CN108689974A - 一种化合物、包含该化合物的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种化合物、包含该化合物的组合物及其用途，还涉及该类化合物在制备用于治疗和预防缺血性脑卒中、治疗和预防肌萎缩侧索硬化药物中的应用。

Description

一种化合物、包含该化合物的组合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种化合物、包含该化合物的组合物及其用途，还涉及该类化合物在制备用于治疗和预防缺血性脑卒中、治疗和预防肌萎缩侧索硬化药物中的应用。
背景技术
缺血性脑卒中是由于各种因素诱发血栓形成所导致的缺血性损伤的疾病，该类疾病给病人带来极大的痛苦甚至生命危险。目前，该类药物的研究一直是药物研究开发的热点和前沿。
肌萎缩侧索硬化(ALS)也叫运动神经元病(MND)，或夏科(Charcot)病，或卢伽雷(Lou Gehrig)病。它是上运动神经元和下运动神经元损伤之后，导致包括球部(所谓球部，就是指的是延髓支配的这部分肌肉)、四肢、躯干、胸部腹部的肌肉逐渐无力和萎缩。肌萎缩侧索硬化是一种非常危险的致命性运动神经元变性疾病。目前尚无有效的预防或治疗ALS疾病的药物。为人类健康，该类药物的研究也是是药物研究开发的热点和前沿之一。
发明内容
本发明的发明人在研制新的心脑血管类药物的过程中，意外地发现一类新化合物，该类化合物出人意料地具有优异的心脑血管活性和肌萎缩侧索硬化活性。
为了完成本发明的目的，本发明提供一种化合物、包含该化合物的组合物及其用途，经过动物实验发现，该类新化合物在脑缺血性疾病及改善心脑循环障碍、抗血栓动物实验中，效果显著。同时，该类化合物在肌萎缩侧索硬化治疗领域有着优异的药理活性
现有技术中未见对该类化合物的报道。
一种化合物，该化合物为通式1的化合物，或其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型，其结构通式如下:
通式1：
其中R1为氢、卤素、羟基、甲氧基、硝基、氨基、烷基、酰胺或羧基；
R2为C1-C8亚烷基；
R3为-COOH、-NR4R；
R4、R5各自独立地为氢、C1-C8烷基；或者R4、R5相连以形成3-7元杂烷基。
进一步的，上述化合物，或其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型：所述化合物为：
M1：
M2：
M3：
M4：
M5：
M6：
M7：
M8
或
M9
本发明阐述了上述新化合物在制备用于治疗和预防缺血性脑卒中、治疗和预防肌萎缩侧索硬化药物中的应用。
本发明还阐述了一种组合物，其包含上述的新化合物，或其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型；和一种或多种选自下列其他治疗活性剂：莰醇或其立体异构体、莰醇衍生物及其盐或其立体异构体及其盐、依达拉奉、依达拉奉衍生物及其盐或其立体异构体及其盐、甲钴胺、腺苷钴胺、羟钴胺、牛磺酸、牛磺酸盐。
进一步的，所述的其他治疗活性剂中莰醇为2-莰醇为(±)-2-莰醇、(+)-2-莰醇或(-)-2-莰醇。
进一步的，所述的其他治疗活性剂中莰醇衍生物包括如下化合物中的一种或几种：
N1：
N2：
N3：
N4：
进一步的，所述的其他治疗活性剂中依达拉奉衍生物包括如下化合物：
H1:
和/或
H2:
所述的组合物，在制备用于治疗和预防缺血性脑卒中、治疗和预防肌萎缩侧索硬化药物中的应用。
在动物药效模型试验中，本发明的化合物对大脑中动脉阻塞引起的脑组织损伤显示出优异的保护作用，表现在可使大脑中动脉血栓模型大鼠的神经症状明显改善，梗塞面积明显减少，并能明显抑制大鼠动-静脉旁路血栓形成，说明本发明化合物可有效抑制血栓形成，对心脑缺血性疾病具有较好的预防和治疗作用。
此外动物试验还说明，本发明的化合物对预防和治疗肌萎缩侧索硬化有良好的效果。
M1的合成：
M8的合成：
M8的合成：
以上本发明各结构通式、结构式以及合成方法的详细描述，不应被认为是对本发明的限制。
具体实施方式
下面以实施例的方式对本发明做进一步的详细说明，给出本发明的实施细节，但是不应被认为是对本发明的限制。
