CN102397272B - 丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗als的药物中的应用 - Google Patents
丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗als的药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102397272B CN102397272B CN 201010289987 CN201010289987A CN102397272B CN 102397272 B CN102397272 B CN 102397272B CN 201010289987 CN201010289987 CN 201010289987 CN 201010289987 A CN201010289987 A CN 201010289987A CN 102397272 B CN102397272 B CN 102397272B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- butylphthalide
- mouse
- als
- mice
- sod1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及医药领域，公开了丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗肌萎缩侧索硬化的药物中的应用。丁基苯酞及所述其衍生物可延缓SOD1-G93A转基因小鼠的发病时间，延长小鼠生存期，减少了脊髓运动神经元退行性病变，使小鼠脊髓前角运动神经元的存活的数目明显增多，还可减少转基因鼠电生理的异常，复合肌肉动作电位波幅和运动单位数目均明显改善，小鼠脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活得到了显著的抑制，明显降低iNOS、NF-κBp65的表达水平，在预防和治疗肌萎缩侧索硬化中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗ALS的药物中的应用。
背景技术
肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)又称Charcot病或Lou Gehrig病，是一种致命性的运动神经元变性疾病。ALS的全球发病率是5～7/10万，好发年龄40～60岁，男女发病比率是1.4～2.5∶1。以肌肉无力、肌束颤动以及肌肉萎缩为主要临床表现，该病会影响咽喉部肌肉，使患者出现言语和吞咽困难；亦可累及呼吸肌，导致呼吸困难而死亡。该病起病隐袭，逐渐进展，平均生存期约为3～5年，最终多因呼吸衰竭而死亡，给国家、社会和家庭都带来了沉重的负担。
ALS的主要病理表现为：脊髓前角细胞、脑干后组运动神经核、大脑皮质运动区锥体细胞变性、数量减少，胶质细胞增生。脊髓前根和脑干运动神经轴突变性和继发脱髓鞘，导致失神经支配和肌萎缩。在疾病发作时脊髓星形胶质细胞肥大增生和小胶质细胞活化。肌电图检查对诊断该病很有价值。常规肌电图呈典型神经源性改变。静息状态下可见纤颤电位、正锐波，有时可见束颤电位；小力收缩时运动单位电位时限增宽、波幅增大、多相波增加，大力收缩呈现单纯相。早期复合肌肉动作电位(CMAP)正常，随着病程进展，肌肉萎缩加重，CMAP下降甚至测不出。CMAP下降反应了有功能的运动单位的减少。在疾病早期或缓慢进展者，虽已有运动神经元丢失，但由于侧支芽生的再支配作用，可无复合肌肉动作电位波幅下降；但当运动神经元丢失速度超过再支配速度时，就出现了复合肌肉动作电位波幅下降。疾病晚期，运动神经元大量丢失，复合肌肉动作电位波幅可降至极低甚至无法测出。运动单位数目估计(MUNE)是一种定量测定支配某一骨骼肌或肌群的有功能的下运动神经元数目的电生理技术。在ALS患者，统计法MUNE测定表现为运动单位数目明显减少。
ALS的发病机制尚不明确，可能涉及兴奋性氨基酸毒性作用、神经营养因子的缺失和异常、氧化应激和线粒体功能障碍、凋亡、神经炎性反应、蛋白聚集、非运动神经元作用等方面。炎症在铜/锌超氧化物岐化酶1(SOD1)介导的运动神经元变性中的作用成为近来研究热点。随着SOD1小鼠临床症状发作后，在脊髓中出现大量活化的小胶质细胞和星形胶质细胞，胶质细胞中表达诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和磷酸酯酶A2、COX-2等。炎症反应强度的增加与疾病的进展是一致的，抑制小胶质细胞激活的药物如minocycline和COX-2抑制剂能延迟SOD1小鼠的发病和病情进展。
目前对ALS的有效性治疗方面并没有取得突破。力如太是美国食品和药物管理局(FDA)批准的唯一用于治疗ALS的药物。其可能机制有：阻滞NMDA受体，稳定失活的电压依赖性钠通道，抑制突触前谷氨酸的释放，促进细胞外谷氨酸的摄取。力如太对体外培养的运动神经元和SOD1转基因小鼠都有神经保护作用。力如太仅能延缓患者平均的生存期2～3个月。人们期望能够将神经营养因子应用于ALS的治疗，然而神经营养因子的临床试验结果是令人失望的。其它的如抗氧化剂、抗凋亡剂、抗炎性药物、免疫调节剂等只是在动物实验或临床试验阶段。目前尚无有效的预防或治疗ALS疾病的药物。
