CN114236010A - 一种生物活性药物的药代动力学分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药代动力学领域，具体公开了一种生物活性药物的药代动力学分析方法，包括以下步骤：S1.称取待分析生物活性药物，配制成其说明书规定的标准浓度；S2.使用缓冲溶液将原料药溶液分别稀释成不同浓度，并将10份不同浓度的溶液作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度百分比；所述系列标准溶液的相对浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30%、50%、100%，直至S8根据药物浓度‑时间数据，计算出药动学参数，在计算药动学参数时，采用药动学软件WinNonlin5.2.1软件模拟拟合；本发明所公开的药代动力学分析方法，测试简便，重现性好，适合大分子生物活性药的药代动力学实验分析。

Description

一种生物活性药物的药代动力学分析方法

技术领域

本发明属于药代动力学领域，具体公开了一种生物活性药物的药代动力学分析方法。

背景技术

生物活性药物，又称生物药物，或者生物技术药物，是指运用微生物学、生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用微生物学、化学、生物化学、生物技术、药学等科学的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。生物药物原料以天然的生物材料为主，包括微生物、人体、动物、植物、海洋生物等。随着生物技术的发展，有目的人工制得的生物原料成为当前生物制药原料的主要来源。如用免疫法制得的动物原料、改变基因结构制得的微生物或其它细胞原料等。生物药物的特点是药理活性高、毒副作用小，营养价值高。生物药物主要有蛋白质、核酸、糖类、脂类等。这些物质的组成单元为氨基酸、核苷酸、单糖、脂肪酸等，对人体不仅无害而且还是重要的营养物质。虽然化学药物制剂(传统药物)仍然占据着医药类的主导地位,但在最近短短的几年中,各种各类的生物药品包括重组蛋白,多肽,抗体,抗体片断,基因工程抗体以及目前仍处于早期研发节段的反叉寡核苷酸,干扰核糖核酸等,都在迅速地研发中并进入各个新兴的市场.

药物代谢动力学（Pharmacokinetic）是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律的一门学科。随着药物化学的发展及人类健康水平的不断提高，对药物的药代动力学性质的要求越来越高：判断一个药物的应用前景特别是市场前景，不单纯是疗效强，毒副作用小；更要具备良好的药代动力学性质。肽类药物就是最典型的例子。一般来说，体内的许多生物活性肽如内啡肽等均具有高效低毒的特点，但是，体内不稳定，口服无效。

药代动力学研究对于药物的有效性和安全性评估非常重要，如选择合适的给药途径，设定合适的给药频率和给药剂量，明确药物是否可以到达相应的靶器官等。但不同于传统的小分子化学药物，生物大分子药物具有相对分子质量大、不易透过生物膜、给药剂量低、易在体内降解等特点，使其在生物体内的处置过程变得更为复杂，也给药代动力学研究提出了新的挑战。特别是蛋白多肽药物、mAb药物、抗体药物偶联物（antibody-drugconjugate，ADC）和核酸药物，其对传统的药代动力处理方法提出了新的要求。

发明内容

针对上述情况，本发明公开了一种生物活性药物的药代动力学分析方法。

本发明的技术方案如下：

一种生物活性药物的药代动力学分析方法，所述生物活性药物为多肽类药物，包括以下步骤：

S1.称取待分析生物活性药物，配制成其说明书规定的标准浓度；

S2.使用缓冲溶液将原料药溶液分别稀释成不同浓度，并将10份不同浓度的溶液作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度百分比；

所述系列标准溶液的相对浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30% 、50%、100%；

S3.经静脉注射的方式给予受试动物由步骤S2制备的溶液，收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理得到血浆样品；使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液；

所述受试动物为重量为10-20g的无胸腺裸鼠，

所述收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理，获得血浆；

S4.于S3得到的血浆中加入0.1-0.3mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀，进行半胱氨酸的封闭处理，得到反应液；

S5.经半胱氨酸封闭的反应液中加入200-400μL消化缓冲液，涡流混合，再加入4-6μL胰酶溶液，涡流混合，孵育得到血浆样品酶解液；

S6，于酶解液中加入1～3μL稳定同位素标记的特征肽段和内标肽段，涡流混匀，将所述特征肽段和所述内标肽段混合酶解；

S7.使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，得生物活性药物浓度；

S8.根据药物浓度-时间数据，计算出药动学参数，在计算药动学参数时，采用药动学软件WinNonlin5.2.1软件模拟拟合。

优选的，所述步骤S3中，所述在进行静脉注射前，对无胸腺裸鼠进行1-2月培养，具体培养条件为：无菌环境下，设定培养室的温度为26-30℃，培养湿度为45-60％，并且培养室中光照为12h明暗交替。

