TWI487521B - 苯酞化合物之應用 - Google Patents

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苯酞化合物之應用
本發明係關於苯酞化合物(phthalide)之應用，尤其關於使用苯酞化合物於促進幹細胞分泌端粒酶(telomerase)、神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、幹細胞趨化因子(stromal cell-derived factor-1，SDF1)、幹細胞趨化因子接受體(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)、及免疫調節因子之至少一者的應用，特別是用於治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病的應用。
神經元(neuron)亦可稱為神經細胞，是生物體神經系統的結構與功能單位之一，可藉由化學訊號及電訊號與其它細胞進行訊息傳遞，具有各種不同的形狀和尺寸，直徑為約4微米至約100微米，結構上大致可分為細胞本體、樹突(dendrite)、及軸突(axon)三部分，其中樹突可將訊息帶入細胞本體，而軸突則可將訊息自細胞本體傳出。
神經元依其訊息傳遞方向及功能可區分為三種：感覺神經元(sensory neuron)、運動神經元(motor neuron)、及連絡神經元(interneuron)，其中運動神經元是控制生物體活動的神經細胞。一般而言，存在腦中的運動神經元稱為上運動神經元，而 存在腦幹及脊髓中的運動神經元稱為下運動神經元。當運動神經元退化造成功能異常時，可能會引起肌萎縮側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、重症肌無力、肌無力、肌肉萎縮、肌營養不良(muscular dystrophy)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、多發性系統退化症(multiple system atrophy)、及/或脊椎性肌肉萎縮症(spinal muscular dystrophy)等運動神經元退化性疾病。患有上述運動神經元退化性疾病之患者，其身體會逐漸出現肌肉無力、萎縮、顫抖、痙攣、僵硬等症狀，並可能導致發音困難、吞嚥困難、呼吸衰竭等。
目前尚無法確定造成運動神經元退化性疾病的真正原因，研究指出，可能的病因包括：因超氧陰離子堆積而刺激自體吞噬作用過度表現所造成的神經元死亡、自體免疫異常、神經元過度興奮(例如，麩胺酸過度累積)、神經元過度氧化、以及遺傳等。目前臨床上用於治療運動神經元退化性疾病的藥物，包括麩氨酸拮抗劑如銳力得(Riluzole)、抗氧化劑如維他命E、神經滋養因子(neurotrophic factor)、以及免疫調節劑(immune modulators)等，然而，前述藥物對於疾病的治療多無明顯益處，或僅能有限地延長患者生命約3至6個月。
另外，研究發現，幹細胞可分化形成神經細胞，這為神經系統疾病如帕金森氏症(Parkinson's disease)、中風、腦損傷、及脊髓損傷等帶來了治療希望。舉例言之，研究發現幹細胞可藉由靜脈注射(即，靜脈移植)穿透血腦屏障(blood brain barrier)，從而減輕老化所引起的神經退化，且可修復並重建受損的腦血管，以維持腦神經的正常化與年輕化。此外，研究顯示， 幹細胞療法(stem cell therapy)已於多名患有腦萎縮合併阿茲海默症(Alzheimer's disease)的患者發揮顯著療效。然而，前述研究亦顯示，幹細胞治療對於運動神經元退化性疾病並無顯著的療效，或僅能提供相當有限的效果，例如：僅能使患有肌萎縮側索硬化症之小鼠的壽命延長至約140天(此可參見Garbuzova-Daviset al .,Human umbilical cord blood treatment in a mouse model of ALS：optimization of cell dose,2008，該文獻全文併於此處以供參考)。因此，目前臨床上仍需要一種可治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病的藥物。
本案發明人研究後發現，苯酞化合物(phthalide)可促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及/或免疫調節因子(如：介白素-6、介白素-8)，且合併使用苯酞化合物及幹細胞，可達到治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病的功效。
本發明之一目的，在於提供一種使用苯酞化合物(phthalide)於製備藥劑的用途，該藥劑係用以促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及免疫調節因子之至少一者。
本發明之另一目的，在於提供一種套組，其係包含：一第一組合物，包含一苯酞化合物；以及一第二組合物，包含一幹細胞；其中，該第一組合物及該第二組合物係供同時或分別投予至一個體。
本發明之又一目的，在於提供一種使用一苯酞化合 物之代謝前驅物於製備用以治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病之藥劑的用途，其中該苯酞化合物之代謝前驅物為3-亞丁基-4,5-二氫苯酞(3-butylidene-4,5-dihydrophthalide，ligustilide)。
本發明之詳細技術內容及部分實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
第1圖顯示亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide，n-BP)於生物體內的代謝，其中，第1A圖顯示亞丁基苯酞與人類肝臟微粒體混合反應之樣本之液相層析串聯質譜分析的質圖譜，第1B圖顯示亞丁基苯酞於生物體中進行第一階代謝之代謝圖譜，第1C圖顯示亞丁基苯酞於生物體中進行第二階代謝之代謝圖譜；第2圖顯示對SOD1 G93A基因轉殖小鼠進行不同投藥處理的小鼠存活曲線圖；第3圖顯示對SOD1 G93A基因轉殖小鼠進行不同投藥處理的小鼠BBB評分曲線圖；第4圖顯示幹細胞以不同成分處理後之端粒酶表現量的長條線圖；第5圖顯示幹細胞以不同成分處理後之BDNF、SDF1、CXCR4、IL-6、及IL-8基因表現量的電泳圖；以及第6圖顯示SOD1 G93A基因轉殖小鼠經亞丁基苯酞結合幹細胞治療之蛋白質表現量，其中，第6A圖顯示以人類粒線體抗體進行 免疫組織化學染色的照片，第6B圖顯示以人類神經滋養因子抗體進行免疫組織化學染色的照片，第6C圖顯示以人類幹細胞趨化因子接受體抗體進行免疫組織化學染色的照片。
以下將具體地描述根據本發明之部分實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所陳述者。此外，除非文中有另外說明，於本說明書中(尤其是在後述專利申請範圍中)所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「有效量」，係指投予至個體時，可有效至少部分改善懷疑個體之狀況的化合物用量；所謂「個體」係指哺乳動物，哺乳動物可為人類或非人動物；所謂「毫克/公斤體重」係指個體每公斤體重所須的劑量(毫克)；所謂「烴基」係包含飽和烴基及具一或多個不飽和鍵之不飽和烴基；所謂「幹細胞療法」係指以任何投藥方式投予一個體一幹細胞的治療方法。