丁基苯酞(3-n-butylphathlide，NBP)其化学名称为消旋-3-正丁基苯酞，商品名恩必普(NBP)，又名芹菜甲素，是从芹菜籽中分离出来的一种有效成分。其分子式：C12H14O2，分子量：190.24，结构式如下：
丁基苯酞对急性缺血性脑卒中的中枢神经功能的损伤有改善作用，其药效学作用如下：(1)具有明显缩小大鼠局部脑缺血脑梗塞面积，改善神经功能缺失作用；(2)能改善小鼠完全脑缺血的脑能量代谢；(3)改善局部脑缺血引起的脑水肿；(4)对缺血区局部脑血流和软脑膜微循环有明显改善作用；(5)抗血栓作用；(6)能显著改善局部脑缺血引起的记忆障碍；(7)对脑卒中易感性自发性高血压大鼠的脑卒中具有预防和治疗作用。
丁基苯酞还具有改善线粒体功能，抗氧自由基，降低细胞内钙水平以及抑制细胞凋亡等作用。中国专利CN03137457.3公开了左旋正丁基苯酞的预防和治疗痴呆的用途；中国专利CN200480029409.0公开了左旋丁基苯酞在制备预防和治疗脑梗塞的药物中的应用；氨丁苯酞对血小板聚集功能的影响(参见马轶涛，中国药理学通报2000Feb；16(1)：72～4)。中国专利CN201010033365.6公开了丁基苯酞及其衍生物在制备治疗帕金森病的药物中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗ALS的药物中的应用。
所述丁基苯酞包括消旋丁基苯酞或左旋丁基苯酞。
所述衍生物在体内代谢为消旋丁基苯酞或左旋丁基苯酞。
发明专利CN101337891A公开了根据前药原理，结构式如式I的化合物在体内能释放NO和丁基苯酞，所述化合物结构式如下：
其中A为C2-C8烷基、C2-C8烯烃基、C2-C8烯烃基、苯基或取代苯基、芳杂环或取代芳杂环；所述取代苯基被1个或多个选自于羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-CH＝CHCOO(CH2)n，n＝2-6取代的苯基，各取代基可以相同或不同；所述芳杂环为1至4个杂原子的5至7元芳香环，所述杂原子独立的选自O、S或N；所述取代芳杂环可任选被1个或多个选自于C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或卤素取代，各取代基可以相同或不同；
R为二甲胺、二乙胺、吡咯、哌啶、吗啉、哌嗪、N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、N-苯基哌嗪、N-苄基哌嗪或N-叔丁氧羰基哌嗪。
因此，所述化合物在体内代谢为丁基苯酞，也必然具有防治ALS的效果。
作为优选，R为吗啉基；A为
n＝3，所述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。
作为优选，R为哌啶基；A为n＝3，所述衍生物为[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。
作为优选，R为二乙胺基；A为
n＝3，所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯。
作为优选，R为二乙胺基；A为
n＝3，所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯。
作为优选，R为吗啉基；A为
n＝3，所述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯。
作为优选，R为二乙胺基；A为C4烷基，所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。
作为优选，R为吗啉基；A为C4烷基，所述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。
作为优选，R为哌啶基；A为C4烷基时，所述衍生物为[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯。
作为优选，R为二乙胺基；A为苯环上间位取代基为C2烷基时，所述衍生物为[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。
作为优选，R为哌啶基；A为苯环上间位取代基为C2烷基时，所述衍生物即为[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。
作为优选，R为吗啉基；A为苯环上间位取代基为C2烷基，所述衍生物即为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。
因此，所述衍生物为[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯或[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯时，其在体内代谢为丁基苯酞，具有预防和治疗ALS的效果。
李江、王晓良等公开了消旋2一(a-羟基戊基)苯甲酸钾盐在体内具有与消旋丁基苯酞一致的组织分部与代谢特征，(参见dl-PHPB的体内外转化及药代动力学研究，中国药理通讯2007年第二十四卷第三期，50-51)。CN1234541C公开了2一(a-羟基戊基)苯甲酸盐在防治心脑血管疾病方面具有与丁基苯酞相似的药理作用，根据化药药物代谢动力学，本领域人员可以合理预期，结构式如式II所示的2一(a-羟基戊基)苯甲酸盐在体内均可离解为丁基苯酞，也必然具有防治ALS的效果。
