WO2014178392A1 - アトピー性皮膚炎モデル動物およびその用途 - Google Patents

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清文 山西
水谷　仁
康友 今井
知広 善本
中西　憲司
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学校法人兵庫医科大学
国立大学法人三重大学
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    • A01K2267/0368—Animal model for inflammation

Definitions

  • the present invention relates to a transgenic non-human mammal that retains the IL-33 gene in a state where it can be specifically expressed in the skin, and a screening method or evaluation method for a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis using the same.
  • Atopic dermatitis is a pruritic, chronic recurrent inflammatory dermatosis that has a genetic background and is characterized by high IgE levels in the serum. Further, mast cells and eosinophils gather at the lesion, and eosinophils in the blood also increase.
  • the mechanism of the development of atopic dermatitis has not yet been fully elucidated, but it is induced by cross-linking of immunoglobulin (hereinafter referred to as Ig) E molecules bound to Fc ⁇ R on activated T cells, basophils or mast cells. As a result of activation of basophils and mast cells, it is considered important that cytokines and chemical mediators related to Th2 occur.
  • Ig immunoglobulin
  • the cytokine is interleukin (hereinafter referred to as IL) -4, IL-13, or IL-5, and the chemical mediator is histamine, serotonin, or the like.
  • IL interleukin
  • antigen-specific IgE plays an important role especially in the activation of basophils and mast cells.
  • Involvement of stimulation, infection, IL-18, etc. has been suggested, but details are unknown.
  • atopic dermatitis model mice prepared by genetic manipulation do not necessarily reflect the characteristics of actual atopic dermatitis.
  • some of the models reported as atopic dermatitis models created by genetic engineering are gene expression enhancement models in which localization of the high expression of the gene is not normally seen in the skin of patients with atopic dermatitis (CASP1 Tg, IL-18 Tg, IL-4 Tg), or dermatitis tissue has no eosinophils or neutrophils, and there is no fluctuation in IgE values (IL-31 Tg) Therefore, it is considered that this is not necessarily a disease model that properly reflects human atopic dermatitis.
  • RelB-KO mice do not show pruritic symptoms
  • MAIL (IkB ⁇ ) -KO mice have a very high perinatal lethality and are severe as skin irritation symptoms. Is complete. Therefore, when these model mice are used for the evaluation of atopic dermatitis, there is a concern that the actual situation is not reflected.
  • Non-patent Document 3 IL-33 has been identified as a cytokine belonging to the IL-1 family having an amino acid sequence highly homologous to IL-1 ⁇ and IL-18, and ST2 is its receptor. ST2 is expressed on Th2 cells and allergic cells (basophils, mast cells, eosinophils, type 2 natural lymphocytes), suggesting that IL-33 is involved in Th2-type allergic diseases. Yes.
  • Non-patent Document 5 Non-patent Document 5
  • An object of the present invention is to produce and analyze a non-human mammal into which IL-33 gene is overexpressed in a skin-specific manner in order to elucidate the function of the IL-33 gene in vivo. Another object is to provide a screening method for an atopic dermatitis preventive / therapeutic drug or a method for evaluating an atopic dermatitis preventive / therapeutic drug using the transgenic non-human mammal.
  • the present inventors introduced a mouse IL-33 gene under the control of the keratin promoter to produce a transgenic (Tg) mouse.
  • Tg mice spontaneous development of dermatitis and the number of inflammatory cells under the rearing conditions of SPF (specific pathogen free) (state not infected with specific pathogenic microorganisms) Increased, total IgE concentration, histamine concentration, cytokine concentration and chemokine concentration, and increased scratching action time. That is, the characteristics of the transgenic mice according to the present invention were consistent with the findings observed in patients with atopic dermatitis. Furthermore, it succeeded in reducing the scratching action time with known antihistamines and steroids. As a result of further studies based on these findings, the present inventors have completed the present invention.
  • the present invention [1] A transgenic non-human mammal that retains IL-33-encoding DNA in a state capable of being specifically expressed in the skin, and corresponding non-transgenic under the breeding conditions of SPF (specific pathogen free) (1) Spontaneously developing dermatitis compared to non-human mammals, (2) The number of inflammatory cells is increasing, (3) having one or more characteristics selected from the group consisting of: increased total IgE concentration, histamine concentration, cytokine concentration and / or chemokine concentration; and (4) increased scratching action time.
  • Human mammals [2] The non-human mammal according to [1], wherein the DNA encoding IL-33 is under the control of a keratin promoter; [3] The non-human mammal according to [2], wherein the keratin promoter is a human keratin 14 promoter; [4] The non-human mammal according to any one of [1] to [3], wherein IL-33 has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a method for screening a therapeutic drug for atopic dermatitis comprising selecting a test substance to be improved as compared with the case of not administering a test compound; [11]
  • a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis is applied to the non-human mammal according to any one of [1] to [9] under the breeding conditions of SPF (specific pathogen free), (1 Measure one or more items selected from the group consisting of :) rash score, (2) inflammatory cell count, (3) total IgE concentration, histamine concentration, cytokine concentration and / or chemokine concentration, and (4) scratching action time.
  • the IL-33 transgenic non-human mammal of the present invention exhibits a phenotype more reflecting the symptoms of atopic dermatitis in humans and is useful as an evaluation system for the role of IL-33 in atopic dermatitis in vivo. Furthermore, it can be used for screening and drug efficacy evaluation of prophylactic / therapeutic agents for atopic dermatitis.
  • Scale scale 50 ⁇ m. It is a figure which shows the tissue specific expression analysis of IL-33 gene in hK14mIL33tg mouse
  • Significance test was performed by log-rank test (two-sided) test, and P ⁇ 0.001 was significant. It is a figure which shows the hematoxylin eosin dyeing
  • Transgenic non-human mammals that hold DNA encoding IL-33 in a state where it can be expressed specifically in the skin are DNA encoding IL-33.
  • DNA encoding IL-33 Is stably maintained in a state where it can be expressed specifically in the skin.
  • Stably retained means that the DNA encoding IL-33 is permanently present in the cells of the animal in a state where it can be specifically expressed in the skin, and the DNA is integrated into the host chromosome. Or may exist stably as extrachromosomal DNA, but preferably the DNA is retained in an integrated state on the host chromosome.
  • the Tg animal of the present invention is a fertilized egg of a non-human mammal, an unfertilized egg, a sperm and a precursor cell thereof (primitive germ cell, oocyte cell, oocyte, egg cell, spermatogonia cell, spermatocyte, sperm cell) Etc.), preferably in the early stages of embryo development of fertilized eggs (more preferably before the 8-cell stage), calcium phosphate coprecipitation, electroporation, lipofection, aggregation, microinjection (micro It is prepared by introducing DNA encoding the target IL-33 by gene transfer methods such as injection), gene gun (particle gun), and DEAE-dextran.
  • a target DNA can be introduced into somatic cells, tissues, organs, etc. of non-human mammals and used for cell culture, tissue culture, and the like. Tg animals can also be produced by fusing (or germline) cells with known cell fusion methods.
  • the target DNA was introduced into embryonic stem cells (ES cells) of a non-human mammal using the above gene transfer method, and the DNA was stably integrated in advance.
  • the ES cell After selecting a clone, the ES cell is injected into a blastocyst, or an ES cell mass and an 8-cell stage embryo are aggregated to produce a chimeric non-human mammal, and the introduced DNA is transmitted to the germ line It is also possible to obtain Tg animals by selecting.
  • a part of the Tg animal living body thus prepared (for example, (1) a cell, tissue, organ or the like stably holding DNA encoding IL-33, (2) a cell derived therefrom or A part of a living body of a non-human mammal that retains DNA encoding IL-33 in a state capable of being specifically expressed in the skin of the present invention) "Can be used for the same purpose as the" non-human mammal holding DNA encoding IL-33 in an expressible state "of the present invention.
  • Preferred examples of the living body of the Tg animal of the present invention include skin, skin-derived tissue pieces (for example, epidermis), cells (for example, epidermal keratinocytes), and the like.
  • non-human mammal that can be the subject of the present invention is not particularly limited as long as it is a non-human mammal for which a transgenic system has been established.
  • a mouse, cow, monkey, pig, sheep, goat, rabbit examples include dogs, cats, guinea pigs, and hamsters.
  • mice with relatively short ontogeny and biological cycle and easy breeding from the viewpoint of producing disease model animals (for example, C57BL / 6 as a pure strain)
  • a B6C3F 1 system, a BDF 1 system, a B6D2F 1 system, a BALB / c system, an ICR system, etc.) are preferable as a hybrid system such as a system, DBA2 system, etc.
  • birds such as chickens can be used for the same purpose as the “non-human mammal” targeted in the present invention.
  • the “DNA encoding IL-33” may be IL-33 DNA derived from a non-human mammal to be introduced (for example, mouse), or a heterologous mammal (for example, human, cow, monkey, pig, It may be DNA encoding IL-33 derived from sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, etc.) or a protein having substantially the same amino acid sequence as that.
  • the DNA encoding IL-33 of the present invention is a DNA encoding IL-33 of a non-human mammal to be introduced or a protein having substantially the same amino acid sequence as that, more preferably mouse IL -33 or a DNA encoding a protein having substantially the same amino acid sequence.
  • DNA encoding mouse IL-33 include DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, preferably DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 90% or more, preferably 95% or more, more preferably about 98% or more. And amino acid sequences having properties.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • SEQ ID NO: 2 the “protein having substantially the same amino acid sequence” includes an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and is represented by SEQ ID NO: 2.
  • a protein having substantially the same activity as a protein comprising an amino acid sequence is preferred.
  • the “substantially equivalent activity” examples include (1) dermatitis-inducing activity, (2) inflammatory cell migration-inducing activity into the dermis layer, (3) total IgE increasing activity in serum, (4) plasma Histamine increasing activity, (5) cytokine, chemokine increasing activity, and (6) scratching behavior-inducing activity. Substantially the same quality indicates that their activities are qualitatively equivalent. Accordingly, it is preferable that the activities are equivalent, but the degree of these activities (eg, about 0.01 to 100 times, preferably about 0.5 to 20 times, more preferably about 0.5 to 2 times) may be different. .
  • the activity can be measured according to a method known per se. Moreover, it can also measure as the Example mentioned later.
  • the DNA encoding IL-33 is preferably in an intron-free form (ie, complementary DNA), such as DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, but the intron 5 ′ and 3 Since 'terminal sequences are common to most eukaryotic genes, in another embodiment, forms containing introns (ie, genomic DNA) may also be preferably used.
  • an intron-free form ie, complementary DNA
  • DNA containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 but the intron 5 ′ and 3 Since 'terminal sequences are common to most eukaryotic genes, in another embodiment, forms containing introns (ie, genomic DNA) may also be preferably used.
  • DNA encoding IL-33 includes DNA derived from tissues of humans and various non-human mammals (bovine, monkey, pig, sheep, goat, rabbit, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) All or part of genomic DNA derived from various commercially available genomic DNA libraries is used as a raw material, or cDNA prepared from RNA derived from human or various non-human mammal tissues is used as a raw material. It can be isolated by a hybridization method or a PCR method using an oligonucleotide prepared based on a known IL-33 gene sequence as a probe or primer.
  • the Tg animal of the present invention retains DNA encoding IL-33 “in a state where it can be specifically expressed in the skin”. Therefore, when introducing the DNA into the target animal, the DNA should be used in a form (eg, an expression vector) containing an expression cassette linked downstream of a promoter that can specifically function in the skin of the target animal. Generally advantageous.
  • vectors carrying DNA encoding IL-33 include plasmids derived from E. coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, bacteriophages such as ⁇ phage, retroviruses such as Moloney leukemia virus, lentiviruses, and adeno-associated genes.
  • An animal such as virus, vaccinia virus or baculovirus or insect virus is used.
  • plasmids preferably E. coli-derived, Bacillus subtilis-derived or yeast-derived plasmids, particularly E. coli-derived plasmids
  • animal viruses preferably retroviruses, lentiviruses
  • promoters that specifically regulate IL-33 gene expression in the skin include various mammals (humans, cows, monkeys, pigs, sheep, goats, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.) And promoters of genes that are specifically regulated in skin derived from birds (such as chickens), preferably human or mouse promoters, more preferably human promoters.
  • a human-derived promoter of a gene whose expression is specifically regulated in the skin for example, a keratin promoter can be mentioned. Human keratin is classified into 54 subtypes, and each subtype is roughly classified into Type I keratin and Type II keratin.
  • Type I keratin includes keratin 9, 10, 12-20, 23-28, 31-40
  • Type II keratin includes keratin 1-8, 71-86.
  • examples of the human-derived keratin promoter include those from the keratin 1 promoter to the keratin 86 promoter.
  • the keratin 14 promoter (GenBank-AC105208.15, 46730-47216) is preferably used.
  • the keratin 5 promoter and the promoter contained in the ortholog in the other non-human mammals of the human keratin can also be used.
  • a sequence also called a polyadenylation (polyA) signal, terminator
  • a sequence also called a polyadenylation (polyA) signal, terminator
  • Efficient transgene expression can be achieved using terminator sequences derived from viral genes or from various mammalian or avian genes.
  • human keratin 14 polyA signal is preferably used.
  • Human growth hormone polyA signal, SV40 virus polyA signal, and the like can also be used.
  • the intron of the eukaryotic gene it is also possible to link a part of the intron of the eukaryotic gene 5 ′ upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3 ′ downstream of the translation region.
  • the intron sequence used in such a case include rabbit ⁇ globin intron 2 and the like.
  • a rabbit ⁇ globin and IgG chimeric intron, CMV intron, SV40 intron, and the like can also be used.
  • the splicing signal and enhancer region of each gene can be linked 5 'upstream of the promoter region, between the promoter region and the translation region, or 3' downstream of the translation region.
  • the above vector when producing a Tg animal using embryonic stem cells (ES cells), can be used as a selectable marker gene (eg, neomycin resistance gene, hygromycin) for selecting a clone in which the introduced DNA is stably integrated. It is preferable to further include a drug resistance gene such as a resistance gene.
  • a selectable marker gene eg, neomycin resistance gene, hygromycin
  • the above promoter, intron, DNA encoding IL-33, polyA signal, etc. are placed in the above vector in the correct arrangement by the usual genetic engineering technique using appropriate restriction enzymes and DNA ligase, that is, Tg animals.
  • IL-33 can be inserted in such a manner that it can be expressed specifically in the skin.
  • the keratin promoter, intron, DNA encoding IL-33, and polyA signal are connected in this order from the 5 'side.
  • keratin 14 promoter in the vector, keratin 14 promoter, rabbit ⁇ globin intron 2, DNA encoding IL-33 having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, and human keratin 14 polyA signal are ligated in this order from the 5 'side.
  • an expression vector containing DNA encoding IL-33 obtained as described above is introduced into an early embryo of a target non-human mammal by a microinjection method.
  • the early embryo of the target non-human mammal can be obtained by collecting in-vivo fertilized eggs obtained by mating male and female of the same non-human mammal, or by collecting eggs and sperm collected from male and female of the same non-human mammal respectively. It can be obtained by fertilization.
  • Non-human mammals age and breeding conditions are different from each other by the animal species used, for example, a mouse (preferably an inbred mouse such as C57BL / 6J (B6), etc. F 1 of B6 and another inbred strain) are preferably about 4 to about 6 weeks of age for females and about 2 to about 8 months of age for males, and about 12 hours in light conditions (eg 7: 00-19: 00) Those raised for one week are preferred.
  • In vivo fertilization may be by natural mating, but in order to regulate the sexual cycle and to obtain a large number of early embryos from one individual, after inducing superovulation by injecting gonadotropin to a female non-human mammal, A method of mating with a non-human mammal is preferred.
  • follicle stimulating hormone pregnant horse serum gonadotropin, generally abbreviated as PMSG
  • luteinizing hormone human chorionic gonadotropin, generally abbreviated as hCG
  • follicle stimulating hormone pregnant horse serum gonadotropin, generally abbreviated as PMSG
  • luteinizing hormone human chorionic gonadotropin, generally abbreviated as hCG
  • hCG human chorionic gonadotropin
  • the preferred dose and interval of administration of hormones differ depending on the type of non-human mammal.
