WO2014139318A1

WO2014139318A1 - 苯酞化合物的应用

Info

Publication number: WO2014139318A1
Application number: PCT/CN2014/000155
Authority: WO
Inventors: 林欣荣; 韩鸿志; 邱紫文; 薛国伟; 黄茂轩
Original assignee: 国钦生物科技股份有限公司
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2014-02-13
Publication date: 2014-09-18
Also published as: EP2974723A1; EP2974723B1; TWI487521B; ES2671999T3; TW201434465A; EP2974723A4

Abstract

一种使用苯酞化合物（phthalide）于制备药剂的用途，该药剂特别用以促进干细胞分泌端粒酶（telomerase）、神经滋养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、干细胞趋化因子（stromal cell-derived factor-1，SDF1）、干细胞趋化因子接受体（CXC chemokine receptor 4，CXCR4）、及免疫调节因子的至少一种；以及一种包含一苯酞化合物以及一干细胞的套组。

Description

勺应用

本发明关于苯酞化合物（phthalide )的应用，尤其关于使用苯酞化合物于制备促进干细胞分泌端粒酶（ telomerase ) 、神经滋养因子 ( brain-derived neurotrophic factor, BDNF ) 、干细胞趋化因子 ( stromal cell-derived factor- 1 , SDFl ) 、干细胞趋化因子接受体（ CXC chemokine receptor 4, CXCR4 ) 、及免疫调节因子的至少一者的药物中的应用，特别是用于制备治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病的药物的应用。

背景技术神经元（neuron )亦可称为神经细胞，是生物体神经系统的结构与功能单位之一，可通过化学信号及电信号与其它细胞进行信息传递，具有各种不同的形状和尺寸，直径为约 4微米至约 100微米，结构上大致可分为细胞本体、树突（dendrite ) 、及轴突（axon ) 三部分，其中树突可将信息带入细胞本体，而轴突则可将信息自细胞本体传出。

神经元依其信息传递方向及功能可区分为三种：感觉神经元（ sensory neuron ) 、运动神经元 ( motor neuron ) 、及连络神经元 ( interneuron ) , 其中运动神经元是控制生物体活动的神经细胞。一般而言，存在脑中的运动神经元称为上运动神经元，而存在脑干及脊髓中的运动神经元称为下运动神经元。当运动神经元退化造成功能异常时，可能会引起肌萎缩侧索硬化症 ( amyotrophic lateral sclerosis, ALS )、重症肌无力、肌无力、 dystrophy ) 、多发性硬化症 ( multiple sclerosis )、多发性系统退化症 (multiple system atrophy)、及 /或脊推性肌肉萎缩症（ spinal muscular dystrophy )等运动神经元退化性疾病。患有上述运动神经元退化性疾病的患者，其身体会逐渐出现肌肉无力、萎缩、颤抖、痉挛、僵硬等症状，并可能导致发音困难、吞咽困难、呼吸衰竭等。

目前尚无法确定造成运动神经元退化性疾病的真正原因，研究指出，可能的病因包括：因超氧阴离子堆积而刺激自体吞噬作用过度表现所造成的神经元死亡、自体免疫异常、神经元过度兴奋（例如，麸胺酸过度累积）、神经元过度氧化、以及遗传等。目前临床上用于治疗运动神经元退化性疾病的药物，包括麸氨酸拮抗剂如锐力得（Riluzole ) 、抗氧化剂如维他命 E、神经滋养因子（ neurotrophic factor ) 、以及免疫调节剂 ( immune modulators ) 等，然而，前述药物对于疾病的治疗多无明显益处，或仅能有限地延长患者生命约 3至 6个月。

另外，研究发现，干细胞可分化形成神经细胞，这为神经系统疾病如帕金森氏症（ Parkinson's disease ) 、中风、脑损伤、及脊髓损伤等带来了治疗希望。举例言之，研究发现干细胞可通过静脉注射（即，静脉移植）穿透血脑屏障（ blood brain barrier ) , 从而减轻老化所引起的神经退化，且可修复并重建受损的脑血管，以维持脑神经的正常化与年轻化。此外，研究显示，干细胞疗法（stem cell therapy ) 已于多名患有脑萎缩合并阿兹海默症（Alzheimer's disease ) 的患者发挥显著疗效。然而，前述研究亦显示，干细胞治疗对于运动神经元退化性疾病并无显著的疗效，或仅能提供相当有限的效果，例如：仅能使患有肌萎缩侧索硬化症的小鼠的寿命延长至约 140 天（此可参见 Garbuzova-Davis et al.， Human umbilical cord blood treatment in a mouse model of ALS: optimization of cell dose, 2008 ) 。因此，目前临床上仍迫切需要一种可治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病的药物。

本发明人研究后发现，苯酞化合物（phthalide )可促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及 / 或免疫调节因子（如：介白素 -6、介白素 -8 ) , 且合并使用苯酞化合物及干细胞，可达到治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病的功效。发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种使用苯酞化合物（phthalide )于制备用以促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及免疫调节因子的至少一者的药剂中的用途。

本发明的另一目的，在于提供一种套组，其包含：一第一组合物，包含一苯酞化合物；以及一第二组合物，包含一干细胞；其中，该第一组合物及该第二组合物为供同时或分别投予至一个体。

本发明的又一目的，在于提供一种使用一苯酞化合物的代谢前驱物于制备用以治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病的药剂的用途，其中该苯酞化合物的代谢前驱物为 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞 ( 3-butylidene-4,5-dihydrophthalide , ligustilide ) 。

本发明的详细技术内容及部分实施态样，将描述于以下内容中，以供本发明所属领域具通常知识者据以明了本发明的特征。

附图说明图 1 显示亚丁基苯酞 ( n-butylidenephthalide, BP ) 于生物体内的代谢，其中，图 1A显示亚丁基苯酞与人类肝脏微粒体混合反应的样本的液相层析串联质谱分析的质图谱，图 1B显示亚丁基苯酞于生物体中进行第一阶代谢的代谢图谱，图 1C显示亚丁基苯酞于生物体中进行第二阶代谢的代谢图谱；

图 2显示对 SOD1 G93A基因转殖小鼠进行不同投药处理的小鼠存活曲线图；

图 3显示对 SOD1 G93 A基因转殖小鼠进行不同投药处理的小鼠 BBB 评分曲线图；

图 4显示干细胞以不同成分处理后的端粒酶表现量的长条线图；图 5显示干细胞以不同成分处理后的 BDNF、 SDF1、 CXCR4、 IL-6、及 IL-8基因表现量的电泳图；以及

图 6显示 SOD1 G93A基因转殖小鼠经亚丁基苯酞结合干细胞治疗的蛋白质表现量，其中，图 6A显示以人类粒线体抗体进行免疫组织化学染色的照片，图 6 B显示以人类神经滋养因子抗体进行免疫组织化学染色的照片，图 6C显示以人类干细胞趋化因子接受体抗体进行免疫组织化学染色的照片。

具体实施方式以下将具体地描述根据本发明的部分实施态样；但是，在不背离本发明精神下，本发明尚可以多种不同形式的态样来实践，不应将本发明保护范围解释为限于说明书所陈述的内容。此外，除非文中有另外说明，于本申请文件中所使用的 "一" 、 "该" 及类似用语应理解为包含单数及复数形式，文中 "视需要取代或置换" 是既包括进行取代或置换的情形，也包括不进行取代或置换的情形；所谓 "有效量" ，是指投予至个体时，可有效至少部分改善怀疑个体的状况的化合物用量；所谓 "个体" 是指哺乳动物，哺乳动物可为人类或非人动物；所谓 "亳克 /公斤体重" 是指个体每公斤体重所需的剂量（亳克）；所谓 "烃基" 是包含饱和烃基及具一个或多个不饱和键的不饱和烃基；所谓 "干细胞疗法" 是指以任何投药方式投予一个体一干细胞的治疗方法。