优选的，所述步骤S3中，所述进行血液样品的处理具体包括：

分别于给药后的0.25h、0.5h、1h、2h、4h、12h、16h、24h、32h、48h、96h对无胸腺裸鼠的血液进行采集，具体为左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.2～0.5ml；

吸取血液样品于加有乙二胺四乙酸二钠抗凝的离心管中，静置20min，然后在4℃环境下进行10-12min离心，离心转速为3000rpm，分离血浆，得到血浆样品。

优选的，所述步骤S3中，所述使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液具体为：

分别取不同浓度的系列标准溶液10μL置于离心管中，分别置于氮吹仪中水浴40℃吹干；

吹干后加入血浆样品10μL，涡旋混合5min，依次加入5μL内标工作液、100μL甲醇，混合均匀，置于高速离心机中16000rpm离心10min得到上清液；

上清液置于离心管中，置于氮吹仪中水浴40℃吹干，在吹干的残渣中加入100μL甲醇复溶，涡旋45s，再次离心得到上清液，即血浆溶液。

优选的，所述步骤S6中，所述特征肽段和内标肽段所含的稳定同位素标记是针对所述特征肽段和内标肽段中的脯氨酸的N和C元素分别进行15N和13C标记。

优选的，所述步骤S7中，所述液相色谱-质谱分析中的液相色谱条件为：采用Antibodix™ NP10色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，10μm；柱温为35-40℃；流动相A为甲酸体积百分数占0.25～0.45％的水；流动相B为甲酸体积百分数占0.25～45％的乙腈；进行梯度洗脱50～60min，进样量为20-40μl，流速为1-2ml/min。

优选的，所述液相色谱-质谱分析中质谱分析的条件为：雾化压力为75～85psi，鞘气温度370～400℃，毛细管电压4700～5300V。

进一步的，上述生物活性药物的药代动力学分析方法在单克隆抗体药物研发中的应用。

进一步的，所述单克隆抗体药物为抗PD-L1药物。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明公开了一种生物活性药物的药代动力学分析方法，对大分子多肽类药物的酶解特异性肽段进行分析和定量，具有简单易行、测试简便、高通量、灵敏度高、重现性好等特点，适合大分子生物活性药的药代动力学实验分析，尤其适合单克隆抗体药物特别是PD-L1药物的药代动力学分析。

附图说明

附图1为本发明生物活性药物的药代动力学分析方法处理流程图。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场渠道购获得的常规试剂产品。

实施例1

一种生物活性药物的药代动力学分析方法，所述生物活性药物为多肽类药物，如附图1所示，包括以下步骤：

S1.称取待分析生物活性药物，配制成其说明书规定的标准浓度；

S2.使用缓冲溶液将原料药溶液分别稀释成不同浓度，并将10份不同浓度的溶液作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度百分比；

所述系列标准溶液的相对浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30% 、50%、100%；

S3.经静脉注射的方式给予受试动物由步骤S2制备的溶液，收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理得到血浆样品；使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液；

所述受试动物为重量为10g的无胸腺裸鼠，

所述收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理，获得血浆；

S4.于S3得到的血浆中加入0.1mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀，进行半胱氨酸的封闭处理，得到反应液；

S5.经半胱氨酸封闭的反应液中加入200μL消化缓冲液，涡流混合，再加入4μL胰酶溶液，涡流混合，孵育得到血浆样品酶解液；

S6，于酶解液中加入1μL稳定同位素标记的特征肽段和内标肽段，涡流混匀，将所述特征肽段和所述内标肽段混合酶解；

S7.使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，得生物活性药物浓度；

S8.根据药物浓度-时间数据，计算出药动学参数，在计算药动学参数时，采用药动学软件WinNonlin5.2.1软件模拟拟合。

所述步骤S3中，所述在进行静脉注射前，对无胸腺裸鼠进行1月培养，具体培养条件为：无菌环境下，设定培养室的温度为26℃，培养湿度为45％，并且培养室中光照为12h明暗交替。