  • the non-human mammal is a mouse (preferably an inbred mouse such as C57BL / 6J (B6), etc.
  • F 1 of B6 and another inbred strain usually after follicle stimulating hormone administration, about
  • a method is preferred in which a luteinizing hormone is administered 48 hours later and a fertilized egg is obtained by immediately mating with a male mouse, and the dosage of follicle stimulating hormone is about 20 to about 50 IU / individual, preferably about 30 IU / individual.
  • the dosage of the hormone is about 0 to about 10 IU / individual, preferably about 5 IU / individual.
  • the fertilized egg After a certain period of time, open the abdominal cavity of a female non-human mammal whose mating has been confirmed by inspection of the vaginal plug, etc., remove the fertilized egg from the oviduct and culture medium for embryo culture (eg, M16 medium, modified Whitten medium, BWW medium, Wash in M2 medium, WM-HEPES medium, BWW-HEPES medium, etc.) to remove cumulus cells, and incubate to DNA microinjection in 5% carbon dioxide / 95% air by the microdrop culture method. If microinjection is not performed immediately, the collected fertilized eggs can be stored frozen by a slow method or an ultra-rapid method.
  • embryo culture medium for embryo culture eg, M16 medium, modified Whitten medium, BWW medium, Wash in M2 medium, WM-HEPES medium, BWW-HEPES medium, etc.
  • ovulation was induced by administering follicle stimulating hormone and luteinizing hormone to female non-human mammals for egg collection (similar to those used in in vivo fertilization are preferably used) as described above. Thereafter, the ovum is collected and cultured in a fertilization medium (eg, TYH medium) in the atmosphere of 5% carbon dioxide / 95% by microdrop culture or the like until in vitro fertilization.
  • a fertilization medium eg, TYH medium
  • the epididymis tail is taken out from the same kind of male non-human mammal (the same as in the case of in-vivo fertilization), and the sperm mass is collected and pre-cultured in a fertilization medium.
  • the fertilized egg having two pronuclei is observed under a microscope. Select.
  • the obtained fertilized egg can be frozen and stored by a slow method or an ultra-rapid method.
  • the microinjection of DNA into a fertilized egg can be performed according to a conventional method using a known apparatus such as a micromanipulator. Briefly, a fertilized egg placed in a microdrop of embryo culture medium is aspirated and fixed with a holding pipette and the DNA solution is directly injected into the male or female pronucleus, preferably into the male pronucleus, using an injection pipette. inject.
  • the introduced DNA is preferably highly purified by CsCl density gradient ultracentrifugation or an anion exchange resin column.
  • the introduced DNA is preferably linearized by cleaving the vector portion using a restriction enzyme.
  • the fertilized egg after DNA introduction is cultured from the 1st cell stage to the blastocyst stage in 5% carbon dioxide gas / 95% air in the embryo culture medium using the microdrop culture method, and then pseudopregnant female. Transplanted into the fallopian tube or uterus of a non-human mammal.
  • the female non-human mammal for embryo transfer may be of the same kind as the animal from which the early embryo to be transplanted is derived. For example, when transplanting a mouse early embryo, an ICR female mouse (preferably about 8 to about 10 weeks old) is preferably used.
  • Examples of a method for putting a female non-human mammal for embryo transfer into a pseudopregnant state include, for example, the same type of vasectomized (ligated) male non-human mammal (for example, in the case of a mouse, an ICR male mouse (preferably about 2 There is known a method of selecting those in which the presence of vaginal plugs has been confirmed by mating with those a month old or older)).
  • Embryonic females may be naturally ovulated, or administered luteinizing hormone-releasing hormone (generally abbreviated as LHRH) or its analog prior to mating with a vasectomized (ligated) male. Alternatively, fertility induced may be used.
  • LHRH luteinizing hormone-releasing hormone
  • LHRH analogs include [3,5-DiI-Tyr 5 ] -LH-RH, [Gln 8 ] -LH-RH, [D-Ala 6 ] -LH-RH, [des-Gly 10 ]- Examples include LH-RH, [D-His (Bzl) 6 ] -LH-RH, and their ethylamide.
  • the dose of LHRH or an analog thereof and the timing of mating with a male non-human mammal after the administration vary depending on the type of non-human mammal.
  • the non-human mammal is a mouse (preferably an ICR mouse, etc.)
  • the dose of the analog is usually about 10-60 ⁇ g / individual, preferably about 40 ⁇ g / individual.
  • the embryo is transplanted to the uterus of the female for embryo reception, and if it is earlier (for example, the 1-cell to 8-cell embryo), the fallopian tube.
  • a female for embryo transfer a female whose a certain number of days has passed since pseudopregnancy is appropriately used depending on the stage of development of the transplanted embryo. For example, in the case of mice, female mice about 0.5 days after pseudopregnancy are preferable for transplanting 2-cell stage embryos, and female mice about 2.5 days after pseudopregnancy are preferable for transplanting blastocyst stage embryos.
  • anesthetizing females for embryo transfer preferably Avertin, Nembutal, etc. are used
  • incisions are drawn to draw out ovaries, and initial embryos (about 5 to about 10) suspended in embryo culture medium are pipetted for embryo transfer Inject into the fallopian tube or near the fallopian junction at the uterine horn.
  • the offspring is a separately provided female female (for example, in the case of a mouse, a female mouse normally mated and delivered) Can be fed into ICR female mice))).
  • DNA encoding IL-33 at the fertilized egg cell stage ensures that the introduced DNA is present in all germ line cells and somatic cells of the subject non-human mammal. Whether or not the introduced DNA is incorporated into the chromosomal DNA can be assayed, for example, by screening the chromosomal DNA separated and extracted from the tail of the offspring by Southern hybridization or PCR.
  • the presence of DNA encoding IL-33 in the germline cells of non-human mammals (F 0 ) obtained as described above indicates that all of the progeny (F 1 ) animals have their germline cells and It means that DNA encoding IL-33 is present in all somatic cells.
  • F 0 animals are obtained as heterozygotes having the introduced DNA only on one of the homologous chromosomes. Individual F 0 individuals are randomly inserted on different chromosomes unless homologous recombination is used. Therefore, when it is desired to obtain a homozygote having a DNA encoding IL-33 in both homologous chromosomes, to produce F 1 animals crossed with an F 0 animal and a non-transgenic animal, one of the homologous chromosomes It is only necessary to cross the heterozygous brothers and sisters having the introduced DNA only into the two. If only introduced DNA is integrated into a locus, 1/4 of the obtained F 2 animals would be homozygotes.
  • an expression vector containing DNA encoding IL-33 is introduced into a target non-human mammal ES cell by a known gene transfer method such as electroporation.
  • ES cells are cells derived from the inner cell mass (ICM) of fertilized eggs at the blastocyst stage, and can be cultured and maintained in an undifferentiated state in vitro.
  • ICM cells are the cells that will form the embryo body in the future, and are the stem cells that form the basis of all tissues including germ cells.
  • ES cells may be established cell lines, or may be newly established according to the method of Evans and Kaufman (Nature 292, 154, 1981).
  • ES cells derived from 129 mice are generally used, but since the immunological background is unclear, a purely alternative and immunologically genetic
  • B57 1 mice C57BL / 6 and DBA / ES cells established from F 1
  • BDF 1 mouse has C57BL / 6 mouse in the background in addition to the advantage that the number of eggs collected is large and the egg is strong, so the ES cell derived from this is C57BL / 6 mouse.
  • ES cells can be prepared, for example, as follows.
  • Female after mating non-human mammals e.g., a mouse (preferably C57BL / 6J (B6) inbred mouse such as, F, etc. 1 of B6 and another inbred strain)
  • B6 non-human mammals
  • a blastocyst-stage embryo is collected from the uterus of a female mouse (approximately 3.5 days of gestation) of about 8 to about 10 weeks of age mated with a male mouse (or early stage before the morula stage)
  • the embryo After the embryo is collected from the fallopian tube, it may be cultured to the blastocyst stage in the same manner as described above in an embryo culture medium, and appropriate feeder cells (for example, in the case of mice, primary fibers prepared from mouse embryos)
  • appropriate feeder cells for example, in the case of mice, primary fibers prepared from mouse embryos
  • some cells of the blastocyst gather to form an ICM that differentiates into an embryo in the future
  • Both male and female ES cells may be used, but male ES cells are usually more convenient for producing germline chimeras. In addition, it is desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to reduce troublesome culture work.
  • the sex determination method for ES cells for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by the PCR method can be mentioned. If this method is used, the number of ES cells (about 50) is about 1 colony, while the number of cells required for karyotyping analysis is about 10 6 cells.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the number of chromosomes of the obtained ES cell is preferably 100% of the normal number.
  • normal cells for example, mice
  • it is desirable to clone again into a cell having a chromosome number of 2n 40.
  • the ES cell line thus obtained needs to be subcultured carefully in order to maintain the properties of undifferentiated stem cells.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblast
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide / 95%) in the presence of LIF (1 to 10,000 U / ml) known as a differentiation inhibitor.
  • LIF 1 to 10,000 U / ml
  • trypsin / EDTA solution is used to form single cells and seed them on newly prepared feeder cells.
  • ES cells can be differentiated into various types of cells such as parietal muscle, visceral muscle, and myocardium by monolayer culture to high density or suspension culture until a cell conglomerate is formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature 292, 154, 1981; GR Martin, Proceedings of National Academy of Sciences USA (Proc. Natl Acad. Sci. USA) 78, 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal of Embryology and Experimental Morphology, 87, 27, 1985] of the present invention.
  • Non-human mammalian cells that specifically express IL-33 in the skin obtained by differentiating ES cells into which DNA encoding IL-33 has been introduced are useful in the study of IL-33 in vivo Is
  • electroporation For gene transfer into ES cells, calcium phosphate coprecipitation, electroporation, lipofection, retrovirus infection, aggregation, microinjection, gene gun (particle gun), Any of the DEAE-dextran method and the like can be used, but the electroporation method is generally selected from the viewpoint that a large number of cells can be easily treated.
  • electroporation the conditions used for gene transfer into normal animal cells may be used as they are.
  • ES cells in the logarithmic growth phase are treated with trypsin and dispersed into single cells, 10 6 Suspend in medium to make ⁇ 10 8 cells / ml, transfer to cuvette, add 10-100 ⁇ g of vector containing DNA encoding IL-33, and apply electric pulse of 200-600 V / cm be able to.
  • ES cells incorporating the introduced DNA can be assayed by screening chromosomal DNA isolated from colonies obtained by culturing single cells on feeder cells by Southern hybridization or PCR,
  • the greatest advantage of a transgenic system using ES cells is that a transformant can be selected at the cell stage using the expression of a drug resistance gene or a reporter gene as an index.
  • the introduction vector used here is not only an expression cassette containing DNA encoding IL-33, but also a drug resistance gene (eg, neomycin phosphotransferase II (nptII) gene, hygromycin phosphotransferase (hpt) gene, etc.) ) And a reporter gene (eg, ⁇ -galactosidase (lacZ) gene, chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene, etc.) and the like.
  • a drug resistance gene eg, neomycin phosphotransferase II (nptII) gene, hygromycin phosphotransferase (hpt) gene, etc.
  • a reporter gene eg, ⁇ -galactosidase (lacZ) gene, chloramphenicol acetyltransferase (cat) gene, etc.
  • the ES cells after gene transfer treatment are cultured in a medium containing a neomycin antibiotic such as G418, and the emerged resistant colonies are transferred to a culture plate. After repeated trypsinization and medium exchange, a part is left for culture, and the rest is subjected to PCR or Southern hybridization to confirm the presence of the introduced DNA.
  • a neomycin antibiotic such as G418,
  • ES cells in which the introduced DNA has been confirmed to be integrated are returned into embryos derived from the same type of non-human mammal, they are integrated into the ICM of the host embryo to form a chimeric embryo.
  • a chimeric transgenic animal can be obtained by transplanting this to a foster parent (female for embryo transfer) and continuing the development. If ES cells contributed to the formation of primordial germ cells that will differentiate into eggs and sperm in the future in a chimeric animal, germline chimeras will be obtained, and this will be crossed to genetically fix the introduced DNA. Tg animals can be made.
  • the chimera embryos are prepared by adhering the early embryos up to the morula stage (aggregate chimera method) and by microinjecting cells into the blastocyst division (injection chimera method) There is.
  • aggregate chimera method aggregate chimera method
  • blastocyst division injection chimera method
  • a method of creating an aggregate chimera by injecting ES cells into the zona pellucida of an 8-cell embryo or a micromanipulator As a method that is easy to operate, a method of producing an aggregate chimera by co-culturing and aggregating an ES cell mass and an 8-cell embryo from which the zona pellucida has been removed has also been performed.
  • the host embryo can be similarly collected from a non-human mammal that can be used as an egg-collecting female in gene transfer into a fertilized egg. It is preferable to collect a host embryo from a mouse having a different color from the strain from which the ES cells are derived so that the contribution rate can be determined by the coat color. For example, if ES cells are derived from 129 mice (hair color: Agouti), C57BL / 6 mice (hair color: black) and ICR mice (hair color: albino) are used as eggs for collection, and ES cells are C57BL / 6 or DBF.
  • ICR mouse or BALB / c mouse is used as a female for egg collection. be able to.
  • germline chimera-forming ability since the germline chimera-forming ability largely depends on the combination of ES cells and host embryos, it is more preferable to select a combination having a high germline chimera-forming ability.
  • mice it is preferable to use a host embryo derived from the C57BL / 6 strain for ES cells derived from the 129 strain, and a host embryo derived from the BALB / c strain for ES cells derived from the C57BL / 6 strain. Etc. are preferred.
  • the female mouse for egg collection is preferably about 4 to about 6 weeks of age, and the male mouse for mating is preferably of the same strain of about 2 to about 8 months of age.
  • the mating may be natural mating, but is preferably performed after gonad stimulating hormone (follicle stimulating hormone and then luteinizing hormone) is administered to induce superovulation.
  • blastocyst stage embryos (for example, in the case of mice, about 3.5 days after mating) are collected from the uterus of the female for egg collection (or early embryos before the morula stage are collected from the oviduct) Later, it may be cultured to the blastocyst stage in the above-mentioned embryo culture medium), and ES cells into which DNA encoding IL-33 has been introduced into the split space of the blastocyst using a micromanipulator (about 10 to about 15) and then transplanted into the uterus of a pseudo-pregnant female non-human mammal.
  • a micromanipulator about 10 to about 15
  • a non-human mammal that can be used as a female for embryo transfer in gene transfer into a fertilized egg can be similarly used.
  • 8-cell embryos and morulas are collected from the oviduct and uterus of the female egg collection (or early embryos before the 8-cell stage).
  • Embryo culture in which the zona pellucida is dissolved in an acidic tyrode solution and then overlaid with mineral oil Place the ES cell mass (about 10 to about 15 cells) into which IL-33-encoding DNA has been introduced into the microdroplet of the culture medium, and then the 8-cell embryo or morula (preferably 2) And co-culture overnight.
  • the obtained morula or blastocyst is transplanted into the uterus of a female non-human mammal for embryo reception in the same manner as described above.
  • a chimeric non-human mammal can be obtained by natural delivery or caesarean section. It is only necessary to continue suckling for naturally delivered embryos, and if a baby is delivered by caesarean section, the offspring are fed by a separately prepared nursing female (a female non-human mammal that is normally mated and delivered). be able to.
  • a nursing female a female non-human mammal that is normally mated and delivered.
  • a chimeric mouse (for example, 50% or more) having a high ES cell contribution rate is selected from the phenotype such as hair color.
  • a chimeric mouse obtained from a chimeric embryo of D3 cells, which are male ES cells derived from 129 mice, and a host embryo derived from a C57BL / 6 mouse
  • Agouti is dominant to Black, so when crossed with female C57BL / 6 mice, the hair color of F 1 obtained is Agouti if the selected male mouse is a germline chimera. .
  • Germline chimeric non-human mammals (founders) into which DNA encoding IL-33 obtained as described above has been introduced are usually obtained as heterozygotes having the introduced DNA only in one of the homologous chromosomes. Individual founders are randomly inserted on different chromosomes unless homologous recombination is used. To obtain a homozygote having a DNA encoding IL-33 in both homologous chromosomes, siblings heterozygote having the transferred DNA in only one of the F 1 animals among homologous chromosomes of that obtained as described above What is necessary is just to cross each other.