端粒（Telomere )为位于染色丝末端的重复序列，已知端粒的长度可决定细胞的寿命。端粒酶（Telomerase )为一反转录酶，其可延长端粒的长度，对于调节细胞生长、维系细胞恒定性以及抑制细胞凋亡（apoptosis ) 皆扮演重要的角色。如上所述，先前的研究显示，干细胞疗法对于治疗运动神经元退化性疾病并不具有显著的疗效，这可能是因为投予至患者体内的干细胞的生命周期较短所致。因此，若能延长干细胞的生命周期

(例如，提高干细胞的端粒酶活性），可望能够提升干细胞于治疗运动神经元退化性疾病的疗效。

此外，于干细胞疗法中，已知干细胞所分泌的神经滋养因子

( brain-derived neurotrophic factor, BDNF ) 、干细胞趋化因子 ( stromal cell-derived factor- 1 , SDF1 ) 、及干细胞趋化因子接受体具有抑制运动神经元的细胞凋亡及促进运动神经元增生的功效，故可用于保护运动神经元，抑制运动神经元的细胞凋亡及促进运动神经元增生（BDNF与 SDF1 对神经元的影响可参见 Park, D. et al" Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve cognitive function and physical activity in ageing mice. J Neurosci Res, 2013 ) 。另一方面，已知干细胞所分泌的免疫调节因子，例如介白素 -6及介白素 -8 , 可通过调节免疫反应而维持神经细胞新生（关于经由调节免疫反应而维持神经细胞新生的研究可参见 Kohman, R.A. et al" "Neurogenesis, inflammation and behavior. Brain Behav Immun, 2013. 27 (1): p. 22-32 ) 。因此，若可增加干细胞的神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及 /或免疫调节因子（如：介白素 -6、介白素 -8 ) 的表现量，则可提升干细胞疗法对于运动神经元退化性疾病的疗效。

本发明人发现，苯酞化合物（phthalide ) 可促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及 /或免疫调节因子（如：介白素 -6、及 /或介白素 -8 ) 。

因此，本发明提供一种使用一苯酞化合物于制备用以促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及免疫调节因子（如：介白素 -6、介白素 -8 ) 的至少一者的药剂的用途。当将该药物投予至一经干细胞疗法治疗的个体（即，经投予一干细胞的个体）、或一将进行干细胞疗法治疗的个体（即，将投予一干细胞的个体时）时，因该苯酞化合物可促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及 /或免疫调节因子，故可延长干细胞的生命周期、抑制运动神经元的细胞凋亡及 /或促进运动神经元增生，且可治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓发病。

于本发明一实施态样中，所使用的苯酞化合物为选自以下群组的至少一者：式（I ) 化合物、式（I ) 化合物的医药可接受的盐、式（I ) 化合物的医药可接受的酯、及前述各项的任意组合:

( I ) ，

其中， A为 C1-C5 烃基，所述烃基视需要经一个或多个选自以下群

Ri为 H, 或为经取代或未经取代的 C1-C20烃基，该烃基的一个或多个 -CH2-为视需要经 -NH-或 -0-置换；以及 Y为 0或 S , 且可视需要与 A 键结形成一五元环，其条件为当 Y与 A键结形成一五元环时， R1不存在。

较佳地，于式（I ) 中， A为一 C1-C5烷基或烯基，所述烷基或烯基是视需要经一个或多个选自以下群组的取代基取代： -0H、 =0、及 C1-C3 烷基； (若存在）为 H, 或为经取代或未经取代的 C1-C10烃基，该烃基的一个或多个 -C¾-为视需要经 -NH-或 -0-置换。较佳地，于式（I ) 中， A为具如下结构：

更佳地，于本发明用途所使用作为苯酞化合物的式（I ) 化合物，为选自以下化合物（1)至（14)、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯、及前述的组合：、

、 4):

其中，化合物（ 10) 中的 Cys是指半胱胺酸（ cysteine); 化合物（ 1 1 ) 中的 Glutathione是指麸胺基硫。

本发明人研究发现，亚丁基苯酞于生物体内可有效促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及 /或免疫调节因子。于上述化合物（1 )至（14)中，化合物（1 ) 即亚丁基苯酞，化合物（2)至（14)则为亚丁基苯酞的代谢物，即，亚丁基苯酞通过生物体内的第一阶（ phase I ) 代谢作用或第二阶 ( phase II ) 代谢作用所产生的化合物，详如后附实施例说明。但凡化合物于生物体内所提供的医药活性，可能来自该化合物的代谢物都包含在内。因此，较佳是于本发明使用上述化合物（1 )至（14)、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯、及前述的组合。

除了式（ I ) 化合物以外，于本发明所使用的苯酞化合物，亦可为亚丁基苯酞的其他结构类似物、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯，或前述各项的任意组合。

于本文中，所谓 "医药可接受的盐"，是包括所述含有酸官能基的化合物与有机或无机碱所形成的医药可接受的盐。其中，与无机碱所形成的盐的例子包括，但不限于，碱金属盐（如钠盐、钾盐）、碱土金属盐（如钙盐、镁盐）、过渡金属盐（如铁盐、锌盐、铜盐、锰盐及铝盐）、以及铵盐；与有机碱所产生的盐的例子包括与甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、异丙基胺、三丙基胺、三丁基胺、乙醇胺、二乙醇胺、 2-二甲基胺乙醇、 2-二乙基胺乙醇、二环己基胺、离胺酸盐、精胺酸盐、组胺酸盐、咖啡碱、海巴胺（ hydrabamine )、胆碱、甜菜碱、乙烯二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌啶、 N-乙基哌啶、四甲基铵化合物、四乙基铵化合物、吡啶、 Ν,Ν-二甲基苯胺、 Ν-甲基哌啶、 Ν-甲基吗啉、二环己基胺、二苯甲基胺、 Ν,Ν-二苯甲基苯乙基胺、 1 -伊芬胺（ l -ephenamine )、 N,N'-二苯甲基乙烯二胺、聚胺树脂及其类似物等所形成的盐。

所谓 "医药可接受的酯"，是包括所述含有如 -ΟΗ 官 E 合物与酸反应所得的酯。该酸可为无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磺胺酸、硝酸、及磷酸的无机酸，和有机酸例如醋酸、三氟醋酸、己二酸、抗坏血酸、天门冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟脑酸 (camphoric acid) , 樟脑石黄酸 ( camphorsulfonic acid )、肉桂酸、才宁檬酸、二葡萄糖酸、乙烷磺酸、麸胺酸、甘醇酸、甘油磷酸、半硫酸( hemisulfic acid )、己醇酸、甲酸、 2-经基乙石黄酸( isethionic acid )、乳酸、羟基马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、三甲基苯磺酸 ( mesitylenesulfonic acid )、甲石黄酸、萘石黄酸 ( naphthalenesulfonic acid ) , 烟碱酸、 2-萘磺酸、草酸、哌酸、果胶酯酸、苯基醋酸、 3 - 苯丙酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、对 -甲苯磺酸、十一烷酸等。