端粒(Telomere)為位於染色絲末端的重複序列，已知端粒的長度可決定細胞的壽命。端粒酶(Telomerase)係一反轉錄酶，其可延長端粒的長度，對於調節細胞生長、維繫細胞恆定性以及抑制細胞凋亡(apoptosis)皆扮演重要的角色。如上所述，先前的研究顯示，幹細胞療法對於治療運動神經元退化性疾病並不具有顯著的療效，這可能是因為投予至患者體內之幹細胞的生命週期較短所致。因此，若能延長幹細胞之生命週期(例如，提高幹細胞之端粒酶活性)，可望能夠提升幹細胞於治療運動神經元退化性疾病的療效。
此外，於幹細胞療法中，已知幹細胞所分泌之神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、幹細胞趨化因子(stromal cell-derived factor-1，SDF1)、及幹細胞趨化因子接受體具有抑制運動神經元之細胞凋亡及促進運動神經元增生之功效，故可用於保護運動神經元，抑制運動神經元之細胞凋亡及促進運動神經元增生(BDNF與SDF1對神經元的影響可參見Park,D.et al .,Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve cognitive function and physical activity in ageing mice.J Neurosci Res,2013，該文獻全文併於此處以供參考)。另一方面，已知幹細胞所分泌之免疫調節因子，例如介白素-6及介白素-8，可藉由調節免疫反應而維持神經細胞新生(關於經由調節免疫反應而維持神經細胞新生的研究可參見Kohman,R.A.et al .,“Neurogenesis,inflammation and behavior.Brain Behav Immun,2013.27(1)：p.22-32，該文獻全文併於此處以供參考)。因此，若可增加幹細胞之神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及/或免疫調節因子(如：介白素-6、介白素-8)的表現量，則可提升幹細胞療法對於運動神經元退化性疾病的療效。
本案發明人發現，苯酞化合物(phthalide)可促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及/或免疫調節因子(如：介白素-6、及/或介白素-8)。
因此，本發明提供一種使用一苯酞化合物於製備用以促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及免疫調節因子(如：介白素-6、介白素-8) 之至少一者之藥劑的用途。當將該藥物投予至一經幹細胞療法治療之個體(即，經投予一幹細胞之個體)、或一將進行幹細胞療法治療之個體(即，將投予一幹細胞之個體時)時，因該苯酞化合物可促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及/或免疫調節因子，故可延長幹細胞的生命週期、抑制運動神經元之細胞凋亡及/或促進運動神經元增生，且可治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病。
於本發明一實施態樣中，所使用之苯酞化合物係選自以下群組之至少一者：式(I)化合物、式(I)化合物之醫藥可接受之鹽、式(I)化合物之醫藥可接受之酯、及前述之組合： 其中，A係C1-C5烴基，其視需要經一或多個選自以下群組之取 代基取代：-OH、=O、及C1-C3烴基；X係H、-OH、或； R1 係H或經取代或未經取代的C1-C20烴基，該烴基之一或多個-CH2 -係視需要經-NH-或-O-置換；以及Y係O或S，且可視需要與A鍵結形成一五員環，其條件為當Y與A鍵結形成一五員環時，R1 不存在。
較佳地，於式(I)中，A係一C1-C5烷基或烯基，其係視需要經一或多個選自以下群組之取代基取代：-OH、=O、及C1-C3烷基；R1 (若存在)係H或經取代或未經取代的C1-C10 烴基，該烴基之一或多個-CH2 -係視需要經-NH-或-O-置換。較佳地，於式(I)中，A係具如下結構： 或；R1 (若存 在)係H、或。
更佳地，於本發明用途所使用作為苯酞化合物之式(I)化合物，係選自以下化合物(1)至(14)、其醫藥可接受之鹽、其醫藥可接受之酯、及前述之組合： 、以及， 其中，化合物(10)中的Cys係指半胱胺酸(cysteine)；化合物(11)中之Glutathione係指麩胺基硫。
本案發明人研究發現，亞丁基苯酞於生物體內可有效促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及/或免疫調節因子。於上述化合物(1)至(14)中，化合物(1)即亞丁基苯酞，化合物(2)至(14)則為亞丁基苯酞的代謝物，即，亞丁基苯酞透過生物體內的第一階(phase I)代謝作用或第二階(phase II)代謝作用所產生的化合物，詳如後附實施例說明。咸信化合物於生物體內所提供之醫藥活性，可能來自該化合物的代謝物。因此，較佳係於本發明使用上述化合物(1)至(14)、其醫藥可接受之鹽、其醫藥可接受之酯、及前述之組合。
除了式(I)化合物以外，於本發明所使用之苯酞化 合物，亦可為亞丁基苯酞之其他結構類似物、其醫藥可接受之鹽、其醫藥可接受之酯，或前述之組合。
於本文中，所謂「醫藥可接受之鹽」，係包括所述含有酸官能基之化合物與有機或無機鹼所形成之醫藥可接受之鹽。其中，與無機鹼所形成之鹽之例子包括，但不限於，鹼金屬鹽(如鈉鹽、鉀鹽)、鹼土金屬鹽(如鈣鹽、鎂鹽)、過渡金屬鹽(如鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、錳鹽及鋁鹽)、以及銨鹽；與有機鹼所產生之鹽之例子包括與甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、乙基胺、二乙基胺、三乙基胺、異丙基胺、三丙基胺、三丁基胺、乙醇胺、二乙醇胺、2-二甲基胺乙醇、2-二乙基胺乙醇、二環己基胺、離胺酸鹽、精胺酸鹽、組胺酸鹽、咖啡鹼、海巴胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、乙烯二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、嘌呤、哌啶、N-乙基哌啶、四甲基銨化合物、四乙基銨化合物、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎啉、二環己基胺、二苯甲基胺、N,N-二苯甲基苯乙基胺、1-伊芬胺(1-ephenamine)、N,N&apos；-二苯甲基乙烯二胺、聚胺樹脂及其類似物等所形成之鹽。
