WO2014140322A1 - Nouveaux médicaments comprenant une composition d'anticorps enrichie en isoforme de charge majoritaire - Google Patents

Nouveaux médicaments comprenant une composition d'anticorps enrichie en isoforme de charge majoritaire Download PDF

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WO2014140322A1
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composition
antibody composition
antigen
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PCT/EP2014/055179
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Guillaume CHEVREUX
Nicolas Bihoreau
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Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
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    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]

Definitions

  • Novel Drugs comprising an Antibody Composition Enriched with Majority Charge Isoform
  • the present invention is in the technical field of antibody therapies involving a target cell killing mechanism by ADCC. It relates to purified antibody compositions, obtained by chromatographic fractionation of the different charge isoforms naturally present in an antibody composition and grouping of one or more chromatographic fractions corresponding to the major peak of the chromatogram, the monoclonal antibody composition as well as obtained being enriched in said majority peak, which represents at least 85% of the chromatogram of the composition obtained, for use as a medicament.
  • Prior art relates to purified antibody compositions, obtained by chromatographic fractionation of the different charge isoforms naturally present in an antibody composition and grouping of one or more chromatographic fractions corresponding to the major peak of the chromatogram, the monoclonal antibody composition as well as obtained being enriched in said majority peak, which represents at least 85% of the chromatogram of the composition obtained, for use as a medicament.
  • an antibody composition is inherently heterogeneous. Indeed, the antibody compositions used in therapy are produced in biological systems (cells, animals or transgenic plants), in which the proteins in general, and therefore the antibodies in particular, are subjected to a number of post-modification modifications. translational (enzymatic modifications or degradations), which will vary from one antibody molecule to another and thus generate micro-heterogeneity within the antibody composition produced.
  • Antibodies are glycoproteins consisting of four polypeptide chains: two heavy chains (called “H” for “heavy”) generally identical and two light chains (called “L” for “light”) generally identical associated by a variable number of disulfide bridges and non-covalent interactions. These chains form a Y-shaped structure, the heavy chain contributing to the trunk of the Y and half of each arm of the Y, the light chain contributing to half of each arm of the Y.
  • Each light chain consists of a constant domain ( C L ) and a variable domain (V L ); the heavy chains are composed of a variable fragment (V H ) and 3 or 4 constant fragments (Cm-C H 3 or Cm) according to the isotype of the antibody (the IgG comprise 3 constant fragments Cm to Cm) -
  • the association of the light chain (V L + C L ) and the heavy chain domains V H and Cm form the Fab fragment, the associated VL and VH domains being responsible for the recognition of the antigen.
  • the constant domains (C H 2 and Cm) or (C H 2 -C H4) of the two heavy chains form the constant Fc fragment.
  • the antibodies are known to be subjected to the following post-translational modifications: terminal modifications of heavy or light chains, glycosylation of the Fc (and possibly Fab) part, deamidation, isomerization, oxidation, fragmentation, and aggregation (see Vlasak et al. 2008).
  • the glycosylation of the constant Fc part of the antibodies is now well known to strongly influence many biological properties of the antibody: in vivo half-life (see Wright et al. induce an ADCC response (cytotoxic cell response dependent on the antibody, see Satoh et al. 2006, Presta et al. 2006), a CDC response (complement-dependent cytotoxic response, see Wright et al. 1994, Presta et al. 2006). ), etc.
  • the content of the antibody composition in fucosylated glycan forms is today known to very strongly affect the ability of the composition to induce an ADCC response in vivo.
  • Khawli et al-2010 and Vogel et al-201 1 describe the separation by chromatographic techniques using a cation exchange resin of the acidic, predominant, and basic isoforms of a monoclonal antibody composition used passive immunotherapy; the analysis of post-translational modifications leading to the existence of several isoforms; as well as the study of the pharmacokinetic properties and certain functional properties of three purified fractions (acid, majority and basic).
  • the chromatogram of the native composition shows, as always, a majority peak, surrounded by peaks comprising acidic isoforms and peaks comprising basic isoforms.
  • the identified post-translational modifications include the reduction of some disulfide bridges (Khawli et al-2010), glycations (Khawli et al-2010, Vogel et al-201 1), dehydration (Khawli et al-2010, Vogel et al. al-201 1), the cleavage of C-terminal lysines of the heavy chains (Khawli et al-2010, Vogel et al-201 1), the presence of aggregates (Gandhi et al-201 1), oxidation phenomena (Gandhi et al-201 1).
  • EP1308456 and WO2004 / 024866 describe chromatographic methods for removing acidic variants of a monoclonal antibody composition, without the effectiveness of the effector properties of the composition before and after purification being tested.
  • WO201 1/009623 discloses a chromatographic method for removing acidic variants or basic variants of a monoclonal antibody composition, without the effector properties of the composition before and after purification being tested.
  • the method described in this document eliminates only one type of variant and only the elimination of acid variants is actually implemented.
  • a fraction purified by chromatography, enriched in the major charge isoform of an antibody composition has a significantly higher capacity to induce an effector response via the CD16 receptor by the effector cells expressing this receptor.
  • a purified fraction enriched in the major charge isoform of an antibody composition makes it possible to induce a stronger ADCC response and a stronger CDC response in vivo, and thus to increase the clinical and / or decrease the doses administered, thus limiting the side effects.
  • the present invention therefore relates to a monoclonal antibody composition obtainable by a process comprising:
  • step b) fractionating the composition obtained in step a) by chromatography, and c) the grouping of one or more chromatographic fractions obtained in step b), corresponding to the major peak of the chromatogram, the monoclonal antibody composition thus obtained being enriched in said majority peak, the latter representing at least 85%, advantageously at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, more preferably at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, minus 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 98,5%, at least 99%, or at least 99,5% of the chromatogram of the composition obtained in step c) ,
  • step b) is carried out by fractionation of the composition obtained in step a) by conventional ion exchange chromatography, by chromatofocusing, or by hydrophobic interaction chromatography.
  • the ion exchange chromatography uses one of the following eluting means:
  • compositions for use as a medicament at least 95%, advantageously at least 96%, at least 97%, at least 98%, or even at least 98.5%, at least 99%, or at least less than 99.5% of the heavy chains of the antibodies present in the composition do not comprise a C-terminal lysine residue.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody composition, wherein at least 95%, preferably at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 98.5%, at least 99%, or at least less than 99.5% of the heavy chains of the antibodies present in the composition do not comprise a C-terminal lysine residue for use as a medicament.
  • the antibody is advantageously directed against a non-ubiquitous antigen present on healthy donor cells, an antigen of a cancer cell, or an antigen of an infected cell. by pathogen.
  • the antibody is an anti-Rhesus D antibody and the composition and intended for the prevention of alloimmunisation in Rh-negative individuals.
  • the antibody is directed against an antigen of a cancer cell and the composition and intended for the treatment of a cancer, the antibody is directed against an antigen of a cell infected with a pathogen and the composition and intended for the treatment of an infection by said pathogenic organism,
  • the antibody is directed against an antigen of an immune cell and the composition for the treatment of an autoimmune disease.
  • the antibody comprises a modification of the Fc fragment increasing its binding to the Fc ⁇ RIII receptor and its effector properties via the Fc ⁇ RIII receptor.
  • the composition for use as a medicament according to the invention may in particular comprise mutations in the Fc fragment increasing its binding to the Fc ⁇ RIII receptor and / or a low fucose content.
  • the antibodies present in the composition have on their N-glycosylation sites of the Fc fragment glycan structures of biantenné type, with a fucose content of less than 65%.
  • the antibody comprises a modification of the Fc fragment increasing its binding to the C1 protein and its effector properties via the complement.
  • the present invention also relates to the use of a chromatographic fractionation step to increase the ability of a monoclonal antibody composition directed against a given antibody to induce antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of target cells expressing said antigen by the effector cells of the immune system expressing the Fc ⁇ RIII receptor (CD16).
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the present invention also relates to the use of a chromatography fractionation step for increasing the ability of a monoclonal antibody composition directed against a given antibody to induce complement-dependent cytotoxicity (CDC) of target cells expressing said antigen by the complement.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • FIG. 1 Chromatograms obtained for three separations by chromatofocusing of an anti-CD20 antibody composition (anion exchange resin (Mono TM P column marketed by GE Life Sciences) with elution by a descending gradient of pH (9.5 at 8.0 using two buffers: buffer A (25 mM diethanolamine), buffer B (polybuffer 96 + pharmalyte 8-10.5))
  • the antibody composition was desalted, and 20 mg was injected onto the column . Fractions of 2 ml were collected. Fractions 33 to 50 were collected for analysis.
  • FIG. 1 Chromatograms of the CEX purified anti-CD20 antibody composition.
  • A Chromatogram of the anti-CD20 antibody composition before purification.
  • B Chromatogram of the composition formed by assembling fractions 1 to 20 corresponding to the major peak of the chromatogram before separation (A). The percentage of the different peaks are indicated.
  • FIG. 4 Binding to CD16 (Biacore) purified fractions by cation exchange chromatography. The CD16 binding of each sample is expressed as a percentage of the CD16 binding of a reference sample
  • the CD16 activity (secretion of IL-2 by Jurkat CD16 cells) of each sample is expressed as a percentage of the CD16 activity of a reference sample.
  • the present invention therefore relates to a monoclonal antibody composition obtainable by a process comprising:
  • step b) fractionating the composition obtained in step a) by chromatography
  • step c) the grouping of one or more chromatographic fractions obtained in step b), corresponding to the major peak of the chromatogram, the monoclonal antibody composition thus obtained being enriched in said majority peak, the latter representing at least 85%, advantageously at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, more preferably at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 98,5%, at least 99%, or at least 99.5% of the chromatogram of the composition obtained in stage c),
  • a monoclonal antibody composition is produced from a cell clone, a transgenic animal or a transgenic plant.
  • antibody or “immunoglobulin” is meant a molecule comprising at least one binding domain to a given antigen and a constant domain comprising a Fc fragment capable of binding to FcR receptors.
  • an antibody is composed of 4 polypeptide chains: 2 heavy chains and 2 light chains linked together by a variable number of disulfide bridges providing flexibility to the molecule.
  • Each light chain consists of a constant domain (CL) and a variable domain (VL); the heavy chains being composed of a variable domain (VH) and 3 or 4 constant domains (CH1 to CH3 or CH1 to CH4) according to the isotype of the antibody.
  • VH variable domain
  • CH1 to CH3 or CH1 to CH4 constant domains
  • antibodies consist of only two heavy chains, each heavy chain comprising a variable domain (VH) and a constant region.
  • Variable domains are involved in antigen recognition, while constant domains are involved in the biological, pharmacokinetic and effector properties of the antibody.
  • the constant domains are characterized by an amino acid sequence very close to one antibody to another, characteristic of the species and the isotype, with possibly somatic mutations.
  • the Fc fragment is naturally composed of the constant region of the heavy chain excluding the CH1 domain, that is to say the lower hinge region and the constant CH2 and CH3 or CH2 to CH4 domains (depending on the isotype ).
  • the complete Fc fragment is composed of the C-terminal portion of the heavy chain from the cysteine residue at position 226 (C226), the numbering of amino acid residues in the Fc fragment being throughout the present invention. description that of the EU index described in Edelman et al. 1969 and Kabat et al. 1991.
  • the corresponding Fc fragments of other types of immunoglobulins can be easily identified by those skilled in the art by sequence alignments.
  • the Fc fragment is glycosylated at the CH2 domain with the presence, on each of the 2 heavy chains, of a / V-glycan linked to the asparagine residue at position 297 (Asn 297).
  • the following binding domains, located in the Fc, are important for the biological properties of the antibody:
  • FcRn receptor binding domain involved in the pharmacokinetic properties (in vivo half-life) of the antibody:
  • C1 complement protein binding domain q involved in the CDC response (for "complement dependent cytotoxicity"): located in the CH2 domain;
  • the Fc fragment of an antibody may be natural, as defined above, or may have been modified in various ways, provided that it comprises a FcR receptor binding domain (Fc ⁇ R receptors for IgG) functional, and preferably a functional FcRn receptor binding domain.
  • the modifications may include deleting certain portions of the Fc fragment, provided that it contains a functional FcR receptor binding domain (Fc ⁇ R receptors for IgG), and preferably a functional FcRn receptor binding domain.
  • the modifications may also include different amino acid substitutions that may affect the biological properties of the antibody, provided that it contains a functional FcR receptor binding domain, and preferably a functional FcRn receptor binding domain.
  • the antibody when it is an IgG, it may comprise mutations intended to increase the binding to the Fc ⁇ RIII receptor (CD16), as described in WO00 / 42072, Shields et al-2001, Lazar et al. 2006, WO2004 / 029207, WO / 2004063351, WO2004 / 074455. Mutations to increase FcRn receptor binding and thus in vivo half-life may also be present, as described for example in Shields et al-2001, Dall'Acqua et al. 2002, Hinton et al. 2004, Dall Acqua et al.
  • “monoclonal antibody” or “monoclonal antibody composition” is meant a composition comprising antibody molecules having identical and unique antigenic specificity.
  • the antibody molecules present in the composition are likely to vary in their post-translational modifications, and in particular in their glycosylation structures or their isolating point, but have all been coded by the same heavy and light chain sequences and therefore have, before any modification post-translational, the same protein sequence.
  • Certain protein sequence differences, related to post-translational modifications eg cleavage of C-terminal heavy chain lysine, deamidation of asparagine residues and / or isomerization of aspartate residues
  • the monoclonal antibody present in the composition used as a medicament in the context of the invention may advantageously be chimeric, humanized, or human. Indeed, this makes it possible to avoid the immune reactions of the patient against the administered antibody.
  • chimeric antibody an antibody which contains a naturally occurring variable (light chain and heavy chain) derived from an antibody of a given species in association with the constant light chain and heavy chain regions of an antibody of a heterologous species to said given species.
  • the monoclonal antibody composition for use as a medicament according to the invention comprises a chimeric monoclonal antibody, it comprises human constant regions.
  • a chimeric antibody can be prepared using genetic recombination techniques well known to those skilled in the art.
  • the chimeric antibody may be made by cloning for the heavy chain and the light chain a recombinant DNA comprising a promoter and a sequence coding for the variable region of the non-human antibody, and a sequence coding for the constant region of the a human antibody.
  • a recombinant DNA comprising a promoter and a sequence coding for the variable region of the non-human antibody, and a sequence coding for the constant region of the a human antibody.
  • humanized antibody is meant an antibody which contains CDRs regions derived from an antibody of non-human origin, the other parts of the antibody molecule being derived from one (or more) human antibodies.
  • some of the skeletal segment residues (referred to as FR) can be modified to maintain binding affinity (Jones et al., 1986, Verhoeyen et al., 1988, Riechmann et al., 1988).
  • the humanized antibodies according to the invention may be prepared by techniques known to those skilled in the art such as “CDR grafting", “resurfacing”, Superhumanization, "Human string content", “FR libraries” technologies.
  • » « FR shuffling "and” Humaneering as summarized in the review of Almagro et al.
  • human antibody is understood to mean an antibody whose entire sequence is of human origin, that is to say whose coding sequences have been produced by recombination of human genes coding for the antibodies. Indeed, it is now possible to produce transgenic animals (eg mice) that are capable, upon immunization, of producing a complete repertoire of human antibodies in the absence of endogenous production of immunoglobulin (see Jakobovits et al. -1993 (a) and (b), Bruggermann et al., 1993 and Duchosal et al., 1992, US patents 5,591, 669, 5,598,369, 5,545,806, 5,545,807, 6,150,584). Human antibodies can also be obtained from phage display libraries (Hoogenboom et al 1991, Marks et al 1991 Vaughan et al 1996).
  • the antibodies can be several isotypes, depending on the nature of their constant region: the constant regions ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ correspond respectively to immunoglobulins IgG, IgA, IgM, IgE and IgD.
  • the monoclonal antibody present in a composition used as a medicament in the context of the invention is of IgG isotype.
  • this isotype shows an ability to generate ADCC activity ("Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity", or antibody-dependent cellular cytotoxicity) in the largest number of individuals (humans).
  • the constant regions ⁇ comprise several subtypes: ⁇ 1, ⁇ 2, ⁇ 3, these three types of constant regions having the particularity of fixing the human complement, and ⁇ 4, thus creating the lgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 sub-isotypes.
  • the monoclonal antibody present in a composition used as a medicament in the context of the invention is of the IgG1 or IgG3 isotype, preferably IgG1.
  • the monoclonal antibody composition can be produced by a cell clone, a transgenic non-human animal or a transgenic plant, by technologies well known to those skilled in the art.
  • cell clones producing the composition can be obtained by 3 main technologies:
  • a heavy and light chain expression vector of the antibody comprises the elements necessary for the expression of the sequences coding for the heavy and light chains of the antibody, and in particular a promoter, a codon for initiation of transcription, termination sequences, and appropriate transcriptional regulatory sequences. These elements vary according to the host serving for the expression and are readily selected by those skilled in the art in view of his general knowledge.
  • the vector may especially be plasmidic or viral. Transformation techniques are also well known to those skilled in the art.
  • Transformation of cell lines by one or more expression vectors of the sequences coding for the heavy and light chains of the antibody is the most commonly used, in particular for obtaining chimeric or humanized antibodies.
  • the transformed cell line is preferably of eukaryotic origin, and may in particular be chosen from insect, plant, yeast or mammalian cells.
  • the antibody composition can then be produced by culturing the host cell under appropriate conditions.
  • Cell lines suitable for the production of antibodies include the lines selected from: SP2 / 0; YB2 / 0; IR983F; human myeloma Namalwa; PERC6; the CHO lines, in particular CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, or CHO line deleted for the two alleles coding for the FUT8 gene and / or the gene GMD; Wil-2; Jurkat; Vero; Molt -4; COS-7; 293-HEK; BHK; K6H6; NSO; SP2 / 0-Ag 14, P3X63Ag8.653, embryonic duck cell line EB66® (Vivalis); and
  • a transgenic non-human animal can be obtained by direct injection of the gene (s) of interest (here, the rearranged genes encoding the heavy and light chains antibody) in a fertilized egg (Gordon et al. 1980).
  • a transgenic non-human animal can also be obtained by introducing the gene (s) of interest (here, the rearranged genes encoding the heavy and light chains of the antibody) into an embryonic stem cell and preparing it. animal by a chimera aggregation method or a chimeric injection method (see Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)).
  • a transgenic non-human animal can also be obtained by a cloning technique in which a nucleus, in which the gene (s) of interest (here, the rearranged genes encoding the heavy and light chains of the antibody) has been introduced, is transplanted into an enucleated egg (Ryan et al 1997, Cibelli et al., 1998, WO0026357A2).
  • a transgenic non-human animal producing an antibody of interest can be prepared by the above methods. The antibody can then be accumulated in the transgenic animal and harvested, in particular from the milk or eggs of the animal.
  • Non-human transgenic animals of interest include mice, rabbits, rats, goats, cattle (including cows), and poultry (especially chicken).
  • the antibody composition can be produced in a transgenic plant.
  • Many antibodies have already been produced in transgenic plants and the technologies necessary to obtain a transgenic plant expressing an antibody of interest and to the recovery of the antibody are well known to those skilled in the art (see Stoger et al-2002, Fisher et al. 2003, Ma et al. 2003, Schillberg et al. 2005). It is also possible to influence the glycosylation obtained in the plants to obtain glycosylation close to that of natural human antibodies (without xylose), but with, in addition, low fucosylation, for example with the aid of small interfering RNAs (Forthal et al. al, 2010).
  • step b) of the process for obtaining a monoclonal antibody composition intended to be used as a medicament according to the invention the different antibody loading isoforms present in the composition obtained in step a) are separated by fractionation of the composition obtained in step a) by chromatography.
  • any monoclonal antibody composition produced by a cell clone, a non-human transgenic animal or a transgenic plant is characterized by the presence of a number of isoforms or charge variants of the same monoclonal antibody.
  • Each isoform or charge variant is characterized by its isoelectric point (p1, also called isoelectric hydrogen potential (pHI)), which corresponds to the pH (hydrogen potential) for which the overall charge of this molecule is zero or, in other words, the pH for which the molecule is electrically neutral (zwitterionic form or mixed ion).
  • p1 isoelectric point
  • pHI isoelectric hydrogen potential
  • the different isoforms or charge variants of a monoclonal antibody will therefore have variable net charges, those whose pl is below the pH carrying a negative charge (the molecule tends to give its protons to the basic medium), those whose pH is equal to pH being neutral, and those whose pH is higher than the pH carrying a positive charge (the molecule tends to conserve its protons or to capture acidic medium).
  • the different isoforms or charge variants of a monoclonal antibody are present in varying proportions, depending on the frequency of post-translational modifications present on each variant.
  • a monoclonal antibody composition generally comprises a major variant or isoform, accompanied by a plurality of so-called acidic or basic variants or isoforms, depending on whether their p1 is lower or higher than that of the majority isoform.
  • the proportions of the acid isoforms, the majority peak and the basic isoforms (calculated from the chromatogram of an ion exchange chromatography) , generally vary around the following values: 10 to 30% of acid isoforms, 50 to 75% of dominant peak, and 8 to 20% of basic isoforms (see Farnan et al. 2009, Rea et al-201 1, Rea and al-2012, Khawli et al., 2010, Zhang et al. 201 1, WO201 1/009623, and EP1308456).
  • the antibody loading isoforms present in a given antibody composition can be separated by different chromatography technologies.
  • Chromatography is a technique for separating chemical substances (homogeneous liquid or gaseous mixture) based on differences in behavior between a current mobile phase and a stationary phase (or fixed phase). Chromatographic methods can be classified according to the nature of the phases used or the phenomena used in the separation.
  • the fractionation of step b) is carried out using ion exchange chromatography. This makes it possible to separate the charge isoforms of the same protein.