所谓 "亚丁基苯酞的结构类似物" 是指一与亚丁基苯酞不同、但其部份或全部化学结构、电子分布、及 /或医药特性与亚丁基苯酞的部份或全部相似的化合物。亚丁基苯酞的结构类似物的例子，除式（ I ) 化合物以外，包括但不限于亚丁基苯酞的代谢前驱物、亚丁基苯酞及其代谢前驱物的异构物、以及前述的医药可接受的盐及酯。所谓 "亚丁基苯酞的代谢前驱物" 是指一经生物体代谢后会产生亚丁基苯酞的化合物。亚丁基苯酞的结构类似物的特定例子如： 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞 ( 3-butylidene-4,5-dihydrophthalide , ligustilide ) 及 3 -丁基 -3 a,4,5,7a-四氢 - 1 (3H)-异苯并呋喃酮 ( 3-butyl-3a,4,5,7a-tetrahydro - 1 (3H)-isobenzofuranone , cnidilide )。

于本发明的部分实施态样中，所使用的苯酞化合物为 3-亚丁基于本发明用途中，所使用的干细胞可为任何适宜用于干细胞疗法的干细胞，例如但不限于选自以下群组之一者：胚胎干细胞、成体干细胞（例如，间叶干细胞（ mesenchymal stem cell )、造血干细胞（ hematopoietic stem cell ) )、诱导性多功能干细胞（ induced pluripotent stem cell , iPSc )、及前述各项的任意组合。其中，该间叶干细胞的例子包括，但不限于骨髓干细胞（ bone marrow stem cell )、脐带血干细胞（ umbilical cord blood stem cell )、胎盘干细胞

( placenta stem cell )、脂肪干细胞（ adipose stem cell , ADSC )、口腔干细胞 ( oral stem cell )、嗅球干细胞（ olfactory bulbs stem cell )、羊水干细胞（ amniotic fluid stem cell )、羊膜干细胞（ amniotic stem cell ) , 脐带干细胞（ umbilical cord stem cell )、及脐带内膜干细胞

( umbilical cord lining stem cell )。于本发明部分实施态样中，所使用的干细胞为脂肪干细胞。

如上所述，于本发明的用途中，所提供的药剂为具有促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及 /或免疫调节因子（例如：介白素 -6、介白素 -8 ) 的功效，故可用于防止运动神经元凋亡、保护运动神经元、及 /或促进运动神经元增生，且可用于治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病。

于本发明部分实施态样中，所提供的药剂是用以治疗脊髓运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病。该运动神经元退化性疾病包含任何与运动神经退化相关的疾病，包括但不限于肌萎缩侧索硬化症 ( amyotrophic lateral sclerosis, ALS ), 重症肌无力 ( myasthenia gravis ), 肌无力 ( gravis), 肌肉萎缩 ( muscular atrophy), 肌营养不良 ( muscular dystrophy ), 多发性硬化症 ( multiple sclerosis ), 多发性系统退化症（ multiple system atrophy )、以及脊推性肌肉萎缩症 ( spinal muscular atrophy ) 等。

根据本发明的一具体实施态样，该药剂能用于治疗肌萎缩侧索硬化症。肌萎缩侧索硬化症又称渐冻人症，患者会出现渐进性的肌肉萎缩，通常在发病后 2至 5年会造成患者四肢瘫痪（ quadriplegia)、吞咽困难、甚至呼吸衰竭。研究指出，肌萎缩侧索硬化症可能与神经元过度兴奋（例如，麸胺酸（ glutamates ) 过度累积）有关，因此目前临床上主要使用麸氨酸拮抗剂，例如锐力得（ Riluzole), 来治疗肌萎缩侧索硬化症，以延长病患的存活率。相较于以锐力得进行治疗，本发明所提供的药剂可更有效地延缓肌萎缩侧索硬化症患者的发病、提高患者的存活率。

于本发明中，所提供的药剂可呈任何形式，并以任何合宜的方式施用。举例言之，但不以此为限，可通过口服、鼻腔给药、皮质脊骨遺注射 ( corticospinal tract inj ection )、鞘内注射 ( intrathecal injection ) , 脑内注射、静脉注射、腹腔注射、及 /或皮下注射等方式施用至一需要的个体。其中，由于口服投药剂型便于病人按时自行服用，故于本发明的一较佳实施态样中，以口服剂型提供该药剂，例如：锭剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、乳剂、及酊剂等。视使用形式及用途而定，该药剂可更包含一医药可接受的载剂。

以制备适于口服投药的剂型为例，该药剂中可含有任何不会不利影响所含活性成分（即，该苯酞化合物）的活性的医药可接受载剂，例如：溶剂、油性溶剂、稀释剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、乳化剂、抗氧化剂、粘合剂、润滑剂、吸湿剂等。可利用任何合宜的方法，将该组合物制成适于口服投药的剂型。

至于制备适于脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、或皮下注射的剂型，该药剂可例如包含一种或多种等张溶液、盐类缓冲液（如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液）、助溶剂（ solubilizer )、乳化剂、以及其他载剂等成分，以制成一静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等。

除了上述佐剂外，该药剂可视需要另含有调味剂、调色剂、着色剂等添加剂，以提高所得药剂服用时的口适感及视觉感受；另可添加合宜用量的保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等，以改善药剂的储存性。此外，视需要地，可于本发明所提供的药剂中并含一种或多种其他活性成分，例如抗氧化剂（如维他命 E )、神经滋养因子 ( neurotrophic factor ) , 免疫调节刻 ( immune modulators ) 等, 以进一步加强本发明药剂的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对所使用的苯酞化合物的所欲功效没有不利的影响即可。

为使本发明所提供的药剂可于一个体中发挥促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及 /或免疫调节因子（如：介白素 -6、介白素 -8 ) 的功效，可以于将干细胞施用至一个体之前、之后或同时投予至该个体中，以改良干细胞疗法。于前述干细胞疗法中，该干细胞的用量，较佳为每次投予约 lx l O²至约 l xl O¹⁵个干细胞 /施打部位，更佳为每次投予约 lxl O⁵至约 lxl O⁸个干细胞 /施打部位。但，对于急性患者而言，干细胞的用量可视实际需要而酌增，例如增加至上述量的数倍或数十倍。此外，可以一日一次、一日多次、或数日一次等不同投药频率施用该药剂，根据投予个体的需求而异。举例言之，当使用于人体以治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病时，该药剂的用量，以苯酞化合物计，较佳为每日投予约 100至约 1 ,000亳克 /公斤体重的剂量，更佳为每日投予约 250 至约 800 亳克 /公斤体重的剂量。此外，可视需要调整每日投药剂量为单次投药或多次投药，以进一步优化苯酞化合物的疗效。举例言之，当所欲投予的单日剂量为 500亳克 /公斤体重时，可单次投予 500亳克 /公斤体重的剂量，或每次投予 250亳克 /公斤体重的剂量，且每天投药二次。本发明另提供一种套组，其包含：一第一组合物，包含一苯酞化合物；以及一第二组合物，包含一干细胞；其中，该第一组合物与该第二组合物为供同时或分别投予至一个体。此外，于使用本发明套组时，可视需要以相同或不同的投药频率施用该第一组合物及该第二组合物，例如一日一次、一日多次、或数日一次等。本发明套组中所含的该苯酞化合物及该干细胞的性质、特征及较佳实施态样皆如本文所描述。

