WO2014181854A1 - Ｈｌａ遺伝子のマルチプレックスｄｎａタイピング方法及びキット - Google Patents

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WO2014181854A1
WO2014181854A1 PCT/JP2014/062433 JP2014062433W WO2014181854A1 WO 2014181854 A1 WO2014181854 A1 WO 2014181854A1 JP 2014062433 W JP2014062433 W JP 2014062433W WO 2014181854 A1 WO2014181854 A1 WO 2014181854A1
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hla
gene
pcr
seq
primer set
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隆 椎名
進悟 鈴木
有紀 和田
滋樹 光永
猪子　英俊
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ジェノダイブファーマ株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the present invention relates to an ultra-high resolution multiplex DNA typing method for HLA genes using a high-throughput DNA sequencer.
  • HLA Human leukocyte antigen
  • MHC major histocompatibility complex
  • HLA class I antigen is composed of ⁇ -chain showing high polymorphism and ⁇ 2-microglobulin with little polymorphism
  • HLA class II antigen is ⁇ -chain with high polymorphism and ⁇ -chain with little polymorphism. Consists of.
  • the ⁇ chain of class I antigen is encoded by HLA-A, HLA-B and HLA-C genes
  • the ⁇ chain of class II antigen is HLA-DRB1, HLA-DRB3 / 4/5, HLA-DQB1, HLA- DPB1 and ⁇ chain are encoded by HLA-DRA1, HLA-DQA1, and HLA-DPA1 genes.
  • exon 2 and exon 3 of the gene encoding the ⁇ chain show high polymorphism in the HLA class I antigen, and exon 2 of the gene encoding the ⁇ chain in the HLA class II antigen is advanced. Show polymorphism.
  • the gene region encoding HLA is located in human chromosome 6 short arm 6p21.3, class I region (HLA-A, HLA-B, HLA-C, etc.) from the telomere side toward the centromere side, Class III region, class II region (HLA-DRA, HLA-DRB1, HLA-DRB3 / 4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, etc.) Have been reported to be associated with blood transfusion, transplantation and various diseases. There is no HLA gene in the class III region, and genes such as complement components and tumor necrosis factor (TNF) are present.
  • TNF tumor necrosis factor
  • HLA-DRB gene region encoding the ⁇ chain of the HLA-DR antigen.
  • pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located in addition to HLA-DRB1 on the same haplotype.
  • HLA-DRB5 (DR51) gene and pseudogenes such as HLA-DRB6 and HLA-DRB9 are located in addition to HLA-DRB1 on the same haplotype.
  • DR3 DR5 and DR6 types
  • pseudogenes such as HLA-DRB3 (DR52) gene
  • HLA-DRB2 and HLA-DRB9 are located on the same haplotype.
  • DR7 and DR9 types in addition to HLA-DRB1, pseudogenes such as HLA-DRB4 (DR53) gene, HLA-DRB7, HLA-DRB8 and HLA-DRB9 are located on the same haplotype.
  • DR8 type no HLA-DRB genes other than HLA-DRB1 are located on the same haplotype (FIG. 1).
  • Each HLA gene exon has a plurality of polymorphic regions (polymorphic regions), and the base sequence (amino acid sequence) of a polymorphic region is common to a plurality of HLA alleles (HLA alleles)
  • each HLA allele is defined by a combination of multiple polymorphic regions.
  • exon 2 or exon 3 having the same base sequence may be common to a plurality of alleles as well as the polymorphic region in the exon.
  • HLA has a high degree of polymorphism, so it is known that HLA alleles are very many, and their notation is also determined. That is, the first zone for discriminating serological HLA type (2 digit level), the second zone for discriminating alleles with amino acid substitution within the same serological HLA type (4 digit level), and no amino acid mutation The third zone (6 digit level) that discriminates alleles in which base substitution is recognized, and the fourth zone (8 digit level) that discriminates alleles with base substitution outside the gene region encoding the HLA molecule (intron). (FIG. 2).
  • HLA type HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1
  • HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 HLA type of the applicant and donor
  • GVHD Graft Versus Host Disease
  • the conventional method is a DNA typing method using PCR centering on the exon region of each HLA gene, the base substitution in the intron region and the promoter region is missed, and as a result, the gene structure is expressed by other expression. There was a possibility of missing the detection of a null allele that is not different from the HLA gene but whose expression is suppressed.
  • Patent Document 1 since the PCR conditions for each HLA gene are not the same, PCR for each HLA gene must be carried out independently, leading to rapid and simple operations. It wasn't.
  • the present inventors proposed a method capable of high-precision typing without phase ambiguity by using a primer set that specifically anneals to the upstream region and downstream region of each locus of HLA ( Patent Document 2 and Non-Patent Document 2).
  • Patent Document 2 and Non-Patent Document 2 the PCR conditions used for each gene are not completely unified, and the multiplex method for simultaneously performing PCR at all loci has not been achieved.
  • a high-speed PCR apparatus that greatly shortens the time required for temperature rise and fall during PCR, which is expected to accelerate PCR, has not been studied.
  • the PCR conditions (annealing temperature) of each HLA gene including HLA-DRB3 / DRB4 / DRB5 for which a gene-specific primer has been newly designed are made the same, and each HLA gene is simultaneously placed in the same container based on the conditions.
  • the present inventors have conducted extensive research, and as a result, by redesigning the primers used for each HLA gene and selecting the DNA polymerase to be used, the same regardless of the type of HLA gene.
  • the present invention was completed by finding that PCR can be performed under conditions.
  • the present invention provides an HLA DNA typing method including the following steps. (1) Primers that specifically hybridize to the upstream region and downstream region of at least two genes selected from genes belonging to HLA class I and class II in the human genome base sequence and amplify under the same PCR conditions Preparing the set; (2) Amplifying the at least two genes in the test sample (DNA) simultaneously in the same container under the same PCR conditions using the primer set; (3) determining the base sequence of the PCR product; and (4) optionally performing a homology search with the database.
  • the present invention relates to HLA class I antigens HLA-A, HLA-B and HLA-C, HLA class II antigens HLA-DRB1, HLA-DRB3 / 4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA -For DPA1 and HLA-DPB1, newly designing PCR primers that can amplify their HLA genes specifically and at the same annealing temperature, selecting a DNA polymerase suitable for this DNA typing method, Set suitable PCR conditions that allow DNA typing of all HLA genes at once with one PCR device when using an enzyme, and HLA-A, HLA-B, HLA- based on the conditions C, to develop a multiplex PCR method for HLA-DRB1, Setting the time required for the extension reaction multiplex PCR method when using, by making full use of the high-throughput sequencing technology, an invention that solves the problems of the prior art.
  • the method of the present invention is the ultimate DNA typing method in which the phase ambiguity in which the positional relationship between cis and trans is unknown is not recognized because the entire base sequence necessary for DNA typing of the HLA gene from one molecule is obtained. For example, highly accurate HLA matching is realized between a transplant candidate and a donor candidate at the time of transplantation. Since the entire nucleotide sequence of the gene including peripheral regions such as the promoter region, exon region, and intron region of the HLA gene is determined, null alleles and novel alleles whose expression is suppressed can be detected.
  • a suitable PCR condition that enables DNA typing of a plurality of HLA genes from a plurality of at a time with one PCR apparatus is set, speeding up and simplification in operation are realized.
  • a multiplex PCR method of a plurality of HLA genes is provided, more accurate and rapid HLA typing of an HLA type between a transplant candidate and a donor candidate is realized.
  • region Supervised by Hidetoshi Isogo, Takehiko Suzuki, Takeo Kuro, "Transplantation and Blood Transfusion Laboratory", Kodansha Scientific, 2004, p. 48. It is a figure which shows the classification method of HLA allyl. Quoted from IMGT-HLA database (www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/).
  • A It is a figure which shows the relationship between HLA class I gene structure and molecular structure.
