesting the recombinant plasmid pET19bMW and the DNA fragment encoding the recombinant LhFVE protein were digested with an endonuclease.
  • Lane 1 DNA molecular weight marker (Markerl+1 kb Marker, purchased from Tiangen)
  • 2 lane restriction The pET19b vector fragment obtained by digesting the recombinant plasmid pET19bMW and the DNA fragment encoding the recombinant LhFVE protein were digested with an endonuclease.
  • Figure 8 is a restriction endonuclease fragment electrophoresis pattern of the recombinant plasmid pET 19blhfIX in Example 4, wherein: Lane 1: DNA molecular weight marker (lkb Marker, purchased from Tiangen); Lane 2: DNA molecular weight marker ( Marker l, purchased from Tiangen); Lane 3: The pET19b vector fragment obtained by double-digesting the recombinant plasmid pET19blhfIX with a restriction enzyme and a DNA fragment encoding the recombinant LhFlX protein.
  • Lane 1 DNA molecular weight marker (lkb Marker, purchased from Tiangen)
  • Lane 2 DNA molecular weight marker ( Marker l, purchased from Tiangen)
  • Lane 3 The pET19b vector fragment obtained by double-digesting the recombinant plasmid pET19blhfIX with a restriction enzyme and a DNA fragment encoding the re
  • Figure 9 is a restriction endonuclease fragment electrophoresis pattern of the recombinant plasmid pET19blhfX in Example 4, wherein: Lane 1: DNA molecular weight marker (Markerl, purchased from Tiangen); Lane 2: DNA molecular weight marker (1Kb Marker) , purchased from Tiangen Company; Lane 3: The pET19b vector fragment obtained by double digestion of the recombinant plasmid pET19blhfX with a restriction enzyme and a DNA fragment encoding the recombinant LhF X protein.
  • Lane 1 DNA molecular weight marker (Markerl, purchased from Tiangen)
  • Lane 2 DNA molecular weight marker (1Kb Marker) , purchased from Tiangen Company
  • Lane 3 The pET19b vector fragment obtained by double digestion of the recombinant plasmid pET19blhfX with a restriction enzyme and a DNA fragment encoding the recombinant LhF
  • Figure 10 is a SDS-PAGE analysis of the recombinant plasmid pET19blhf YE induced expression of recombinant LhF YE protein in Escherichia coli in Example 5, wherein, Lane 1 : Protein molecular weight marker (Unst. Protein Marker, purchased from Themo Scientific); : Total bacterial protein that did not express recombinant LhFVE protein before induction; Lane 3: Total bacterial protein after induction of expression of recombinant LhF W protein, indicated by the arrow as recombinant LhFVE protein expressed.
  • Lane 1 Protein molecular weight marker (Unst. Protein Marker, purchased from Themo Scientific)
  • Lane 3 Total bacterial protein after induction of expression of recombinant LhF W protein, indicated by the arrow as recombinant LhFVE protein expressed.
  • Figure 11 is a diagram showing the recombinant plasmid pET19blhfIX induced expression of recombinant LhFlX protein in Escherichia coli in Example 5.
  • Figure 12 is a diagram showing the expression of recombinant LhF X protein in Escherichia coli by recombinant plasmid pET19blhf X in Example 5.
  • Figure 13 is a diagram showing the western-blot identification analysis of the recombinant LhFW protein induced to express in Example 5.
  • Figure 14 is a diagram showing the western-blot identification analysis of the recombinant LhFK protein induced to be expressed in Example 5.
  • Fig. 15 is a diagram showing the western-blot identification analysis of the recombinant LhFX protein induced to be expressed in Example 5.
  • Figure 16 is a SDS-PAGE analysis of recombinant LhFW protein purified by affinity chromatography in Example 6, wherein: Lane 1 : Protein molecular weight marker (Unst. Protein Marker, purchased from Themo Scientific); 2 Lane: Purification Post restructuring
  • Figure 17 is a SDS-PAGE analysis of recombinant LhFK protein purified by affinity chromatography in Example 6, wherein: Lane 1 : Protein molecular weight marker (Unst. Protein Marker, purchased from Themo Scientific); Lane 2: Purification Post-recombinant LhFlX protein.
  • Figure 18 is a SDS-PAGE analysis of recombinant LhFX protein purified by affinity chromatography in Example 6, wherein: Lane 1: Protein molecular weight marker (Unst. Protein Marker, purchased from Themo Scientific); Lane 2: Purification Post-recombinant LhFX protein.
  • Figure 19 is a schematic diagram of the eukaryotic recombinant plasmid p C DNA3.1-LhFVE of Example 7, wherein the counterclockwise sequence is a forward gene fragment and the clockwise is a reverse gene fragment.
  • Figure 20 is a schematic diagram of the eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1-LhFlX of Example 7, wherein the counterclockwise sequence is a forward gene fragment and the clockwise is a reverse gene fragment.
  • Figure 21 is a schematic diagram of the eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1 -LhFX of Example 7, wherein the counterclockwise sequence is a forward gene fragment and the clockwise is a reverse gene fragment.
  • Figure 22 is a growth curve of the effect of the recombinant LhFVH protein of Example 10 on Escherichia coli DH5a, wherein ⁇ «C «si : a control group without added protein; ⁇ : 15 miscellaneous : addition of 12.5 g/mL recombinant LhFVE protein Experimental group; TM «S g «: experimental group to which 25 g/mL recombinant LhFVII protein was added; : experimental group to which 50 g/mL recombinant LhFVE protein was added.
  • Figure 23 is a growth curve of the effect of the recombinant LhF IX protein of Example 10 on Escherichia coli DH5CX, wherein - ⁇ - mt i. a control group without added protein; an experimental group supplemented with 12.5 g/mL recombinant LhFlX protein; ⁇ 3 ⁇ 4 An experimental group supplemented with 25 g/mL recombinant LhFlX protein; an experimental group supplemented with 50 g/mL recombinant LhFlX protein.
  • Figure 24 is a growth curve of the effect of the recombinant LhF X protein of Example 10 on Escherichia coli DH5a, wherein: a control group without added protein; ⁇ -n.$m ⁇ : an experimental group supplemented with 12.5 g/mL recombinant LhFX protein ; an experimental group supplemented with 25 g/mL recombinant LhFX protein; an experimental group supplemented with 50 g/mL recombinant LhFX protein.
  • Figure 25 is a graph showing the increase in the survival rate of the lethal dose of Pseudomonas aeruginosa mice by the recombinant LhFW protein of Example 11, wherein KConto: infected mice not injected with drugs; Yimaiqing: infected mice injected with meropenem; Pan-Western spines: Infected mice injected with penicillin; - ' ⁇ ? ⁇ : infected mice injected with recombinant LhFvn protein.
  • Figure 26 is a graph showing the increase in the survival rate of the lethal dose of Pseudomonas aeruginosa mice by the recombinant LhFlX protein of Example 11, wherein G ttrol : infected mice not injected with drugs; infected mice infected with penicillin; Instruction manual
  • FIG. 27 is a graph showing the increase in the survival rate of a lethal dose of Pseudomonas aeruginosa mice by recombinant LhF X protein described in Example 11, wherein C ⁇ S! tmt : infected mice not injected with drugs; Panyi Street: injection of penicillin Infected mouse
  • Figure 28 is a mass spectrometric detection of the recombinant LhFW proteolytic LPS of Example 12, wherein the upper layer is the LhFVE protein mass spectrum; the middle layer is the untreated LPS mass spectrum; and the lower layer is the mass spectrum of the LhFW protein treated LPS.
  • Figure 29 is a silver staining assay of recombinant LhFW proteolytic LPS as described in Example 13, wherein lane 1 : protein pre-stained marker; lane 2: recombinant LhFVE protein; lane 3: untreated. K12 LPS; lane 4: LhFW Treated £.co/z' K12 LPS.
  • Example 1 Obtaining a gene encoded by a recombinant LhFW protein
  • the plasmid containing the human coagulation factor W CDS region (Guangzhou Fueneng Gene Co., Ltd.) was used as a template, and PCR amplification was carried out using primer 1 and primer 2.
  • the Nco I cleavage site and the Hisx6 protein purification tag were introduced into the sequence of the stalk I, and the Xho I cleavage site was inserted into the stalk 2 sequence. After amplification, a 497 bp DNA fragment containing the human clotting factor W light chain coding sequence was obtained.
  • the PCR reaction system (50 ⁇ ) is as follows:
  • the PCR amplification reaction conditions were set according to the instructions of PrimeStar DNA polymerase (purchased from Takara): predenaturation at 98 °C for 2 min, denaturation at 98 °C for 10 sec, renaturation at 55 °C for 15 sec, extension at 72 °C for 50 sec, After 30 cycles, it was extended at 72 ° C for 4 min.
  • PrimeStar DNA polymerase purchased from Takara
  • the amplified product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis (see Figure 1), and the fragment was recovered according to the instructions of the gel recovery kit (purchased from Omega).
  • Example 2 Obtaining the coding gene of recombinant LhFlX protein
  • the plasmid containing the human coagulation factor IX CDS region (Guangzhou Fueneng Gene Co., Ltd.) was used as a template, and PCR amplification was carried out using primer 1 and primer 2.
  • the Nco I restriction site and the Hisx6 protein purification tag were introduced into the sequence of the primer I, and the Xho l restriction site was introduced into the primer 2 sequence.
  • a DNA fragment of 476 bp in length containing the coding sequence of human coagulation factor IX light chain was obtained.
  • the PCR reaction system (50 ⁇ is as follows:
  • the PCR amplification reaction conditions were set according to the instructions of PrimeStar DNA Polymerase: predenaturation at 98 °C for 2 min, denaturation at 98 °C for 10 sec, renaturation at 55 °C for 15 sec, extension at 72 °C for 50 sec, 72° after 30 cycles. C extends for 4 min.