更优选地，所述衍生物为2一(a-羟基戊基)苯甲酸盐，结构式如式II所示：
其中，M为一价金属离子或是二价金属离子，n＝2或n＝3。
作为优选，2一(a-羟基戊基)苯甲酸盐中所述M为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子、镁离子或锌离子。
经动物试验证实，本发明所述丁基苯酞及其衍生物可延缓SOD1-G93A转基因小鼠的发病时间，延长小鼠生存期，减少了脊髓运动神经元退行性病变，使小鼠脊髓前角运动神经元的存活的数目明显增多，还可减少转基因鼠电生理的异常，复合肌肉动作电位波幅和运动单位数目均明显改善，小鼠脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活得到了显著的抑制，明显降低了iNOS、NF-κBp65的表达水平，可用于制备预防和治疗肌萎缩侧索硬化的药物，具有良好的应用前景。
附图说明：
图1示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠对生存期的影响；
图2示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠体重的影响；
图3示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠转棒实验潜伏期的影响；
图4示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠悬线实验潜伏期的影响；
图5示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠脊髓小胶质细胞激活的影响；
图6示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠脊髓星形胶质细胞激活的影响；
图7示不同剂量消旋丁基苯酞对ALS模型鼠iNOS、NF-κBp65蛋白表达的影响；
图8示消旋丁基苯酞对ALS模型鼠发病时间的影响；
图9示左旋丁基苯酞对ALS模型鼠发病期的影响；
图10示左旋丁基苯酞对ALS模型鼠生存期的影响。
具体实施方式：
本发明公开了丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗ALS病的药物中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
按照本发明，实施例公开消旋丁基苯酞和左旋丁基苯酞制备预防和治疗ALS病的药物中的应用，本领域技术人员根据现有技术及药理学原理，合理预期在体内代谢为消旋或左旋丁基苯酞的衍生物具有预防和治疗ALS的效果。
所述衍生物包括结构式如式I所示：
其中A为C2-C8烷基、C2-C8烯烃基、C2-C8烯烃基、苯基或取代苯基、芳杂环或取代芳杂环；所述取代苯基被1个或多个选自于羟基、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、-CH＝CHCOO(CH2)n，n＝2-6取代的苯基，各取代基可以相同或不同；所述芳杂环为1至4个杂原子的5至7元芳香环，所述杂原子独立的选自O、S或N；所述取代芳杂环可任选被1个或多个选自于C1-C6烷基、C1-C6烷氧基或卤素取代，各取代基可以相同或不同；
R为二甲胺、二乙胺、吡咯、哌啶、吗啉、哌嗪、N-甲基哌嗪、N-乙基哌嗪、N-异丙基哌嗪、N-苯基哌嗪、N-苄基哌嗪或N-叔丁氧羰基哌嗪。
以及结构式如式II所示的化合物：
其中，M为一价金属离子或是二价金属离子，n＝2或n＝3。
作为优选，所述M为钾离子、钠离子、锂离子、钙离子、镁离子或锌离子。
所述衍生物包括2一(a-羟基戊基)苯甲酸钾盐、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-{2-甲氧基-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]}苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-4-[2-(4-硝氧丁氧羰基)乙烯基]苯酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-(4-硝氧)丁酯、[2-(1-二乙胺基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯、[2-(1-哌啶基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯、[2-(1-吗啉基乙酰氧)正戊基]苯甲酸-[4-(2-硝氧乙基)]苯酯。
本发明提供的丁基苯酞及其衍生物可以延缓SOD1-G93A转基因小鼠的发病时间，延长小鼠生存期，减少脊髓运动神经元退行性病变，使小鼠脊髓前角运动神经元的存活的数目明显增多，还可减少转基因鼠电生理的异常，复合肌肉动作电位波幅和运动单位数目均明显改善，小鼠脊髓星形胶质细胞和小胶质细胞的激活得到了显著的抑制，明显降低了iNOS、NF-κBp65的表达水平，可有效预防和治疗肌萎缩侧索硬化。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：ALS转基因鼠的鉴定