  • Selection of heterozygotes can be assayed by screening for example F 1 animals separated extracted chromosomal DNA from the tail by Southern hybridization or PCR method. If only introduced DNA is integrated into a locus, 1/4 of the obtained F 2 animals would be homozygotes.
  • Another preferred embodiment when using a virus as an expression vector includes a method of infecting an early embryo or ES cell of a non-human mammal with a virus containing DNA encoding IL-33 (eg, proceeding) Of the National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) Vol. 99, No. 4, pp. 2140-2145, 2002).
  • a virus containing DNA encoding IL-33 eg, proceeding
  • a virus containing DNA encoding IL-33 eg. proceeding
  • it If it is an early embryo after culturing for 1 to 2 days, it can be transplanted into the oviduct or uterus of a female non-human mammal for pseudoembrynation as described above, and it can be an ES cell.
  • a selective agent such as G418 or hygromycin is added and the culture is continued to select cells into which the vector has been incorporated.
  • G418 or hygromycin is added and the culture is continued to select cells into which the vector has been incorporated.
  • the Tg animals of the present invention have the following characteristics compared to corresponding non-transgenic animals under SPF breeding conditions: (1) spontaneously develop dermatitis, (2) The number of inflammatory cells is increasing, (3) having one or more features selected from the group consisting of: increased total IgE concentration, histamine concentration, cytokine concentration and / or chemokine concentration; and (4) increased scratching action time.
  • the expression intensity of IL-33 is higher in epidermal keratinocytes than in healthy individuals (Non-patent Document 3).
  • IL-5 gene expression is increased in the skin area of human atopic dermatitis patients (Corren J, Discov Med 13: 305-12, 2012), and there is no increase in eosinophils in the blood Patients also have eosinophil infiltration in the skin area (Kiehl P et al., Br J Dermatol. 145: 720-9, 2001). Furthermore, in patients with atopic dermatitis, histamine concentration and IgE concentration are increased with the activation of mast cells. On the other hand, the above-mentioned Tg animal of the present invention can also confirm a markedly high level of IL-33 expression in the skin, and its phenotype is consistent with the characteristics of patients with atopic dermatitis.
  • the Tg animal of the present invention when the Tg animal of the present invention is a Tg mouse, some Tg mice develop dermatitis from 6 weeks of age under the SPF breeding conditions, and all Tg mice after 8 weeks of age develop all dermatitis. Dermatitis spontaneously developed. In addition, inflammatory cells (particularly eosinophils, mast cells, type 2 innate lymphoid cells) were significantly increased in the skin, peripheral blood or lymph nodes. Further, the total IgE concentration in serum was also significantly increased as compared with wild type mice, and the histamine concentration in plasma was also significantly increased as compared with wild type mice.
  • cytokines As cytokines, IL-4 and IL-13 were significantly increased in the skin, and IL-5 was significantly increased in the skin and serum as compared with wild-type mice.
  • CCL5 and CCL11 in chemokines were significantly increased in the skin, and CCL2 and CCL4 were significantly increased in the skin and serum compared to wild-type mice.
  • the scratching time is significantly increased compared to wild-type mice, and the scratching time and rash score increased by antihistamines (diphenhydramine hydrochloride) and steroids (betamethasone butyrate propionate) are reduced. I was able to. More specifically, the characteristic of the Tg mouse of the present invention was about 10 to 15 as a dermatitis rash score.
  • eosinophils are about 7-8 times in skin, about 4-5 times in peripheral blood, and mast cells are about 2-3 times in skin compared to wild-type mice.
  • Type 2 natural lymphocytes were about 12 times in skin, about 10 times in peripheral blood, and about 20 times in lymph nodes.
  • the total IgE concentration was about 20 to 30 times that of the wild type mouse, and the histamine concentration was about 8 to 9 times that of the wild type mouse.
  • the cytokine concentration is about 50 times and about 3 times in the skin for IL-4 and IL-13, and about 50 times and about 1500 times and more in the skin and serum, respectively, compared to wild type mice.
  • IL-5 was below the detection limit (0.3 pg / mL) in the wild type but was about 500 pg / mL in the Tg mouse).
  • CCL5 and CCL11 increased about 4 times and about 5 times in the skin
  • CCL2 increased about 7 times and about 14 times in the skin and serum, respectively
  • CCL4 increased about 8 and about 100 times in the skin and serum, respectively.
  • DNA encoding IL-33 under the control of the human keratin 14 promoter is highly expressed in a skin-specific manner, and eosinophils, mast cells, and type 2 natural lymphocytes. It is considered that an inflammatory reaction is induced through activation, and atopic dermatitis is developed.
  • the Tg animal of the present invention is useful for screening for a prophylactic or therapeutic agent for atopic dermatitis.
  • the present invention applies the test compound to the Tg animal under the breeding conditions of SPF (specific pathogen free).
  • SPF specific pathogen free.
  • a screening method for a therapeutic drug for atopic dermatitis which comprises selecting the test substance which is measured as described above and improves the measured item as compared with the case where the test compound is not administered.
  • test compound is administered to the Tg animal of the present invention.
  • test compounds in addition to known synthetic compounds, peptides, proteins, DNA libraries, etc., for example, tissue extracts of mammals (eg, mice, rats, pigs, cows, sheep, monkeys, humans, etc.), cell cultures, etc. A supernatant or the like is used.
  • the test compound may be administered before or after the aforementioned characteristics are observed.
  • the administration method may be oral or parenteral. Oral administration can be mixed with feed or drinking water.
  • parenteral administration examples include administration by application, intraperitoneal administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, intravenous injection, etc., rectal administration by suppository, and the like.
  • the administration may be a single administration or multiple administrations.
  • each item can be performed by a publicly known method, or may be performed according to examples described later.
  • the eruption score none of the five items of pruritus, erythema / bleeding, edema, epidermis peeling / spearing, desquamation / drying, none (0 points), mild (1 point), moderate (2 points), severe ( 3 points) and can be measured from the total number of points (Matsuda H et al., Int. Immunol, 9 (3): 461-466, 1997).
  • the number of inflammatory cells can be measured by, for example, flow cytometric analysis of cells derived from skin tissue, peripheral blood, or lymph nodes.
  • the inflammatory cells include eosinophils, neutrophils, basophils, mast cells, type 2 natural lymphocytes, etc., preferably eosinophils, mast cells and type 2 natural lymphocytes.
  • the total IgE concentration, histamine concentration, cytokine concentration and chemokine concentration can be measured by ELISA using each antibody.
  • the cytokine is preferably IL-5 or IL-13.
  • the scratching behavior time can be measured by measuring the scratching behavior time within a certain time after administration of the test compound.
  • the measurement results of the characteristics obtained as described above are compared with the case of no test compound administration. And when the measurement result of the obtained characteristic is improved as compared with the case where the test compound is not administered, the test compound can be selected as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis.
  • the improvement is that (1) the eruption score is lower than that when the test compound is not administered, (2) the number of inflammatory cells is reduced as compared with the case where the test compound is not administered, and (3) total IgE. It means that the concentration, histamine concentration, cytokine concentration and / or chemokine concentration decreases compared to the case where the test compound is not administered, and (4) the scratching action time becomes shorter than the case where the test compound is not administered.
  • the measurement results after administration of the test compound are (1) the rash score decreased by 60% or more, preferably 70% or more, and (2) the number of inflammatory cells is 65% or more, Is 75% or more, more preferably 85% or more, and (3) the total IgE concentration is 65% or more, preferably 75% or more, more preferably 85% or more, and the histamine concentration is 85% or more, preferably 90% or more.
  • cytokine concentration is 70% or more, preferably 80% or more
  • chemokine concentration is 70% or more, preferably 80% or more
  • / or (4) scratching action time is 70% or more, preferably 80% or more
  • the test compound can be selected as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis.
  • a correlation diagram between the characteristics and the presence or absence of atopic dermatitis may be prepared in advance, and the obtained measurement result of the characteristics may be compared with the correlation diagram. The comparison is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the test compound can be selected as a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis.
  • the therapeutic agent for atopic dermatitis selected by the screening method can be used to improve the symptoms of atopic dermatitis in mammals (preferably humans).
  • the therapeutic agent is formulated as needed, and is orally or parenterally a mammal (eg, human, rat, mouse, guinea pig, rabbit, sheep, pig, cow, horse, cat, dog, monkey, etc.) Can be administered.
  • the dose of the prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis varies depending on the age, weight, severity of symptoms, route of administration, etc. of the subject of administration. ) Is about 0.1 to about 100 mg, preferably about 1.0 to about 50 mg, more preferably about 1.0 to about 20 mg per day. When the administration subject is an animal other than a human, an amount converted per 60 kg body weight can be administered.
  • the present invention applies a prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis to the Tg animal under SPF (specific pathogen free) breeding conditions, and (1) rash score, (2) number of inflammatory cells, (3 Measure one or more items selected from the group consisting of :) total IgE concentration, histamine concentration, cytokine concentration and / or chemokine concentration, and (4) scratching action time, and the measured item is the prevention of atopic dermatitis -To provide a method for evaluating the effectiveness of a preventive / therapeutic agent for atopic dermatitis compared to the case of no treatment.
  • the prophylactic / therapeutic agent for atopic dermatitis administered to the Tg animal of the present invention may be a known prophylactic / therapeutic agent, such as a steroid (corticosteroid) (example) , Clobetasol propionate, betamethasone butyrate propionate, beclomethasone propionate, alcrometasone propionate, dexamethasone acetate); topical tacrolimus (Protopic® ointment); antihistamine (eg, diphenhydramine hydrochloride, chlorpheniramine hydrochloride , Promethazine hydrochloride, hydroxyzine, cyproheptadine hydrochloride, epinastine hydrochloride, etc.), but are not limited thereto.
  • a steroid corticosteroid
  • Clobetasol propionate betamethasone butyrate propionate
  • beclomethasone propionate alcrometasone propionate
  • the administration time, administration method, number of administrations, etc. of the atopic dermatitis preventive / therapeutic agent may be the same as in the above screening method.
  • the dosage may be appropriately determined by those skilled in the art depending on the prophylactic / therapeutic agent for each atopic dermatitis.
  • the characteristic measurement method compared in the evaluation method of the present invention may be performed according to the description in the screening method.
  • the greater the degree of improvement in the measurement results of the obtained characteristics compared to the case of non-administration of the atopic dermatitis prevention / treatment agent the greater the prevention / treatment drug for the atopic dermatitis Can be evaluated as having a high preventive and therapeutic effect.
  • the improvement here may be the same as described above.
  • Example 1 Construction of Transgene A DNA sequence containing a 2.0 kb human keratin 14 promoter between the EcoRI and HindIII sites of pBluescript II KS (-) phagemid vector (Agilent technologies, La Jolla, CA) (GenBank AC105208.15 4051-42254 base sequence), a DNA sequence containing 0.64 kb rabbit ⁇ globin intron 2 (GenBank V00878.1 551-1195), a 0.49 kb human keratin 14 poly A signal (GenBank AC105208.15 46730- 47216) was produced.
  • KS pBluescript II KS
  • This vector has a BamHI site between rabbit ⁇ globin intron 2 and human keratin 14 poly A signal, and the cDNA inserted into the BamHI site is stable in the stratified squamous epithelium such as the epidermis under the control of the keratin 14 promoter.
  • CDNA encoding 0.8kb full-length mouse IL-33 variant 1 (61-861 nucleotide sequence of GenBank AK163464.1) is a plasmid DNA contained in fantom TM clone B230120N24 (Danaform, Yokohama) as a template, mIL33cinf1: 5'-GGGCGAATACGGATCATGAGACCTAGAATGAAGTATTCCA-3 '(SEQ ID NO: 3) and mIL33cinf2: 5'-GGACTCTAGAGGATCTTAGATTTTCGAGAGCTTAAACATA-3 '(SEQ ID NO: 4) And inserted into the BamHI site using In-Fusion HD cloning kit (Takara Bio, Otsu).
  • mouse IL-33 cDNA expression vector is digested with XmaI, XhoI, and XmnI restriction enzymes and contains human keratin 14 promoter, rabbit ⁇ globin intron 2, mouse IL-33 variant 1 cDNA, and human keratin 14 poly A signal.
  • a 4.0 kb linear DNA was isolated and purified (FIG. 1).
  • Example 2 Production of IL-33 Gene Transgenic Mice
  • Transgenic mice were produced by microinjection according to the method of Hogan et al. (Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994).
  • the DNA fragment containing mouse IL-33 variant 1 cDNA prepared in Example 1 was microinjected into the pronuclei of 400 fertilized eggs derived from the C57BL / 6J strain.
  • the injected fertilized egg was transplanted into the fallopian tube of a pseudopregnant female mouse and reared.
  • the resulting 122 offspring were weaned at 4 weeks of age. When reaching 6 weeks of age, DNA was collected from the tails of 109 grown mice (68 males, 41 females).
  • msF4358 5'-GGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTG-3 '(SEQ ID NO: 5) and mIL33R5046: 5'-TTTGCAAGGCGGGACCAGGG-3 '(SEQ ID NO: 6) PCR was performed using a primer set having the sequence of 12 and it was confirmed that 12 mice had the transgene.
  • mouse strain hK14mIL33tg # 1 HCM-0374
  • hK14mIL33tg mouse strain hK14mIL33tg # 1 (HCM-0374)
  • hK14mIL33tg mouse strain hK14mIL33tg # 1 (HCM-0374)
  • hK14mIL33tg mouse strain hK14mIL33tg # 1 (HCM-0374)
  • hK14mIL33tg is a dermatitis that occurs stably with growth and can transduce the transgene to the germ line.
  • HCM-0374 mouse strain hK14mIL33tg # 1
  • hK14mIL33tg mouse strain hK14mIL33tg # 1 (HCM-0374)
  • hK14mIL33tg mouse strain hK14mIL33tg # 1 (HCM-0374)
  • hK14mIL33tg mouse strain hK14mIL33tg #
  • Example 4 Expression Analysis of IL-33 in the Skin of hK14mIL33tg Mice The mouse auricle was fixed with 4% paraformaldehyde and then embedded in paraffin to prepare 4 ⁇ m sections. Sections were reacted with anti-IL-33 polyclonal antibody and fluorescently stained with Alexa594. Among the three experiments, representative results are shown in the figure (Fig. 3). The fluorescence intensity is shown in black. The solid line in the figure represents the stratum corneum surface, and the dotted line represents the epidermal-dermis boundary. Compared to wild type mice (WT), enhanced expression of IL-33 was observed in the keratinocyte nuclei of hK14mIL33tg mice (Tg) skin.
  • WT wild type mice
  • Tg keratinocyte nuclei of hK14mIL33tg mice
  • Example 5 Tissue-specific expression analysis of IL-33 gene in hK14mIL33tg mice Expression of IL-33 gene in each organ of wild type mice and hK14mIL33tg mice was compared by qPCR. Data showed representative results from two experiments (FIG. 4). In hK14mIL33tg mice, it was suggested that IL-33 gene expression was selectively enhanced in the skin as compared with each organ.
  • infiltrative erythema with crusts, erosion, or desquamation is present on the face, especially around the eyes, around the nose, other neck, auricle, limbs, tail, etc. It occurred at the site where there was little and was easy to receive the stimulus from the outside world (FIG. 5).
  • the photograph shows representative findings of 24-28 week old mice.
  • Example 8 Hematoxylin and eosin staining findings of skin lesions in hK14mIL33tg mice Skin tissue of wild type mice (WT) and skin lesions of hK14mIL33tg mice (Tg) (both of the eyes) were stained with hematoxylin and eosin. A representative histological image of two experiments using three mice was shown (FIG. 7). In hK14mIL33tg mice, epidermal thickening and infiltration of inflammatory cells including eosinophils were observed in the dermis.
  • Example 9 Flow cytometric analysis of eosinophils in skin and peripheral blood of hK14mIL33tg mice Flow cytometric analysis of eosinophils infiltrating the skins of wild type mice (WT) and hK14mIL33tg mice (Tg) was performed. Representative data from 2 experiments with 4 mice are shown ( Figure 8).