实施例1：对大脑中动脉血栓模型(Middle Cerebral Artery Thrombosis，MCAT)大鼠神经症状及脑梗塞范围的影响。
一、动物
SD大鼠，雌雄各半，体重190～250g。
二、药物与试剂
受试药
M1、N2
试剂
FeCl3*6H20(A.R.)，用lmol/L盐酸配制；红四氮唑(TTC)，(C.P.)。
三、仪器
XTT实体显微镜；恒温水浴振荡器；电子分析天平。
四、试验方法及结果
(一)对MCAT大鼠神经症状的影响
1、分组见表1
表1
表1
2、给药：造模前预防给药，每天灌胃给药1次，连续给药3天，第4天造模，造模后即刻灌胃给予一天剂量。造模后12小时再灌胃给予一天剂量，对照组给予等量溶媒。
3、实施造模手术：大鼠腹腔注射12％水合氯醛溶液(350mg/kg)麻醉。将大鼠右侧卧位固定，在眼外眦和外耳道连线中点作一弧形切口，长约1.5cm，夹断颞肌并切去，暴露颞骨，用牙科钻在颧骨与颞鳞骨接合处向口侧1mm处作一直径为2.5mm的骨窗，清理残渣，暴露大脑中动脉(位于嗅束及大脑下静脉之间)。将吸有50％氯化铁溶液(lmol/L盐酸)10ul的小片定量滤纸敷在此段大脑中动脉上，约30miri待血管颜色变黑后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。
4、行为检测：在术后不同时间点(6h，24h)对动物进行行为评分。(1)提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分；如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘的屈曲又有内旋者，记为1分。(2)将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力记为0分；如向手术对侧推动时阻力下降者，记为1分。(3)将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分；手术对侧前肢肌张力下降记为1分。(4)提鼠尾离开地面约一尺，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分，否则记为0分。根据以上标准评分，满分为4分，分数越高，动物的行为障碍越严重。
结果显示，假手术组未见行为异常改变，模型组大鼠在术后6h、24h均出现偏瘫样症状，主要表现为手术对侧前肢内收，肩内旋，前肢肌张力降低，肩抗力下降。与模型组相比，各给药组大鼠在术后24h的神经症状均显著改善，并有明显的量效关系。
(二)对MCAT大鼠脑梗塞范围的影响
动物经末次行为评分后，断头取脑。去掉嗅球、小脑和低位脑干，剩余部份在4℃以下冠状切成5片。迅速将脑片置于TTC染液中(每5ml染液中含4％TTC1.5ml，1MK2HPO40.1ml)，37℃避光温孵30分钟，再取出，置于10％甲醛液中避光保存。经染色后非缺血区为玫瑰红色，梗塞区为白色。将白色组织仔细挖下称重，以梗塞组织重量占总脑重量的百分比作为脑梗塞范围。
结果显示，术后24h除假手术组无梗塞灶外，模型组和给药组大鼠均有不同程度的梗塞灶。与模型组相比，M1各给药组大鼠对缺血性脑损伤引起的脑组织梗塞症状有明显改善作用，并有明显的量效关系；N2各给药组大鼠对缺血性脑损伤引起的脑组织梗塞症状均有所改善，但不明显；M1+N2各给药组大鼠均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系。
实施例2：对大鼠动一静脉旁路血栓形成的影响本实施例选用：
一、动物
SD大鼠，雌雄各半，体重190～250g。
二、药物与试剂
受试药
M1
三、仪器
AEG-220型电子分析天平；Df-206型鼓风干燥箱。
四、试验方法与结果
1、分组见表2
表2
2、给药
每天灌胃给药1次，连续给药3天，血栓模型组给予等量溶媒。末次给药后即进行手术。
3、造模方法