目前广泛应用临床和基础研究的ALS转基因鼠是SOD1-G93A小鼠，它携带能表达人G93A(氨基酸链上第93位甘氨酸被丙氨酸替代)错义突变的SOD1基因，能模拟ALS慢性进展性的病程以及部分病理和生化表现。SOD1-G93A小鼠的主要特征：大约3-4个月出现后肢无力，悬尾时后肢震颤及外展无力，2周后小鼠1个或2个肢体瘫痪，逐渐出现毛发粗糙，消瘦，5个月后运动不能，最终因呼吸衰竭而死亡。
本发明所述ALS转基因小鼠(B6SJL-TgN[SOD1-G93A]1Gur，编号002726)购自美国Jackson Laboratory(Barharbor，ME，U.S.A)。
1.1子代鼠的鉴定
①DNA提取：剪取子代鼠的尾尖约2mm，置于一EP管中，加入150ul 50mM的NaOH，95℃孵育30分钟，涡漩使鼠尾尖充分消化后，加入12.5ul 1M Tris-HCL(PH＝8.0)，再涡旋，10,000rpm离心2分钟。基因组DNA即在上清液中。
②PCR反应：基因扩增条件为：95℃3min，然后95℃45S，60℃30s，(35个循环)，72℃延伸5min。
③PCR产物分析：吸取10ul PCR产物，在2％琼脂糖凝胶上电泳，80V，45min，用全自动凝胶成像系统拍摄，上海英维俊生物公司进行产物的纯化和测序。
1.2ALS转基因鼠的表型特征：ALS鼠3个月左右逐渐出现悬尾肢体震颤，后肢无力，进行加重的爬行时步态不稳，摇摆，单侧或双侧肢体瘫痪，直至双后肢僵直不能爬行和自主进食。
1.3动物分组和给药(治疗给药)
1、消旋丁基苯酞组：分3个剂量(30mg/kg，60mg/kg，120mg/kg)SOD1-G93A阳性鼠日龄90日即开始每天灌胃给药，直至死亡；
2、溶剂对照组：SOD1-G93A阳性鼠日龄90日即开始予同体积的花生油灌胃；
3、正常对照组：野生型同窝SOD1-G93A阴性鼠日龄90日即开始予同体积的花生油灌胃。
实施例2：观察消旋丁基苯酞对ALS小鼠发病时间和生存期、运动功能的影响
每天观察所有SOD1-G93A转基因鼠的精神状态、病情进展、存活情况。发病的评判：连续2天观察出现肢体震颤和(或)肢体无力即判为发病死亡时间：将鼠置为仰卧位，30秒内不能翻身为俯卧位即判断死亡。
转棒实验：转棒实验可以评价运动的协调性、力量和平衡能力。实验鼠放置于直径3.5cm的转棒仪上，转速调至16rpm，记录坠落的最长潜伏期，以180秒为分界值，超过180秒按180秒记录，不足180秒按实际时间记录。小鼠运动能力的评测从70天开始，小鼠先8rpm练习5天使之习惯运动并获得一个基础运动值。每次实验重复3次并取其最好成绩记录，每只实验鼠每周测定2次。
悬线实验：主要评价小鼠的抓握力量。将实验鼠置于传统用的鼠笼盖上，轻轻震动鼠笼盖促使实验鼠紧握鼠笼盖，随后迅速翻转鼠笼盖，记录后肢离开笼盖的最长潜伏期，以90秒为分界值，超过90秒按90秒记录，不足90秒按实际时间记录。每次实验重复3次并取其最好成绩记录，每只实验鼠每周测定2次。
悬尾实验：悬吊鼠尾，观察后肢的伸展及其弯腰情况，并予评分——2分：正常；1分：部分正常；0分：缺失。
本发明人通过检测发病晚期小鼠的翻正反射确定小鼠的临床死亡时间，经统计分析发现，60mg/kg消旋丁基苯酞组小鼠的平均生存期比溶剂对照组延长了20天，30mg/kg和120mg/kg消旋丁基苯酞组小鼠的平均生存期比溶剂对照组未见有明显改变见图1。以上结果说明，消旋丁基苯酞延缓SOD1-G93A转基因小鼠的发病时间，延长小鼠生存期。
本发明人采用了Rotarod转棒仪、悬线实验、悬尾实验来检测小鼠的运动功能。ALS小鼠发病3周体重明显下降，消旋丁基苯酞60mg/kg组小鼠体重的降低被延缓，见图2。野生型小鼠始终能在最好的水平完成转棒和悬线实验。ALS小鼠发病后转棒实验和悬线实验的潜伏期逐渐缩短，在发病5周左右不能维持实验，而消旋丁基苯酞60mg/kg组小鼠运动功能评分的减低被延缓(见图3，图4)。
实施例3：ALS转基因鼠的电生理学检测
自发电位：实验鼠经10％水合氯醛麻醉，同心针电极插入后肢腓肠肌肌腹中，观察有无纤颤电位和(或)正锐波。
复合肌肉动作电位(CMAP)的记录：实验鼠经10％水合氯醛麻醉，刺激腰段脊旁坐骨神经，记录电极插入后肢腓肠肌肌腹中。给予超强刺激，得CMAP并记录，测量峰峰值表示CMAP波幅，并记录远端运动潜伏期(DML)。
运动单位数量(MUNE)评估：参照“统计学方法技术”的原理，实验鼠经10％水合氯醛麻醉，刺激腰段脊旁坐骨神经，记录电极插入后肢腓肠肌肌腹中。调整电极位置，以最小刺激强度获得最大复合肌肉动作电位(CMAP)；并获得刺激反应功能曲线，保证起始部分和终止部分所包含的2～4个反应点位于同一水平，根据刺激反应功能曲线确定采样区间。首先选择曲线中相邻2个反应点间波幅差距最大的部分，作为第1个采样区间；选择曲线中相邻2个反应点间波幅差距次大的部分，作为第2个采样区间；选择曲线上相邻2个反应点间波幅差距，第3大的部分，作为第3个采样区间；最后选择曲线中相邻2个反应点间波幅差距最小的部分；作为第4个采样区间。调整刺激强度，使所获得的反应点均落于采样区间内，然后进行采样，采样时保证同一采样区间内至少存在连续且规律出现的两种类型的反应点，否则应扩大采样区间的范围，直至满足采样条件。同一采样区间可重复采样2～10次结束某一采样区间采样的条件为：所得运动单位电位波幅的标准差小于均数的10％，采样点直方图近似正态分布或略呈负性偏态分布。结束某一采样区间的采样后，可获得该区间的采样范围和运动单位数目估计测值。重复上述采样步骤，对下一个选定的采样区间进行检测，直至完成全部4个采样区间的采样最终获得复合肌肉动作电位波幅和运动单位数目。