  • the amplified product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis (see Figure 2), and the fragment was recovered according to the instructions of the gel recovery kit (purchased from Omega).
  • Example 3 Obtaining the gene encoding the recombinant LhF X protein
  • PCR amplification primers (synthesized by Handsome Biotechnology Co., Ltd.):
  • the plasmid containing the human coagulation factor X CDS region (Guangzhou Fueneng Gene Co., Ltd.) was used as a template, and PCR amplification was carried out using primer 1 and primer 2.
  • the Nco I restriction site and the Hisx6 protein purification tag were introduced into the sequence of the primer I, and the Xhol restriction site was introduced into the primer 2 sequence.
  • a 458 bp DNA fragment containing the human coagulation factor X light chain coding sequence was obtained.
  • the PCR reaction system (50 ⁇ ) is as follows:
  • Plasmid containing human coagulation factor X CDS region (100 ng/yL) : 2 ⁇ L
  • PrimeStarDNA Polymerase 0.5 ⁇ L
  • the PCR amplification reaction conditions were set according to the instructions of PrimeStar DNA polymerase: predenaturation at 98 °C for 2 min, denaturation at 98 °C for 10 sec, renaturation at 55 °C for 15 sec, extension at 72 °C for 50 sec, extension at 72 °C after 30 cycles. Min.
  • the amplified product was analyzed by 2% agarose gel electrophoresis (see Figure 3), and the fragment was recovered according to the instructions of the gel recovery kit (purchased from Omega).
  • Example 4 Construction of prokaryotic recombinant plasmid expressing recombinant LhFW, LhFlX, LhFX protein
  • the LhFVD gene fragment cloned in Example 1, the LhF1X gene fragment cloned in Example 2, the LhFX gene fragment cloned in Example 3, and the prokaryotic expression vector were digested with restriction endonuclease Nco/ and (both purchased from TaKaRaFermentas Co., Ltd.), respectively.
  • pET19b product of Novagen
  • reaction product was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and the fragment was recovered under the ultraviolet light of the gel imaging system according to the instructions of the gel recovery kit (purchased from Omega Corporation).
  • the gel recovery kit purchased from Omega Corporation.
  • the above-described transformed E. coli Top monoclonal was cultured in small amounts, and the plasmid was extracted with a plasmid extraction kit (purchased from OMEGA), and subjected to Nco l/Xho l double digestion. After identification of the double-cut products by gel electrophoresis, the restriction endonuclease digestion of the three recombinant plasmids was shown in Figure 7-9. The two bands formed by the digestion products corresponded to the expected product size, indicating that the plasmid was successfully constructed.
  • the double-enzyme-cleaved plasmid was sent to the Beijing Huada Gene Research Center for sequencing of the inserted fusion gene fragment.
  • the prokaryotic recombinant plasmid containing the LhFVE gene with the correct sequencing result was named pET19blhfW
  • the prokaryotic recombinant plasmid containing the LhFlX gene was named as pET19blhflX
  • pET19blhfX a prokaryotic recombinant plasmid containing the LhF X gene was named pET19blhfX.
  • Example 5 Expression of prokaryotic recombinant plasmid in Escherichia coli
  • the recombinant plasmids pET19blhfVn, pET19blhfIX, and pET19blhfX constructed in Example 4 were transformed into E. coli BL21(DE3) (purchased from Invitrogen), respectively, and the monoclonal was picked up in LB medium containing 0.1 g/mL ampicillin at 37 °C. Incubate at 185 rpm to OD 6TO 0.6, and 1 mL of the bacterial solution was frozen at -20 °C.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside
  • the strain expressing LhF VE was named LhF VH -pET19bBL21-(DE3)
  • the strain expressing LhFlX was named LhFlX-pET19bBL21-(DE3)
  • the strain expressing LhF X was named LhF. X -pET 19bBL21 - (DE3).
  • Example 6 Affinity chromatography purification of recombinant LhFVE, LhF IX and LhF X proteins
  • Ultrasonic broken cells power: 300 W; ultrasonic time: 10 s; interval: 10 s; total ultrasonic time: 3 min; performed in an ice bath). After the end of the ultrasound, the bacterial solution is at 4. C, 48400 X g was centrifuged at 30 mm, and the supernatant was collected and placed on ice.
  • the eluate containing the protein of interest was ultrafiltered with Tris-Cl buffer (pH 7.4), the buffer was replaced, and concentrated. After filtration, high concentration recombinant protein - recombinant LhFW, LhF IX, LhF X protein can be obtained. Protein quantification showed that about 15 mg of the target protein with a purity of more than 90% per liter of the expressed bacteria.
  • Example 7 Construction of eukaryotic recombinant plasmid expressing recombinant LhFW, LhF IX, LhF X protein
  • Primer 2 TATCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGTCGGCCTTGG
  • Primer 3 TAAGGATCCTGCAGAGATTTCATCATGCAGCGCGTGAAC
  • Primer 4 TATCTCGAGTTAATGATGA GATGATGATGACGGGTGAGCT
  • the plasmid containing the human coagulation factor W CDS region (Guangzhou Fueneng Gene Co., Ltd.) was used as a template, and PCR amplification was carried out using primer 1 and primer 2.
  • the BamH I cleavage site and the cozak sequence were introduced into the primer 1 sequence, and the Xho I restriction site and the His protein purification tag were introduced into the primer 2 sequence.
  • the plasmid containing the human coagulation factor IX CDS region (Guangzhou Fueneng Gene Co., Ltd.) was used as a template, and PCR amplification was carried out using primer 3 and primer 4.
  • the BamH I cleavage site, the cozak sequence and the signal peptide were introduced into the primer 3 sequence, and the Xho I cleavage site and the His protein purification tag were introduced into the primer 4 sequence.
  • the plasmid containing the human coagulation factor X CDS region (Guangzhou Fueneng Gene Co., Ltd.) was used as a template, and PCR amplification was carried out using primer 5 and primer 6.
  • the BamH I restriction site, the cozak sequence, and the signal peptide were introduced into the primer 5 sequence, and the Xho I restriction site and the His protein purification tag were introduced into the sequence of the cDNA.
  • the PCR reaction was carried out in accordance with Example 1.
  • the restriction endonuclease BamH xho I (both purchased from TaKaRaFermentas Co., Ltd.) was used to double-cleave the LhFVE, LhFlX, LhF X gene fragments and the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 ( + ) (product of Novagen), respectively.
  • the reaction system is referred to in Example 4.
  • the ligation and transformation of the gene with the eukaryotic expression vector and the identification procedure of the recombinant plasmid are referred to in Example 4.
  • the recombinant plasmid containing the LhFVH gene with the correct sequencing result was named pcDNA3.1-LhFW
  • the recombinant plasmid containing the LhFlX gene was named pcDNA3.1-LhFlX
  • the recombinant plasmid containing the LhF X gene was named pcDNA3.1-LhF X.
  • the plasmid map is shown in Figure 19-21.
  • Example 8 Construction of a stable cell line expressing recombinant LhFVE, LhFlX, LhF X protein
  • DG44 cells purchased from ATCC
  • FBS fetal calf serum
  • DG44 cells were inoculated with 4 ⁇ 10 5 /mL in a 6-well plate, 2 mL per well.
  • LipofectamineTM 2000 reagent purchased from Invitrogen. Specific steps are as follows-
  • the cells were transferred to a 100 mm culture dish at a ratio of 1:2000, and added to a final concentration of 800 g/mL of G418 (purchased from Gibco) for transfection of empty vector and untransfected group. For comparison. After 15 days, the monoclonals were transferred to a 24-well plate culture. After the cells were full, they were transferred to a 6-well plate, and the culture was expanded in a 100 mm culture dish. When the cell fusion degree reached 90%, 1:4 was frozen in 10% DMSO. (purchased from Gibco) in FBS.
  • Genomic PCR and RT-PCR detection of the selected positive cell clones can amplify the target fragment, indicating that the fusion gene has been integrated into the cell genome and functional mRNA transcription.
  • the obtained stable cell lines were named DG44. -LhFVE, DG44-LhFlX, DG44-LhF X.
  • Example 9 Collection of recombinant LhFVE, LhFlX, LhF X proteins expressed by eukaryotic recombinant plasmid
  • DG44-LhF W, DG44-LhFlX, DG44-LhF X cells were cultured in 10% FBS-containing ⁇ - ⁇ complete medium supplemented with 400 g/mL G418 and passaged to 10 plates.
  • Example 10 Detection of antibacterial activity of recombinant LhFVH, LhFlX and LhF X proteins
  • the 96-well plate was placed at 37 ° C, shaken at 175 rpm, and sampled every 30 minutes.
  • the absorbance at 600 nm was measured under an ultraviolet spectrophotometer to make a bacteriostatic curve.
  • MIC determination The growth phenomenon was observed after 8 hours of culture, and it was visually observed or determined by ultraviolet spectrophotometer at a wavelength of 600 nm.
  • the minimum inhibitory protein concentration without bacterial growth was the minimum inhibitory concentration MIC.
  • the growth curve of recombinant LhFVIL LhFlX and LhF X proteins on Escherichia coli DH5a is shown in Fig. 22 to Fig. 24. It can be seen from Fig. 22 to Fig. 24 that recombinant LhFVE, LhFlX and LhF X proteins have significant inhibitory effects on the growth of DH5a, and recombinant LhFVH The MIC of LhFlX and LhF X proteins was 25 g/mL.