所謂「醫藥可接受之酯」，係包括所述含有如-OH官能基之化合物與酸反應所得之酯。該酸可為無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磺胺酸、硝酸、及磷酸之無機酸，和有機酸例如醋酸、三氟醋酸、己二酸、抗壞血酸、天門冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、丁酸、樟腦酸(camphoric acid)、樟腦磺酸(camphorsulfonic acid)、肉桂酸、檸檬酸、二葡萄糖酸、乙烷磺酸、麩胺酸、甘醇酸、甘油磷酸、半硫酸(hemisulfic acid)、己醇酸、甲酸、2-羥基 乙磺酸(isethionic acid)、乳酸、羥基馬來酸、蘋果酸、丙二酸、扁桃酸、三甲基苯磺酸(mesitylenesulfonic acid)、甲磺酸、萘磺酸(naphthalenesulfonic acid)、菸鹼酸、2-萘磺酸、草酸、哌酸、果膠酯酸、苯基醋酸、3-苯丙酸、特戊酸、丙酸、丙酮酸、水楊酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、酒石酸、對-甲苯磺酸、十一烷酸等。
所謂「亞丁基苯酞之結構類似物」係指一與亞丁基苯酞不同、但其部份或全部化學結構、電子分佈、及/或醫藥特性與亞丁基苯酞之部份或全部相似的化合物。亞丁基苯酞之結構類似物的例子，除式(I)化合物以外，包括但不限於亞丁基苯酞之代謝前驅物、亞丁基苯酞及其代謝前驅物的異構物、以及前述之醫藥可接受的鹽及酯。所謂「亞丁基苯酞之代謝前驅物」係指一經生物體代謝後會產生亞丁基苯酞的化合物。亞丁基苯酞之結構類似物的特定例子如：3-亞丁基-4,5-二氫苯酞(3-butylidene-4,5-dihydrophthalide，ligustilide)及3-丁基-3a,4,5,7a-四氫-1(3H)-異苯并呋喃酮(3-butyl-3a,4,5,7a-tetrahydro-1(3H)-isobenzofuranone，cnidilide)。
於本發明之部分實施態樣中，所使用之苯酞化合物係3-亞丁基-4,5-二氫苯酞。
於本發明用途中，所使用之幹細胞可為任何適宜用於幹細胞療法的幹細胞，例如但不限於選自以下群組之一者：胚胎幹細胞、成體幹細胞(例如，間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)、造血幹細胞(hematopoietic stem cell))、誘導性多功能幹細胞(induced pluripotent stem cell，iPSc)、及前述之組合。其中， 該間葉幹細胞之例子包括，但不限於骨髓幹細胞(bone marrow stem cell)、臍帶血幹細胞(umbilical cord blood stem cell)、胎盤幹細胞(placenta stem cell)、脂肪幹細胞(adipose stem cell，ADSC)、口腔幹細胞(oral stem cell)、嗅球幹細胞(olfactory bulbs stem cell)、羊水幹細胞(amniotic fluid stem cell)、羊膜幹細胞(amniotic stem cell)、臍帶幹細胞(umbilical cord stem cell)、及臍帶內膜幹細胞(umbilical cord lining stem cell)。於本發明部分實施態樣中，所使用之幹細胞為脂肪幹細胞。
如上所述，於本發明之用途中，所提供之藥劑係具有促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及/或免疫調節因子(例如：介白素-6、介白素-8)之功效，故可用於防止運動神經元凋亡、保護運動神經元、及/或促進運動神經元增生，且可用於治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病。
於本發明部分實施態樣中，所提供之藥劑係用以治療脊髓運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病。該運動神經元退化性疾病係包含任何與運動神經退化相關的疾病，包括但不限於肌萎縮側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、重症肌無力(myasthenia gravis)、肌無力(gravis)、肌肉萎縮(muscular atrophy)、肌營養不良(muscular dystrophy)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、多發性系統退化症(multiple system atrophy)、以及脊椎性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy)等。
根據本發明之一具體實施態樣，該藥劑係用於治療肌萎縮側索硬化症。肌萎縮側索硬化症又稱漸凍人症，患者會出 現漸進性的肌肉萎縮，通常在發病後2至5年會造成患者四肢癱瘓(quadriplegia)、吞嚥困難、甚至呼吸衰竭。研究指出，肌萎縮側索硬化症可能與神經元過度興奮(例如，麩胺酸(glutamates)過度累積)有關，因此目前臨床上主要使用麩氨酸拮抗劑，例如銳力得(Riluzole)，來治療肌萎縮側索硬化症，以延長病患的存活率。相較於以銳力得進行治療，本發明所提供之藥劑可更有效地延緩肌萎縮側索硬化症患者之發病、提高患者的存活率。
於本發明中，所提供之藥劑可呈任何形式，並以任何合宜之方式施用。舉例言之，但不以此為限，可經由口服、鼻腔給藥、皮質脊髓注射(corticospinal tract injection)、鞘內注射(intrathecal injection)、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及/或皮下注射等方式施用至一需要的個體。其中，由於口服投藥劑型便於病人按時自行服用，故於本發明之一較佳實施態樣中，係以口服劑型提供該藥劑，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑、懸液劑、乳劑、及酊劑等。視使用形式及用途而定，該藥劑可更包含一醫藥可接受的載劑。
以製備適於口服投藥之劑型為例，該藥劑中可含有任何不會不利影響所含活性成分(即，該苯酞化合物)之活性的醫藥可接受載劑，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。可利用任何合宜之方法，將該組合物製成適於口服投藥的劑型。
至於製備適於脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、或皮下注射之劑型，該藥劑可例如包含一或多種等張溶 液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、助溶劑(solubilizer)、乳化劑、以及其他載劑等成分，以製成一靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等。