复合肌肉动作电位(CMAP)波幅的大小主要反应了周围神经轴索的功能。运动单位数目的估计(MUNE)反应了有功能的运动单位的多少。
结果发现与正常对照组的小鼠比较ALS转基因鼠均有正锐波和纤颤电位，CMAP波幅(24.3±0.30mv vs 12.8±7.15mv)和MUNE(135.8±8.64vs 63.2±31.87)均明显下降。60mg/kg消旋丁基苯酞组较溶剂对照组的CMAP波幅(18.2±7.27mv vs 12.8±7.15mv，p＜0.05)明显改善，见表1。MUNE(110.5±9.68vs 63.2±31.87p＜0.05)明显改善，见表2。*P＜0.01，#P＜0.05。
表1复合肌肉动作波幅
*与正常对照组比较P＜0.05
表2运动单位数目
*与正常对照组比较P＜0.05
实施例4：ALS鼠腰段脊髓前角的病理学检测：脊髓组织学和运动神经元计数
导致SOD1-G93A转基因小鼠发生疾病的直接因素为脊髓前角运动神经元退行性变。尼氏染色可以表示出运动神经元的胞体及其胞核的状态。本发明人采用尼氏染色方法观察了小鼠脊髓前角神经元。
实验鼠10％水合氯醛深度麻醉后，用4℃生理盐水进行心脏灌注后，一部分脊髓(L4～L5段)用于组织病理学分析和免疫组化分析。脊髓取出后，浸泡于4％的多聚甲醛中4℃过夜，随后用10％，20％，30％的蔗糖溶液4℃分别处理24小时。另一部分脊髓(C1～L3段)用于western blot检测，其取出后迅速置于液氮中，～80℃冰箱保存。脊髓L4～L5段经上述处理后，石蜡包埋，脊髓连续切片的厚度为6μm，切片贴到多聚赖氨酸处理的载玻片上。为了计数运动神经元，脊髓L4-L5段连续切片200张，每7张取1张做尼氏染色。处理好的切片用显微镜明视野拍照后，计数。
计数的标准：计数的目的神经元所在的区域为脊髓前角部分，中央管以上的部分；运动神经元的直径在20μm以上；运动神经元有明显的细胞核。
Nissl染色的具体步骤如下：
(1)二甲苯脱蜡10min×2次；
(2)依次通过无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精
(3)蒸馏水冲洗5min×1次；
(4)切片入焦油紫工作液染色30分钟；
(5)切片入蒸馏水洗去浮色；
(6)切片入70％酒精、80％酒精、95％酒精分色；1分钟；镜下观察尼氏体颗粒清晰。
(7)切片入特殊分色液中退背景；100％酒精∶乙醚∶氯仿＝1∶1∶1
(8)切片入无水酒精脱水，二甲苯I、二甲苯II透明，中性树胶封片。
通过对各组转基因小鼠脊髓((L4～L5段)组织切片，尼氏染色，显微镜观察和计数，发现与正常对照组小鼠对比，发病中期SOD1-G93A转基因小鼠脊髓前角运动神经元数目明显下降(8.5±2.92vs 28.5±6.36野生型P＝0.000)，而60mg/kg消旋丁基苯酞组可以有效保护脊髓前角运动神经元，使小鼠脊髓前角运动神经元的存活的数目明显增多(16.8±2.64vs 8.5±2.92，P＝0.002)，30mg/kg组无明显的保护脊髓前角运动神经元的作用(8.6±2.92vs 8.5±2.92，P＞0.05)，120mg/kg组也没有观察到明显的保护脊髓前角运动神经元的作用(8.5±0.87vs 8.5±2.92，P＞0.05)，结果见表3。说明消旋丁基苯酞减少了脊髓运动神经元退行性病变。
表3运动神经元计数
*与正常对照组比较P＜0.01
形态学、组织学观察结果显示：SOD1-G93A转基因小鼠的发病症状与ALS患者的临床表现十分相似，表现为渐进性的肌无力，肌萎缩，直至瘫痪和死亡，病理改变时脊髓前角运动神经元选择性丢失。转基因鼠发病后逐渐出现双侧后肢的无力、瘫痪以致萎缩，60mg/kg消旋丁基苯酞组小鼠病理改变一定程度改善。
实施例5：消旋丁基苯酞对ALS转基因小鼠神经保护作用的机制
炎症反应在ALS病情的发生和发展中扮演重要的角色，胶质细胞的激活是SOD1-G93A转基因小鼠体内炎症反应的检测指标之一。本发明人使用CD11b和GFAP作为标记分别观察了转基因小鼠脊髓前角小胶质细胞和星形胶质细胞的形态。
本发明分别用CD11b和GFAP来检测脊髓切片(L4～L5段)来评估小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况，研究消旋丁基苯酞对SOD1-G93A转基因鼠胶质细胞激活的影响。
免荧光染色的具体步骤如下：
(1)二甲苯脱蜡10min×2次；
(2)依次通过无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精
(3)蒸馏水冲洗5min×1次；
(4)抗原修复：枸橼酸盐缓冲液(pH＝6.0)高压修复
(5)冷却至室温，蒸馏水冲洗2min×3次，甩干；
(6)3％过氧化氢室温孵育10min，甩干；
(7)0.01mmol/LPBS冲洗5min×3次；
(8)置于湿盒中，荧光笔画圈，3％胎牛血清室温孵育10min，倾去血清，勿洗；
(9)加入一抗GFAP(1∶800)，CD11b(1∶100)30μl 4℃过夜，阴性对照加入抗体稀释液；
(10)取出湿盒，室温中静置30min，使其恢复室温；0.01mmol/LPBS冲洗5min×3次；
(11)分别滴加FITC标记的山羊抗大鼠IgG(1∶100)，TRITC标记的山羊抗兔IgG(1∶100)室温孵育60分钟，PBS洗涤5min×3；
(12)甘油缓冲液封片后，荧光显微镜下观察。