  • the ratio of eosinophils is B220 - CD3 - CD45 + of skin cells, that is, leukocytes excluding T cells and B cells (neutrophils, eosinophils, basophils, mast cells, type 2 natural lymphocytes, etc. was calculated from the number of cells.
  • hK14mIL33tg mice In the skin, the eosinophil infiltration of CCR3 + Siglec-F + was significantly increased in hK14mIL33tg mice, which was an average of 7.4 times that of wild-type mice (FIG. 9). Similarly, flow cytometry analysis of peripheral blood cells of wild type mice (WT) and hK14mIL33tg mice (Tg) was performed. Representative data of 2 experiments using 4 mice are shown (FIGS. 10 and 11). Similarly, in peripheral blood, hK14mIL33tg mice showed a significant increase in eosinophils with an average value of 4.5 times that of wild-type mice.
  • RNA was prepared from the periocular skin and the expression of eosinophil markers eosinophil peroxidase (Epx) and eosinophil granule major basic protein gene (Prg2) were analyzed by quantitative real-time RT-PCR. .
  • Epx eosinophil peroxidase
  • Prg2 eosinophil granule major basic protein gene
  • Example 10 Toluidine Blue Staining Findings of Skin Lesions in hK14mIL33tg Mice Toluidine blue staining of skin tissues of wild type mice (WT) and skin lesions of hK14mIL33tg mice (Tg) (both eye circumferences). A representative histological image of two experiments using three mice was shown (FIG. 13). As a result of staining with toluidine blue, it was found that mast cells in the dermis increased in the dermatitis lesion tissue produced in hK14mIL33tg mice.
  • Example 11 Flow Cytometry Analysis of Mast Cells in hK14mIL33tg Mice Flow cytometric analysis of mast cells present in the skin of wild type mice (WT) or hK14mIL33tg mice (Tg) was performed (FIG. 14). The ratio of mast cells was calculated from flow cytometric analysis of cutaneous B220 ⁇ CD3 ⁇ cells (FIG. 15). It was revealed that mast cells that are c-kit + IgE + were significantly increased in lesioned skin of hK14mIL33tg mice compared to normal skin of wild-type mice.
  • Example 12 Analysis of blood histamine concentration and IgE concentration in hK14mIL33tg mice Plasma was collected from wild type mice (WT) and hK14mIL33tg mice (Tg), and histamine concentrations were measured by ELISA. Serum was collected from wild-type mice and hK14mIL33tg mice, and the total IgE concentration was measured by ELISA. The histamine concentration in plasma was 0.18 ⁇ M on average in wild-type mice, but was an extremely high value of 1.46 ⁇ M on average in hK14mIL33tg mice, suggesting activation of mast cells in hK14mIL33tg mice (FIG. 16).
  • the total IgE value in serum was 20 fold higher, with an average of 386 ng / mL in hK14mIL33tg mice compared to an average of 15 ng / mL in wild-type mice (FIG. 17).
  • Example 13 Analysis of scratching behavior in hK14mIL33tg mice With respect to wild-type mice (WT) and hK14mIL33tg mice (Tg), the skin scratching time (sec / min) in an arbitrary 20 minutes was measured. Compared to wild type mice, hK14mIL33tg mice showed a significant increase in scratching time, suggesting that itching of the skin was strong (FIG. 18). Furthermore, the effect of antihistamines on scratching behavior was examined. Diphenhydramine hydrochloride 2 mg was administered intraperitoneally to hK14mIL33tg mice. Thereby, the time of scratching behavior of mice observed from 20 minutes to 6 minutes after administration decreased from an average of 4.6 minutes to an average of 0.2 minutes (FIG. 19). It is suggested that mast cells may be involved as a cause of pruritus associated with dermatitis in hK14mIL33tg mice.
  • Example 14 Analysis of Cytokine and Chemokine Concentration in hK14mIL33tg Mice Eosinophils are induced by Th2 cytokines such as IL-5 and IL-13, RANTES / CCL5 which is a ligand that binds to the receptor CCR3 expressed by eosinophils, It is known to be controlled by chemokines such as Eotaxin-1 / CCL11. Therefore, the cytokine and chemokine concentrations in the serum and periocular skin extract of wild type mice (WT) and hK14mIL33tg mice (Tg) were comprehensively measured.
  • WT wild type mice
  • Tg hK14mIL33tg mice
  • hK14mIL33tg mice showed high levels of IL-5 in both serum and skin (FIGS. 20 and 21).
  • CCL2 and CCL4 increased in both serum and skin
  • CCL5 and CCL11 increased in skin (FIGS. 20 and 21).
  • these results suggested that these cytokines may play an important role in eosinophilic inflammation in hK14mIL33tg mice.
  • Th1 cytokines such as TNF- ⁇ and IFN- ⁇ , IL-12p40.
  • IL-18 For IL-18, TSLP, and IL-25, which are epithelial cell-derived cytokines that cause other allergic inflammation, there is a slight increase in IL-18 in skin lesions, as seen in other dermatitis model mice There was no increase in serum IL-18. TSLP and IL-25 were not significantly increased.
  • Example 15 Flow Cytometry Analysis of Skin Infiltrating Cells, Peripheral Blood Cells, or Lymph Node Cells in hK14mIL33tg Mice
  • type 2 natural lymphocytes are assumed as cells that produce IL-5 depending on IL-33.
  • Example 14 since the production of IL-5 and IL-13 was increased in hK14mIL33tg mice, it was examined whether the type 2 natural lymphocytes producing these cytokines were increased. Flow cytometric analysis of node-derived cells was performed.
  • Lin ⁇ ST2 + IL-5 + or Lin ⁇ ST2 + IL-13 + cells was calculated from flow cytometric analysis of Lin ⁇ cells (FIG. 24).
  • Tg lymph nodes of hK14mIL33tg mice
  • WT wild type mice
  • Example 16 Analysis of Effect of IL-5 Neutralizing Antibody Administration in hK14mIL33tg Mice
  • control IgG1 antibody (20 ⁇ g / animal) or IL -5 neutralizing antibody (20 ⁇ g / mouse) was administered intraperitoneally to hK14mIL33tg mice every 2 days for 2 weeks. Thereafter, flow cytometric analysis of peripheral blood cells of hK14mIL33tg mice was performed. Cells were gated on the B220 - CD3 - CD45 + fraction. Representative data from experiments performed with 4 mice are shown (FIG. 25).
  • the ratio of eosinophils obtained was calculated from flow cytometric analysis of peripheral blood cells of B220 ⁇ CD3 ⁇ CD45 + cells (FIG. 26).
  • eosinophilia in peripheral blood was significantly improved compared to the control group.
  • hematoxylin and eosin staining of the periocular skin tissue of hK14mIL33tg mice was performed.
  • a representative diagram of the experiment performed with 4 mice is shown (FIG. 27). In dermatitis lesions, epidermal thickening was improved, infiltrating cells were decreased, and eosinophil infiltration was also clearly improved.
  • IL-33 and eosinophil granule major basic protein gene (Prg2) were analyzed (FIG. 28).
  • IL-5 neutralizing antibody administration did not change the induction of IL-33 gene expression in the skin, but the expression of Prg2, a marker of eosinophils, was significantly reduced. Therefore, administration of IL-5 neutralizing antibody suppressed eosinophil infiltration into the skin in hK14mIL33tg mice. From the above, it was suggested that IL-5 produced from type 2 innate lymphocytes is important for eosinophilia in hK14mIL33tg mice.
  • Example 17 Inhibition of scratching behavior by steroid drugs in hK14mIL33tg mice
  • White petrolatum as a control and betamethasone butyrate propionate as a steroid were applied 5 times every 2 days to the skin area of hK14mIL33tg mice.
  • the skin eruption score was evaluated as none (0 points), mild (1 point), moderate (2 points), or severe (3 points) for pruritus, itch, erythema / bleeding, edema, epidermis detachment / ⁇ , desquamation / dryness. (Matsuda H et al., Int. Immunol, 9 (3): 461-466, 1997).
  • the total score of the skin eruption score decreased from an average of 12.3 points to 4.8 points after application, confirming a significant improvement (FIG. 29).
  • the Tg animal of the present invention is useful for the analysis of the pathogenesis and pathology of atopic dermatitis and the determination of the effect of a therapeutic drug for atopic dermatitis.
  • IL-33 was found to be an extremely important cytokine for the development of atopic dermatitis. In the future, it can be expected to be applied to elucidation of IL-33 production, extracellular release and activation mechanisms, and regulatory molecules that control this.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2013-096637 (filing date: May 1, 2013) filed in Japan, the contents of which are incorporated in full herein.

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Abstract

　本発明は、IL-33をコードするDNAを皮膚において特異的に発現可能な状態で保持するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、SPF(specific pathogen free）の飼育条件下で、対応する非トランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較して （１）皮膚炎を自然発症する、 （２）炎症細胞数が増加している、 （３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度が増加している、および （４）掻破行動時間が増加している からなる群から選択される特徴を１つ以上有する、非ヒト哺乳動物などを提供する。

Description

アトピー性皮膚炎モデル動物およびその用途
　本発明は、IL-33遺伝子を皮膚において特異的に発現可能な状態で保持するトランスジェニック非ヒト哺乳動物およびそれを用いたアトピー性皮膚炎予防・治療剤のスクリーニング方法または評価方法などに関する。
　アトピー性皮膚炎（Atopic Dermatitis）は、掻痒性、慢性反復性の炎症性皮膚病であり、遺伝的背景を有し、血清中において高いIgEレベルを伴うことを特徴とする。また、病変部には肥満細胞や好酸球が集まり、血中の好酸球も増加する。アトピー性皮膚炎発症のメカニズムは未だ完全には解明されていないが、活性化Ｔ細胞、好塩基球あるいは肥満細胞上のFcεRに結合したイムノグロブリン（以下、Igと記す）Ｅ分子の架橋によって誘導された好塩基球と肥満細胞との活性化の結果、Th2に関連したサイトカインとケミカルメディエーターの生成が起こることが重要と考えられる。上記サイトカインとは、インターロイキン（以下、ILと記す）-4、IL-13、IL-5であり、ケミカルメディエーターとはヒスタミン、セロトニン等である。この場合、特に好塩基球と肥満細胞の活性化には抗原特異的IgEが重要な役割を果たすが、抗原特異性が明確でない自然型アトピー性皮膚炎の場合は、その限りではなく、外的刺激や感染、IL-18などの関与が示唆されているが、詳細は不明である。