本发明套组可用于促进干细胞分泌以下的至少一者：端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及免疫调节因子（如：介白素 -6、介白素 -8 )。因此，该套组可用于防止运动神经元凋亡、保护运动神经元、及 /或促进运动神经元增生，且可用于治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病。较佳地，本发明的套组是用于治疗脊髓运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病。该运动神经元退化性疾病，包含任何与运动神经退化相关的疾病，包括但不限于肌萎缩侧索硬化症、重症肌无力、肌无力、肌肉萎缩、肌营养不、多发性硬化症、多发性系统退化症、脊推性肌肉萎缩症等。根据本发明的一实施态样，该套组为用于治疗肌萎缩侧索硬化症。

于本发明套组中，该第一组合物及第二组合物较佳是置于不同包装中，例如分别置于不同的塑胶袋、塑胶瓶、玻璃瓶、安瓿 ( ampoule ) , 纸盒或塑胶盒中，且各该包装可彼此相连或分离。此外，该第一组合物与该第二组合物可分别呈任何适于投药的相同或不同形式。举例言之，但不以此为限，该第一组合物与该第二组合物可各自独立通过口服、鼻腔给药、皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射、及 /或皮下注射等方式施用至需要的个体。于根据本发明的部分实施态样，该第一组合物为呈口服剂型（如：锭剂），该第二组合物则呈可通过脑内注射或静脉注射的置于玻璃瓶的注射剂型。

视使用形式及用途而定，该第一组合物及第二组合物可分另包含任何医药可接受的载剂、佐剂、添加剂，以呈所欲的投药形式，只要该等载剂、佐剂、添加剂对于该苯酞化合物及 /或干细胞的所欲功效没有不利的影响即可。

以制备适于口服投药的剂型为例，该第一组合物及该第二组合物可各自含有任何不会不利影响所含活性成分（即，该苯酞化合物或干细胞）的活性的医药可接受载剂，例如：溶剂、油性溶剂、稀释剂、安定剂、吸收延迟剂、崩散剂、乳化剂、抗氧化剂、粘合剂、润滑剂、吸湿剂等。可利用任何合宜的方法，将该第一组合物及 / 或该第二组合物制成适于口服投药的剂型，例如：锭剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、流浸膏剂、溶液剂、糖浆剂、悬液剂、乳剂、及酊剂等等。

至于制备适于脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、或皮下注射的剂型，该第一组合物及该第二组合物可各自例如包含一种或多种等张溶液、盐类缓冲液（如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液）、助溶剂（ solubilizer )、乳化剂、以及其他载剂等成分，以制成一静脉输注液、乳剂静脉输注液、干粉注射剂、悬液注射剂、或干粉悬液注射剂等。

除了上述佐剂外，该第一组合物及 /或第二组合物可视需要另含有调味剂、调色剂、着色剂等添加剂，以提高所得药剂服用时的口适感及视觉感受；另可添加合宜用量的保存剂、防腐剂、抗菌剂、抗真菌剂等，以改善药剂的储存性。此外，视需要地，可于本发明套组的第一组合物及 /或第二组合物中并含一种或多种其他活性成分，以进一步加强本发明药剂的功效或增加制剂配方的运用灵活性与调配度，只要该其他活性成分对所使用的苯酞化合物及 /或干细胞的所欲功效没有不利的影响即可。

此外，可视实际使用需求，调整本发明套组中该第一组合物以及第二组合物的施用剂量为适于单次或多次使用。因此，可视需要于本发明套组中另外包含一使用说明书，以说明该第一组合物以及第二组合物的使用方式。举例言之，当施用本发明套组于人体以治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病时，该第一组合物的用量，以该苯酞化合物计，较佳为每日约 100至约 1 ,000亳克 /公斤体重，更佳为每日约 250 至约 800 亳克 /公斤体重；该第二组合物的用量，以该干细胞计，较佳为 l xl O²至约 lxl O¹⁵个细胞 /施打部位，更佳为 lxl O⁵至约 lxl O⁸个细胞 /施打部位。然而对于急性患者而言，该用量可视实际需要增加至前述量的数倍或数十倍。根据本发明的一治疗肌萎缩侧索硬化症的实施例中，该苯酞化合物为亚丁基苯酞，其施用剂量为每天约 500 亳克 /公斤体重；而该干细胞为脂肪干细胞，其脑内注射的剂量为每次约 2x l 0⁶个细胞，而静脉注射的剂量为每次约 l x l O⁶个细胞。

本发明套组可更包含一第三组合物，该第三组合物包含一溶剂及 /或一溶液，较佳是置于与该第一组合物及该二组合物不同的包装（例如，塑胶袋、塑胶瓶、玻璃瓶或安瓿）中，可于使用时与该第一组合物及 /或该第二组合物混合，以提供一注射液。适用于第三组合物的溶剂，包括但不限于极性溶剂，例如水、二甲基亚砜 ( DMSO )、及乙醇等；适用于第三组合物的溶液，包括但不限于盐类缓冲液、以及任何用于提供注射剂型的合宜注射液。盐类缓冲液的例子，包括但不限于磷酸缓冲液（ PBS )、柠檬酸盐缓冲液、及生理食盐水等。于本发明的一实施态样中，是于投药前将第二组合物（包含一干细胞）与第三组合物（包含一磷酸缓冲液）混合，以提供供注射的剂型。

此外，本案发明人研究后发现，苯酞化合物的代谢前驱物本身亦具有治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病的功效，其功效不仅优于单独使用亚丁基苯酞，亦较合并使用亚丁基苯酞与干细胞为佳。因此，本发明亦提供一种使用一苯酞化合物的代谢前驱物于制备用以治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病的药剂的用途，其中该苯酞化合物的代谢前驱物为 3-亚丁基 -4, 5-二氢苯酞。

根据本发明，使用苯酞化合物的代谢前驱物所提供的药剂，可例如用于治疗以下疾病或延缓其发病：肌萎缩侧索硬化症、重症肌无力、肌无力、肌肉萎缩、肌营养不良、多发性硬化症、多发性系统退化症、脊推性肌肉萎缩症、及前述各项的任意组合，且尤其可用于治疗肌萎缩侧索硬化症及 /或延缓其发病。其中，该药剂的剂型、投药方式、及用量等皆如前述所述。

兹以下列实施例进一步例示说明本发明。其中该等实施例仅提供作为说明，而非用以限制本发明的保护范围。

[实施例】

[实施例 1】亚丁基苯酞的代谢物阶（phase I ) 代谢及第二阶（phase II ) 代谢二类，第一阶代谢主要为药物的氧化还原反应或水解反应，第二阶代谢则主要由细胞色素 P450单力口氧酶 ( cytochrome P450 ( CYP 450 ) monoxygenase ) 系统进行代谢反应。本实施例分别借助在体外 ( in v ro )将亚丁基苯酞与肝脏微粒体（ microsomes ) 或经冷冻保存的肝脏细胞 ( cryopreserved hepatocytes ) 混合反应, 以模拟亚丁基苯酞于生物体肝脏内所进行的第一阶代谢及第二阶代谢，并以液相层析串联质谱仪（ LC-MS/MS ) 分析反应后溶液中的产物，以确认亚丁基苯酞的代谢产物及代谢图谱（ profile )。

( 1 ) 第一阶代谢试验

分别将 2微莫耳浓度的亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP 95% + E-BP 5% ) 与含有人类、大鼠、或狗的肝脏微粒体 ( 0.5 亳克 /亳升）的磷酸钾缓冲液（ 100亳莫耳浓度， pH 7.4 ) 混合，于 37°C下反应 10分钟后，添加经预热的辅因子（包含 2亳莫耳浓度烟碱酰胺腺嘌呤二核甘酸磷酯（NADPH) 及 3 亳莫耳浓度氯化镁），于 37°C下反应 60分钟，接着添加三倍体积的含有 0.1% 甲酸的乙腈以终止反应。将样本以 13,000转 /分钟的转速离心 5分钟，取上清液进行液相层析串联质谱仪分析，以分析代谢物。