将大鼠腹腔注射10％水合氯醛0.35ml/100g麻醉，仰卧位固定，手术，分离右颈总动脉和左颈外静脉。在10cm长的聚乙烯管中段放入一根事先称重的长8cm的0号手术线，以生理盐水溶液充满，两端联结长约3cm充满生理盐水的插管。该管的一端插入左颈外静脉后，另一端插入右颈总动脉。血液从右侧颈总动脉流至聚乙烯管内，再返流入左颈外静脉，构成环路血流。lOmin后中断血流，迅速取出血栓称重，该重量减去丝线重、纸重即血栓湿重；放入烘箱中60℃干燥24h，取出血栓称重，该重量减去丝线重、纸重即血栓干重。
结果显示，与血栓模型组相比，M1各给药组大鼠的血栓湿重和干重均显著减少，并有明显的量效关系；N2各给药组大鼠改善不明显；M1+N2各给药组大鼠均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系。
试验例3：对东莨菪碱致痴呆小鼠学习和记忆行为的影响：
一、材料
SPF级KM小鼠，雄性，18-22克。
0.9％生理盐水注射液。
二、分组见表3
表3
三、给药
小鼠分别静脉给予上述药物，连续给药14天。假手术组同等条件下给予0.9％生理盐水。
四、对小鼠跳台反应的影响
小鼠末次给药前2天每天1次进行跳台反应训练。训练时，将待测小鼠放入跳台仪中，适应环境5min。然后向底部栅板通电，记录小鼠跳下高台的时间(潜伏时间)和5min内小鼠由高台跳下受到电击的次数(重测期错误次数)。以小鼠学会遇电刺激时可以正确逃避至平台上为指标。末次给药30min后除空白对照组腹腔注射0.9％生理盐水注射液外，其余各组分别注射5mg/kg的东莨菪碱注射液，30min后进行正式测验，记录小鼠潜伏时间和5min内重测期错误次数。
五、统计方法
数据处理数据由SPSS11.5统计软件进行方差分析及组间检验。
六、实验结果
结果显示，东莨菪碱模型组与空白对照组相比，小鼠逃避潜伏期明显缩短，错误次数明显增加(P〈0.01)，说明小鼠记忆障碍模型成功建立。与模型组相比，M1各剂量给药组潜伏期均有不同程度的延长，错误次数也明显减少，均具有统计学差异；N2各给药组不明显；M1+N2各给药组均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系及统计学差异。
试验例4：对小鼠脑缺血再灌注后学习和记忆行为的影响：
一、材料
SPF级KM小鼠，雄性，18-22克。
0.9％生理盐水。
二、实验方法
小鼠脑缺血再灌注损伤模型的制作：小鼠ip(腹腔注射)4％水合氯醛0.4g/kg麻醉，颈正中切开皮肤，钝性分离双侧颈总动脉，双侧颈总动脉下穿“4-0”手术丝线，悬吊至双侧颈总动脉血流完全阻断，lh后抽出丝线使其血流再灌注。假手术组亦下穿丝线但不悬吊阻断血流，lh后也抽出丝线。而后所有小鼠缝合皮肤，回笼饲养。
三、分组见表4
表4
四、给药
每日一次，从手术当天开始，连续灌胃给药21天。假手术组同等条件下给予0.9％生理盐水。
五、对小鼠跳台反应的影响
小鼠末次给药前2天，于给药后30min进行跳台反应训练。训练时，将待测小鼠放入跳台仪中，适应环境5min。然后向底部栅板通电，记录小鼠跳下高台的时间(潜伏时间)和5min内小鼠由高台跳下受到电击的次数(重测期错误次数)。以小鼠学会遇电刺激时可以正确逃避至平台上为指标。末次给药lh后进行正式测验，记录小鼠潜伏时间和5min内重测期错误次数。
六、统计方法
数据处理数据由SPSS11.5统计软件进行方差分析及组间检验。
七、实验结果
结果显示，模型组小鼠的各项指标均与假手术组有极显著性差异(P<0.01)，说明此模型成功。与模型组相比，M1各剂量给药组组潜伏期均有不同程度的延长，错误次数也明显减少，有明显的量效关系，均具有统计学差异。相比之下N2各给药组改善不明显；M1+N2各给药组均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系及统计学差异。
试验例5:观察M1对ALS小鼠发病时间和生存期、运动功能的影响
动物分组和给药
给药组分9个组(M1组：20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg；N2组：2mg/kg，4mg/kg，8mg/kg；M1+N2组：20mg/kg+2mg/kg，40mg/kg+4mg/kg，80mg/kg+8mg/kg。)S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始每天灌胃给药，直至死亡；