  • ion exchange chromatography anions or cations
  • the parameter that will allow the separation of the various constituents is their net charge.
  • the antibody composition is first loaded onto an ion exchange resin.
  • resins stationary or stationary phase
  • anion exchange chromatography or negatively (cation exchange chromatography).
  • charge molecules opposite to that of the resin ions will be retained / fixed on the resin.
  • any type of strong or weak cation or anion exchange resin known to those skilled in the art and suitable for the separation of the antibody composition of interest may be used.
  • the average isoelectric point (pI) of an antibody composition generally varies between 5 and 9, most often between 7 and 9.
  • a cation exchange resin is used for a pI greater than 8
  • an anion exchange resin is used for a pI less than 6, an anion exchange resin is used for a pI between 6 and 8, both types of ion exchange resins (cations or anions) can be tested.
  • anion exchange chromatography negatively charged resin
  • anion exchange chromatography charged resin positively.
  • the ion exchange resins generally consist of a crosslinked polymer or gel, on which positively charged (anion exchange resin) or negatively (cation exchange resin) groups are grafted.
  • the crosslinked polymer or gel may especially be chosen from dextran (eg Sephadex®), agarose (eg Sepharose®), cellulose, methacrylate polymers (eg Fratogel®), vinyl polymers (eg Fractoprep ®) such as poly (styrene divinylbenzene) (eg Monobeads TM, Source TM, Bio Mab NP-5 or NP-10, Sepax Antibodix TM NP1.7, NP3, NP5 and NP10).
  • the gel may advantageously be in the form of beads, with a mean diameter of between 10 and 200 ⁇ .
  • cation exchange resins negatively charged groups are grafted onto the crosslinked polymer, such as sulfopropyl (SP), methyl sulfonate (S) or carboxymethyl (CM) groups.
  • positively charged groups are grafted on the crosslinked polymer, such as quaternary ammonium groups (Q), especially aminoethyl quaternary (QAE), diethylaminoethyl (DEAE), dimethylaminoethyl (DMAE), trimethylaminoethyl (TMAE), or dimethylaminopropyl (ANX).
  • Q quaternary ammonium groups
  • Q quaternary ammonium groups
  • QAE aminoethyl quaternary
  • DEAE diethylaminoethyl
  • DMAE dimethylaminoethyl
  • TMAE trimethylaminoethyl
  • ANX dimethylaminopropyl
  • Cation exchange resins suitable for use in the present invention include Source TM 15S or 30S, Mono-S resins (commercially available from GE Life Sciences); ProPac® WCX (in particular ProPac® WCX-10), ProPac® SCX (in particular ProPac® SCX-10 or SCX-20), ProSwift WCX, MAbPac® SCX (in particular MAbPac® SCX-10) (marketed by Dionex) ; Bio Mab (in particular Bio Mab NP-5 or NP-10, marketed by Agilent), PL-SCX (marketed by Agilent); Sepax Antibodix TM (in particular Sepax Antibodix TM NP1.7, NP3, NP5 and NP10) (marketed by Sepax) (see Farnan et al.
  • ProPac® WCX in particular ProPac® WCX-10
  • ProPac® SCX in particular ProPac® SCX-10 or SCX-20
  • anion exchange resins suitable for use in the present invention include Source TM 15Q or 30Q, Mono TM -Q resins (commercially available from GE Life Sciences); ProPac® WAX (in particular ProPac® WAX-10), ProPac® SAX (in particular ProPac® SAX-10) (marketed by Dionex).
  • the elution of the fixed molecules may in particular be carried out using an elution buffer (mobile phase) containing ions of charge opposite to that of the resin ions, which will compete with the molecules fixed to interact with the charged charges. by the resin.
  • an elution buffer mobile phase
  • ions of charge opposite to that of the resin ions which will compete with the molecules fixed to interact with the charged charges. by the resin.
  • the elution is carried out not with the aid of an ionic strength gradient, but with the aid of a pH gradient.
  • many ionizable groups are sensitive to pH. With an ascending gradient of pH (i.e. increasing the pH), the ionization of the acid groups (negatively charged) is favored and the ionization of the basic groups (positively charged) is unfavorable. By increasing the pH, the appearance of a net negative charge is therefore favored for the molecules carrying pH-sensitive ionizable groups.
  • An ascending pH gradient thus also makes it possible to separate the charge isoforms of an antibody composition fixed on a negatively charged resin (cation exchange). With a descending gradient of pH (i.e.
  • Rea et al-2012 also describes the principle of this technology, as well as how to appropriately select the column, buffers and operation parameters for separating isoforms or antibody load variants (see section 8, pages 451 -452).
  • Example 1 also describes the separation of charge isoforms from an antibody composition by cation exchange chromatography and elution by an ascending pH gradient.
  • the elution can also be carried out by the combination of an ionic strength gradient and a pH gradient ("hybrid" elution), as described in Rea et al. -2012 (see section 9 page 453).
  • an ion exchange resin (anions or cations) is also used as a stationary or stationary phase, but elution is not performed using a force gradient ionic and / or pH, but using a displacement molecule, that is to say a molecule with a high affinity for the chromatography resin, which will compete for the fixation on the resin with the antibody molecules previously fixed on the resin, and thus move the antibody molecules having a lower affinity for the resin than the displacement molecule.
  • the antibody molecules are thus forced to migrate along the column by a wave of displacement molecule.
  • any elution buffer pH gradient or ionic strength
  • appropriate displacement may be used, depending on the chosen column.
  • resins and associated buffers are described in Farnan et al. 2009, Khawli et al. 2010, Lucas et al. 201, Zhang et al. 201, Rea et al. 201, and McAtee et al.
  • Another chromatographic technique that separates the charge isoforms from an antibody composition is chromatofocusing.
  • the proteins are separated according to their isoelectric point (p1).
  • This technique relies on the use of the combination of a particular resin (fixed or stationary phase) and a particular amphoteric buffer.
  • obtaining a linear gradient of pH requires an equal buffer capacity over the entire pH range used for the separation, hence the need for buffers designed specifically for this application and resins substituted with charged buffer amines.
  • the principle of separation is as follows: a chromatofocusing resin is equilibrated with a starting buffer at a pH slightly higher than the highest required pH. An elution buffer (adjusted to the lowest pH required) is passed through the column and begins to titrate the amines of the resin and proteins. As the elution buffer passes through the column, the pH is decreased and a descending and moving gradient of pH is generated. The sample is applied to the column after a first volume of elution buffers is passed over the column. The proteins in the sample are titrated (pH adjustment) as soon as that they are introduced in the column. Those that are at pH above their p1 are negatively charged and retained near the top of the column (by binding to positively charged amino groups). Proteins that are at a pH below their pI begin to migrate along the column with the buffer flow and will not bind to the column before reaching an area where the pH is greater than their pI. This is the beginning of the separation process.
  • proteins with different pIs migrate at different rates across the column as the pH gradient develops, binds, and continuously dissociates from the positively charged amino-bearing resin. by being gradually focused into narrow bands and finally eluted. Proteins with the highest pH are eluted first, while protein with the lowest pH is eluted last.
  • the resin used for separation by chromatofocusing is based on a conventional resin (crosslinked polymer or gel as described above, preferably in the form of beads as described above), in particular of the poly (styrene divinylbenzene) or agarose type. crosslinked, which is characterized by the grafting of positively charged amino groups. These amino groups positively charged buffers are especially secondary, tertiary and / or quaternary amine groups.
  • resins useful in chromafocalization include Mono TM -P (crosslinked poly (styrene divinylbenzene) grafted with secondary, tertiary and / or quaternary amine groups), PBE 94 and PBE 1 18 (crosslinked 6% agarose resins).
  • the Mono TM -P and PBE 94 columns are suitable for separation between pH 9 and pH 4, while the PBE 1 18 column is suitable for separation with a pH gradient starting above pH 9.
  • the Mono TM columns -P and PBE 94, and in particular the Mono TM -P column, are preferred.
  • the starting buffers used may in particular be based on a solution of diethanolamine, Tris, triethanolamine, bis-Tris, triethylamine, ethanolamine, imidazole, histidine, or piperazine at different pH (addition of a type of acid HCI, acetic acid, or iminodoacetic acid).
  • amphoteric elution buffers used include Polybuffer 74 (pH range: 7-4, for Mono TM -P and PBE 94 columns), Polybuffer 96 (pH range: 9-6, for Mono TM columns -P and PBE 94), and Pharmalyte pH8-10.5 (pH range: 1-18, for PBE column 1 18).
  • step b) of the method for obtaining a monoclonal antibody composition intended to be used as a medicament according to the invention the fractionation of step a) is carried out by one of the following chromatography techniques:
  • step b) of the method for obtaining a monoclonal antibody composition intended to be used as a medicament according to the invention the fractionation of step a) is carried out by one of the following techniques: following chromatography:
  • the inventors have been able to separate the isoforms or charge variants of a monoclonal antibody composition by two different techniques that may be used in the context of the invention:
  • the chromatogram of an antibody composition obtained by chromatographic technology for separating the charge isoforms still comprises a major peak comprising the major charge isoform as well as other isoforms close to the major isoform (this is that is to say with few modifications compared to the majority isoform and therefore a pl and a net charge at a given pH very close to that or that of the majority isoform), surrounded by minority peaks comprising on the one hand the isoforms called "acid”, whose pl is lower compared to the major isoform, and on the other hand the so-called "basic” isoforms, whose pl is greater than the majority isoform (see Figures 1-2) .
  • the different isoforms appear on the chromatogram and are eluted in the following order: • Use of cation exchange chromatography (negatively charged resin), whatever the elution mode (elution by ionic gradient, pH gradient, Ph gradient and ionic strength or by a molecule of displacement): the acidic isoforms (which are less positively charged than the major isoform) are eluted first, followed by the major isoform, then basic isoforms (which are more positively charged than the majority isoform) (see Figure 1).
  • Chromatofocusing the basic isoforms are eluted first, followed by the major isoform, then acid isoforms (see FIG. 1 of the present description);
  • the isoforms or charge variants of an antibody present in an antibody composition produced by a cell clone, a non-human transgenic animal or a transgenic plant may also be separated by other technologies than chromatography. However, if these technologies are very useful for the purpose of analysis or characterization of the isoforms or charge variants, they do not allow these isoforms to be separated with an acceptable yield and are therefore little used for a preparative purpose.
  • isoelectric focusing (so-called “IEF” for "Isoelectric focusing”, and also called electrofocusing).
  • FIE isoelectric focusing
  • the basic principle of isoelectric focusing (FIE) is to create in a gel (possibly included in a capillary) a pH gradient in which the proteins subjected to an electric field can move. The proteins will migrate in this electric field. Arrivals at the pH corresponding to their pl, they will stop because their net charge will be zero. In this way, it is possible to separate the proteins of a preparation according to their pl.
  • Such a pH gradient can be created with polyelectrolytes bearing a certain number of positively or negatively ionizable groups (amines, carboxyls or sulphates) and possessing a certain buffering power. These molecules are called ampholytes. If these ampholytes are subjected to an electric field bounded by a solution of a strong acid at the anode and by a solution of a strong base at the cathode, they will migrate and be distributed in order of pl. Their buffering capacity will help to maintain around them a small zone of pH equal to their pl. A series of ampholytes each having a pl covering a certain pH range will therefore create a continuous pH gradient. If a small amount of protein is migrated into this system, after or during training, they will also migrate and become immobile.
  • agarose As an inert matrix for the gel, it is possible to use agarose, acrylamide or, more rarely, dextran, in which the pH gradient will be formed. A polyacrylamide gel is most often used. Since only pI must influence migration, it is necessary to use acrylamide concentrations whose porosity will not slow down large proteins compared to small ones, but is sufficiently strong to be easily handled. A gel of 5-6% is usually the case.
  • the anode buffer is a strong acid, usually phosphoric acid.
  • a strong base is placed, often triethanoamine.
  • Ampholytes are included in the gel preparation mixture prior to polymerization. These molecules, which are polyelectrolytes, move in the electric field and arrange themselves one after the other in the order of their own pl. Many companies manufacture a large number of ampholyte mixtures covering very narrow or very wide ranges of pH: Ampholine® (including Ampholine® pH 6/8 and Ampholine® pH 7/9 marketed by Sigma Aldrich), Pharmalyte® (particularly Pharmalyte® pH 8 / 10.5 sold in particular by Sigma Aldrich and GE Healthcare, Life Sciences), BioLite® (in particular BioLite® pH 6/8, BioLite® pH 7/9 and BioLite® pH 8/10 marketed by Bio-Rad ), Zoom® (including Zoom® pH 6/9 marketed by Life Technologies / Invitrogen), Servalyt TM (including Servalyt TM pH 6/8, Servalyt TM pH 6/9, Servalyt TM pH 7/9 marketed by Serva), SinuLyte
  • each ampholyte When a voltage is applied between the two electrodes, each ampholyte will move to its isoelectric point and become immobilized there. Gradients of various pH amplitudes can be created by combining various ampholytes.
  • gradients with very small intervals eg 0.1 pH unit
  • the antibody composition to be analyzed may be added after polymerization of the gel or directly into the mixture prior to polymerization. Since the antibodies are larger than the ampholytes, they will migrate much more slowly and the ampholytes will therefore be able to stabilize well before the antibodies have moved substantially.
  • the duration of the migration is not critical. Indeed, the antibodies are not likely to come out of the gel since they will stop at the point where they have reached their pl. It is only necessary that the migration lasts long enough for the ampholytes to have the time to migrate properly and that the antibodies have time to reach their pl. At 2 mA, the estimated time required is about 1 hour.
  • the gel may be stained to analyze the different charge isoforms present in the antibody composition. Staining can be performed by any conventional technique used in conventional electrophoresis. However, ampholytes must be removed from the gel as they may become stained. Thus, the staining is usually preceded by soaking in a 5 or 10% trichloroacetic acid bath to diffuse out of the gel while fixing the antibodies on the spot.
  • markers possessing a given p1 makes it possible to determine quite precisely the p1 of the different isoforms of charge.
  • the proportion in the analyzed composition of each IEF separated charge isoform relative to the total isoforms can be quantified using image analysis software, such as the Quantity One® software, for example. by Bio-Rad.
  • the isoelectric focusing technology does not allow easy harvesting of the separated isoforms and is therefore generally used for analysis and quantification purposes. for purposes of preparative separation of different isoforms.
  • step c) of the process the composition of interest according to the invention, intended to be used as a medicament, is obtained by grouping one or more chromatographic fractions obtained in step b), corresponding to the peak majority of the chromatogram, the monoclonal antibody composition thus obtained being enriched in said majority peak, the latter representing at least 85%, advantageously at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, more at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, or at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least at least 98%, at least 98.5%, at least 99%, or at least 99.5% of the chromatogram of the composition obtained in step c).
  • a composition for use as a medicament at least 95%, advantageously at least 96%, at least 97%, at least 98%, or even at least 98.5%, at least 99% or at least 99.5% of the heavy chains of the antibodies present in the composition do not include a C-terminal lysine residue.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody composition, wherein at least 95%, preferably at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 98.5%, at least 99%, or at least less than 99.5% of the heavy chains of the antibodies present in the composition do not comprise a C-terminal lysine residue for use as a medicament.
  • the basic isoforms of the antibodies present in the composition have at least one heavy chain with a C-terminal lysine residue.
  • Such a composition thus comprises only the major isoform and acid isoforms. Since the basic isoforms are not very active for the effector functions via Fc ⁇ RIII and via the complement (see Examples) and represent before purification approximately 8 to 20% (measured by chromatography), such a composition is capable of inducing a stronger ADCC via Fc ⁇ RIII and a stronger CDC response than the total composition, before excluding basic isoforms.
  • Such a composition can be obtained by chromatographic separation as described above, but the collected fractions corresponding in this case to those of the acid and majority isoforms.
  • the antibody composition obtainable by the process described above and intended to be used as a medicament may be used in any pathology that may be treated with monoclonal antibodies, in particular when the destruction of target cells by ADCC or CDC is useful for treatment.
  • ADCC Alzheimer et al.
  • 1994, Velders et al. 1998, Cartron et al 2002, lanello et al-2005, Weiner et al-2010 the prevention of alloimmunization in Rh-negative pregnant women
  • Béliard et al-2008 the ADCC response is also known to play an important role in the anti-infectious response against viruses (Ahmad et al. 1996, Miao et al. (Albrecht et al 2007, Casadevall et al 2002) and parasites (Zeitlin et al 2000).
  • new therapies aim to eliminate the immune cells responsible for the attacks, such as B or T lymphocytes for example, the ADCC then playing a very important role (Edwards et al-2006; et al-2010).
  • the CDC response is also known to be important in various pathologies and in particular in the treatment of cancers.
  • the antibody is advantageously directed against a non-ubiquitous antigen present on healthy donor cells, an antigen of a cancer cell, an antigen of a cell infected with a pathogen, or an antigen from an immune cell.
  • the antibody is an anti-Rhesus D antibody (in particular Roledumab, Atorolimumab or Morolimumab, in particular Roledumab) and the composition is intended for the prevention of alloimmunisation in Rh-negative individuals,
  • the antibody is directed against an antigen of a cancer cell and the composition is for the treatment of cancer
  • the antibody is directed against an antigen of a cell infected with a pathogenic agent and the composition is intended for the treatment of an infection by said pathogenic organism,
  • the antibody is directed against an antigen of an immune cell and the composition is for the treatment of an autoimmune disease.
  • the antibodies can in particular be directed against the following antigens: CD20, Her2 / neu, CD52, EGFR, EPCAM, CCR4, CTLA-4 (CD152), CD19, CD22, CD3, CD30, CD33, CD4, CD40, CD51 (Integrin alpha-V), CD80, CEA, FR-alpha, GD2, GD3, HLA-DR, IGF1 R (CD221), phosphatidylserine, SLAMF7 (CD319), TRAIL-R1, TRAIL-R2.
  • Hematologic cancers rituximab, ofatumumab,
  • Solid cancers including:
  • lymphocytic leukemia Hematologic cancers, including lymphocytic leukemia
  • Solid tumors including:
  • colorectal cancer head cancer Futuximab, Imgatuzumab,
  • stomach glioma, astrocytoma Zalutumumab
  • Solid cancers including:
  • CCR4 Mogamulizumab including: Leukemia / adult T-cell lymphoma
  • CD152 Hematological cancers
  • Visilizumab in particular: multiple myeloma
  • CD33 Lintuzumab in particular: acute myeloid leukemia, myelodysplastic syndromes
  • Cedelizumab Cedelizumab, Clenoliximab, Melanoma, T cell lymphoma
  • Dacetuzumab in particular: non-lymphoma
  • Lucatumumab Hodgkin's Teneliximab, Hodgkin's Lymhoma, Multiple Myeloma
  • B cell lymphoma including: B cell lymphoma
  • Solid tumors including:
  • HLA-DR Apolizumab Hematologic cancers
  • Solid tumors including:
  • IGF1 R non-small lung cancer
  • CD221 cells, adenocortical carcinoma
  • pancreatic cancer Solid tumors including:
  • Solid tumors including:
  • Solid tumors including:
  • the antibodies may in particular be directed against the following antigens: antigens of Clostridium difficile, antigens of Staphylococcus aureus (in particular ClfA and lipotheicoic acid), antigens of cytomegalovirus (in particular glycoprotein B), Escherichia coli antigens (including Shiga-like toxin, MB subunit), Respiratory syncytial virus antigens (Protein F in particular), Hepatitis B virus antigens, Influenza A virus antigens (including haemagglutinin), Pseudomonas antigens aeruginosa serotype IATS 01 1, antigens of rabies virus (Glycoprotein in particular), phosphatidylserine
  • Clostridium difficile infection Clostridium difficile Bezlotoxumab ClfA antigen
  • glycoprotein B glycoprotein B
  • the antibodies can in particular be directed against the following antigens: CD20, CD52, CD25, CD2, CD22, CD3, and CD4. More specifically, specific pairs (antigen / autoimmune disease) known for their therapeutic interest (antibodies of this antigenic specificity approved in at least one country for the treatment of the aforementioned autoimmune disease, or clinical trials in progress) are indicated in Table 3. below.
  • Antibody compositions for use as a medicine according to the invention are particularly intended for therapies involving an ADCC response, which includes many cases as explained in detail above. It is therefore advantageous that these antibodies have also been optimized by other means to induce an in vivo ADCC response via the strongest possible FcyRIII receptor.
  • the antibody in a composition for use as a medicament according to the invention, comprises a modification of the Fc fragment increasing its binding to the Fc ⁇ RIII receptor and its effector properties via the Fc ⁇ RIII receptor.
  • a composition for use as a medicament according to the invention comprises a monoclonal antibody whose sequence has been modified at at least one amino acid residue of the Fc fragment to increase the binding to the Fc ⁇ RIII receptor, as described in WO00 / 42072, Shields et al-2001, Lazar et al. 2006, WO2004 / 029207, WO / 2004063351, WO2004 / 074455.
  • mutations at the following positions of Fc have been described as allowing to increase the affinity for the FcyRI II receptor and the ability to induce an ADCC via this receptor: 219, 222, 224, 239, 247, 256, 267 , 270, 283, 280, 286, 290, 294, 295, 296, 298, 300, 320, 326, 330, 332, 333, 334, 335, 339, 360, 377, 396.
  • Combinations of interesting mutations include: E333A / K334A, T256A / S298A, S298A / E333A, S298A / K334A, S298A / E333A / K334A, S267A / D280A (WO00 / 42072), S239D / I332E, S239D / I332E / A330L (Lazar and al-2006), V264I / I332E, S298A / I332E, S239E / I332E, S239Q / I332E, S239D / I332D, S239D / I332E, S239D / I332N, S239D / I332Q, S239E / I332D, S239E / I332N, S239N / I332E, S239Q / I332D, A330Y / I
  • a monoclonal antibody composition for use as a medicament according to the invention comprises a low fucose content.