  • Example 11 Determination of antibacterial activity of recombinant LhFVH, LhF IX. LhF X protein in animals
  • the experimental animals were BAL B/C male rats (body weight about 18-22g, from Sichuan University), divided into 11 groups, 8 in each group, of which the experimental group was 3 groups, and the rest were various control groups.
  • Recombinant LhFVH, LhF IX, and LhF X proteins were prepared according to the aseptic method using physiological saline to prepare samples with a concentration of 100 g/mL, and stored on ice for use.
  • the lethal dose of Pseudomonas aeruginosa was intraperitoneally injected into the BAL B/C male rats in each experimental group and three control groups at a dose of 500 ⁇ .
  • the recombinant LhFVE protein (50 ⁇ ⁇ / only) was administered to the tail vein of the first experimental group, and the recombinant LhFlX protein was administered to the tail vein of the second experimental group (100 ⁇ ⁇ /only;), the third experimental group was administered recombinant LhFX protein (100 ⁇ ⁇ / only) in the tail vein; the BALB/C male rats in the three control groups were infected with the cells for 30 min, and the first and second control groups were respectively tailed. Penicillin (9.1 mg/mouse) and meropenem (1.5 mg/mouse) were administered intravenously, and the third control group was not administered.
  • the remaining fourth, fifth, sixth, seventh, and eighth control groups were not injected with Pseudomonas aeruginosa, and only the same doses of recombinant LhFW, LhFlX, and LhFX proteins were injected into the first, second, and third experimental groups. , equal doses of penicillin and meropenem with the first and second controls.
  • the recombinant LhFVE, LhFlX, and LhFX proteins of the present invention allowed 100% survival of mice infected with a lethal dose of P. aeruginosa for 14 days.
  • the survival rate of the mice after the 14th was 100%, while the mice in the first control group (penicillin group) died, and the survival rate of the lethal dose of Pseudomonas aeruginosa mice was as shown in Fig. 25- Figure 27 shows.
  • the fourth, fifth, sixth, seventh, and eighth mice all survived.
  • the experimental results show that the recombinant LhFVE, LhFlX and LhFX proteins of the present invention have antibacterial activity against Gram-negative bacteria in animals, and the toxicity is small, and the animal does not die.
  • Example 12 Mass spectrometry detection of recombinant LhFW, LhFlX, LhFX protein damage to endotoxin (LPS)
  • Control group 1 0.5 g ⁇ iLLhFVn or LhFlX or LhFX 120
  • Control group 2 TBS 120 ⁇ L
  • the supernatant was dialyzed against a 100D dialysis bag for 16 hours, and the dialysis buffer was deionized water. After the end of the dialysis, the treated sample was analyzed by mass spectrometry MALDI-TOF;
  • the sample of the mixed DHB was spotted on a stainless steel MTP 384 target plate (Bruker Daltonics), and then the sample on the target plate was dried by hot air;
  • Example 13 Silver staining detection of recombinant LHFW, LhFlX, LhF X proteolytic coZ K12 LPS
  • the LPS samples were treated with LhFW, LhFlX, and LhF X obtained in Example 6, and the control group was treated with TBS buffer for LPS samples, incubated overnight, and then the precipitate was collected by centrifugation;
  • LPS lx loading buffer 0.05 M Tris-HCl, containing 10 g/L SDS, 100 g/L sucrose, 0.5% ⁇ -mercaptoethanol, 10 mg/L bromophenol blue, pH 6.8 and post-treatment The precipitated samples were mixed and incubated on a 100 ° C metal bath for 5 min ;
  • the silver staining map takes LhFW as an example, as shown in Figure 29.
  • LhFVH treatment the LPS band was significantly reduced and weakened, indicating that light chain protein cleared most of the LPS. Therefore, the LhFVE, LhFlX, and LhF X of the present invention have a function of hydrolyzing LPS and can be used for treating endotoxemia.

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Abstract

本发明通过体外抑菌活性检测了人凝血因子轻链蛋白抗不同革兰氏阴性菌的最低抑菌浓度，通过体内抑菌活性检测了人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌的抑制作用，证明了人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用，以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感染的新型药物。通过质谱及银染检测证明了人凝血因子轻链蛋白对内毒素的水解及清除作用，以便开发出一类治疗内毒素血症的新型药物。所述人凝血因子轻链蛋白为人凝血因子VII、IX、X轻链蛋白，以及与它们具有50％以上同源性的蛋白。

Description

说明书
人凝血因子轻链蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物医药领域， 特别涉及人凝血因子轻链蛋白及其在制药中的应用。
背景技术
革兰氏阴性菌泛指在革兰氏染色反应中呈现红色的细菌。 由于细胞壁结构的不同， 在革 兰氏染色过程中， 不同的染料造成了其与革兰氏阳性菌着色的不同（阳性菌为紫色）。革兰氏 阴性菌以大肠杆菌为代表， 还有变形杆菌、 痢疾杆菌、 肺炎杆菌、 布氏杆菌、 流感 （嗜血） 杆菌、 副流感 （嗜血） 杆菌、 卡他 （摩拉） 菌、 不动杆菌属等等。 该类细菌的致病能力往往 与其细胞壁的特殊组分——脂多糖 （又叫内毒素）相关。 在人体当中， 脂多糖会诱导机体产 生大量细胞因子并激活免疫系统， 最终形成有机体对病原菌的先天性免疫应答。 例如红肿就 是细胞因子大量产生并释放导致的。