溶剂对照组：S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃；
正常对照组：野生型同窝S0D1-G93A阴性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃。
每组12只小鼠。
每天观察所有S0D1-G93A转基因鼠的精神状态、病情进展、存活情况。
发病的评判
连续2天观察出现肢体震颤和(或)肢体无力即判为发病死亡时间：将鼠置为仰卧位，30秒内不能翻身为俯卧位即判断死亡。
转棒实验
转棒实验可以评价运动的协调性、力量和平衡能力。实验鼠放置于直径3.5cm的转棒仪上，转速调至16rpm，记录坠落的最长潜伏期，以180秒为分界值，超过180秒按180秒记录，不足180秒按实际时间记录。小鼠运动能力的评测从70天开始，小鼠先8rpm练习5天使之习惯运动并获得一个基础运动值。每次实验重复3次并取其最好成绩记录，每只实验鼠每周测定2次。
悬线实验
主要评价小鼠的抓握力量。将实验鼠置于传统用的鼠笼盖上，轻轻震动鼠笼盖促使实验鼠紧握鼠笼盖，随后迅速翻转鼠笼盖，记录后肢离开笼盖的最长潜伏期，以90秒为分界值，超过90秒按90秒记录，不足90秒按实际时间记录。每次实验重复3次并取其最好成绩记录，每只实验鼠每周测定2次。
悬尾实验
悬吊鼠尾，观察后肢的伸展及其弯腰情况，并予评分：2分代表正常；1分代表部分正常；0分代表缺失。
本发明人通过检测发病晚期小鼠的翻正反射确定小鼠的临床死亡时间，经统计分析发现，M1各组小鼠的平均生存期比溶剂对照组均有明显延长，并有明显的量效关系。结果说明，M1有效延缓S0D1-G93A转基因小鼠的发病时间，延长小鼠生存期，并有明显的量效关系。
与血栓模型组相比，各给药组大鼠的血栓湿重和干重均显著减少，并有明显的量效关系。
本发明人采用了Rotarod转棒仪、悬线实验、悬尾实验来检测小鼠的运动功能。ALS小鼠发病3周体重明显下降，M1各组小鼠体重的降低被明显延缓并有明显的量效关系。野生型小鼠始终能在最好的水平完成转棒和悬线实验。ALS小鼠发病后转棒实验和悬线实验的潜伏期逐渐缩短，在发病5周左右不能维持实验，M1各组小鼠运动功能评分的减低被明显延缓，并有明显的量效关系；相比之下N2各给药组改善不明显；M1+N2各给药组均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系。
试验例6：ALS转基因鼠的电生理学检测
给药组分9个组(M1组：20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg；N2组：2mg/kg，4mg/kg，8mg/kg；M1+N2组：20mg/kg+2mg/kg，40mg/kg+4mg/kg，80mg/kg+8mg/kg。)S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始每天灌胃给药，直至死亡；
溶剂对照组：S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃；
正常对照组：野生型同窝S0D1-G93A阴性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃。
每组12只小鼠。
自发电位
实验鼠经10％水合氯醛麻醉，同心针电极插入后肢腓肠肌肌腹中，观察有无纤颤电位和(或)正锐波。
复合肌肉动作电位(CMAP)的记录
实验鼠经10％水合氯醛麻醉，刺激腰段脊旁坐骨神经，记录电极插入后肢腓肠肌肌腹中。给予超强刺激，得CMAP并记录，测量峰峰值表示CMAP波幅，并记录远端运动潜伏期(DML)。
运动单位数量(MUNE)评估