  • fucose content is meant the percentage of fucosylated forms within the N-glycans attached to the Asn297 residue of the Fc fragment of each heavy chain of each antibody.
  • low fucose content is meant a fucose content less than or equal to 65%.
  • the fucose content is less than or equal to 65%, preferably less than or equal to 60%, 55% or 50%, or even less than or equal to 45%, 40%, 35% or 30%. , 25% or 20%. However, it is not necessary that the fucose content be zero, and it may for example be greater than or equal to 5%, 10%, 15% or 20%.
  • the fucose content can for example be between 5 and 65%, between 5 and 60%, between 5 and 55%, between 5 and 50%, between 5 and 45%, between 5 and 40%, between 5 and 35% between 5 and 30%, between 5 and 25%, between 5 and 20%, between 10 and 65%, between 10 and 60%, between 10 and 55%, between 10 and 50%, between 10 and 45%, between 10 and 40%, between 10 and 35%, between 10 and 30%, between 10 and 25%, between 10 and 20%, between 15 and 65%, between 15 and 60%, between 15 and 55%, between 15 and 50%, between 15 and 45%, between 15 and 40%, between 15 and 35%, between 15 and 30%, between 15 and 25%, between 15 and 20%, between 20 and 65%, between 20 and 60% between 20 and 55%, between 20 and 50%, between 20 and 45%, between 20 and 40%, between 20 and 35%, between 20 and 30%, between 20 and 25%.
  • the antibody composition may furthermore possess different types of glycosylation (oligomannose-type N-glycans or biantennary complexes, variable proportion of N-acetylglucosamine residues (GIcNAc)) or galactose residues in the case of N-glycans of the biantennary complex type. ), provided that it has a low fucose content.
  • glycosylation oligomannose-type N-glycans or biantennary complexes, variable proportion of N-acetylglucosamine residues (GIcNAc)) or galactose residues in the case of N-glycans of the biantennary complex type.
  • oligomannose-type N-glycans can be obtained by culturing in the presence of different glycosylation inhibitors, such as the inhibitors of ⁇ 1,2-mannosidase I (such as Deoxymannojirimycin or "DMM”) or ⁇ -glucosidase (such as castanospermine or "Cs"); or by production of the antibody in the CHO Lec 1 line.
  • different glycosylation inhibitors such as the inhibitors of ⁇ 1,2-mannosidase I (such as Deoxymannojirimycin or "DMM") or ⁇ -glucosidase (such as castanospermine or "Cs"); or by production of the antibody in the CHO Lec 1 line.
  • N-glycans of the biantennen complex type can be obtained in most mammalian cells, but also in bacteria, yeasts or plants whose glycosylation machinery has been modified.
  • lines naturally possess a low activity of the FUT8 (1, 6-fucosyltransferase) enzyme responsible for the addition of fucose to the Fc-linked GIcNAc; such as the YB2 / 0 line, the EB66® duck embryonic cell line, or the rat rat H4-II-E hepatoma lines (DSM ACC3129), H4-ll-Es (DSM ACC3130); can be used.
  • Mutant lines for other genes whose subexpression or overexpression leads to a low fucose content may also be used, such as the CHO Lec13 line, a mutant of the CHO line having decreased GDP-fucose synthesis.
  • N-glycans notably FUT8, see Yamane-Ohnuki et al-2004, but also GMD, a gene involved in the transport of GDP-fucose, see Kanda et al-2007.
  • Another alternative is to select a line of interest and overexpress a protein interfering in one way or another with the fucosylation of N-glycans, such as the protein GnTIII ( ⁇ (1,4) -N-acetylglucosaminetransferase III ).
  • GnTIII ⁇ (1,4) -N-acetylglucosaminetransferase III
  • Oligomannose N-glycans have a reduced half-life in vivo compared to biantennane-type N-glycans. Therefore, advantageously, the antibodies present in the composition have, at their N-glycosylation sites of the Fc fragment, glycan structures of the bantennate complex type, with a low fucose content, as defined above.
  • the monoclonal antibody composition may have a content of G0 + G1 + G0F + G1 F greater than 60% and a low fucose content as defined above. It may also have a G0 + G1 + G0F + G1 F content content greater than 65% and a low fucose content, as defined above. It may also have a G0 + G1 + G0F + G1 F content content greater than 70% and a low fucose content, as defined above. It may also have a G0 + G1 + G0F + G1 F content content greater than 75% and a low fucose content, as defined above.
  • G0 + G1 + G0F + G1 F content content greater than 80% and a low fucose content, as defined above. It may also have a G0 + G1 + G0F + G1 F content content greater than 60%, 65%, 70%, 75% or 80% and a G0F + G1 F content content of less than 50%.
  • the forms G0, G1, G0F and G1 F are as defined below:
  • Such antibody compositions can in particular be obtained by production in YB2 / 0, in CHO Lec13, in wild-type CHO lines cultured in the presence of small interfering RNAs directed against FUT8 or GMD, in CHO lines including the two alleles of the FUT8 gene. coding for the 1, 6- fucosyltransferase or the two alleles of the GMD gene encoding the GDP-fucose transporter in Golgi were deleted.
  • Antibody compositions for use as a medicine according to the invention are also intended for therapies involving a CDC response. It may therefore also be advantageous, in addition to or alternatively to modifications increasing the activity via Fc ⁇ RIII, that these antibodies have also been optimized by other means to induce a CDC response in vivo via the strongest C1 protein q possible.
  • the antibody in a composition for use as a medicament according to the invention, comprises a modification of the Fc fragment increasing its binding to C1 protein and its effector properties via complement.
  • the present invention also relates to the use of a chromatographic fractionation step to increase the ability of a monoclonal antibody composition directed against a given antibody to induce antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of target cells expressing said antigen by the effector cells of the immune system expressing the Fc ⁇ RIII receptor (CD16).
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • the composition thus obtained has an improved ability to induce ADCC of target cells expressing the antigen of interest by the effector cells of the immune system expressing the Fc ⁇ RIII receptor (CD16), and especially by natural killer cells (or NK cells for "Natural killer cells”).
  • the ratio R of the ADCC levels obtained with the composition enriched in isoforms of the major peak and with the composition before fractionation defined by the following formula:
  • ADCC level obtained with the isoform enriched composition of the majority ADCC rate peak obtained with the composition before fractionation is at least 1.15 (corresponding to an increase in the ADCC level of at least 15%); advantageously at least 1, 16; at least 1, 17; at least 1, 18; at least 1, 19; more preferably at least 1, 20; at least 1.25; at least 1.30; at least 1.35; at least 1.40; at least 1.45; or at least 1.50 (corresponding to an increase in the ADCC rate of at least 50%).
  • the present invention also relates to the use of a chromatography fractionation step for increasing the ability of a monoclonal antibody composition directed against a given antibody to induce complement-dependent cytotoxicity (CDC) of target cells expressing said antigen by the complement.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • composition thus obtained has an improved ability to induce complement lysis of target cells expressing the antigen of interest.
  • ratio R of the CDC levels obtained with the composition enriched in isoforms of the majority peak and with the composition before fractionation defined by the following formula:
  • CDC level obtained with the isoform enriched composition of the majority CDC level peak obtained with the composition before fractionation is at least 1.15 (corresponding to a CDC rate increase of at least 15%); advantageously at least 1, 16; at least 1, 17; at least 1, 18; at least 1, 19; more preferably at least 1, 20; at least 1.25; at least 1.30; at least 1.35; at least 1.40; at least 1.45; at least 1, 50 (corresponding to a CDC rate increase of at least 50%).
  • the chromatography fractionation step can be carried out in any of the above described ways to obtain the majority isoform enriched antibody compositions according to the invention for use as a medicament.
  • the fractionation can be carried out by one of the following chromatography techniques:
  • the monoclonal antibody composition for which such a chromatography fractionation step is performed in order to increase the ADCC or CDC response capabilities via the CD16 expressing effector cells may be any of the monoclonal antibody compositions described above.
  • the monoclonal antibody present in the composition may be human, humanized or chimeric.
  • the antibody can be directed against a cancer cell antigen, and in particular one of the antigens described above in the context of the treatment of cancers.
  • the antibody may be directed against an antigen of the infected cells, and in particular against one of the antigens described above as part of the treatment of infectious diseases.
  • the target cells are immune cells involved in the development of an autoimmune disease, the antibody can be directed against an antigen of these immune cells, and in particular against one of the antigens described above in the context of the treatment of autoimmune diseases.
  • the fractionation step by chromatography (step a)) is preferably followed by a step of grouping the chromatographic fractions obtained corresponding to the major peak of the chromatogram (step b)), the monoclonal antibody composition thus obtained being enriched in said majority peak, this representing at least 85% of the chromatogram of the composition obtained in step b) (after fractionation and grouping of the chromatographic fractions of interest).
  • Mono P 5/200 GL anion exchange resin was used. 20 mg of desalted protein were injected at each separation. Elution was performed using a descending pH gradient (pH 9.5 to 8.0), using the following two buffers:
  • Buffer A 25 mM diethanolamine
  • Buffer B polybuffer 96 + pharmalyte 8-10.5.
  • the eluates from the separations were collected in fractions of 2mL.
  • the fractions of interest are fractions 33 to 50.
  • Separation 1 has undergone a particular concentration so that the fractions can be rendered sterile by filtration:
  • SCX cation exchange resin (MabPac SCX 4x250 mm, Dionex) was used at 30 ° C. Elution was performed using an ascending pH gradient (pH 6 to 10), using the following two buffers:
  • Buffer A 20 mM NaH 2 PO 4, 60 mM NaCl (pH 6),
  • Buffer B 20 mM Na 2 HPO 4, 60 mM NaCl (pH 10).
  • the gradient was obtained as follows: 10% to 60% buffer B in 60 minutes.
  • the eluates of the separations were collected in fractions.
  • the fractions of interest are fractions 1 to 20. Analysis of CD16 receptor binding by BIACORE
  • SPR Surface Plasmon Resonance
  • a soluble CD16a receptor was immobilized on the detection chip using amine coupling.
  • One flow cell is used for the antibody, the other flow cell is left free to subtract the background noise.
  • the antibodies are injected at three concentrations and the kinetic parameters are estimated by performing for each concentration a binding ratio at both the association phase and the dissociation phase.
  • the SPR signal expressed in resonance units (RU), represents the association and dissociation of the antibody to the receptor.
  • the test used is the following:
  • the antibodies are incubated with WIL2-S cells (CD20 positive target cells) and Jurkat CD16 cells (effector cells) (CD16FF genotype).
  • WIL2-S cells CD20 positive target cells
  • Jurkat CD16 cells effector cells
  • IL2 cytokines
  • Antibody 50 ⁇ dilutions ranging from 0.156 to 10 ng / ml in IMDM 5% FCS
  • WIL2-S cells 50 ⁇ to 6x10 5 / ml in IMDM 5% SVF (ie 30x10 3 cells / 5 ( ⁇ l)
  • the WN2-S target cells are cultured in IMDM medium with 10% decomplemented FCS (medium 110). They are subcultured twice a week in 100 ml of media at 0.2 ⁇ 10 6 cells / ml in an F175 flask. The test is performed on transplanted cells for 24 to 72 hours, and repeated at 1. 10 6 cells / ml in an IMDM + 5% FCS decomplemented medium (medium 15).
  • Human serum (AB human serum obtained by coagulation of whole blood) is thawed on the day it is used. Thawing is carried out at + 4 ° C. After thawing, the serum is diluted to 1 ⁇ 2 in medium 15.
  • CelITiter-Blue® (Proméga) is stored at -20 ° C, thawed at room temperature before use.
  • the concentration of the antibodies to be studied is adjusted to 1 ⁇ g ml in medium 15.
  • concentration of the antibodies to be studied is adjusted to 1 ⁇ g ml in medium 15.
  • the cells are deposited directly in the plate after adjustment at 1.10 ° C. / ml and set at 37 ° C.
  • the cells and the sample are incubated for 5 minutes with shaking at 37 ° C. before depositing the serum.
  • the reading can be delayed the next day by stopping and stabilizing the reaction by adding 25 ⁇ l of 3% SDS.
  • the plate is then stored at room temperature.
  • the plates are centrifuged for 2 minutes at 125 g. 100 ⁇ of each well is taken and distributed in a black optical plate with transparent backgrounds while maintaining the plate plan.
  • the reading of the plate is performed with the fluorescence reader with the following parameters:
  • This method involves the use of a bacterial cysteine protease (IdeS, an enzyme that breaks down the immunoglobulins of Streptococcus pyogenes), which specifically cleaves the IgGs under their hinge domain, the heavy chain being cleaved into two 25 kDa fragments respectively constituted by the VH domains. -CH1 and CH2-CH3.
  • IdeS an enzyme that breaks down the immunoglobulins of Streptococcus pyogenes
  • the fragments are separated by liquid chromatography with an acetonitrile gradient and analyzed by mass spectrometry, by the following protocol:
  • fraction purified by chromatofocusing or by CEX were freeze-dried and redissolved in 20 ⁇ l of a digestion buffer (50 mM NaH2PO2 and 150 mM NaCl, pH 6.30), and 100 ⁇ l of IdeS enzyme were added in following the instructions of the enzyme kit (FabRICATOR Kit, Genovis, Lund, Sweden).
  • the preparation was incubated at 37 ° C for 1 hour under microwave power at 50 W power (CEM Discover System, CEM, Matthews, NC, USA) to improve hydrolysis.
  • a denaturing buffer 8M urea and 0.4M NH 4 HCO 3, pH 8.0
  • DTT dithiothreitol
  • the eluted species were then analyzed by a QSTAR mass spectrometer (QSTAR XL, Applied Biosystems, Toronto, Canada) operating in a positive ion mode of 500 to 3000 m / z and calibrated according to the procedure described by the manufacturer for renin .
  • QSTAR mass spectrometer QSTAR XL, Applied Biosystems, Toronto, Canada
  • FIG. 1 The chromatograms of the 3 separations are presented in FIG. 1, which shows that they are perfectly superimposable, thus demonstrating the reproducibility of the chromatofocusing separation method. Due to the use of an anion exchange resin and a descending pH gradient, the basic isoforms are eluted first followed by the major isoform followed by acid isoforms.
  • the chromatograms of 1 1 cation exchange chromatographic (CEX) separations of the charge isoforms are shown in FIG. 2. Due to the use of a cation exchange resin, the acid isoforms are eluted first, followed by isoform, followed by basic isoforms.
  • CEX cation exchange chromatographic
  • Peak 4 (P4, main peak) was reanalyzed to CEX to verify the purification efficiency.
  • the percentages of acidic, main and basic isoforms obtained before and after separation by CEX are shown in Figure 3 and Table 4 below, and clearly show the purification efficiency of the main peak.
  • the fraction corresponding to the major isoform induces a significantly greater activation of Jurkat CD16 cells than the fractions comprising the acidic or basic isoforms.
  • the ability of the different charge isoforms to activate effector cells via CD16 varies significantly, with the major isoform having a significantly improved ability compared to other isoforms to activate CD16 expressing effector cells.
  • Activation of Jurkat CD16 cells by a reference composition by the total composition before separation, and by the fractions F36 (basic isoforms), F39 (major isoform), and F43, F44, F48, F49 and F50 (isoforms of more and more acidic) of a separation by chromatofocusing.
  • CEX cation exchange chromatography
  • the purified fractions by chromatofocusing and the CEX purified fractions were analyzed by LC-MS to characterize the percentage of heavy chains with or without N-terminal lysine.

Abstract

La présente invention se situe dans le domaine technique des thérapies par anticorps impliquant un mécanisme de destruction de cellules cibles par ADCC. Elle concerne des compositions d'anticorps purifiées, obtenues par fractionnement par chromatographie des différentes isoformes de charge naturellement présentes dans une composition d'anticorps et regroupement d'une ou plusieurs fractions chromatographiques correspondant au pic majoritaire du chromatogramme, la composition d'anticorps monoclonal ainsi obtenue étant enrichie dans ledit pic majoritaire, celui-ci représentant au moins 85% du chromatogramme de la composition obtenue, pour une utilisation en tant que médicament.

Description

Nouveaux médicaments comprenant une composition d'anticorps enrichie en isoforme de charge majoritaire
Domaine de l'invention
La présente invention se situe dans le domaine technique des thérapies par anticorps impliquant un mécanisme de destruction de cellules cibles par ADCC. Elle concerne des compositions d'anticorps purifiées, obtenues par fractionnement par chromatographie des différentes isoformes de charge naturellement présentes dans une composition d'anticorps et regroupement d'une ou plusieurs fractions chromatographiques correspondant au pic majoritaire du chromatogramme, la composition d'anticorps monoclonal ainsi obtenue étant enrichie dans ledit pic majoritaire, celui-ci représentant au moins 85% du chromatogramme de la composition obtenue , pour une utilisation en tant que médicament. Art antérieur
On a assisté au cours de la dernière décennie à un fort développement des traitements d'immunothérapie passive à l'aide d'anticorps, souvent monoclonaux, dans différents domaines thérapeutiques : cancers, prévention de l'alloimmunisation chez les femmes enceintes Rhésus-négatives, maladies infectieuses, maladies inflammatoires et notamment autoimmunes.
Bien que les traitements d'immunothérapie passive à l'aide d'anticorps aient aujourd'hui démontré leur intérêt thérapeutique, les niveaux de réponse clinique observés sont encore insuffisants, et il existe donc un besoin pour des compositions d'anticorps plus efficaces, permettant d'augmenter les réponses cliniques et d'administrer des doses plus faibles, afin de limiter les effets secondaires.
Comme tout produit biologique, une composition d'anticorps est par nature hétérogène. En effet, les compositions d'anticorps utilisées en thérapie sont produites dans des systèmes biologiques (cellules, animaux ou plantes transgéniques), dans lesquels les protéines en général, et donc les anticorps en particuliers, sont soumis à un certain nombre de modifications post-traductionnelles (modifications enzymatiques ou dégradations), qui vont varier d'une molécule d'anticorps à une autre et générer ainsi une micro-hétérogénéité au sein de la composition d'anticorps produite.
Les anticorps sont des glycoprotéines constituées de quatre chaînes polypeptidiques : deux chaînes lourdes (dites « H » pour « heavy ») généralement identiques et deux chaînes légères (dites « L » pour « light ») généralement identiques associées par un nombre variable de ponts disulfures et des interactions non covalentes. Ces chaînes forment une structure en Y, la chaîne lourde contribuant au tronc du Y et à la moitié de chaque bras du Y, la chaîne légère contribuant à la moitié de chaque bras du Y. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant (CL) et d'un domaine variable (VL); les chaînes lourdes sont composées d'un fragment variable (VH) et de 3 ou 4 fragments constants (Cm à CH3 ou Cm) selon l'isotype de l'anticorps (les IgG comprennent 3 fragments constants Cm à Cm)- L'association de la chaîne légère (VL+CL) et des domaines VH et Cm de la chaîne lourde forment le fragment Fab, les domaines VL et VH associés étant responsables de la reconnaissance de l'antigène. Les domaines constants (CH2 et Cm) ou (CH2 à CH4) des deux chaînes lourdes forment le fragment constant Fc.
Les anticorps sont connus pour être soumis aux modifications post-traductionnelles suivantes : modifications terminales des chaînes lourdes ou légères, glycosylation de la partie Fc (et éventuellement des Fab), déamidation, isomérisation, oxidation, fragmentation, et agrégation (voir Vlasak et al-2008).
La plupart des modifications post-traductionnelles conduisent à une altération des propriétés de charge de surface de l'anticorps, soit directement en modifiant le nombre de groupes chargés, soit indirectement en introduisant des modifications structurales, qui elles-mêmes modifient la distribution locale des résidus chargés ou changent leur pKa. Toutes ces modifications génèrent donc également une microhétérogénéité, de nombreuses isoformes de charges différentes d'un même anticorps, avec des points isoélectriques (pl) distincts, cohabitant ainsi au sein d'une composition d'anticorps (voir Vlasak et al-2008).
Parmi les modifications post-traductionnelles, la glycosylation de la partie constante Fc des anticorps est aujourd'hui bien connue pour influencer fortement de nombreuses propriétés biologiques de l'anticorps : demi-vie in vivo (voir Wright et al- 1994), capacité à induire une réponse ADCC (réponse cellulaire cytotoxique dépendante de l'anticorps, voir Satoh et al-2006, Presta et al-2006), une réponse CDC (réponse cytotoxique dépendante du complément, voir Wright et al-1994, Presta et al-2006), etc .. En particulier, la teneur de la composition d'anticorps en formes glycanniques fucosylées est aujourd'hui connue pour affecter très fortement la capacité de la composition à induire une réponse ADCC in vivo.