所述步骤S3中，所述进行血液样品的处理具体包括：

分别于给药后的0.25h、0.5h、1h、2h、4h、12h、16h、24h、32h、48h、96h对无胸腺裸鼠的血液进行采集，具体为左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.2ml；

吸取血液样品于加有乙二胺四乙酸二钠抗凝的离心管中，静置20min，然后在4℃环境下进行10min离心，离心转速为3000rpm，分离血浆，得到血浆样品。

所述步骤S3中，所述使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液具体为：

分别取不同浓度的系列标准溶液10μL置于离心管中，分别置于氮吹仪中水浴40℃吹干；

吹干后加入血浆样品10μL，涡旋混合5min，依次加入5μL内标工作液、100μL甲醇，混合均匀，置于高速离心机中16000rpm离心10min得到上清液；

上清液置于离心管中，置于氮吹仪中水浴40℃吹干，在吹干的残渣中加入100μL甲醇复溶，涡旋45s，再次离心得到上清液，即血浆溶液。

所述步骤S6中，所述特征肽段和内标肽段所含的稳定同位素标记是针对所述特征肽段和内标肽段中的脯氨酸的N和C元素分别进行15N和13C标记。

所述步骤S7中，所述液相色谱-质谱分析中的液相色谱条件为：采用Antibodix™NP10色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，10μm；柱温为35℃；流动相A为甲酸体积百分数占0.25％的水；流动相B为甲酸体积百分数占0.25％的乙腈；进行梯度洗脱50min，进样量为20μl，流速为1ml/min。

所述液相色谱-质谱分析中质谱分析的条件为：雾化压力为75psi，鞘气温度370℃，毛细管电压4700V。

实施例2

一种生物活性药物的药代动力学分析方法，所述生物活性药物为多肽类药物，如附图1所示，包括以下步骤：

S1.称取待分析生物活性药物，配制成其说明书规定的标准浓度；

S2.使用缓冲溶液将原料药溶液分别稀释成不同浓度，并将10份不同浓度的溶液作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度百分比；

所述系列标准溶液的相对浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30% 、50%、100%；

S3.经静脉注射的方式给予受试动物由步骤S2制备的溶液，收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理得到血浆样品；使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液；

所述受试动物为重量为15g的无胸腺裸鼠，

所述收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理，获得血浆；

S4.于S3得到的血浆中加入0.2mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀，进行半胱氨酸的封闭处理，得到反应液；

S5.经半胱氨酸封闭的反应液中加入300μL消化缓冲液，涡流混合，再加入5μL胰酶溶液，涡流混合，孵育得到血浆样品酶解液；

S6，于酶解液中加入2μL稳定同位素标记的特征肽段和内标肽段，涡流混匀，将所述特征肽段和所述内标肽段混合酶解；

S7.使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，得生物活性药物浓度；

S8.根据药物浓度-时间数据，计算出药动学参数，在计算药动学参数时，采用药动学软件WinNonlin5.2.1软件模拟拟合。

所述步骤S3中，所述在进行静脉注射前，对无胸腺裸鼠进行1.5月培养，具体培养条件为：无菌环境下，设定培养室的温度为28℃，培养湿度为50％，并且培养室中光照为12h明暗交替。

所述步骤S3中，所述进行血液样品的处理具体包括：

分别于给药后的0.25h、0.5h、1h、2h、4h、12h、16h、24h、32h、48h、96h对无胸腺裸鼠的血液进行采集，具体为左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.35ml；

吸取血液样品于加有乙二胺四乙酸二钠抗凝的离心管中，静置20min，然后在4℃环境下进行11min离心，离心转速为3000rpm，分离血浆，得到血浆样品。

所述步骤S3中，所述使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液具体为：

分别取不同浓度的系列标准溶液10μL置于离心管中，分别置于氮吹仪中水浴40℃吹干；

吹干后加入血浆样品10μL，涡旋混合5min，依次加入5μL内标工作液、100μL甲醇，混合均匀，置于高速离心机中16000rpm离心10min得到上清液；

上清液置于离心管中，置于氮吹仪中水浴40℃吹干，在吹干的残渣中加入100μL甲醇复溶，涡旋45s，再次离心得到上清液，即血浆溶液。

所述步骤S6中，所述特征肽段和内标肽段所含的稳定同位素标记是针对所述特征肽段和内标肽段中的脯氨酸的N和C元素分别进行15N和13C标记。

所述步骤S7中，所述液相色谱-质谱分析中的液相色谱条件为：采用Antibodix™NP10色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，10μm；柱温为37℃；流动相A为甲酸体积百分数占0.35％的水；流动相B为甲酸体积百分数占0.35％的乙腈；进行梯度洗脱55min，进样量为30μl，流速为1.5ml/min。