  • B It is a figure which shows the structure of the promoter area
  • FIG. 4 is an agarose gel electrophoresis image showing the amplification status of the HLA-DRB1 gene amplified in Test Example 1. It is a figure which shows the agarose gel electrophoresis image which shows the PCR condition of the HLA gene amplified in Example 1. It is a figure which shows the agarose gel electrophoresis image which shows the PCR condition of the HLA gene amplified in Example 2. It is a figure which shows the agarose gel electrophoresis image which shows the PCR condition of the HLA gene amplified in Example 3. It is a figure which shows the agarose gel electrophoresis image which shows the PCR condition of the HLA gene amplified in Example 4. FIG.
  • FIG. 6 is an agarose gel electrophoresis image showing the PCR status of HLA-A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1 genes amplified in Example 5.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring the length of PCR products of a multiplex PCR product of HLA-A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1 genes amplified in Example 5 using a bioanalyzer.
  • FIG. 4 is an agarose gel electrophoresis image showing the PCR status of HLA-A, HLA-B, HLA-C, and HLA-DRB1 genes amplified in Comparative Example 1.
  • Primer set preparation step In the DNA typing method of the present invention, first, upstream of each gene of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, and HLA-DPA1 in the human genome base sequence From the region, from the 5 ′ untranslated region of each gene of HLA-DRB1 and HLA-DPB1 to the untranslated region of exon 2 and exon 2 to 3 ′, and from exon 2 to 3 ′ of HLA-DRB3 / 4/5 A primer set for exhaustively PCR of the untranslated region is prepared, which can be annealed under the same conditions.
  • the genomic base sequence of human chromosome 6 (6p21.3) including the region where the HLA gene is present has already been elucidated, and the relationship between the gene structure and the structure of the expression product (HLA antigen) is also known (Fig. 3 and FIG. 5).
  • the genes of HLA-A, HLA-B and HLA-C that define the classic HLA class I antigen contain 8 exons (FIG. 3 (a)), and two types of exons are located outside exon 1. There are enhancer and promoter regions, and expression is regulated (FIG. 3 (b)). Furthermore, since it is known that there are many polymorphic regions in exons 2, 3 and 4, the conventional DNA typing method particularly performs PCR using primers prepared based on exons 2 and 3. As a result, the above-described problem has occurred (FIG. 4).
  • HLA-DR, HLA-DQ, and HLA-DP that define classical HLA class II antigens are composed of ⁇ chain and ⁇ chain, and each gene contains 5 or 6 exons (FIG. 5).
  • the promoter region is located outside exon 1 and expression is regulated (FIG. 5 (b)).
  • PCR using a primer prepared based on exon 2 is performed. The problem described above has occurred (FIG. 4).
  • HLA-A, HLA-B, HLA-C classical class I antigens
  • HLA-DRB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1 classical class I antigens
  • HLA-DRB3 / 4/5 exons 2 to 3 'untranslated regions Prepare a primer set that can be used, and use the amplified PCR product for high-throughput sequencing, which will be described later, thus eliminating uncertainty such as phase ambiguity and accurately detecting the presence or absence of null allyl. Can do.
  • primer sets corresponding to at least two genes among the PCR primer sets listed in Tables 1 to 3 below are prepared.
  • the at least two genes are at least two genes selected from HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DRB1, and HLA-DPB1.
  • 2 types, 3 types, 4 types, 5 types selected from HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DRB1, and HLA-DPB1 All 6 and 7 combinations, and all 8 gene combinations.
  • the primer set corresponding to each gene is described below.
  • SEQ ID NOs: 1 to 3 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-A gene, which is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-A gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NOs: 1 and 2 have base sequences corresponding to positions 29,909,483 to 29,909,514 in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 3 has a complementary nucleotide sequence to the nucleotide sequence corresponding to the 29,914,925th position to the 29,914,954th position in the human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 5,500 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 4 and 5 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-B gene, which is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-B gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 4 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 31,325,796th position to the 31,325,824th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 5 has a nucleotide sequence corresponding to the 31,321,210th position to the 31,321,235th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is about 4,600 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 6 to 8 in Table 1 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-C gene, which is an MHC class I ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-C gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NOs: 6 and 7 have a base sequence complementary to the base sequence corresponding to the 31st, 240th, 868th to the 31st, 240th, 896th positions in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 8 has a nucleotide sequence corresponding to the 31st, 236, 075th position to the 31st, 236, 114th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 4,800 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 9 and 10 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DR2 (DR15) and HLA-DR2 (DR16) subtypes of the HLA-DRB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 10 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,609th position to the 32,546,629th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 9 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,552,130th position to the 32,552,153th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 5,600 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 11 and 12 in Table 2 show the HLA-DRB1, HLA-DR5 (DR11), HLA-DR5 (DR12), HLA-DR6 (DR13), HLA-DR6 ( DR14), a PCR primer set that specifically amplifies the HLA-DR8 subtype.
  • These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 12 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,546,608th position to the 32,546,629th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 11 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,552,137th position to the 32,552,162th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 5,600 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 13 to 15 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DRB3 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB3 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: 6_cox_hap2).
  • SEQ ID NOs: 13 and 14 have a base sequence complementary to the base sequence corresponding to the 3rd, 939, 356th to 3,939, 379th positions in the human genome base sequence (reference sequence: 6_cox_hap2).
  • SEQ ID NO: 15 has a nucleotide sequence corresponding to the 3,934,187th position to the 3,934,207th position in a human genome sequence (Reference sequence: 6_cox_hap2).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 5,200 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 16 and 17 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DRB4 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB4 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: chr6_mann_hap4).
  • SEQ ID NO: 16 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 3,851,270th position to the 3,851,293th position in a human genome sequence (Reference sequence: chr6_mann_hap4).
  • SEQ ID NO: 17 has the 3rd, 846th, 108th to the 3rd, 846th, 128th base sequences in a human genome base sequence (reference sequence: chr6_mann_hap4).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 5,200 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 18 and 19 in Table 2 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DRB5 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DRB5 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 18 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,489,933th position to the 32,489,956th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 19 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,485,256th position to the 32,485,276th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of the PCR product obtained using these primer sets is approximately 4,700 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 20 and 21 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DQA1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DQA1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 20 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,604,465th position to the 32,604,488th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 21 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 32,611,936th position to the 32,611,960th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 7,500 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 22 to 26 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DQB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DQB1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 22 has a nucleotide sequence corresponding to the 32,627,406th position to the 32,627,433th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NOs: 23 and 25 have base sequences corresponding to positions 32,635,612 to 32,635,643 in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NOs: 24 and 26 have base sequences complementary to base sequences corresponding to the 32,635,612th position to the 32,635,640th position in a human genome sequence (reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 8,200 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 27 to 29 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPA1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the entire region of the HLA-DPA1 gene (including promoter, exon and intron) from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 27 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 33,041,573th position to the 33,041,600th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 28 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 33,041,573th position to the 33,041,598th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 29 has a nucleotide sequence corresponding to the 33,031,885th position to the 33,031,912th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 9,700 bases (bp).
  • SEQ ID NOs: 30 and 31 in Table 3 are PCR primer sets that specifically amplify the HLA-DPB1 gene, which is an MHC class II ⁇ chain. These primer sets are base sequences present at positions sandwiching the exon 2 to 3 'untranslated region of the HLA-DPB1 gene from the upstream side and the downstream side in the human genome base sequence (reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 30 has a nucleotide sequence corresponding to the 33,048,182nd position to the 33,048,207th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • SEQ ID NO: 31 has a complementary nucleotide sequence to a nucleotide sequence corresponding to the 33,055,428th position to the 33,055,453th position in a human genome sequence (Reference sequence: hg19).
  • the expected length of PCR products obtained using these primer sets is approximately 7,300 bases (bp).
  • primers can be prepared by techniques usually used in the art.
  • the primer sets described in Tables 1 to 3 show the most preferred examples.
  • Any set of (sense) side primer and antisense (anti-sense) side primer can be used in the same manner.
  • primers having a difference of 1 to several bases each have a different sequence number. Was granted. These one to several base differences are due to polymorphism.
  • the test sample (DNA) is subjected to PCR using the primer set prepared in step (1).
  • PCR is performed according to the usual protocol. Specifically, it is as follows. 1. DNA is extracted from the sample according to the form of the test sample. 2. The extracted DNA is quantified, and a primer solution is appropriately set to prepare a reaction solution. 3. Set the reaction conditions and perform PCR.