Au contraire, bien que de nombreux articles visent à caractériser les isoformes de charge présents dans une composition d'anticorps pour justifier de la reproductibilité et de la qualité des lots commerciaux d'anticorps monoclonaux, les autres modifications post-traductionnelles conduisant à l'existence de nombreuses isoformes de charge distinctes d'un même anticorps au sein d'une composition d'anticorps ont jusqu'ici été considérées comme ayant peu ou pas d'impact sur les propriétés biologiques des anticorps in vivo. Ainsi, bien qu'il soit généralement considéré comme indispensable dans l'art antérieur de faire un suivi qualité des lots commerciaux d'anticorps sur le plan des isoformes de charge, ce suivi est considéré comme un pur suivi de qualité des produits et il n'a jamais été proposé d'utiliser une fraction purifiée d'une composition d'anticorps, fortement enrichie en un isoforme de charge particulier, dans un but thérapeutique. En effet, en absence de mise en évidence d'un effet significatif sur au moins certaines propriétés biologiques de la composition d'anticorps, il n'y avait aucune raison de ne pas utiliser la composition entière, de compliquer le procédé de préparation et diminuer le rendement. Or, comme indiqué ci-dessus, à l'exception de la glycosylation, les autres modifications post-traductionnelles conduisant à l'existence de nombreuses isoformes de charge distinctes d'un même anticorps au sein d'une composition d'anticorps étaient jusqu'ici considérées comme n'altérant pas les propriétés biologiques des anticorps. L'une des modifications conduisant à l'apparition de plusieurs isoformes de charge est le clivage enzymatique de la lysine C-terminale au niveau des chaînes lourdes de l'anticorps. Un tel clivage se produit, à différents degré selon les molécules d'anticorps, dès que l'anticorps est produit dans une cellule exprimant une carboxypeptidase. La présence d'une lysine C-terminale confère un caractère plutôt basique, du fait de la chaîne latérale de la lysine. Son clivage sur l'une et/ou l'autre chaîne lourde génère donc des isoformes plus acides. Il existe généralement des isoformes avec 0, 1 ou 2 lysines C-terminales sur les chaînes lourdes, créant ainsi trois isoformes avec des pl légèrement différents (voir Vlasak et al-2008). Sur cette modification particulière, Antes et al-2007 décrit l'analyse par focalisation isoélectrique (IEF) de lots d'un anticorps monoclonal humanisé anti-Lewis-Y IGN31 1 utilisé dans l'immunothérapie passive des cancers produits en présence ou en absence de sérum. Les auteurs montrent que les profils d'isoformes de charge des compositions d'anticorps produites en présence et en absence de sérum sont différents, la composition produite en absence de sérum étant moins affectée que celle produite en présence de sérum par le clivage enzymatique de la lysine C- terminale de la chaîne lourde de l'anticorps. L'analyse de l'effet de cette modification sur les capacités respectives des deux compositions à induire une réponse CDC (via le complément) n'a pas montré d'effet significatif lié à cette modification.
Un autre type de modification conduisant à l'apparition de plusieurs isoformes de charge au sein d'une composition d'anticorps est la cyclisation de résidus glutamine ou acide glutamique N-terminaux, qui conduit à la formation d'un groupement pyroglutamate (pE) et donc à des isoformes plus acides. Cette modification se produit de façon systématique, à différents degré, dans toute composition d'anticorps, mais n'est pas considérée comme susceptible d'affecter les propriétés fonctionnelles de l'anticorps (voir Vlasak et al-2008).
Encore un autre type de modification conduisant à l'apparition de plusieurs isoformes de charge au sein d'une composition d'anticorps est la formation d'adduits covalents et notamment les phénomènes de glycation (ajout non enzymatique de sucres), en particulier sur les résidus lysine, qui génèrent des isoformes plus acides. Ce type de modification est également considéré comme n'étant pas susceptible d'affecter les propriétés fonctionnelles de l'anticorps (voir Vlasak et al-2008).
Un autre type usuel de modification conduisant à l'apparition de plusieurs isoformes de charge au sein d'une composition d'anticorps est la déamidation de résidus asparagine et l'isomérisation de résidus aspartate, qui génère des isoformes plus acides. Dans la partie constante des anticorps, les résidus asparagine sensibles aux phénomènes de déamidation sont situés dans le domaine CH3, loin des sites de liaison au récepteur FcRn et aux récepteurs FcyR. Ces modifications sont donc généralement considérées comme n'étant pas susceptible d'affecter les propriétés fonctionnelles de l'anticorps (voir Vlasak et al-2008).
Khawli et al-2010 et Gandhi et al-201 1 décrivent la séparation par des techniques de chromatographie utilisant une résine échangeuse de cations des isoformes acides, majoritaire, et basiques d'une composition d'anticorps monoclonal utilisé une immunothérapie passive ; l'analyse des modifications post-traductionnelles conduisant à l'existence de plusieurs isoformes ; ainsi que l'étude des propriétés pharmacocinétiques et de certaines propriétés fonctionnelles de trois fractions purifiées (acide, majoritaire et basique). Dans les deux cas, le chromatogramme de la composition native montre, comme toujours, un pic majoritaire, entouré de pics comprenant des isoformes acides et de pics comprenant des isoformes basiques. Les modifications post-traductionnelles identifiées incluent notamment la réduction de certains ponts disulfures (Khawli et al-2010), des glycations (Khawli et al-2010 ; Gandhi et al-201 1 ), des déamidations (Khawli et al-2010 ; Gandhi et al-201 1 ), le clivage de lysines C-terminales des chaînes lourdes (Khawli et al-2010 ; Gandhi et al-201 1 ), la présence d'aggrégats (Gandhi et al-201 1 ), des phénomènes d'oxidation (Gandhi et al-201 1 ). L'analyse des propriétés pharmacocinétique (liaison FcRn et test in vivo dans Khawli et al-2010) n'a pas permis de mettre en évidence de différence significative de comportement au niveau des trois fractions purifiées testées. Dans les deux articles, la capacité des trois fractions purifiées à inhiber in vitro la prolifération d'une lignée cellulaire exprimant l'antigène dont l'anticorps est spécifique, en absence de cellules effectrices, a également été testée. Un tel test permet de mettre en évidence la capacité de liaison à l'antigène et d'induction d'apoptose. Bien que la fraction acide ait dans les deux articles une capacité très légèrement inférieure, les résultats ne sont pas significatifs et aucune différence significative n'a donc été observée entre les trois fractions purifiées. De plus, la fraction enrichie en isoforme majoritaire n'a pas de capacités améliorées par rapport à la composition d'anticorps totale, avant séparation des trois fractions.
Par ailleurs, d'autres documents décrivent comment analyser et/ou séparer certains isoformes de charge d'anticorps, mais sans comparer les propriétés effectrices des différentes isoformes. Ainsi, EP1308456 et WO2004/024866 décrivent des procédés chromatographiques visant à éliminer les variants acides d'une composition d'anticorps monoclonal, sans que les propriétés effectrices de la composition avant et après purification n'aient été testées. De même, WO201 1/009623 décrit un procédé chromatographique visant à éliminer les variants acides ou les variants basiques d'une composition d'anticorps monoclonal, sans que les propriétés effectrices de la composition avant et après purification n'aient été testées. De plus, le procédé décrit dans ce document ne permet d'éliminer qu'un seul type de variant et seule l'élimination des variants acides est effectivement mise en œuvre.
Ainsi, à l'exception de la glycosylation, qui est connue pour avoir des effets sur les propriétés fonctionnelles des anticorps, les éléments disponibles dans l'art antérieur concernant les autres modifications post-traductionnelles conduisant à l'obtention de plusieurs isoformes de charge (provenant de différentes modifications apportées à l'isoforme majoritaire), suggèrent que ces modifications n'ont pas d'impact sur les propriétés fonctionnelles des anticorps.
Pourtant, les inventeurs ont trouvé de façon surprenante qu'une fraction purifiée par chromatographie, enrichie en l'isoforme de charge majoritaire d'une composition d'anticorps, possède une capacité significativement plus forte à induire une réponse effectrice via le récepteur CD16 par les cellules effectrices exprimant ce récepteur. Ainsi, une fraction purifiée enrichie en l'isoforme de charge majoritaire d'une composition d'anticorps permet d'induire une plus forte réponse ADCC et une plus forte réponse CDC in vivo, et donc d'augmenter les réponses cliniques et/ou de diminuer les doses administrées, limitant ainsi les effets secondaires.
Résumé de l'invention
La présente invention concerne donc une composition d'anticorps monoclonal susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant :
a) la production d'une composition d'anticorps monoclonal à partir d'un clone cellulaire, d'un animal non-humain transgénique ou d'une plante transgénique,
b) le fractionnement de la composition obtenue à l'étape a) par chromatographie, et c) le regroupement d'une ou plusieurs fractions chromatographiques obtenues à l'étape b), correspondant au pic majoritaire du chromatogramme, la composition d'anticorps monoclonal ainsi obtenue étant enrichie dans ledit pic majoritaire, celui-ci représentant au moins 85%, avantageusement au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, plus avantageusement au moins 90%, au moins 91 %, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 98,5%, au moins 99%, ou au moins 99,5% du chromatogramme de la composition obtenue à l'étape c),
pour son utilisation en tant que médicament.
Avantageusement, l'étape b) est réalisée par fractionnement de la composition obtenue à l'étape a) par chromatographie échangeuse d'ions classique, par chromatofocalisation, ou par chromatographie d'interactions hydrophobes.
Avantageusement, la chromatographie échangeuse d'ions utilise l'un des moyens d'élution suivants :
• gradient de force ionique ; et/ou
• gradient de pH ; ou
• molécule de déplacement.
Avantageusement, dans une telle composition pour une utilisation en tant que médicament, au moins 95%, avantageusement au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, voire au moins 98,5%, au moins 99%, ou au moins 99,5% des chaînes lourdes des anticorps présents dans la composition ne comprennent pas de résidu lysine en C-terminal.
L'invention concerne également une composition d'anticorps monoclonal, dans laquelle au moins 95%, avantageusement au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, voire au moins 98,5%, au moins 99%, ou au moins 99,5% des chaînes lourdes des anticorps présents dans la composition ne comprennent pas de résidu lysine en C-terminal, pour son utilisation en tant que médicament.
Dans les compositions pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention, l'anticorps est avantageusement dirigé contre un antigène non ubiquitaire présent sur des cellules de donneur sain, un antigène d'une cellule cancéreuse, ou un antigène d'une cellule infectée par agent pathogène.
En particulier, les modes de réalisation suivant sont préférés :
l'anticorps est un anticorps anti-Rhésus D et la composition et destinée à la prévention de l'alloimmunisation chez les individus Rhésus-négatifs.
l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule cancéreuse et la composition et destinée au traitement d'un cancer, l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule infectée par un agent pathogène et la composition et destinée au traitement d'une infection par ledit organisme pathogène,
l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule immunitaire et la composition et destinée au traitement d'une maladie autoimmune.
Dans un mode de réalisation avantageux, dans une composition pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention, l'anticorps comprend une modification du fragment Fc augmentant sa liaison au récepteur FcyRIII et ses propriétés effectrices via le récepteur FcyRIII. La composition pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention peut notamment comprendre des mutations dans le fragment Fc augmentant sa liaison au récepteur FcyRIII et/ou une faible teneur en fucose. En particulier, avantageusement, les anticorps présents dans la composition possèdent sur leurs sites de N-glycosylation du fragment Fc des structures glycanniques de type biantenné, avec une teneur en fucose inférieure à 65%.
Dans un mode de réalisation avantageux, dans une composition pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention, l'anticorps comprend une modification du fragment Fc augmentant sa liaison à la protéine C1 q et ses propriétés effectrices via le complément
La présente invention concerne également l'utilisation d'une étape de fractionnement par chromatographie pour augmenter la capacité d'une composition d'anticorps monoclonal dirigé contre un anticorps donné à induire la cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC) de cellules cibles exprimant ledit antigène par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur FcyRIII (CD16).
La présente invention concerne également l'utilisation d'une étape de fractionnement par chromatographie pour augmenter la capacité d'une composition d'anticorps monoclonal dirigé contre un anticorps donné à induire la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) de cellules cibles exprimant ledit antigène par le complément. Description des figures
Figure 1. Chromatogrammes obtenus pour trois séparations par chromatofocalisation d'une composition d'anticorps anti-CD20 (résine échangeuse d'anions (colonne Mono™ P commercialisée par GE Life Sciences) avec élution par un gradient descendant de pH (de 9,5 à 8,0 en utilisant deux tampons : tampon A (diéthanolamine 25 mM), tampon B (polybuffer 96 + pharmalyte 8-10,5)). La composition d'anticorps a été dessalée, et 20 mg ont été injectés sur la colonne. Des fractions de 2 ml_ ont été collectées. Les fractions 33 à 50 ont été collectées pour analyse.
Figure 2. Superposition de 1 1 chromatogrammes correspondant à onze séparations par chromatographie échangeuse de cations (même colonne et élution que A). Les fractions F1 à F20 ont été collectées et regroupée par pics : P1 (acide, F1 à F3), P2 (acide, F4 et F5), P3 (acide, F6), P4 (pic principal, F7 à F10), P5 (basique, F1 1 ), P6 (basique, F12 à F14), P7 (basique, F15 à F17), et P8 (basique, F18 à F20).
Figure 3. Chromatogrammes de la composition d'anticorps anti-CD20 purifiée par CEX. A. Chromatogramme de la composition d'anticorps anti-CD20 avant purification. B. Chromatogramme de la composition formée par assemblage des fractions 1 à 20 correspondant au pic majoritaire du chromatogramme avant séparation (A). Le pourcentage des différents pics sont indiqués.
Figure 4. Liaison au CD16 (Biacore) des fractions purifiées par chromatographie échangeuse de cations. La liaison au CD16 de chaque échantillon est exprimée en pourcentage de la liaison au CD16 d'un échantillon de référence
Figure 5. Activité CD16 des fractions purifiées par chromatofocalisation (A) ou par chromatographie échangeuse de cations (B). L'activité CD16 (sécrétion d'IL-2 par les cellules Jurkat CD16) de chaque échantillon est exprimée en pourcentage de l'activité CD16 d'un échantillon de référence.
Figure 6. Cytotoxicité dépendante du complément (CDC) des fractions purifiées par chromatographie échangeuse de cations. La réponse CDC de chaque échantillon est exprimée en pourcentage de la réponse CDC d'un échantillon de référence.
Description détaillée de l'invention
La présente invention concerne donc une composition d'anticorps monoclonal susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant :
a) la production d'une composition d'anticorps monoclonal à partir d'un clone cellulaire, d'un animal non-humain transgénique ou d'une plante transgénique,
b) le fractionnement de la composition obtenue à l'étape a) par chromatographie, et
c) le regroupement d'une ou plusieurs fractions chromatographiques obtenues à l'étape b), correspondant au pic majoritaire du chromatogramme, la composition d'anticorps monoclonal ainsi obtenue étant enrichie dans ledit pic majoritaire, celui-ci représentant au moins 85%, avantageusement au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, plus avantageusement au moins 90%, au moins 91 %, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 98,5%, au moins 99%, ou au moins 99,5% du chromatogramme de la composition obtenue à l'étape c),
pour son utilisation en tant que médicament. A l'étape a), une composition d'anticorps monoclonal est produite à partir d'un clone cellulaire, d'un animal transgénique ou d'une plante transgénique.
Par « anticorps » ou « immunoglobuline », on entend une molécule comprenant au moins un domaine de liaison à un antigène donné et un domaine constant comprenant un fragment Fc capable de se lier aux récepteurs FcR. Chez la plupart des mammifères, comme l'homme et la souris, un anticorps est composé de 4 chaînes polypeptidiques : 2 chaînes lourdes et 2 chaînes légères reliées entre elles par un nombre variable de ponts disulfures assurant une flexibilité à la molécule. Chaque chaîne légère est constituée d'un domaine constant (CL) et d'un domaine variable (VL); les chaînes lourdes étant composées d'un domaine variable (VH) et de 3 ou 4 domaines constants (CH1 à CH3 ou CH1 à CH4) selon l'isotype de l'anticorps. Chez quelques rares mammifères, comme les chameaux et les lamas, les anticorps sont constitués de seulement deux chaînes lourdes, chaque chaîne lourde comprenant un domaine variable (VH) et une région constante.
Les domaines variables sont impliqués dans la reconnaissance de l'antigène, tandis que les domaines constants sont impliqués dans les propriétés biologiques, pharmacocinétiques et effectrices, de l'anticorps.
Contrairement aux domaines variables dont la séquence varie fortement d'un anticorps à un autre, les domaines constants sont caractérisés par une séquence en acides aminés très proche d'un anticorps à l'autre, caractéristique de l'espèce et de l'isotype, avec éventuellement quelques mutations somatiques. Le fragment Fc est naturellement composé de la région constante de la chaîne lourde à l'exclusion du domaine CH1 , c'est-à-dire de la région charnière inférieure et des domaines constants CH2 et CH3 ou CH2 à CH4 (selon l'isotype). Chez les lgG1 humaines, le fragment Fc complet est composé de la partie C-terminale de la chaîne lourde à partir du résidu cystéine en position 226 (C226), la numérotation des résidus d'acides aminés dans le fragment Fc étant dans toute la présente description celle de l'index EU décrit dans Edelman et al-1969 et Kabat et al-1991 . Les fragments Fc correspondants d'autres types d'immunoglobulines peuvent être identifiés aisément par l'homme du métier par des alignements de séquences.
Le fragment Fc est glycosylé au niveau du domaine CH2 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes lourdes, d'un /V-glycanne lié au résidu asparagine en position 297 (Asn 297). Les domaines de liaison suivants, situés dans le Fc, sont importants pour les propriétés biologiques de l'anticorps :
domaine de liaison au récepteur FcRn, impliqué dans les propriétés pharmacocinétiques (demi-vie in vivo) de l'anticorps :
Différentes données suggèrent que certains résidus situés à l'interface des domaines CH2 et CH3 sont impliqués dans la liaison au récepteur FcRn. domaine de liaison à la protéine du complément C1 q, impliqué dans la réponse CDC (pour « cytotoxicité dépendante du complément ») : situé dans le domaine CH2;
- domaine de liaison aux récepteurs FcR, impliqué dans les réponses de type phagocytose ou ADCC (pour « cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps) : situé dans le domaine CH2.
Au sens de l'invention, le fragment Fc d'un anticorps peut être naturel, tel que défini ci-dessus, ou bien avoir été modifié de diverses façons, à condition de comprendre un domaine de liaison aux récepteurs FcR (récepteurs FcyR pour les IgG) fonctionnel, et de préférence un domaine de liaison au récepteur FcRn fonctionnel. Les modifications peuvent inclure la délétion de certaines parties du fragment Fc, pourvu que celui-ci contienne un domaine de liaison aux récepteurs FcR (récepteurs FcyR pour les IgG) fonctionnel, et de préférence un domaine de liaison au récepteur FcRn fonctionnel. Les modifications peuvent également inclure différentes substitutions d'acides aminés susceptibles d'affecter les propriétés biologiques de l'anticorps, pourvu que celui-ci contienne un domaine de liaison aux récepteurs FcR fonctionnel, et de préférence un domaine de liaison au récepteur FcRn fonctionnel. En particulier, lorsque l'anticorps est un IgG, il peut comprendre des mutations destinées à augmenter la liaison au récepteur FcyRIII (CD16), telles que décrites dans WO00/42072, Shields et al-2001 , Lazar et al-2006, WO2004/029207, WO/2004063351 , WO2004/074455. Des mutations permettant d'augmenter la liaison au récepteur FcRn et donc la demi-vie in vivo peuvent également être présentes, comme décrit par exemple dans Shields et al-2001 , Dall'Acqua et al- 2002, Hinton et al-2004, Dall'Acqua et al-2006(a), WO00/42072, WO02/060919A2, WO2010/045193, ou WO2010/106180A2. D'autres mutations, comme celles permettant de diminuer ou d'augmenter la liaison aux protéines du complément et donc la réponse CDC, peuvent ou non être présentes (voir W099/51642, WO2004074455A2, Idusogie et al-2001 , Dall'Acqua et al-2006(b), et Moore et al- 2010).
Par « anticorps monoclonal » ou « composition d'anticorps monoclonal », on entend une composition comprenant des molécules d'anticorps possédant une spécificité antigénique identique et unique. Les molécules d'anticorps présentes dans la composition sont susceptibles de varier au niveau de leurs modifications post- traductionnelles, et notamment au niveau de leurs structures de glycosylation ou de leur point isolélectrique, mais ont toutes été codées par les mêmes séquences de chaînes lourde et légère et ont donc, avant toute modification post-traductionnelle, la même séquence protéique. Certaines différences de séquences protéique, liées à des modifications post-traductionnelles (comme par exemple le clivage de la lysine C-terminale de la chaîne lourde, la déamidation de résidus asparagine et/ou l'isomérisation de résidus aspartate), peuvent néanmoins exister entre les différentes molécules d'anticorps présentes dans la composition.
L'anticorps monoclonal présent dans la composition utilisée en tant que médicament dans le cadre de l'invention peut avantageusement être chimérique, humanisé, ou humain. En effet, cela permet d'éviter les réactions immunitaires du patient contre l'anticorps administré.
Par anticorps « chimérique », on entend désigner un anticorps qui contient une région variable (chaîne légère et chaîne lourde) naturelle dérivée d'un anticorps d'une espèce donnée en association avec les régions constantes de chaîne légère et chaîne lourde d'un anticorps d'une espèce hétérologue à ladite espèce donnée. Avantageusement, si la composition d'anticorps monoclonal pour son utilisation en tant que médicament selon l'invention comprend un anticorps monoclonal chimérique, celui-ci comprend des régions constantes humaines. Partant d'un anticorps non humain, un anticorps chimérique peut être préparé en utilisant les techniques de recombinaison génétique bien connues de l'homme du métier. Par exemple, l'anticorps chimérique pourra être réalisé en clonant pour la chaîne lourde et la chaîne légère un ADN recombinant comportant un promoteur et une séquence codant pour la région variable de l'anticorps non humain, et une séquence codant pour la région constante d'un anticorps humain. Pour les méthodes de préparation d'anticorps chimériques, on pourra par exemple se référer au document Verhoeyn et al-1988.
Par anticorps « humanisé », on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humaine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. En outre, certains des résidus des segments du squelette (dénommés FR) peuvent être modifiés pour conserver l'affinité de liaison (Jones et al-1986 ; Verhoeyen et al- 1988 ; Riechmann et al-1988). Les anticorps humanisés selon l'invention peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme de l'art telles les technologies de « CDR grafting », de « resurfacing », de SuperHumanisation, de « Human string content », de « FR libraries », de « Guided sélection », de « FR shuffling » et de « Humaneering », comme résumé dans la revue de Almagro et al- 2008.