参照“统计学方法技术”的原理，实验鼠经10％水合氯醛麻醉，刺激腰段脊旁坐骨神经，记录电极插入后肢腓肠肌肌腹中。调整电极位置，以最小刺激强度获得最大复合肌肉动作电位(CMAP)：并获得刺激反应功能曲线，保证起始部分和终止部分所包含的2～4个反应点位于同一水平，根据刺激反应功能曲线确定采样区间。首先选择曲线中相邻2个反应点间波幅差距最大的部分，作为第1个采样区间；选择曲线中相邻2个反应点间波幅差距次大的部分，作为第2个采样区间；选择曲线上相邻2个反应点间波幅差距，第3大的部分，作为第3个采样区间；最后选择曲线中相邻2个反应点间波幅差距最小的部分；作为第4个采样区间。调整刺激强度，使所获得的反应点均落于采样区间内，然后进行采样，采样时保证同一采样区间内至少存在连续且规律出现的两种类型的反应点，否则应扩大采样区间的范围，直至满足采样条件。同一采样区间可重复采样2～10次结束某一采样区间采样的条件为：所得运动单位电位波幅的标准差小于均数的10％，采样点直方图近似正态分布或略呈负性偏态分布。结束某一采样区间的采样后，可获得该区间的采样范围和运动单位数目估计测值。重复上述采样步骤，对下一个选定的采样区间进行检测，直至完成全部4个采样区间的采样最终获得复合肌肉动作电位波幅和运动单位数目。
复合肌肉动作电位(CMAP)波幅的大小主要反应了周围神经轴索的功能。运动单位数目的估计(MUNE)反应了有功能的运动单位的多少。
结果发现与正常对照组的小鼠比较ALS转基因鼠均有正锐波和纤颤电位，CMAP波幅和MUNE均明显下降。M1各组较溶剂对照组的CMAP波幅明显改善，并有明显的量效关系。MUNE明显改善，并有明显的量效关系；相比之下N2各给药组改善不明显；M1+N2各给药组均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系。
试验例7：ALS鼠腰段脊髓前角的病理学检测：脊髓组织学和运动神经元计数
动物分组和给药
给药组分9个组(M1组：20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg；N2组：2mg/kg，4mg/kg，8mg/kg；M1+N2组：20mg/kg+2mg/kg，40mg/kg+4mg/kg，80mg/kg+8mg/kg。)S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始每天灌胃给药，直至死亡；
溶剂对照组：S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃；
正常对照组：野生型同窝S0D1-G93A阴性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃。
每组12只小鼠。
导致S0D1-G93A转基因小鼠发生疾病的直接因素为脊髓前角运动神经元退行性变。尼氏染色可以表示出运动神经元的胞体及其胞核的状态。本发明人采用尼氏染色方法观察了小鼠脊髓前角神经元。
实验鼠10％水合氯醛深度麻醉后，用4℃生理盐水进行心脏灌注后，一部分脊髓(L4～L5段)用于组织病理学分析和免疫组化分析。脊髓取出后，浸泡于4％的多聚甲醛中4℃过夜，随后用10％，20％，30％的蔗糖溶液4℃分别处理24小时。另一部分脊髓(C1～L3段)用于western blot检测，其取出后迅速置于液氮中，80℃冰箱保存。脊髓(L4～L5)段经上述处理后，石蜡包埋，脊髓连续切片的厚度为6μm，切片贴到多聚赖氨酸处理的载玻片上。为了计数运动神经元，脊髓L4-L5段连续切片200张，每7张取1张做尼氏染色。处理好的切片用显微镜明视野拍照后，计数。
计数的标准
计数的目的神经元所在的区域为脊髓前角部分，中央管以上的部分；运动神经元的直径在20μm以上；运动神经元有明显的细胞核。
Nissl染色的具体步骤如下：
1、二甲苯脱蜡10分钟*2次；
2、依次通过无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精；
3、蒸馏水冲洗5分钟*1次；
4、切片入焦油紫工作液染色30分钟；
5、切片入蒸馏水洗去浮色；
6、切片入70％酒精、80％酒精、95％酒精分色；1分钟；镜下观察尼氏体颗粒清晰；
7、切片入特殊分色液中退背景；100％酒精：乙醚：氯仿＝1:1:1；
8、切片入无水酒精脱水，二甲苯I、二甲苯II透明，中性树胶封片。