除了上述佐劑外，該藥劑可視需要另含有調味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加合宜用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善藥劑的儲存性。此外，視需要地，可於本發明所提供之藥劑中併含一或多種其他活性成分，例如抗氧化劑(如維他命E)、神經滋養因子(neurotrophic factor)、免疫調節劑(immune modulators)等，以進一步加強本發明藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對所使用之苯酞化合物之所欲功效沒有不利的影響即可。
為使本發明所提供之藥劑可於一個體中發揮促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及/或免疫調節因子(如：介白素-6、介白素-8)之功效，可以於將幹細胞施用至一個體之前、之後或同時投予至該個體中，以改良幹細胞療法。於前述幹細胞療法中，該幹細胞之用量，較佳係每次投予約1x102 至約1x1015 個幹細胞/施打部位，更佳係每次投予約1x105 至約1x108 個幹細胞/施打部位。惟，對於急性患者而言，幹細胞之用量可視實際需要而酌增，例如增加至數倍或數十倍。此外，可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同投藥頻率施用該藥劑，端視投予個體之需求而異。舉例言之，當使用於人體以治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病 時，該藥劑之用量，以苯酞化合物計，較佳為每日投予約100至約1,000毫克/公斤體重的劑量，更佳為每日投予約250至約800毫克/公斤體重的劑量。
本發明另提供一種套組，其係包含：一第一組合物，包含一苯酞化合物；以及一第二組合物，包含一幹細胞；其中，該第一組合物與該第二組合物係供同時或分別投予至一個體。此外，於使用本發明套組時，可視需要以相同或不同的投藥頻率施用該第一組合物及該第二組合物，例如一日一次、一日多次、或數日一次等。本發明套組中所含之該苯酞化合物及該幹細胞的性質、特徵及較佳實施態樣皆如本文所描述。
本發明套組可用於促進幹細胞分泌以下之至少一者：端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及免疫調節因子(如：介白素-6、介白素-8)。因此，該套組可用於防止運動神經元凋亡、保護運動神經元、及/或促進運動神經元增生，且可用於治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病。較佳地，本發明之套組係用於治療脊髓運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病。該運動神經元退化性疾病，係包含任何與運動神經退化相關的疾病，包括但不限於肌萎縮側索硬化症、重症肌無力、肌無力、肌肉萎縮、肌營養不良、多發性硬化症、多發性系統退化症、脊椎性肌肉萎縮症等。根據本發明之一實施態樣，該套組係用於治療肌萎縮側索硬化症。
於本發明套組中，該第一組合物及第二組合物較佳係置於不同包裝中，例如分別置於不同的塑膠袋、塑膠瓶、玻璃瓶、安瓿(ampoule)、紙盒或塑膠盒中，且各該包裝可彼此相連 或分離。此外，該第一組合物與該第二組合物可分別呈任何適於投藥之相同或不同形式。舉例言之，但不以此為限，該第一組合物與該第二組合物可各自獨立經由口服、鼻腔給藥、皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及/或皮下注射等方式施用至需要的個體。於根據本發明之部分實施態樣，該第一組合物係呈口服劑型(如：錠劑)，該第二組合物則呈可經由腦內注射或靜脈注射之置於玻璃瓶之注射劑型。
視使用形式及用途而定，該第一組合物及第二組合物可分另包含任何醫藥可接受的載劑、佐劑、添加劑，以呈所欲之投藥形式，只要該等載劑、佐劑、添加劑對於該苯酞化合物及/或幹細胞之所欲功效沒有不利的影響即可。
以製備適於口服投藥之劑型為例，該第一組合物及該第二組合物可各自含有任何不會不利影響所含活性成分(即，該苯酞化合物或幹細胞)之活性的醫藥可接受載劑，例如：溶劑、油性溶劑、稀釋劑、安定劑、吸收延遲劑、崩散劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、潤滑劑、吸濕劑等。可利用任何合宜之方法，將該第一組合物及/或該第二組合物製成適於口服投藥的劑型，例如：錠劑、膠囊劑、顆粒劑、散劑、流浸膏劑、溶液劑、糖漿劑j、懸液劑、乳劑、及酊劑等等。
至於製備適於脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、或皮下注射之劑型，該第一組合物及該第二組合物可各自例如包含一或多種等張溶液、鹽類緩衝液(如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液)、助溶劑(solubilizer)、乳化劑、以及其他載劑等成分，以製成一靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、 懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等。
除了上述佐劑外，該第一組合物及/或第二組合物可視需要另含有調味劑、調色劑、著色劑等添加劑，以提高所得藥劑服用時的口適感及視覺感受；另可添加合宜用量之保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等，以改善藥劑的儲存性。此外，視需要地，可於本發明套組之第一組合物及/或第二組合物中併含一或多種其他活性成分，以進一步加強本發明藥劑之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對所使用之苯酞化合物及/或幹細胞之所欲功效沒有不利的影響即可。
此外，可視實際使用需求，調整本發明套組中該第一組合物以及第二組合物的施用劑量為適於單次或多次使用。因此，可視需要於本發明套組中另外包含一使用說明書，以說明該第一組合物以及第二組合物之使用方式。舉例言之，當施用本發明套組於人體以治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病時，該第一組合物之用量，以該苯酞化合物計，較佳為每日約100至約1,000毫克/公斤體重，更佳為每日約250至約800毫克/公斤體重；該第二組合物之用量，以該幹細胞計，較佳為1x102 至約1x1015 個細胞/施打部位，更佳為1x105 至約1x108 個細胞/施打部位。然而對於急性患者而言，該用量可視實際需要增加至數倍或數十倍。根據本發明之一治療肌萎縮側索硬化症的實施例中，該苯酞化合物係亞丁基苯酞，其施用劑量為每天約500毫克/公斤體重；而該幹細胞係脂肪幹細胞，其腦內注射之劑量為每次約2x106 個細胞，而靜脈注射之劑量為每次約1x106 個細胞。
本發明套組可更包含一第三組合物，該第三組合物 係包含一溶劑及/或一溶液，較佳係置於與該第一組合物及該二組合物不同之包裝(例如，塑膠袋、塑膠瓶、玻璃瓶或安瓿)中，可於使用時與該第一組合物及/或該第二組合物混合，以提供一注射液。適用於第三組合物之溶劑，包括但不限於極性溶劑，例如水、二甲基亞碸(DMSO)、及乙醇等；適用於第三組合物之溶液，包括但不限於鹽類緩衝液、以及任何用於提供注射劑型之合宜注射液。鹽類緩衝液的例子，包括但不限於磷酸緩衝液(PBS)、檸檬酸鹽緩衝液、及生理食鹽水等。於本發明之一實施態樣中，係於投藥前將第二組合物(包含一幹細胞)與第三組合物(包含一磷酸緩衝液)混合，以提供供注射之劑型。