Par anticorps « humain », on entend un anticorps dont toute la séquence est d'origine humaine, c'est-à-dire dont les séquences codantes ont été produites par recombinaison de gènes humains codant pour les anticorps. En effet, il est maintenant possible de produire des animaux transgéniques (par ex. des souris) qui sont capables, sur immunisation, de produire un répertoire complet d'anticorps humains en l'absence de production endogène d'immunoglobuline (voir Jakobovits et al-1993(a) et (b); Bruggermann et al-1993; et Duchosal et al-1992, U.S. patents 5,591 ,669, 5,598,369, 5,545,806, 5,545,807, 6,150,584). Les anticorps humains peuvent aussi être obtenus à partir de banques de présentation de phages (Hoogenboom et al-1991 ; Marks et al-1991 ; Vaughan et al-1996).
Les anticorps peuvent être plusieurs isotypes, en fonction de la nature de leur région constante : les régions constantes γ, α, μ, ε et δ correspondent respectivement aux immunoglobulines IgG, IgA, IgM, IgE et IgD. Avantageusement, l'anticorps monoclonal présent dans une composition utilisée en tant que médicament dans le cadre de l'invention est d'isotype IgG. En effet, cet isotype montre une capacité à engendrer une activité ADCC (« Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity », soit Cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps) chez le plus grand nombre d'individus (humains). Les régions constantes γ comprennent plusieurs sous-types : γ1 , γ2, γ3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, et γ4, créant ainsi les sous-isotypes lgG1 , lgG2, lgG3, et lgG4. Avantageusement, l'anticorps monoclonal présent dans une composition utilisée en tant que médicament dans le cadre de l'invention est d'isotype lgG1 ou lgG3, de préférence lgG1.
La composition d'anticorps monoclonal peut être produite par un clone cellulaire, un animal non-humain transgénique ou une plante transgénique, par des technologies bien connues de l'homme du métier.
Notamment, des clones cellulaires produisant la composition peuvent être obtenus par 3 technologies principales :
1 ) Obtention d'un hybridome par fusion d'un lymphocyte B produisant l'anticorps d'intérêt avec une lignée immortalisée,
2) Immortalisation d'un lymphocyte B produisant l'anticorps d'intérêt par le virus
Epstein-Barr (EBV),
3) Isolement des séquences codant pour un anticorps d'intérêt (généralement à partir d'un hybridome ou d'un lymphocyte B immortalisé), clonage dans un ou plusieurs vecteur(s) d'expression des séquences codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps, transformation d'une lignée cellulaire par le(s) vecteur(s) d'expression, et séparation des différents clones cellulaires obtenus. Un vecteur d'expression des chaînes lourde et légère de l'anticorps comprend les éléments nécessaires à l'expression des séquences codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps, et notamment un promoteur, un codon d'initiation de la transcription, des séquences de terminaison, et des séquences de régulation de la transcription appropriées. Ces éléments varient en fonction de l'hôte servant pour l'expression et sont choisis aisément par l'homme du métier au vu de ses connaissances générales. Le vecteur peut notamment être plasmidique ou viral. Les techniques de transformations sont également bien connues de l'homme du métier.
La transformation de lignées cellulaires par un ou plusieurs vecteur(s) d'expression des séquences codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps est la plus communément utilisée, en particulier pour l'obtention d'anticorps chimériques ou humanisés.
La lignée cellulaire transformée est de préférence d'origine eucaryote, et peut notamment être choisie parmi les cellules d'insecte, de plantes, de levure ou de mammifères. La composition d'anticorps peut alors être produite en cultivant la cellule hôte dans des conditions appropriées. Des lignées cellulaires appropriées pour la production d'anticorps incluent notamment les lignées choisies parmi : SP2/0 ; YB2/0 ; IR983F ; le myélome humain Namalwa ; PERC6 ; les lignées CHO, notamment CHO-K-1 , CHO-Lec10, CHO-Lec1 , CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, ou lignée CHO délétée pour les deux allèles codant pour le gène FUT8 et/ou le gène GMD ; Wil-2; Jurkat; Vero; Molt -4; COS-7; 293-HEK; BHK; K6H6; NSO; SP2/0-Ag 14, P3X63Ag8.653, lignée de cellule de canard embryonnaire EB66® (Vivalis) ; et lignées d'hépatome de rat H4-II-E (DSM ACC3129), H4-ll-Es (DSM ACC3130) (voir WO2012/041768) Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps est produit dans l'une des lignées suivantes : YB2/0 ; lignée CHO délétée pour les deux allèles codant pour le gène FUT8 et/ou le gène GMD ; lignée de cellule de canard embryonnaire EB66® (Vivalis) ; et lignées d'hépatome de rat H4-II-E (DSM ACC3129), H4-II-ES (DSM ACC3130). Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps est produit dans YB2/0 (ATCC CRL-1662). Alternativement, la composition d'anticorps peut être produite dans un animal non- humain transgénique.
Un animal non-humain transgénique peut être obtenu par injection directe du ou des gène(s) d'intérêt (ici, les gènes réarrangés codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps) dans un œuf fertilisé (Gordon et al-1980). Un animal non-humain transgénique peut également être obtenu par introduction du ou des gène(s) d'intérêt (ici, les gènes réarrangés codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps) dans une cellule souche embryonnaire et préparation de l'animal par une méthode d'agrégation de chimère ou une méthode d'injection de chimère (voir Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)). Un animal non-humain transgénique peut également être obtenu par une technique de clonage dans laquelle un noyau, dans lequel le ou les gène(s) d'intérêt (ici, les gènes réarrangés codant pour les chaînes lourde et légère de l'anticorps) a été introduit, est transplanté dans un œuf énucléé (Ryan et al-1997; Cibelli et al-1998, WO0026357A2). Un animal non humain transgénique produisant un anticorps d'intérêt peut être préparé par les méthodes ci-dessus. L'anticorps peut alors être accumulé dans l'animal transgénique et récolté, notamment à partir du lait ou des œufs de l'animal. Pour la production d'anticorps dans le lait d'animaux non humains transgéniques, des procédés de préparation sont notamment décrits dans WO9004036A1 , WO9517085A1 , WO0126455A1 , WO2004050847A2, WO2005033281 A2, WO2007048077A2. Des procédés de purification de protéines d'intérêt à partir du lait sont également connus (voir WO0126455A1 , WO2007106078A2). The animaux non humains transgéniques d'intérêt incluent notamment la souris, le lapin, le rat, la chèvre, les bovins (notamment la vache), et les volailles (notamment le poulet).
La composition d'anticorps peut être produite dans une plante transgénique. De nombreux anticorps ont déjà été produits dans des plantes transgéniques et les technologies nécessaires à l'obtention d'une plante transgénique exprimant un anticorps d'intérêt et à la récupération de l'anticorps sont bien connues de l'homme du métier (voir Stoger et al-2002, Fisher et al-2003, Ma et al-2003, Schillberg et al- 2005). Il est également possible d'influencer la glycosylation obtenue dans les plantes pour obtenir une glycosylation proche de celle des anticorps humains naturels (sans xylose), mais avec en outre une faible fucosylation, par exemple à l'aide de petits ARNs interférants (Forthal et al-2010).
A l'étape b) du procédé permettant d'obtenir une composition d'anticorps monoclonal destinée à être utilisée en tant que médicament selon l'invention, les différents isoformes de charge d'anticorps présents dans la composition obtenue à l'étape a) sont séparés par fractionnement de la composition obtenue à l'étape a) par chromatographie. Comme expliqué en introduction, toute composition d'anticorps monoclonal produite par un clone cellulaire, un animal transgénique non humain ou une plante transgénique est caractérisée par la présence d'un certain nombre d'isoformes ou variants de charge d'un même anticorps monoclonal. La présence de ces différents isoformes ou variants de charge est liée à l'existence de modifications post- traductionnelles conduisant à une altération des propriétés de charge de surface de l'anticorps, soit directement en modifiant le nombre de groupes chargés, soit indirectement en introduisant des modifications structurales, qui elles-mêmes modifient la distribution locale des résidus chargés ou changent leur pKa. Chaque isoforme ou variant de charge est caractérisé par son point isoélectrique (pl, encore appelé potentiel hydrogène isoélectrique (pHI)), qui correspond au pH (potentiel hydrogène) pour lequel la charge globale de cette molécule est nulle ou, autrement dit, le pH pour lequel la molécule est électriquement neutre (forme zwitterionique ou ion mixte). A un pH donné, les différents isoformes ou variants de charge d'un anticorps monoclonal auront donc des charges nettes variables, ceux dont le pl est inférieur au pH portant une charge négative (la molécule a tendance à céder ses protons au milieu basique), ceux dont le pl est égal au pH étant neutres, et ceux dont le pl est supérieur au pH portant une charge positive (la molécule a tendance à conserver ses protons ou à en capter du milieu acide). Les différents isoformes ou variants de charge d'un anticorps monoclonal sont présents dans des proportions variables, en fonction de la fréquence des modifications post-traductionnelles présentes sur chaque variant. Une composition d'anticorps monoclonal comprend généralement un variant ou isoforme majoritaire, accompagné d'une pluralité de variants ou isoformes dits acides ou basiques, selon que leur pl est inférieur ou supérieur à celui de l'isoforme majoritaire. Selon l'anticorps, son mode de production et les étapes de purifications qu'il peut avoir déjà subies, les proportions des isoformes acides, du pic majoritaire et des isoformes basiques (calculés à partir du chromatogramme d'une chromatographie échangeuse d'ions), varient généralement autour des valeurs suivantes : 10 à 30% d'isoformes acides, 50 à 75% de pic majoritaire, et 8 à 20% d'isoformes basiques (voir Farnan et al-2009, Rea et al-201 1 , Rea et al-2012, Khawli et al-2010, Zhang et al-201 1 , WO201 1/009623, et EP1308456).
Du fait de leurs différences en termes de pl et de charge nette à un pH donné, les isoformes de charge d'anticorps présentes dans une composition d'anticorps donnée peuvent être séparées par différentes technologies de chromatographie.
La chromatographie est une technique de séparation des substances chimiques (mélange homogène liquide ou gazeux) qui repose sur des différences de comportement entre une phase mobile courante et une phase stationnaire (ou phase fixe). On peut classer les méthodes chromatographiques d'après la nature des phases utilisées ou celle des phénomènes mis en œuvre dans la séparation. Dans un mode de réalisation de l'invention, le fractionnement de l'étape b) est réalisé à l'aide d'une chromatographie échangeuse d'ions. Cela permet en effet de séparer les isoformes de charge d'une même protéine. Dans la chromatographie échangeuse d'ions (anions ou cations), le paramètre qui va permettre la séparation des différents constituants est leur charge nette.
La composition d'anticorps est d'abord chargée sur une résine échangeuse d'ions. Pour cela, on utilise des résines (phase fixe ou stationnaire) chargées positivement (chromatographie échangeuse d'anions) ou négativement (chromatographie échangeuse de cations). Les molécules de charge opposée à celle des ions de la résine seront retenues/fixées sur la résine.
On peut utiliser tout type de résine échangeuse de cations ou d'anions, forte ou faible, connue de l'homme du métier et appropriée pour la séparation de la composition d'anticorps d'intérêt. En fonction de sa séquence protéique, le point isoélectrique (pl) moyen d'une composition d'anticorps varie généralement entre 5 et 9, le plus souvent entre 7 et 9. Pour un pl supérieur à 8, une résine échangeuse de cations est utilisée. A l'inverse, pour un pl inférieur à 6, une résine échangeuse d'anions est utilisée. Pour un pl compris entre 6 et 8, les deux types de résines échangeuses d'ions (cations ou anions) peuvent être testés. Ainsi, même si une chromatographie échangeuse de cations (résine chargée négativement) suivie d'une élution avec un gradient de force ionique est le plus souvent utilisée, il est également possible dans certains cas d'utiliser une chromatographie échangeuse d'anions (résine chargée positivement).
Les résines échangeuses d'ions sont généralement constituées d'un polymère réticulé ou gel, sur lequel des groupements chargés positivement (résine échangeuse d'anions) ou négativement (résine échangeuse de cations) sont greffés. Le polymère réticulé ou gel peut notamment être choisi parmi le dextrane (ex : Sephadex®), l'agarose (ex : Sepharose®), la cellulose, les polymères de méthacrylate (ex : Fratogel®), les polymères vinyliques (ex : Fractoprep®) tels que le poly(styrène divinylbenzène) (ex : Monobeads™ ; Source™ ; Bio Mab NP-5 ou NP-10 ; Sepax Antibodix™ NP1 .7, NP3, NP5 et NP10).
Le gel peut avantageusement se présenter sous forme de billes, avec un diamètre moyen compris entre 10 et 200 μηη.
Pour les résines échangeuses de cations, des groupements chargés négativement sont greffés sur le polymère réticulé, tels que des groupements de type sulfopropyl (SP), méthyl sulfonate (S) ou carboxyméthyl (CM). Pour les résines échangeuses d'anions, des groupements chargés positivement sont greffés sur le polymère réticulé, tels que des groupements de type ammonium quaternaire (Q), notamment aminoéthyle quaternaire (QAE), diéthylaminoéthyle (DEAE), diméthylaminoéthyle (DMAE), triméthylaminoéthyl (TMAE), ou diméthylaminopropyle (ANX).
Des résines échangeuses de cations susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la présente invention incluent les résines Source™ 15S ou 30S, Mono-S (commercialisées par GE Life Sciences) ; ProPac® WCX (en particulier ProPac® WCX-10), ProPac® SCX (en particulier ProPac® SCX-10 ou SCX-20), ProSwift WCX, MAbPac® SCX (en particulier MAbPac® SCX-10) (commercialisées par Dionex) ; Bio Mab (en particulier Bio Mab NP-5 ou NP-10, commercialisées par Agilent), PL-SCX (commercialisées par Agilent) ; Sepax Antibodix™ (en particulier Sepax Antibodix™ NP1 .7, NP3, NP5 et NP10) (commercialisées par Sepax) (voir Farnan et al-2009, Khawli et al-2010, Gandhi et al-201 1 , Zhang et al-201 1 , Rea et al-201 1 et McAtee et al-2012). De même, des résines échangeuses d'anions susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la présente invention incluent les résines Source™ 15Q ou 30Q, Mono™-Q (commercialisées par GE Life Sciences) ; ProPac® WAX (en particulier ProPac® WAX-10), ProPac® SAX (en particulier ProPac® SAX-10) (commercialisées par Dionex).
Une fois la composition d'anticorps chargée sur la résine échangeuse d'ions, différents modes d'élution peuvent être utilisés pour séparer les isoformes de charge.
L'élution des molécules fixées peut notamment être réalisée en utilisant un tampon d'élution (phase mobile) contenant des ions de charge opposée à celle des ions de la résine, qui vont entrer en compétition avec les molécules fixées pour interagir avec les charges portées par la résine. On peut soit utiliser directement un tampon contenant une forte concentration en ions (pour éluer toutes les molécules d'un coup) ou au contraire augmenter progressivement la concentration ionique (on parle alors de gradient de force ionique), ce qui permet de décrocher successivement les différentes molécules en fonction de la force de leurs interactions électrostatiques avec la résine. Pratiquement, dans ce dernier cas de figure, on utilise deux solutions tampon, l'une de faible concentration ionique et l'autre de forte concentration ionique. Deux pompes pilotées aspirent et mélangent ces deux solutions selon un rapport qui varie avec le temps (la proportion de solution de forte concentration ionique augmentant progressivement). Le produit de ce mélange est utilisé dans la colonne. Des exemples de procédés précis de séparation des isoformes de charges d'une composition d'anticorps par cette technologie sont décrits dans Gandhi et al- 201 1 . Rea et al-2012 décrit également le principe de cette technologie, ainsi que comment choisir de manière appropriée la colonne, les tampons et les paramètres d'opération pour séparer des isoformes ou variants de charge d'anticorps (voir section 7 pages 447-451 ).
Dans une variante de la chromatographie échangeuse d'ions l'élution est réalisée non pas à l'aide d'un gradient de force ionique, mais à l'aide d'un gradient de pH. En effet, de nombreux groupes ionisables sont sensibles au pH. Avec un gradient ascendant de pH (i.e. en augmentant le pH), on favorise l'ionisation des groupements acides (chargés négativement) et on défavorise l'ionisation des groupements basiques (chargés positivement). En augmentant le pH, on favorise donc l'apparition d'une charge nette négative pour les molécules portant des groupes ionisables sensibles au pH. Un gradient ascendant de pH permet donc également de séparer les isoformes de charge d'une composition d'anticorps fixées sur une résine chargée négativement (échangeuse de cations). Avec un gradient descendant de pH (i.e. en diminuant le pH), on favorise l'ionisation des groupements basiques (chargés positivement) et on défavorise l'ionisation des groupements acides (chargés négativement). En diminuant le pH, on favorise donc l'apparition d'une charge nette positive pour les molécules portant des groupes ionisables sensibles au pH. Un gradient descendant de pH permet donc également de séparer les isoformes de charges d'une composition d'anticorps fixées sur une résine chargée positivement (échangeuse d'anions). Des exemples de procédés précis de séparation des isoformes de charges d'anticorps par chromatographie échangeuse d'ions avec élution par un grandient de pH sont décrits dans Farnan et al-2009 et Rea et al-201 1. Rea et al-2012 décrit également le principe de cette technologie, ainsi que comment choisir de manière appropriée la colonne, les tampons et les paramètres d'opération pour séparer des isoformes ou variants de charge d'anticorps (voir section 8 pages 451 -452). L'Exemple 1 décrit aussi la séparation des isoformes de charges d'une composition d'anticorps par chromatographie échangeuse de cations et élution par un gradient ascendant de pH.
Dans une autre variante de la chromatographie échangeuse d'ions, l'élution peut également être réalisée par la combinaison d'un gradient de force ionique et d'un gradient de pH (élution dite « hybride »), comme décrit dans Rea et al-2012 (voir section 9 page 453).
Dans encore une autre variante de la chromatographie échangeuse d'ions, appelée ici « chromatographie échangeuse d'ions de déplacement » et qui permet également de séparer les isoformes de charges d'une composition d'anticorps, une résine échangeuse d'ions (anions ou cations) est également utilisée comme phase fixe ou stationnaire, mais l'élution est réalisée non pas à l'aide d'un gradient de force ionique et/ou de pH, mais à l'aide d'une molécule de déplacement, c'est-à-dire d'une molécule ayant une forte affinité pour la résine de chromatographie, qui va entrer en compétition pour la fixation sur la résine avec les molécules d'anticorps préalablement fixées sur la résine, et ainsi déplacer les molécules d'anticorps ayant une plus faible affinité pour la résine que la molécule de déplacement. Les molécules d'anticorps sont ainsi forcées à migrer le long de la colonne par une vague de molécule de déplacement. Comme celle-ci traverse la colonne, un nouvel équilibre s'installe, dans lequel les molécules d'anticorps entrent en compétition les unes avec les autres pour les sites de liaison à la résine restant disponibles. Au cours de ce processus d'équilibrage dynamique, les différents variants ou isoformes de charge d'anticorps sont séparés en fonction de leur affinité plus ou moins grande pour la résine échangeuse d'ions. Le principe de cette méthode de séparation chromatographique, ainsi que des résines, tampons et matériels nécessaires pour sa mise en œuvre afin de séparer les isoformes de charges d'une composition d'anticorps sont notamment décrits dans Khawli et al-2010, Zhang et al-201 1 , et McAtee et al-2012.
Dans ces différents modes d'élution de la chromatographie échangeuse d'ins, tout tampon d'élution (gradient de pH ou de force ionique) ou de déplacement approprié peut être utilisé, en fonction de la colonne choisie. Des exemples de résines et tampons associés sont décrits dans Farnan et al-2009, Khawli et al-2010, Gandhi et al-201 1 , Zhang et al-201 1 , Rea et al-201 1 et McAtee et al-2012.
Une autre technique de chromatographie qui permet de séparer les isoformes de charge d'une composition d'anticorps est la chromatofocalisation. Dans cette technique, les protéines sont séparées en fonction de leur point isoélectrique (pl). Cette technique repose sur l'utilisation de l'association d'une résine (phase fixe ou stationnaire) particulière et d'un tampon amphotère particulier. Notamment, l'obtention d'un gradient linéaire de pH requiert une capacité tampon égale sur toute la gamme de pH utilisée pour la séparation, d'où la nécessité de tampons conçus spécifiquement pour cette application et de résines substituées avec des aminés tampon chargées.
Le principe de la séparation est le suivant : une résine de chromatofocalisation est équilibrée avec un tampon de départ à un pH légèrement supérieur au pH le plus haut requis. Un tampon d'élution (ajusté au pH le plus bas requis) est passé à travers la colonne et commence à titrer les aminés de la résine et des protéines. Au fur et à mesure que le tampon d'élution passe à travers la colonne, le pH est diminué et un gradient descendant et mouvant de pH est généré. L'échantillon est appliqué à la colonne après qu'un premier volume de tampons d'élution soit passé sur la colonne. Les protéines de l'échantillon sont titrées (ajustement du pH) dès qu'elles sont introduites dans la colonne. Celle qui sont à un pH supérieur à leur pl sont chargées négativement et retenues près du sommet de la colonne (par liaison aux groupements aminés chargés positivement). Les protéines qui sont à un pH inférieur à leur pl commencent à migrer le long de la colonne avec le flux de tampon et de se lieront pas à la colonne avant d'atteindre une zone où le pH est supérieur à leur pl. C'est de début du processus de séparation.