结果发现，在野生型小鼠，小胶质细胞为分枝状，细胞体较小，显示为静息状态的小胶质细胞。在ALS小鼠，小胶质细胞CDllb表达增强，细胞突起增粗、缩短，并向病变神经元迁移，在运动神经元周围则呈圆形的巨噬细胞样形态，显示为充分活化的小胶质细胞。与溶剂对照组相比，消旋丁基苯酞60mg/kg能够明显减轻小胶质细胞的活化。另外，GFAP免疫荧光染色显示ALS小鼠星形胶质细胞免疫学标志GFAP上调，细胞增大。与溶剂对照组相比，消旋丁基苯酞60mg/kg能够明显减轻星形胶质细胞反应。说明消旋丁基苯酞抑制了转基因小鼠脊髓胶质细胞的激活。统计结果见图5和图6，*P＜0.01。
实施例6：消旋丁基苯酞对SOD1-G93A转基因鼠iNOS、NF-κBp65蛋白表达的影响
炎症在ALS的发生和发展中起了非常重要的作用。本发明采用western blot检测了炎症相关指标iNOS、NF-κBp65蛋白的表达。
脊髓(C1～L3段)标本从～80℃冰箱中取出后，置于RIPA裂解液中，超声破碎1分钟，12000rpm，4℃离心，15分钟，取上清。分装后保存于-80℃冰箱备用。SDS-PAGE电泳，转膜，封闭液，硝酸纤维素膜室温封闭1小时。一抗(iNOS、NF-κBp65)4℃孵育过夜。二抗，室温孵育1小时。采用化学发光法显影，拍照。
结果发现，与野生型小鼠相比转基因小鼠iNOS、NF-κBp65的水平明显升高。消旋丁基苯酞60mg/kg明显降低了iNOS、NF-κBp65的水平，见图7，统计结果显示其差异具有显著性。说明消旋丁基苯酞抑制了ALS转基因小鼠脊髓炎症相关蛋白的水平，减少炎症的发生。
实施例7：消旋丁基苯酞对ALS转基因鼠发病时间的影响
参照实验例1对实验动物分组(预防给药)，实验鼠分为：
1.消旋丁基苯酞组：剂量(60mg/kg)
SOD1-G93A阳性鼠日龄42天即开始每天灌胃给药，直至死亡；
2.溶剂对照组：SOD1-G93A阳性鼠日龄42天即开始予同体积的花生油灌胃；
3.正常对照组：野生型同窝SOD1-G93A阴性鼠日龄42天即开始予同体积的花生油灌胃。
ALS鼠发病和死亡的判断标准参照实施例2。
结果发现，消旋丁基苯酞60mg/kg组小鼠比溶剂对照组小鼠平均的发病时间延缓了15天(113.5±13.71vs 98±8.72)。见图8。
实施例8：左旋丁基苯酞对ALS转基因鼠生存期和发病时间的影响
参照实施例1对实验动物分组(预防给药)，实验鼠分为：
左旋丁基苯酞组：剂量30mg/kg，SOD1-G93A阳性鼠日龄42目即开始每天灌胃给药，直至死亡；
溶剂对照组：SOD1-G93A阳性鼠日龄42天即开始予同体积的花生油灌胃；
正常对照组：野生型同窝SOD1-G93A阴性鼠日龄42天即开始予同体积的花生油灌胃。
ALS鼠发病和死亡的判断标准参照实施例2。
参照实施例4，采用了Rotarod转棒仪、悬线实验、悬尾实验来检测小鼠的运动功能，发现左旋丁基苯酞30mg/kg组小鼠比溶剂对照小鼠延缓发病时间17天(100.2±5.52VS 117.1±12.57)见图9，延长生存期21天(157.9±4.81VS 178.8±12.29)，见图10。
以上结果说明，左旋丁基苯酞也可延缓SOD1-G93A转基因小鼠的发病时间，延长小鼠生存期，与消旋丁基苯酞具有相似的药理作用。
实施例9：左旋丁基苯酞对ALS转基因鼠电生理学检测的影响
参照实施例3的方法，对各组进行复合肌肉动作电位(CMAP)的记录以及运动单位数量(MUNE)评估，结果见表4和表5。
表4复合肌肉动作电位
*与对照组比较P＜0.05
表5运动单位数目估计
*与对照组比较P＜0.05
实施例10：左旋丁基苯酞对ALS鼠腰段脊髓前角运动神经元计数的影响
参照实施例4，实验鼠10％水合氯醛深度麻醉后，用4℃生理盐水进行心脏灌注后，一部分脊髓(L4～L5段)用于组织病理学分析和免疫组化分析。脊髓取出后，浸泡于4％的多聚甲醛中4℃过夜，随后用10％，20％，30％的蔗糖溶液4℃分别处理24小时。再依次入30％、50％、70％酒精处理24小时脊髓L4～L5段经上述处理后，石蜡包埋，脊髓连续切片的厚度为6μm，切片贴到多聚赖氨酸处理的载玻片上。为了计数运动神经元，脊髓L4-L5段连续切片200张，每7张取1张做尼氏染色。处理好的切片用显微镜明视野拍照后，计数。
计数的标准：计数的目的神经元所在的区域为脊髓前角部分，中央管以上的部分；运动神经元的直径在20μm以上；运动神经元有明显的细胞核，结果见表6，说明左旋丁基苯酞减少了脊髓运动神经元退行性病变。
表6运动神经元计数
*与对照组比较P＜0.01
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.消旋丁基苯酞或左旋丁基苯酞在制备预防和治疗ALS的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010289987 CN102397272B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗als的药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 201010289987 CN102397272B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗als的药物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102397272A CN102397272A (zh) | 2012-04-04 |
| CN102397272B true CN102397272B (zh) | 2013-08-14 |