所述液相色谱-质谱分析中质谱分析的条件为：雾化压力为75～85psi，鞘气温度370～400℃，毛细管电压4700～5300V。

实施例3

一种生物活性药物的药代动力学分析方法，所述生物活性药物为多肽类药物，如附图1所示，包括以下步骤：

S1.称取待分析生物活性药物，配制成其说明书规定的标准浓度；

S2.使用缓冲溶液将原料药溶液分别稀释成不同浓度，并将10份不同浓度的溶液作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度百分比；

所述系列标准溶液的相对浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30% 、50%、100%；

S3.经静脉注射的方式给予受试动物由步骤S2制备的溶液，收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理得到血浆样品；使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液；

所述受试动物为重量为20g的无胸腺裸鼠，

所述收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理，获得血浆；

S4.于S3得到的血浆中加入0.3mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀，进行半胱氨酸的封闭处理，得到反应液；

S5.经半胱氨酸封闭的反应液中加入200-400μL消化缓冲液，涡流混合，再加入6μL胰酶溶液，涡流混合，孵育得到血浆样品酶解液；

S6，于酶解液中加入3μL稳定同位素标记的特征肽段和内标肽段，涡流混匀，将所述特征肽段和所述内标肽段混合酶解；

S7.使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，得生物活性药物浓度；

S8.根据药物浓度-时间数据，计算出药动学参数，在计算药动学参数时，采用药动学软件WinNonlin5.2.1软件模拟拟合。

所述步骤S3中，所述在进行静脉注射前，对无胸腺裸鼠进行2月培养，具体培养条件为：无菌环境下，设定培养室的温度为30℃，培养湿度为60％，并且培养室中光照为12h明暗交替。

所述步骤S3中，所述进行血液样品的处理具体包括：

分别于给药后的0.25h、0.5h、1h、2h、4h、12h、16h、24h、32h、48h、96h对无胸腺裸鼠的血液进行采集，具体为左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液。采血完毕立即用纱布压迫止血。每次采血量0.5ml；

吸取血液样品于加有乙二胺四乙酸二钠抗凝的离心管中，静置20min，然后在4℃环境下进行12min离心，离心转速为3000rpm，分离血浆，得到血浆样品。

所述步骤S3中，所述使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液具体为：

分别取不同浓度的系列标准溶液10μL置于离心管中，分别置于氮吹仪中水浴40℃吹干；

吹干后加入血浆样品10μL，涡旋混合5min，依次加入5μL内标工作液、100μL甲醇，混合均匀，置于高速离心机中16000rpm离心10min得到上清液；

上清液置于离心管中，置于氮吹仪中水浴40℃吹干，在吹干的残渣中加入100μL甲醇复溶，涡旋45s，再次离心得到上清液，即血浆溶液。

所述步骤S6中，所述特征肽段和内标肽段所含的稳定同位素标记是针对所述特征肽段和内标肽段中的脯氨酸的N和C元素分别进行15N和13C标记。

所述步骤S7中，所述液相色谱-质谱分析中的液相色谱条件为：采用Antibodix™NP10色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，10μm；柱温为40℃；流动相A为甲酸体积百分数占0.45％的水；流动相B为甲酸体积百分数占45％的乙腈；进行梯度洗脱60min，进样量为40μl，流速为2ml/min。

所述液相色谱-质谱分析中质谱分析的条件为：雾化压力为85psi，鞘气温度400℃，毛细管电压5300V。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.一种生物活性药物的药代动力学分析方法，其特征在于，所述生物活性药物为多肽类药物，包括以下步骤：

S1.称取待分析生物活性药物，配制成其说明书规定的标准浓度；

S2.使用缓冲溶液将原料药溶液分别稀释成不同浓度，并将10份不同浓度的溶液作为系列标准溶液，以原料药溶液的总浓度作为标示量，计量各标准溶液中各组分的相对浓度百分比；