Au fur et à mesure que le pH continue à diminuer au sommet de la colonne (évolution du gradient de pH), toute protéine dont le pl est supérieur au nouveau pH devient chargée positivement, est repoussée par les groupements aminés chargés positivement, et commence à migrer le long de la colonne avec le tampon d'élution, sa migration étant plus rapide que celle du gradient de pH. Au fur et à mesure que cette protéine migre le long de la colonne, le pH augmente. Lorsque la protéine atteint une zone où le pH est supérieur à son pl, elle redevient chargée négativement et se lie à nouveau à la colonne. Elle reste liée jusqu'à ce que le gradient de pH mouvant réduise le pH local en dessous de son pl, moment où elle redevient chargée positivement et recommence à migrer. Ce processus se répète jusqu'à ce que la protéine soit éluée de la colonne à un pH proche de son pl.
Le nom de cette technologie provient d'un effet de focalisation de la technique. En effet, dans un gradient descendant de pH, une protéine peut exister sous trois états de charge : positive, négative ou neutre. De plus, dans la chromatofocalisation, l'état de charge d'une protéine varie sans cesse au fur et à mesure que le gradient de pH se développe et que la protéine migre à travers les différentes zones de pH de la colonne. Les molécules à l'arrière d'une zone vont migrer plus rapidement que celles à l'avant de cette même zone, formant progressivement des bandes de plus en plus étroites de protéines, chaque bande correspondant à une ou plusieurs protéines de même pl.
Ainsi, en chromatofocalisation, les protéines ayant des pl différents migrent à différentes vitesses à travers la colonne au fur et à mesure que le gradient de pH se développe, se liant et se dissociant continuellement de la résine porteurs de groupements aminés tampons chargés positivement, tout en étant progressivement focalisées en bandes étroites et finalement éluées. Les protéines avec le pl le plus élevé est éluée la première, alors que la protéine avec le pl le plus faible sera éluée la dernière.
La résine utilisée pour une séparation par chromatofocalisation est fondée sur une résine classique (polymère réticulé ou gel tel que décrit ci-dessus, de préférence sous forme de billes tel que décrit ci-dessus), notamment de type poly(styrène divinylbenzène) ou agarose réticulé, celle-ci étant caractérisée par le greffage de groupements aminés tampons chargés positivement. Ces groupements aminés tampons chargés positivement sont notamment des groupements aminés secondaires, tertiaires et/ou quaternaires. Des exemples de résines utile en chromafocalisation incluent les colonnes Mono™-P (poly(styrène divinylbenzène) réticulé greffé avec des groupements aminés secondaires, tertiaires et/ou quaternaires), PBE 94 et PBE 1 18 (résines d'agarose à 6% réticulée greffée par des groupements aminés secondaires, tertiaires et/ou quaternaires liés aux monosaccharides par des liaisons éther) commercialisées par GE Life Sciences ou GE Healthcare. Les colonnes Mono™-P et PBE 94 sont appropriées pour une séparation entre pH 9 et pH 4, tandis que la colonne PBE 1 18 est appropriée pour une séparation avec un gradient de pH commençant au-dessus de pH 9. Les colonnes Mono™-P et PBE 94, et notamment la colonne Mono™-P, sont préférées. Les tampons de départ utilisés peuvent reposer notamment sur une solution de diéthanolamine, de Tris, de triéthanolamine, de bis-Tris, de triélthylamine, d'éthanolamine, d'imidazole, d'histidine, ou de pipérazine à différents pH (ajout d'un acide type HCI, acide acétique, ou acide iminodoacétique).
Les tampons amphotères d'élution utilisés incluent notamment les tampons Polybuffer 74 (gamme de pH : 7-4, pour les colonnes Mono™-P et PBE 94), Polybuffer 96 (gamme de pH : 9-6, pour les colonnes Mono™-P et PBE 94), et Pharmalyte pH8-10.5 (gamme de pH : 1 1 -8, pour la colonne PBE 1 18).
Des instructions précises d'utilisation et de sélection de ces tampons sont disponibles auprès du fabricant de ces colonnes.
Encore une autre technique de chromatographie permettant de séparer les isoformes de charge d'une composition d'anticorps est la chromatographie d'interactions hydrophobes.
Ainsi, avantageusement, à l'étape b) du procédé permettant d'obtenir une composition d'anticorps monoclonal destinée à être utilisée en tant que médicament selon l'invention, le fractionnement de l'étape a) est réalisé par l'une des techniques de chromatographie suivantes :
• chromatographie échangeuse d'ions (anions ou cations) avec élution par un gradient de force ionique (chromatographie échangeuse d'ions avec gradient de force ionique),
• chromatographie échangeuse d'ions (anions ou cations) avec élution par un gradient (ascendant en cas d'échange de cations, descendant en cas d'échange d'anions) de pH (chromatographie échangeuse d'ions avec gradient de pH), • chromatographie échangeuse d'ions (anions ou cations) avec élution par un gradient de force ionique et de pH (chromatographie échangeuse d'ions hybride),
• chromatographie échangeuse d'ions (anions ou cations) avec élution par une molécule de déplacement (chromatographie échangeuse d'ions de déplacement),
• chromatofocalisation, et
• chromatographie d'interactions hydrophobes.
Avantageusement, à l'étape b) du procédé permettant d'obtenir une composition d'anticorps monoclonal destinée à être utilisée en tant que médicament selon l'invention, le fractionnement de l'étape a) est réalisé par l'une des techniques de chromatographie suivantes :
• chromatographie échangeuse d'ions (quel que soit le mode d'élution), en particulier la chromatographie échangeuse d'ions avec gradient de pH, et
• chromatofocalisation.
En particulier, les inventeurs ont pu séparer les isoformes ou variants de charge d'une composition d'anticorps monoclonal par deux techniques différentes, susceptibles d'être utilisées dans le cadre de l'invention :
• chromatofocalisation : colonne Mono™ P (GE Life Sciences) avec élution par un gradient descendant de pH (de 9,5 à 8,0 en utilisant deux tampons : tampon A (diéthanolamine 25 mM), tampon B (polybuffer 96 + pharmalyte 8- 10,5)) ;
• chromatographie échangeuse de cations (colonne SCX, MabPac, Dionex) avec élution par un gradient ascendant de pH (Tampon A : 20 mM NaH2P04, 60 mM NaCI (pH 6) ; Tampon B : 20 mM Na2HP04, 60 mM NaCI (pH10), gradient : 10% à 60% de Tampon B en 60 minutes).
Le chromatogramme d'une composition d'anticorps obtenu par une technologie de chromatographie permettant de séparer les isoformes de charge comprend toujours un pic majoritaire comprenant l'isoforme de charge majoritaire ainsi que d'autres isoformes proches de l'isoforme majoritaire (c'est-à-dire avec peu de modifications par rapport à l'isoforme majoritaire et donc un pl et une charge nette à un pH donné très proche de celui ou celle de l'isoforme majoritaire), entouré de pics minoritaires comprenant d'une part les isoformes dites « acides », dont le pl est inférieur par rapport à l'isoforme majoritaire, et d'autre part les isoformes dites « basiques », dont le pl est supérieur par rapport à l'isoforme majoritaire (voir Figures 1 -2).
En fonction de la technique de chromatographie utilisée, les différents isoformes apparaissent sur le chromatogramme et sont élués dans l'ordre suivant : • Utilisation d'une chromatographie échangeuse de cations (résine chargée négativement), quel que soit le mode d'élution (élution par un gradient de force ionique, un gradient de pH, un gradient de Ph et de force ionique ou par une molécule de déplacement) : les isoformes acides (qui sont moins positivement chargées que l'isoforme majoritaire) sont élués les premiers, suivis de l'isoforme majoritaire, puis des isoformes basiques (qui sont davantage positivement chargées que l'isoforme majoritaire) (voir Figure 1 de Khawli et al-2010, Figure 3 de Rea et al-2012 ; Figure 1 de Farnan et al- 2009 et Figure 1 de Rea et al-201 1 ; Figure 1 de Zhang et al-201 1 et Figure 8.10.2 de McAtee et al-2012 ; et Figure 2 de la présente description) ;
• Utilisation d'une chromatographie échangeuse d'anions (résine chargée positivement), quel que soit le mode d'élution (élution par un gradient de force ionique, un gradient de pH, un gradient de Ph et de force ionique ou par une molécule de déplacement) : les isoformes basiques (qui sont moins négativement chargés que l'isoforme majoritaire) sont élués les premiers, suivis de l'isoforme majoritaire, puis des isoformes acides (qui sont davantage négativement chargées que l'isoforme majoritaire) ;
• Chromatofocalisation : les isoformes basiques sont élués les premiers, suivis de l'isoforme majoritaire, puis des isoformes acides (voir Figure 1 de la présente description) ;
Les isoformes ou variants de charge d'un anticorps présents au sein d'une composition d'anticorps produite par un clone cellulaire, un animal transgénique non humain ou une plante transgénique, peuvent également être séparés par d'autres technologies que la chromatographie. Cependant, si ces technologies sont très utiles dans un but d'analyse ou de caractérisation des isoformes ou variants de charge, elles ne permettent pas de séparer ces isoformes avec un rendement acceptable et sont donc peu utilisées dans un but préparatif.
Parmi ces autres technologies, on peut notamment citer la focalisation isoélectrique (dite « IEF » pour « Isoelectric focusing », et également appelée électrofocalisation). Le principe de base de la focalisation isoélectrique (FIE) est de créer dans un gel (éventuellement inclus dans un capillaire) un gradient de pH dans lequel pourront se déplacer les protéines soumises à un champ électrique. Les protéines migreront dans ce champ électrique. Arrivées au pH correspondant à leur pl, elles s'immobiliseront puisque leur charge nette sera nulle. De cette façon, il est possible de séparer les protéines d'une préparation selon leur pl. On peut créer un tel gradient de pH avec des polyélectrolytes portant un certain nombre de groupes ionisables positivement ou négativement (aminés, carboxyles ou sulfates) et possédant un certain pouvoir tampon. Ces molécules sont appelées ampholytes. Si on soumet ces ampholytes à un champ électrique borné par une solution d'un acide fort à l'anode et par une solution d'une base forte à la cathode, ils migreront et se distribueront par ordre de pl. Leur capacité tampon aidera à maintenir autour d'elles une petite zone de pH égal à leur pl. Une série d'ampholytes ayant donc chacun un pl couvrant une certaine gamme de pH créera donc un gradient continu de pH. Si on fait migrer une petite quantité de protéines dans ce système, après ou durant sa formation, elles migreront aussi et s'immobiliseront à leur pl.
Comme matrice inerte pour le gel, on peut utiliser de l'agarose, de l'acrylamide ou, plus rarement du dextran, dans lequel se formera le gradient de pH. Un gel de polyacrylamide est le plus souvent utilisé. Puisque seul le pl doit influencer la migration, il faut utiliser des concentrations d'acrylamide dont la porosité ne ralentira pas les grosses protéines par rapport aux petites mais qui est suffisamment solide pour être aisément manipulable. Un gel de 5-6% fait généralement l'affaire.
Le tampon de l'anode est un acide fort, généralement de l'acide phosphorique. À la cathode, on place une base forte, souvent de la triéthanoamine.
Les ampholytes sont inclus dans le mélange de préparation du gel avant sa polymérisation. Ces molécules, qui sont des polyélectrolytes, se déplacent dans le champ électrique et se disposent les unes à la suite des autres dans l'ordre de leur propre pl. Beaucoup de compagnies fabriquent un grand nombre de mélanges d'ampholytes couvrant des gammes très étroites ou très larges de pH: Ampholine® (notamment Ampholine® pH 6/8 et Ampholine® pH 7/9 commercialisés par Sigma Aldrich), Pharmalyte® (notamment Pharmalyte® pH 8/10,5 commercialisé notamment par Sigma Aldrich et GE Healthcare, Life Sciences), BioLite® (notamment BioLite® pH 6/8, BioLite® pH 7/9 et BioLite® pH 8/10 commercialisé par Bio-Rad), Zoom® (notamment Zoom® pH 6/9 commercialisé par Life technologies/invitrogen), Servalyt™ (notamment Servalyt™ pH 6/8, Servalyt™ pH 6/9, Servalyt™ pH 7/9 commercialisés par Serva), SinuLyte™ (notamment SinuLyte™ pH 6/8, SinuLyte™ pH 6/9, SinuLyte™ pH 7/9, SinuLyte™ pH 8/10 commercialisés par Sinus), etc. Lorsqu'on applique une tension entre les deux électrodes, chaque ampholyte se déplacera jusqu'à son point isoélectrique et s'y immobilisera. On peut créer des gradients de diverses amplitudes de pH en combinant divers ampholytes. En particulier, pour l'analyse des isoformes de charge dans une composition d'anticorps, on peut réaliser des gradients avec de très faibles intervalles (e.g. 0.1 unité de pH) entre chaque ampholyte, sur une petite gamme de pH centrée sur le pl moyen de l'anticorps et correspondant à la gamme de pl des différents isoformes (par exemple entre pH 6 et pH 8 ou entre pH 7 et pH 9), permettant une séparation très fine des différents isoformes de charge. La composition d'anticorps à analyser peut être ajoutée après la polymérisation du gel ou directement dans le mélange avant la polymérisation. Comme les anticorps sont plus gros que les ampholytes, ils migreront beaucoup plus lentement et les ampholytes pourront donc se stabiliser à leur pl bien avant que les anticorps ne se soient déplacés substantiellement.
La durée de la migration n'est pas critique. En effet, les anticorps ne risquent pas de sortir du gel puisqu'ils s'immobiliseront au point où ils auront atteint leur pl. Il convient seulement que la migration dure suffisamment longtemps pour que les ampholytes aient le temps de migrer correctement et que les anticorps aient le temps d'atteindre leur pl. À 2 mA, on estime le temps requis à environ 1 heure.
Après migration, le gel peut être coloré pour analyser les différents isoformes de charge présents dans la composition d'anticorps. La coloration peut être réalisée par toute technique usuelle utilisée en électrophorèse classique. Il faut cependant éliminer les ampholytes du gel car elles peuvent se colorer. On fait donc généralement précéder la coloration par trempage dans un bain d'acide trichloroacétique 5 ou 10% pour les faire diffuser hors du gel tout en fixant les anticorps sur place.
L'utilisation de marqueurs possédant un pl donné permet de déterminer assez précisément le pl des différents isoformes de charge.
Suite à la coloration, la proportion dans la composition analysée de chaque isoforme de charge séparé en IEF par rapport aux isoformes totaux peut être quantifiée à l'aide de logiciels d'analyse d'image, comme le logiciel Quantity One® par exemple, commercialisé par Bio-Rad.
Bien que très précise et sensible pour séparer les isoformes de charge présents dans une composition d'anticorps, la technologie de focalisation isoélectrique ne permet pas de récolter facilement les isoformes séparés et est donc généralement utilisée plutôt à des fins d'analyse et de quantification qu'à des fins de séparation préparative des différents isoformes. A l'étape c) du procédé , la composition d'intérêt selon l'invention, destinée à être utilisée en tant que médicament, est obtenue par regroupement d'une ou plusieurs fractions chromatographiques obtenues à l'étape b), correspondant au pic majoritaire du chromatogramme, la composition d'anticorps monoclonal ainsi obtenue étant enrichie dans ledit pic majoritaire, celui-ci représentant au moins 85%, avantageusement au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, plus avantageusement au moins 90%, au moins 91 %, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, voire au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 98,5%, au moins 99%, ou au moins 99,5% du chromatogramme de la composition obtenue à l'étape c).
Avantageusement, dans une composition pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention, au moins 95%, avantageusement au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, voire au moins 98,5%, au moins 99%, ou au moins 99,5% des chaînes lourdes des anticorps présents dans la composition ne comprennent pas de résidu lysine en C-terminal. L'invention concerne également une composition d'anticorps monoclonal, dans laquelle au moins 95%, avantageusement au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, voire au moins 98,5%, au moins 99%, ou au moins 99,5% des chaînes lourdes des anticorps présents dans la composition ne comprennent pas de résidu lysine en C-terminal, pour son utilisation en tant que médicament. En effet, les isoformes basiques des anticorps présents dans la composition possèdent au moins une chaîne lourde avec un résidu lysine en C-terminal. Une telle composition comprend donc uniquement l'isoforme majoritaire et les isoformes acides. Les isoformes basiques étant peu actives pour les fonctions effectrices via FcyRIII et via le complément (voir Exemples) et représentant avant purification environ 8 à 20 % (mesurés par chromatographie), une telle composition est capable d'induire une plus forte ADCC via FcyRIII et une plus forte réponse CDC que la composition totale, avant exclusion des isoformes basiques. Une telle composition peut être obtenue par séparation chromatographique comme décrit ci-dessus, les fractions collectées correspondant toutefois dans ce cas à celles des isoformes acides et majoritaire.
La composition d'anticorps susceptible d'être obtenue par le procédé décrit ci- dessus et destinée à être utilisée comme médicament, peut être utilisé dans toute pathologie susceptible d'être traitée par des anticorps monoclonaux, en particulier lorsque la destruction de cellules cibles par ADCC ou par CDC est utile au traitement.
Il est aujourd'hui connu que l'ADCC est un mécanisme essentiel pour l'efficacité clinique d'un traitement d'immunothérapie passive à l'aide d'anticorps destiné au traitement des cancers (Wallace et al-1994 ; Velders et al-1998 ; Cartron et al- 2002 ; lanello et al-2005 ; Weiner et al-2010), de la prévention de l'alloimmunisation chez les femmes enceintes Rhésus-négatives (Béliard et al-2008). De plus, la réponse ADCC est également connue pour jouer un rôle important dans la réponse anti-infectieuse contre les virus (Ahmad et al-1996, Miao et al-2009), les bactéries (Albrecht et al-2007 ; Casadevall et al-2002) et les parasites (Zeitlin et al-2000). De plus, dans le cadre des maladies autoimmunes, de nouvelles thérapies visent à éliminer les cellules immunitaires responsables des attaques, telles que les lymphocytes B ou T par exemple, l'ADCC jouant alors un rôle très important (Edwards et al-2006 ; Chan et al-2010).
La réponse CDC est également connue pour être importante dans différentes pathologies et notamment dans le traitement des cancers.
Ainsi, dans les compositions pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention, l'anticorps est avantageusement dirigé contre un antigène non ubiquitaire présent sur des cellules de donneur sain, un antigène d'une cellule cancéreuse, un antigène d'une cellule infectée par un agent pathogène, ou un antigène d'une cellule immunitaire.
En particulier, les modes de réalisation suivant sont préférés :
l'anticorps est un anticorps anti-Rhésus D (notamment le Roledumab, le Atorolimumab ou le Morolimumab, en particulier le Roledumab) et la composition est destinée à la prévention de l'alloimmunisation chez les individus Rhésus-négatifs,
l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule cancéreuse et la composition est destinée au traitement d'un cancer,
- l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule infectée par un agent pathogène et la composition est destinée au traitement d'une infection par ledit organisme pathogène,
l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule immunitaire et la composition est destinée au traitement d'une maladie autoimmune.
Dans le cadre du traitement des cancers, les anticorps peuvent notamment être dirigés contre les antigènes suivants : CD20, Her2/neu, CD52, EGFR, EPCAM, CCR4, CTLA-4 (CD152), CD19, CD22, CD3, CD30, CD33, CD4, CD40, CD51 (Integrin alpha-V), CD80, CEA, FR-alpha, GD2, GD3, HLA-DR, IGF1 R (CD221 ), phosphatidylserine, SLAMF7 (CD319), TRAIL-R1 , TRAIL-R2.