  • Thermal denaturation step usually 92-98 ° C
  • Annealing step usually 55-72 ° C
  • Elongation step (usually 65-80 ° C)
  • the temperature of the annealing and extension step is preferably about 65 to 70 ° C.
  • the temperature is set to 65 ° C to 68 ° C.
  • HLA allyl can be produced in equal proportions (uniformly). 4).
  • the obtained PCR product is purified and subjected to the next nucleotide sequencing step.
  • primer set newly set in the present invention By using a primer set newly set in the present invention, it has become possible to simultaneously amplify a plurality of different genes under the same conditions by reaction in one tube.
  • the enzyme (DNA polymerase) used by this invention is not specifically limited, For example, a commercial item can also be used. Examples include PrimeSTAR GXL DNA Polymerase, Tks Gflex DNA Polymerase manufactured by TaKaRA, TaKaRa LA Taq, Long PCR Enzyme Mix manufactured by Thermo SCIENTIFIC, and the like.
  • step (3) A base sequence determination step. Next, the base sequence of the PCR product (amplified DNA) generated in step (2) is determined. This step is preferably performed using a technique called a so-called high-throughput sequence (or an ultra-high-speed sequence or a massively parallel sequence). For the high-throughput sequence, see, for example, “Experimental Medicine” Vol. 27, No. 1, 2009 (Yodosha).
  • Described herein is a method for sequencing based on the Roche 454 GS system.
  • the base sequences can also be determined in the same way for Life Technologies' genome sequencer Ion Torrent PGM system and Illumina's MiSeq system.
  • the PCR product obtained in step (2) is fragmented to about 500 bases using a nebulizer.
  • a DNA adapter is added to the end of the fragmented DNA fragment.
  • the DNA fragment to which the DNA adapter is added is converted into a single-stranded DNA fragment, and then the beads are bound to the beads via the adapter.
  • the obtained beads are encapsulated in a water-in-oil emulsion (microbeads in which one DNA fragment is bound to one bead).
  • a reactor environment is formed).
  • Emulsion PCR is performed to form a copy of each DNA fragment on each bead (each DNA fragment is clonally amplified in each microreactor, thus amplifying multiple fragments without competition with other sequences) Can be implemented in parallel at the same time).
  • the emulsion is then broken to recover the beads with amplified DNA fragments. 5.
  • nucleic acids Four types of nucleic acids (A, C, G, T) are added in a certain order, a chemiluminescence pattern corresponding to the added nucleic acid is recorded, and a base sequence is determined by a combination of the signal intensity and position information.
  • the sff file is included in the test sample by comparing with the data of the known HLA allele nucleotide sequence database.
  • the fourth zone level HLA allele of DNA (8 digit level) is determined.
  • the method of the present invention uses the primer sets described in Tables 1 to 3 as representative examples. It is characterized in that primers are set at positions sandwiching the entire HLA class I and HLA class II gene regions, and the amplified DNA is sequenced over almost the entire region, whereby ambiguity (uncertainty) It is also possible to obtain information on null allyl.
  • PCR of a plurality of genes can be performed simultaneously with a single PCR device by newly setting a primer set so that the annealing temperature during PCR of each HLA gene is the same. Further, in the present invention, by setting the above new primer set, it has become possible to perform a multiplex PCR method in which a plurality of HLA genes are simultaneously amplified in one tube. Furthermore, it was confirmed that the primer set and enzyme combination used in the present invention can be applied to a high-speed PCR apparatus. Therefore, PCR can be performed more rapidly and with higher accuracy than before.
  • Example 1 [the purpose] As an enzyme, PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa) is used to confirm the amplification status of each HLA gene. [Method] Using PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa) and using the already extracted genomic DNA as a template, each gene-specific primer set of HLA class I and HLA class II (see Tables 1 to 3: SEQ ID NOs: 1 to 31) PCR was performed using The specific procedure is as follows.
  • Example 2 [the purpose] Using Tks Gflex DNA Polymerase (TaKaRa) as an enzyme, it aimed to confirm the amplification situation in each HLA gene. [Method] Using Tks Gflex DNA Polymerase (TaKaRa) and genomic DNA already extracted as a template, each gene-specific primer set of HLA class I and HLA class II (see Tables 1 to 3: SEQ ID NOs: 1 to 31) PCR was performed using The specific procedure is as follows.
  • Example 4 The reproducibility of PCR products using Tks Gflex DNA Polymerase (TaKaRa) and GeneAmp PCR System 9700 (Life Technologies) is confirmed, and the PCR conditions set in the present invention are suitable for ultrahigh resolution DNA typing of HLA genes. In order to confirm this, the nucleotide sequence of the PCR product was determined using a plurality of DNA samples. [Method] 1.
  • the base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows. (1) The PCR product was purified according to the standard protocol of QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). (2) The concentration was measured according to the standard protocol of PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen). (3) The purified PCR product was adjusted to a concentration of 500 ng / 100 ⁇ L, and a rapid library was prepared, emulsion PCR, and sequencing were performed according to the standard protocol of Genome Sequencer (GS) Junior (Roche). A base sequence of 10,000 reads was obtained. (4) A homology analysis was performed between all HLA allele data registered in the IMGT HLA database and all reads, and candidate HLA allele sequences were selected. (5) Using the candidate HLA allele sequence as a reference, GS Reference Mapper (Roche) is used to map the reference and the lead under the condition of 100% match, and the HLA allele is visually confirmed by checking the mapping status. Identified.
  • Exon 2 from the 5 ′ untranslated region of HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1 using 4 specimens containing allele combinations in which phase ambiguity is found in the conventional DNA typing method Exon 2 to 3 'untranslated region of HLA-DRB1, HLA-DRB3 / 4/5, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1 from 5' untranslated region of exon 2 and HLA-DPB1 PCR products derived from each gene from exon 2 to 3 ′ untranslated region were subjected to HLA typing using Genome Sequencer (GS) Junior (Roche).
  • HLA-A HLA-B
  • HLA-C HLA-DRB1
  • HLA-DRB3 HLA-DRB3 / 4/5
  • HLA-DQB1 HLA-DQA1, HLA-DPA1, and HLA-DPB1
  • novel alleles were detected in the HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, and HLA-DQB1 genes (Table 5). Therefore, this method enables 8-digit level HLA typing without phase ambiguity, and is excellent for efficiently detecting base substitutions, insertions and deletions in promoters and introns that cause null alleles. It was considered a tool.
  • Example 5 [the purpose] Using Tks Gflex DNA Polymerase (TaKaRa) and GeneAmp PCR System 9700 (Life Technologies), the possibility of the multiplex PCR method of HLA-A, HLA-B, HLA-C and HLA-DRB1 is verified. [Method] 1.
  • the electrophoretic image is shown in FIG.
  • the length of the PCR product was accurately measured using a bioanalyzer (DNA 12000 chip).
  • the electrophoretic image is shown in FIG.
  • the base sequence of the PCR product was determined. Specifically, it was performed as follows. (1) The PCR product was purified according to the standard protocol of QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN). (2) The concentration was measured according to the standard protocol of PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen). (3) The purified PCR product was adjusted to a concentration of 500 ng / 100 ⁇ L, and a rapid library was prepared, emulsion PCR, and sequencing were performed according to the standard protocol of Genome Sequencer (GS) Junior (Roche). A base sequence of 10,000 reads was obtained. (4) A homology analysis was performed between all HLA allele data registered in the IMGT HLA database and all reads, and candidate HLA allele sequences were selected. (5) Using the candidate HLA allele sequence as a reference, GS Reference Mapper (Roche) is used to map the reference and the lead under the condition of 100% coincidence. Identified.
  • the PCR product derived from each gene was subjected to HLA typing using Genome Sequencer (GS) Junior (Roche). As a result, all samples were determined to be the HLA allyl obtained in Example 4 without any contradiction. Therefore, the multiplex method of the present invention using a high-speed PCR apparatus was considered to be an excellent tool useful for simplifying and speeding up complicated PCR operations in clinical settings.