在革兰氏阴性菌感染的治疗中， 除了清除感染灶及用相应的支持对症治疗外， 还需使用 抗生素。 目前主要采用的是氨基糖苷类、 β-内酰胺类等抗生素。 这些抗生素对各种革兰氏阴 性菌有强大杀菌作用， 而且对于铜绿假单胞菌、 肺炎克雷伯氏菌、 大肠埃希氏菌等常见革兰 氏阴性杆菌都具有较长时间的抗生素后效应。 除了抗生素以外， 如前列腺素合成酶抑制剂、 左旋咪唑、 吞噬肽等也被用于革兰氏阴性菌感染的治疗。 然而， 随着抗生素的广泛应用， 临 床出现的抗生素滥用现象导致细菌的耐药性己经从单类耐药发展成为多重耐药， 使大量原本 能够有效替代的二线抗生素无效。 其次， 抗菌药物在杀 /抑菌的同时会诱导内毒素的产生， 增 加了疾病的治疗难度， 所以尽管不断有新的杀伤力强的抗生素问世及先进的支持疗法出现， 革兰氏阴性菌感染所致的内毒素血症的处理仍是临床上棘手的问题，尤其是其 20~30%的死亡 率更是令人难以接受。 据报道脂多糖是导致革兰氏阴性菌感染后发生的一系列毒性反应的主 要病源物。 虽然抗生素对清除细菌具有较好的效果， 但对已游离于血液中的脂多糖以及由其 持续刺激靶细胞产生的多种有害细胞因子无能为力， 所以临床选用抗菌药物时应对药敏实验 结果及其诱导内毒素释放的特性进行综合考虑。 第三， 因为脂多糖在革兰氏阴性菌的细胞壁 表面， 使得很多旧型抗生素不能有效抑制此类细菌。 基于这些原因， 近年来人们正在积极开 拓治疗革兰氏阴性菌感染的新领域。
抗菌肽 (antimicrobial peptides, AMPs) 是指具有抗菌活性的短肽，这类活性肽多数具有热 稳定性、 强碱性及广谱抗菌等特点。 目前人们已经从不同的生物体中鉴定出约 2000 多个 AMPs,这些 AMPs经诱导而合成，在机体抵抗病原体的入侵方面起着重要的作用，被认为是 生物非特异性免疫功能的重要防御成分。 因此寻找新型抗革兰氏阴性菌的 APMs成为研究的 热点与难点。
人凝血因子 VK human factor VL hFVD是人体内天然存在的蛋白质，其分子量约为 50 kD。 其分子包含四个结构域： N末端膜结合的 γ羧基谷氨酸结构域（Gla结构域）， 两个表皮生长因 子样结构域 （EGF1、 EGF2) 和一个 C端丝氨酸蛋白酶结构域。 它在人体内还存在一些序列 同源性较高的类似物，如人凝血因子 IX (human factor IX， hFlX)、人凝血因子 X ( human factor 说明书
X， hF X ) 等。 迄今为止， 尚未见以人凝血因子 W、 人凝血因子 IX、 人凝血因子 X三者的轻 链作为抑菌药物治疗细菌感染的相关报道及制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物 的报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供人工制备的人凝血因子轻链蛋白， 本发明的另一目的是证明所 述人凝血因子轻链蛋白对革兰氏阴性菌具有抑制作用， 以便开发出一类治疗革兰氏阴性菌感 染的新型药物及治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物。
本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 1 所述，或与 SEQ ID NO: 1所述氨基酸序列具有 50%以上的同源性的蛋白。与序列表中 SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列具有 50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 3所述。
或本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 2所述，或与 SEQ ID NO: 2所述氨基酸序列具有 50%以上的同源性的蛋白。与序列表中 SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列具有 50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 3所述。
或本发明所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 3所述，或与 SEQ ID NO: 3所述氨基酸序列具有 50%以上的同源性的蛋白。与序列表中 SEQ ID NO: 3所述的氨基酸序列具有 50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2所述。
氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 1所述列的人凝血因子轻链蛋白命名为 LhFVL 氨 基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 2所述的人凝血因子轻链蛋白命名为 LhFlX, 氨基酸序列 为序列表中 SEQ ID NO: 3所述的人凝血因子轻链蛋白命名为 LhF X。
上述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白， 由原核重组质粒表达而成， 或真核重组质粒表 达而成， 或通过化学合成制备。
本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒， 由序列表中 SEQ ID NO: 4 所述的核苷酸序列或与序列表中 SEQ ID NO: 4所述的核苷酸序列具有 50%以上同源性的基 因分别与原核载体或真核载体构建而成。 与序列表中 SEQ ID NO: 4所述的核苷酸序列具有 50%以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 5或 SEQ ID NO: 6所述。所述 原核载体为 pET质粒系统， 包括 pET-14b、 pET-19b、 pET-21a (十）、 pET-28a ( +)、 pET-42a (+); 所述真核载体为 pcDNA3.1 ( + )、 pcD A3.1 ( - )。
本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒， 由序列表中 SEQ ID NO: 5 所述的核苷酸序列或与序列表中 SEQ ID NO: 5所述的核苷酸序列具有 50%以上同源性的基 因分别与原核载体或真核载体构建而成。 与序列表中 SEQ ID NO: 5所述的核苷酸序列具有 50%以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 6所述。所述 原核载体为 pET质粒系统， 包括 pET-14b、 pET-19b、 pET-21a (+)、 pET-28a ( +)、 pET-42a 说明书
(+)； 所述真核载体为 pcDNA3.1 ( + )、 pcD A3.1 ( - )。
本发明所述人凝血因子轻链的原核重组质粒、真核重组质粒， 由序列表中 SEQ ID NO: 6 所述的核苷酸序列或与序列表中 SEQ ID NO: 6所述的核苷酸序列具有 50%以上同源性的基 因分别与原核载体或真核载体构建而成。 与序列表中 SEQ ID NO: 6所述的核苷酸序列具有 50%以上同源性的基因的核苷酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 4或 SEQ ID NO: 5所述。所述 原核载体为 pET质粒系统， 包括 pET-14b、 pET-19b、 pET-21a (十）、 pET-28a ( +)、 pET-42a (+); 所述真核载体为 pcDNA3.1 ( + )、 pcD A3.1 ( - )。
本发明所使用的方法：
( 1 )通过 PCR反应，获取编码重组 LhFVIL LhFlX、 LhFX蛋白的基因或与它们具有 50% 以上同源性的基因；
(2)将上述扩增的各基因片段分别插入到原核载体或真核载体构建原核重组质粒或真核 重组质粒，再将原核重组质粒或真核重组质粒转化至感受态细菌中进行培养，然后筛选出含有 正确插入片段的重组质粒测序；
(3 )将测序结果正确的原核重组质粒转化入工程菌中进行表达， 分离纯化表达的蛋白即 获得重组 LhFW蛋白、 LhFlX蛋白、 LhFX蛋白或与它们具有 50%以上同源性的蛋白； 或将真 核重组质粒转染至哺乳动物细胞进行培养，建立稳定细胞系进行真核表达，然后分离纯化的蛋 白即获得重组 LhFVH蛋白、 LhFlX蛋白、 LhFX蛋白或与它们具有 50%以上同源性的蛋白；
(4) 重组 LhFVE、 LhFlX、 LhF X蛋白或与它们具有 50%以上同源性的蛋白的体外抑菌 活性检测；
(5 ) 重组 LhFVE、 LhFlX, LhF X蛋白或与它们具有 50%以上同源性的蛋白的体内抑菌 活性检测；
(6) 重组 LhFW、 LhFlX、 LhF X蛋白或与它们具有 50%以上同源性的蛋白水解脂多糖 的质谱检测；
(7) 重组 LhFVE、 LhFlX、 LhF X蛋白或与它们具有 50%以上同源性的蛋白水解脂多糖 的银染检测；
所述原核载体为 pET质粒系统，所述 pET质粒系统包括 pET-14b、 pET-19b、 pET-21a(+) pET-28a (+) ^ pET-42a +)等原核表达质粒； 所述真核载体为 pcDNA3.1 ( + )、 pcDNA3.1 (-)等。
人凝血因子轻链蛋白的化学合成通常委托专业公司。
本发明所述 LhFVIK LhFlX、 LhFX蛋白能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖 （又称内毒素， 为革兰氏阴性菌外膜的主要成分）， 破坏细胞结构的稳定性， 进而起到杀菌的作用。 同时， 研究表明轻链蛋白与组织因子具有很强的结合作用。当有机体受到创伤时， 组织因子会大量 暴露于伤口处， 使得轻链蛋白随之聚集在伤口处， 起到对伤口的靶向抑菌作用。体外抑制革 兰氏阴性菌活性检测表明： LhFVII、 LhFlX、 LhF X蛋白体对革兰氏阴性菌具有明显的抑制作 用， 它们对大肠杆菌 DH50 大肠杆菌 BL21、 绿脓杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、 阴沟肠杆菌、 嗜水气单胞菌、 异型枸櫞酸杆菌、 卡他莫拉菌、 奇异变形杆菌、 普通变形杆菌、 粘质沙雷氏 说明书
杆菌的最低抑菌浓度 （MIC) 如下：
MIC ( g/mL)
菌种
LhFW LhFlX LhF X
大肠杆菌 DH5a 25 25 25