( 2 ) 第二阶代谢试验

分别将含有 5xl0⁵个人类、大鼠、或狗的解冻后的肝脏细胞的威廉姆斯 E培养液（ William's E medium ) 添加至 12孔培养盘中培养 6小时，添力口 0.5亳升亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP 95% + E-BP 5% ) ( 50微莫耳浓度）至培养盘中，并于 37°C、 95%相对湿度、及 5% C0₂下培养 6小时后，添加 2亳升 100%乙腈以终止反应，收集样本并充分混合，于 4°C下以 45,000 g 离心 10 分钟后，取收集上清液进行干燥，接着进行液相层析串联质谱仪分析，以分析代谢物。

( 3 ) 液相层析串联质谱仪分析

分别将由（ 1 ) 和（ 2 ) 获得的样本溶于含有 0.1%甲酸的乙腈溶液中，于 4°C下以 45,000g离心 10分钟，并将样本取至自动取样瓶（ autosampler vials, Agilent公司，美国）进行分析。该液相层析质谱仪系统包含具有 1200SL HPLC系统（ Agilent公司，美国）的 ABSCIEX 5500 Q TRAP™系统、高效液相层析仪（ HPLC )、一管柱（ Symmetry® C18, 3.5微莫耳浓度， 4.6x75亳米）、及一自动取样机（Agilent公司，美国），以正离子电洒模式，于 5.5千伏特、 550°C下以氮气作为辅助气体进行质谱分析。使用双溶剂（溶剂 A: 0.1%甲酸；溶剂 B: 含 0.1%甲酸的甲醇）系统以 0.8 亳升 /分钟定速进行高效液相层析。高效液相层析仪的梯度系统设定为 0至 2分钟： 10%溶剂 B; 2 至 7分钟： 10%溶剂 B 至 95%溶剂 B; 7 至 12 分钟： 95%溶剂 B; 12 至 14分钟： 95%溶剂 B 至 10%溶剂 B; 14 至 20分钟： 10%溶剂 B; 实验全长为 20分钟。将 20微升等分试样 ( aliquots ) 注入液相层析串联质谱仪系统进行分析。接着，通过 LightSight™软件分析液相层析串联质谱图的主要信号峰及各个信号峰相较于亚丁基苯酞的质谱图所示的质量偏移（ mass shift), 以分析样品中所含代谢物，并测定亚丁基苯酞于生物体中的生物转化路径及其代谢图谱，结果如表 1、表 2、图 1A、图 IB及图 1C所示。

图 1A显示亚丁基苯酞（质谱仪分析的 m/z为 189.1 ) 与人类肝脏微粒体混合反应后，样本进行质谱仪分析后的片段产物图谱，显示 m/z为 171.2amu、 153.1amu、 143.0amu、 128.0amu、及 115.0amu 等主要信号峰；图 1B显示亚丁基苯酞与肝脏微粒体混合反应后所形成的代谢图谱及化合物（2 ) 至（ 9) 的化学结构；图 1C所示为亚丁基苯酞与冷冻保存的肝脏细胞混合反应后，所形成的代谢图谱及化合物（ 11 ) 至（ 14) 的化学结构。

下表 1显示亚丁基苯酞与肝脏微粒体混合反应（即，第一阶代谢）后的代谢产物的种类与利用软件分析所得的生物转化路径，结果显示亚丁基苯酞在与大鼠、狗、及人类的肝脏微粒体混合反应后，皆可反应形成本发明化合物（ 2 ) 至（ 9), 显示亚丁基苯酞在不同生物体中经肝脏代谢后皆会产生相似的代谢物。

表 1

下表 2显示亚丁基苯酞与冷冻保存的肝脏细胞混合反应（即，第二阶代谢）后的代谢产物的种类与利用软件分析所得的生物转化路径，结果显示，亚丁基苯酞在与大鼠、狗、及人类的冷冻保存的肝脏细胞混合反应后，可反应形成本发明化合物（ 11 ) 至（ 14 ) , 显示亚丁基苯酞在不同生物体中经肝脏代谢后会产生相似的代谢表 2

[实施例 2】基因转殖小鼠存活率的活体内试验

已知肌萎缩侧索硬化症的病患中，约有 20%会发生铜 /锌超氧化物歧化酶（ SOD1 ) 的基因突变，其中以 G93A突变位点最多，利用基因转殖技术转入经突变的人类 SOD1-G93A 的基因转殖小鼠 (于此称『 SOD1-G93A 基因转殖小鼠』），因具有与人相似的发病特点，而可作为临床上用于研究肌萎缩侧索硬化症的动物模型，此

SOD1-G93A基因转殖小鼠会于出生后约第 90士 5天开始发病，于出生后约第 125±5天死亡。

本实施例即釆用上述 SOD1-G93A 基因转殖小鼠作为研究对象，进行活体内（ Wvo ) 试验，实验分为以下五组：（A) 控制组 (未投药）； ( B) 锐力得实验组：在 SOD1-G93A 基因转殖小鼠出生后第 60天开始定时腹腔注射锐力得，每天 1次，剂量为 16亳克 /公斤体重；（ C )亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide:包含 Z-BP 95% + E-BP 5% ) 实验组（ BP 500 mg/kg/qd): 在 SOD1-G93A基因转殖小鼠出生后第 60 天开始定时口服投予亚丁基苯酞（购自景明化工），每天 1 次，每次剂量 ⁵00 亳克 /公斤体重；（D) 亚丁基苯酞 ( n-butylidenephthalide:包含 Z-BP 95% + E-BP 5% )实验组（ BP 250 mg/kg/bid): 在 SOD1-G93A基因转殖小鼠出生后第 60天开始定时口服投予亚丁基苯酞（购自景明化工），每天 2 次，每次剂量 250 亳克 /公斤体重；（E)脂肪干细胞 +亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP95% + E-BP 5% ) ( ADSC+BP ) 实验组：于 SOD1-G93A 基因转殖小鼠出生后第 60 天以脑内注射人类脂肪干细胞（剂量为 2xl0⁶个细胞 /30微升磷酸缓冲液），于出生后第 90天以静脉注射脂肪干细胞（剂量为 lxlO⁶个细胞 /150 微升磷酸缓冲液），并同时于出生后第 60 天开始定时口服投予亚丁基苯酞 ( n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP 95% + E-BP 5% ), 每天 1次，每次剂量 500 亳克 /公斤体重；（ F) Ligustilide ( 3-亚丁基 -4, 5-二氢苯酞，即，亚丁基苯酞的代谢前驱物，购自 Pharmaron ) 实验组：在 SOD 1 -G93A 基因转殖小鼠出生后第 60 天开始定时口服投予 Ligustilide , 每天 1 次，每次剂量 500亳克 /公斤体重。于第 30天给药后开始观察并用脂肪干细胞及亚丁基苯酞是否可延长 SOD1-G93A基因转殖小鼠的存活天数（即，存活超过 125天），结果显示于图 2及表 3。