此外，本案發明人研究後發現，苯酞化合物之代謝前驅物本身亦具有治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病之功效，其功效不僅優於單獨使用亞丁基苯酞，亦較合併使用亞丁基苯酞與幹細胞為佳。因此，本發明亦提供一種使用一苯酞化合物之代謝前驅物於製備用以治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病之藥劑的用途，其中該苯酞化合物之代謝前驅物為3-亞丁基-4,5-二氫苯酞。
根據本發明，使用苯酞化合物之代謝前驅物所提供之藥劑，可例如用於治療以下疾病或延緩其發病：肌萎縮側索硬化症、重症肌無力、肌無力、肌肉萎縮、肌營養不良、多發性硬化症、多發性系統退化症、脊椎性肌肉萎縮症、及前述之組合，且尤其可用於治療肌萎縮側索硬化症及/或延緩其發病。其中，該藥劑的劑型、投藥方式、及用量等皆如前述所述。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等 實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
[實施例]
[實施例1]亞丁基苯酞的代謝物
已知藥物在生物體肝臟內的藥物代謝途徑主要可區分為第一階(phase I)代謝及第二階(phase II)代謝二類，第一階代謝主要為藥物之氧化還原反應或水解反應，第二階代謝則主要由細胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450(CYP 450)monoxygenase)系統進行代謝反應。本實施例分別藉由在體外(in vitro )將亞丁基苯酞與肝臟微粒體(microsomes)或經冷凍保存之肝臟細胞(cryopreserved hepatocytes)混合反應，以模擬亞丁基苯酞於生物體肝臟內所進行之第一階代謝及第二階代謝，並以液相層析串聯質譜儀(LC-MS/MS)分析反應後溶液中的產物，以確認亞丁基苯酞之代謝產物及代謝圖譜(profile)。
(1)第一階代謝試驗
分別將2微莫耳濃度之亞丁基苯酞與含有人類、大鼠、或狗之肝臟微粒體(0.5毫克/毫升)之磷酸鉀緩衝液(100毫莫耳濃度，pH 7.4)混合，於37℃下反應10分鐘後，添加經預熱的輔因子(包含2毫莫耳濃度菸鹼醯胺腺嘌呤二核甘酸磷酯(NADPH)及3毫莫耳濃度氯化鎂)，於37℃下反應60分鐘，接著添加三倍體積之含有0.1%甲酸的乙腈以終止反應。將樣本以13,000轉/分鐘之轉速離心5分鐘，取上清液進行液相層析串聯質譜儀分析，以分析代謝物。
(2)第二階代謝試驗
分別將含有5 x 105 個人類、大鼠、或狗之解凍後的肝臟細胞的威廉姆斯E培養液(William’s E medium)添加至12孔培養盤中培養6小時，添加0.5毫升亞丁基苯酞(50微莫耳濃度)至培養盤中，並於37℃、95%相對溼度、及5% CO2 下培養6小時後，添加2毫升100%乙腈以終止反應，收集樣本並充分混合，於4℃下以45,000g離心10分鐘後，取收集上清液進行乾燥，接著進行液相層析串聯質譜儀分析，以分析代謝物。
(3)液相層析串聯質譜儀分析
分別將由(1)和(2)獲得的樣本溶於含有0.1%甲酸之乙腈溶液中，於4℃下以45,000g離心10分鐘，並將樣本取至自動取樣瓶(autosampler vials，Agilent公司，美國)進行分析。該液相層析質譜儀系統包含具有1200SL HPLC系統(Agilent公司，美國)的ABSCIEX 5500 Q TRAPTM 系統、高效液相層析儀(HPLC)、一管柱(Symmetry® C18，3.5微莫耳濃度，4.6 x 75毫米)、及一自動取樣機(Agilent公司，美國)，以正離子電灑模式，於5.5千伏特、550℃下以氮氣作為輔助氣體進行質譜分析。使用雙溶劑(溶劑A：0.1%甲酸；溶劑B：含0.1%甲酸之甲醇)系統以0.8毫升/分鐘定速進行高效液相層析。高效液相層析儀的梯度系統設定為0至2分鐘：10%溶劑B；2至7分鐘：10%溶劑B至95%溶劑B；7至12分鐘：95%溶劑B；12至14分鐘：95%溶劑B至10%溶劑B；14至20分鐘：10%溶劑B；實驗全長為20分鐘。將20微升等分試樣(aliquots)注入液相層析串聯質譜儀系統進行分析。接著，透過LightSightTM 軟體分析液相層析串聯質譜圖之主要訊號峰及各個訊號峰相較於亞丁基苯酞之質譜圖所示之 質量偏移(mass shift)，以分析樣品中所含代謝物，並測定亞丁基苯酞於生物體中的生物轉化路徑及其代謝圖譜，結果如表1、表2、第1A圖、第1B圖及第1C圖所示。
第1A圖顯示亞丁基苯酞(質譜儀分析之m/z為189.1)與人類肝臟微粒體混合反應後，樣本進行質譜儀分析後的片段產物圖譜，顯示m/z為171.2 amu、153.1 amu、143.0 amu、128.0 amu、及115.0 amu等主要訊號峰；第1B圖顯示亞丁基苯酞與肝臟微粒體混合反應後所形成之代謝圖譜及化合物(2)至(9)之化學結構；第1C圖所示為亞丁基苯酞與冷凍保存之肝臟細胞混合反應後，所形成之代謝圖譜及化合物(11)至(14)之化學結構。
下表1顯示亞丁基苯酞與肝臟微粒體混合反應(即，第一階代謝)後之代謝產物的種類與利用軟體分析所得的生物轉化路徑，結果顯示亞丁基苯酞在與大鼠、狗、及人類之肝臟微粒體混合反應後，皆可反應形成本發明化合物(2)至(9)，顯示亞丁基苯酞在不同生物體中經肝臟代謝後皆會產生相似的代謝物。
下表2顯示亞丁基苯酞與冷凍保存之肝臟細胞混合反應(即，第二階代謝)後之代謝產物的種類與利用軟體分析所得的生物轉化路徑，結果顯示，亞丁基苯酞在與大鼠、狗、及人類之冷凍保存之肝臟細胞混合反應後，可反應形成本發明化合物(11)至(14)，顯示亞丁基苯酞在不同生物體中經肝臟代謝後會產生相似的代謝物。
[實施例2]基因轉殖小鼠存活率之活體內試驗
已知肌萎縮側索硬化症之病患中，約有20%會發生銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)的基因突變，其中以G93A突變位點最多，利用基因轉殖技術轉入經突變的人類SOD1-G93A的基因轉殖小鼠(於此稱『SOD1-G93A基因轉殖小鼠』)，因具有與人相似的發病特點，而可作為臨床上用於研究肌萎縮側索硬化症的動物模型，此SOD1-G93A基因轉殖小鼠會於出生後約第90±5天開始發病，於出生後約第125±5天死亡。