大肠杆菌 BL21 50 50 50
绿脓杆菌 25 25 25
肺炎克雷伯氏菌 25 25 25
阴沟肠杆菌 25 50 50
嗜水气单胞菌 25 25 25
异型枸橼酸杆菌 50 50 25
卡他莫拉菌 25 25 25
奇异变形杆菌 25 25 25
普通变形杆菌 50 50 25
粘质沙雷氏杆菌 25 50 25
LhFVIL LhFlX、 LhF X蛋白在动物体内的抑菌活性检测表明： LhFVH、 LhFlX、 LhF X蛋 白对动物体内的革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用， 可以使受到致死剂量绿脓杆菌感染的小 鼠在 14天保持 100%的存活率， 并且未感染绿脓杆菌的小鼠在注射所述蛋白后， 全部存活， 说 明本发明所述 LhFW、 LhFlX、 LhF X蛋白本身免疫原性低， 毒性小。
本发明所述 LhFVH、 LhFlX、 LhF X蛋白能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖 （又称内毒素， 见实施例 12、 13 ), 而脂多糖是导致内毒素血症的主要病源物， 因而本发明所述 LhFVIL LhF IX、 LhF X蛋白可在制备治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物中应用。
本发明具有以下有益效果-
1、本发明提供的人工制备的人凝血因子轻链蛋白， 能够水解革兰氏阴性菌的外膜、破坏 其细胞结构的稳定性， 对革兰氏阴性菌具有明显的抑制作用， 因而为革兰氏阴性菌感染所致 疾病提供了一类新型治疗药物。
2、本发明提供的人工制备的人凝血因子轻链蛋白， 能够水解革兰氏阴性菌的脂多糖（又 称内毒素）， 因而为革兰氏阴性菌所致的内毒素血症提供了一类新型治疗药物。
3、 本发明提供的人工制备的人凝血因子轻链蛋白， 能够通过与 TF的结合靶向定位在有 机体伤口部位， 对伤口部位的革兰氏阴性菌具有良好的靶向杀菌效果， 有望用于制备新型的 靶向抗菌药物。
4、 人凝血因子 VII、 IX、 X轻链蛋白是人体中固有的天然成分， 本发明以其为抑菌结构域 可以有效降低药物的免疫源性。
5、 由于可以直接通过基因工程技术在大肠杆菌工程菌细胞内准确表达重组人凝血因子 轻链蛋白， 因而生产成本较低， 有利于工业化生产。
附图说明 说明书
图 1是实施例 1所述编码重组蛋白 LhFVE基因序列 PCR扩增电泳图， 图中， 1泳道： DNA分 子量标记 （Markerl , 购自天根公司） ； 2泳道： 编码 LhFW的序列。
图 2是实施例 2所述编码重组蛋白 LhFlX基因序列 PCR扩增电泳图， 图中， 1泳道： DNA分 子量标记 （Markerl , 购自天根公司） ； 2泳道： 编码 LhFlX的序列。
图 3是实施例 3所述编码重组蛋白 LhF X基因序列 PCR扩增电泳图， 图中， 1泳道： DNA分 子量标记 （Markerl , 购自天根公司） ； 2泳道： 编码 LhF X的序列。
图 4是实施例 4所述原核重组质粒 pET19blhfW的示意图， 其中， 逆时针序列为正向基因片 段， 顺时针为反向基因片段。
图 5是实施例 4所述原核重组质粒 pET19blhfIX的示意图， 其中， 逆时针序列为正向基因片 段， 顺时针为反向基因片段。
图 6是实施例 4所述原核重组质粒 pET19blhfX的示意图， 其中， 逆时针序列为正向基因片 段， 顺时针为反向基因片段。
图 7是实施例 4中重组质粒 pET19blh 的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图， 其中， 1泳 道： DNA分子量标记（Markerl+1 kb Marker, 购自天根公司）； 2泳道： 用限制性内切酶双酶 切重组质粒 pET19bMW后所得的 pET19b载体片段和编码重组 LhFVE蛋白的 DNA片段。
图 8是实施例 4中重组质粒 pET 19blhfIX的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图， 其中， 1泳 道： DNA分子量标记 （lkb Marker, 购自天根公司） ； 泳道 2: DNA分子量标记 （Marker l , 购自天根公司） ； 3泳道： 用限制性内切酶双酶切重组质粒 pET19blhfIX后所得的 pET19b载体 片段和编码重组 LhFlX蛋白的 DNA片段。
图 9是实施例 4中重组质粒 pET19blhfX的限制性内切酶酶切片段电泳鉴定图， 其中， 1泳 道： DNA分子量标记 （Markerl , 购自天根公司） ； 2泳道： DNA分子量标记 （1Kb Marker, 购自天根公司） ； 3泳道： 用限制性内切酶双酶切重组质粒 pET19blhfX后所得的 pET19b载体 片段和编码重组 LhF X蛋白的 DNA片段。
图 10是实施例 5中重组质粒 pET19blhf YE在大肠杆菌中诱导表达重组 LhF YE蛋白的 SDS-PAGE分析图， 其中， 1泳道： 蛋白质分子量标记 （Unst.Protein Marker, 购自 Themo Scientific)； 2泳道：诱导之前未表达重组 LhFVE蛋白的菌体总蛋白； 3泳道：诱导表达重组 LhF W蛋白后的菌体总蛋白， 箭头指示为表达出的重组 LhFVE蛋白。
图 11是实施例 5中重组质粒 pET19blhfIX在大肠杆菌中诱导表达重组 LhFlX蛋白的
SDS-PAGE分析图， 其中， 1泳道： 蛋白质分子量标记 （Unst.Protein Marker, 购自 Themo Scientific)； 2泳道：诱导之前未表达重组 LhF IX蛋白的菌体总蛋白； 3泳道：诱导表达重组 LhF IX蛋白后的菌体总蛋白， 箭头指示为表达出的重组 LhFlX蛋白。
图 12是实施例 5中重组质粒 pET19blhf X在大肠杆菌中诱导表达重组 LhF X蛋白的
SDS-PAGE分析图， 其中， 1泳道： 蛋白质分子量标记 （Unst.Protein Marker, 购自 Themo Scientific)； 2泳道：诱导之前未表达重组 LhF X蛋白的菌体总蛋白； 3泳道：诱导表达重组 LhF X蛋白后的菌体总蛋白， 箭头指示为表达出的重组 LhF X蛋白。 说明书
图 13是实施例 5中诱导表达的重组 LhFW蛋白的 western-blot鉴定分析图。
图 14是实施例 5中诱导表达的重组 LhFK蛋白的 western-blot鉴定分析图。
图 15是实施例 5中诱导表达的重组 LhFX蛋白的 western-blot鉴定分析图。
图 16是实施例 6中经亲合层析法纯化的重组 LhFW蛋白的 SDS-PAGE鉴定分析图，其中， 1 泳道： 蛋白质分子量标记（Unst.Protein Marker, 购自 Themo Scientific) ； 2泳道： 纯化后重组
LhFVE蛋白。
图 17是实施例 6中经亲合层析法纯化的重组 LhFK蛋白的 SDS-PAGE鉴定分析图，其中， 1 泳道： 蛋白质分子量标记（Unst.Protein Marker, 购自 Themo Scientific) ； 2泳道： 纯化后重组 LhFlX蛋白。
图 18是实施例 6中经亲合层析法纯化的重组 LhFX蛋白的 SDS-PAGE鉴定分析图， 其中， 1 泳道： 蛋白质分子量标记（Unst.Protein Marker, 购自 Themo Scientific) ； 2泳道： 纯化后重组 LhFX蛋白。
图 19是实施例 7所述真核重组质粒 pCDNA3.1-LhFVE的示意图， 其中， 逆时针序列为正向 基因片段， 顺时针为反向基因片段。
图 20是实施例 7所述真核重组质粒 pcDNA3.1-LhFlX的示意图， 其中， 逆时针序列为正向 基因片段， 顺时针为反向基因片段。
图 21是实施例 7所述真核重组质粒 pcDNA3.1 -LhFX的示意图， 其中， 逆时针序列为正向 基因片段， 顺时针为反向基因片段。
图 22是实施例 10所述重组 LhFVH蛋白对大肠杆菌 DH5a作用的生长曲线， 其中， ^«C«s i: 未添加蛋白的对照组； 》 ：15雜¾ : 添加 12.5 g/mL重组 LhFVE蛋白的实验 组； ™«S g«： 添加 25 g/mL重组 LhFVII蛋白的实验组； ： 添加 50 g/mL 重组 LhFVE蛋白的实验组。
图 23是实施例 10所述重组 LhF IX蛋白对大肠杆菌 DH5CX作用的生长曲线， 其中， -^- mt i. 未添加蛋白的对照组; 添加 12.5 g/mL重组 LhFlX蛋白的实验 组； ~Η^ ¾ 添加 25 g/mL重组 LhFlX蛋白的实验组； 添加 50 g/mL 重组 LhFlX蛋白的实验组。
图 24是实施例 10所述重组 LhF X蛋白对大肠杆菌 DH5a作用的生长曲线， 其中， : 未添加蛋白的对照组; →-n.$m^: 添加 12.5 g/mL重组 LhFX蛋白的实验 组； 添加 25 g/mL重组 LhFX蛋白的实验组； 添加 50 g/mL 重组 LhFX蛋白的实验组。
图 25是实施例 11所述重组 LhFW蛋白提高感染致死剂量绿脓杆菌小鼠存活率的曲线， 其 中， KConto : 未注射药物的感染小鼠； 義麥清廳： 注射美罗培南的感染小鼠； 盘摄西棘： 注射盘尼西林的感染小鼠； - 'ω?ν : 注射重组 LhFvn蛋白的感染小鼠。 图 26是实施例 11所述重组 LhFlX蛋白提高感染致死剂量绿脓杆菌小鼠存活率的曲线， 其 中， G ttrol: 未注射药物的感染小鼠； 棘注射盘尼西林的感染小鼠； 说明书
蕖穸鏺南： 注射美罗培南的感染小鼠； 注射重组 LhF IX蛋白的感染小鼠。 图 27是实施例 11所述重组 LhF X蛋白提高感染致死剂量绿脓杆菌小鼠存活率的曲线， 其 中， C<S! tmt : 未注射药物的感染小鼠； 盘愿街鉢： 注射盘尼西林的感染小鼠
-X-翁罗镲南： 注射美罗培南的感染小鼠； 注射重组 LhF X蛋白的感染小鼠。
图 28是实施例 12所述重组 LhFW蛋白水解 LPS的质谱检测图谱， 其中上层图谱为 LhFVE蛋 白质谱图； 中层为未处理的 LPS质谱图； 下层为 LhFW蛋白处理 LPS后的质谱图。
图 29是实施例 13所述重组 LhFW蛋白水解 LPS的银染检测图谱， 其中 1泳道： 蛋白预染 marker; 2泳道： 重组 LhFVE蛋白； 3泳道： 未经处理的 . K12 LPS; 4泳道： LhFW处理后 的 £. co/z' K12 LPS。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。 下属实施例中， 凡未注明具体实验条件的， 均 为按照本领域技术人员熟知的常规条件， 例如 Sambrook等著的分子克隆： 实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)， 实验动物常规手册 (；国家实验动物规范中 心, 2004年 11月 基本技术指南第五版 （John Wiley& Sons, Inc， 2005 ) 中所述的条件及实 验步骤， 或按照制造厂商所建议的条件及实验步骤。