如图 2及表 3所示，相较于控制组的 SOD1-G93A基因转殖小鼠（平均存活约 126.4±7.2天），锐力得实验组的 SOD1-G93A基因转殖小鼠（平均约存活 133.7士 6.4天）的寿命仅延长约 7.3士 0.8天；亚丁基苯酞实验组（BP 250mg/kg/bid)的 SOD1-G93A基因转殖小鼠 (平均约存活 217.7±23.2 天）的寿命则可延长约 91 .3± 16 天； Ligustilide 实验组的 SOD1-G93A 基因转殖小鼠（平均约存活 201.2士 6 天）的寿命可延长约 74.5士 0.1 天；脂肪干细胞 +亚丁基苯酞实验组的 SOD1-G93A基因转殖小鼠（平均约存活 185士 7.5 天）的寿命可延长达约 58.6士 0.3天。

上述结果显示，相较于使用锐力得或单独每天口服一次亚丁基苯酞，本发明结合亚丁基苯酞和脂肪干细胞能更有效地提高患有肌萎缩侧索硬化的小鼠的存活率。此外， Ligustilide ( 即，亚丁基苯酞的代谢前驱物）的单独使用或单独每天口服二次亚丁基苯酞，所提供的提高患有肌萎缩侧索硬化的小鼠的存活率，不仅远高于单独每天口服一次亚丁基苯酞，亦高于合并使用亚丁基苯酞和干细胞。

[实施例 3】萎缩侧索硬化症的活体内试验

此实施例使用 SOD1-G93A基因转殖小鼠作为活体内试验的对象。将 60天大的 SOD1-G93A基因转殖小鼠随机性分为以下五组： ( A) 控制组（未投药）；（ B) 锐力得实验组：在 SOD1-G93A基因转殖小鼠出生后第 60天开始定时腹腔注射锐力得，每天 1 次，每次剂量 16亳克 /公斤体重；（ C)亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP95%+E-BP5% )实验组（ BP 500mg/kg/qd ):在 SOD1-G93A 基因转殖小鼠出生后第 60 天开始定时口服投予亚丁基苯酞（购自景明化工），每天 1 次，每次剂量 500 亳克 /公斤体重；（D)亚丁基苯酞 ( n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP95%+E-BP5% )实验组 ( BP 250 mg/kg/bid): 在 SOD1-G93A基因转殖小鼠出生后第 60天开始定时口服投予亚丁基苯酞（购自景明化工），每天 2 次，每次剂量 250 亳克 /公斤体重；（E) 脂肪干细胞 + 亚丁基苯酞 ( n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP95%+E-BP5% ) ( ADSC+BP )实验组：于 SOD 1 -G93A基因转殖小鼠出生后第 60天以脑内注射人类脂肪干细胞（剂量为 2x l 0⁶个细胞 /30微升磷酸缓冲液），于出生后第 90天以静脉注射脂肪干细胞（剂量为 l x l O⁶个细胞 /150微升磷酸缓冲液），并同时于出生后第 60天开始定时口服投予亚丁基苯酞 ( n-butylidenephthalide : 包含 Z-BP95%+E-BP5% ) , 每天 1次，每次剂量 500 亳克 /公斤体重；（ F ) Ligustilide ( 3-亚丁基 -4, 5-二氢苯酞，即，亚丁基苯酞的代谢前驱物，购自 Pharmaron ) 实验组：在 SOD 1 -G93A 基因转殖小鼠出生后第 60 天开始定时口服投予 Ligustilide , 每天 1次，每次剂量 500亳克 /公斤体重。

于投药后第 30天开始，利用神经行为学评分法（ BBB评分； Basso, Beattie, and Bresnahan ( BBB ) Locomotor Rating Scale ) 观察小鼠后肢，其中正常小鼠后肢评分为 21 分；发病的 SOD 1 -G93A 基因转殖小鼠的后肢评分会从 21 分开始往下降至 0分，评分愈低显示小鼠运动功能愈异常，以此 BBB 评分表来记录投药的疗效。结果显示于图 3。

如图 3所示，在未投药的控制组小鼠中，小鼠的 BBB评分大约在出生第 1 10天后，即开始急遽下降（由 19分降至 0分）；在锐力得实验组小鼠中，小鼠的 BBB评分大约在第 90天至 125天之间开始缓慢下降 ( 由 21分降至 16分），在约第 125天后，开始急遽下降（由 16 分降至 0 分）；在亚丁基苯酞实验组小鼠中，小鼠的 BBB评分大约在第 125天至第 135天之间开始缓慢下降（由 21分降至 16分），在约第 135天后，开始急遽下降（由 16分降至 0分）；在 Ligustilide实验组小鼠中 , 小鼠的 BBB评分大约在第 130天至第 170天之间开始缓慢下降（由 21分降至 18分 ) , 在约第 170天后，开始急遽下降（由 18分降至 0分）；在脂肪干细胞 +亚丁基苯酞实验组小鼠中，小鼠的 BBB评分大约在第 150天至第 190天之间才开始缓慢下降（由 21分降至 0分）。

上述结果显示，相较于使用锐力得或单独每天口服一次亚丁基苯酞，本发明结合亚丁基苯酞与脂肪干细胞能更有效地延缓肌萎缩侧索硬化症的发病。此外， Ligustilide亦可有效地延长肌萎缩侧索硬化症小鼠的发病，且其效果不仅优于单独每天口服一次亚丁基苯酞，亦较合并使用亚丁基苯酞与干细胞为佳。

[实施例 4】促进干细胞分泌端粒酶的体外实验

以如下步骤自人体脂肪组织分离中分离脂肪干细胞。首先，以磷酸盐缓冲液清洗人体脂肪组织（取自临床研究），以眼科剪将脂肪组织剪碎。接着，加入 0.075%第一型胶原酶（ collagenase type I ) ( Sigma-Aldrich Co. , St. Louis , MO , USA ), 在 37 °C水浴摇床消化 30至 60分钟后，添加含有 10%胎牛血清（ Invitrogen, Carlsbad , CA , USA ) 的 DMEM/F- 12培养液（ Invitrogen ) 终止消化。以 100 微米的耐纶网孔过滤该经消化的脂肪组织细胞，以移除细胞残留物。将所得细胞悬浮液离心 10分钟，以获得一沉淀物，在 37 °C、 5%C0₂下将沉淀物培养于 DMEM/F- 12培养液中（含有 10%胎牛血清、 100活性单位 /亳升青霉素、及 100亳克 /亳升链霉素）。接着，以磷酸缓冲液清洗所培养的细胞，以移除残留未贴附的红血球。将所得细胞（即，含有脂肪干细胞的间质血管细胞群（ stromal vascular fraction , SVF ) ) 于 37 °C、 5%C0₂ 下培养于含有 10%胎牛血清的 DMEM/F- 12 培养液中。将贴附的细胞维持在培养液中，每两天更换培养液，直到细胞占满生长平面空间达 80% ( 80% confluence ) , 再于 37 °C 下以 0.25% 的胰蛋白酶 / 乙二胺四乙酸 ( ethylenediaminetetraacetic acid , EDTA ) 消化细胞，离心后再重新悬浮于 DMEM/F- 12培养液中。接着，使细胞悬浮液贴附在新的三角培养瓶中并维持培养，经过三次继代后，以所得人类脂肪干细胞进行以下试验。

将脂肪干细胞培养于 10厘米培养皿，分别添加不同浓度的丙戊酸钠（ Valproic acid , VPA ) ( 1微莫耳浓度或 10微莫耳浓度 )或亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP95%+E-BP5% ) ( 100 微莫耳浓度或 250微莫耳浓度），培养 24小时，再利用端粒酶反转录酶聚合反应免疫酵素测定套件（ telomerase PCR ELISA kit , Cat. No. 1 1854666910 , Roche公司 ) 来分析端粒酶的表现量。于本实验中， ADSC组别为未经亚丁基苯酞处理的组别；正控制组为套件所附的高表现端粒酶样品（ reconstitute lyophilized cell extract ); 负控制组为套件所附的高表现端粒酶样品于 85 °C下加热 10分钟，使蛋白质失活的样品。此外，先前研究显示 VPA 可用于增加脂肪干细胞端粒酶的活性，因此本实验中使用 VPA 作为对照组。结果显示于图 4。