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Abstract

　ハイスループットシークエンサーを駆使し、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除した高精度のＤＮＡタイピング方法及びキットを提供することを目的とする。本発明は、（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩに属する遺伝子から選択される少なくとも２種の遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にハイブリダイズし、かつ同一のＰＣＲ条件にて増幅するプライマーセットを準備するステップ；（２）前記プライマーセットを用いて、被検試料（ＤＮＡ）中の前記少なくとも２種の遺伝子を同一のＰＣＲ条件で同時に同一容器内で増幅するステップ；（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップを含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。

Description

ＨＬＡ遺伝子のマルチプレックスＤＮＡタイピング方法及びキット
　本発明は、ハイスループットＤＮＡシークエンサーを用いたＨＬＡ遺伝子の超高解像度マルチプレックスＤＮＡタイピング方法に関する。
　ヒトの主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘ；ＭＨＣ）であるヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｎｔｉｇｅｎ；ＨＬＡ）は、病原体等の外来タンパク質由来ペプチド、および自己タンパク質由来ペプチドをＴ細胞に提示することにより免疫応答の誘導に深く関わっているが、主なものとして６種類の抗原が知られている。ほぼすべての細胞で発現しているクラスＩ抗原（ＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ）と、主として免疫系の細胞で発現しているクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ－ＤＲ，ＨＬＡ－ＤＱ，ＨＬＡ－ＤＰ）である。
　ＨＬＡクラスＩ抗原は高度な多型性を示すα鎖と多型性がほとんど無いβ２－ミクログロブリンからなり、ＨＬＡクラスＩＩ抗原は高度な多型が存在するβ鎖と多型性が少ないα鎖から成る。クラスＩ抗原のα鎖はＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃの各遺伝子にコードされ、クラスＩＩ抗原のβ鎖はＨＬＡ－ＤＲＢ１，ＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＢ１、α鎖はＨＬＡ－ＤＲＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子にコードされている。遺伝子レベルでは、ＨＬＡクラスＩ抗原ではα鎖をコードしている遺伝子のエクソン２とエクソン３が高度な多型性を示し、ＨＬＡクラスＩＩ抗原ではβ鎖をコードしている遺伝子のエクソン２が高度な多型性を示す。
　ＨＬＡをコードしている遺伝子領域はヒト第６染色体短腕部６ｐ２１．３に位置し、テロメア側からセントロメア側に向けて、クラスＩ領域（ＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ等）、クラスＩＩＩ領域、クラスＩＩ領域（ＨＬＡ－ＤＲＡ，ＨＬＡ－ＤＲＢ１，ＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５，ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１，ＨＬＡ－ＤＰＢ１等）の順に並び、多くの遺伝子が非常に高い密度でコードされており、輸血や移植及び様々な疾患との関連性が報告されてきている。クラスＩＩＩ領域にはＨＬＡ遺伝子は存在せず、補体成分や腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）等の遺伝子が存在している。
　ＨＬＡ－ＤＲ抗原のβ鎖をコードするＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子領域には５種類の構造多型が確認されている。ＤＲ１型やＤＲ１０型では、同一ハプロタイプ上にＨＬＡ－ＤＲＢ１の他にＨＬＡ－ＤＲＢ６やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ２型では、同一ハプロタイプ上にＨＬＡ－ＤＲＢ１の他にＨＬＡ－ＤＲＢ５（ＤＲ５１）遺伝子やＨＬＡ－ＤＲＢ６やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ３、ＤＲ５およびＤＲ６型では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の他に同一ハプロタイプ上にＨＬＡ－ＤＲＢ３（ＤＲ５２）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ２やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。ＤＲ４、ＤＲ７およびＤＲ９型では、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の他に同一ハプロタイプ上にＨＬＡ－ＤＲＢ４（ＤＲ５３）遺伝子やＨＬＡ-ＤＲＢ７、ＨＬＡ-ＤＲＢ８やＨＬＡ－ＤＲＢ９などの偽遺伝子が位置する。これらに対して、ＤＲ８型では、同一ハプロタイプ上にＨＬＡ－ＤＲＢ１以外のＨＬＡ－ＤＲＢ遺伝子は位置しない（図１）。
　各ＨＬＡ遺伝子のエクソンには複数の多型性に富む領域（多型領域）が存在し、ある多型領域の塩基配列（アミノ酸配列）が、複数のＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡアリル）に共通であることも多い。すなわち各ＨＬＡアリルは複数の多型領域の組み合わせにより規定される。ＨＬＡクラスＩ抗原ではエクソン内の多型領域のみならず、同一の塩基配列をもつエクソン２あるいはエクソン３が複数のアリルに共通であることもある。
　ＨＬＡには高度な多型が存在するためＨＬＡアリルの種類が極めて多いことも知られ、それらの表記法も決められている。即ち、血清学的ＨＬＡ型を判別する第１区域（２桁レベル）、同一の血清学的ＨＬＡ型内でアミノ酸置換を伴うアリルを判別する第２区域（４桁レベル）、アミノ酸変異を伴わない塩基置換が認められるアリルを判別する第３区域（６桁レベル）、及びＨＬＡ分子をコードする遺伝子領域外（イントロン）での塩基置換を伴うアリルを判別する第４区域（８桁レベル）である（図２）。
　骨髄移植の際には、移植希望者とドナーのＨＬＡ型（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１）が４桁レベルで完全適合すれば移植の成功率が向上し、重度の移植片対宿主病（Ｇｒａｆｔ　Ｖｅｒｓｕｓ　Ｈｏｓｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ；ＧＶＨＤ）頻度が低下すると言われている。逆に、ＨＬＡ型が４桁レベルで不一致であると拒絶反応が起こる等の不具合を生じる危険性が高くなる。従って、ＨＬＡタイピングを正確かつ高精度に実施することが臨床的にも極めて重要である。
　ＨＬＡ遺伝子におけるＤＮＡタイピング法として、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）に基づくＳＢＴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｂａｓｅｄ　Ｔｙｐｉｎｇ）法やＳＳＯ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｏｒｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）－Ｌｕｍｉｎｅｘ法が主流となっている。
　これら従来のＤＮＡタイピング法は、多数のサンプルを迅速にタイピングできるという長所はあるが、多型領域やクラスＩ遺伝子の場合はエクソンの染色体上のシス・トランスの位置関係を正確に決めることができないこともあるため、フェーズ・アンビギュイティ（ｐｈａｓｅ　ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）が生じ、高精度なＨＬＡタイピングが難しい場合があった。
　また、従来の方法は、各ＨＬＡ遺伝子のエクソン領域を中心とするＰＣＲを用いたＤＮＡタイピング法であるため、イントロン領域やプロモーター領域における塩基置換を見逃してしまい、その結果、遺伝子構造は他の発現ＨＬＡ遺伝子と変わらないが、発現が抑制されるヌル（ｎｕｌｌ）アリルの検出を見逃す可能性があった。
　例えば、特許文献１に記載された方法では、各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ条件が同一でないことから、各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲを独立的に実施しなければならず、操作の迅速化及び簡便化につながるものではなかった。
　本発明者等は、ＨＬＡの各遺伝子座の上流領域及び下流領域に各々特異的にアニールするプライマーセットを用いることにより、フェーズ・アンビギュイティのない高精度のタイピングが可能な方法を提案した（特許文献２及び非特許文献２）。しかしながら、当該方法においても各遺伝子に用いるＰＣＲ条件が完全には統一されておらず、全ての遺伝子座のＰＣＲを同時に実施するマルチプレックス法には至っていなかった。
　さらに、ＰＣＲの迅速化が期待されるＰＣＲの際の温度の上昇や下降に必要な時間を大幅に短縮させた高速ＰＣＲ装置については検討されていなかった。
特開平１１－２１６０００号公報 国際公開ＷＯ２０１３／０１１７３４号パンフレット
Ｌｉｎｄ　Ｃ．等、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７１巻、１０３３－１０４２頁（２０１０年） Ｓｈｉｉｎａ　Ｔ．等、Ｔｉｓｓｕｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ、第８０巻、３０５－３１６頁（２０１２年）
　本発明は、新規に遺伝子特定的プライマーを設計したＨＬＡ－ＤＲＢ３／ＤＲＢ４／ＤＲＢ５を含む各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ条件（アニーリング温度）を同一にし、その条件に基づいて各ＨＬＡ遺伝子を同時に同一容器内でＰＣＲ増幅できるマルチプレックスＰＣＲ法を開発すること、さらには、当該方法を高速ＰＣＲ装置に適用した場合のマルチプレックスＰＣＲ法の条件（伸長反応に必要な時間）を設定することにより、フェーズ・アンビギュイティに由来する曖昧さを排除し、かつ迅速化及び簡便化を達成できる超高解像度ＤＮＡタイピング方法を提供することを課題とする。
　前記の課題を解決するために本発明者等は鋭意研究を重ねた結果、各ＨＬＡ遺伝子に用いるプライマーを再設計し、使用するＤＮＡポリメラーゼを選択することにより、ＨＬＡ遺伝子の種類によらず同一の条件でＰＣＲすることが可能となることを見出し、本発明を完成した。
　即ち本発明は、以下のステップを含むＨＬＡのＤＮＡタイピング方法を提供する。
（１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩに属する遺伝子から選択される少なくとも２種の遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にハイブリダイズし、かつ同一のＰＣＲ条件にて増幅するプライマーセットを準備するステップ；
（２）前記プライマーセットを用いて、被検試料（ＤＮＡ）中の前記少なくとも２種の遺伝子を同一のＰＣＲ条件で同時に同一容器内で増幅するステップ；
（３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び
（４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ。
　本発明は、特にＨＬＡクラスＩ抗原であるＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡクラスＩＩ抗原であるＨＬＡ－ＤＲＢ１，ＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１について、それらのＨＬＡ遺伝子を特異的に、かつ同一のアニーリング温度で増幅しうるＰＣＲプライマーを新たに設計すること、本ＤＮＡタイピング方法に好適なＤＮＡポリメラーゼを選択すること、その酵素を使用した場合に１台のＰＣＲ装置で１度にすべてのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングを可能とする好適なＰＣＲ条件を設定すること、その条件に基づいたＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のマルチプレックスＰＣＲ法を開発すること、さらには、高速ＰＣＲ装置を用いた場合のマルチプレックスＰＣＲ法の伸長反応に必要な時間を設定すること、ハイスループットシークエンシング技術を駆使することにより、上記従来技術の課題を解決した発明である。
　本発明の方法は１分子からのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングに必要な全塩基配列が得られるので、シス・トランスの位置関係不明なフェーズ・アンビギュイティの認められない究極のＤＮＡタイピング法であり、例えば、移植の際の移植希望者とドナー候補との間における高精度なＨＬＡの一致が実現される。