本實施例即採用上述SOD1-G93A基因轉殖小鼠作為研究對象，進行活體內(in vivo )試驗，實驗分為以下五組：(A)控制組(未投藥)；(B)銳力得實驗組：在SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天開始定時腹腔注射銳力得，每天1次，劑量為16毫克/公斤體重；(C)亞丁基苯酞實驗組(n-BP)：在SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天開始定時口服投予亞丁基苯酞(購自景明化工)，每天1次，每次劑量500毫克/公斤體重；(D)Ligustilide(3-亞丁基-4,5-二氫苯酞，即，亞丁基苯酞之代 謝前驅物，購自Pharmaron)實驗組：在SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天開始定時口服投予Ligustilide，每天1次，每次劑量500毫克/公斤體重；(E)脂肪幹細胞+亞丁基苯酞(ADSC+n-BP)實驗組：於SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天以腦內注射人類脂肪幹細胞(劑量為2 x 106 個細胞/30微升磷酸緩衝液)，於出生後第90天以靜脈注射脂肪幹細胞(劑量為1 x 106 個細胞/150微升磷酸緩衝液)，並同時於出生後第60天開始定時口服投予亞丁基苯酞，每天1次，每次劑量500毫克/公斤體重。於第30天給藥後開始觀察併用脂肪幹細胞及亞丁基苯酞是否可延長SOD1-G93A基因轉殖小鼠的存活天數(即，存活超過125天)，結果顯示於第2圖及表3。
如第2圖及表3所示，相較於控制組之SOD1-G93A基因轉殖小鼠(平均存活約127±5.0天)，銳力得實驗組之SOD1-G93A基因轉殖小鼠(平均約存活133.3±6.8天)的壽命僅 延長約6.3±1.8天；亞丁基苯酞實驗組之SOD1-G93A基因轉殖小鼠(平均約存活148.3±2.9天)的壽命則可延長約21.3±2.1天；Ligustilide實驗組之SOD1-G93A基因轉殖小鼠(平均約存活201.5±5.1天)的壽命可延長約74.5±0.1天；脂肪幹細胞+亞丁基苯酞實驗組之SOD1-G93A基因轉殖小鼠(平均約存活184.5±10.2天)的壽命可延長達約57.5±5.2天。
上述結果顯示，相較於使用銳力得或單獨使用亞丁基苯酞，本發明結合亞丁基苯酞和脂肪幹細胞能更有效地提高患有肌萎縮側索硬化之小鼠的存活率。此外，Ligustilide(即，亞丁基苯酞之代謝前驅物)之單獨使用，所提供之提高患有肌萎縮側索硬化之小鼠的存活率，不僅遠高於單獨使用亞丁基苯酞，亦高於合併使用亞丁基苯酞和幹細胞。
[實施例3]萎縮側索硬化症之活體內試驗
此實施例使用SOD1-G93A基因轉殖小鼠作為活體內試驗的對象。將60天大之SOD1-G93A基因轉殖小鼠隨機性分為以下五組：(A)控制組(未投藥)；(B)銳力得實驗組：在SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天開始定時腹腔注射銳力得，每天1次，每次劑量16毫克/公斤體重；(C)亞丁基苯酞實驗組(n-BP)：在SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天開始定時口服投予亞丁基苯酞，每天1次，每次劑量500毫克/公斤體重；(D)Ligustilide實驗組：在SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天開始定時口服投予Ligustilide，每天1次，每次劑量500毫克/公斤體重；(E)脂肪幹細胞+亞丁基苯酞實驗組(ADSC+n-BP)：於SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天以腦內注射人類脂肪 幹細胞(劑量為2 x 106 個細胞/30微升磷酸緩衝液)，於出生後第90天進行靜脈注射脂肪幹細胞(劑量為1 x 106 個細胞/150微升磷酸緩衝液)，並同時於出生後第60天開始定時口服投予亞丁基苯酞，每天1次，每次劑量500毫克/公斤體重。
於投藥後第30天開始，利用神經行為學評分法(BBB評分；Basso,Beattie,and Bresnahan(BBB)Locomotor Rating Scale)觀察小鼠後肢，其中正常小鼠後肢評分為21分；發病之SOD1-G93A基因轉殖小鼠的後肢評分會從21分開始往下降至0分，評分愈低顯示小鼠運動功能愈異常，以此BBB評分表來記錄投藥的療效。結果顯示於第3圖。
如第3圖所示，在未投藥的控制組小鼠中，小鼠的BBB評分大約在出生第110天後，即開始急遽下降(由19分降至0分)；在銳力得實驗組小鼠中，小鼠的BBB評分大約在第90天至125天之間開始緩慢下降(由21分降至16分)，在約第125天後，開始急遽下降(由16分降至0分)；在亞丁基苯酞實驗組小鼠中，小鼠的BBB評分大約在第125天至第135天之間開始緩慢下降(由21分降至16分)，在約第135天後，開始急遽下降(由16分降至0分)；在Ligustilide實驗組小鼠中，小鼠的BBB評分大約在第130天至第170天之間開始緩慢下降(由21分降至18分)，在約第170天後，開始急遽下降(由18分降至0分)；在脂肪幹細胞+亞丁基苯酞實驗組小鼠中，小鼠的BBB評分大約在第150天至第190天之間才開始緩慢下降(由21分降至0分)。
上述結果顯示，相較於使用銳力得或單獨使用亞丁基苯酞，本發明結合亞丁基苯酞與脂肪幹細胞能更有效地延緩肌 萎縮側索硬化症的發病。此外，Ligustilide亦可有效地延長肌萎縮側索硬化症小鼠的發病，且其效果不僅優於單獨使用亞丁基苯酞，亦較合併使用亞丁基苯酞與幹細胞為佳。
[實施例4]促進幹細胞分泌端粒酶之體外實驗
以如下步驟自人體脂肪組織分離中分離脂肪幹細胞。首先，以磷酸鹽緩衝液清洗人體脂肪組織(取自臨床研究)，以眼科剪將脂肪組織剪碎。接著，加入0.075%第一型膠原酶(collagenase type I)(Sigma-Aldrich Co.，St.Louis，MO，USA)，在37℃水浴搖床消化30至60分鐘後，添加含有10%胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的DMEM/F-12培養液(Invitrogen)終止消化。以100微米的耐綸網孔過濾該經消化的脂肪組織細胞，以移除細胞殘留物。將所得細胞懸浮液離心10分鐘，以獲得一沉澱物，在37℃、5%CO2 下將沉澱物培養於DMEM/F-12培養液中(含有10%胎牛血清、100活性單位/毫升青黴素、及100毫克/毫升鏈黴素)。接著，以磷酸緩衝液清洗所培養的細胞，以移除殘留未貼附的紅血球。將所得細胞(即，含有脂肪幹細胞的間質血管細胞群(stromal vascular fraction，SVF))於37℃、5% CO2 下培養於含有10%胎牛血清的DMEM/F-12培養液中。將貼附的細胞維持在培養液中，每兩天更換培養液，直到細胞佔滿生長平面空間達80%(80% confluence)，再於37℃下以0.25%的胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)消化細胞，離心後再重新懸浮於DMEM/F-12培養液中。接著，使細胞懸浮液貼附在新的三角培養瓶中並維持培養，經過三次繼代後，以所得人類脂肪幹細胞進行以下試驗。