如图 4所示，以亚丁基苯酞（ 100微莫耳浓度或 250微莫耳浓度）处理脂肪干细胞，可有效提升脂肪干细胞中端粒酶的活性（即可提高脂肪干细胞中端粒酶的表现量），显示亚丁基苯酞可通过提升脂肪干细胞的端粒酶活性而延长脂肪干细胞生命周期。

[实施例 5】促进干细胞分泌神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及免疫调节因子的体外实验

在 37°C下以 6孔盘培养人类脂肪干细胞（ 2χ10⁵个脂肪干细胞 /每孔）至隔天，加入不同浓度的亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide: 包含 Z-BP95%+E-BP5%) ( 10微克 /亳升、 20微克 /亳升、或 50微克 /亳升）培养 12小时后，利用专一性引子进行反转录酶-聚合酶连锁反应（ RT-PCR) 分别检测神经滋养因子（ BDNF)、干细胞趋化因子（ SDF1 )、干细胞趋化因子接受体（ CXCR4)、介白素 -6( IL-6)、及介白素 -8 ( IL-8 ) 的基因表现量。 RT-PCR 所用的引子序列显示于表 4所列的 SEQ ID ΝΟ:1 至 SEQ ID NO: 10及所附的序列表中。实验以 β-肌动蛋白作为控制组，结果显示于图 5。

表 4

引子 SEQ ID NO 序列（ 5，至 3， ) 神经滋养因子引子

SEQ ID NO: 1 gtgtgcgaca gcattagcca gtgg -顺向序列

神经滋养因子引子

SEQ ID NO: 2 cacatacatg aaactggtaa ttctcc

-反向序列

干细胞趋化因子引

SEQ ID NO: 3 atgaacgcca aggtcgtggt c 子-顺向序列

干细胞趋化因子引

SEQ ID NO: 4 tcatggacct ctttcgaaat ttgttc 子-反向序列

干细胞趋化因子接

受体引子-顺向序 SEQ ID NO: 5 ggccctcaag accacagtca 列

干细胞趋化因子接

受体引子-反向序 SEQ ID NO: 6 gaagttcaaa agtgaggtcg att 列介白素 -6引子-顺

SEQ ID NO : 7 tgccagcctg ctgacgaagc 向序列

介白素 -6引子-反

SEQ ID NO : 8 tctgtgccca gtggacaggt 向序列

介白素 -8引子-顺

SEQ ID NO : 9 gctggccgtg gctctcttgg 向序列

介白素 -8引子-反

SEQ ID NO : 10 tccacaaccc tctgcaccca 向序列

如图 5所示，脂肪干细胞在添加亚丁基苯酞（特别是在 20微克 /亳升的浓度下）并培养 12小时后，其神经滋养因子、干细胞趋化因子、及干细胞趋化因子接受体的基因表现量皆会增加。此外，添加亚丁基苯酞后，如介白素 -6 及介白素 -8 的免疫调节因子的表现量也会增加，显示亚丁基苯酞可增加细胞激素的基因表现量并调节免疫反应，从而维持神经新生。上述结果显示，并用亚丁基苯酞与脂肪干细胞可增加脂肪干细胞的神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及免疫调节因子的基因表现量，从而可抑制神经元的细胞凋亡及促进神经元增生。

[实施例 6】促进干细胞分泌神经滋养因子及干细胞趋化因子接受体的活体内试验于 SOD 1 -G93A基因转殖小鼠出生后第 60天开始每天口服投予亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide : 包含 Z-BP95%+E-BP5% ), 每天 1次，每次剂量 500亳克 /公斤体重，并同时于出生后第 60天以脑内注射人类脂肪干细胞（剂量为 2x l 0⁶个细胞 /30 微升磷酸缓冲液），另于出生后第 90天以静脉注射人类脂肪干细胞（剂量为 l x l O⁶ 个细胞 /150 亳升磷酸缓冲液）。于第 90 天以水合氯醛（ chloral hydrate ) 麻醉小鼠，牺牲取出脑部、脊髓组织进行免疫组织化学 ( immunohistochemistry , IHC ) 染色。以 4% 三聚甲醛 ( paraformaldehyde ) 固定所切下的脊髓和脑组织至隔天 ( overnight ) , 随后以莱卡恒冷器 ( Leica cryostat ) 在维持低温的 30%蔗醣中切出 10 微米的薄片。将自小鼠脊髓、脑皮质或海马回切下的薄片安置（ mounted ) 于明胶涂层的玻片上，以阻断缓冲液 ( blocking buffer ) 孵化处理（ incubate ) 后，于 4 °C下分别加入人类粒线体抗体 ( anti-human mitochondria , 购自 Abeam ) (可用于辨识所注射的人类脂肪干细胞）、人类神经滋养因子抗体 ( anti-human BDNF , 购自 GeneTex )、或人类干细胞趋化因子接受体抗体 ( anti-human CXCR4 , 购自 GeneTex ) 等一级抗体进行孵化处理隔夜。实验结果显示于图 6A、图 6B、及图 6C。

如图 6A所示，当投予 SOD 1 -G93A基因转殖小鼠亚丁基苯酞与人类脂肪干细胞的组合后，可于小鼠脊髓中检测到人类脂肪干细胞（图 6A中圆圈标示处），显示经脑内注射（或静脉注射）所施予的脂肪干细胞确实可从脑部（或静脉）迁移到脊髓，而发挥保护脊髓的运动神经的功效。此外，如图 6B 及图 6C 所示，当投予 SOD 1 -G93A 基因转殖小鼠亚丁基苯酞与人类脂肪干细胞的组合后，于小鼠脑部及脊髓中所检测到的人类神经滋养因子（图 6B 中圆圈标示处）及人类干细胞趋化因子接受体（图 6C中圆圈标示处）的表现量皆有显著的增加。

上述结果显示出，并用亚丁基苯酞与脂肪干细胞可增加脂肪干细胞的神经滋养因子及干细胞趋化因子接受体的蛋白质表现量，从而可用于抑制神经元的细胞凋亡并促进神经元增生。

以上实施例的结果显示，并用苯酞化合物及干细胞，可促进干细胞分泌端粒酶、神经滋养因子、干细胞趋化因子、干细胞趋化因子接受体、及 /或免疫调节因子（如：介白素 -6、介白素 -8 ) , 故可防止运动神经元凋亡、保护运动神经元、及 /或促进运动神经元增生，并可治疗运动神经元退化性疾病及 /或延缓其发病。

上述实施例仅是用以例示说明本发明的原理及功效，而非用于限制本发明。任何熟于此项技艺的人士均可在不违背本发明的技术原理及精神的情况下，对上述实施例进行修改及变化，但均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims

权利要求书

1、一种使用一苯酞化合物（ phthalide) 于制备用以促进干细胞分泌端粒酶（ telomerase )、神经滋养因子（ brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、干细胞趋化因子 ( stromal cell-derived factor- 1, SDFl )、干细胞趋化因子接受体（ CXC chemokine receptor 4, CXCR4)、免疫调节因子的至少一者的药剂中的用途。