　ＨＬＡ遺伝子のプロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域など周辺領域を含む遺伝子全塩基配列が決定されるので、発現が抑制されるｎｕｌｌアリルや新規アリルの検出が可能となる。
本発明では、１台のＰＣＲ装置で１度に複数から全てのＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピングを可能とする好適なＰＣＲ条件を設定したことから、操作上の迅速化及び簡便化が実現される。
本発明では、複数のＨＬＡ遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ法を提供することから、移植希望者とドナー候補との間のＨＬＡ型の更に高精度かつ迅速なＨＬＡタイピングが実現される。
ＨＬＡ－ＤＲ遺伝子領域を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４８頁から引用した。 ＨＬＡアリルの分類法を示す図である。ＩＭＧＴ－ＨＬＡデータベース（www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/）から引用した。 （ａ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第３５頁から引用した。 各ＨＬＡ遺伝子の構造を示す模式図である。 （ａ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子構造と分子構造との関連性を示す図である。（ｂ）ＨＬＡクラスＩＩ遺伝子のプロモーター領域の構造を示す図である。猪子英俊、笹月健彦、十字猛夫　監修、「移植・輸血検査学」、講談社サイエンティフィック、２００４年、第４６頁～第４７頁から引用した。 試験例１で増幅したＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子の増幅状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 実施例１で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 実施例２で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 実施例３で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 実施例４で増幅したＨＬＡ遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 実施例５で増幅したＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，　ＨＬＡ－Ｃ，　ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 実施例５で増幅したＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，　ＨＬＡ－Ｃ，　ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ産物をバイオアナライザーによりＰＣＲ産物の長さを測定した結果を示す図である。 比較例１で増幅したＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，　ＨＬＡ－Ｃ，　ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＰＣＲ状況を示すアガロースゲル電気泳動像を示す図である。 比較例１で増幅したＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，　ＨＬＡ－Ｃ，　ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のマルチプレックスＰＣＲ産物をバイオアナライザーによりＰＣＲ産物の長さを測定した結果を示す図（上図）及びその電気泳動像を示す図（下図）である。
　以下、本発明のＤＮＡタイピング方法をステップ毎に詳細に説明する。
（１）プライマーセット準備ステップ
　本発明のＤＮＡタイピング方法においては、まず、ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ，ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＡ１の各遺伝子の上流領域から下流領域、ＨＬＡ－ＤＲＢ１及びＨＬＡ－ＤＰＢ１の各遺伝子の５’非翻訳領域からエクソン２及びエクソン２から３’側の非翻訳領域ならびにＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５のエクソン２から３’側の非翻訳領域を網羅的にＰＣＲさせるためのプライマーセットであって、同一条件でのアニーリングが可能なプライマーセットを準備する。
　ＨＬＡ遺伝子が存在する領域を含むヒト第６染色体（６ｐ２１．３）のゲノム塩基配列は既に解明されており、その遺伝子構造及び発現産物（ＨＬＡ抗原）の構造との関連も知られている（図３と図５参照）。
　即ち、古典的ＨＬＡクラスＩ抗原を規定するＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの遺伝子は８個のエクソンを含んでおり（図３（ａ））、エクソン１の外側には２種類のエンハンサーやプロモーター領域があり発現が調節されている（図３（ｂ））。
　さらに、エクソン２、３及び４において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２及び３に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したような問題が生じていた（図４）。
　また、古典的ＨＬＡクラスＩＩ抗原を規定するＨＬＡ－ＤＲ，ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰはα鎖とβ鎖から構成され、それぞれの遺伝子は５個又は６個のエクソンを含んでおり（図５（ａ））、エクソン１の外側にはプロモーター領域があって発現が調節されている（図５（ｂ））。
　さらに、エクソン２及び３において多型領域が多数存在することも知られているため、従来のＤＮＡタイピング方法では、特にエクソン２に基づいて作成されたプライマーを用いたＰＣＲが行なわれ、それに伴って前述したような問題が生じていた（図４）。
　本発明では、古典的クラスＩ抗原（ＨＬＡ－Ａ，ＨＬＡ－Ｂ，ＨＬＡ－Ｃ）ならびに古典的クラスＩＩ抗原（ＨＬＡ－ＤＲＢ１，ＨＬＡ－ＤＱＡ１，ＨＬＡ－ＤＱＢ１，ＨＬＡ－ＤＰＡ１，ＨＬＡ-ＤＰＢ１）の遺伝子領域の全て（エクソンのみならず、イントロン、５’側と３’側の非翻訳領域、プロモーター領域も含む）及びＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５のエクソン２から３’側の非翻訳領域をＰＣＲできるプライマーセットを調製し、それを用いて増幅したＰＣＲ産物を後述するハイスループットシークエンシングに供するので、フェーズ・アンビギュイティ等の不確実さを排除でき、ｎｕｌｌアリルの有無も正確に検知することができる。
　具体的には、下記表１～表３に掲げるＰＣＲプライマーセットのうち、少なくとも２種の遺伝子に対応するプライマーセットを調製する。
　少なくとも２種の遺伝子とは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１から選択される少なくとも２種の遺伝子を意味し、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１から選択される２種、３種、４種、５種、６種及び７種の全ての組み合わせ、並びに８種全ての遺伝子の組み合わせを包む。
　各遺伝子に対応するプライマーセットについては以下に述べる。
　表１における配列番号１～３は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ａ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ａ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１と２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９０９，４８３番目から第２９，９０９，５１４番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号３は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第２９，９１４，９２５番目から第２９，９１４，９５４番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，５００塩基（ｂｐ）である。
表１における配列番号４と５は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ｂ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，３２５，７９６番目から第３１，３２５，８２４番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
配列番号５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，３２１，２１０番目から第３１，３２１，２３５番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，６００塩基（ｂｐ）である。
表１における配列番号６～８は、ＭＨＣクラスＩα鎖であるＨＬＡ－Ｃ遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－Ｃ遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号６と７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２４０，８６８番目から第３１，２４０，８９６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３１，２３６，０７５番目から第３１，２３６，１１４番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，８００塩基（ｂｐ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表２における配列番号９と１０は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ２（ＤＲ１５）、ＨＬＡ－ＤＲ２（ＤＲ１６）サブタイプを特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０９番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３０番目から第３２，５５２，１５３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，６００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号１１と１２は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＨＬＡ－ＤＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ５（ＤＲ１１）、ＨＬＡ－ＤＲ５（ＤＲ１２）、ＨＬＡ－ＤＲ６（ＤＲ１３）、ＨＬＡ－ＤＲ６（ＤＲ１４）、ＨＬＡ－ＤＲ８サブタイプを特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５４６，６０８番目から第３２，５４６，６２９番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号１１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，５５２，１３７番目から第３２，５５２，１６２番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，６００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号１３～１５は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１３と１４は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）における第３，９３９，３５６番目から第３，９３９，３７９番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号１５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：６＿ｃｏｘ＿ｈａｐ２）における第３，９３４，１８７番目から第３，９３４，２０７番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，２００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号１６と１７は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｃｈｒ６＿ｍａｍｎ＿ｈａｐ４）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｃｈｒ６＿ｍａｎｎ＿ｈａｐ４）における第３，８５１，２７０番目から第３，８５１，２９３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号１７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｃｈｒ６＿ｍａｎｎ＿ｈａｐ４）における第３，８４６，１０８番目から第３，８４６，１２８番目の塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約５，２００塩基（ｂｐ）である。