Plus précisément, des couples (antigène/cancer) spécifiques connus pour leur intérêt thérapeutique (anticorps de cette spécificité antigénique approuvé dans au moins un pays pour le traitement du cancer mentionné, ou essais cliniques en cours) sont indiqués dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1. Couples (antigène/cancer) spécifiques d'intérêt
Cancer(s) susceptibles d'être traités
Exemple d'anticorps dirigé
Antigène avec un anticorps de cette spécificité contre cet antigène
antigénique
Cancers hématologiques, rituximab, ofatumumab,
notamment : lymphome non
Ocrelizumab, Tositumomab,
CD20 hodgkinien, lymphome de cellules B,
Veltuzumab,
leucémie lymphocytaire chronique, Ublituximab
lymphome folliculaire,
Cancers solides, notamment :
cancer du sein, cancer du poumon
Her2/neu Trastuzumab, Pertuzumab non à petites cellules, cancer du pancréas, cancer de la prostate, cancer de l'ovaire
Cancers hématologiques, notamment : leucémie lymphocytaire
CD52 alemtuzumab chronique, leucémie myéloïde
chronique, lymphome de cellules T cutané ou périphérique
Tumeurs solides, notamment :
Cetuximab, panitumumab,
cancer colorectal, cancer de la tête Futuximab, Imgatuzumab,
et du cou, cancer du poumon,
EGFR Matuzumab, Necitumumab,
cancer de l'œsophage , cancer de Nimotuzumab,
l'estomac, gliome, astrocytome Zalutumumab
anaplastique, glioblastome
Cancers solides, notamment :
Edrecolomab,
EPCAM Cancer colorectal, cancer de la
Adecatumumab, Solitomab,
prostate, cancer du sein
Cancers hématologiques,
CCR4 Mogamulizumab notamment : Leucémie/lymphome de cellules T adulte
CTLA-4
(connu aussi Tumeurs solides, notamment :
sous la Ipilimumab, Tremelimumab, mélanome, cancer de la prostate, dénomination cancer de la vessie
CD152) Cancers hématologiques,
notamment : Lymphome non
Blinatumomab (targets both
CD19 hodgkinien, leucémie
CD19 and CD3)
lymphoblastique aiguë, cancer du poumon, cancer gastrointestinal
Cancers hématologiques,
CD22 Epratuzumab
notamment : cancers des cellules B
Otelixizumab, Teplizumab, Cancers hématologiques,
CD3
Visilizumab notamment : myélome multiple
Cancers hématologiques,
CD30 Iratumumab notamment : lymphome non
hodgkinien
Cancers hématologiques,
CD33 Lintuzumab notamment : leucémie myéloïde aiguë, syndromes myélodysplatiques
Cedelizumab, Clenoliximab, Mélanome, lymphome de cellules T
CD4
Priliximab, Zanolimumab cutané ou périphérique
Cancers hématologiques,
Dacetuzumab, notamment : lymphome non
CD40
Lucatumumab, Teneliximab hodgkinien, lymhome de Hodgkin, myélome multiple
CD51
(Integrin Intetumumab Tumeurs solides
alpha-V)
Cancers hématologiques,
CD80 Galiximab
notamment : lymphome de cellules B
Tumeurs solides, notamment :
CEA Labetuzumab
cancer colorectal
FR-alpha Farletuzumab Cancer de l'ovaire
Ganglioside
3F8, TRBS07 Neuroblastome, mélanome
GD2
Ganglioside Mélanome, cancer du poumon à
Ecromeximab, Mitumomab
GD3 petites cellules
HLA-DR Apolizumab Cancers hématologiques
Tumeurs solides, notamment :
Cixutumumab,
IGF1 R cancer du poumon non à petites
Figitumumab,
(CD221 ) cellules, carcinome adénocortical,
Robatumumab, Ganitumab
cancer du pancréas Tumeurs solides, notamment :
phosphatidyl
Bavituximab cancer du sein, cancer du poumon serine
non à petites cellules
SLAMF7
Elotuzumab Myélome multiple
(CD319)
Tumeurs solides, notamment :
cancer du poumon non à petites
TRAIL-R1 Mapatumumab
cellules, cancer colorectal ;
lymphome non hodgkinien
Tumeurs solides, notamment :
Conatumumab, cancer du sein, cancer du pancréas,
TRAIL-R2 Lexatumumab, cancer colorectal, cancer du poumon
Tigatuzumab non à petites cellules, cancer de
l'ovaire
Dans le cadre du traitement des infections par des organismes pathogènes, les anticorps peuvent notamment être dirigés contre les antigènes suivants : antigènes de Clostridium difficile, antigènes de Staphylococcus aureus (notamment ClfA et acide lipotheicoïque), antigènes du cytomégalovirus (notamment la glycoprotéine B), antigènes d'Escherichia coli (notamment toxine Shiga-like, sous unité MB), antigènes du virus respiratoire syncytial (Protéine F notamment), antigènes du virus de l'hépatite B, antigènes du virus Influenza A (Hémagglutinine notamment), antigènes de Pseudomonas aeruginosa sérotype IATS 01 1 , antigènes du virus de la rage (Glycoprotéine notamment), phosphatidylserine
Plus précisément, des couples (antigène/maladie infectieuse) spécifiques connus pour leur intérêt thérapeutique (anticorps de cette spécificité antigénique approuvé dans au moins un pays pour le traitement de la maladie infectieuse mentionnée, ou essais cliniques en cours) sont indiqués dans le Tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2. Couples (antigène/maladie infectieuse) spécifiques d'intérêt
Maladie(s) infectieuse(s)
Exemple d'anticorps susceptible(s) d'être traitée(s) avec
Antigène
dirigé contre cet antigène un anticorps de cette spécificité antigénique
Antigène de Actoxumab,
Clostridium difficile infection Clostridium difficile Bezlotoxumab Antigène ClfA de
Staphylococcus Tefibazumab Staphylococcus aureus infection aureus
Antigène du
Sevirumab Infection par le cytomégalovirus cytomégalovirus
glycoprotéine B du
Regavirumab Infection par le cytomégalovirus cytomégalovirus
toxine Shiga-like,
Infection par Escherichia coli, sous unité MB Urtoxazumab
serotype 0121
d'Escherichia coli
Protéine F du
Palivizumab, Infection par le virus respiratoire virus respiratoire
Motavizumab syncytial
syncytial
Antigène de
surface du virus Exbivirumab, Libivirumab Infection par le virus de l'hépatite B de l'hépatite B
Antigène du virus
Tuvirumab Infection par le virus de l'hépatite B de l'hépatite B
Hémagglutinine du Grippe, notamment grippe
CR6261
virus Influenza A espagnole et H5N1
Acide
Staphylococcus aureus infection, lipotheicoïque de
Pagibaximab choc septique par Staphylococcus Staphylococcus
aureus
aureus
Infection par les virus de l'hépatite C, influenza A et B, VIH 1 et 2, phosphatidylserine Bavituximab
rougeole, virus syncytial respiratoire, virus pichinde
Antigène de
Pseudomonas Infection par Pseudomonas
Panobacumab
aeruginosa aeruginosa
sérotype IATS 01 1
Glycoprotéine du Foravirumab,
Infection par le virus de la rage virus de la rage Rafivirumab
Dans le cadre du traitement des maladies autoimmunes, les anticorps peuvent notamment être dirigés contre les antigènes suivants : CD20, CD52, CD25, CD2, CD22, CD3, et CD4. Plus précisément, des couples (antigène/maladie autoimmune) spécifiques connus pour leur intérêt thérapeutique (anticorps de cette spécificité antigénique approuvé dans au moins un pays pour le traitement de la maladie autoimmune mentionnée, ou essais cliniques en cours) sont indiqués dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3. Couples (antigène/maladie autoimmune) spécifiques d'intérêt
Figure imgf000033_0001
Les compositions d'anticorps destinées à une utilisation en tant que médicament selon l'invention sont notamment destinées aux thérapies impliquant une réponse ADCC, ce qui inclut de nombreux cas de figures comme expliqué en détail ci- dessus. Il est donc avantageux que ces anticorps aient également été optimisés par d'autres moyens pour induire une réponse ADCC in vivo via le récepteur FcyRIII la plus forte possible. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux, dans une composition pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention, l'anticorps comprend une modification du fragment Fc augmentant sa liaison au récepteur FcyRIII et ses propriétés effectrices via le récepteur FcyRIII.
Deux moyens principaux ont pour le moment été décrits pour optimiser une activité ADCC via le récepteur FcyRIII : L'insertion d'au moins une mutation au niveau de certains résidus acides aminés du fragment Fc, comme décrit notamment dans WO00/42072, Shields et al-2001 , Lazar et al-2006, WO2004/029207, WO/2004063351 , WO2004/074455.
- L'optimisation de la nature des /V-glycannes attachés au résidu Asn297 de chaque chaîne lourde dans le fragment Fc.
Ainsi, un mode de réalisation avantageux, une composition pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention comprend un anticorps monoclonal dont la séquence a été modifiée au niveau d'au moins un résidu d'acides aminés du fragment Fc pour augmenter la liaison au récepteur FcyRIII, comme décrit dans WO00/42072, Shields et al-2001 , Lazar et al-2006, WO2004/029207, WO/2004063351 , WO2004/074455.
En particulier, des mutations aux positions suivantes du Fc ont été décrites comme permettant d'augmenter l'affinité pour le récepteur FcyRI II et la capacité à induire une ADCC via ce récepteur : 219, 222, 224, 239, 247, 256, 267, 270, 283, 280, 286, 290, 294, 295, 296, 298, 300, 320, 326, 330, 332, 333, 334, 335, 339, 360, 377, 396.
Plus particulièrement, les substitutions suivantes ont été décrites comme permettant d'augmenter l'affinité pour le récepteur FcyRI II et la capacité à induire une ADCC via ce récepteur : S219Y ; K222N; H224L; L234E, L234Y, L234V; L235D, L235S, L235Y, L235I; S239D, S239T ; V240I, V240M; P247L ; T256A, T256N ; V264I, V264T; V266I ; S267A ; D270E ; D280A, D280K, D280H, D280N, D280T, D280Q, D280Y ; V282M; E283Q; N286S; K290A, K290Q, K290S, K290E, K290G, K290D, K290P, K290N, K290T, K290S, K290V, K290T, K290Y; E294N; Q295K; Y296W; S298A, S298N, S298V, S298D, S298E; Y300I, Y300L; K320M, K320Q, K320E; N325T; K326S, K326N, K326Q, K326D, K326E; A330K, A330L, A330Y, A330I; I332E, I332D; E333A, E333Q, E333D; K334A, K334N, K334Q, K334S, K334E, K334D, K334M, K334Y, K334H, K334V, K334L, K334I; T335E, T335K ; A339T ; K360A ; F372Y ; I377F ; V379M ; P396H, P396L ; D401V.
Des combinaisons de mutations intéressantes incluent : E333A/K334A, T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K334A, S298A/E333A/K334A, S267A/D280A (WO00/42072), S239D/I332E, S239D/I332E/A330L (Lazar et al-2006), V264I/I332E, S298A/I332E, S239E/I332E, S239Q/I332E, S239D/I332D, S239D/I332E, S239D/I332N, S239D/I332Q, S239E/I332D, S239E/I332N, S239N/I332E, S239Q/I332D, A330Y/I332E, V264I/A330Y/I332E, A330L/I332E,
V264I/A330L/I332E, S239EA 264I/I332E, S239EA 264I/A330Y/I332E,
S239D/A330Y/I332E, S239N/A330Y/I332E, S239D/A330L/I332E, S239N/A330L/I332E, V264I/S298A/I332E, S239D/S298A/I332E,
S239N/S298A/I332E, S239DA 264I/I332E (WO2004/029207).
Alternativement ou en sus, une composition d'anticorps monoclonal pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention comprend une faible teneur en fucose. Par « teneur en fucose », on entend le pourcentage de formes fucosylées au sein des N-glycannes attachés au résidu Asn297 du fragment Fc de chaque chaîne lourde de chaque anticorps. Par « faible teneur en fucose », on entend une teneur en fucose inférieure ou égale à 65%. En effet, il est aujourd'hui connu que la teneur en fucose d'une composition d'anticorps joue un rôle crucial dans la capacité de cette composition à induire une forte réponse ADCC via le récepteur FcyRIII. Avantageusement, la teneur en fucose est inférieure ou égale à 65%, de préférence inférieure ou égale à 60%, à 55% ou à 50%, voire inférieure ou égale à 45%, à 40%, à 35%, à 30%, à 25% ou à 20%. Cependant, il n'est pas nécessaire que la teneur en fucose soit nulle, et elle peut par exemple être supérieure ou égale à 5%, à 10%, à 15% ou à 20%. La teneur en fucose peut par exemple être comprise entre 5 et 65%, entre 5 et 60%, entre 5 et 55%, entre 5 et 50%, entre 5 et 45%, entre 5 et 40%, entre 5 et 35%, entre 5 et 30%, entre 5 et 25%, entre 5 et 20%, entre 10 et 65%, entre 10 et 60%, entre 10 et 55%, entre 10 et 50%, entre 10 et 45%, entre 10 et 40%, entre 10 et 35%, entre 10 et 30%, entre 10 et 25%, entre 10 et 20%, entre 15 et 65%, entre 15 et 60%, entre 15 et 55%, entre 15 et 50%, entre 15 et 45%, entre 15 et 40%, entre 15 et 35%, entre 15 et 30%, entre 15 et 25%, entre 15 et 20%, entre 20 et 65%, entre 20 et 60%, entre 20 et 55%, entre 20 et 50%, entre 20 et 45%, entre 20 et 40%, entre 20 et 35%, entre 20 et 30%, entre 20 et 25%.
La composition d'anticorps peut par ailleurs posséder différents types de glycosylation (N-glycannes de type oligomannose ou complexes biantennés, proportion variable de résidus N-acétylglucosamine (GIcNAc) intercalaires ou de résidus galactose dans le cas des N-glycannes de type complexes biantennés), à condition de posséder un faible teneur en fucose. Ainsi, des N-glycannes de type oligomannose peuvent être obtenus par culture en présence de différents inhibiteurs de glycosylation, tels que les inhibiteurs de a1 ,2-mannosidase I (comme la Deoxymannojirimycine ou « DMM ») ou de Γα-glucosidase (comme la castanospermine ou « Cs ») ; ou bien par production de l'anticorps dans la lignée CHO Lec 1 . La production dans le lait de chèvres transgéniques conduit également à l'obtention d'anticorps dont le N-glycanne majoritaire est de type oligomannose, avec comme formes minoritaires des formes complexes biantennées fucosylées avec un ou deux galactoses, sans GIcNAc intercalaire et sans sialylation (G1 F ou G2F) (voir WO2007048077A2). Des N-glycannes de type complexe biantenné peuvent être obtenus dans la plupart des cellules de mammifères, mais également dans des bactéries, levures ou plantes dont la machinerie de glycosylation a été modifiée. Pour limiter la teneur en fucose, des lignées possédant naturellement une faible activité de l'enzyme FUT8 (1 ,6-fucosyltransférase) responsable de l'ajout du fucose sur le GIcNAc lié au fragment Fc ; telles que la lignée YB2/0, la lignée de cellule embryonnaire de canard EB66®, ou les lignées d'hépatome de rat rat H4-II-E (DSM ACC3129), H4-ll-Es (DSM ACC3130) ; peuvent être utilisées. Des lignées mutantes pour d'autres gènes et dont la sous-expression ou la surexpression conduit à une faible teneur en fucose peuvent également être utilisées, comme la lignée CHO Lec13, un mutant de la lignée CHO ayant une synthèse diminuée du GDP-fucose. Il est également possible de sélectionner une lignée d'intérêt et de diminuer ou abolir (notamment par utilisation d'ARN interférents ou par mutation ou délétion du gène exprimant la protéine d'intérêt) l'expression d'une protéine impliquée dans la voie de fucosylation des N-glycannes (notamment FUT8, voir Yamane-Ohnuki et al-2004 ; mais également GMD, un gène impliqué dans le transport du GDP-fucose, voir Kanda et al-2007). Une autre alternative consiste à sélectionner une lignée d'intérêt et à surexprimer une protéine interférant d'une façon ou d'une autre avec la fucosylation des N-glycannes, comme la protéine GnTIII (β(1 ,4)-N-acétylglucosaminetransférase III). En particulier, des anticorps possédant des N-glycannes faiblement fucosylés ont été notamment obtenus par :
· Production dans YB2/0 (voir EP1 176195A1 , WO01/77181 , Shinkawa et al-
2003) CHO Lec13 (voir Shields et al-2002), EB66® (Olivier et al-2010), ou les lignées d'hépatome de rat rat H4-II-E (DSM ACC3129), H4-ll-Es (DSM ACC3130) (voir WO2012/041768).
• Production dans une lignée CHO sauvage en présence de petits ARNs interférents dirigés contre FUT8 (Mori et al-2004, Suzuki et al-2007,
Cardarelli et al-2009, Cardarelli et al-2010, Herbst et al-2010), ou GMD (gène codant pour le transporteur du GDP-fucose dans le Golgi, voir Imai- Nishiya et al-2007)
• Production dans une lignée CHO dont les deux allèles du gène FUT8 codant pour la 1 ,6-fucosyltransférase ont été délétés (Yamane-Ohnuki et al-2004), ou dont les deux allèles du gène GMD codant pour le transporteur du GDP- fucose dans le Golgi ont été délétés (Kanda et al-2007),
• Production dans une lignée CHO dans laquelle le gène codant pour l'enzyme GnTIII (β(1 ,4)-N-acétylglucosaminetransférase III) a été surexprimé par transgénèse (Umana et al-1999). Outre une faible fucosylation, les N- glycannes obtenus sont caractérisés par une forte teneur en GIcNAc intercalaire. • Production dans des plantes (N. benthamiana) transgéniques, avec une forte diminution des teneurs en résidus 31 ,2-xylose et a1 ,3-fucose grâce à l'utilisation de petits A Ns interférants (Forthal et al-2010).
Les N-glycannes de type oligomannose ont une demi-vie réduite in vivo par rapport aux N-glycannes de type complexe biantenné. Par conséquent, avantageusement, les anticorps présents dans la composition possèdent sur leurs sites de N- glycosylation du fragment Fc des structures glycanniques de type complexe biantenné, avec une faible teneur en fucose, comme défini ci-dessus.
En particulier, la composition d'anticorps monoclonal peut posséder une teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 60% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 65% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 70% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 75% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 80% et une faible teneur en fucose, telle que définie ci-dessus. Elle peut également posséder teneur en formes G0+G1 +G0F+G1 F supérieure à 60%, à 65%, à 70%, à 75% ou à 80% et une teneur en formes G0F+G1 F inférieure à 50%. Les formes G0, G1 , G0F et G1 F sont telles que définies ci-dessous :
Figure imgf000037_0001
G0 G0F G1 G1 F
■ GIcNÂc O Mannose Galactose ► Fucose
De telles compositions d'anticorps peuvent notamment être obtenues par production dans YB2/0, dans CHO Lec13, dans des lignées CHO sauvages cultivées en présence de petits ARNs interférants dirigés contre FUT8 ou GMD, dans des lignées CHO dont les deux allèles du gène FUT8 codant pour la 1 ,6- fucosyltransférase ou les deux allèles du gène GMD codant pour le transporteur du GDP-fucose dans le Golgi ont été délétés.
Les compositions d'anticorps destinées à une utilisation en tant que médicament selon l'invention sont également destinées aux thérapies impliquant une réponse CDC. Il peut donc également être avantageux, en sus ou alternativement à des modifications augmentant l'activité via FcyRIII que ces anticorps aient également été optimisés par d'autres moyens pour induire une réponse CDC in vivo via la protéine C1 q la plus forte possible. Ainsi, dans un mode de réalisation avantageux, dans une composition pour une utilisation en tant que médicament selon l'invention, l'anticorps comprend une modification du fragment Fc augmentant sa liaison à la protéine C1 q et ses propriétés effectrices via le complément.
De telles mutations sont notamment décrites dans les documents suivants : WO2004074455A2, Idusogie et al-2001 , Dall'Acqua et al-2006(b), et Moore et al- 2010.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une étape de fractionnement par chromatographie pour augmenter la capacité d'une composition d'anticorps monoclonal dirigé contre un anticorps donné à induire la cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC) de cellules cibles exprimant ledit antigène par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur FcyRIII (CD16).
La composition ainsi obtenue possède une capacité améliorée à induire l'ADCC de cellules cibles exprimant l'antigène d'intérêt par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur FcyRIII (CD16), et notamment par les cellules tueuses naturelles (ou cellules NK pour « Natural killer cells »). De préférence, le rapport R des taux ADCC obtenus avec la composition enrichie en isoformes du pic majoritaire et avec la composition avant fractionnement, défini par la formule suivante :
taux ADCC obtenu avec la composition enrichie en isoformes du pic majoritaire taux ADCC obtenu avec la composition avant fractionnement est d'au moins 1 ,15 (correspondant à une augmentation du taux ADCC d'au moins 15%) ; avantageusement au moins 1 ,16 ; au moins 1 ,17 ; au moins 1 ,18 ; au moins 1 ,19 ; plus avantageusement au moins 1 ,20 ; au moins 1 ,25 ; au moins 1 ,30 ; au moins 1 ,35 ; au moins 1 ,40 ; au moins 1 ,45 ; voire au moins 1 ,50 (correspondant à une augmentation du taux ADCC d'au moins 50%). La présente invention concerne également l'utilisation d'une étape de fractionnement par chromatographie pour augmenter la capacité d'une composition d'anticorps monoclonal dirigé contre un anticorps donné à induire la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) de cellules cibles exprimant ledit antigène par le complément.
La composition ainsi obtenue possède une capacité améliorée à induire la lyse par le complément de cellules cibles exprimant l'antigène d'intérêt. De préférence, le rapport R des taux CDC obtenus avec la composition enrichie en isoformes du pic majoritaire et avec la composition avant fractionnement, défini par la formule suivante :
taux CDC obtenu avec la composition enrichie en isoformes du pic majoritaire taux CDC obtenu avec la composition avant fractionnement est d'au moins 1 ,15 (correspondant à une augmentation du taux CDC d'au moins 15%) ; avantageusement au moins 1 ,16 ; au moins 1 ,17 ; au moins 1 ,18 ; au moins 1 ,19 ; plus avantageusement au moins 1 ,20 ; au moins 1 ,25 ; au moins 1 ,30 ; au moins 1 ,35 ; au moins 1 ,40 ; au moins 1 ,45 ; voire au moins 1 ,50 (correspondant à une augmentation du taux CDC d'au moins 50%).
Dans les deux utilisations ci-dessus, l'étape de fractionnement par chromatographie peut être réalisée de toute manière décrite ci-dessus pour obtenir les compositions d'anticorps enrichies en isoforme majoritaire selon l'invention pour leur utilisation en tant que médicament. En particulier, le fractionnement peut être réalisé par l'une des techniques de chromatographie suivantes :
• chromatographie échangeuse d'ions, quel que soit le mode d'élution (gradient de force ionique, gradient de pH, gradient de pH et de force ionique, molécule de déplacement) ;
• chromatofocalisation ;
• chromatographie d'interactions hydrophobes.
La composition d'anticorps monoclonal pour laquelle une telle étape de fractionnement par chromatographie est réalisée dans le but d'augmenter les capacités d'ADCC ou de réponse CDC via les cellules effectrices exprimant CD16 peut être toute composition d'anticorps monoclonal décrite ci-dessus. En particulier, l'anticorps monoclonal présent dans la composition peut être humain, humanisé ou chimérique.
Il peut également être dirigé contre tout type d'antigène et notamment ceux décrits ci-dessus. En particulier, lorsque les cellules cibles sont des cellules cancéreuses, l'anticorps peut être dirigé contre un antigène de cellule cancéreuse, et notamment l'un des antigènes décrits ci-dessus dans le cadre du traitement des cancers. Lorsque les cellules cibles sont des cellules infectées par un agent pathogène, l'anticorps peut être dirigé contre un antigène des cellules infectées, et notamment contre l'un des antigènes décrits ci-dessus dans le cadre du traitement des maladies infectieuses. Lorsque les cellules cibles sont des cellules immunitaires impliquées dans le développement d'une maladie autoimmune, l'anticorps peut être dirigé contre un antigène de ces cellules immunitaires, et notamment contre l'un des antigènes décrits ci-dessus dans le cadre du traitement des maladies automimmunes.