2、根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：该苯酞化合物选自以下群组：亚丁基苯酞、亚丁基苯酞的结构类似物、亚丁基苯酞的结构类似物的医药可接受盐、亚丁基苯酞的结构类似物的医药可接受酯、以及前述各项的任意组合。

3、根据权利要求 2 所述的用途，其特征在于：该亚丁基苯酞的结构类似物为 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞（ 3-butylidene-4,5- dihydrophthalide , ligustilide )。

4、根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：该苯酞化合物为选自以下群组：式（ I) 化合物、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯、及前述各项的任意组合：

其中 ,

A为 C1-C5烃基，所述烃基视需要经一个或多个选自以下群组的取代基取代： -OH、 =0、及 C1-C3烃基；

X为 H、 -OH、 0=寺=0. 或

όΗ ΗΟ'Ϊ 或多个 -CH₂-为视需要经 -NH-或 -O-置换；以及

Y为 0或 S, 且可视需要与 A键结形成一五元环，其条件为当 Y与 A键结形成一五元环时，不存在。

5、根据权利要 H 求 4所述的用途，其特征在于： A为 C1-C5烷基或烯基，所述烷基或烯基为视需要经一个或多个选自下列群组的取代基取代： -OH、 =0、及 C1-C3 烷基；为 H, 或经取代或未经取代的 C1-C 10烃基，该烃基的一个或多个 -CH₂-为视需要经 -NH- 或 -0-置换。

6、根据权利要求 4所述的用途，其特征在于： A为

『

-、

亂

Rl为 H ^

、 Ηθθ^γ^Α v^c y、、

-CH.-CH-C00H i

7、根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：该

自以下群组：

)、

14)、

及前述各项的任意组合

8、根据权利要求 1 所述的用途，其特征在于：该苯酞化合物丁基苯酞。

9、根据权利要求 1 至 8 中任一项所述的用途，其特征在于：该干细胞为选自以下群组：胚胎干细胞、成体干细胞、诱导性多功能干细胞（ induced pluripotent stem cell )、及前述各项的任意组合。

10、根据权利要求 1 至 8中任一项所述的用途，其特征在于：该干细胞为选自以下群组：间叶干细胞（ mesenchymal stem cell )、造血干细胞（ hematopoietic stem cell )、及前述的组合。

1 1、根据权利要求 1至 8中任一项所述的用途，其特征在于：该干细胞为选自以下群组的间叶干细胞：骨髓干细胞、脐带血干细胞、胎盘干细胞、脂肪干细胞、口腔干细胞、嗅球干细胞、羊水干细胞、羊膜干细胞、脐带干细胞、脐带内膜干细胞、及前述各项的任意组合。

12、根据权利要求 1 至 8中任一项所述的用途，其特征在于：该干细胞为脂肪干细胞。

13、根据权利要求 1 至 8中任一项所述的用途，其特征在于：该药剂与一干细胞同时或分别投予至一个体，以防止运动神经元细胞凋零、保护运动神经元细胞、及 /或促进运动神经元细胞增生。

14、根据权利要求 1 至 8中任一项所述的用途，其特征在于：该药剂与一干细胞同时或分别投予至一个体，以治疗运动神经退化性疾病及 /或延缓该个体运动神经退化性疾病的发病。

15、根据权利要求 14所述的用途，其特征在于：该运动神经元退化性疾病为选自以下群组：肌萎缩侧索硬化症、重症肌无力、肌无力、肌肉萎缩、肌营养不良、多发性硬化症、多发性系统退化症、脊推性肌肉萎缩症、及前述各项的任意组合。

16、根据权利要求 14所述的用途，其特征在于：该运动神经化性疾病为肌萎缩侧索硬化症。

17、一种套组，其特征包含：

一第一组合物，包含一苯酞化合物（phthalide ); 以及

一第二组合物，包含一干细胞；

其中，该第一组合物与该第二组合物为供同时或分别投予至一

18、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该苯酞化合物为选自以下群组：亚丁基苯酞（ n-butylidenephthalide )、亚丁基苯酞的结构类似物、亚丁基苯酞的结构类似物的医药可接受盐、亚丁基苯酞的结构类似物的医药可接受酯、以及前述各项的任意组合。

19、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该亚丁基苯酞的结构类似物为 3-亚丁基 -4,5-二氢苯酞（ 3 -butylidene-4,5-

20、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该苯酞化合物为选自以下群组：式（ I ) 化合物、其医药可接受的盐、其医药可接受的酯、及前述的组合：

其中 ,

A为 C 1 -C5 烃基，所述 C 1 -C5 烃基视需要经一个或多个选自以下群组的取代基取代： -OH、 =0、及 C1-C3烃

X为 Η、 -0Η、或

Rl为 H, 或经取代或未经取代的 C1-C20烃基，该烃基的一个个 -CH₂-视需要经 -NH-或 -0-置换；以及

21、根据权利要求 20所述的套组，其特征在于： A为 C1-C5 烷基或烯基，所述烷基或烯基视需要经一个或多个选自下列群组的取代基取代： -OH、 =0、及 C1-C3烷基；

为 11, 或经取代或未经取代的 C1-C10烃基，该烃基 CH₂-视需要经 -NH-或 -0-置换。

22、根据权利要求 20所述的套组，其特征在于： A为

23、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该苯酞化合物为选自以下群组：

(2)、

(7)、

(9)、 (10)

及前述各项的任意组合。

24、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该苯酞化合

25、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该干细胞为选自以下群组：胚胎干细胞、成体干细胞、诱导性多功能干细胞

( induced pluripotent stem cell )、及前述各项的任意组合。

26、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该干细胞为选自以下群组：间叶干细胞（ mesenchymal stem cell )、造血干细胞

( hematopoietic stem cell )、及前述的组合。

27、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该干细胞为选自以下群组的间叶干细胞：骨髓干细胞、脐带血干细胞、胎盘干细胞、脂肪干细胞、口腔干细胞、嗅球干细胞、羊水干细胞、羊膜干细胞、脐带干细胞、脐带内膜干细胞、及前述各项的任意组合。

28、根据权利要求 17所述的套组，其特征在于：该干细胞为脂肪干细胞。

29、根据权利要求 17至 28中任一项所述的套组，其特征在于：更包含一第三组合物，该第三组合物包含一溶剂及 /或一溶液，且于使用时与该第一组合物及 /或该第二组合物混合，以提供一注射液。

30、根据权利要求 17至 28中任一项所述的套组，其特征在于：该第一组合物是呈供口服投药、鼻腔投药、皮质脊髓注射

( corticospinal tract injection )、鞘内注射 ( intrathecal injection )、脑内注射、静脉注射、腹腔注射、及 /或皮下注射的形式；该第二组合物是呈供皮质脊髓注射、鞘内注射、脑内注射、静脉注射、腹腔注射、及 /或皮下注射的形式。

3 1、一种使用一苯酞化合物（phthalide ) 的代谢前驱物于制备用以延缓运动神经元退化性疾病的发病及 /或治疗运动神经元退化性疾病的药剂的用途，其特征在于：该苯酞化合物的代谢前驱物为 3 -亚丁基 -4,5-二氢苯酞 ( 3 -butylidene-4,5-dihydrophthalide , ligustilide )。

32、根据权利要求 3 1 所述的用途，其特征在于：该运动神经元退化性疾病为选自以下的至少一者：肌萎缩侧索硬化症、重症肌无力、肌无力、肌肉萎缩、肌营养不良、多发性硬化症、多发性系统退化症、及脊推性肌肉萎缩症。

33、根据权利要求 3 1 所述的用途，其特征在于：该运动神经元退化性疾病为肌萎缩侧索硬化症。