　表２における配列番号１８と１９は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号１８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，４８９，９３３番目から第３２，４８９，９５６番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号１９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，４８５，２５６番目から第３２，４８５，２７６番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約４，７００塩基（ｂｐ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表３における配列番号２０と２１は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６０４，４６５番目から第３２，６０４，４８８番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号２１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６１１，９３６番目から第３２，６１１，９６０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，５００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号２２～２６は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２２は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６２７，４０６番目から第３２，６２７，４３３番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号２３と２５は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６３５，６１２番目から第３２，６３５，６４３番目に相当する塩基配列を持つ。
　配列番号２４と２６は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３２，６３５，６１２番目から第３２，６３５，６４０番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約８，２００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号２７～２９は、ＭＨＣクラスＩＩα鎖であるＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子の全領域（プロモーター、エクソン及びイントロンを含む）を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号２７は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４１，５７３番目から第３３，０４１，６００番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号２８は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４１，５７３番目から第３３，０４１，５９８番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　配列番号２９は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０３１，８８５番目から第３３，０３１，９１２番目に相当する塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約９，７００塩基（ｂｐ）である。
　表３における配列番号３０と３１は、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖であるＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子を特異的に増幅するＰＣＲプライマーセットである。これらのプライマーセットは、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）において、ＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子のエクソン２から３’非翻訳領域を上流側及び下流側から挟み込む位置に存在する塩基配列である。
　配列番号３０は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０４８，１８２番目から第３３，０４８，２０７番目に相当する塩基配列を持つ。
配列番号３１は、ヒトゲノム塩基配列（リファレンス配列：ｈｇ１９）における第３３，０５５，４２８番目から第３３，０５５，４５３番目に相当する塩基配列に相補的な塩基配列を持つ。
　これらのプライマーセットを用いて得られるＰＣＲ産物の予測される長さは約７，３００塩基（ｂｐ）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　これらのプライマーは、当該分野で通常用いられている手法により調製することができる。また、表１～表３に記載したプライマーセットは最も好ましい例を示したものであり、本発明の方法においては、ＨＬＡの各遺伝子全領域を上流側及び下流側から挟み込む位置にアニーリング可能なセンス（Ｓｅｎｓｅ）側プライマーとアンチセンス（Ａｎｔｉ－ｓｅｎｓｅ）側プライマーとのセットであれば同様に使用することができる。
　なお、この明細書においては、リファレンス配列の同一の位置に相当する塩基配列（又はそれに相補的な塩基配列）であっても、１～数塩基が相違しているプライマーについては各々別個の配列番号を付与した。これらの１～数塩基の相違は多型によるものである。
（２）ＰＣＲステップ
　本発明の方法では、前記ステップ（１）で準備したプライマーセットを用い、被検試料（ＤＮＡ）をＰＣＲする。
　ＰＣＲは、通常のプロトコールに従って実施される。具体的には次の通りである。
　１．被検試料の形態に応じて、当該試料からＤＮＡを抽出する。
　２．抽出したＤＮＡを定量し、適宜プライマー濃度を設定して反応液を調製する。
　３．反応条件を設定してＰＣＲを実施する。
　　例：熱変性ステップ（通常は９２～９８℃）
　　　　アニーリングステップ（通常は５５～７２℃）
　　　　伸長ステップ（通常は６５～８０℃）
　本発明の方法では、前記アニーリング及び伸長ステップの温度を約６５～７０℃とするのが好ましい。より好ましくは６５℃～６８℃とする。約６５～７０℃でアニーリング及び伸長させることにより、ＨＬＡアリルを等比率で（均一に）生成させることができる。
　４．得られたＰＣＲ産物を精製し、次の塩基配列決定ステップに供する。
　本発明において新たに設定されたプライマーセットを用いることにより、１チューブ内での反応で複数の異なる遺伝子を同一条件かつ同時に増幅できることが可能となった。
　なお、本発明で用いる酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は特に限定されるものではないが、例えば、市販品を使用することもできる。例えば、ＴａＫａＲＡ社製のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｕｍｅｒａｓｅ、Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＴａＫａＲａ　ＬＡ　Ｔａｑ、Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製のＬｏｎｇ　ＰＣＲ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ等を挙げることができる。
（３）塩基配列決定ステップ。
　次に、前記ステップ（２）で生成されたＰＣＲ産物（増幅ＤＮＡ）の塩基配列を決定する。このステップは、いわゆるハイスループットシークエンス（あるいは超高速シークエンス、大量並列シークエンス）と呼ばれている手法を用いて実施するのが好ましい。ハイスループットシークエンスに関しては、例えば、「実験医学」第２７巻、第１号、２００９年（羊土社）等を参照されたい。
　本明細書では、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）の４５４　ＧＳシステムに基づいて配列決定する方法を以下に記載する。なお、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のゲノムシークエンサーＩｏｎ　Ｔｏｒｒｅｎｔ　ＰＧＭシステム及びイルミナ（ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＭｉＳｅｑシステムも同様に塩基配列決定が可能である。
　１．前記ステップ（２）で得られたＰＣＲ産物をネブライザーにより約５００塩基ほどに断片化する。
　２．その断片化されたＤＮＡ断片の末端にＤＮＡアダプターを付加する。
　３．ＤＮＡアダプターを付加したＤＮＡ断片を一本鎖ＤＮＡ断片にした後、アダプターを介してビーズに結合させる、得られたビーズを油中水型エマルジョンに包み込む（１ビーズに１つのＤＮＡ断片が結合したマイクロリアクター環境が形成される）。
　４．エマルジョンＰＣＲを実施し、各ビーズ上に各ＤＮＡ断片のコピーを形成させる（各ＤＮＡ断片は各々のマイクロリアクター内でクローナルに増幅されるので、他の配列との競合もなく、多数の断片の増幅が同時に並列的に実施できる）。ついで、エマルジョンを破壊して増幅されたＤＮＡ断片を有するビーズを回収する。
　５．ビーズを濃縮し、ピコタイタープレートにローディングする（１ウェルに１個のビーズが入るサイズである）。
　６．各々のビーズについて、ポリメラーゼが酵素反応するときに生じるピロリン酸を、ルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光の強度とパターンからＤＮＡの塩基配列を決定する。４種類の核酸（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を一定の順序で加える、添加した核酸に応じた化学発光パターンを記録し、そのシグナル強度と位置情報との組み合わせにより塩基配列を決定する。
（４）ＤＮＡタイピングステップ
　次いで、前記ステップ（３）で得られるｓｆｆ　ｆｉｌｅをＭＩＤタグ毎に分類した後、既知のＨＬＡアリルの塩基配列データベースのデータと比較することにより、被検試料に含まれていたＤＮＡの第４区域レベルのＨＬＡアリル（８桁レベル）が決定される。
　本発明の方法は、前記表１～表３に記載したプライマーセットを代表例とする。ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子全領域を挟み込む位置にプライマーを設定し、ほぼ全領域に渡って増幅したＤＮＡの配列決定をすることに特徴を有し、それによってアンビギュイティ（不確実さ）を排除し、ｎｕｌｌアリルに関する情報を得ることもできる。
　本発明では、各ＨＬＡ遺伝子のＰＣＲの際のアニーリング温度が同一となるようなプライマーセットを新たに設定したことにより、１台のＰＣＲ装置で複数の遺伝子のＰＣＲを同時に行うことができる。
また本発明では、上記の新たなプライマーセットを設定したことにより、複数のＨＬＡ遺伝子を１チューブ内で同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲ法を行うことが可能になった。
さらに、本発明で使用するプライマーセット及び酵素の組み合わせは、高速ＰＣＲ装置にも適用可能であることを確認した。したがって、従来より迅速かつ高精度にＰＣＲを行うことができる。
　以下に具体例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（試験例１）
［目的］
　本発明の方法に適したＰＣＲ酵素を特定すること。
［方法］
　ＤＲ９とＤＲ１５をヘテロ接合体として有する既に抽出されているゲノムＤＮＡ、２サンプルを鋳型として、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のプロモーター領域からエクソン２を特異的に増幅させるプライマーセット（非特許文献２参照）を用いてＰＣＲを行った。
　なお、このゲノムＤＮＡの選択は、ＤＲ９のＰＣＲ産物の長さが１１．２ｋｂであり、ＤＲ１５のＰＣＲ産物の長さが６．１ｋｂであることから、両ＨＬＡアリルが同量で増幅していることを確認しやすいこと、ＤＲ９のＰＣＲ産物は本発明の中で最も長いものであり、ＤＲ９のＰＣＲ産物が得られれば、その他のＨＬＡ遺伝子についても同様に増幅できると考えたことによる。