將脂肪幹細胞培養於10公分培養皿，分別添加不同濃度之丙戊酸鈉(Valproic acid，VPA)(1微莫耳濃度或10微莫耳濃度)或亞丁基苯酞(100微莫耳濃度或250微莫耳濃度)，培養24小時，再利用端粒酶反轉錄酶聚合反應免疫酵素測定套件(telomerase PCR ELISA kit，Cat.No.11854666910，Roche公司)來分析端粒酶的表現量。於本實驗中，ADSC組別為未經亞丁基苯酞處理之組別；正控制組為套件所附之高表現端粒酶樣品(reconstitute lyophilized cell extract)；負控制組為套件所附之高表現端粒酶樣品於85℃下加熱10分鐘，使蛋白質失活之樣品。此外，先前研究顯示VPA可用於增加脂肪幹細胞端粒酶的活性，因此本實驗中使用VPA作為對照組。結果顯示於第4圖。
如第4圖所示，以亞丁基苯酞(100微莫耳濃度或250微莫耳濃度)處理脂肪幹細胞，可有效提升脂肪幹細胞中端粒酶的活性(即，可提高脂肪幹細胞中端粒酶的表現量)，顯示亞丁基苯酞可經由提升脂肪幹細胞之端粒酶活性而延長脂肪幹細胞生命週期。
[實施例5]促進幹細胞分泌神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及免疫調節因子的體外實驗
在37℃下以6孔盤培養人類脂肪幹細胞(2×105 個脂肪幹細胞/每孔)至隔天，加入不同濃度之亞丁基苯酞(10微克/毫升、20微克/毫升、或50微克/毫升)培養12小時後，利用專一性引子進行反轉錄脢-聚合脢連鎖反應(RT-PCR)分別檢測神經滋養因子(BDNF)、幹細胞趨化因子(SDF1)、幹細胞趨化因子接受體(CXCR4)、介白素-6(IL-6)、及介白素-8(IL-8)之基因表現量。RT-PCR所用之引子序列顯示於表4所列之SEQ ID NO：1 至SEQ ID NO：10及所附的序列表中。實驗以β-肌動蛋白作為控制組，結果顯示於第5圖。
如第5圖所示，脂肪幹細胞在添加亞丁基苯酞(特別是在20微克/毫升的濃度下)並培養12小時後，其神經滋養因子、幹細胞趨化因子、及幹細胞趨化因子接受體的基因表現量皆會增加。此外，添加亞丁基苯酞後，如介白素-6及介白素-8之免疫調節因子的表現量也會增加，顯示亞丁基苯酞可增加細胞激素的基因表現量並調節免疫反應，從而維持神經新生。上述結果顯示， 併用亞丁基苯酞與脂肪幹細胞可增加脂肪幹細胞之神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及免疫調節因子的基因表現量，從而可抑制神經元之細胞凋亡及促進神經元增生。
[實施例6]促進幹細胞分泌神經滋養因子及幹細胞趨化因子接受體的活體內試驗
於SOD1-G93A基因轉殖小鼠出生後第60天開始每天口服投予亞丁基苯酞，每天1次，每次劑量500毫克/公斤體重，並同時於出生後第60天以腦內注射人類脂肪幹細胞(劑量為2 x 106 個細胞/30微升磷酸緩衝液)，另於出生後第90天以靜脈注射人類脂肪幹細胞(劑量為1 x 106 個細胞/150毫升磷酸緩衝液)。於第90天以水合氯醛(chloral hydrate)麻醉小鼠，犧牲取出腦部、脊髓組織進行免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色。以4%三聚甲醛(paraformaldehyde)固定所切下的脊髓和腦組織至隔天(overnight)，隨後以萊卡恆冷器(Leica cryostat)在維持低溫的30%蔗醣中切出10微米的薄片。將自小鼠脊髓、腦皮質或海馬迴切下的薄片安置(mounted)於明膠塗層的玻片上，以阻斷緩衝液(blocking buffer)孵化處理(incubate)後，於4℃下分別加入人類粒線體抗體(anti-human mitochondria，購自Abcam)(可用於辨識所注射之人類脂肪幹細胞)、人類神經滋養因子抗體(anti-human BDNF，購自GeneTex)、或人類幹細胞趨化因子接受體抗體(anti-human CXCR4，購自GeneTex)等一級抗體進行孵化處理隔夜。實驗結果顯示於第6A圖、第6B圖、及第6C圖。
如第6A圖所示，當投予SOD1-G93A基因轉殖小鼠亞丁基苯酞與人類脂肪幹細胞之組合後，可於小鼠脊髓中偵測到人類脂肪幹細 胞(第6A圖中圓圈標示處)，顯示經腦內注射(或靜脈注射)所施予之脂肪幹細胞確實可從腦部(或靜脈)遷移到脊髓，而發揮保護脊髓的運動神經之功效。此外，如第6B及6C圖所示，當投予SOD1-G93A基因轉殖小鼠亞丁基苯酞與人類脂肪幹細胞之組合後，於小鼠腦部及脊髓中所偵測到的人類神經滋養因子(第6B圖中圓圈標示處)及人類幹細胞趨化因子接受體(第6C圖中圓圈標示處)的表現量皆有顯著的增加。
上述結果顯示出，併用亞丁基苯酞與脂肪幹細胞可增加脂肪幹細胞之神經滋養因子及幹細胞趨化因子接受體之蛋白質表現量，從而可用於抑制神經元之細胞凋亡並促進神經元增生。
以上實施例之結果顯示，併用苯酞化合物及幹細胞，可促進幹細胞分泌端粒酶、神經滋養因子、幹細胞趨化因子、幹細胞趨化因子接受體、及/或免疫調節因子(如：介白素-6、介白素-8)，故可防止運動神經元凋亡、保護運動神經元、及/或促進運動神經元增生，並可治療運動神經元退化性疾病及/或延緩其發病。
上述實施例僅係用以例示說明本發明之原理及功效，而非用於限制本發明。任何熟於此項技藝之人士均可在不違背本發明之技術原理及精神的情況下，對上述實施例進行修改及變化。因此，本發明之權利保護範圍應如後附申請專利範圍所界定者。
<110> 國欽生物科技股份有限公司
<120> 苯酞化合物之應用
<130> 無
<150> US 61/777,127
<151> 2013-03-12
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人造序列
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<223> IL-8引子-反向序列
<400> 10

Claims (21)

  1. 一種使用一苯酞化合物(phthalide)於製備藥劑的用途，該藥劑係用以促進幹細胞分泌端粒酶(telomerase)、神經滋養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、幹細胞趨化因子(stromal cell-derived factor-1，SDF1)、幹細胞趨化因子接受體(CXC chemokine receptor 4，CXCR4)、免疫調節因子之至少一者；其中該苯酞化合物係選自以下群組：亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide)、3-亞丁基-4,5-二氫苯酞(ligustilide)、以及前述之組合。
  2. 如請求項1之用途，其中該苯酞化合物係亞丁基苯酞。
  3. 如請求項1或2之用途，其中該幹細胞係選自以下群組：胚胎幹細胞、成體幹細胞、誘導性多功能幹細胞(induced pluripotent stem cell)、及前述之組合。
  4. 如請求項1或2之用途，其中該幹細胞係選自以下群組：間葉幹細胞(mesenchymal stem cell)、造血幹細胞(hematopoietic stem cell)、及前述之組合。
  5. 如請求項1或2之用途，其中該幹細胞係選自以下群組之間葉幹細胞：骨髓幹細胞、臍帶血幹細胞、胎盤幹細胞、脂肪幹細胞、口腔幹細胞、嗅球幹細胞、羊水幹細胞、羊膜幹細胞、臍帶幹細胞、臍帶內膜幹細胞、及前述之組合。
  6. 如請求項1或2之用途，其中該幹細胞係脂肪幹細胞。