实施例 1: 获取重组 LhFW蛋白编码的基因
1、 合成如下所示 PCR扩增引物 （由英俊生物技术有限公司合成）：
引物 1 :
Nco l
引物 2:
5 ' -TATCTCGAGTTA TCGGCCTTGGGGTTTGCTGGC ΑΓΤ-3 '
Xho l
2、 PCR扩增体系
以含有人凝血因子 W CDS区的质粒（广州复能基因有限公司）为模板， 用引物 1和引物 2 进行 PCR扩增。 弓 I物 1序列中引入 Nco I酶切位点以及 Hisx6蛋白纯化标签， 弓 |物 2序列中入 Xho I酶切位点。 扩增后得到长 497bp、 含有人凝血因子 W轻链编码序列的 DNA片段。 PCR反应体 系 （50 μί) 如下：
去离子水： 31.5
5 X反应 buffer: 10 μΐ,
dNTP Mix: 4 xL
引物 1 ( lO mM) ： 1 μL
引物 2 ( lO mM) ： 1
含人凝血因子 W CDS区质粒 （100 ng/(iL) ： 2 ( L
PrimeStar DNA聚合酶： 0.5 说明书
3、 PCR扩增反应条件
参照 PrimeStar DNA聚合酶 （购自 Takara公司） 的说明书设置 PCR扩增反应条件： 98 °C预变性 2 min， 98°C变性 10 sec、 55 °C复性 15 sec、 72 °C延伸 50 sec, 30个循环后 72°C延伸 4 min。
4、扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳分析（见图 1 )， 并按胶回收试剂盒（购自 Omega公司） 的说明回收片段。
实施例 2: 获取重组 LhFlX蛋白的编码基因
1、 合成如下所示 PCR扩增引物 （由英俊生物技术有限公司合成）：
引物 1 :
Nco l
引物 2:
5'- ATTCTCGAGTTAACGGGTGAGCTTAGAAGTTTGT - 3 '
Xho l
2、 PCR扩增体系
以含有人凝血因子 IX CDS区的质粒（广州复能基因有限公司）为模板， 用引物 1和引物 2 进行 PCR扩增。 弓 I物 1序列中引入 Nco I酶切位点以及 Hisx6蛋白纯化标签， 引物 2序列中引入 Xho l酶切位点。 扩增后得到长 476bp、 含有人凝血因子 IX轻链编码序列的 DNA片段。 PCR反 应体系 （50 μυ 如下：
去离子水： 31.5
5χ反应 buffer: 10
dNTP Mix: 4
引物 1 ( lO mM) ： 1
引物 2 ( lO mM) ： 1
含人凝血因子 IX CDS区的质粒 （lOO ng L) ： 2 \iL
PrimeStar DNA聚合酶： 0.5
3、 PCR扩增反应条件
参照 PrimeStar DNA聚合酶的说明书设置 PCR扩增反应条件： 98 °C预变性 2 min, 98 °C 变性 10 sec、 55 °C复性 15 sec、 72°C延伸 50 sec, 30个循环后 72°C延伸 4 min。
4、扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳分析（见图 2)， 并按胶回收试剂盒（购自 Omega公司） 的说明回收片段。
实施例 3: 获取重组 LhF X蛋白的编码基因
1、 合成如下所示 PCR扩增引物， （由英俊生物技术有限公司合成）：
引物 1 : 说明书
Ncol
引物 2:
5 ' - ATTCTCGAGTTAGCGTTCC AGGGTCTGTTTCC- 3 '
Xhol
2、 PCR扩增体系
以含有人凝血因子 X CDS区的质粒（广州复能基因有限公司）为模板， 用引物 1和引物 2 进行 PCR扩增。 弓 I物 1序列中引入 Nco I酶切位点以及 Hisx6蛋白纯化标签， 引物 2序列中引入 Xhol酶切位点。 扩增后得到长 458bp、 含有人凝血因子 X轻链编码序列的 DNA片段。 PCR反 应体系 （50 μί) 如下:
去离子水： 31.5 μL
5 X反应 buffer: 10
dNTP Mix: 4
引物 1 (10mM) ： 1 L
引物 2 (lOmM) ： 1 L
含人凝血因子 X CDS区的质粒 （100ng/yL) ： 2 μL
PrimeStarDNA聚合酶： 0.5 μL
3、 PCR扩增反应条件
参照 PrimeStarDNA聚合酶说明书设置 PCR扩增反应条件： 98°C预变性 2min， 98°C变 性 10 sec、 55°C复性 15 sec、 72°C延伸 50 sec, 30个循环后 72°C延伸 4 min。
4、扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳分析（见图 3)， 并按胶回收试剂盒（购自 Omega公司） 的说明回收片段。
实施例 4: 表达重组 LhFW、 LhFlX、 LhFX蛋白的原核重组质粒的构建
1、 基因片段与原核表达载体的预处理
用限制性内切酶 Nco/及 (均购自 TaKaRaFermentas公司） 分别双酶切实施例 1克 隆的 LhFVD基因片段、 实施例 2克隆的 LhFlX基因片段、 实施例 3克隆的 LhFX基因片段以 及原核表达载体 pET19b (Novagen公司产品）， 37°C过夜， 反应体系如下：
试 齐 U LhFVE ,γ^) LhFlXi^L) LhFX (μ^ pET19b (μΐθ
DNA 20 20 20 20
Ncol 1 1 1 1
Xhol 1 1 1 1
10x缓冲液 6 6 6 6
双蒸水 2 2 2 2
总体积 30 30 30 30
双酶切结束后， 反应产物经 1%琼脂糖凝胶电泳， 在凝胶成像系统的紫外灯下， 按胶回收 试剂盒 （购自 Omega公司） 的说明回收片段。 说明书
2、 LhF W, LhFlX、 L 基因与 pET19b原核表达载体的连接与转化
( 1 )将上述步骤中所获得的 LhF W、 LhFlX、 L/LF«因片段及原核载体片段粗略定量 后， 按基因片段与原核载体的分子数比为 3:1的连接反应原则进行连接实验， 反应体系如下:
体积 （μ
pET19b DNA 1.5
LhF V LhFlX L LhF X DNA 7
T4连接酶 0.5
10 x 缓冲液试 1
总体积 10
剂
(2)整个反应过程在 T4 DNA连接酶 （购自 Fermentas公司） 作用下在 16°C反应过夜。 使上述扩增的 3种基因片段分别插入到 pET19b原核表达载体中， 所构建的原核重组质粒结 构图见图 4-图 6。
(3 )将连接产物分别转化大肠杆菌 ToplO (购自 Invitrogen公司） 的感受态细胞 （按 《分子克隆操作指南》 自制）。 连接产物的转化方法主要歩骤如下：
1)取连接产物 5 μL加入大肠杆菌 ToplO的感受态细胞 100 μL置于 1.5 mL Ep管中， 阴 性对照为大肠杆菌 ToplO的感受态细胞 100 置于 1.5 mL Ep管中；
2)置于冰上 30 min;
3) 42Ό循环金属浴 90s;
4)快速将管转至冰浴中， 冷却 2 min;
5)加 900 μL SOC培养基（蛋白胨 10 g，酵母浸出物 5 g， NaCl 0.5 g， KC1 0.186 g， MgCl2 0.95 g， 用 ddH20溶解后定容于 980 ml， 高压灭菌， 待冷却至室温后加入无菌 20%葡萄糖 20 mL), 置于冰上；
6) 37°C， 180 rpm振摇培养 1 h;
7)将菌液 4000 g离心 3 min, 留 200 上清， 倒去多余培养基后， 用余下的 200 μ 重悬细菌；
8)将重悬的转化细菌均匀涂布于含 0.1 g/mL氨苄青霉素的固体 LB培养基上， 置 37°C 恒温培养箱培养过夜。
3、 重组质粒的鉴定
挑取上述转化的大肠杆菌 Top单克隆小量培养后用质粒提取试剂盒（购自 OMEGA)提取 质粒， 进行 Nco l/Xho l双酶切鉴定。 双酶切产物经凝胶电泳鉴定后， 3种重组质粒的限制性内 切酶酶切片段电泳鉴定图如图 7-图 9所示。 酶切产物所形成的两条带， 与预期产物大小相符， 说明质粒构建成功。
将双酶切鉴定无误的质粒送北京华大基因研究中心对插入的融合基因片段进行测序， 最 后将测序结果正确的含 LhFVE基因的原核重组质粒命名为 pET19blhfW， 含 LhFlX基因的原核 重组质粒命名为 pET19blhflX， 含 LhF X基因的原核重组质粒命名为 pET19blhfX。 说明书
实施例 5: 原核重组质粒在大肠杆菌中的表达
1、 将实施例 4构建的重组质粒 pET19blhfVn、 pET19blhfIX、 pET19blhfX分别转化大肠杆 菌 BL21(DE3) (购自 Invitrogen) ， 挑取单克隆于含 0.1 g/mL氨苄青霉素的 LB培养基中， 37°C 185 rpm振荡培养至 OD6TO 0.6， 取 1 mL菌液冻于 -20°C。 然后在剩余的菌液中加入终浓度 0.8 mM的 IPTG (异丙基 -β-D-硫代半乳糖苷） 继续培养 6 h， 取 1 mL菌液冻于 -20°C。
2、 将上述 IPTG诱导前、 诱导后的样品在 5%的浓缩胶和 12%的分离胶中进行 SDS-PAGE 电泳检测， 分析目的蛋白的表达情况， 3种重组质粒在大肠杆菌中诱导表达重组蛋白的 SDS-PAGE分析图分别见图 10-图 12。 结果显示蛋白正常表达。
3、对目的蛋白进行 Western-blot鉴定。将凝胶上的蛋白质电转移到硝酸纤维素滤膜（GE) 上， 电转移后的膜用封闭液 （约 5%的 PBST脱脂奶粉） 室温摇床震摇封闭处理 2 h; 再分别加 入小鼠抗 FVE、 小鼠抗 FIX、 小鼠抗 F X单克隆抗体（Santa公司产品）反应液， 4°C过夜； 充分 洗涤后再加入酶标二抗（羊抗鼠 IgG) ， 室温摇床震摇作用 2 h; 充分洗涤后加 ECL ( Thermo) 反应液反应 5 min后， 胶片曝光显色， 诱导表达的 3种重组蛋白的 western-blot鉴定分析图分别 如见图 13-图 15所示。
结果显示 IPTG诱导后融合蛋白有明显表达， 将表达 LhF VE的菌株命名为 LhF VH -pET19bBL21-(DE3), 表达 LhFlX的菌株命名为 LhFlX-pET19bBL21-(DE3)， 表达 LhF X的菌株 命名为 LhF X -pET 19bBL21 -(DE3)。