　遺伝子操作されたアトピー性皮膚炎モデルマウスとしては７系統〔IL-4 Tg、CASP1 Tg、IL-18 Tg、IL-31 Tg、Re1B-KO、CatE-KO（非特許文献１）、MAIL-KO（非特許文献２）〕が報告されている。
　しかし、遺伝子操作により作製されたアトピー性皮膚炎モデルマウスは実際のアトピー性皮膚炎の特徴を必ずしも反映していない。例えば、遺伝子操作により作製されたアトピー性皮膚炎モデルとして報告されたモデルの幾つかは、該遺伝子の高発現の局在がアトピー性皮膚炎患者皮膚では通常みられない遺伝子の発現増強モデルである（CASP1 Tg、IL-18 Tg、IL-4 Tg）、あるいは皮膚炎組織に好酸球も好中球もなく、IgEの数値に変動がない（IL-31 Tg）、などの特徴を持つことからヒトのアトピー性皮膚炎を必ずしも適切に反映する疾患モデルではないと考えられる。他にRelB-KOマウスは掻痒症状を呈さない、MAIL(IkBζ)-KOマウスは周産期致死率が非常に高く、皮膚炎症症状が激烈であるなどの点でアトピー性皮膚炎モデルとしては不完全である。従って、これらのモデルマウスをアトピー性皮膚炎の評価に用いる場合、実態を反映しないことが懸念される。
　ところで、近年においてはアトピー性皮膚炎の研究が進み、新たな知見がもたらされている。最近では、アトピー性皮膚炎患者の皮膚の表皮角化細胞の核内において、IL-33の発現が増加していることが報告されている（非特許文献３）。IL-33はIL-1βやIL-18と相同性の高いアミノ酸配列を有するIL-1ファミリーに属するサイトカインとして同定され、ST2をその受容体とする。ST2はTh2細胞やアレルギーに関わる細胞（好塩基球、肥満細胞、好酸球、２型自然リンパ球）上に発現することから、IL-33はTh2型アレルギー疾患に関与することが示唆されている。しかしながら、マウス組換え体IL-33を直接皮膚の真皮内に局所投与すると、真皮の膠原線維の増加を伴う強皮症様の反応が起こり、表皮の変化は伴わないとする報告(非特許文献４)と、表皮肥厚を伴う乾癬様の皮膚炎が起きる(非特許文献５)という報告があり、IL-33の皮膚への影響は明確ではなかった。かかる現状において、現在に至るまでIL-33を皮膚において高発現するトランスジェニック動物は存在しておらず、その表現型についても不明なままであった。
Gutermuth J et al. Int Arch Allergy Immunol, 2004, 135, 262-276 Shiina T et al. J Biol Chem. 2004, 279, 55493-55498 Savinko T et al. J Invest Dermatol, 2012, 132: 1392-1400 Rankin AL et al. J Immunol, 2010, 184:1526-1535 Hueber AJ et al. Eur J Immunol, 2011, 41:2229-2237
　本発明の目的は、IL-33遺伝子の生体内での機能を解明すべく、皮膚特異的に過剰発現するIL-33遺伝子導入非ヒト哺乳動物を作製し、解析することであり、さらに得られた該遺伝子導入非ヒト哺乳動物を用いて、アトピー性皮膚炎予防・治療薬のスクリーニング方法またはアトピー性皮膚炎予防・治療薬の評価方法を提供することである。
　本発明者らは、ケラチンプロモーターの制御下にマウスIL-33遺伝子を導入して、トランスジェニック（Tg）マウスを作製した。その結果、該Tgマウスでは、対応する非トランスジェニックマウスに比べて、SPF（specific pathogen free）（特定の病原微生物に感染していない状態）の飼育条件下で皮膚炎の自然発症、炎症細胞数の増加、総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度およびケモカイン濃度の増加、掻破行動時間の増加が認められた。即ち、本発明によるトランスジェニックマウスの特徴は、アトピー性皮膚炎患者において観察される所見と一致した。さらに、公知の抗ヒスタミン薬やステロイド薬によって掻破行動時間を低減させることに成功した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、
［１］IL-33をコードするDNAを皮膚において特異的に発現可能な状態で保持するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、SPF（specific pathogen free）の飼育条件下で、対応する非トランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較して
（１）皮膚炎を自然発症する、
（２）炎症細胞数が増加している、
（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度が増加している、および
（４）掻破行動時間が増加している
からなる群から選択される特徴を１つ以上有する、非ヒト哺乳動物；
［２］IL-33をコードするDNAがケラチンプロモーターの制御下にある、［１］に記載の非ヒト哺乳動物；
［３］ケラチンプロモーターがヒトケラチン14プロモーターである、［２］に記載の非ヒト哺乳動物；
［４］IL-33が配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する［１］～［３］のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物；
［５］炎症細胞が好酸球、肥満細胞および２型自然リンパ球からなる群から選択される細胞である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物；
［６］サイトカインがIL-4、IL-5またはIL-13である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物；
［７］ケモカインがCCL2、CCL4、CCL5またはCCL11である、［１］～［６］のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物；
［８］掻破行動時間または皮膚炎の症状が抗ヒスタミン薬またはステロイド薬によって低減することを特徴とする、［１］～［７］のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物；
［９］非ヒト哺乳動物がマウスである、［１］～［８］のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物；
［１０］SPF（specific pathogen free）の飼育条件下で、［１］～［９］のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物に試験化合物を適用し、（１）皮疹スコア、（２）炎症細胞数、（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度、および（４）掻破行動時間からなる群から選択される項目を１つ以上測定し、測定された前記項目を試験化合物非投与の場合と比べて改善させる試験物質を選択することを含む、アトピー性皮膚炎治療薬のスクリーニング方法；
［１１］SPF（specific pathogen free）の飼育条件下で、［１］～［９］のいずれか１つに記載の非ヒト哺乳動物にアトピー性皮膚炎の予防・治療薬を適用し、（１）皮疹スコア、（２）炎症細胞数、（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度、および（４）掻破行動時間からなる群から選択される項目を１つ以上測定し、測定された前記項目をアトピー性皮膚炎の予防・治療薬非投与の場合と比べる、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬の効果の評価方法；
を提供する。
　本発明のIL-33遺伝子導入非ヒト哺乳動物は、ヒトにおけるアトピー性皮膚炎の症状をより反映した表現型を示し、生体でのアトピー性皮膚炎におけるIL-33の役割の評価系として有用であり、さらにアトピー性皮膚炎の予防・治療剤のスクリーニング・薬効評価に用いることができる。
ヒトケラチン14プロモーター、ウサギβグロビンイントロン2、マウスIL-33 variant 1 cDNA、ヒトケラチン14 poly Aシグナルを含む4.0 kbの線状DNAの構造を示す図である。 IL-33遺伝子トランスジェニックマウスの耳組織におけるIL-33遺伝子の発現量比を示す図である。野生型マウスのIL-33遺伝子発現量を１とする。C1, C2：野生型マウス。#番号：hK14mIL33tg 初代遺伝子導入候補マウス。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の耳介皮膚におけるIL-33の発現解析を示す図である。目盛尺：50μm。 hK14mIL33tgマウスにおけるIL-33遺伝子の組織特異性発現解析を示す図である。野生型マウスに対するhK14mIL33tgマウスの各臓器におけるIL-33遺伝子の発現量の比を示す。皮膚で選択的にIL-33遺伝子が増加していることを示す。 hK14mIL33tgマウス(Tg)における皮膚炎の肉眼像を示す図である。WT：野生型マウス。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)における皮膚病変の発症経過と頻度を示す図である。有意差検定はログ・ランクテスト(two-sided) で行い、P<0.001と有意であった。 野生型マウス(WT)の皮膚組織とhK14mIL33tgマウス(Tg)の皮膚病変組織（いずれも眼囲）のヘマトキシリン・エオシン染色像を示す図である。目盛尺;200μm;50μm（差込図）。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の眼囲皮膚細胞のフローサイトメトリー解析を示す図である。数値は、CCR3+Siglec-F+細胞（好酸球）の割合を示す。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の眼囲皮膚細胞におけるCCR3+Siglec-F+細胞（好酸球）の割合を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=4) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の末梢血細胞のフローサイトメトリー解析を示す図である。数値は、CCR3+Siglec-F+細胞（好酸球）の割合を示す。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の末梢血細胞におけるCCR3+Siglec-F+細胞（好酸球）の割合を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=4) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の眼囲皮膚における好酸球ペルオキシダーゼ遺伝子(Epx)および好酸球顆粒主要塩基性タンパク質遺伝子(Erg2)の発現を定量的リアルタイムRT-PCRで解析した図を示す。平均±標準誤差(n=5) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)の皮膚組織とhK14mIL33tgマウス(Tg)の皮膚病変組織（いずれも眼囲）のトルイジンブルー染色像を示す図である。目盛尺;50μm。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の眼囲皮膚細胞のフローサイトメトリー解析を示す図である。数値は、c-kit+IgE+細胞（肥満細胞）の比率を示す。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の眼囲皮膚細胞におけるc-kit+IgE+細胞（肥満細胞）の割合を示す図である。データは、平均±標準誤差 (n = 4) *P<0.05 (検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の血漿中のヒスタミン濃度を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=4) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の血清中の総IgE濃度を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=4) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の任意の20分間における皮膚掻破時間(sec/min) を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=3) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 ジフェンヒドラミン塩酸塩投与前後のhK14mIL33tgマウスの任意の20分間における皮膚掻破時間(sec/min)を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=3) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の血清中の各ケモカイン、サイトカイン濃度を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=6) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の皮膚抽出液中の各ケモカイン、サイトカイン濃度を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=6) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)の皮膚、末梢血およびリンパ節細胞のフローサイトメトリー解析を示す図である。数値は、FSC低値SSC低値の細胞（リンパ球をゲート）のフローサイトメトリー解析から計算したLin- ST2+Sca-1+ 細胞（２型自然リンパ球）の比率を示す。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)のリンパ節細胞のフローサイトメトリー解析を示す図である。数値は、フローサイトメトリー解析から計算したST2+IL-5+またはST2+IL-13+細胞の比率を示す。 野生型マウス(WT)およびhK14mIL33tgマウス(Tg)のリンパ節細胞のIL-5あるいはIL-13を産生する２型自然リンパ球の割合を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=3) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 IL-5中和抗体または対照IgG抗体投与後のhK14mIL33tgマウスの末梢血細胞のフローサイトメトリー解析を示す図である。数値は、CCR3+ Siglec-F+細胞（好酸球）の比率である。 IL-5中和抗体または対照IgG抗体投与後のhK14mIL33tgマウスの末梢血細胞におけるCCR3+Siglec-F+細胞（好酸球）の割合を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=4) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 IL-5中和抗体または対照IgG抗体投与後のhK14mIL33tgマウスの眼囲皮膚組織のヘマトキシリン・エオシン染色像を示す図である。目盛尺;50μm。 IL-5中和抗体または対照IgG抗体投与後のhK14mIL33tgマウスの皮膚におけるIL33遺伝子およびPrg2遺伝子発現変動を示す図である。データは、平均±標準誤差(n=4) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。 白色ワセリンまたはベタメタゾン酪酸エステルプロピオン酸エステル塗布前後のhK14mIL33tgマウスの皮疹スコアを示す図である。■：白色ワセリン。●：ベタメタゾン酪酸エステルプロピオン酸エステル。データは、平均±標準誤差(n=4) *P<0.05(検定はStudent’s t-テストによる)。
　IL-33をコードするDNAを皮膚において特異的に発現可能な状態で保持するトランスジェニック非ヒト哺乳動物（以下、「本発明のTg動物」という場合もある）は、IL-33をコードするDNAを皮膚において特異的に発現可能な状態で安定に保持する。「安定に保持」するとは、該動物の細胞内にIL-33をコードするDNAが皮膚において特異的に発現可能な状態で永続的に存在することを意味し、該DNAが宿主染色体上に組み込まれていても、あるいは染色体外DNAとして安定に存在していてもよいが、好ましくは、該DNAは宿主染色体上に組み込まれた状態で保持される。
　本発明のTg動物は、非ヒト哺乳動物の受精卵や、未受精卵、精子およびその前駆細胞（始原生殖細胞、卵原細胞、卵母細胞、卵細胞、精原細胞、精母細胞、精細胞等）などに、好ましくは受精卵の胚発生の初期段階（さらに好ましくは8細胞期以前）において、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、DEAE-デキストラン法などの遺伝子導入法によって、目的とするIL-33をコードするDNAを導入することにより作製される。また、該遺伝子導入法により、非ヒト哺乳動物の体細胞、組織、臓器などに目的とするDNAを導入し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、この細胞を上述の胚（もしくは生殖）細胞と公知の細胞融合法を用いて融合させることによりTg動物を作製することもできる。あるいは、ノックアウト動物を作製する場合と同様に、非ヒト哺乳動物の胚性幹細胞（ES細胞）に上記の遺伝子導入法を用いて目的とするDNAを導入し、予め該DNAが安定に組み込まれたクローンを選択した後に、該ES細胞を胚盤胞に注入するかあるいはES細胞塊と8細胞期胚とを凝集させてキメラ非ヒト哺乳動物を作製し、生殖系列に導入DNAが伝達されたものを選択することによってもTg動物を得ることが可能である。
　また、このようにして作製されたTg動物の生体の一部（例えば、(1) IL-33をコードするDNAを安定に保持する細胞、組織、臓器など、(2)これらに由来する細胞または組織を培養し、必要に応じて継代したものなど）も、本発明の「IL-33をコードするDNAを皮膚において特異的に発現可能な状態で保持する非ヒト哺乳動物の生体の一部」として、本発明の「IL-33をコードするDNAを発現可能な状態で保持する非ヒト哺乳動物」と同様な目的に用いることができる。
　本発明のTg動物の生体の一部としては、皮膚や、皮膚由来の組織片（例えば、表皮）および細胞（例えば、表皮角化細胞）などが好ましく例示される。
　本発明で対象とし得る「非ヒト哺乳動物」は、トランスジェニック系が確立されたヒト以外の哺乳動物であれば特に制限はなく、例えば、マウス、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスターなどが挙げられる。好ましくは、マウス、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター等であり、なかでも疾患モデル動物作製の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、繁殖が容易なマウス（例えば、純系としてC57BL/6系統、DBA2系統など、交雑系としてB6C3F1系統、BDF1系統、B6D2F1系統、BALB/c系統、ICR系統など）が好ましい。
　また、哺乳動物以外にもニワトリなどの鳥類が本発明で対象とする「非ヒト哺乳動物」と同様の目的に用いることができる。
　「IL-33をコードするDNA」は、導入対象の非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）由来のIL-33 DNAであってもよいし、異種哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラットなど）由来のIL-33もしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAであってもよい。好ましくは、本発明のIL-33をコードするDNAは、導入対象の非ヒト哺乳動物のIL-33もしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAであり、より好ましくはマウスIL-33もしくはそれと実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするDNAである。マウスIL-33をコードするDNAとしては、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列をコードするDNA、好ましくは配列番号：１で表わされる塩基配列を含むDNAが挙げられる。「実質的に同一のアミノ酸配列」としては、例えばマウスIL-33の場合、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と約90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは約98%以上の同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。アミノ酸配列の同一性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。