通过对各组转基因小鼠脊髓(L4～L5段)组织切片，尼氏染色，显微镜观察和计数，发现与正常对照组小鼠对比，发病中期S0D1-G93A转基因小鼠脊髓前角运动神经元数目明显下降，而M1各组可以有效保护脊髓前角运动神经元，使小鼠脊髓前角运动神经元的存活的数目明显增多，并有明显的量效关系。说明M1减少了脊髓运动神经元退行性病变；相比之下N2各给药组改善不明显；M1+N2各给药组均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系。
形态学、组织学观察结果显示：S0D1-G93A转基因小鼠的发病症状与ALS患者的临床表现十分相似，表现为渐进性的肌无力，肌萎缩，直至瘫痪和死亡，病理改变时脊髓前角运动神经元选择性丢失。转基因鼠发病后逐渐出现双侧后肢的无力、瘫痪以致萎缩，M1各组小鼠病理改变一定程度改善。M1+N2各给药组均明显优于M1各相应给药组，改善明显并有的量效关系。
试验例8:M1对ALS转基因小鼠神经保护作用的机制
动物分组和给药
给药组分9个组(M1组：20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg；N2组：2mg/kg，4mg/kg，8mg/kg；M1+N2组：20mg/kg+2mg/kg，40mg/kg+4mg/kg，80mg/kg+8mg/kg。)S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始每天灌胃给药，直至死亡；
溶剂对照组：S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃；
正常对照组：野生型同窝S0D1-G93A阴性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃。
每组12只小鼠。
炎症反应在ALS病情的发生和发展中扮演重要的角色，胶质细胞的激活是S0D1-G93A转基因小鼠体内炎症反应的检测指标之一。本发明人使用CD11b和GFAP作为标记分别观察了转基因小鼠脊髓前角小胶质细胞和星形胶质细胞的形态。
本发明分别用CD11b和GFAP来检测脊髓切片(L4～L5段)来评估小胶质细胞和星形胶质细胞活化情况，研究M1对S0D1-G93A转基因鼠胶质细胞激活的影响。
免荧光染色的具体步骤如下：
1、二甲苯脱蜡10minX2次；
2、依次通过无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精；
3、蒸馏水冲洗5分钟*1次；
4、抗原修复：枸橼酸盐缓冲液(pH＝6.0)高压修复；
5、冷却至室温，蒸馏水冲洗2分钟*3次，甩干；
6、3％过氧化氢室温孵育10分钟，甩干；
7、0.Olmmol/LPBS冲洗5分钟*3次；
8、置于湿盒中，荧光笔画圈，3％胎牛血清室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗；
9、加入一抗GFAP(1：800)，CD11b(1：100)30μl 4℃过夜，阴性对照加入抗体稀释液；
10、取出湿盒，室温中静置30分钟，使其恢复室温；0.01mmol/LPBS冲洗5分钟*3次；
11、分别滴加FITC标记的山羊抗大鼠IgG(1：100)，TRITC标记的山羊抗兔IgG(1：100)室温孵育60分钟，PBS洗涤5分钟*3；
12、甘油缓冲液封片后，荧光显微镜下观察。
结果发现，在野生型小鼠，小胶质细胞为分枝状，细胞体较小，显示为静息状态的小胶质细胞。在ALS小鼠，小胶质细胞CDllb表达增强，细胞突起增粗、缩短，并向病变神经元迁移，在运动神经元周围则呈圆形的巨噬细胞样形态，显示为充分活化的小胶质细胞。与溶剂对照组相比，M1各组均能能够明显减轻小胶质细胞的活化，并有明显的量效关系。另外，GFAP免疫荧光染色显示ALS小鼠星形胶质细胞免疫学标志GFAP上调，细胞增大。与溶剂对照组相比，M1各组能够明显减轻星形胶质细胞反应，并有明显的量效关系。说明M1抑制了转基因小鼠脊髓胶质细胞的激活；相比之下N2各给药组改善不明显；M1+N2各给药组均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系。
试验例9:M1对S0D1-G93A转基因鼠iN0S、NF-k Bp65蛋白表达的影响
动物分组和给药