所述系列标准溶液的相对浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%、10%、20%、30% 、50%、100%；

S3.经静脉注射的方式给予受试动物由步骤S2制备的溶液，收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理得到血浆样品；使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液；

所述受试动物为重量为10-20g的无胸腺裸鼠，

所述收集动物血液样品于聚乙烯管中，并进行血液样品的处理，获得血浆；

S4.于S3得到的血浆中加入0.1-0.3mg固体半胱氨酸封闭剂，涡流混匀，进行半胱氨酸的封闭处理，得到反应液；

S5.经半胱氨酸封闭的反应液中加入200-400μL消化缓冲液，涡流混合，再加入4-6μL胰酶溶液，涡流混合，孵育得到血浆样品酶解液；

S6，于酶解液中加入1～3μL稳定同位素标记的特征肽段和内标肽段，涡流混匀，将所述特征肽段和所述内标肽段混合酶解；

S7.使用液相色谱串联质谱仪将酶解后的反应液进行液相色谱-质谱分析，将所选的特征性肽段峰面积与内标肽段峰面积比值代入标准曲线，得生物活性药物浓度；

S8.根据药物浓度-时间数据，计算出药动学参数，在计算药动学参数时，采用药动学软件WinNonlin5.2.1软件模拟拟合。

2.根据权利要求1所述的一种生物活性药物的药代动力学分析方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述在进行静脉注射前，对无胸腺裸鼠进行1-2月培养，具体培养条件为：无菌环境下，设定培养室的温度为26-30℃，培养湿度为45-60％，并且培养室中光照为12h明暗交替。

3.根据权利要求1所述的一种生物活性药物的药代动力学分析方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述进行血液样品的处理具体包括：

分别于给药后的0.25h、0.5h、1h、2h、4h、12h、16h、24h、32h、48h、96h对无胸腺裸鼠的血液进行采集，具体为左手抓住小鼠颈部皮肤，轻压在实验台上，取侧卧位，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出；用眼科弯镊迅速夹去眼球，将鼠倒立，用器皿接住流出的血液；采血完毕立即用纱布压迫止血；每次采血量0.2～0.5ml；

吸取血液样品于加有乙二胺四乙酸二钠抗凝的离心管中，静置20min，然后在4℃环境下进行10-12min离心，离心转速为3000rpm，分离血浆，得到血浆样品。

4.根据权利要求1所述的一种生物活性药物的药代动力学分析方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述使用血浆样品和系列标准溶液制成相应的血浆溶液具体为：

分别取不同浓度的系列标准溶液10μL置于离心管中，分别置于氮吹仪中水浴40℃吹干；

吹干后加入血浆样品10μL，涡旋混合5min，依次加入5μL内标工作液、100μL甲醇，混合均匀，置于高速离心机中16000rpm离心10min得到上清液；

上清液置于离心管中，置于氮吹仪中水浴40℃吹干，在吹干的残渣中加入100μL甲醇复溶，涡旋45s，再次离心得到上清液，即血浆溶液。

5.根据权利要求1所述的一种生物活性药物的药代动力学分析方法，其特征在于，所述步骤S6中，所述特征肽段和内标肽段所含的稳定同位素标记是针对所述特征肽段和内标肽段中的脯氨酸的N和C元素分别进行15N和13C标记。

6.根据权利要求1所述的一种生物活性药物的药代动力学分析方法，其特征在于，所述步骤S7中，所述液相色谱-质谱分析中的液相色谱条件为：采用Antibodix™ NP10色谱柱，所述色谱柱的规格为4.6mm×250mm，10μm；柱温为35-40℃；流动相A为甲酸体积百分数占0.25～0.45％的水；流动相B为甲酸体积百分数占0.25～45％的乙腈；进行梯度洗脱50～60min，进样量为20-40μl，流速为1-2ml/min。

7.根据权利要求1所述的一种生物活性药物的药代动力学分析方法，其特征在于，所述液相色谱-质谱分析中质谱分析的条件为：雾化压力为75～85psi，鞘气温度370～400℃，毛细管电压4700～5300V。

8.如权利要求1-7所述的生物活性药物的药代动力学分析方法在单克隆抗体药物研发中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体药物为抗PD-L1药物。

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