　「実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質」としては、例えばマウスIL-33の場合、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含み、配列番号：２で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が好ましい。「実質的に同質の活性」としては、例えば、（１）皮膚炎誘導活性、（２）真皮層への炎症細胞の遊走誘導活性、（３）血清中の総IgE増大活性、（４）血漿中のヒスタミン増大活性、（５）サイトカイン、ケモカイン増大活性および（６）掻破行動惹起活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が定性的に同等であることを示す。したがって、該活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度（例、約0.01～100倍、好ましくは約0.5～20倍、より好ましくは約0.5～2倍）は異なっていてもよい。該活性の測定は、自体公知の方法に準じて行なうことができる。また、後述する実施例の通りに測定することもできる。
　IL-33をコードするDNAは、例えば配列番号：１で表わされる塩基配列を含むDNAのように、イントロンを含まない形態（即ち、相補DNA）であることが好ましいが、イントロンの5’および3’末端配列はほとんどの真核生物遺伝子で共通であるので、別の実施態様においてはイントロンを含む形態（即ち、ゲノムDNA）もまた、好ましく用いられ得る。
　IL-33をコードするDNAは、ヒトや各種非ヒト哺乳動物（ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）の組織などに由来するDNAおよび市販の各種ゲノムDNAライブラリーに由来するゲノムDNAの全てあるいは一部を原料として用い、あるいはヒトや各種非ヒト哺乳動物の組織などに由来するRNAから公知の方法により調製されたcDNAを原料として用い、公知のIL-33遺伝子配列をもとに作製したオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして、ハイブリダイゼーション法もしくはPCR法などにより単離することができる。
　本発明のTg動物は、IL-33をコードするDNAを「皮膚において特異的に発現可能な状態で」保持している。したがって、当該DNAを対象動物に導入するにあたっては、当該DNAを対象動物の皮膚内で特異的に機能し得るプロモーターの下流に連結した発現カセットを含む形態（例、発現ベクターなど）で用いるのが一般に有利である。
　IL-33をコードするDNAを担持するベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物もしくは昆虫ウイルスなどが用いられる。なかでも、プラスミド（好ましくは大腸菌由来、枯草菌由来または酵母由来、特に大腸菌由来のプラスミド）や、動物ウイルス（好ましくはレトロウイルス、レンチウイルス）が好ましい。
　IL-33遺伝子の皮膚において特異的な発現調節を行うプロモーターとしては、例えば、各種哺乳動物（ヒト、ウシ、サル、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）および鳥類（ニワトリなど）に由来する皮膚において特異的に発現調節される遺伝子のプロモーターなどが挙げられ、好ましくはヒトまたはマウス由来のプロモーターが挙げられ、より好ましくはヒト由来のプロモーターである。皮膚において特異的に発現調節される遺伝子のヒト由来プロモーターとしては、例えばケラチンプロモーターが挙げられる。ヒトケラチンは、54種類のサブタイプに分類され、各サブタイプはTypeIケラチンとTypeIIケラチンに大別される。TypeIケラチンとしてはケラチン９、１０、１２～２０、２３～２８、３１～４０が挙げられ、TypeIIケラチンとしてはケラチン１～８、７１～８６が挙げられる。従って、ヒト由来ケラチンプロモーターとしては、これらケラチン１プロモーターからケラチン８６プロモーターが挙げられるが、本発明においては、ケラチン１４プロモーター(GenBank AC105208.15の46730-47216)が好ましく用いられる。その他、ケラチン５プロモーター、また、前記ヒトケラチンの他の非ヒト哺乳動物におけるオルソログに含まれるプロモーターを用いることもできる。
　IL-33をコードするDNAの下流には、Tg動物において目的とするメッセンジャーRNAの転写を終結させる配列（ポリアデニレーション(polyA)シグナル、ターミネーターとも呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス遺伝子由来、あるいは各種哺乳動物または鳥類の遺伝子由来のターミネーター配列を用いて、効率よい導入遺伝子の発現を達成することができる。本発明においては、ヒトケラチン１４polyAシグナルが好ましく用いられる。また、ヒト成長ホルモンpolyAシグナル、SV40ウイルスpolyAシグナルなどを用いることもできる。IL-33遺伝子をさらに高発現させる目的で、真核遺伝子のイントロンの一部を、プロモーター領域の5’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3’下流に連結することも可能である。そのような場合に用いられるイントロン配列としては、例えば、ウサギβグロビンイントロン２などが挙げられる。その他、ウサギβグロビンとIgGのキメライントロン、ＣＭＶイントロン、ＳＶ４０イントロンなども用いることもできる。各遺伝子のスプライシングシグナル、エンハンサー領域を、プロモーター領域の5’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3’下流に連結することも可能である。
　また、胚性幹細胞（ES細胞）を用いてTg動物を作製する場合、上記のベクターは、導入DNAが安定に組み込まれたクローンを選択するための選択マーカー遺伝子（例：ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などの薬剤耐性遺伝子）をさらに含むことが好ましい。
　上記のプロモーター、イントロン、IL-33をコードするDNA、polyAシグナルなどは、適当な制限酵素およびDNAリガーゼ等を用いた通常の遺伝子工学的手法により、上記のベクター中に正しい配置で、即ちTg動物においてIL-33を皮膚において特異的に発現可能な配置で、挿入することができる。例えば、後述する実施例において用いられるように、５’側からケラチンプロモーター、イントロン、IL-33をコードするDNA、polyAシグナルの順番に連結されることが好ましい。より好ましくは、ベクター中において５’側からケラチン１４プロモーター、ウサギβグロビンイントロン２、配列番号：１の塩基配列を有するIL-33をコードするDNA、ヒトケラチン１４polyAシグナルの順番に連結される。
　好ましい一実施態様においては、上記のようにして得られるIL-33をコードするDNAを含む発現ベクターは、マイクロインジェクション法により対象となる非ヒト哺乳動物の初期胚に導入される。
　対象非ヒト哺乳動物の初期胚は、同種の非ヒト哺乳動物の雌雄を交配させて得られる体内受精卵を採取するか、あるいは同種の非ヒト哺乳動物の雌雄からそれぞれ採取した卵と精子を体外受精させることにより得ることができる。
　用いる非ヒト哺乳動物の齢や飼育条件等は動物種によってそれぞれ異なるが、例えばマウス（好ましくはC57BL/6J（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）を用いる場合は、雌が約4～約6週齢、雄が約2～約8ヶ月齢程度のものが好ましく、また、約12時間明期条件（例えば7:00-19:00）で約1週間飼育したものが好ましい。
　体内受精は自然交配によってもよいが、性周期の調節と1個体から多数の初期胚を得ることを目的として、雌非ヒト哺乳動物に性腺刺激ホルモンを投与して過剰排卵を誘起した後、雄非ヒト哺乳動物と交配させる方法が好ましい。雌非ヒト哺乳動物の排卵誘発法としては、例えば初めに卵胞刺激ホルモン（妊馬血清性性腺刺激ホルモン、一般にPMSGと略する）、次いで黄体形成ホルモン（ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、一般にhCGと略する）を、例えば腹腔内注射などにより投与する方法が好ましいが、好ましいホルモンの投与量、投与間隔は非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはC57BL/6J（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）の場合は、通常、卵胞刺激ホルモン投与後、約48時間後に黄体形成ホルモンを投与し、直ちに雄マウスと交配させることにより受精卵を得る方法が好ましく、卵胞刺激ホルモンの投与量は約20～約50IU/個体、好ましくは約30IU/個体、黄体形成ホルモンの投与量は約0～約10IU/個体、好ましくは約5IU/個体である。
　一定時間経過後、膣栓の検査等により交配を確認した雌非ヒト哺乳動物の腹腔を開き、卵管から受精卵を取り出して胚培養用培地（例：M16培地、修正Whitten培地、BWW培地、M2培地、WM-HEPES培地、BWW-HEPES培地等）中で洗って卵丘細胞を除き、微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下でDNA顕微注入まで培養する。直ちに顕微注入を行わない場合、採取した受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
　一方、体外受精の場合は、採卵用雌非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）に上記と同様に卵胞刺激ホルモンおよび黄体形成ホルモンを投与して排卵を誘発させた後、卵子を採取して受精用培地（例：TYH培地）中で体外受精時まで微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下で培養する。他方、同種の雄非ヒト哺乳動物（体内受精の場合と同様のものが好ましく用いられる）から精巣上体尾部を取り出し、精子塊を採取して受精用培地中で前培養する。前培養終了後の精子を卵子を含む受精用培地に添加し、微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下で培養した後、2個の前核を有する受精卵を顕微鏡下で選抜する。直ちにDNAの顕微注入を行わない場合は、得られた受精卵を緩慢法または超急速法等で凍結保存することも可能である。
　受精卵へのDNAの顕微注入は、マイクロマニピュレーター等の公知の装置を用いて常法に従って実施することができる。簡潔に言えば、胚培養用培地の微小滴中に入れた受精卵をホールディングピペットで吸引して固定し、インジェクションピペットを用いてDNA溶液を雄性もしくは雌性前核、好ましくは雄性前核内に直接注入する。導入DNAはCsCl密度勾配超遠心または陰イオン交換樹脂カラム等で高度に精製したものを用いることが好ましい。また、導入DNAは制限酵素を用いてベクター部分を切断し、直鎖状にしておくことが好ましい。
　DNA導入後の受精卵は胚培養用培地中で微小滴培養法等により5%炭酸ガス/95%大気下で1細胞期～胚盤胞期まで培養した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植される。受胚用雌非ヒト哺乳動物は移植される初期胚が由来する動物と同種のものであればよく、例えば、マウス初期胚を移植する場合は、ICR系の雌マウス（好ましくは約8～約10週齢）などが好ましく用いられる。受胚用雌非ヒト哺乳動物を偽妊娠状態にする方法としては、例えば、同種の精管切除（結紮）雄非ヒト哺乳動物（例えば、マウスの場合、ICR系の雄マウス（好ましくは約2ヶ月齢以上））と交配させて、膣栓の存在が確認されたものを選択する方法が知られている。
　受胚用雌は自然排卵のものを用いてもよいし、あるいは精管切除（結紮）雄との交配に先立って、黄体形成ホルモン放出ホルモン（一般にLHRHと略する）もしくはその類縁体を投与し、受精能を誘起させたものを用いてもよい。LHRH類縁体としては、例えば、[3,5-DiI-Tyr5]-LH-RH、[Gln8]-LH-RH、[D-Ala6]-LH-RH、[des-Gly10]-LH-RH、[D-His(Bzl)6]-LH-RHおよびそれらのEthylamideなどが挙げられる。LHRHもしくはその類縁体の投与量、ならびにその投与後に雄非ヒト哺乳動物と交配させる時期は、非ヒト哺乳動物の種類によりそれぞれ異なる。例えば、非ヒト哺乳動物がマウス（好ましくはICR系のマウスなど）の場合には、通常、LHRHもしくはその類縁体を投与した後、約4日目に雄マウスと交配させることが好ましく、LHRHあるいはその類縁体の投与量は、通常、約10～60μg/個体、好ましくは約40μg/個体である。
　通常、移植される初期胚が桑実胚期以後の場合は受胚用雌の子宮に、それより前（例えば、1細胞期～8細胞期胚）であれば卵管に胚移植される。受胚用雌は、移植胚の発生段階に応じて偽妊娠からある日数が経過したものが適宜使用される。例えばマウスの場合、2細胞期胚を移植するには偽妊娠後約0.5日の雌マウスが、胚盤胞期胚を移植するには偽妊娠後約2.5日の雌マウスが好ましい。受胚用雌を麻酔（好ましくはAvertin、ネンブタール等が使用される）後、切開して卵巣を引き出し、胚培養用培地に懸濁した初期胚（約5～約10個）を胚移植用ピペットを用いて、卵管腹腔口もしくは子宮角の卵管接合部付近に注入する。
　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開により仔非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（例えばマウスの場合、通常に交配・分娩した雌マウス（好ましくはICR系の雌マウス等））に哺乳させることができる。
　受精卵細胞段階におけるIL-33をコードするDNAの導入は、導入DNAが対象非ヒト哺乳動物の生殖系列細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。導入DNAが染色体DNAに組み込まれているか否かは、例えば、産仔の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定することができる。上記のようにして得られる仔非ヒト哺乳動物（F0）の生殖系列細胞においてIL-33をコードするDNAが存在することは、その後代（F1）の動物全てが、その生殖系列細胞および体細胞のすべてにIL-33をコードするDNAが存在することを意味する。
　通常、F0動物は相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のF0個体は相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。従って、相同染色体の両方にIL-33をコードするDNAを有するホモ接合体を得たい場合には、F0動物と非トランスジェニック動物とを交雑してF1動物を作製し、相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。1遺伝子座にのみ導入DNAが組み込まれていれば、得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
　別の一実施態様においては、IL-33をコードするDNAを含む発現ベクターは、エレクトロポレーション法等の公知の遺伝子導入法により対象となる非ヒト哺乳動物のES細胞に導入される。
　ES細胞は胚盤胞期の受精卵の内部細胞塊（ICM）に由来し、インビトロで未分化状態を保ったまま培養維持できる細胞をいう。ICMの細胞は将来、胚本体を形成する細胞であり、生殖細胞を含むすべての組織の基になる幹細胞である。ES細胞としては、既に樹立された細胞株を用いてもよく、また、EvansとKaufmanの方法（ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年）に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスES細胞の場合、現在、一般的には129系マウス由来のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で、例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス（C57BL/6とDBA/2とのF1）から樹立されるES細胞なども良好に用いることができる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これ由来のES細胞は疾患モデルマウスを作製したとき、C57BL/6マウスと戻し交雑することでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
　ES細胞の調製は、例えば以下のようにして行うことができる。交配後の雌非ヒト哺乳動物［例えばマウス（好ましくはC57BL/6J（B6）などの近交系マウス、B6と他の近交系とのF1など）を用いる場合は、約2ヶ月齢以上の雄マウスと交配させた約8～約10週齢程度の雌マウス（妊娠約3.5日）が好ましく用いられる］の子宮から胚盤胞期胚を採取して（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、胚培養用培地中で上記と同様にして胚盤胞期まで培養してもよい）、適当なフィーダー細胞（例えばマウスの場合、マウス胎仔から調製される初代線維芽細胞や公知のSTO線維芽細胞株等）層上で培養すると、胚盤胞の一部の細胞が集合して将来胚に分化するICMを形成する。この内部細胞塊をトリプシン処理して単細胞を解離させ、適切な細胞密度を保ち、培地交換を行いながら、解離と継代を繰り返すことによりES細胞が得られる。
　ES細胞は雌雄いずれを用いてもよいが、通常雄のES細胞の方が生殖系列キメラを作製するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、PCR法によりY染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その1例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約106個の細胞数を要していたのに対して、1コロニー程度のES細胞数（約50個）で済むので、培養初期におけるES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
　また、第二次セレクションとして、例えば、G-バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるES細胞の染色体数は正常数の100%が望ましいが、細胞株樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞への遺伝子導入の後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が2n=40である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
　このようにして得られるES細胞株は、未分化幹細胞の性質を維持するために注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO線維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上で、分化抑制因子として知られるLIF（1～10,000U/ml）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、5%炭酸ガス/95%空気または5%酸素/5%炭酸ガス/90%空気）で約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液（通常0.001～0.5%トリプシン/0.1～5mM EDTA、好ましくは約0.1%トリプシン/1mM EDTA）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1～3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
　ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M. J. Evans及びM. H. Kaufman, ネイチャー（Nature）第292巻、154頁、1981年；G. R. Martin, プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.）第78巻、7634頁、1981年；T. C. Doetschmanら, ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のIL-33をコードするDNAを導入されたES細胞を分化させて得られるIL-33を皮膚において特異的に発現する非ヒト哺乳動物細胞は、生体におけるIL-33の細胞生物学的検討において有用である。