给药组分9个组(M1组：20mg/kg，40mg/kg，80mg/kg；N2组：2mg/kg，4mg/kg，8mg/kg；M1+N2组：20mg/kg+2mg/kg，40mg/kg+4mg/kg，80mg/kg+8mg/kg。)S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始每天灌胃给药，直至死亡；
溶剂对照组：S0D1-G93A阳性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃；
正常对照组：野生型同窝S0D1-G93A阴性鼠日龄90日即开始予同重量的花生油灌胃。
每组12只小鼠。
炎症在ALS的发生和发展中起了非常重要的作用。本发明采用western blot检测了炎症相关指标iN0S、NF-K Bp65蛋白的表达。
脊髓(C1～L3段)标本从—80℃冰箱中取出后，置于RIPA裂解液中，超声破碎1分钟，12000rpm，4℃离心，15分钟，取上清液。分装后保存于-80℃冰箱备用。SDS-PAGE电泳，转膜，封闭液，硝酸纤维素膜室温封闭1小时。一抗(iN0S、NF-k Bp65)4℃孵育过夜。二抗，室温孵育1小时。采用化学发光法显影，拍照。
结果发现，与野生型小鼠相比，转基因小鼠iN0S、NF-k Bp65的水平明显升高。M1各组均明显降低了iNOS、NF-k Bp65的水平，并有明显的量效关系，统计结果显示。其差异具有显著性。说明M1明显抑制了ALS转基因小鼠脊髓炎症相关蛋白的水平，减少炎症的发生；相比之下N2各给药组改善不明显；M1+N2各给药组均明显优于M1各相应给药组，并有明显的量效关系。

Claims (8)

1.一种化合物，其特征在于，该化合物为通式1的化合物，或其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型，其结构通式如下:
通式1：
其中R1为氢、卤素、羟基、甲氧基、硝基、氨基、烷基、酰胺或羧基；
R2为C1-C8亚烷基；
R3为-COOH、-NR4R5；
R4、R5各自独立地为氢、C1-C8烷基；或者R4、R5相连以形成3-7元杂烷基。
2.根据权利要求1所述的化合物，或其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型，其特征在于，所述的化合物为：
M1：
M2：
M3：
M4：
M5：
M6：
M7：
M8
或
M9
3.一种包含权利要求1或2所述的化合物的组合物，或其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型；其特征在于，该组合物还包括一种或多种选自下列其他治疗活性剂：莰醇或其立体异构体、莰醇衍生物及其盐或其立体异构体及其盐、依达拉奉、依达拉奉衍生物及其盐或其立体异构体及其盐、甲钴胺、腺苷钴胺、羟钴胺、牛磺酸、牛磺酸盐。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的其他治疗活性剂中的莰醇为2-莰醇为(±)-2-莰醇、(+)-2-莰醇或(-)-2-莰醇。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的其他治疗活性剂中莰醇衍生物包括如下化合物中的一种或几种：
N1：
N2：
N3：
N4：
6.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的其他治疗活性剂中依达拉奉衍生物包括如下化合物：
H1:
和/或
H2:
7.如权利要求3所述的组合物，在制备用于治疗和预防缺血性脑卒中、治疗和预防肌萎缩侧索硬化药物中的应用。
8.权利要求1或2所述的新化合物，或其立体异构体，药学上可接受的盐和/或水合物、溶剂合物或晶型，在制备用于治疗和预防缺血性脑卒中、治疗和预防肌萎缩侧索硬化药物中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2023066162A1 (zh) * 2021-10-18 2023-04-27 苏州沪云新药研发股份有限公司 莰醇在制备治疗缺血性脑卒中的药物中的用途

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