L'étape de fractionnement par chromatographie (étape a)) est de préférence suivie d'une étape de regroupement des fractions chromatographiques obtenues correspondant au pic majoritaire du chromatogramme (étape b)), la composition d'anticorps monoclonal ainsi obtenue étant enrichie dans ledit pic majoritaire, celui- ci représentant au moins 85% du chromatogramme de la composition obtenue à l'étape b) (après fractionnement et regroupement des fractions chromatographiques d'intérêt).
Les exemples suivants correspondent à des illustrations de la présente invention.
Exemples Exemple 1. Préparation de fractions purifiées des isoformes de charge d'une composition d'anticorps anti-CD20, caractérisation des isoformes et de leurs propriétés effectrices
Matériels et méthodes
Composition d'anticorps anti-CD20
Toutes les séparations et analyses ont été effectuées sur un lot de composition d'anticorps anti-CD20 produit par un clone YB2/0.
Séparation des isoformes de charge par chromatofocalisation
Trois séparations préparatives des isoformes de charge d'une même composition d'anticorps ont été réalisées par chromatofocalisation.
Une résine échangeuse d'anions Mono P 5/200 GL a été utilisée. 20 mg de protéine dessalée ont été injectés à chaque séparation. L'élution a été réalisée à l'aide d'un gradient descendant de pH (pH 9,5 à 8,0), en utilisant les deux tampons suivants :
Tampon A : diéthanolamine 25 mM, Tampon B : polybuffer 96 + pharmalyte 8-10,5.
Les éluats des séparations ont été collectés en fractions de 2mL. Les fractions d'intérêt sont les fractions 33 à 50.
Les fractions des 3 séparations ont été concentrées pour analyse.
La séparation 1 (S1 ) a subi une concentration particulière pour que les fractions puissent être rendues stériles par filtration :
Concentration des fractions sur Amicon Ultra 10kDa pour obtenir un volume de 1 mL
Filtration stérilisante
- Prélèvement d'un aliquot pour mesure de la concentration et d'un aliquot pour mesure d'activité
Séparation des isoformes de charge par chromatographie échangeuse de cations (CEX)
Onze séparations des isoformes de charge ont été réalisées par chromatographie échangeuse de cations avec élution par un gradient ascendant de pH (CEX).
Une résine échangeuse de cations SCX (MabPac SCX 10 4x250 mm, Dionex) a été utilisée à 30°C. L'élution a été réalisée à l'aide d'un gradient ascendant de pH (pH 6 à 10), en utilisant les deux tampons suivants :
- Tampon A : 20 mM NaH2P04, 60 mM NaCI (pH 6),
- Tampon B : 20 mM Na2HP04, 60 mM NaCI (pH10).
Le gradient a été obtenu de la façon suivante : 10% à 60% de tampon B en 60 minutes.
Les éluats des séparations ont été collectés en fractions. Les fractions d'intérêt sont les fractions 1 à 20. Analyse de la liaison au récepteur CD16 par BIACORE
Une méthode a été développée pour mesurer la capacité d'une composition d'anticorps à se lier au récepteur CD16a en utilisation la technologie SPR (« Surface plasmon résonance ») sur un système Biacore T100 (GEHealthcare). Un récepteur CD16a soluble a été immobilisé sur la puce de détection en utilisant un couplage aminé. Une cellule de flux est utilisée pour l'anticorps, l'autre cellule de flux est laissée libre pour soustraire le bruit de fond. Les anticorps sont injectés à trois concentrations et les paramètres cinétiques sont estimés en réalisant pour chaque concentration un rapport de liaison à la fois à la phase d'association et à la phase de dissociation. Le signal SPR, exprimé en unités de résonnance (RU), représente l'association et la dissociation de l'anticorps au récepteur. Activation de cellules effectnces via CD16 (Test Jurkat CD16)
La capacité des différentes fractions séparées par chromatofocalisation et par chromatographie échangeuse de cations (CEX), comprenant différentes isoformes de charge, à induire une réponse de cellules effectrices via le récepteur CD16 (FcyRIII) a été testée.
Le test utilisé est le suivant :
Les anticorps sont incubés avec des cellules WIL2-S (cellules cibles CD20 positives) et des cellules Jurkat CD16 (cellules effectrices) (génotype CD16FF). La quantité de cytokines (IL2) sécrétée par les cellules Jurkat CD16 a été mesurée par ELISA.
Plus précisément, en plaque de 96 puits, on mélange :
• Anticorps : 50μΙ de dilutions allant de 0,156 à 10 ng/ml en IMDM 5% SVF
• PMA 50μΙ d'une dilution à 40ng/ml en IMDM 5% SVF (soit 2ng PMA / 50μΙ)
• Cellules WIL2-S : 50μΙ à 6x105/ml en IMDM 5% SVF (soit 30x103 cellules/5(^l)
• Jurkat CD16. 50μΙ à 10x106/ml en IMDM 5% SVF (soit 500x103 cellules/5(^l)
Deux contrôles sont utilisés : contrôle négatif sans cellules cibles et contrôle positif activité maximale :
Contrôle négatif sans cellules : on ajout par puits :
• 50 μΙ de cellules Jurkat CD16 à 10x106 cellules/ml (soit 500x103 cellules/50Ml)
• 50 μΙ de PMA à 40 ng/ml (soit 2ng PMA / 50μΙ)
• 50 μΙ d'anticorps à la concentration la plus forte
· 50 μΙ de milieu IMDM + 5 % SVF
Contrôle positif activité maximale : on ajout par puits :
• 50 μΙ de cellules Jurkat CD16 à 10x106 cellules/ml (soit 500x 103 cellules / 50μΙ)
• 50 μΙ de PMA à 40 ng/ml (soit 2ng PMA / 50μΙ)
· 50 μΙ de lonomycine à 5 μg/ml
• 50 μΙ de milieu IMDM + 5 % SVF
Agiter doucement et incuber une nuit à 37°C +/- 0.5°C
Décanter les cellules 1 minute à 125 g
Transférer 160 μΙ de surnageant dans une plaque 96 puits fonds ronds
Décanter de nouveau les cellules 1 minute à 125 g
Doser l'IL-2 dans le surnageant. Lecture à 450nm. L'activité CD16 (sécrétion d'IL-2) de chaque échantillon est exprimée en pourcentage de l'activité CD16 d'un échantillon de référence.
Cytotoxicité dépendante du complément (CDC)
Les cellules cibles WN2-S sont cultivées dans un milieu d'IMDM avec 10 % de SVF décomplémenté (milieu 110). Elles sont repiquées deux fois par semaine dans 100ml de milieux à 0.2 106 cellules/ml dans une flasque F175. Le test s'effectue sur des cellules repiquées depuis 24 à 72 heures, et reprises à 1 . 106 cellules/ml dans un milieu IMDM+5%SVF décomplémenté (milieu 15).
Le sérum humain (sérum humain AB obtenu par coagulation d'un sang total) est décongelé le jour où il est utilisé. La décongélation est réalisée à + 4° C. Après décongélation le sérum est dilué au ½ dans du milieu 15.
Le CelITiter-Blue® (Proméga) est stocké à - 20° C, il est laissé décongelé à température ambiante avant utilisation.
La concentration des anticorps à étudier est ajustée à 1 μg ml dans du milieu 15. Dans une plaque à 96 puits fonds U, ajouter :
• 50 μΙ de cellules cibles (WN2S à 1 . 106 cellules/ml)
• 50 μΙ d'anticorps à tester
• 50 μΙ de sérum humain dilué ½.
Les cellules sont déposées directement dans la plaque après ajustement à 1 .10eC/ml et mis à 37° C.
On incube pendant 5 minutes les cellules et l'échantillon sous agitation à 37° C avant de déposer le sérum.
Deux témoins sont réalisés : sans cellules (C-) et sans anticorps (AC-). L'élément manquant est remplacé par du milieu 15.
On incube à 37° C pendant 2 heures sous agitation. On ajouter alors 30 μΙ de CelITiter-Blue® dans chaque puits, on homogénéise par pipetage inverse au moment de l'ajout et on incube à 37° C pendant 3 heures et 30 minutes sous agitation.
Au terme de l'incubation la lecture peut être différée le lendemain en stoppant et stabilisant la réaction par ajout de 25 μΙ de SDS 3 %. La plaque est alors conservée à température ambiante.
Au terme de l'incubation ou le lendemain les plaques sont centrifugées 2 min à 125 g. 100 μΙ de chaque puits est prélevé puis distribué dans une plaque optique noire à fonds transparents en conservant le plan de plaque.
La lecture de la plaque est effectuée avec le lecteur de fluorescence avec les paramètres suivants :
• Excitation : 530/25 nm • Emission : 590/20 nm
• Lecture par le bas de la plaque (FOND)
• Temps d'intégration : 20 s
• Nombre de flashes : 25
· Gain : calculé à partir du puits pris dans le puits témoin ne contenant pas d'anticorps (cellules+ sérum+ milieu 15)
• Agitation d'intensité 2 pendant 15 secondes en mode orbital
Caractérisation des isoformes par spectrométrie de masse
Les différentes isoformes de charge présentes dans les différentes fractions séparées par chromatofocalisation ou par chromatographie échangeuse de cations (CEX) ont été analysées par spectrométrie de masse comme décrit dans Chevreux- 201 1 .
Cette méthode comprend l'utilisation d'une cystéine protéase bactérienne (IdeS, enzyme dégradant les immunoglobulines de Streptococcus pyogenes), qui clive spécifiquement les IgG sous leur domaine charnière, la chaîne lourde étant clivée en deux fragments de 25 kDa constitués respectivement des domaines VH-CH1 et CH2-CH3. Les fragments sont séparés par chromatographie liquide avec un gradient d'acétonitrile et analysés en spectrométrie de masse, par le protocole suivant :
100 μg de fraction purifiée par chromatofocalisation ou par CEX ont été lyophilisés et redissous dans 20 μΙ d'un tampon de digestion (50 mM NaH2P02 et 150 mM NaCI, pH 6,30), et 100 Ul d'enzyme IdeS ont été ajoutés en suivant les instructions du kit d'enzyme (FabRICATOR Kit, Genovis, Lund, Suède). La préparation a été incubée à 37°C pendant 1 heure sous assistance microonde à une puissance de 50 W (CEM Discover System, CEM, Matthews, NC, USA) pour améliorer l'hydrolyse. Ensuite, 25 μΙ d'un tampon dénaturant (8M urée et 0,4M NH4HC03, pH 8,0) ont été ajoutés, suivis de 5 μΙ d'une solution de dithiothréitol (DTT) à 250 mM. L'échantillon a été incubé à 50 °C pendant 20 minutes sous assistance microonde à une puissance de 50 W pour assurer la réduction complète de la protéine, qui a ensuite été analysée par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS).
Un aliquot du mélange réactionnel correspondant à une quantité de 20 μg a été injecté sur une colonne ProSphere C4 à phase inverse (150 x 2,1 mM, 5 μηη, Alltech) équilibrée à 70°C à un flux de 350 μΙ/min. La chromatographie en phase inverse a été réalisée en utilisant un système de chromatographie liquide ultra- performante (UPLC, Acquity UPLC, Waters, Milford, MA, USA). Le gradient a été généré en utilisant de l'acide trifluoroacétique (TFA) à 0,1 % comme phase mobile A et de l'acétonitrile comprenant 0,1 % de TFA comme phase mobile B. Après une élution isocratique à 10% de B pendant 5 minutes, B a été augmenté à 27% pendant 5 minutes puis à 40% pour 10 minutes additionnelles. La colonne a ensuite été lavée pendant 3 minutes avec 90% de B et rééquilibrée pendant 2 minutes à 10% de B, donnant une durée globale de 25 minutes.
Les espèces éluées ont ensuite été analysées par un spectromètre de masse QSTAR (QSTAR XL, Applied Biosystems, Toronto, Canada) opérant en mode d'ion positif de 500 à 3000 m/z et calibré selon la procédure décrite par le fabricant pour la rénine.
Résultats Séparation des isoformes de charge par chromatofocalisation
Les chromatogrammes des 3 séparations sont présentés sur la Figure 1 , qui montre qu'ils sont parfaitement superposables, démontrant ainsi la reproductibilité de la méthode de séparation par chromatofocalisation. Du fait de l'utilisation d'une résine échangeuse d'anions et d'un gradient descendant de pH, les isoformes basiques sont éluées les premières, suivies de l'isoforme majoritaire, puis des isoformes acides.
Les fractions 33 à 50 ont été récoltées pour analyses ultérieures de leurs propriétés biochimiques et effectrices.
Séparation des isoformes de charge par chromatographie échangeuse de cations (CEX)
Les chromatogrammes de 1 1 séparations par chromatographie échangeuse de cations (CEX) des isoformes de charge sont présentés sur la Figure 2. Du fait de l'utilisation d'une résine échangeuse de cations, les isoformes acides sont éluées les premières, suivies de l'isoforme majoritaire, puis des isoformes basiques.
Le pic 4 (P4, pic principal) a été réanalysé en CEX pour vérifier l'efficacité de la purification. Les pourcentages d'isoformes acides, principal et basiques obtenus avant et après séparation par CEX sont présentés sur la Figure 3 et dans le Tableau 4 ci-dessous, et montrent clairement l'efficacité de purification du pic principal.
Tableau 4. Pourcentages d'isoformes acides, principal et basiques obtenus avant et après séparation par CEX
Echantillon Formes acides Pic principal Formes basiques
Avant séparation 12,6 % 58,7 % 28,7 %
Après séparation 3,5 % 93,4 % 3,1 % Analyse de la liaison au récepteur CD16 par BIACORE
La capacité des différentes fractions séparées par chromatographie échangeuse de cations, comprenant différentes isoformes de charge, à lier le récepteur CD16 a été testée.
Les résultats sont présentés sur la Figure 4, et montrent une perte d'affinité pour pour les formes acides (P1 à P3) et pour le pic 7 (P7), mais pas pour les autres formes basiques (P6, P8).
Activation de cellules effectrices via CD16 (Test Jurkat CD16)
La capacité des différentes fractions séparées par chromatofocalisation et par chromatographie échangeuse de cations (CEX), comprenant différentes isoformes de charge, à induire une réponse de cellules effectrices via le récepteur CD16 (FcyRIII) a été testée.
Les résultats sont présentés dans la Figure 5 (CEX), et le Tableau 5 (séparation par chromatofocalisation) ci-dessous.
Dans chaque cas, on observe que la fraction correspondant à l'isoforme majoritaire induit une activation des cellules Jurkat CD16 significativement plus importante que les fractions comprenant les isoformes acides ou basique.
Ainsi, la capacité des différents isoformes de charge à activer des cellules effectrices via CD16 varie significativement, l'isoforme majoritaire ayant une capacité significativement améliorée par rapport aux autres isoformes à activer des cellules effectrices exprimant CD16.
Le test décrit ci-dessus, qui mesure la quantité d'IL-2 sécrétée par des cellules Jurkat transfectées par le récepteur CD16 en présence d'une composition d'anticorps, a été montré comme représentatif de la capacité de cette composition d'anticorps à induire l'ADCC par les cellules effectrices exprimant CD16 (WO2004/024768). Par conséquent, les résultats présentés dans les Tableaux 4 à 6 ci-dessous indiquent que les fractions purifiées correspondant au pic majoritaire de chromatofocalisation ou de CEX avant purification ont une capacité significativement améliorée par rapport aux autres isoformes et par rapport à une composition totale comprenant tous les isoformes à induire l'ADCC via les cellules effectrices exprimant CD16. Tableau 5. Activation des cellules Jurkat CD16 par une composition de référence, par la composition totale avant séparation, et par les fractions F36 (isoformes basiques), F39 (isoforme majoritaire), et F43, F44, F48, F49 et F50 (isoformes de plus en plus acides) d'une séparation par chromatofocalisation.
Figure imgf000047_0001
Cytotoxicité dépendante du complément (CDC)
La capacité des différentes fractions séparées par chromatographie échangeuse de cations (CEX), comprenant différentes isoformes de charge, à induire une réponse cytotoxique dépendante du complément (CDC) a été mesurée.
Les résultats sont présentés sur la Figure 6, et montrent une forte perte d'activité pour les formes acides (P1 : 37%, P2 : 52%, et P3 : 69%) et les formes basiques (P5 : 45%, P6=K1 : 64%, P7 : 35%, et P8=K2 : 49%) par rapport au pic principal (P4). Le pic correspondant à l'isoforme majoritaire (P4) induit donc une réponse CDC significativement plus importante que les fractions comprenant les isoformes acides ou basique.
Caractérisation des isoformes par spectrométrie de masse
Les fractions purifiées par chromatofocalisation et les fractions purifiées par CEX ont été analysées par LC-MS pour caractériser le pourcentage de chaînes lourdes avec ou sans lysine N-terminale.
Pour les fractions purifiées par chromatofocalisation et les fractions purifiées par CEX correspondant au pic majoritaire avant séparation, l'analyse a montré que plus de 95% des chaînes lourdes ne comprennent pas de lysine C-terminale. Conclusion
Les résultats présentés ci-dessus montrent que les isoformes de charge d'une composition d'anticorps correspondant au pic majoritaire d'une séparation par chromatographie échangeuse d'ions (CEX) ou par chromatofocalisation ont une capacité significativement plus grande que les isoformes acides ou basiques de la même composition d'anticorps à activer les cellules effectrices via le récepteur FCYRI I I (CD16), et également via le complément.
L'utilisation de fractions purifiées correspondant à ce pic majoritaire permettrait donc d'augmenter encore les propriétés effectrices via CD16 (ADCC, sécrétion de cytokines) dans le cadre de pathologies traitées par des anticorps monoclonaux dans lesquelles l'ADCC ou la réponse CDC joue un rôle important, telles que notamment la prévention de l'alloimmunisation, ou le traitement des cancers, des maladies infectieuses, et des maladies auto-immunes.
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Claims

Revendications
1 . Composition d'anticorps monodonal susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant :
a) la production d'une composition d'anticorps monodonal à partir d'un clone cellulaire, d'un animal non-humain transgénique ou d'une plante transgénique, b) le fractionnement de la composition obtenue à l'étape a) par chromatographie, et
c) le regroupement d'une ou plusieurs fractions chromatographiques obtenues à l'étape b), correspondant au pic majoritaire du chromatogramme, la composition d'anticorps monodonal ainsi obtenue étant enrichie dans ledit pic majoritaire, celui-ci représentant au moins 85% du chromatogramme de la composition obtenue à l'étape c),
pour son utilisation en tant que médicament.
2. Composition d'anticorps monodonal selon la revendication 1 pour son utilisation en tant que médicament selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le fractionnement de l'étape b) est réalisé par chromatographie échangeuse d'ions, par chromatofocalisation, ou par chromatographie d'interactions hydrophobes.
3. Composition d'anticorps monodonal selon la revendication 2 pour son utilisation en tant que médicament selon la revendication 2, caractérisée en ce que la chromatographie échangeuse d'ions utilise l'un des moyens d'élution suivants :
• gradient de force ionique ; et/ou
· gradient de pH ; ou
• molécule de déplacement.
4. Composition d'anticorps monodonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'au moins 95% des chaînes lourdes des anticorps présents dans la composition ne comprennent pas de résidu lysine en C- terminal.
5. Composition d'anticorps monodonal, dans laquelle au moins 95% des chaînes lourdes des anticorps présents dans la composition ne comprennent pas de résidu lysine en C-terminal, pour son utilisation en tant que médicament.
6. Composition d'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre un antigène non ubiquitaire présent sur des cellules de donneur sain, un antigène d'une cellule cancéreuse, un antigène d'une cellule infectée par agent pathogène, ou un antigène d'une cellule immunitaire.
7. Composition d'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'anticorps est un anticorps anti-Rhésus D et la composition est destinée à la prévention de l'alloimmunisation chez les individus Rhésus-négatifs.
8. Composition d'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule cancéreuse et la composition est destinée au traitement d'un cancer.
9. Composition d'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule infectée par agent pathogène et la composition est destinée au traitement d'une infection par ledit organisme pathogène.
10. Composition d'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que l'anticorps est dirigé contre un antigène d'une cellule immunitaire et la composition est destinée au traitement d'une maladie autoimmune.
1 1. Composition d'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'anticorps comprend une modification du fragment Fc augmentant sa liaison au récepteur FcyRIII et ses propriétés effectrices via le récepteur FcyRIII
12. Composition d'anticorps monoclonal selon la revendication 1 1 pour son utilisation en tant que médicament selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que l'anticorps comprend au moins une mutation au niveau de certains résidus acides aminés du fragment Fc.
13. Composition d'anticorps monoclonal selon la revendication 1 1 ou la revendication 12 pour son utilisation en tant que médicament selon la revendication
1 1 ou la revendication 12, caractérisée en ce qu'elle comprend une teneur en fucose inférieure ou égale à 65%.
14. Composition d'anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que l'anticorps comprend une modification du fragment Fc augmentant sa liaison à la protéine C1 q et ses propriétés effectrices via le complément
15. Utilisation d'une étape de fractionnement par chromatographie pour augmenter la capacité d'une composition d'anticorps monoclonal dirigé contre un anticorps donné à induire la cytotoxicité cellulaire dépendante de l'anticorps (ADCC) de cellules cibles exprimant ledit antigène par les cellules effectrices du système immunitaire exprimant le récepteur FcyRI II (CD16).
16. Utilisation d'une étape de fractionnement par chromatographie pour augmenter la capacité d'une composition d'anticorps monoclonal dirigé contre un anticorps donné à induire la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) de cellules cibles exprimant ledit antigène par le complément.
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