　ES細胞への遺伝子導入には、リン酸カルシウム共沈殿法、電気穿孔（エレクトロポレーション）法、リポフェクション法、レトロウイルス感染法、凝集法、顕微注入（マイクロインジェクション）法、遺伝子銃（パーティクルガン）法、DEAE-デキストラン法などのいずれも用いることができるが、簡便に多数の細胞を処理できること等の点からエレクトロポレーション法が一般的に選択されている。エレクトロポレーションには通常の動物細胞への遺伝子導入に使用されている条件をそのまま用いればよく、例えば、対数増殖期にあるES細胞をトリプシン処理して単一細胞に分散させた後、106～108細胞/mlとなるように培地に懸濁してキュベットに移し、IL-33をコードするDNAを含むベクターを10～100μg添加し、200～600V/cmの電気パルスを印加することにより行なうことができる。
　導入DNAが組み込まれたES細胞は、単一細胞をフィーダー細胞上で培養して得られるコロニーから分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることによっても検定することができるが、ES細胞を用いるトランスジェニック系の最大の長所は、薬剤耐性遺伝子やレポーター遺伝子の発現を指標として細胞段階で形質転換体を選択できることである。したがって、ここで使用される導入ベクターは、IL-33をコードするDNAを含む発現カセットに加えて、薬剤耐性遺伝子（例：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII（nptII）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）遺伝子など）やレポーター遺伝子（例：β-ガラクトシダーゼ（lacZ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（cat）遺伝子など）等の選択マーカー遺伝子をさらに含むことが望ましい。例えば、選択マーカー遺伝子としてnptII遺伝子を含むベクターを用いた場合、遺伝子導入処理後のES細胞をG418などのネオマイシン系抗生物質を含有する培地中で培養し、出現した耐性コロニーをそれぞれ培養プレートに移してトリプシン処理、培地交換を繰り返した後、一部を培養用として残し、残りをPCRもしくはサザンハイブリダイゼーションにかけて導入DNAの存在を確認する。
　導入DNAの組込みが確認されたES細胞を同種の非ヒト哺乳動物由来の胚内に戻すと、宿主胚のICMに組み込まれてキメラ胚が形成される。これを仮親（受胚用雌）に移植してさらに発生を続けさせることにより、キメラトランスジェニック動物が得られる。キメラ動物の中でES細胞が将来卵や精子に分化する始原生殖細胞の形成に寄与した場合には、生殖系列キメラが得られることとなり、これを交配することにより導入DNAが遺伝的に固定されたTg動物を作製することができる。
　キメラ胚の作製方法としては、桑実胚期までの初期胚同士を接着させて集合させる方法（集合キメラ法）と、胚盤胞の割腔内に細胞を顕微注入する方法（注入キメラ法）とがある。ES細胞によるキメラ胚の作製においては従来より後者が広く行なわれているが、最近では、8細胞期胚の透明帯内へのES細胞の注入により集合キメラを作る方法や、マイクロマニピュレーターが不要で操作が容易な方法として、ES細胞塊と透明帯を除去した8細胞期胚とを共培養して凝集させることによって集合キメラを作製する方法も行われている。　いずれの場合も、宿主胚は受精卵への遺伝子導入における採卵用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物から同様にして採取することができるが、例えばマウスの場合、キメラマウス形成へのES細胞の寄与率を毛色（コートカラー）で判定し得るように、ES細胞の由来する系統とは毛色の異なる系統のマウスから宿主胚を採取することが好ましい。例えば、ES細胞が129系マウス（毛色：アグーチ）由来であれば、採卵用雌としてC57BL/6マウス（毛色：ブラック）やICRマウス（毛色：アルビノ）を用い、ES細胞がC57BL/6もしくはDBF1マウス（毛色：ブラック）由来やTT2細胞（C57BL/6とCBAとのF1（毛色：アグーチ）由来）であれば、採卵用雌としてICRマウスやBALB/cマウス（毛色：アルビノ）を用いることができる。
　また、生殖系列キメラ形成能はES細胞と宿主胚との組み合わせに大きく依存するので、生殖系列キメラ形成能の高い組み合わせを選択することがより好ましい。例えばマウスの場合、129系統由来のES細胞に対してはC57BL/6系統由来の宿主胚等を用いることが好ましく、C57BL/6系統由来のES細胞に対してはBALB/c系統由来の宿主胚等が好ましい。
　採卵用雌マウスは約4～約6週齢程度が好ましく、交配用の雄マウスとしては約2～約8ヶ月齢程度の同系統のものが好ましい。交配は自然交配によってもよいが、好ましくは性腺刺激ホルモン（卵胞刺激ホルモン、次いで黄体形成ホルモン）を投与して過剰排卵を誘起した後に行なわれる。
　胚盤注入法による場合は、胚盤胞期胚（例えばマウスの場合、交配後約3.5日）を採卵用雌の子宮から採取し（あるいは桑実胚期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で胚盤胞期まで培養してもよい）、マイクロマニピュレーターを用いて胚盤胞の割腔内にIL-33をコードするDNAが導入されたES細胞（約10～約15個）を注入した後、偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。受胚用雌非ヒト哺乳動物は受精卵への遺伝子導入における受胚用雌として使用され得る非ヒト哺乳動物を同様に用いることができる。
　共培養法による場合は、8細胞期胚および桑実胚（例えばマウスの場合、交配後約2.5日）を採卵用雌の卵管および子宮から採取して（あるいは8細胞期以前の初期胚を卵管から採取した後、上述の胚培養用培地中で8細胞期または桑実胚期まで培養してもよい）酸性タイロード液中で透明帯を溶解した後、ミネラルオイルを重層した胚培養用培地の微小滴中にIL-33をコードするDNAが導入されたES細胞塊（細胞数約10～約15個）を入れ、さらに上記8細胞期胚または桑実胚（好ましくは2個）を入れて一晩共培養する。得られた桑実胚または胚盤胞を上記と同様にして受胚用雌非ヒト哺乳動物の子宮内に移植する。
　移植胚が首尾よく着床し受胚雌が妊娠すれば、自然分娩もしくは帝王切開によりキメラ非ヒト哺乳動物が得られる。自然分娩した受胚雌にはそのまま哺乳を継続させればよく、帝王切開により出産した場合は、産仔は別途用意した哺乳用雌（通常に交配・分娩した雌非ヒト哺乳動物）に哺乳させることができる。
　生殖系列キメラの選択は、まずES細胞の雌雄が予め判別されている場合はES細胞と同じ性別のキメラマウスを選択し（通常は雄性ES細胞が使用されるので、雄キメラマウスが選択される）、次いで毛色等の表現型からES細胞の寄与率が高いキメラマウス（例えば、50%以上）を選択する。例えば、129系マウス由来の雄性ES細胞であるD3細胞とC57BL/6マウス由来の宿主胚とのキメラ胚から得られるキメラマウスの場合、アグーチの毛色の占める割合の高い雄マウスを選択するのが好ましい。選択されたキメラ非ヒト哺乳動物が生殖系列キメラであるか否かの確認は、適当な系統の同種動物との交雑により得られるF1動物の表現型に基づいて行なうことができる。例えば、上記キメラマウスの場合、アグーチはブラックに対して優性であるので、雌C57BL/6マウスと交雑すると、選択された雄マウスが生殖系列キメラであれば得られるF1の毛色はアグーチとなる。
　上記のようにして得られるIL-33をコードするDNAが導入された生殖系列キメラ非ヒト哺乳動物（ファウンダー）は、通常、相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体として得られる。また、個々のファウンダーは相同組換えによらない限り異なる染色体上にランダムに挿入される。相同染色体の両方にIL-33をコードするDNAを有するホモ接合体を得るためには、上記のようにして得られるF1動物のうち相同染色体の一方にのみ導入DNAを有するヘテロ接合体の兄妹同士を交雑すればよい。ヘテロ接合体の選択は、例えばF1動物の尾部より分離抽出した染色体DNAをサザンハイブリダイゼーションまたはPCR法によりスクリーニングすることにより検定することができる。1遺伝子座にのみ導入DNAが組み込まれていれば、得られるF2動物の1/4がホモ接合体となる。
　発現ベクターとしてウイルスを用いる場合の別の好ましい一実施態様として、IL-33をコードするDNAを含むウイルスで、非ヒト哺乳動物の初期胚もしくはES細胞を感染させる方法が挙げられる（例えば、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第99巻, 第4号, 第2140-2145頁, 2002年参照）。例えば、レトロウイルスやレンチウイルスを用いる場合、ディッシュなどの適当な培養器に細胞（受精卵は透明帯を除いておくことが好ましい）を播き、培養液にウイルスベクターを加えて（所望によりポリブレンを共存させてもよい）、1～2日間培養後、初期胚であれば、上述のように偽妊娠させた受胚用雌非ヒト哺乳動物の卵管または子宮内に移植し、ES細胞であれば、上述のようにG418やハイグロマイシンなどの選択薬剤を添加して培養を続け、ベクターが組み込まれた細胞を選択する。
　さらに、プロシーディングズ・オヴ・ナショナル・アカデミー・オヴ・サイエンシーズ・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）第98巻, 第13090-13095頁, 2001年に記載されるように、雄非ヒト哺乳動物から採取した精原細胞をSTOフィーダー細胞と共培養する間にウイルスベクターに感染させた後、雄性不妊非ヒト哺乳動物の精細管に注入して雌非ヒト哺乳動物と交配させることにより、効率よくIL-33へテロTg（+/-）産仔を得ることができる。
　本発明のTg動物は、SPFの飼育条件下で、対応する非トランスジェニック動物と比較して、以下の特性：
（１）皮膚炎を自然発症する、
（２）炎症細胞数が増加している、
（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度が増加している、および
（４）掻破行動時間が増加している
からなる群から選択される特徴を１つ以上有することを特徴とする。
　アトピー性皮膚炎患者は、表皮角化細胞において健常者の該細胞よりも、IL-33の発現強度が高い（非特許文献３）。また、ヒトのアトピー性皮膚炎患者の皮疹部においてIL-5遺伝子発現が亢進しており(Corren J, Discov Med 13:305-12, 2012)、血中の好酸球増多がみられない患者でも皮疹部には好酸球浸潤が認められる(Kiehl P et al., Br J Dermatol. 145:720-9, 2001)。さらに、アトピー性皮膚炎患者においては、肥満細胞の活性化に伴い、ヒスタミン濃度、IgE濃度の増加が見られる。
　一方、上記の本発明のTg動物も、皮膚において顕著に高いレベルのIL-33発現を確認することができると共に、その表現型も、アトピー性皮膚炎患者の有する特徴と一致する。後述する実施例では、本発明のTg動物がTgマウスであった場合、SPFの飼育条件下で６週齢から一部のTgマウスが皮膚炎を発症し、８週齢以降では全てTgマウスが皮膚炎を自然発症した。また、炎症細胞（特に好酸球、肥満細胞、２型自然リンパ球（type 2 innate lymphoid cells））について、皮膚、末梢血またはリンパ節において有意な増加を認めた。さらに、血清中の総IgE濃度についても、野生型マウスと比較して有意に増加し、また、血漿中のヒスタミン濃度についても、野生型マウスと比較して有意に増加した。サイトカインとして、IL-4、IL-13が皮膚中で、IL-5が、皮膚、血清中で野生型マウスと比較して有意に増加した。また、ケモカインについてCCL5、CCL11が皮膚中で、CCL2、CCL4が皮膚、血清中で野生型マウスと比較して有意に増加した。加えて、野生型マウスと比較して掻破行動時間が有意に増加し、抗ヒスタミン薬（ジフェンヒドラミン塩酸塩）やステロイド薬（ベタメタゾン酪酸エステルプロピオン酸エステル）によって増加した掻破行動時間や皮疹スコアを低減させることができた。
　より具体的には、本発明のTgマウスの前記特徴は、皮膚炎の皮疹スコアとしては約１０～１５であった。また、炎症細胞数としては野生型マウスと比較して好酸球は皮膚では約７～８倍、末梢血では約４～５倍であり、肥満細胞は皮膚では約２～３倍であり、２型自然リンパ球は皮膚では約１２倍、末梢血では約１０倍、リンパ節では約２０倍であった。また、総IgE濃度としては野生型マウスと比較して約２０～３０倍であり、ヒスタミン濃度としては野生型マウスと比較して約８～９倍であった。また、サイトカイン濃度としては野生型マウスと比較してIL-4、IL-13が皮膚ではそれぞれ約５０倍、約３倍、IL-5が皮膚、血清中ではそれぞれ約５０倍、約１５００倍以上（IL-5は血清中において、野生型では検出限界(０．３pg/mL)以下であったが、Tgマウスでは約５００pg/mLであった）に増加した。また、CCL5、CCL11が皮膚中ではそれぞれ約４倍、約５倍、CCL2が皮膚、血清中それぞれ約７倍、約１４倍、CCL4が皮膚、血清中それぞれ約８倍、約１００倍に増加した。
　以上の特徴から、本発明のTg動物では、ヒトケラチン１４プロモーターの制御の下IL-33をコードするDNAが、皮膚特異的に高発現され、好酸球、肥満細胞、２型自然リンパ球の活性化を介して、炎症反応を惹起し、アトピー性皮膚炎を発症していると考えられる。
　従って、本発明のTg動物は、アトピー性皮膚炎の予防または治療薬のスクリーニングに有用であり、本発明は、SPF（specific pathogen free）の飼育条件下で、該Tg動物に試験化合物を適用し、（１）皮疹スコア、（２）炎症細胞数、（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度、および（４）掻破行動時間からなる群から選択される項目を１つ以上測定し、測定された前記項目を試験化合物非投与の場合に比べて改善させる試験物質を選択することを含む、アトピー性皮膚炎治療薬のスクリーニング方法を提供する。
　本発明のスクリーニング方法では、本発明のTg動物に試験化合物を投与する。試験化合物としては、公知の合成化合物、ペプチド、タンパク質、DNAライブラリーなどの他に、例えば哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物、細胞培養上清などが用いられる。試験化合物を投与する時期は、前記した特徴が観察されるようになる前でも後からでもよい。投与の方法としては、経口的であっても非経口的であってもよい。経口的投与としては飼料や飲料水に混ぜて投与することができる。非経口的投与としては、塗布による投与、腹腔内投与、静脈注射、皮下注射、皮内注射、筋肉注射、点滴注射等による投与、坐剤による直腸投与などが挙げられる。また、投与は単回投与であっても複数回投与であってもよい。
　各項目の測定は公知の方法によって行うこともできるし、後述する実施例に従って行ってもよい。例えば、皮疹スコアについては、掻痒、紅斑／出血、浮腫、表皮剥離／糜爛、落屑／乾燥の５項目について、それぞれ無し（０点）、軽度（１点）、中等度（２点）、重症（３点）で評価し、その合計点数から計測することができる（Matsuda H et al., Int. Immunol, 9(3):461-466, 1997）。炎症細胞数については、例えば、皮膚組織、末梢血またはリンパ節由来の細胞をフローサイトメトリー解析することによって、その割合を測定することができる。ここで、炎症細胞は、好酸球、好中球、好塩基球、肥満細胞、２型自然リンパ球などが挙げられるが、好ましくは、好酸球、肥満細胞および２型自然リンパ球である。総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度およびケモカイン濃度の測定については、各抗体を用いてELISAによって測定することができる。ここで、サイトカインは、IL-5またはIL-13が好ましく挙げられる。掻破行動時間については、試験化合物投与後に、一定時間内の掻破行動時間を測定することによって測定することができる。
　上記のようにして得られた前記特徴の測定結果について、試験化合物非投与の場合と比較する。そして、得られた前記特徴の測定結果が、試験化合物非投与の場合に比べて改善される場合には、該試験化合物をアトピー性皮膚炎の予防・治療剤として選択することができる。ここで改善されるとは、（１）皮疹スコアが試験化合物非投与の場合に比べて下がること、（２）炎症細胞数が試験化合物非投与の場合に比べて減ること、（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度が試験化合物非投与の場合に比べて下がること、（４）掻破行動時間が試験化合物非投与の場合に比べて短くなることをいう。例えば、試験化合物投与後の測定結果が、試験化合物非投与の場合と比べて、（１）皮疹スコアが６０％以上、好ましくは７０％以上下がり、（２）炎症細胞数が６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上下がり、（３）総IgE濃度が６５％以上、好ましくは７５％以上、より好ましくは８５％以上下がり、ヒスタミン濃度が８５％以上、好ましくは９０％以上下がり、サイトカイン濃度が７０％以上、好ましくは８０％以上下がり、ケモカイン濃度が７０％以上、好ましくは８０％以上下がり、および／または（４）掻破行動時間が７０％以上、好ましくは８０％以上下がる場合、該試験化合物をアトピー性皮膚炎の予防・治療剤として選択することができる。
　あるいは、前記特徴についてアトピー性皮膚炎の有無との相関図をあらかじめ作製しておき、得られた前記特徴の測定結果をその相関図と比較してもよい。比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。比較した結果が、試験化合物非投与の場合に比べて改善される場合には、該試験化合物をアトピー性皮膚炎の予防・治療剤として選択することができる。
　該スクリーニング法により選択されたアトピー性皮膚炎治療薬は、哺乳動物（好ましくはヒト）におけるアトピー性皮膚炎の症状の改善に使用することができる。該治療薬は、必要に応じて製剤化され、経口的もしくは非経口的に哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に投与することができる。
　該アトピー性皮膚炎の予防・治療薬の投与量は、投与対象の年齢、体重、症状の重篤度、投与ルートなどにより異なるが、例えば、皮膚に塗布する場合、一般的に成人（体重60kg）においては、一日につき約0.1～約100mg、好ましくは約1.0～約50mg、より好ましくは約1.0～約20mgである。投与対象がヒト以外の動物の場合も、体重60kg当たりに換算した量を投与することができる。
　また、本発明のTg動物は、アトピー性皮膚炎のモデル動物として有用であることから、該動物は、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬の評価方法に用いることができる。従って、本発明は、SPF（specific pathogen free）の飼育条件下で、該Tg動物にアトピー性皮膚炎の予防・治療薬を適用し、（１）皮疹スコア、（２）炎症細胞数、（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および/またはケモカイン濃度、および（４）掻破行動時間からなる群から選択される項目を１つ以上測定し、測定された前記項目をアトピー性皮膚炎の予防・治療薬非投与の場合と比べる、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬の効果の評価方法を提供する。
　本発明の評価方法で、本発明のTg動物に投与されるアトピー性皮膚炎の予防・治療薬としては、公知の予防・治療剤であってよく、たとえば、ステロイド（副腎皮質ホルモン剤）（例、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸プロピオン酸ベタメタゾン、ベクロメタゾンプロピオン酸エステル、プロピオン酸アルクロメタゾン、酢酸デキサメタゾンなど）；タクロリムス外用薬（プロトピック（登録商標）軟膏）；抗ヒスタミン薬（例、塩酸ジフェンヒドラミン、マレイン酸クロルフェニラミン、塩酸プロメタジン、ヒドロキシジン、塩酸シプロヘプタジン、エピナスチン塩酸塩等）などが挙げられるが、それらに制限されない。アトピー性皮膚炎予防・治療剤の投与時期、投与方法、投与回数などは前記のスクリーニング方法と同様であってよい。また、投与量は、各アトピー性皮膚炎の予防・治療薬によって、当業者が適宜決定してよい。