  7. 如請求項1或2之用途，其中該藥劑係與一幹細胞同時或分別投予至一個體，以防止運動神經元細胞凋零、保護運動神經元 細胞、及/或促進運動神經元細胞增生。
  8. 如請求項1或2之用途，其中該藥劑係與一幹細胞同時或分別投予至一個體，以治療運動神經退化性疾病及/或延緩其發病。
  9. 如請求項8之用途，其中該運動神經元退化性疾病係選自以下群組：肌萎縮側索硬化症、重症肌無力、肌無力、肌肉萎縮、肌營養不良、多發性硬化症、多發性系統退化症、脊椎性肌肉萎縮症、及前述之組合。
  10. 如請求項8之用途，其中該運動神經元退化性疾病係肌萎縮側索硬化症。
  11. 一種套組，其係包含：一第一組合物，包含一苯酞化合物(phthalide)；以及一第二組合物，包含一幹細胞；其中，該第一組合物與該第二組合物係供同時或分別投予至一個體；以及其中該苯酞化合物係選自以下群組：亞丁基苯酞(n-butylidenephthalide)、3-亞丁基-4,5-二氫苯酞(ligustilide)、以及前述之組合。
  12. 如請求項11之套組，其中該苯酞化合物係亞丁基苯酞。
  13. 如請求項11之套組，其中該幹細胞係選自以下群組：胚胎幹細胞、成體幹細胞、誘導性多功能幹細胞(induced pluripotent stem cell)、及前述之組合。
  14. 如請求項11之套組，其中該幹細胞係選自以下群組：間葉幹 細胞(mesenchymal stem cell)、造血幹細胞(hematopoietic stem cell)、及前述之組合。
  15. 如請求項11之套組，其中該幹細胞係選自以下群組之間葉幹細胞：骨髓幹細胞、臍帶血幹細胞、胎盤幹細胞、脂肪幹細胞、口腔幹細胞、嗅球幹細胞、羊水幹細胞、羊膜幹細胞、臍帶幹細胞、臍帶內膜幹細胞、及前述之組合。
  16. 如請求項11之套組，其中該幹細胞係脂肪幹細胞。
  17. 如請求項11至16中任一項之套組，其更包含一第三組合物，該第三組合物係包含一溶劑及/或一溶液，且於使用時與該第一組合物及/或該第二組合物混合，以提供一注射液。
  18. 如請求項11至16中任一項之套組，其中該第一組合物係呈供口服投藥、鼻腔投藥、皮質脊髓注射(corticospinal tract injection)、鞘內注射(intrathecal injection)、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及/或皮下注射之形式；該第二組合物係呈供皮質脊髓注射、鞘內注射、腦內注射、靜脈注射、腹腔注射、及/或皮下注射之形式。
  19. 一種使用一苯酞化合物(phthalide)之代謝前驅物於製備用以延緩運動神經元退化性疾病之發病及/或治療運動神經元退化性疾病之藥劑的用途，其中該苯酞化合物之代謝前驅物係3-亞丁基-4,5-二氫苯酞(3-butylidene-4,5-dihydrophthalide，ligustilide)。
  20. 如請求項19之用途，其中該運動神經元退化性疾病係選自以下之至少一者：肌萎縮側索硬化症、重症肌無力、肌無力、肌 肉萎縮、肌營養不良、多發性硬化症、多發性系統退化症、及脊椎性肌肉萎縮症。
  21. 如請求項19之用途，其中該運動神經元退化性疾病係肌萎縮側索硬化症。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10493105B2 (en) * 2014-09-11 2019-12-03 Taiwan Mitochondrion Applied Technology Co., Ltd Isolated adipose-derived mesenchymal stem cells treated with angelica extract or butylidenephthalide, and wherein the cells have an increased mitochondrial membrane potential and a decreased level of IL-8, and methods for treating parkinson's disease
TWI625391B (zh) * 2014-09-17 2018-06-01 國璽幹細胞應用技術股份有限公司 藁本內酯之應用
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TWI675678B (zh) * 2018-08-23 2019-11-01 國為生醫科技股份有限公司 亞丁基苯酞於多巴胺神經前驅細胞移植治療的應用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2375302T3 (es) * 2005-05-24 2012-02-28 Dsm Ip Assets B.V. Derivados de ligustilida para el tratamiento de trastornos inflamatorios.
WO2010063743A1 (en) * 2008-12-03 2010-06-10 Cellerix, S.A. Methods for the preparation of adipose derived stem cells and utilizing said cells in the treatment of diseases
CN102844027A (zh) * 2009-11-23 2012-12-26 培力(香港)健康产品有限公司 治疗炎症和免疫系统障碍的新治疗方法
CN102397272B (zh) * 2010-09-17 2013-08-14 石药集团恩必普药业有限公司 丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗als的药物中的应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Liu Shih-Ping et al.;"n-Butylidenephthalide(BP) Maintains Stem Cell Pluripotency by Activating Jak2/Stat3 Pathway and Increases the Efficiency of iPS Cells Generation";PLOS ONE,2012,volume 7,issue 9. 張紅麗；"丁苯酞對ALS模型小鼠生存期及CDK5 P35表達的影響";河北醫科大學，2012 *
Yan Ru et al.;"Pharmacokinetics and Metabolism of Ligustilide,a Major Bioactive Component in Rhizoma Chuanxiong,in the Rat";Drug Metabolism and Disposition,2008,vol.36,no.2,pages 400-408. *
劉強等;"肌萎縮側索硬化症的幹細胞移植治療與進展";中國組織工程研究與臨床康復，2009，第13卷，第10期，第1942-1946 頁 *

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