实施例 6: 重组 LhFVE、 LhF IX、 LhF X蛋白的亲和层析纯化
1、 按照实施例 5中的方法大规模培养 LhF W -PET19bBL21-(DE3)、 LhF IX -pET19bBL21-(DE3)、 LhF X -pET19bBL21-(DE3)细菌， 并添加 IPTG诱导， 于 18 °C、 175 rpm 震荡培养过夜。
2、将上述菌液 4000 g离心 3 min收集菌体。用 EW buffer ( 20 mM磷酸钠， 500 mM NaCl, ImM DTT, O. lmM PMSF, pH7.4 ) 重悬洗涤菌体沉淀。 4000 χ g离心 3 min， 弃上清。 再用 10 mL EW buffer重悬菌体。
3、超声波破碎菌体（功率： 300 W;超声时间： 10 s; 间隔时间： 10 s;总超声时间： 3 min; 冰浴中进行） 。 超声结束后， 将菌液于 4。C， 48400 X g离心 30 mm， 收集上清， 置于冰上。
3、 按 Co2+纯化系统（Talon Metal Affinity Resin, Clontech公司产品）说明书预装层析柱， 并上样。 10ml EW洗涤柱子两次， 并用 10 mM咪唑溶液清洗杂蛋白。 最后以 100 mM咪唑洗脱 蛋白， 经亲合层析法纯化的 3种重组蛋白的 SDS-PAGE鉴定分析图分别见图 16-图 18。
4、将含有目的蛋白的洗脱液用 Tris-Cl缓冲液（pH 7.4 )进行超滤， 置换 buffer并浓缩。 超 滤后可得高浓度重组蛋白——重组 LhFW、 LhF IX、 LhF X蛋白。 蛋白定量显示， 每升表达菌 液可得纯度在 90%以上的目的蛋白约 15 mg。
实施例 7: 表达重组 LhFW、 LhF IX、 LhF X蛋白的真核重组质粒的构建
1、 合成如下所示 PCR扩增引物， （由英俊生物技术有限公司合成） ：
弓 I物 1 : TAAGGATCCTGCAGAGATTTCATCATGGTCTCCCA 说明书
BamH I cozak
引物 2 : TATCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGTCGGCCTTGG
Xho I 6xHis
引物 3 : TAAGGATCCTGCAGAGATTTCATCATGCAGCGCGTGAAC
BamH I cozak
引物 4 : TATCTCGAGTTAATGATGA GATGATGATGACGGGTGAGCT
Xho I 6xHis
弓 I物 5 : TAAGGATCCTGCAGAGATTTCATCATGGGGCGCCCA
BamH I cozak
引物 6 : TATCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGGCGTTCCA
Xho I 6xHis
2、 PCR扩增体系
以含有人凝血因子 W CDS区的质粒（广州复能基因有限公司）为模板， 用引物 1和引物 2 进行 PCR扩增。 引物 1序列中引入 BamH I酶切位点、 cozak序列， 引物 2序列中引入 Xho I酶切 位点以及 His蛋白纯化标签。 以含有人凝血因子 IX CDS区的质粒 （广州复能基因有限公司） 为模板， 用引物 3和引物 4进行 PCR扩增。 引物 3序列中引入 BamH I酶切位点、 cozak序列以及 信号肽， 引物 4序列中引入 Xho I酶切位点以及 His蛋白纯化标签。 以含有人凝血因子 X CDS 区的质粒（广州复能基因有限公司）为模板， 用引物 5和引物 6进行 PCR扩增。 引物 5序列中引 入 BamH I酶切位点、 cozak序列以及信号肽， 弓 |物 6序列中引入 Xho I酶切位点以及 His蛋白纯 化标签。
PCR反应参照实施例 1进行。
3、 真核表达重组 LhFVH、 LhFlX、 LhF X蛋白的重组质粒的构建
用限制性内切酶 BamH xho I (均购自 TaKaRaFermentas公司） 分别双酶切实施例 Ί 克隆的 LhFVE、 LhFlX、 LhF X基因片段以及真核表达载体 pcDNA3.1 ( + ) (Novagen公司产 品）， 反应体系参照实施例 4。 基因与真核表达载体的连接与转化以及重组质粒的鉴定步骤参 照实施例 4。
最后将测序结果正确的含 LhFVH基因的重组质粒命名为 pcDNA3.1-LhFW， 含 LhFlX基因 的重组质粒命名为 pcDNA3.1-LhFlX， 含 LhF X基因的重组质粒命名为 pcDNA3.1-LhF X。质粒 图谱见图 19-图 21。
实施例 8: 表达重组 LhFVE、 LhFlX , LhF X蛋白的稳定细胞系的构建
1、 细胞准备
将 DG44细胞（购自 ATCC )培养于添加了 10% FBS (胎牛血清，购自 Hiclony)的 α-ΜΕΜ
(含 L-谷氨酰胺， 核糖核酸及脱氧核糖核酸） 完全培养基 （购自 Hiclony) 中。 转染前一天 在六孔板中接种 DG44细胞 4χ 105个 /mL， 每孔 2mL。
2、 细胞转染 说明书
采用脂质体法转染细胞， 方法按照 Lipofectamine™2000试剂 （购自 Invitrogen)说明书 进行。 具体步骤如下-
1 ) 细胞培养基换成无血清 α-ΜΕΜ培养基， 2mL/孔。
2) 将真核重组质粒 pcDNA3.1-LhFW、 PcDNA3.1-LhFlX pcDNA3.1-LhF X分别 （总量 为 4.0 g) 与 250 μL Opti-MEM混合， 同时将 10 lipo2000 与 250 Opti-MEM混合， 静 置 5 min。
3 ) 将 2种溶液充分混合， 静置 20 min, 将脂质体复合物加入细胞孔中， 轻轻混匀， 放 入 37 °C培养箱培养。
4) 5h后， 将培养基更换为添加了 10% FBS 的 α- ΜΕΜ完全培养基；
3、 阳性细胞克隆筛选及扩大
重组质粒转染 24 h后， 细胞以 1： 2000比例转入 100 mm培养皿中培养， 加入终浓度为 800 g/mL的 G418 (购自 Gibco)筛选， 以转染空载体和未转染组作对照。 15天后挑取单克 隆转入 24孔板培养， 待细胞长满后依次转入 6孔板， 100 mm培养皿扩大培养,待细胞融合度 达 90%时 1： 4冻存于含 10% DMSO (购自 Gibco ) 的 FBS中。
4、 阳性细胞克隆鉴定
对挑取的阳性细胞克隆进行基因组 PCR和 RT-PCR技术检测，均可扩增出目的片段，说明融 合基因己整合在细胞基因组并有功能性 mRNA转录， 将获得的稳定细胞系分别命名为 DG44-LhFVE、 DG44-LhFlX、 DG44-LhF X。
实施例 9: 真核重组质粒所表达的重组 LhFVE、 LhFlX , LhF X蛋白的收集
1、 在添加有 400 g/mL G418的含 10%FBS 的 α-ΜΕΜ完全培养基中分别培养 DG44-LhF W、 DG44-LhFlX、 DG44-LhF X细胞并传代至 10板。
2、当每板细胞融合度均达 90%以上时将 10%FBS的 α-MDM完全培养基换为 CHO无血 清培养基， 并添加终浓度 l g/mL Vitamin-K ( Sigma)
3、 培养 3天后， 收集培养上清， 离心弃去细胞沉淀， 上清经 PEG20000 (Merck)浓缩 5 倍后， 采用钴离子亲和层析法进行纯化并通过 SDS-PAGE、 Western Blot进行鉴定， 步骤参照 实施例 6。
实施例 10: 重组 LhFVH、 LhFlX、 LhF X蛋白的抑菌活性检测
1、 以大肠杆菌 DH5ct为例， 将大肠杆菌 DH5CI在 LB固体培养基上画线培养后， 挑取典型 菌落接种于普通 LB液体培养基中， 37°C， 185 rpm振荡培养直至达到对数生长期（OD6QQ=0.5 )。 4000 X g离心 3 min， 弃上清， 用新鲜 LB培养基重悬菌体。
2、将上述菌液稀释后接种在 96孔板上， 每孔总体积为 100 L, 菌量约为 5 x 105 CFU/mL。
3、 分别将重组 LhFW、 LhFlX、 LhF X蛋白添加至上述孔中， 使最高浓度孔的蛋白终浓度 为 50 g/mL。 以此浓度为基础， 2倍梯度稀释， 直至蛋白形成浓度为 50、 25、 12.5 g/mL的浓 度梯度。 每个浓度梯度设 3个平行孔。 同时设无细菌空白孔以及无蛋白的细菌孔， 每组 3个平 行孔。 说明书
4、 将上述 96孔板置于 37°C， 175 rpm摇床振荡培养， 每 30min取样， 在紫外分光光度计下 检测 600nm波长处的吸光值， 做出抑菌曲线。 MIC判定： 培养 8 h后观察生长现象， 肉眼观察 或以紫外分光光度计在 600 nm波长下进行判定， 以无细菌生长的最小重组蛋白浓度为最小抑 制浓度 MIC。
重组 LhFVIL LhFlX、 LhF X蛋白对大肠杆菌 DH5a作用的生长曲线见图 22-图 24， 由图 22- 图 24可知， 重组 LhFVE、 LhFlX、 LhF X蛋白对 DH5a的生长具有明显的抑制作用， 重组 LhFVH、 LhFlX、 LhF X蛋白的 MIC均为 25 g/mL。
5、以与大肠杆菌 DH5ot相同的方法检测重组 LhFVIL LhF IX , LhF X蛋白对大肠杆菌 BL21、 绿脓杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、 阴沟肠杆菌、 嗜水气单胞菌、 异型枸橼酸杆菌、 卡他莫拉菌、 奇异变形杆菌、 普通变形杆菌、 粘质沙雷氏杆菌等革兰氏阴性菌的生长情况的影响， MIC如 下表：
MIC ^g/mL)
菌种
LhFW LhFlX LhF X
大肠杆菌 BL21 50 50 50
绿脓杆菌 25 25 25
肺炎克雷伯氏菌 25 25 25
阴沟肠杆菌 25 50 50
嗜水气单胞菌 25 25 25
异型枸橼酸杆菌 50 50 25
卡他莫拉菌 25 25 25
奇异变形杆菌 25 25 25
普通变形杆菌 50 50 25
粘质沙雷氏杆菌 25 50 25
结论： 从上述实验结果可知， 本发明所述重组 LhFVIL LhFlX、 LhF X蛋白对多种革兰氏 阴性菌均具有抑制作用。
实施例 11: 重组 LhFVH、 LhF IX. LhF X蛋白在动物体内的抑菌活性测定
1、 实验动物为 BAL B/C雄鼠 （体重约为 18-22g， 来源于四川大学） ， 分为 11组， 每组 8 只， 其中实验组为 3组， 其余为各种对照组。
2、 将绿脓杆菌 （来源于四川大学） 的菌液在 LB固体培养基上画线培养后， 挑取典型菌 落接种于普通 LB液体培养基中， 经过 37°C过夜振荡培养约 12 h后 4000 χ g离心 3 min, 弃上清， 生理盐水重悬菌体后待用。