（１）ＰＣＲには表４に示した２３種類の市販されているＬｏｎｇ　ｒａｎｇｅ　ＰＣＲ酵素を用いた。すなわち、５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１．５～３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、各酵素のプロトコールに準じたＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰ及びＬｏｎｇ　ｒａｎｇｅ　ＰＣＲ酵素を加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを３０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図６に示した。
［結果及び考察］
　標準プロトコールに従ったＰＣＲならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、４種類の酵素、すなわちＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＴａＫａＲａ　ＬＡ　Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）、Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）及びＬｏｎｇ　ＰＣＲ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）にて、２サンプルともに目的の分子量の位置にかつ両ＨＬＡアリル由来のＰＣＲ産物が得られた（図６）。
　しかしながら、以下に示す試験例１の結果から、上記４種類のうち、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）及びＴｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ＴａＫａＲａ　ＬＡ　Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ）及びＬｏｎｇ　ＰＣＲ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）の３種類の酵素が、各ＨＬＡ遺伝子のアリル由来のＰＣＲ産物をほぼ均等に増幅できることが判明し、これら３種類の酵素が本発明の方法に特に好適であることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（実施例１）
［目的］
　酵素として、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、各ＨＬＡ遺伝子における増幅状況を確認する。
［方法］
　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１～表３参照：配列番号１～３１）を用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、４μＬの５ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ緩衝液、１．６μＬのｄＮＴＰ溶液、１～３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）ずつのＰＣＲプライマー、０．４μＬのＰｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　ＧＸＬポリメラーゼを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、７０℃で５分間の２ステップを１工程として、これを３０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００　（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図７に示した。
［結果及び考察］
　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）におけるＰＣＲ条件の検討ならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物にて目的の分子量の位置に単一のＰＣＲ産物が得られた（図７）。
（実施例２）
［目的］
　酵素として、Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、各ＨＬＡ遺伝子における増幅状況を確認することを目的にした。
［方法］
　Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１～表３参照：配列番号１～３１）を用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１０μＬの２ｘ Ｇｆｌｘ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、１～３μＬ（４　ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．２μＬのＴｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返した。その後、９８℃で１０秒間、６５℃で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図８に示した。
［結果及び考察］
　Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）におけるＰＣＲ条件の検討ならびにそれらＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物にて、目的の分子量の位置に単一のＰＣＲ産物が得られた（図８）。
比較例１の結果と比較しても、Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いた場合は、各ＨＬＡ遺伝子とも満遍なく均一に増幅できた。
（実施例３）
［目的］
　汎用されているＰＣＲ装置、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）とＰＣＲの高速化に特化した増幅装置、ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｆａｓｔ（ＴａＫａＲａ）との間におけるＰＣＲ状況の相違を確認し、ＰＣＲに必要な時間を検討する。
［方法］
　Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されているゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１～表３参照：配列番号１～３１）を用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１０μＬの２ｘ Ｇｆｌｅｘ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、１～３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．２μＬのＴｋｓ　Ｇｆｌｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返した。その後、９８℃で１０秒間、６５℃で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）とＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｆａｓｔ（ＴａＫａＲａ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図９に示した。
［結果及び考察］
　２機種のＰＣＲ装置を用いたＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、両機種間でバンドの出現状況に大差はなく、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物にて、目的の分子量の位置に単一のＰＣＲ産物が得られた（図９）。
　ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）の場合、ＰＣＲに必要な時間は３時間１０分間であったのに対して、ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｆａｓｔ（ＴａＫａＲａ）では、２時間４５分間であった。
　したがって、本発明の方法は、ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｆａｓｔ（ＴａＫａＲａ）等の高速ＰＣＲ装置への適用が可能であり、ＰＣＲの高速化に寄与することが確認された。
（実施例４）
［目的］
　Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）ならびにＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）を用いたＰＣＲ産物の再現性を確認するとともに、本発明で設定したＰＣＲ条件がＨＬＡ遺伝子の超高解像度ＤＮＡタイピングに好適であることを裏付けるために、複数のＤＮＡサンプルを用いてＰＣＲ産物の塩基配列決定を行った。
［方法］
１．Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されており、ＨＬＡ型が既に明らかにされており、従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体（Ｓａｍｐｌｅ１～４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子特異的プライマーセット（表１～表３参照：配列番号１～３１）を用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１０μＬの２ｘＧｆｌｘＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、１～３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．２μＬのＴｋｓ　ＧｆｌｅｘＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返した。その後、９８℃で１０秒間、６５℃で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図１０に示した。
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
（３）精製したＰＣＲ産物を５００ｎｇ／１００μＬの濃度に調整し、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、ｒａｐｉｄライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、１サンプルあたり２万リードの塩基配列を得た。
（４）それら配列をＩＭＧＴ　ＨＬＡデータベースに登録されている全ＨＬＡアリルデータと全リード間で相同性解析を行い、候補ＨＬＡアリル配列を選択した。
（５）その候補ＨＬＡアリル配列をリファレンスとして、ＧＳ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｍａｐｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、リファレンスとリードとを１００％一致の条件でマッピングを行い、目視でマッピング状況を確認することにより、ＨＬＡアリルを同定した。
［結果及び考察］
１．ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、ＨＬＡクラスＩ及びＨＬＡクラスＩＩの各遺伝子におけるＰＣＲ産物ともに、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図１０）。またＰＣＲ産物の塩基配列をサンガー法により決定した結果、既報と矛盾しないＨＬＡアリルが得られたことから、本ＰＣＲ系はＨＬＡタイピングに使用しうるものと考えられた。
２．従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体を用いてＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域、ＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１の５’非翻訳領域からエクソン２及びＨＬＡ－ＤＰＢ１のエクソン２から３’非翻訳領域の各遺伝子由来のＰＣＲ産物をＧｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）によりＨＬＡタイピングをおこなった。その結果、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ３／４／５、ＨＬＡ－ＤＱＢ１については、遺伝子領域全体のタイピングが可能であった。ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＰＢ１については、エクソン部分のみのタイピングが可能であった。さらに、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１の各遺伝子では、新規アリルを検出した（表５）。よって本法は、フェーズ・アンビギュイティのない８桁レベルのＨＬＡタイピングを可能とするとともに、ｎｕｌｌアリルの原因となるプロモーターやイントロン内の塩基置換や挿入・欠失を効率よく検出するための優れたツールであると考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