　本発明の評価方法で比較される特徴の測定方法は、前記スクリーニング方法に記載に従って実施してよい。また、その評価方法について、得られた前記特徴の測定結果が、アトピー性皮膚炎予防・治療剤非投与の場合に比べて改善される程度が大きい程、該アトピー性皮膚炎の予防・治療薬を予防・治療効果が高いと評価することができる。ここで改善されるとは前記と同様であってよい。
　以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。
実施例１　トランスジーンの構築
　pBluescript II KS(-)ファージミドベクター(Agilent technologies, La Jolla, CA)のEcoRIとHindIII部位の間に、2.0 kbのヒトケラチン14プロモーターを含むDNA配列(GenBank AC105208.15の40251-42254の塩基配列)、0.64 kb ウサギβグロビンイントロン 2を含むDNA配列(GenBank V00878.1の551-1195)、0.49 kbヒトケラチン14 poly Aシグナルを含むDNA配列（GenBank AC105208.15の46730- 47216）をもつK14発現ベクターを作製した。このベクターは、ウサギβグロビンイントロン 2とヒトケラチン14 poly Aシグナルの間にBamHI 部位を配し、BamHI部位に挿入したcDNAがケラチン14プロモーターの制御下に、表皮などの重層扁平上皮で安定して発現する構築である。0.8kb完全長マウスIL-33バリアント1をコードするcDNA(GenBank AK163464.1の61-861の塩基配列)はfantomTM clone B230120N24（ダナフォーム、横浜）に含まれるプラスミドDNAを鋳型にして、
mIL33cinf1：
5’-GGGCGAATACGGATCATGAGACCTAGAATGAAGTATTCCA-3’ (配列番号：３)および
mIL33cinf2：
5’-GGACTCTAGAGGATCTTAGATTTTCGAGAGCTTAAACATA-3’ (配列番号：４)
のPCRプライマーで増幅し、BamHI部位にIn-Fusion HD cloning kit(タカラバイオ, 大津)を用いて挿入した。得られたマウスIL-33 cDNA発現ベクターをXmaI、XhoI、XmnI の制限酵素で消化し、ヒトケラチン14プロモーター、ウサギβグロビンイントロン2、マウスIL-33 variant 1 cDNA、ヒトケラチン14 poly Aシグナルを含む4.0 kbの線状DNA を単離、精製した（図１）。
実施例２　IL-33遺伝子トランスジェニックマウスの作出
　マイクロインジェクションによるトランスジェニックマウス作製はHoganらの方法（Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1994）に従って行った。実施例１にて作製したマウスIL-33 variant 1 cDNAを含む前記DNA断片をC57BL/6J系統由来受精卵４００個の前核にマイクロインジェクションした。インジェクションした受精卵を偽妊娠雌マウスの卵管内に移植し、飼育した。得られた産仔１２２匹を４週齢で離乳させた。６週齢に達した時点で、生育した１０９匹のマウス（雄６８匹、雌４１匹）の尾からDNAを採取した。取得したDNAに対して、
msF4358：
5'-GGAGGGGGCAAAGTTTTCAGGGTG-3'（配列番号：５）および
mIL33R5046：
5'-TTTGCAAGGCGGGACCAGGG-3'（配列番号：６）
の配列を有するプライマーセットを用いてPCRを行い、１２匹のマウスがトランスジーンを有することを確認した。
実施例３　IL-33遺伝子トランスジェニックマウスの耳組織におけるIL-33遺伝子の発現解析
　実施例２において取得された１２匹のIL-33遺伝子トランスジェニックマウスについて、耳生検組織からRNAを抽出した。得られたRNAをもとにして、TaqManプローブMm00505403_m1 (Life Technologies Corp, Carlsbad, CA) を用いて定量的リアルタイムRT-PCRを実施し、マウスIL-33遺伝子（Il33）を高発現するマウスを選別した。１２匹のIL-33遺伝子トランスジェニックマウスのうち４匹は耳組織において、野生型マウスに比べてIL-33遺伝子が１１～４１倍高発現していることを確認した（図２）。このうち#89マウスをファウンダーとして用いることによって、生育とともに皮膚炎が安定的に生じ、生殖細胞系列へのトランスジーンの伝播が可能なマウス系統hK14mIL33tg #1 (HCM-0374)（以下、hK14mIL33tg）を樹立した。以後の解析は、hK14mIL33tgをC57BL/6Jマウスと交配して得た子孫のマウスを用いて行った。 
実施例４　hK14mIL33tgマウスの皮膚におけるIL-33の発現解析
　マウスの耳介を4%パラホルムアルデヒドで固定後、パラフィンに包埋し、4μmの切片を作製した。切片を抗IL-33ポリクローナル抗体と反応させ、Alexa594で蛍光染色した。3回の実験のなかで、代表的な結果を図に示した（図３）。蛍光強度は黒色で示した。図の実線は角層表面を、点線は表皮真皮境界部を示す。野生型マウス（WT）に比較して、hK14mIL33tgマウス（Tg）皮膚の表皮の角化細胞の核にIL-33の発現増強を認めた。
実施例５　hK14mIL33tgマウスにおけるIL-33遺伝子の組織特異的発現解析
　野生型マウスおよびhK14mIL33tgマウスの各臓器におけるIL-33遺伝子の発現をqPCRで比較した。データは２回の実験の代表的な結果を示した（図４）。hK14mIL33tgマウスでは、各臓器に比較してIL-33遺伝子の発現が皮膚において選択的に増強していることが示唆された。
実施例６　hK14mIL33tgマウスにおける皮膚炎の肉眼所見
　hK14mIL33tgマウスにおいて、痂皮、びらん、あるいは落屑を伴う浸潤性紅斑が顔面、とくに眼周囲、鼻周囲、その他、頚部、耳介、手足、尾部等、毛が少なく外界からの刺激を受けやすい部位に生じた（図５）。写真は24-28週齢のマウスの代表的な所見を示す。
実施例７　hK14mIL33tgマウスにおける皮膚病変の発症経過と頻度
　hK14mIL33tgマウスは正常に出生し、6週齢までは正常に発育した。野生型マウス（WT）(n = 7)と比較し、hK14mIL33tgマウス（Tg）(n = 4)では6週齢から8週齢にかけて皮膚病変が発症した。8週齢以降は全てのhK14mIL33tgマウスに皮膚病変が見られた（図６）。
実施例８　hK14mIL33tgマウスにおける皮膚病変組織のヘマトキシリン・エオシン染色所見
　野生型マウス（WT）の皮膚組織とhK14mIL33tgマウス（Tg）の皮膚病変組織（いずれも眼囲）をヘマトキシリン・エオシン染色した。３匹のマウスを用いた２回の実験の代表的な組織像を示した（図７）。hK14mIL33tgマウスでは、表皮の肥厚と真皮内に好酸球を含む炎症細胞浸潤がみられた。
実施例９　hK14mIL33tgマウスの皮膚および末梢血好酸球のフローサイトメトリー解析
　野生型マウス（WT）およびhK14mIL33tgマウス（Tg）の皮膚に浸潤する好酸球のフローサイトメトリー解析を行った。４匹のマウスを用いた２回の実験のうちの代表的データを示した（図８）。好酸球の比率は、皮膚細胞のB220-CD3-CD45+、即ち、T細胞、B細胞を除いた白血球（好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、２型自然リンパ球などが相当）の細胞数から計算した。皮膚では、CCR3+Siglec-F+の好酸球浸潤がhK14mIL33tgマウスでは野生型マウスに比較して平均値で7.4倍と、著しい増加が見られた（図９）。
　また同様に、野生型マウス（WT）およびhK14mIL33tgマウス（Tg）の末梢血細胞のフローサイトメトリー解析を行った。４匹のマウスを用いた２回の実験のうちの代表的データを示した（図１０、１１）。末梢血でも、同様にhK14mIL33tgマウスでは野生型マウスに比較して平均値で4.5倍と有意な好酸球増多が認められた。
　さらに、眼囲皮膚から全RNAを調製し、好酸球マーカーである好酸球ペルオキシダーゼ(Epx)および好酸球顆粒主要塩基性タンパク質遺伝子(Prg2)の発現を定量的リアルタイムRT-PCRで解析した。その結果、EpxとPrg2の遺伝子発現はhK14mIL33tgマウス（Tg）において野生型マウス（WT）よりも、それぞれ、平均値で26.9倍、45.7倍と、有意に高値であった（図１２）。
実施例１０　hK14mIL33tgマウスにおける皮膚病変組織のトルイジンブルー染色所見
　野生型マウス（WT）の皮膚組織とhK14mIL33tgマウス（Tg）の皮膚病変組織（いずれも眼囲）をトルイジンブルー染色した。３匹のマウスを用いた２回の実験の代表的な組織像を示した（図１３）。トルイジンブルーによる染色の結果、hK14mIL33tgマウスに生じた皮膚炎病変部組織では、真皮の肥満細胞が増加していることが判明した。
実施例１１　hK14mIL33tgマウスにおける肥満細胞のフローサイトメトリー解析
　野生型マウス（WT）あるいはhK14mIL33tgマウス（Tg）の皮膚に存在する肥満細胞のフローサイトメトリー解析を行った（図１４）。肥満細胞の比率は、皮膚のB220-CD3-細胞のフローサイトメトリー解析から計算した（図１５）。hK14mIL33tgマウス病変部皮膚では、c-kit+IgE+である肥満細胞が野生型マウスの正常皮膚に比較して、有意に増加していることが明らかになった。
実施例１２　hK14mIL33tgマウスにおける血中ヒスタミン濃度およびIgE濃度解析
　野生型マウス（WT）およびhK14mIL33tgマウス（Tg）から血漿を採取し、ヒスタミン濃度をELISAで測定した。また、野生型マウスおよびhK14mIL33tgマウスから血清を採取し、総IgE濃度をELISAで測定した。血漿中のヒスタミン濃度は、野生型マウスでは平均 0.18 μMであったが、hK14mIL33tgマウスでは平均1.46 μMと、著しい高値であり、hK14mIL33tgマウスにおける肥満細胞の活性化が示唆された（図１６）。また、血清中の総IgE値は、野生型マウスでは平均15 ng/mLに対し、hK14mIL33tgマウスでは平均386 ng/mLと、20倍以上の高値を示した（図１７）。
実施例１３　hK14mIL33tgマウスにおける掻破行動解析
　野生型マウス（WT）およびhK14mIL33tgマウス（Tg）について、任意の20分間における皮膚掻破時間(sec/min)を測定した。野生型マウスに比較してhK14mIL33tgマウスでは有意な掻破時間の増加が見られ、皮膚の掻痒（かゆみ）が強いことが示唆された（図１８）。さらに、掻破行動に対する抗ヒスタミン薬の効果を検証した。ジフェンヒドラミン塩酸塩2mgをhK14mIL33tgマウスの腹腔内に投与した。それにより、投与６分後から２０分間に観察されるマウスの掻破行動の時間が平均4.6分から平均0.2分に減少した（図１９）。hK14mIL33tgマウスの皮膚炎に伴う掻痒の原因として、肥満細胞が関与している可能性が示唆される。
実施例１４　hK14mIL33tgマウスにおけるサイトカインおよびケモカイン濃度の解析
　好酸球の誘導はIL-5、IL-13などのTh2サイトカインや、好酸球が発現する受容体CCR3に結合するリガンドであるRANTES/CCL5やEotaxin-1/CCL11などのケモカインで制御されることが知られている。そこで、野生型マウス（WT）とhK14mIL33tgマウス（Tg）の血清および眼囲皮膚抽出液中のサイトカインとケモカイン濃度を網羅的に測定した。野生型マウスに比較して、hK14mIL33tgマウスでは、IL-5は血清と皮膚の両方で高値を示した（図２０、２１）。またhK14mIL33tgマウスにおいて、CCL2、CCL4は血清と皮膚の両方で増加し、CCL5とCCL11は皮膚で増加した（図２０、２１）。これらの結果から、hK14mIL33tgマウスにおける好酸球性炎症にこれらのサイトカインが重要な役割を担う可能性が示唆された。一方、hK14mIL33tgマウスにおいてTNF-αやIFN-γなどのTh1サイトカイン、IL-12p40には変化が無かった。他のアレルギー性炎症を引き起こす上皮細胞由来サイトカインであるIL-18、TSLP、IL-25については、皮膚病変部におけるIL-18の増加はわずかであり、他の皮膚炎モデルマウスで見られるような血清中のIL-18の増加は見られなかった。また、TSLPやIL-25には有意な増加は見られなかった。
実施例１５　hK14mIL33tgマウスにおける皮膚浸潤細胞、末梢血細胞またはリンパ節細胞のフローサイトメトリー解析
　IL-33を誘導する肺の寄生虫感染の実験(Yasuda K et al., Proc Natl Acad Sci U S A,109:3451-62012, 2012)では、IL-33に依存してIL-5を産生する細胞として２型自然リンパ球が想定されている。実施例１４において、hK14mIL33tgマウスにおいてIL-5やIL-13の産生増強が見られたため、これらのサイトカインを産生する２型自然リンパ球が増加しているかどうかを検討するため皮膚、末梢血、リンパ節由来細胞のフローサイトメトリー解析を行った。細胞は、Linマーカー陰性の細胞分画にゲートをかけた。3匹のマウスを用いた２回の実験の内の代表的なデータである（図２２）。野生型マウス（WT）と比べて、hK14mIL33tgマウス（Tg）ではLin- ST2+ Sca-1+２型自然リンパ球が皮膚局所、末梢血、リンパ節で増加していることが判明した。即ち、IL-33は２型自然リンパ球の誘導に関与することが示唆された。次に、リンパ節のLin- ST2+ 細胞におけるIL-5、IL-13 の発現を解析した。IL-5やIL-13を産生する細胞を同定するため、細胞内染色を行った。細胞は、Linマーカー陰性の細胞分画にゲートをかけた。3匹のマウスを用いた実験の代表的なデータである（図２３）。さらに、Lin-ST2+IL-5+またはLin-ST2+IL-13+細胞の比率を、Lin-細胞のフローサイトメトリー解析から計算した（図２４）。野生型マウス（WT）に比較してhK14mIL33tgマウス（Tg）のリンパ節では、IL-5あるいはIL-13を産生する２型自然リンパ球の増加が認められた。
実施例１６　hK14mIL33tgマウスにおけるIL-5中和抗体投与の効果解析
　hK14mIL33tgマウスにおける好酸球増多にIL-5が必要かどうかを明らかにする目的で、対照のIgG1抗体（20μg/匹）あるいはIL-5中和抗体（20μg/匹）をhK14mIL33tgマウスの腹腔内に2日おきに２週間投与した。その後、hK14mIL33tgマウスの末梢血細胞のフローサイトメトリー解析を行った。細胞は、B220-CD3-CD45+分画にゲートをかけた。4匹のマウスで行った実験の代表的なデータを示す（図２５）。得られた好酸球の比率はB220-CD3-CD45+細胞の末梢血細胞のフローサイトメトリー解析から計算した（図２６）。IL-5中和抗体投与群のhK14mIL33tgマウスでは、対照群に比して末梢血中の好酸球増多が有意に改善した。さらに、hK14mIL33tgマウスの眼囲皮膚組織のヘマトキシリン・エオシン染色を行った。4匹のマウスで行った実験の代表的な図を示す（図２７）。皮膚炎の病変部では、表皮肥厚の改善、浸潤細胞の減少がみられ、好酸球の浸潤も明らかに改善した。また、皮膚病変部組織におけるIL-33と好酸球顆粒主要塩基性タンパク質遺伝子(Prg2)の発現を解析した（図２８）。hK14mIL33tgマウスにおいて、IL-5中和抗体投与により、皮膚のIL-33遺伝子発現誘導には変化が無かったが、好酸球のマーカーであるPrg2の発現は有意に低下した。従って、IL-5中和抗体投与によってhK14mIL33tgマウスにおける皮膚への好酸球浸潤が抑制された。以上から、hK14mIL33tgマウスの好酸球増多には２型自然リンパ球などから産生されるIL-5が重要であることが示唆された。
実施例１７　hK14mIL33tgマウスにおけるステロイド薬による掻破行動抑制
　hK14mIL33tgマウスの掻破行動に対するステロイド薬の効果を検証した。hK14mIL33tgマウスの皮疹部に、対照として白色ワセリン、ステロイド薬としてベタメタゾン酪酸エステルプロピオン酸エステルを２日おきに５回塗布した。皮疹スコアとして掻痒、紅斑／出血、浮腫、表皮剥離／糜爛、落屑／乾燥の５項目について、無し（０点）、軽度（１点）、中等度（２点）、重症（３点）で評価を行った（Matsuda H et al., Int. Immunol, 9(3):461-466, 1997）。その結果、皮疹スコアの合計点が平均１２．３点から塗布後に４．８点にまで減少し、有意な改善が確認できた（図２９）。
　本発明のTg動物は、アトピー性皮膚炎の発症機序・病態の解析、アトピー性皮膚炎治療薬の効果判定に有用である。また、IL-33がアトピー性皮膚炎の発症に極めて重要なサイトカインであることが判明した。今後は、IL-33の産生と細胞外への遊離・活性化機構、これを制御する調節分子の解明などへの応用も期待できる。さらに、IL-33を標的とする新規アトピー性皮膚炎治療薬や、IL-33が病態に関与する喘息、アレルギー性鼻炎、花粉症をはじめ、関節リウマチ、炎症性腸疾患など、他の疾患の治療薬開発にも役立つと期待できる。
　本出願は、日本で出願された特願２０１３－０９６６３７（出願日：平成２５年５月１日）を基礎としており、その内容はすべて本明細書に包含されるものとする。

Claims (11)

  1. 　IL-33をコードするDNAを皮膚において特異的に発現可能な状態で保持するトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、SPF(specific pathogen free）の飼育条件下で、対応する非トランスジェニック非ヒト哺乳動物と比較して
    （１）皮膚炎を自然発症する、
    （２）炎症細胞数が増加している、
    （３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度が増加している、および
    （４）掻破行動時間が増加している
    からなる群から選択される特徴を１つ以上有する、非ヒト哺乳動物。
  2. 　IL-33をコードするDNAがケラチンプロモーターの制御下にある、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
  3. 　ケラチンプロモーターがヒトケラチン14プロモーターである、請求項２記載の非ヒト哺乳動物。
  4. 　IL-33が配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を有する請求項１～３のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
  5. 　炎症細胞が好酸球、肥満細胞および２型自然リンパ球からなる群から選択される細胞である、請求項１～４のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
  6. 　サイトカインがIL-4、IL-5またはIL-13である、請求項１～５のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
  7. 　ケモカインがCCL2、CCL4、CCL5またはCCL11である、請求項１～６のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
  8. 　掻破行動時間または皮膚炎の症状が抗ヒスタミン薬またはステロイド薬によって低減することを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
  9. 　非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１～８のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
  10. 　SPF(specific pathogen free）の飼育条件下で、請求項１～９のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物に試験化合物を適用し、（１）皮疹スコア、（２）炎症細胞数、（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度、および（４）掻破行動時間からなる群から選択される項目を１つ以上測定し、測定された前記項目を試験化合物非投与の場合と比べて改善させる試験物質を選択することを含む、アトピー性皮膚炎治療薬のスクリーニング方法。
  11. 　SPF(specific pathogen free）の飼育条件下で、請求項１～９のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物にアトピー性皮膚炎の予防・治療薬を適用し、（１）皮疹スコア、（２）炎症細胞数、（３）総IgE濃度、ヒスタミン濃度、サイトカイン濃度および／またはケモカイン濃度、および（４）掻破行動時間からなる群から選択される項目を１つ以上測定し、測定された前記項目をアトピー性皮膚炎の予防・治療薬非投与の場合と比べる、アトピー性皮膚炎の予防・治療薬の効果の評価方法。
     
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