3、将重组 LhFVH、 LhF IX、 LhF X蛋白按照无菌操作法，用生理盐水配制成浓度分别为 100 g/mL的样品， 冰上保存待用。
4、将青霉素、美罗培南分别用无菌生理盐水溶解， 按照 60 1¾成人表面积换算成8^ 8/。 雄鼠的临床等效用药剂量。 青霉素为 9.1 mg/只， 美罗培南为 1.5 mg/只。 说明书
5、 将致死剂量绿脓杆菌菌液按 500 μΙ只的剂量腹腔注射各实验组和三个对照组中的 BAL B/C雄鼠。
6、 三个实验组的 BALB/C雄鼠感染菌体 30min后， 第一实验组尾静脉给药重组 LhFVE蛋 白 （50μ§/只） 、 第二实验组尾静脉给药重组 LhFlX蛋白 (100μ§/只；)、 第三实验组尾静脉给药 重组 LhFX蛋白 （100 μ§/只)； 三个对照组的 BALB/C雄鼠感染菌体 30min后， 其中第一、第二 对照组分别尾静脉给药青霉素 （9.1 mg/只） 、 美罗培南 （1.5 mg/只） ， 第三对照组不给药。 余下的第四、 第五、 第六、 第七、 第八对照组不注射绿脓杆菌菌液， 只分别注射与第一、 第 二、 第三实验组等剂量的重组 LhFW、 LhFlX、 LhFX蛋白， 与第一、 第二对照组等剂量的青 霉素、 美罗培南。
7、 给药 72 h后， 对各实验组和对照组的 BALB/C雄鼠进行二次给药， 给药类型和剂量与 第一次给药相同。
8、 BALB/C雄鼠给药后每 24h观察一次， 记录存活情况， 第 15天处死所有动物。
存活率 =存活小鼠 /8x 100%
实验结果： 本发明所述重组 LhFVE、 LhFlX、 LhFX蛋白可以使受到致死剂量绿脓杆菌感 染的小鼠在 14天保持 100%的存活。 第二对照组（美罗培南组） 小鼠在 14后存活率为 100%, 而第一对照组（青霉素组）小鼠全部死亡， 感染致死剂量绿脓杆菌小鼠存活率的情况如图 25- 图 27所示。 第四、 第五、 第六、 第七、 第八的小鼠全部存活。
实验结果表明， 本发明所述重组 LhFVE、 LhFlX、 LhFX蛋白在动物体内对革兰氏阴性菌 具有抑菌活性， 且毒性小， 不会导致动物死亡。
实施例 12: 质谱检测重组 LhFW、 LhFlX, LhFX蛋白对内毒素 （LPS) 的破坏作用
1、 用实施例 6获得的重组 LhFVH、 LhFlX、 LhFX蛋白处理 1 mg/mL的 coZi K12 LPS (Sigma) ， 体系设置为：
实验组： 0.5 g LLhFVn或 LhFlX或 LhFX 120
1 mg/mL LPS 250(iL
生理盐水 30 (iL
对照组 1: 0.5 g^iLLhFVn或 LhFlX或 LhFX 120
生理盐水 280 ^iL
对照组 2: TBS 120 μL
1 mg/mL LPS 250 L
生理盐水 30 (iL
2、 按照上述体系将其放在 37Ό 150 rpm条件下孵育过夜。 孵育结束后， 最大转速 17000 g 离心 5分钟。 离心结束后。 收集上清。
3、 将上清用 100D的透析袋透析 16小时， 透析 buffer为去离子水， 透析结束以后用质谱 MALDI-TOF分析处理后的样品；
4、 首先取 1 的溶于 33%乙醇中的 10 mg/mL的 2， 5-二羟基本甲酸 （DHB) 与 1 的样 说明书
品混匀；
5 将混合的了 DHB的样品点在不锈钢 MTP 384靶板上 （Bruker Daltonics) ， 接着通过热 气将靶板上的样品烘干；
6烘干后， 用 Autoflex TOF/TOF lI仪器 （Bruker) 氮气 377 nm激光束， 正离子模式条件 下分析，通过 FlexC0ntr01 2.2软件控制操作，整个质谱图通过使用反射器模式，加速电压 19 kV， 反射器电压 20 kV， 在阳离子模式下脉冲激发 140 ns， 扫描范围从质荷比 600到 7000，数据收集 时间平均为 500激光脉冲，其最低的激光能量必需能够获得足够的信噪比，质谱中产生的各峰 是通过使用 Bruker Flex分析软件 （Version 3.0 ) 获得；
7、 后源衰变（PSD )质谱使用 Bruker Daltonics LIFT系统记录， 在 18.96 kV先驱离子加速 电压和碎片加速 （LIFT电压 4.37 kV) 。 反射器电压 1和 2分别设置为 23.49 kV和 9.69 kV; 实验图谱以 LhFW为例， 结果见图 28。 未经处理的 LPS (中） 存在明显的 m/z 2318.4峰， 而 LhFVH处理 LPS后（下）， 质谱峰缺失 m/z 2318.4， 说明 LPS被轻链蛋白水解。 因此本发明所 述 LhFVH、 LhFlX , LhF X具有水解 LPS的作用， 可用于治疗内毒素血症。
实施例 13: 银染检测重组 LhFW、 LhFlX、 LhF X蛋白水解的 coZ K12 LPS
1、用实施例 6获得的 LhFW、 LhFlX、 LhF X分别处理 LPS样品， 对照组为 TBS缓冲液作用 LPS样品， 孵育过夜， 然后离心收集沉淀；
2、 用 LPS l x loading buffer ( 0.05 M的 Tris-HCl， 含 10 g/L SDS， 100 g/L蔗糖， 0.5% β-巯 基乙醇， lO mg/L溴酚蓝， pH 6.8 )与处理后处理后的沉淀样品混合， 100°C金属浴上孵育 5 min;
3、 15%分离胶（含 4 mol/L尿素， 1.0mm厚 Bio-Rad具体配置如下：去离子水 1.15 mL， 30% 丙烯酰胺 2.5 mL, 1.5 mol/L Tris-HCl (PH8.8, 含 10%SDS ) 1.3 mL, 10%过硫酸铵 50 μί， TEMED 4 μί) 混匀， 制胶， 水封压平分离胶；
4、 5%浓缩胶配制:去离子水 1.42 mL, 30%丙烯酰胺 0.33 mL, 1 mol L Tris-HCl (PH6.8, 含 10%SDS ) 0.25 mL, 10%过硫酸铵 20 L， TEMED 2 μί)混匀， 灌胶， 迅速插上 10孔梳子；
5、 待胶制好后， 点样， 然后以 120V的电压跑胶分离； 跑胶结束后， 开始银染， 将胶剥 下来到一个用去离子水洗净的盒子中,然后用去离子水将胶洗涤 3次；
6、 洗涤结束后， 用 50 mL固定液 （30%乙醇、 10%冰乙酸、 7 g L高碘酸） 于室温固定氧 化 25 min。 固定结束后， 用去离子水洗涤凝胶 3次， 5 min/次；
7、 洗涤结束后， 于室温下， 用 lOO mL 1 g/L的 AgN03染色 40 min。 染色结束， 用 dd¾0 涮洗一次；
8、 用 50 mL在冰上预冷的 30 g L Na2CO3， 当在显色时加入 0.02%甲醛， 显色， 当出现条 带时或条带开始变黑时加入 6 mL的冰乙酸终止反应； 待终止反应结束后， 去掉终止液， 用去 离子水保存凝胶。
银染图谱以 LhFW为例， 如图 29。 经过 LhFVH处理后， LPS条带明显减少并变弱， 说明轻 链蛋白清除了大部分 LPS。 因此本发明所述 LhFVE、 LhFlX、 LhF X具有水解 LPS的作用， 可用 于治疗内毒素血症。

Claims

权利要求书
1、 人凝血因子轻链基因所编码的蛋白， 其氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 1所述， 或与 SEQ ID NO: 1所述氨基酸序列具有 50%以上的同源性的蛋白。
2、根据权利要求 1所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白， 其特征在于与序列表中 SEQ ID NO: 1所述的氨基酸序列具有 50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 2或 SEQ ID NO: 3所述。
3、 人凝血因子轻链基因所编码的蛋白， 其氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 2所述， 或与 SEQ ID NO: 2所述氨基酸序列具有 50%以上的同源性的蛋白。
4、根据权利要求 3所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白， 其特征在于与序列表中 SEQ ID NO: 2所述的氨基酸序列具有 50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 3所述。
5、 人凝血因子轻链基因所编码的蛋白， 其氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 3所述， 或与 SEQ ID NO: 3所述氨基酸序列具有 50%以上的同源性的蛋白。
6、根据权利要求 5所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白， 其特征在于与序列表中 SEQ ID NO: 3所述的氨基酸序列具有 50%以上同源性的蛋白的氨基酸序列为序列表中 SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO: 2所述。
7、根据权利要求 1至 6中任一权利要求所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白， 其特征 在于由原核重组质粒表达而成， 或真核重组质粒表达而成， 或通过化学合成制备。
8、权利要求 1至 7所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白在治疗革兰氏阴性菌感染的药 物中的应用。
9、权利要求 1至 7所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白在治疗革兰氏阴性菌所致的内 毒素血症的药物中的应用。
10、 权利要求 1至 7所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白在制备治疗革兰氏阴性菌感 染的药物中的应用。
11、 权利要求 1至 7所述人凝血因子轻链基因所编码的蛋白在制备治疗革兰氏阴性菌所 致的内毒素血症的药物中的应用。
12、 一种药物组合物， 其特征在于， 包括如权利要求 1-7所述的人凝血因子轻链基因所 编码的蛋白。
13、 一种治疗革兰氏阴性菌感染的药物， 其特征在于， 包括如权利要求 1-7所述的人凝 血因子轻链基因所编码的蛋白。
14、 一种治疗革兰氏阴性菌所致的内毒素血症的药物， 其特征在于， 包括如权利要求 1-7
权利要求书 所述的人凝血因子轻链基因所编码的蛋白。
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