Family
ID=45880171
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 201010289987 Active CN102397272B (zh) | 2010-09-17 | 2010-09-17 | 丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗als的药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102397272B (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI487521B (zh) * | 2013-03-12 | 2015-06-11 | Hawking Biolog Technology Co Ltd | 苯酞化合物之應用 |
| CN104042606B (zh) * | 2013-03-12 | 2017-05-24 | 国钦生物科技股份有限公司 | 苯酞化合物的应用 |
| US20140271568A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-09-18 | Hawking Biological Technology Co., Ltd | Method and kit for providing an increased expression of telomerase, brain-derived neurotrophic factor, stromal cell-derived factor-1, cxc chemokine receptor 4, and/or immune regulatory factor of stem cell |
| TWI625391B (zh) | 2014-09-17 | 2018-06-01 | 國璽幹細胞應用技術股份有限公司 | 藁本內酯之應用 |
| TWI625392B (zh) * | 2014-09-17 | 2018-06-01 | 國璽幹細胞應用技術股份有限公司 | 藁本內酯於提升幹細胞治療自體免疫疾病、心血管疾病、及／或血液性疾病之效益的應用 |
| CN107595877B (zh) * | 2016-07-12 | 2020-08-28 | 石药集团恩必普药业有限公司 | 一种含有丁苯酞的药物组合物及其在治疗als病药物中的应用 |
| CN107595876B (zh) * | 2016-07-12 | 2020-10-16 | 石药集团恩必普药业有限公司 | 一种含有丁苯酞的药物组合物及其在治疗als病药物中的应用 |
| WO2019179346A1 (zh) * | 2018-03-19 | 2019-09-26 | 河南真实生物科技有限公司 | 苯甲酸类化合物及其制备方法和应用 |
| WO2021185356A1 (zh) * | 2020-03-20 | 2021-09-23 | 石药集团恩必普药业有限公司 | 丁基苯酞及其衍生物的用途 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1382682A (zh) * | 2002-05-09 | 2002-12-04 | 中国医学科学院药物研究所 | 2－(α－羟基戊基)苯甲酸盐及其制法和用途 |
| CN101337891A (zh) * | 2008-05-19 | 2009-01-07 | 中国药科大学 | 一氧化氮供体型丁基苯酞衍生物、其制备方法及医药用途 |
-
2010
- 2010-09-17 CN CN 201010289987 patent/CN102397272B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1382682A (zh) * | 2002-05-09 | 2002-12-04 | 中国医学科学院药物研究所 | 2－(α－羟基戊基)苯甲酸盐及其制法和用途 |
| CN101337891A (zh) * | 2008-05-19 | 2009-01-07 | 中国药科大学 | 一氧化氮供体型丁基苯酞衍生物、其制备方法及医药用途 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 丁苯酞对AMPA诱导的神经细胞损伤的保护作用及机制研究;齐新;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20090715(第7期);E070-14,第3-4页 * |
| 刘娟等.白血病抑制因子降低AMPA受体在肌萎缩侧索硬化转基因G93AG1H小鼠脑干及感觉运动皮质的表达.《中国临床康复》.2006,第10卷(第46期),126-128. |
| 白血病抑制因子降低AMPA受体在肌萎缩侧索硬化转基因G93AG1H小鼠脑干及感觉运动皮质的表达;刘娟等;《中国临床康复》;20061215;第10卷(第46期);126-128 * |