（実施例５）
［目的］
　Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、ならびにＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）を用いてＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１のマルチプレックスＰＣＲ法の可能性を検証する。
［方法］
１．Ｔｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）を用いて、既に抽出されており、ＨＬＡ型が既に明らかにされており、従来のＤＮＡタイピング法にてフェーズ・アンビギュイティの見られるアリルの組み合わせを含む４検体（Ｓａｍｐｌｅ１～４）のゲノムＤＮＡを鋳型として、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の各遺伝子特異的プライマーセット（特許文献３、表１及び表２参照：配列番号１～１２）を１本のチューブに混合したもの用いてＰＣＲを行った。具体的な手順は次の通りである。
（１）５０ｎｇのゲノムＤＮＡ溶液に、１０μＬの２ｘＧｆｌｘＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ、１～３μＬ（４ｐｍｏｌ／μＬ）のＰＣＲプライマー、０．２μＬのＴｋｓ　ＧｆｌｅｘＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、反応液の全量を滅菌水にて２０μＬに調整した。
（２）これを９４℃で２分間の保温後、続いて９８℃で１０秒間、６８℃で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返した。その後、９８℃で１０秒間、６５℃で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返した。なお、このＰＣＲにはＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　９７００（ライフテクノロジーズ）を用いた。ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図１１に示した。また、バイオアナライザー（ＤＮＡ１２０００チップ）を用いて、ＰＣＲ産物の長さを正確に測定した。その泳動像を図１２に示した。
２．ＰＣＲ産物の塩基配列を決定した。具体的には次の通り行った。
（１）ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）の標準プロトコールにしたがって精製した。
（２）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ　ｄｓＤＮＡ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の標準プロトコールにしたがって濃度を測定した。
（３）精製したＰＣＲ産物を５００ｎｇ／１００μＬの濃度に調整し、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）の標準プロトコールにしたがって、ｒａｐｉｄライブラリーの作製、エマルジョンＰＣＲ、シークエンシングをおこない、１サンプルあたり２万リードの塩基配列を得た。
（４）それら配列をＩＭＧＴ　ＨＬＡデータベースに登録されている全ＨＬＡアリルデータと全リード間で相同性解析を行い、候補ＨＬＡアリル配列を選択した。
（５）その候補ＨＬＡアリル配列をリファレンスとして、ＧＳ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｍａｐｐｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、リファレンスとリードとを１００％一致の条件でマッピングを行い、目視によるマッピング状況を確認することにより、ＨＬＡアリルを同定した。
［結果及び考察］
　ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の各遺伝子を独立的にＰＣＲさせた場合、ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動から、目的の分子量の位置に単一の増幅産物が得られた（図１１のレーン１～３）。その一方、それらプライマーをミックスしてＰＣＲさせた場合、各遺伝子におけるＰＣＲ産物を反映すると思われる複数のバンドが観察された（図１１のレーン４）。そこでバイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ　ＤＮＡ１２０００キット）を用いて詳細にＰＣＲ産物の長さを測定した結果、各遺伝子由来のＰＣＲ産物が増幅していることを確認した（図１２）。さらに、各遺伝子由来のＰＣＲ産物をＧｅｎｏｍｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）Ｊｕｎｉｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）によりＨＬＡタイピングをおこなった結果、いずれのサンプルとも、矛盾なく実施例４にて得られたＨＬＡアリルに判定された。よって高速ＰＣＲ装置を使用した本発明のマルチプレックス法は、臨床現場におけるＰＣＲの煩雑な操作の簡素化や迅速化に役立つ優れたツールであると考えられた。
（比較例１）
［目的］
　本発明のプライマーセットがマルチプレックス増幅に適していることを確認する。
［方法］
　実施例５と同様の条件で、特許文献２に開示されているＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の各遺伝子に対するプライマーセットを用いてＰＣＲさせる実験を行った。
［結果及び考察］
　ＰＣＲ後に、アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物の増幅状況を確認した。その泳動像を図１３（左側）に示した。また、バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ　ＤＮＡ１２０００キット）を用いて、ＰＣＲ産物の長さを正確に測定した。その泳動像を図１４（左側）に示した。
　比較のため、本発明で新たに設定したプライマーセットを使用した場合の結果を同図の右側に示した。
　図１４から明らかなように、従来（特許文献２）に記載されたプライマーセット（前開発プライマーセット）を用いた場合には、特にＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲＢ１の各遺伝子を同時に同一容器内で増幅させた場合、特異ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃが十分に増幅されなかったのに対し、本発明の新規なプライマーセット（新規開発プライマーセット）を使用した場合は、いずれの遺伝子も均等に増幅された。

Claims (18)

  1. （１）ヒトゲノム塩基配列におけるＨＬＡクラスＩ及びクラスＩＩに属する遺伝子から選択される少なくとも２種の遺伝子の上流領域及び下流領域に各々特異的にハイブリダイズし、かつ同一のＰＣＲ条件にて増幅するプライマーセットを準備するステップ；
    （２）前記プライマーセットを用いて、被検試料（ＤＮＡ）中の前記少なくとも２種の遺伝子を同一のＰＣＲ条件で同時に同一容器内で増幅するステップ；
    （３）ＰＣＲ産物の塩基配列を決定するステップ；及び
    （４）任意に、データベースとのホモロジー検索を実施するステップ；
    を含むことを特徴とする、ＨＬＡのＤＮＡタイピング方法。
  2. 前記遺伝子が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＱＡ１、ＨＬＡ－ＤＱＢ１、ＨＬＡ－ＤＰＡ１、ＨＬＡ－ＤＲＢ１、及びＨＬＡ－ＤＰＢ１から選択される少なくとも２種の遺伝子であり、前記プライマーセットが、当該少なくとも２種の遺伝子に対応するプライマーセットである、請求項１に記載の方法。
  3. 前記プライマーセットが、配列番号１～３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドから選択される、請求項２に記載の方法。
  4. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ａ遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：１、２及び３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ｂ遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：４及び５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記遺伝子がＨＬＡ－Ｃ遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：６、７及び８の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  7. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ２（ＤＲ１５）型又はＤＲ２（ＤＲ１６）型を含み、前記プライマーセットが配列番号：９及び１０の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  8. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ１遺伝子のＤＲ３型、ＤＲ５（ＤＲ１１）型、（ＤＲ１２）型、ＤＲ６（ＤＲ１３）型（ＤＲ１４）型又はＤＲ８を含み、前記プライマーセットが配列番号：１１及び１２の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  9. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ３遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：１３、１４及び１５の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  10. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ４遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：１６及び１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  11. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＲＢ５遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：１８及び１９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  12. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＱＡ１遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：２０及び２１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  13. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＱＢ１遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：２２、２３、２４、２５及び２６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  14. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＰＡ１遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：２７、２８及び２９の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  15. 前記遺伝子がＨＬＡ－ＤＰＢ１遺伝子を含み、前記プライマーセットが配列番号：３０及び３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含む、請求項３に記載の方法。
  16. 前記ＰＣＲの温度条件が、９４度で２分間の保温後、続いて９８度で１０秒間、６８度で５分間の２ステップを１工程として、これを１０回繰り返し、その後、９８度で１０秒間、６５度で５分間の２ステップを１工程として、これを２０回繰り返す条件である、請求項１に記載の方法。
  17. 配列番号：１～３１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング用プライマーセット。
  18. 請求項１７に記載のプライマーセット及び特定のＤＮＡポリメラーゼを含む、ＨＬＡ遺伝子のＤＮＡタイピング用キット。
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