| 齐新.丁苯酞对AMPA诱导的神经细胞损伤的保护作用及机制研究.《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》.2009,(第7期),E070-14,第3-4页. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102397272A (zh) | 2012-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102397272B (zh) | 丁基苯酞及其衍生物在制备预防和治疗als的药物中的应用 | |
| CN109055302A (zh) | Hbv转基因小鼠原代肝细胞的分离、培养与鉴定的方法 | |
| US8362070B2 (en) | Application of puerarin in the preparation of P2X3 mediated drugs for pain/nervous system diseases | |
| CN108024978A (zh) | 二羧酸的双酰胺衍生物作为用于刺激组织再生和恢复减退的组织功能的药剂 | |
| WO2011160597A1 (zh) | 一种具有降高血压活性的呋喃香豆素类化合物及其制备方法 | |
| CN102716142A (zh) | 淫羊藿苷在制备治疗帕金森病的药物中的应用 | |
| CN105388294B (zh) | 线粒体三功能酶α亚基在制备AA005抑制脂质累积的药物靶标的应用 | |
| CN106511347A (zh) | 氯化两面针碱在制备预防/治疗脓毒症药物中的应用 | |
| JP7367205B2 (ja) | 抗老化作用を有するポリペプチドｒｖ３及びｒｖ４、並びにその使用 | |
| WO2019071395A1 (zh) | 一种抗白色念珠菌的二芳基硫族化合物及其制备和应用 | |
| CN105853417B (zh) | 乌头碱在治疗红斑狼疮中的应用 | |
| Tongson et al. | Experimental ascaridiasis: influence of chicken age and infective egg dose on structure of Ascaridia galli populations | |
| CN110143926B (zh) | 具有防治冻伤作用的化合物及其衍生物的应用 | |
| JP2018087143A (ja) | ５−［２−［（６−アミノ）−９ｈ−プリン−９−イル］エチルアミノ］−１−ペンタノール多結晶体 | |
| US20220062315A1 (en) | Anti-human norovirus agent | |
| CN109745314A (zh) | 铁螯合剂Deferasirox(DFX)在治疗宫颈癌的药物中的应用 | |
| CN108689974A (zh) | 一种化合物、包含该化合物的组合物及其用途 | |
| Ejaz et al. | Anti-angiogenic and teratological activities associated with exposure to total particulate matter from commercial cigarettes | |
| CN107028956A (zh) | 一种治疗经期抑郁症的药物组合物 | |
| KR102322102B1 (ko) | 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 | |
| CN112245433B (zh) | 依克多因类物质在制备防治缺血性脑卒中药物中的应用 | |
| CN106727916A (zh) | 罗勒多糖提取物在制备治疗肺纤维化药物中的应用 | |
| CN106924240A (zh) | 包含槲皮素的药物组合物及其用途 | |
| CN113262222A (zh) | 葫芦巴碱在制备预防和/或治疗糖尿病心肌病药物中的用途 | |
| Datri et al. | Scholars Academic Journal of Pharmacy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: ENBIPU PHARMACY CO., LTD., SHIYAO GROUP. Free format text: FORMER OWNER: NIU FENG Effective date: 20130628 Free format text: FORMER OWNER: GUO HAIBO Effective date: 20130628 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20130628 Address after: 052160 No. 88 economic and Technological Development Zone, Hebei, Shijiazhuang Applicant after: Enbipu Pharmacy Co., Ltd., Shiyao Group. Address before: 052160 No. 88, Yangzi Road, Shijiazhuang economic and Technological Development Zone, Hebei Applicant before: Niu Feng Applicant before: Guo Haibo |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |