WO2014092496A1 - 탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아민 화합물의 제조방법 - Google Patents

탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아민 화합물의 제조방법 Download PDF

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amino
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신종식
박을수
말릭샤히어
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    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing an optically active amine compound using omega transaminases, and more particularly, a racemic amine or amino acid is divided into optically active amines or amino acids using omega transaminases as a biocatalyst. It relates to a method for producing an optically active amine compound.
  • Chiral is the Greek term for hand, which is likened to the fact that the left and right hands cannot overlap each other.
  • These chiral compounds are optically active (the ability to rotate polarization). In this sense, a drug is classified as a chiral drug when two molecules in the drug are enantiomeric due to a three-dimensional structure that cannot overlap each other.
  • Chiral amines are essential for the manufacture of a number of medications, such as (S) -rivastigmine, a drug for many Alzheimer's diseases, dilevabol, an antihypertensive agent, sitagliptin, an antidiabetic agent, and mexyltine, an antiarrhythmic and antimuscular agent. Because of this pharmaceutical usefulness of chiral amines, optically using biocatalysts such as kinetic splitting, asymmetric synthesis, deacemization, etc., are environmentally friendly alternatives to chemical processes such as selective crystallization or asymmetric catalytic hydrogenation. Research into the preparation of active chiral amines has been actively conducted.
  • chiral amino acids are also important compounds used in various fields such as medicine, food, agriculture and chemical industry. Natural amino acids can be produced simply through fermentation processes, but non-natural amino acids have to be produced using biocatalysts or chemical catalysts.
  • the catalyst used in the production of non-natural amino acids as a chemical catalyst has a problem in that the cost is very expensive, which increases the production cost of the non-natural amino acids. Therefore, a method of producing an unnatural amino acid using a biocatalyst is mainly used.
  • omega transaminases have high conversion rate, excellent enantioselectivity and high stability, and do not require external cofactors, making them an effective biocatalyst for the production of chiral compounds.
  • a method of providing an optically active amine or amino acid by providing ⁇ -keto acid as a substrate as an amino acceptor along with an omega transaminase and deracemicizing a racemic compound by kinetic resolution reaction is obtained.
  • the reason why ⁇ -keto acid is used as the amino acceptor is that conventional low-cost amino receptors, propanal and butanal, have low enantiomeric excess, severely inactivate enzymes, and have chemical toxicity, whereas ⁇ -ketosan Can solve these problems.
  • Korean Patent Publication No. 10-1291586 discloses a method of using a fusion protein of Vitreosila hemoglobin and D-amino acid oxidase, but the separation target is limited to homoalanine.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing an optically active amine compound from racemic amine compounds, more specifically the expensive ⁇ -keto acid as a starting material
  • the present invention provides a method for preparing an amine compound having optical activity from a racemic amine compound having high optical purity while reducing the production cost by using it as a substrate of an omega transaminase by forming an intermediate without use.
  • Method for producing an optically active amino acid according to one feature of the present invention for solving the above problems is characterized in that it comprises the following steps.
  • the method for preparing an optically active amine according to one aspect of the present invention is characterized by comprising the following steps.
  • the threonine diazinase is a step of dilating L- threonine to produce the amino receptor ⁇ -keto acid
  • step 3 The racemic amine provided in step 1) and the ⁇ -keto acid produced in step 2) produce optically active amines through kinetic resolution by (S)-or (R) -selective omega transaminases. step.
  • the (S) -selective omega transaminases are derived from Ochrobactrumanthropi, an enzyme or paragocus encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 1]
  • Deyi is derived from the tripicans ( Paracoctus denitrificans ), may be an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 2].
  • the (R) -selective omega transaminases are derived from Aspergillus terreus , and in the enzyme or Arthrobacter sp . , Encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 3] . As derived, it may be an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 4].
  • the racemic amino acid may be any one or more selected from the group consisting of racemic alanine, racemic serine, racemic homoserine, racemic norvaline, racemic norleucine and racemic leucine.
  • the racemic amine is ⁇ -methylbenzylamine, 4-fluoro- ⁇ -methylbenzylamine, ⁇ -ethylbenzylamine, 1-methyl-3-phenylpropylamine, 1-aminoindane, sec-butylamine, cyclo It may be any one or more selected from the group consisting of phofilethylamine, 2-aminopentane, 2-aminooctane, 1-methoxy-2-propylamine, and alaninol.
  • the present invention also provides an optically active amino acid or an optically active amine prepared by the above method.
  • the expensive ⁇ -keto acid used in the method for preparing the optically active compound using omega transaminase is not provided as a substrate. Since it is not necessary, the production cost of the optically active amine or the optically active amino acid which is the finally obtained optically active amine compound can be greatly reduced.
  • the finally obtained optically active amine compound has high optical purity and can be used for medicines, pesticides and the like.
  • 1 is a graph showing the inactivation of D-amino acid transaminases to L-amino acids.
  • 2 is a graph showing conversion to L-amino acids using isopropylamine as the amino donor.
  • Figure 3 is a graph showing the production amount of L- homoalanine from racemic homoalanine according to an embodiment according to the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the concentration according to the reaction time of the substrate ⁇ -ketoglutarate and isopropylamine and the final product D- glutamate according to an embodiment of the present invention.
  • 5 is a graph comparing the activity of pyruvate and propanal as amino acceptors for omega transaminases.
  • Figure 6 is a graph showing the results of measuring the concentration of (S) and (R) configuration ⁇ -methylbenzylamine according to the reaction time using the (R) -selective omega transaminases according to the present invention.
  • the present inventors have made a research effort to develop a method for producing an optically active amine compound that reduces the production cost, and completed the method for producing an asymmetric optically active amine compound using deracemicization according to the present invention.
  • the method of dividing the optically pure amine compound from the racemic amine compound may be carried out through methods such as kinetic separation, asymmetric synthesis, deacemization (deacemization).
  • the production of optically pure amine compounds through the deracemicization is carried out by reaction of ⁇ -keto acid with (S)-or (R) -selective omega transaminas after deracemicization of the racemic amine compound provided as a substrate.
  • S S-or (R) -selective omega transaminas
  • the present invention allows the production of an expensive ⁇ -keto acid used for optical cleavage of such racemic amine compounds as an intermediate without providing a substrate, thereby lowering the production cost of the optically active amine compound and having high purity optical activity.
  • the invention relates to a method for producing the same.
  • the racemic amine compound of the present invention may be racemic amine or racemic amino acid
  • the optically active amine compound prepared by the method of the present invention may be an amino acid and an amine compound having high optical purity.
  • the production method of the L-amino acid according to the present invention can be prepared as shown in the following [Scheme 1].
  • D-amino acid of racemic amino acid becomes a substrate of D-selective amino acid transamidase, and the amino group of D-amino acid is added to amino receptor by D-selective amino acid transamidase.
  • ⁇ -keto acid can be produced as an intermediate.
  • the ⁇ -keto acid produced as an intermediate receives an amino group from an amino donor by (S) -selective omega transaminase to produce L-amino acid, thereby obtaining L-amino acid, which is the final product to be obtained in the present invention.
  • pure L-amino acids can be obtained by deracemization of racemic amino acids by reaction of D-amino acid transaminases with (S) -selective omega transaminases.
  • the R 1 may be each independently at least one selected from the group consisting of methyl, ethyl, propyl, butyl, hydroxymethyl and hydroxyethyl, wherein R 2 is 2-carboxyethyl, phenyl, phenylmethylyl. Can be.
  • the racemic amino acid in the substance provided as a substrate in step 1) is active against D- or L-selective amino acid transaminases and (S) or (R) -selective omega transaminases, which are substrates provided in the present invention.
  • the genie may be provided as a substrate without particular limitation as long as it is an amino acid, and preferably, any one or more amino acids selected from the group consisting of alanine, serine, homoserine, norvaline, norleucine and leucine.
  • the amino acceptor has activity against the D- or L-selective amino acid transaminases, but also shows activity against the (S)-or (R) -selective omega transaminases.
  • ⁇ -ketoglutarate, phenylglyoxylate, phenylpyruvate may be present as a preferred amino acceptor of the reaction according to the invention as there is no activity for it.
  • the D-amino acid transaminases can be used without particular limitation as long as they actively react with the amino acceptor while enabling deracemicization of racemic amino acids, but are derived from Bacillus sparicus in the present invention. It is preferable to use an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 5].
  • L-amino acid transaminases can be used without particular limitation as long as they actively react with the amino acceptor while enabling deracemicization of racemic amino acids, but in the present invention, it is derived from Escherichia coli ( Escherichiacoli ). It is preferable to use an enzyme encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6].
  • the (S) -selective omega transaminases can be used without particular limitation as long as they react with ⁇ -keto acid to produce L-type amino acids, but are derived from Ochrobactrumanthropi in the present invention. It is preferable to use an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 1] or to use an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 2] as derived from Paragocus dendricus (Paracoccusdenitrificans ).
  • the (R) -selective omega transaminase can be used without particular limitation as long as it reacts with ⁇ -keto acid to produce D-amino acid, but in the present invention is derived from Aspergillus terreus ( Aspergillus terreus ) As an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 3] or Asrobacter sp . ( Arthrobacter sp . ), It is preferable to use an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 4].
  • the method for preparing the optically active amine compound according to the present invention includes the following steps.
  • the threonine diazinase is a step of dilating L- threonine to produce the amino receptor ⁇ -keto acid
  • step 3 producing the optically active amine by the racemic amine provided in step 1) and the ⁇ -keto acid produced in step 2) by (S)-or (R) -selective omega transaminases.
  • the present invention provides racemic amine and L-threonine as a substrate in step 1), wherein the enzyme is threonine diamine and (S)-or (R)-selective.
  • Omega transaminases ((S)-or (R)-selective ⁇ -TA) may be provided.
  • the threonine diminase may produce 2-oxobutyrate by dilating the L-threonine.
  • the 2-oxobutyrate may act as an amino receptor, and thus may be used as an expensive ⁇ -keto acid that is an amino receptor.
  • the 2-oxobutyrate may act as an amino acceptor having a significantly improved effect than the propanal which is conventionally used as another amino acceptor.
  • the (S) -amine in the racemic amine and the step 2) ⁇ -keto acids can produce (R) -amines and L-homoalanines by (S) -selective omega transaminases. This may be produced by performing kinetic resolution of the threonine dianaminase and the (S) -selective omega transamiase through a coupled enzyme reaction.
  • step 1) when (R) -selective omega transaminases are provided in step 1), (R) -amine in the racemic amine in step 3) and ⁇ -keto acid produced in step 2) are (R). It is possible to produce (S) -amines and D-homoalanines by) -selective omega transaminases. This may be produced by performing kinetic resolution of the threonine dianaminase and the (R) -selective omega transaminases through a coupled enzyme reaction.
  • the final product after the reaction may be (R) -amines and ketones and L-homoalanines, which also provides the (R) -selective omega transaminases. If the final product after the reaction may be (S) -amine and ketone and D- homoalanine.
  • the threonine diamine is not particularly limited, but is preferably derived from Escherichia coli , and may be an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 7].
  • the (S) -selective omega transaminases can be used without particular limitation as long as they react with ⁇ -keto acid to produce L-type amino acids, but in the present invention are derived from Ochrobactrumanthropi . It is preferable to use an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 1] or to use an enzyme encoded by the nucleotide sequence of [SEQ ID NO: 2] as derived from Paragocus desequipans (Paracoccus denitrificans) .
  • the (R) -selective omega transaminase can be used without particular limitation as long as it reacts with ⁇ -keto acid to produce D-amino acid, but in the present invention is derived from Aspergillus terreus ( Aspergillus terreus ) As an enzyme derived from the base sequence of [SEQ ID NO: 3] or Asrobacter sp . (Arthrobacter sp .) , It is preferable to use an enzyme encoded by the base sequence of [SEQ ID NO: 4].
  • Ochrobactrumanthropi was incubated for 12 hours at 37 ° C. in LB-broth (peptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, pH 7) from single colony ( Genes expressing S) -selective omega transaminases were synthesized and obtained by amplification by PCR using DNA primers. The obtained DNA fragment was inserted into the expression vector DNA pET28a (+) using Nde1, Xho1 restriction enzyme and ligase. The primers used are shown in Table 1 below.
  • D-amino acid transaminase gene sequence (NCBI gene ID: 849138) derived from Bacillus sphaericus (NCBI gene ID: 849138) was synthesized in the pGEM-T vector to express a gene expressing D-amino acid transaminase from the plasmid using a synthetic DNA primer. Obtained by amplification by PCR method. The obtained DNA fragment was cloned into the expression vector DNA pET28a (+) using Nco1 and Xho1 restriction enzymes. The primers used at this time are shown in Table 4 below.
  • an L-branched chain amino acid transamiase gene was synthesized into a pGEM-T vector to express a L-branched chain amino acid transamiase from a plasmid using a synthetic DNA primer. Obtained by amplification by PCR method. The obtained DNA fragment was cloned into the expression vector DNA pET28a (+) using Nco1 and Xho1 restriction enzymes.
  • E. coli BL21 (DE3) was transformed using the plasmids obtained in Examples 1-6 above. After incubation in 300 mL of LB-boros containing kanamycin, IPTG (final concentration 1 mM) was added at a suspension (OD) of 0.5. After culturing at 37 ° C. for 6 hours or more, centrifuged at 4 ° C. at 10000 ⁇ g for 20 minutes to obtain bacterial cells, and 15 mL suspension suspension (50 Mm Tris-HCl, 50 mM calcium chloride, 1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 0.1 mM PMSF, 20 ⁇ M PLP, pH 7).
  • 1 unit of the (S)-or (R) -selective omega transaminase activity purified in Examples 1 to 3 was measured for 1 minute in 20 mM pyruvate, 20 mM (S) - ⁇ -methylbenzylamine. ⁇ mole of acetophenone is produced.
  • 1 unit of D- or L-selective transamiase activity purified in Examples 4 and 5 means that 1 ⁇ mole of pyruvate is generated for 1 minute in 20 mM D-alanine and 2-oxobutyrate.
  • 1 unit of threonine diminase activity purified in Example 6 means that 1 ⁇ mole of 2-oxobutyrate is produced for 1 minute in 0.1 mM PLP and 50 mM L-threonine.
  • HPLC for acetophenone for (S)-or (R) -selective omega transaminases, pyruvate for D- or L-selective amino acid transaminases, and pyruvate for threonine diamines The case was measured using 2-oxobutyrate.
  • Chiral amines and amino acids were derivatized with GITC and Marfey reagents and analyzed by liquid chromatography (HPLC) in order to obtain concentration analysis and optical purity (ee).
  • General GITC derivatization was performed by mixing the reaction sample (amine or amino acid of 0.5 mM or less) with the derivatization solution (1.5 mM GITC, 1.5 mM triethylamine in acetonitrile) in a 1: 1 manner and reacting at room temperature for 35 minutes or more. . Then analyzed using C18 column and HPLC. The flow rate is 1 ml / min and analyzed using a UV meter at 254 nm.
  • ⁇ -methylbenzylamine is 1a
  • 4-fluoro- ⁇ -methylbenzylamine is 1b
  • ⁇ -ethylbenzylamine is 1c
  • 1-methyl-3-phenylpropylamine is 1d
  • 1 -Aminoindan to 1e sec-butylamine to 1f
  • cyclophoroethylethylamine to 1g
  • 2-aminopentane to 1h
  • 2-aminooctane to 1i
  • the amine is 1j and the alaninol is 1k, respectively.
  • A Methanol (0.1% TFA)
  • B TDW (0.1% TFA)
  • the reaction was carried out using D-amino acid transaminas purified in Example 7 as a substrate with various keto acids and D-alanine or D-homoalanine shown in the following [Table 7].
  • the reaction by 0.1 U / ml of D-amino acid transaminase at 20 mM keto acid, 20 mM D-alanine or D- homoalanine and 50 mM potassium phosphate (pH 7) was carried out at 37 ° C. for 10 minutes and the resulting ketone The amount of acid produced (pyruvate or 2-oxobutyrate) was measured.
  • D-amino acid transaminases are 2-oxobutyrate, ⁇ -hydroxypyruvate, mercaptopyruvate, fluoropyruvate, 3-methyl-2-oxobutyrate, 2-oxopetanoate, 4-methyl It was confirmed that activity is present for keto acids such as -2 oxopentanoate, 2-ketohexanoate, ⁇ -ketoglutarate, phenylpyruvate, pyruvate, and the results are shown in Table 7 and Table. 8 is shown.
  • reaction was carried out using a substrate of 50 mM racemic amino acid, 35 mM ⁇ -ketoglutarate or phenylglyoxylate or phenylpyruvate, 35 mM isopropylamine.
  • substrate and product were measured by reaction time, and D-amino acid and L-amino acid were analyzed for homoalanine, serine, homoserine, norvaline, leucine and norleucine.
  • the experiment was performed to confirm the production of D-amino acid from high concentration racemic amino acids using L-type branched chain amino acid transaminases and (R) -selective omega transaminases purified in Example 7.
  • the (R) -selective omega transamise coupling reaction was carried out at 37 ° C.
  • the reaction was carried out using racemic ⁇ -methylbenzylamine and pyruvate or propanal as substrates using (S) -selective omega transaminases purified in Example 7.
  • the amount of ⁇ -methylbenzylamine was measured by dividing the mixture into (S) - ⁇ -methylbenzylamine and (R) - ⁇ -methylbenzylamine with time, and the optical purity thereof was obtained.
  • the substrate specificity for the amine of (S) -selective omega transaminases derived from O. anthropi purified in Example 7 was investigated.
  • the concentration of each enzyme was varied as shown in Table 14 to perform a coupled enzyme reaction.
  • the reaction was carried out at 100 mM racemic ⁇ -methylbenzylamine, 60 mM L-threonine, 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate buffer pH 7.5, 37 ° C. for 2.5 hours.
  • the optical purity was 28%, 65%, 90 when the concentration of threonine diamines was fixed at 9U / ml and the concentration of omega transaminases was increased to 1.25U / ml, 2.50U / ml, and 3.75U / ml.
  • ⁇ -TA Omega transaminases
  • TD threonine diamines
  • a concentration measured by standard calibration measured in HPLC analysis of GITC derivatives
  • b measured by HPLC analysis of GITC derivatives
  • ⁇ -keto acid is formed as a reaction intermediate, it is not necessary to use expensive ⁇ -keto acid as a reaction starting material, and the optically active amine compound prepared by the method of the present invention Since the optical purity is more than 99%, it can be widely used in medicine, pesticide industry, etc. requiring a chiral compound.

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Abstract

본 발명은 광학 활성을 가지는 아미노산 및 아민의 제조방법에 관한 것이다. 두 제조방법 모두 α-케토산이 반응 중간체로 형성되기 때문에 오메가 트랜스아미네이즈에 의한 키네틱 레졸루션 수행시 고가의 α-케토산을 출발 물질로 사용하지 않고도 라세믹 아민 화합물인 라세믹 아미노산 또는 라세믹 아민을 광학적으로 분리할 수 있어 생산비용을 크게 낮출 수 있을 뿐만 아니라 생성된 광학 활성 아민 화합물은 높은 광학적 순도를 가진다.

Description

탈라세믹화를 이용한 광학 활성 아민 화합물의 제조방법
본 발명은 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 라세믹 아민 또는 아미노산을 오메가 트랜스아미네이즈를 생체 촉매로 사용하여 광학 활성 아민 또는 아미노산으로 분할하는 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
키랄(Chiral)이란 왼손과 오른손이 서로 겹칠 수 없는 거울상의 관계에 있음에 비유된 그리스어로 '손'을 의미하며 이러한 키랄 화합물은 광학 활성(편광을 회전시키는 능력)이 있다. 이러한 의미로 의약품 중에서 어떤 두 분자가 서로 겹칠 수 없는 3차원적 구조에 기인하여 거울상 이성질체의 관계에 있을 때,'키랄의약품'으로 분류한다. 현재 순수한 키랄 화합물의 생산에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이중 키랄 아민 또는 키랄 아미노산은 제약, 농약 및 화학산업에서 중요한 역할을 한다.
키랄 아민은 여러 알츠하이머 병의 치료제인 (S)-리바스티그민, 항고혈압제인 딜레바볼, 항당뇨병제인 시타글립틴, 항부정맥제이자 항근경직제인 멕실레틴과 같은 다수의 의약품 제조에 반드시 필요하다. 키랄 아민의 이러한 약제학적 유용성 때문에, 선택적 결정화나 비대칭적 촉매수소화와 같은 화학공정에 대한 친환경적인 대안으로서 동역학적 분할, 비대칭 합성(asymmetric synthesis), 탈라세믹화(deracemization) 등과 같은 생체촉매를 이용한 광학 활성 키랄 아민의 제조에 대한 연구가 활발히 진행되었다.
또한, 키랄 아미노산 역시 의약, 식품, 농업 및 화학산업 등 다양한 분야에 사용되는 중요한 화합물이다. 천연 아미노산의 경우에는 발효 공정 등을 통해 간단히 생산할 수 있지만 비천연 아미노산의 경우에는 생체 촉매 또는 화학촉매를 이용하여 생산할 수 밖에 없다. 비천연 아미노산을 화학촉매로 생산하는 경우에 사용되는 촉매는 그 비용이 매우 고가여서 비천연 아미노산의 생산 단가를 높이는 요인이 되는 문제점이 있다. 따라서 생체 촉매를 이용하여 비천연아미노산을 생산하는 방법이 주로 사용된다.
한편, 오메가 트랜스아미네이즈는 높은 전환율, 우수한 거울상 선택성과 높은 안정성을 가지며, 외부 보조인자를 요하지 않아 키랄 화합물의 생산에 효과적인 생체 촉매로 각광 받고 있다. 특히 오메가 트랜스아미네이즈와 함께 아미노 수용체로서 α-케토산을 기질로 제공하고 라세믹 화합물을 키네틱레졸루션 반응시켜 탈라세믹화하여 광학 활성 아민 또는 아미노산을 수득하는 방법이 부각되고 있다. 이때 아미노 수용체로서 α-케토산을 사용하는 이유는 기존의 저가의 아미노 수용체인 프로판알 및 부탄알은 거울상체의 잉여율이 낮고, 효소를 심하게 비활성화시키며, 화학독성을 가짐에 반해 α-케토산은 이러한 문제들의 해결이 가능하다. 다만 α-케토산이 이러한 문제들을 해결할 수 있다고 하여도, 그 단가가 지나치게 높기 때문에 이를 통한 최종 광학 활성 화합물의 생산 단가도 그만큼 높아질 수 밖에 없다는 문제점이 있다. 이를 해결하기 위해 한국등록특허공보 제10-1291586호는 비트레오실라 헤모글로빈과 D-아미노산 옥시다아제의 융합단백질을 이용하는 방법이 보고되었으나 분리 대상이 호모알라닌에 한정되어 제한이 있다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 라세믹 아민 화합물로부터 광학 활성 아민 화합물의 제조방법을 제공하는 것이며, 보다 구체적으로는 고가의 α-케토산을 출발 물질로 사용하지 않고 중간체로 형성함으로써 오메가 트랜스아미네이즈의 기질로 이용하여 생산 단가를 감소시키면서 광학적 순도가 높은 라세믹 아민 화합물로부터 광학 활성을 가진 아민 화합물의 제조방법을 제공한다.
위와 같은 과제를 해결하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 광학 활성 아미노산의 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
1) 기질인 라세믹 아미노산, 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 효소인 D- 또는 L- 선택적 아미노산 트랜스아미네이즈 및 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 제공하는 단계,
2) 상기 1)단계에서 제공된 기질 중 라세믹 아미노산과 아미노 수용체가 효소인 D- 또는 L- 선택적 아미노산 트랜스아미네이즈의 반응에 의하여 α-케토산을 생산하는 단계,
3) 상기 α-케토산이 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 반응하여 광학 활성 아미노산을 생산하는 단계.
또한, 본 발명의 한 특징에 따른 광학 활성 아민의 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
1) 기질인 라세믹 아민 및 L-쓰레오닌을 효소인 쓰레오닌 디아미네이즈 및 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 제공하는 단계,
2) 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 L-쓰레오닌을 디아미네이션하여 아미노 수용체인 α-케토산을 생산하는 단계,
3) 상기 1)단계에서 제공된 라세믹 아민과 상기 2)단계에서 생성된 α-케토산이 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 키네틱 레졸루션을 통해 광학 활성 아민을 생산하는 단계.
본 발명의 일 구체예에 의하면, 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)에서 유래된 것으로서, [서열번호 1]의 염기서열로 암호화 되는 효소 또는 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)에서 유래된 것으로서, [서열번호 2]의 염기서열로 암호화 되는 효소일 수 있다.
또한, 상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 아스퍼질러스 터레우스(Aspergillus terreus)에서 유래된 것으로서, [서열번호 3]의 염기서열로 암호화 되는 효소 또는 아스로박터 종(Arthrobacter sp.)에서 유래된 것으로서, [서열번호 4]의 염기서열로 암호화 되는 효소일 수 있다.
상기 라세믹 아미노산은 라세믹 알라닌, 라세믹 세린, 라세믹 호모세린, 라세믹 노르발린, 라세믹 노르류신 및 라세믹 류신으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 라세믹 아민은 α-메틸벤질아민, 4-플루오로-α-메틸벤질아민, α-에틸벤질아민, 1-메틸-3-페닐프로필아민, 1-아미노인단, sec-부틸아민, 사이크로포로필에틸아민, 2-아미노펜테인, 2-아미노옥테인, 1-메톡시-2-프로필아민 및 알라니놀로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 광학 활성 아미노산 또는 광학 활성 아민을 제공한다.
본 발명에 따른 광학 활성 아민 화합물의 제조방법에 의해 광학 활성을 가지는 아민과 아미노산을 생산하게 되면, 오메가 트랜스아미나제를 이용한 광학 활성 화합물 제조방법에 사용되던 고가의 α-케토산을 기질로 제공하지 않아도 되므로, 최종 수득되는 광학 활성 아민 화합물인 광학 활성 아민 또는 광학 활성 아미노산의 생산 단가를 크게 절감시킬 수 있다.
또한 상기 최종 수득되는 광학 활성 아민 화합물은 높은 광학 순도를 가짐으로 의약품, 농약 등에 사용될 수 있다.
도 1은 L-아미노산에 대한 D-아미노산 트랜스아미네이즈의 불활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 아미노 공여체로서 아이소프로필아민을 사용하여 L-아미노산으로의 전환율을 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 일 실시예에 따른 라세믹 호모알라닌으로부터 L-호모알라닌의 생산량을 보여주는 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따른 일 실시예에 따른 기질인 α-케토글루타레이트 및 아이소프로필아민과 최종 생성물인 D-글루타메이트의 반응시간에 따른 농도를 나타낸 그래프이다.
도 5은 오메가 트랜스아미네이즈에 대하여 아미노 수용체로써 파이루베이트(pyruvate)와 프로판알(propanal)의 활성을 비교한 그래프이다.
도 6는 본 발명에 따른 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 사용하여 (S) 와 (R) 배열 α-메틸벤질아민의 농도를 반응시간에 따라 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이에 본 발명자들은 생산 단가를 절감시키는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 본 발명에 따른 탈라세믹화를 이용한 비대칭 광학 활성 아민 화합물의 제조방법을 완성하였다.
일반적으로 라세믹 아민 화합물로부터 광학적으로 순수한 아민 화합물을 분할하는 방법은 동역학적 분할, 비대칭합성(asymmetric synthesis), 탈라세믹화(deracemization) 등의 방법을 통해 수행될 수 있다. 이중 상기 탈라세믹화를 통해 광학적으로 순수한 아민 화합물의 생산은 기질로 제공된 라세믹 아민 화합물의 탈라세믹화 후 α-케토산과 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 반응에 의해 생산될 수 있다. 본 발명은 이러한 라세믹 아민 화합물의 광학 분할에 사용되는 고가의 α-케토산을 기질로 제공하지 않고 중간체로 생성되게 하여 광학 활성 아민 화합물의 생산 단가를 낮추면서도 높은 순도의 광학 활성을 가지는 아민 화합물을 생산하는 방법에 관한 발명이다. 본 발명의 라세믹 아민 화합물은 라세믹 아민 또는 라세믹 아미노산일 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 광학 활성 아민 화합물은 광학 순도가 높은 아미노산과 아민 화합물일 수 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 L-아미노산의 제조방법은 하기 단계를 포함한다.
1) 기질인 라세믹 아미노산, 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 효소인 D-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈 및 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 제공하는 단계,
2) 상기 1)단계에서 제공된 기질 중 라세믹 아미노산과 아미노 수용체가 효소인 D-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈의 반응에 의하여 α-케토산을 생산하는 단계,
3) 상기 α-케토산이 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 반응하여 광학 활성을 띠는 L-아미노산을 생산하는 단계.
본 발명에 따른 상기 L-아미노산의 생산방법은 하기 [반응식 1]에 나타나는 바와 같이 제조될 수 있다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2013011574-appb-I000001
(상기 R1은 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 하이드록시메틸, 하이드록시에틸 및 2-메틸프로필로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 R2는 2-카르복실에틸, 페닐, 페닐메틸 일 수 있다.)
상기 [반응식 1]에 나타나는 바와 같이 본 발명은 라세믹 아미노산 중 D-아미노산이 D-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈의 기질이 되며, D-아미노산의 아미노기가 D-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈에 의하여 아미노 수용체에 전달되며 그 결과 α-케토산을 중간체로서 생산할 수 있다. 이렇게 중간체로 생산된 α-케토산이 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 아미노 공여체로부터 아미노기를 전달받아 L-아미노산을 생산함으로써, 본 발명에서 최종 수득하려는 목적물인 L-아미노산의 수득이 가능하다. 즉, D-아미노산 트랜스아미네이즈와 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 반응에 의하여 라세믹 아미노산을 탈라세믹화(deracemization)함으로써 순수한 L-아미노산을 수득할 수 있다.
구체적으로 본 발명에 따른 D-아미노산의 제조방법은 하기 단계를 포함한다.
1) 기질인 라세믹 아미노산, 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 효소인 L-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈 및 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 제공하는 단계,
2) 상기 1)단계에서 제공된 기질 중 라세믹 아미노산과 아미노 수용체가 효소인 L-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈의 반응에 의하여 α-케토산을 생산하는 단계,
3) 상기 α-케토산이 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 반응하여 광학 활성을 띠는 D-아미노산을 생산하는 단계.
본 발명에 따른 상기 D-아미노산의 생산방법은 하기 [반응식 2]에 나타나는 바와 같이 제조될 수 있다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2013011574-appb-I000002
(상기 R1은 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 하이드록시메틸 및 하이드록시에틸로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 상기 R2는 2-카르복실에틸, 페닐, 페닐메틸 일 수 있다.)
상기 [반응식 2]에 나타나는 바와 같이, 본 발명은 라세믹 아미노산 중 L-아미노산만이 L-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈의 기질이 되며, L-아미노산의 아미노기가 L-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈에 의하여 아미노 수용체에 전달되며, 그 결과 α-케토산을 중간체로서 생산할 수 있다. 이렇게 중간체로 생산된 α-케토산이 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 아미노 공여체로부터 아미노기를 전달받아 D-아미노산을 생산함으로써, 본 발명에서 최종 수득하려는 목적물인 D-아미노산의 수득이 가능하다. 즉, L-아미노산 트랜스아미네이즈와 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 커플드 엔자임(coulpled enzyme) 반응에 의하여 라세믹 아미노산을 탈라세믹화(deracemization)함으로써 순수한 D-아미노산을 수득할 수 있다.
상기 [반응식 1] 또는 [반응식 2]에 나타난 바와 같이, 본 발명은 α-케토산이 기질로 제공되지 않고 중간체로 생산하는데, 이는 상기 D-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈가 라세믹 아미노산 중의 D-아미노산만을, L-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈가 라세믹 아미노산 중의 L-아미노산만을 선택하여 아미노산의 아미노기를 아미노 수용체에 전달하여 α-케토산이 생성된다.
따라서, 상기 [반응식 1]에서는 라세믹 아미노산 중 L-아미노산이 반응에 참여하지 않으며, 라세믹 아미노산 중 D-아미노산만이 상기 [반응식 1]에 의해 L-아미노산으로 거울상 이성질화됨으로써 라세믹 아미노산으로부터 L-아미노산이 광학분할된다. 또한, 마찬가지로 상기 [반응식 2]에서는 라세믹 아미노산 중 D-아미노산이 반응에 참여하지 않으며, 라세믹 아미노산 중 L-아미노산만이 상기 [반응식 2]에 의해 D-아미노산으로 거울상 이성질화됨으로써 라세믹 아미노산으로부터 D-아미노산이 광학분할된다. 본 발명에 따라 라세믹 아미노산에서 분할된 광학 활성 아미노산의 광학적 순도는(enantiomeric excess; ee)는 99% 이상일 수 있다.
상기 [반응식 1]에 나타나는 바와 같이, 생성물인 L-아미노산과 함께, 아미노 수용체가 아미노산으로부터 아미노기를 전달받아 생성되는 물질도 반응에 참여하지 않고 최종 생성물로 남게되며, D-글루타메이트, D-페닐글라이신 또는 D-페닐알라닌일 수 있다. 또한, 아미노 공여체가 오메가 트랜스아미네이즈에 의해 아미노기를 제공하고 생성된 케톤 역시 최종 생성물일 수 있다.
또한, 상기 [반응식 2]에 나타나는 바와 같이, 생성물인 D-아미노산과 함께, 아미노 수용체가 아미노산으로부터 아미노기를 전달받아 생성되는 물질도 반응에 참여하지 않고 최종 생성물로 남게되며, L-글루타메이트, L-페닐글라이신 또는 L-페닐알라닌일 수 있다. 또한, 아미노 공여체가 오메가 트랜스아미네이즈에 의해 아미노기를 제공하고 생성된 케톤 역시 최종 생성물일 수 있다.
본 발명에 따라 최종 생산되는 광학 활성 아미노산은 바람직하게는 광학 활성을 지닌 D- 또는 L- 배열 알라닌, 호모알라닌, 세린, 호모세린, 노르발린, 노르류신 및 류신으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 L- 또는 D- 아미노산일 수 있다.
상기 1)단계에서 기질로 제공되는 물질 중 라세믹 아미노산은 본 발명에 제공되는 기질인 D- 또는 L- 선택적 아미노산 트랜스아미네이즈와 (S) 또는 (R) -선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 대해 활성을 지니는 아미노산이라면 특별한 제한 없이 기질로 제공될 수 있으며, 바람직하게는 알라닌, 세린, 호모세린, 노르발린, 노르류신 및 류신으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 아미노산일 수 있다.
상기 1)단계에서 기질로 제공되는 물질 중 아미노 수용체는 상기 D- 또는 L- 선택적 아미노산 트랜스아미네이즈에 대해서는 활성을 지니고 있으면서도 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 대해서는 활성을 보이지 않아야 하는데, α-케토글루타레이트, 페닐글라이옥실레이트, 페닐파이루베이트는 이에 대한 활성이 존재하지 않아 본 발명에 따른 상기 반응의 바람직한 아미노 수용체로 제공될 수 있다.
상기 1)단계에서 기질로 제공되는 물질 중 아미노 공여체는 D- 또는 L-아미노산 선택적 트랜스아미네이즈에 대하여는 활성이 존재하지 않으면서 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 대해 활성이 존재하면서 아미노기를 제공하는 것이어야 하므로, 바람직하게는 아이소프로필아민, 메틸벤질아민 및 벤질아민으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 D-아미노산 트랜스아미네이즈는 라세믹 아미노산의 탈라세믹화를 가능하게 하면서 아미노 수용체와 활발하게 반응하는 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있는 것이지만, 본 발명에서는 바실러스 스패리쿠스(Bacillussphaericus)로부터 유래된 것으로서, [서열번호 5]의 염기서열로 암호화되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 L-아미노산 트랜스아미네이즈는 라세믹 아미노산의 탈라세믹화를 가능하게 하면서 아미노 수용체와 활발하게 반응하는 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있는 것이지만, 본 발명에서는 대장균(Escherichiacoli)로부터 유래된 것으로서, [서열번호 6]의 염기서열로 암호화되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 α-케토산과 반응하여 L-형아미노산을 생산하는 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있는 것이지만, 본 발명에서는 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)에서 유래된 것으로서, [서열번호 1]의 염기서열로 암호화되는 효소를 이용하거나 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)로부터 유래된 것으로서, [서열번호 2]의 염기서열로 암호화되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 α-케토산과 반응하여 D-아미노산을 생산하는 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있는 것이지만, 본 발명에서는 아스퍼질러스 터레우스(Aspergillus terreus)에서 유래된 것으로서, [서열번호 3]의 염기서열로 암호화 되는 효소 또는 아스로박터 종(Arthrobacter sp.)에서 유래된 것으로서, [서열번호 4]의 염기서열로 암호화 되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
구체적으로, 본 발명에 따른 광학 활성 아민 화합물의 제조방법은 하기 단계를 포함한다.
1) 기질인 라세믹 아민 및 L-쓰레오닌을 효소인 쓰레오닌 디아미네이즈 및 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 제공하는 단계,
2) 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 L-쓰레오닌을 디아미네이션하여 아미노 수용체인 α-케토산을 생산하는 단계,
3) 상기 1)단계에서 제공된 라세믹 아민과 상기 2)단계에서 생성된 α-케토산이 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 광학 활성 아민을 생산하는 단계.
상기 본 발명에 따른 광학 활성 아민 화합물의 제조방법은 하기 [반응식 3]으로 나타낼 수 있다.
[반응식3]
Figure PCTKR2013011574-appb-I000003
상기 [반응식 3]과 같이 본 발명은 1)단계에서 라세믹 아민과 L-쓰레오닌을 기질로서 제공하고, 여기에 효소인 쓰레오닌 디아미네이즈와 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈( (S)- 또는 (R)- 선택적 ω-TA)를 제공할 수 있다. 이중 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 상기 L-쓰레오닌을 디아미네이션시켜 2-옥소부티레이트를 생산할 수 있다. 이러한 상기 2-옥소부티레이트는 아미노 수용체로 작용할 수 있으며, 이를 통해 아미노 수용체인 고가의 α-케토산으로 사용될 수 있다. 또한 상기 2-옥소부티레이트는 종래 또 다른 아미노 수용체로 사용되고 있는 프로판알보다 현저히 향상된 효과를 가지는 아미노 수용체로 작용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 1)단계에서 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 라세믹 아민 중 (S)-아민과 상기 2)단계에서 생성된 α-케토산이 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 (R)-아민과 L-호모알라닌을 생산할 수 있다. 이는 상기 쓰레오닌 디아미네이즈와 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈가 커플드 엔자임(coupled enzyme) 반응을 통한 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)을 수행함으로써 생산되는 것일 수 있다.
또한, 상기 1)단계에서 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 라세믹 아민 중 (R)-아민과 상기 2)단계에서 생성된 α-케토산이 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 (S)-아민과 D-호모알라닌을 생산할 수 있다. 이는 상기 쓰레오닌 디아미네이즈와 상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈가 커플드 엔자임(coupled enzyme) 반응을 통한 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)을 수행함으로써 생산되는 것일 수 있다.
따라서, 상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 제공하는 경우 반응 후 최종 생성물은 (R)-아민과 케톤 및 L-호모알라닌일 수 있으며, 또한 상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 제공하는 경우 반응 후 최종 생성물은 (S)-아민과 케톤 및 D-호모알라닌일 수 있다.
상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 특별한 제한이 있는 것은 아니지만 바람직하게는 대장균(Escherichia coli)에서 유래한 것으로서, [서열번호 7]의 염기서열로 암호화되는 효소일 수 있다.
상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 α-케토산과 반응하여 L-형아미노산을 생산하는 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있는 것이지만, 본 발명에서는 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)에서 유래된 것으로서, [서열번호 1]의 염기서열로 암호화되는 효소를 이용하거나 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)로부터 유래된 것으로서, [서열번호 2]의 염기서열로 암호화되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 α-케토산과 반응하여 D-아미노산을 생산하는 것이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있는 것이지만, 본 발명에서는 아스퍼질러스 터레우스(Aspergillus terreus)에서 유래된 것으로서, [서열번호 3]의 염기서열로 암호화 되는 효소 또는 아스로박터 종(Arthrobacter sp.)에서 유래된 것으로서, [서열번호 4]의 염기서열로 암호화 되는 효소를 이용하는 것이 바람직하다.
상기 라세믹 아민은 바람직하게는 α-메틸벤질아민, 4-플루오로-α-메틸벤질아민, α-에틸벤질아민, 1-메틸-3-페닐프로필아민, 1-아미노인단, sec-부틸아민, 사이크로포로필에틸아민, 2-아미노펜테인, 2-아미노옥테인, 1-메톡시-2-프로필아민 및 알라니놀로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상의 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예로서 α-메틸벤질아민(1a)과 L-쓰레오닌(2)을 기질로 제공하여 이루어지는 반응을 하기 [반응식 4]로 나타냈다.
[반응식4]
Figure PCTKR2013011574-appb-I000004
상기 [반응식 4]에 나타난 바와 같이, 쓰레오닌 디아미네이즈(TD)가 L-쓰레오닌(2)을 디아미네이션하여 2-옥소부티레이트(3)를 생산하면 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈((S)-selective ω-TA)가 라세믹 α-메틸벤질 아민(1a) 중 (S)-α-메틸벤질 아민만을 선택적으로 기질로 사용하여 디아미네이션 한 후, 다시 2-옥소부티레이트(3)를 아미네이션하는 트랜스아미네이션 반응을 할 수 있다. 이러한 반응을 통해 결과적으로는 아세토페논(5)과 L-호모알라닌(4)을 생산하게 된다. 이는 결국 최종 생성물로서 (R)-α-메틸벤질아민((R)-1a), L-호모알라닌 및 아세토페논을 수득할 수 있음을 의미한다.
또한 상기 [반응식 4]의 일부 변형으로서, (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 사용하는 반대의 경우에는 쓰레오닌 디아미네이즈(TD)가 L-쓰레오닌을 디아미네이션하여 2-옥소부티레이트(3)를 생산하면 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈((R)-selective ω-TA)가 라세믹 α-메틸벤질아민(1a) 중 (R)-α-메틸벤질 아민만을 선택적으로 기질로 사용하여 디아미네이션 한 후, 다시 2-옥소부티레이트(3)를 아미네이션하는 트랜스아미네이션 반응을 할 수 있다. 이러한 반응을 통해 결과적으로는 아세토페논과 D-호모알라닌을 생산하게 된다. 이는 결국 최종 생성물로서 (S)-α-메틸벤질아민, D-호모알라닌 및 아세토페논을 수득할 수 있음을 의미한다.
본 발명의 또 다른 특징에 따른 리간드, 의약품 및 생리활성물질은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 생산된 순도 99%이상의 L- 또는 R- 아미노산 또는 L- 또는 R- 아민을 포함하는 리간드, 의약품 및 생리활성물질로서 당업계에 적용되는 공지의 리간드, 의약품 및 생리활성물질이 모두 포함될 수 있다. 또한 상기 리간드, 의약품 및 생리활성물질은 당업계에 적용되는 모든 공지의 방법으로 제조되는 리간드, 의약품 및 생리활성물질이 모두 포함될 수 있다.
실시예 1. 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)로부터 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 암호화하는 재조합 DNA의 제조
오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)를 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7) 중에서 37 ℃, 12 시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.
표 1
구분 염기서열
정방향 프라이머 5’-GATATACCATGGNNACTGCTCAGCCAAACTCT-3’
역방향 프라이머 5’-CGAGTGCGGCCGTCCTGGTGAGGCTTGC-3’
실시예 2. 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)로부터 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 암호화하는 재조합 DNA의 제조
파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)를 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7) 중에서 37 ℃, 12 시간 배양한 후 싱글 콜로니로부터 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같다.
표 2
구분 염기서열
정방향 프라이머 5’-GATATACATATGAACCAACCGCAAAGC-3’
역방향 프라이머 5’-GTGGTGCTCGAGGGCCACCTCGGCAAA-3’
실시예 3. 아스퍼질러스터레우스(Aspergillusterreus )로부터 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA로 이루어진 재조합 DNA의 제조
아스퍼질러스터레우스(Aspergillusterreus) 유래의 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈 유전자 서열(NCBI gene ID: 115385557)을 pGEM-T vector에 합성하여 플라스미드로부터 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nco1, Xho1 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 3과 같다.
표 3
구분 염기서열
정방향 프라이머 5’-AGAAGGAGATATACCATGGCCTCCATGGACAAAGTCT-3’
역방향 프라이머 5’-GGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTTCCTCTCGTTATAATC-3’
실시예 4. 바실러스 스패리쿠스( Bacillussphaericus) 유래의 D-아미노산 트랜스아미네이즈를 암호화하는 재조합 DNA의 제조
바실러스 스패리쿠스(Bacillus sphaericus) 유래의D-아미노산 트랜스아미네이즈 유전자 서열(NCBI gene ID: 849138)을 pGEM-T vector에 합성하여 플라스미드로부터 D-아미노산 트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nco1, Xho1 제한효소를 이용하여 클로닝하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 4와 같다.
표 4
구분 염기서열
정방향 프라이머 5’- GATATACCATGGCATACTCATTATGG-3’
역방향 프라이머 5’- GTGGTGCTCGAGGGCATTAATTGAAATTGG-3’
실시예 5. 대장균(Escherichia coli)유래의 L-아미노산 트랜스아미네이즈를 암호화하는 재조합 DNA의 제조
대장균(Escherichiacoli)유래의 L-아미노산 트랜스아미네이즈로서 L-가지사슬 아미노산 트랜스아미네이즈 유전자를 pGEM-T벡터에 합성하여 플라스미드로부터 L-가지사슬 아미노산 트랜스아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nco1, Xho1 제한효소를 이용하여 클로닝하였다
실시예 6. 대장균(Escherichia coli)유래의 쓰레오닌 디아미네이즈를 암호화하는 DNA 및 벡터 DNA로 이루어진 재조합 DNA의 제조
대장균(Escherichiacoli)을 LB-브로쓰(펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, 염화나트륨 5 g/L, pH 7)중에서 37 ℃, 12 시간 배양한 후 싱글콜로니로부터쓰레오닌디아미네이즈를 발현하는 유전자를 합성하였으며, 이를 DNA 프라이머를 이용하여 PCR 방법에 의하여 증폭하여 수득하였다. 수득된 DNA 단편을 발현 벡터 DNA pET28a(+)에 Nde1, Xho1 제한효소와 라이게이즈를 이용하여 삽입하였다. 이때 사용된 프라이머는 하기 표 5와 같다.
표 5
구분 염기서열
정방향 프라이머 5’-GATATACATATGGCTGACTCGCAACCCCTG-3’
역방향 프라이머 5’-GTGGTGCTCGAGACCCGCCAAAAAGAA-3’
실시예 7. 형질 전환 균주로부터 효소 과발현 및 정제
상기 실시예 1 내지 실시예 6에 의해 수득된 플라스미드를 사용하여 E.coli BL21(DE3)를 형질 전환시켰다. 가나마이신을 함유하는 LB-보로쓰 300 mL에서 배양시킨 후, IPTG(최종 농도 1 mM)를 현탁도(OD) 0.5에서 첨가하였다. 이후 6 시간 이상 37 ℃에서 배양한 후 4 ℃에서 10000×g 로 20 분간 원심분리하여 세균세포를 얻어 15 mL 리서스펜션 버퍼(50 Mm Tris-HCl, 50 mM 염화칼슘, 1 mM β-머캅토에탄올, 0.1 mM PMSF, 20 μM PLP, pH 7)로 현탁시켰다. 이를 빙냉시키면서 초음파 처리를 한 다음 4 ℃에서 17000×g로 30분간 원심 분리하여 상층액을 조추출액으로 수득하였다. 이 조추출액을 친화성 크로마토그래피를 이용하여 원하는 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈, (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈, D-아미노산 트랜스아미네이즈, L-아미노산 트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈를 정제하여 효소 용액을 얻었다.
실시예 8. 정제된 효소의 활성측정 및 농도결정
효소의 활성 및 농도 결정은 37 ℃ 에서 50 mM potassium phosphate 버퍼 pH 7 에서 수행되었다. 활성 측정을 위한 효소반응은 반응시작 10분 후 반응용액 100 μl에 아세도니트릴 600 μl를 넣어 멈추었다.
상기 실시예 1 내지 3에서 정제된 1 unit의 (S)- 또는 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈 활성은 20 mM 파이루베이트, 20 mM (S)-α-메틸벤질아민에서 1분 동안 1 μmole의 아세토페논이 생기는 것을 의미한다. 상기 실시예 4와 5에서 정제된 1 unit의 D- 또는 L- 선택적 트랜스아미네이즈 활성은 20 mM D-알라닌과 2-옥소부티레이트에서 1분 동안 파이루베이트 1 μmole이 생기는 것을 의미한다. 또한, 상기 실시예 6에서 정제된 1 unit의 쓰레오닌디아미네이즈 활성은 0.1 mM PLP, 50 mM L-쓰레오닌 에서 1분 동안 2-옥소부티레이트 1 μmole이 생기는 것을 의미한다.
활성 측정시 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 경우는 아세토페논을 HPLC를, D- 또는 L- 선택적 아미노산 트랜스아미네이즈 경우는 파이루베이트를, 쓰레오닌 디아미네이즈의 경우는 2-옥소부티레이트를 이용하여 측정하였다.
실시예 9. 아민 및 아미노산의 분석
생산물의 농도분석과 광학적 순도(enantiomeric excess; ee)를 구하기 위하여 키랄 아민과 아미노산은 GITC와 Marfey 시약을 이용하여 유도체화 한 후 액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분석하였다. 일반적인 GITC 유도체화 과정은 반응샘플(0.5 mM 이하의 아민 또는 아미노산)과 유도체화용액 (1.5 mM GITC, 1.5 mM 트라이에틸아민 in 아세토나이트릴)과 1:1로 섞은 후 상온에서 35분 이상 반응시켰다. 이후 C18 컬럼과 HPLC를 이용하여 분석하였다. 유속은 1 ml/min 이며 254 nm에서 UV 측정기를 이용하여 분석하였다. Marfey reagent 유도체화 과정은 10 μl의 샘플을 1 M 소디움바이카르보네이트 8 μl와 40 μl 1% Marfey reagent 를 섞은 후 40 ℃에서 1 시간 반응한 후 식히고 8 μl의 1 M 염산을 섞어준다. 이 용액을 434 μl 의 40% 아세토나이트릴 용액과 섞은 후 C18 컬럼과 HPLC를 이용하여 분석한다. 유속은 1 ml/min 이며 온도는 40 ℃ 그리고 320 nm에서 UV 측정기를 이용하여 분석하였다. 그 결과를 하기 [표 6]에 나타내었다. 광학적 순도는 위에서 측정된 (S)-거울상체(enantiomer)의 농도(CS)와 (R)-거울상체(enantiomer)의 농도(CR)를 이용하여 계산하였다. 그 계산식은 아래에 나타내었다.
[계산식]
Figure PCTKR2013011574-appb-I000005
또한 하기 표 6에서 α-메틸벤질아민는 1a로, 4-플루오로-α-메틸벤질아민은 1b로, α-에틸벤질아민은 1c로, 1-메틸-3-페닐프로필아민은 1d로, 1-아미노인단은 1e로, sec-부틸아민은 1f로, 사이크로포로필에틸아민은 1g로, 2-아미노펜테인은 1h로, 2-아미노옥테인은 1i로, 1-메톡시-2-프로필아민은 1j로, 알라니놀은 1k로 각각 나타내었다.
표 6
방출 상태(elution condition)a 반응 시간 (분)
(R)-형태 (S)-형태
GITC 유도체화
1a A55%, B45%의 등용매용리 14.5 16.2
1b A55%, B45%의 등용매용리 18.7 21.5
1c A55%, B45%의 등용매용리 24.5 26.4
1d A55%, B45%의 등용매용리 39.4 42.0
1e A60%, B40%에서 A50%, B50%로의 점변 용리 14.1 16.6
1f A50%, B50%의 등용매용리 13.3 14.4
1h A50%, B50%의 등용매용리 27.5 30.6
1i A65%, B35%의 등용매용리 23.6 25.4
1j A60%, B40%에서 A65%, B35%로의 점변 용리 24.9 27.0
4 A55%, B45%의 등용매용리 5.3 4.
알라닌 A50%, B50%의 등용매용리 5.6 4.6
Marfey 시약 유도체화
1g A50%, B50%의 등용매용리 26.9 28.5
1k A55%, B45%의 등용매용리 4.9 3.3
A:메탄올(0.1%TFA), B:TDW(0.1%TFA)
실시예 10. 정제한 D-아미노산 트랜스아미네이즈의 케토산에 대한 기질 특이성 및 케토산에 의해 전환된 광학 활성 아미노산
상기 실시예 7에서 정제된 D-아미노산 트랜스아미네이즈를 사용하여 하기 [표 7]에 나타낸 각종 케토산과 D-알라닌 또는 D-호모알라닌을 기질로 하여 반응을 수행하였다. 20 mM 케토산, 20 mM D-알라닌 또는 D- 호모알라닌 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7)에서 0.1 U/ml 의 D-아미노산 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 10 분간 반응시키고 생성된 케토산(파이루베이트 또는 2-옥소부티레이트)의 생성량을 측정하였다. D-아미노산 트랜스아미네이즈는 2-옥소부티레이트, β-하이드록시파이루베이트, 머캅토파이루베이트, 플루오로파이루베이트, 3-메틸-2-옥소부티레이트, 2-옥소페타노에이트, 4-메틸-2옥소펜타노에이트, 2-케토헥사노에이트, α-케토글루타레이트, 페닐파이루베이트, 파이루베이트 등의 케토산에 대하여 활성이 존재함을 확인하였고 그 결과를 하기 표 7 및 표 8에 나타내었다.
표 7
기질 생성물
아미노 수용체 아미노 공여체 D-아미노산 파이루베이트(mM)
2-옥소부티레이트 D-알라닌 호모알라닌 1.375
β-하이드록시파이루베이트 D-알라닌 세린 0.079
머캅토파이루베이트 D-알라닌 시스테인 0.022
플루오로파이루베이트 D-알라닌 플루오로알라닌 0.053
브로모파이루베이트 D-알라닌 브로모알라닌 0.000
3-메틸-2-옥소부티레이트 D-알라닌 발린 0.014
트라이메틸파이루베이트 D-알라닌 tert-류신 0.000
2-옥소페타노에이트 D-알라닌 노르발린 0.882
4-메틸-2옥소펜타노에이트 D-알라닌 류신 0.073
2-케토헥사노에이트 D-알라닌 노르류신 0.531
α-케토글루타레이트 D-알라닌 글루타메이트 0.971
페닐글라이옥실레이트 D-알라닌 페닐글라이신 0.000
페닐파이루베이트 D-알라닌 페닐알라닌 0.075
2-(3-하이드록시-1-아다만틸)-옥소-에타노에이트 D-알라닌 3-하이드록시아다만틸글라이신 0.000
표 8
기질 생성물
아미노수용체(케토산) 아미노공여체(D-아미노산) D-아미노산 2-옥소부티레이트(mM)
파이루베이트 D-호모알라닌 알라닌 0.399
2-옥소펜타노에이트 D-호모알라닌 노르발린 0.651
실시예 11. 정제한 D-아미노산 트랜스아미네이즈의 L-형 아미노산 농도에 따른 활성 저하 여부
상기 실시예 7에서 정제된 D-아미노산 트랜스아미네이즈를 사용하여 라세믹 아미노산의 계속적인 디라세마이제이션을 위해서는 최종 생산되는 L-아미노산에 의한 D-아미노산 트랜스아미네이즈 효소의 활성에 영향을 미치지 않아야 한다. 그 이유는 최종 생산되는 L-아미노산에 의해 그 활성이 저하된다면 계속적인 반응을 이끌어내기 어렵기 때문이다. 20 mM D-형 호모알라닌, 20 Mm 파이루베이트 및 50 mM 인산칼륨(pH 7)에서 L-형 호모알라닌의 농도를 각각 0, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20 mM로 하여 D-아미노산 트랜스아미네이즈의 활성을 확인하기 위하여 37 ℃에서 10분간 반응시키고 2-옥소부티레이트의 생산량을 측정하였다. 이 결과 D-아미노산 트랜스아미네이즈는 최종 생산되는 L-아미노산에 의하여 활성이 저하되지 않는 것을 확인하였다. 그 결과는 하기 도 1에 나타내었다.
실시예 12. 정제한 오메가 트랜스아미네이즈의 케토산에 대한 기질특이성 및 케토산에 의해 전환된 광학 활성 아미노산
상기 실시예 7에서 정제된 O.anthropi와P.denitrificans 유래의 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 케토산에 대한 기질특이성을 조사하였다. 20 mM 케토산, 20 mM (S)-α-메틸벤질아민 및 50 mM 인산칼륨(pH 7)에서 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 10 분간 반응시키고 생성된 아세토페논의 생산량을 측정하였다. (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 글라이옥실레이트, 파이루베이트, 2-옥소부티레이트, β-하이드록시파이루베이트, 플루오로파이루베이트, 2-옥소펜타노에이트, 4-메틸-2옥소펜타노에이트(P.denitrifican),2-케토헥사노에이트 등의 케토산에 대하여 활성이 존재함을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
표 9
Figure PCTKR2013011574-appb-T000001
상기 표 9에서 확인할 수 있는 바와 같이 α-케토글루타레이트는 오메가 트랜스아미네이즈에 대해서는 활성이 존재하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 상기 표 7 및 표 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 상기 α-케토글루타레이트는 D-아미노산 트랜스아미네이즈에 대해서는 활성이 존재하는 것을 확인할 수 있어 본 발명에서 아미노 수용체로 작용하는 바람직한 일실시예에 해당할 수 있음을 확인되었다.
실시예 13. 정제한 오메가 트랜스아미네이즈의 아민에 대한 기질특이성 및 파이루베이트로부터 전환된 L-알라닌
상기 실시예 4에서 정제된 오.안트로피(O.anthropi)와 피.덴트리피칸(P.denitrificans) 유래의 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 아민에 대한 기질특이성을 조사하였다. 20 mM 아민, 20 mM(S)-아민(40mM라세믹 sec-부틸아민) 및 50 mM 인산칼륨 (pH 7)에서 오메가 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 10 분간 반응시키고 생성된 L-형 알라닌의 생산량을 측정하였다. 오메가 트랜스아미네이즈는 (S)-α-메틸벤질아민, 아이소프로필, sec-부틸아민 등의 아민에 대하여 활성이 존재함을 확인하였다. 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
표 10
Figure PCTKR2013011574-appb-T000002
실험예
실험예 1. 정제한 오메가 트랜스아미네이즈가 반응하고 아미노 공여체로써 아이소프로필아민을 사용한 경우 케토산으로부터 고농도의 L-아미노산의 생산
실시예 7에서 정제된 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하여 케토산으로부터 고농도의 L-아미노산이 생산됨을 확인하는 실험을 수행하였다. 100 mM 2-옥소부티레이트, 100 mM 아이소프로필아민 및 50 mM 인산칼륨(pH 7)에서 1U/ml 오메가 트랜스아미네이즈에 의한 반응을 37 ℃에서 반응시키고 시간에 따라 생산된 L-호모알라닌의 생산량을 측정하였다. 아이소프로필아민을 아미노공여체로 사용하고 정제한 오메가 트랜스아미네이즈에 의해 케토산으로부터 고농도의 L-호모알라닌이 생산되며, 그 전환율은 80% 이상으로 진행되는 것을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.
실험예 2. 정제한 D-아미노산 트랜스아미네이즈와 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 커플링 반응에 의한 고농도 라세믹 아미노산의 L-아미노산으로의 전환
실시예 4에서 정제된 D-아미노산 트랜스아미네이즈와 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하여 고농도 라세믹 아미노산으로부터 L-아미노산이 생산됨을 확인하는 실험을 진행하였다. 100 mM 라세믹 아미노산, 70 mM α-케토글루타레이트 또는 페닐글라이옥실레이트 또는 페닐파이루베이트(아미노 수용체), 70 mM 아이소프로필아민(아미노 공여체), 0.1 mM PLP 및 50 mM인산칼률(pH 7)에서 4 U/ml D-아미노산 트랜스아미네이즈와 20U/ml (S)-선택적오메가트랜스아미네이즈커플링반응을 37 ℃ 에서 진행하였다. 류신과 노르류신의 경우는 50 mM 라세믹 아미노산, 35 mM α-케토글루타레이트 또는 페닐글라이옥실레이트 또는 페닐파이루베이트, 35 mM 아이소프로필아민의 기질을 사용하여 반응하였다. 알라닌 생산을 위한 디라세마이제이션 반응의 경우에는 반응 시간 별로 기질, 생성물을 측정하였으며 호모알라닌, 세린, 호모세린, 노르발린, 류신, 노르류신의 경우에는 D-아미노산과 L-아미노산을 분석하였다. 다양한 아미노산들에 대해서 100 mM 라세믹 아미노산(류신과 노르류신은 50 mM)으로부터 L-아미노산을 99 % 이상의 광학적 순도(ee)를 디라세마이제이션을 통하여 얻을 수 있었다. 그 결과를 하기 도 3, 도 4 및 표 11에 나타내었다.
표 11
아미노산 L-아미노산 최종 농도 (mM) ee (%) 반응시간 (h)
알라닌 100.15 99.34 10
호모알라닌 99.24 99.94 6
세린 101.84 98.92 25
노르발린 103.86 99.16 25
노르류신 55.29 99.30 20
류신 49.66 99.81 10
호모세린 98.51 98.87 25
실험예 3. 정제한 L-형 가지사슬 아미노산 트랜스아미네이즈와 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 커플링 반응에 의한 고농도 라세믹 아미노산의 D-아미노산으로의 전환
상기 실시예 7에서 정제된 L-형 가지사슬 아미노산 트랜스아미네이즈와 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하여 고농도 라세믹 아미노산으로부터 D-아미노산이 생산됨을 확인하는 실험을 진행하였다. 100 mM 라세믹 아미노산, 70 mM α-케토글루타레이트, 70 mM 아이소프로필아민, 0.1 mM PLP 및 50 mM 인산칼륨(pH 7)에서 4 U/ml L-형 가지사슬 트랜스아미네이즈와 20U/ml (R)-선택적오메가트랜스아미네이즈커플링반응을 37 ℃ 에서 진행하였다. 노르류신의 경우는 50 mM 라세믹 아미노산, 35 mM α-케토글루타레이트, 35 mM 아이소프로필아민의 기질을 사용하여 반응하였다. 알라닌, 호모알라닌, 세린, 호모세린, 노르발린, 류신, 노르류신의 경우에는 D-아미노산과 L-아미노산을 분석하였다. 다양한 아미노산들에 대해서 100 mM 라세믹 아미노산(노르류신은 50 mM)으로부터 D-아미노산을 99 % 이상의 광학적 순도(ee)를 디라세마이제이션을 통하여 얻을 수 있었다. 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
표 12
아미노산 D-아미노산 최종 농도 (mM) ee (%) 반응시간 (h)
알라닌 102.88 99.10 20
호모알라닌 99.54 99.82 15
세린 100.71 99.01 20
노르발린 98.42 99.01 20
노르류신 48.58 99.51 20
호모세린 97.78 98.89 25
실험예 4. 정제한 오메가 트랜스아미네이즈를 이용한 광학 활성 키랄 아민의 키네틱레졸루션(kinetic resolution) 반응 시 파이루베이트와 프로판알의 아미노 수용체로써 활성 비교
상기 실시예 7에서 정제된 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하여 라세믹 α-메틸벤질아민과 파이루베이트 또는 프로판알을 기질로 사용하여 반응을 수행하였다. 100 mM α-메틸벤질아민, 80 mM 파이루베이트 또는 프로판알, 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7.5, 37 ℃ 조건에서 O.anthropi 유래의 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈 5 U/ml을 첨가하여 시간에 따라 α-메틸벤질아민의 양을 (S)-α-메틸벤질아민과 (R)-α-메틸벤질아민으로 나눠서 각각 측정하였으며, 이의 광학적 순도를 구하였다. 그 결과 파이루베이트의 경우 3시간의 반응 만에 99% 이상의 enatiomeric excess로 (R)-α-메틸벤질아민을 얻을 수 있었으나 프로판알의 경우 24시간의 반응에도 57% 의 광학적 순도로 (R)-α-메틸벤질아민을 얻을 수 있었다. 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.
실험예 5. 정제한 오메가트랜스아미네이즈의 아민에 대한 기질 특이성 조사
상기 실시예 7에서 정제된 O.anthropi 유래의 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈의 아민에 대한 기질특이성을 조사하였다. α-메틸벤질아민(1a), 4-플루오로-α-메틸벤질아민(1b), α-에틸벤질아민(1c), 1-메틸-3-페닐프로필아민(1d), 1-아미노인단(1e), sec-부틸아민(1f), 사이크로포로필에틸아민(1g), 2-아미노펜테인(1h), 2-아미노옥테인(1i), 1-메톡시-2-프로필아민(1j)과 알라니놀(1k) 11가지 아민들에 대하여 기질특이성을 조사하였다. 10 mM 의 racemic 아민, 10 mM 파이루베이트 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7.5, 37 ℃ 조건에서 O.anthropi 유래의 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈 0.125 U/ml을 첨가하여 10분간 반응하여 L-알라닌의 생성량을 GITC 유도체화를 통하여 측정하였다. 모든 활성은 5% 이하 전환율의 초기반응속도 구간에서 측정되었다. α-메틸벤질아민의 초기반응속도는 0.033 mM/min으로 측정되었다. α-메틸벤질아민에 대한 활성을 100%로 하였을 때 아릴알킬아민인 4-플루오로-α-메틸벤질아민(1b)의 경우는 91%, α-에틸벤질아민(1c)는 18%, 1-메틸-3-페닐프로필아민(1d)은 70%, 1-아미노인단(1e)은 64%((S)-1-아미노인단은 (S)-α-메틸벤질아민의 153%)의 활성을 지녔으며, 알킬아민의 경우 sec-부틸아민(1f)는 54%, 사이크로포로필에틸아민(1g)는 63%, 2-아미노펜테인(1h)은 29%, 2-아미노옥테인(1i)은 146%, 1-메톡시-2-프로필아민(1j)은 60%, 알라니놀(1k)은 63%의 활성을 지녔다. 그 결과를 하기 표 13에 나타내었다.
표 13
Figure PCTKR2013011574-appb-T000003
실험예 6. 쓰레오닌 디아미네이즈와 오메가 트랜스아미네이즈가 커플드 엔자임(coupled enzyme) 반응 하여 키네틱 레졸루션(kinetic resolution)을 수행하는 경우 농도 변화에 따른 광학 활성 키랄 아민의 수득률
상기 실시예 7에서 정제된 쓰레오닌 디아미네이즈와 오메가 트랜스아미네이즈를 이용하여 각 효소의 농도를 하기 [표 14]과 같이 다양하게 하여 coupled enzyme 반응을 수행하였다. 100 mM 라세믹 α-메틸벤질아민, 60 mM L-쓰레오닌, 0.1 mM PLP, 50 mM Phosphate 버퍼 pH 7.5, 37 ℃ 조건에서 2.5시간 반응하였다. 쓰레오닌 디아미네이즈의 농도를 9U/ml로 고정하고 오메가 트랜스아미네이즈의 농도를 1.25U/ml, 2.50U/ml, 3.75U/ml로 늘려 주었을 때 광학적 순도가 28%, 65%, 90%로 증가하는 것을 확인하였지만 오메가 트랜스아미네이즈의 농도를 1.25U/ml로 고정하고 쓰레오닌디아미네이즈의 농도를 9U/ml, 18U/ml, 27U/ml로 증가시켰을 경우에는 광학적 순도(ee)가 28%, 24%, 26%로 향상되는 것을 확인하지 못하였다. 따라서 이 coupled enzyme 반응의 rate determining step은 오메가 트랜스아미네이즈의 반응이므로 오메가 트랜스아미네이즈의 농도를 증가시키는 것이 바람직하다. 그 결과를 하기 표 14에 나타내었다.
표 14
ω-TA(U mL-1) TD(U mL-1) 4a(mM) (R)-1ab의 ee(%)
1.25 9 15 28
2.50 9 33 65
3.75 9 47 90
1.25 18 19 24
1.25 27 13 26
(ω-TA: 오메가 트랜스아미네이즈, TD:쓰레오닌디아미네이즈, a: GITC 유도체의 HPLC 분석에서 측정된 표준 칼리브레이션에 의해 측정된 농도, b: GITC 유도체의 HPLC 분석에 의해 측정함)
실험예 7. L-쓰레오닌과 라세믹 아민을 기질로 하면서, (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈의 커플드 엔자임 반응을 이용한 (R)-아민의 수득과 L-호모알라닌의 생산
실시예 9에서 가장 좋은 결과를 얻은 효소 비율을 참고하고 실시예 7에서 정제된 오메가 트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈를 이용하여 커플드 엔자임 반응을 이용한 아민의 키네틱 레졸루션과 L-호모알라닌의 생산 실험을 수행하였다. 11가지 아민(α-메틸벤질아민(1a), 4-플루오로-α-메틸벤질아민(1b), α-에틸벤질아민(1c), 1-메틸-3-페닐프로필아민(1d), 1-아미노인단(1e), sec-부틸아민(1f), 사이크로포로필에틸아민(1g), 2-아미노펜테인(1h), 2-아미노옥테인(1i), 1-메톡시-2-프로필아민(1j)과 알라니놀(1k))에 대하여 키네틱 레졸루션을 수행하였다. 100 mM 아민(1a-1k), 60 mM L-쓰레오닌, 0.1 mM PLP, 50 mM phosphate 버퍼 pH 7.5에 3.75 U/ml (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 9 U/ml 쓰레오닌 디아미네이즈를 첨가하여 각 아민의 농도와 enantiomeric excess를 측정하였다. α-에틸벤질아민(1c), 2-아미노옥테인(1i), 알라니놀(1k)을 제외한 모든 아민에 대해서 10시간 이내의 반응시간만에 99% 이상의 enantiomeric excess를 얻을 수 있었다. α-에틸벤질아민(1c), 2-아미노옥테인(1i), 알라니놀(1k)의 키네틱 레졸루션을 위해서 이 커플드 엔자임 반응의 rate determining step인 오메가 트랜스아미네이즈의 농도를 10U/ml로 증가 함으로서 α-에틸벤질아민(1c), 2-아미노옥테인(1i)에 대하여 30시간 이내에 99% 이상의 enantiomeric excess를 얻을 수 있었고 알라니놀(1k)에 대해서는 66%의 enantiomeric excess를 얻을 수 있었다. 모든 반응에서 L-호모알라닌이 99% enantiomeric excess로 생성 되는 것을 확인 하였다. 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다.
표 15
키랄 아민 반응시간(h) 전환율(%) (R)-아민의 ee(%)
1a 3 49.9 >99
1b 3.5 50.5 >99
1c 28 35.1 52
1c 30 50.1 >99
1d 5 50.9 >99
1e 7 50.0 >99
1f 8 50.2 >99
1g 8 50.1 >99
1h 9 50.5 >99
1i 24 37.4 58
1i 24 50.2 >99
1j 9 50.6 >99
1k 30 40.8 66
실험예 8. L-쓰레오닌과 라세믹 아민을 기질로 하면서, (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈의 커플드 엔자임 반응을 이용한 (S)-아민의 수득과 D-호모알라닌의 생산
실시예 7에서 정제된 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 쓰레오닌 디아미네이즈를 이용하여 커플드 엔자임 반응을 이용한 아민의 키네틱 레졸루션과 D-호모알라닌의 생산 실험을 수행하였다. 30mM α-메틸벤질아민, 20 mM L-쓰레오닌, 0.1 mM PLP, 50 mM phosphate 버퍼 pH 7.5에 1.5 U/ml (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 4.5 U/ml 쓰레오닌 디아미네이즈를 첨가하여 각 (S) 배열 또는 (R) 배열 α-메틸벤질아민의 농도를 반응시간에 따라 측정하였다. 99%이상의 광학적 순도를 5시간 반응만에 얻을 수 있었으며, 마찬가지로 D-호모알라닌을 99%이상의 광학적 순도로 얻을 수 있었다. 그 결과를 하기 도 6에 나타내었다.
본 발명의 라세믹 아민 화합물 제조방법에 따르면 α-케토산이 반응 중간체로 형성되므로 고가의 α-케토산을 반응 출발 물질로 사용할 필요가 없으며, 본 발명의 방법에 의해 제조된 광학 활성 아민 화합물은 광학적 순도가 99% 이상이므로 키랄 화합물을 필요로 하는 의약, 농약 산업 등에 폭넓게 사용될 수 있다.

Claims (19)

1) 기질인 라세믹 아미노산, 아미노 수용체 및 아미노 공여체를 효소인 D- 또는 L- 선택적 아미노산 트랜스아미네이즈 및 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 제공하는 단계;
2) 상기 1)단계에서 제공된 기질 중 라세믹 아미노산과 아미노 수용체가 효소인 D- 또는 L- 선택적 아미노산 트랜스아미네이즈의 반응에 의하여 α-케토산을 생산하는 단계; 및
3) 상기 α-케토산이 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈와 반응하여 광학 활성 아미노산을 생산하는 단계를 포함하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 1)단계에서 D-아미노산 트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 2)단계에서 라세믹 아미노산 중 D-아미노산과 아미노 수용체가 효소인 D-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈에 의하여 α-케토산을 생산한 후, 상기 3)단계에서 α-케토산이 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 L-아미노산을 생산하는 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 1)단계에서 L-아미노산 트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 2)단계에서 라세믹 아미노산 중 L-아미노산과 아미노 수용체가 효소인 L-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈에 의하여 α-케토산을 생산한 후, 상기 3)단계에서 α-케토산이 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 D-아미노산을 생산하는 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)에서 유래된 것으로서, [서열번호 1]의 염기서열로 암호화 되는 효소 또는 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)에서 유래된 것으로서, [서열번호 2]의 염기서열로 암호화 되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 아스퍼질러스 터레우스(Aspergillus terreus)에서 유래된 것으로서, [서열번호 3]의 염기서열로 암호화 되는 효소 또는 (Arthrobacter sp.)에서 유래된 것으로서, [서열번호 4]의 염기서열로 암호화 되는 효소 인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 라세믹 아미노산은 라세믹 알라닌, 라세믹 세린, 라세믹 호모세린, 라세믹 노르발린, 라세믹 노르류신 및 라세믹 류신으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 아미노 수용체는 α-케토글루타레이트, 페닐글라이옥실레이트 또는 페닐파이루베이트 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 아미노 공여체는 아이소프로필아민, 메틸벤질아민 또는 벤질아민으로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 D-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈는 바실러스 스패리쿠스(Bacillussphaericus)로부터 유래된 것으로서, [서열번호 5]의 염기서열로 암호화되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 L-선택적 아미노산 트랜스아미네이즈는 대장균(Escherichiacoli)로부터 유래된 것으로서, [서열번호 6]의 염기서열로 암호화되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조 방법.
1) 기질인 라세믹 아민 및 L-쓰레오닌을 효소인 쓰레오닌 디아미네이즈 및 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 제공하는 단계;
2) 상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 L-쓰레오닌을 디아미네이션하여 아미노 수용체인 α-케토산을 생산하는 단계; 및
3) 상기 1)단계에서 제공된 라세믹 아민과 상기 2)단계에서 생성된 α-케토산이 (S)- 또는 (R)- 선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 키네틱 레졸루션을 통해 광학 활성 아민을 생산하는 단계를 포함하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 1)단계에서 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 라세믹 아민 중 (S)-아민과 상기 2)단계에서 생성된 α-케토산이 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 키네틱 레졸루션을 통해 (R)-아민을 생산하는 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 1)단계에서 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈를 제공하는 경우에는 상기 3)단계에서 라세믹 아민 중 (R)-아민과 상기 2)단계에서 생성된 α-케토산이 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈에 의하여 키네틱 레졸루션을 통해 (S)-아민을 생산하는 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 (S)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 오크로박트럼앤트로피(Ochrobactrumanthropi)에서 유래된 것으로서, [서열번호 1]의 염기서열로 암호화 되는 효소 또는 파라고쿠스덴이트리피컨스(Paracoccusdenitrificans)에서 유래된 것으로서, [서열번호 2]의 염기서열로 암호화 되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 (R)-선택적 오메가 트랜스아미네이즈는 아스퍼질러스 터레우스(Aspergillus terreus)에서 유래된 것으로서, [서열번호 3]의 염기서열로 암호화 되는 효소 또는 아스로박터 종(Arthrobacter sp.)에서 유래된 것으로서, [서열번호 4]의 염기서열로 암호화 되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 라세믹 아민은 α-메틸벤질아민, 4-플루오로-α-메틸벤질아민, α-에틸벤질아민, 1-메틸-3-페닐프로필아민, 1-아미노인단, sec-부틸아민, 사이크로포로필에틸아민, 2-아미노펜테인, 2-아미노옥테인, 1-메톡시-2-프로필아민 및 알라니놀로 이루어지는 군 중에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법.
제11항에 있어서,
상기 쓰레오닌 디아미네이즈는 대장균(Escherichiacoli)로부터 유래된 것으로서, [서열번호 7]의 염기서열로 암호화되는 효소인 것을 특징으로 하는 광학 활성 아민 화합물의 제조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조된 광학 활성 아미노산.
제11항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해서 제조된 광학 활성 아민.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109370998B (zh) * 2018-11-30 2020-08-04 江南大学 一种催化效率提高的ω-转氨酶突变体I215F
CN111951898B (zh) * 2020-06-30 2024-02-23 中国科学院微生物研究所 一种筛选能将l-氨基酸转化为2-酮酸酶的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090246837A1 (en) * 2006-02-13 2009-10-01 Karen Robins Process for The Preparation of Optically Active Chiral Amines
WO2011106696A2 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the production of l-homoalanine
WO2012007548A1 (en) * 2010-07-14 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. (r)-selective amination

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6358714B1 (en) * 1995-04-03 2002-03-19 The Nutrasweet Company Materials and methods for the production of D-phenylalanine
KR100433134B1 (ko) 2002-03-05 2004-05-27 김병기 신규한 호열성 미생물 및 이를 이용한 방향족ｌ-아미노산의 제조 방법
WO2006132145A1 (ja) * 2005-06-09 2006-12-14 Daicel Chemical Industries, Ltd. Ｌ－アミノ酸の製造方法
DE102009000592A1 (de) * 2009-02-04 2010-08-05 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aminogruppen tragenden, multizyklischen Ringsystemen
KR101291586B1 (ko) 2012-06-26 2013-08-01 현대합성공업 주식회사 워셔액 누출 방지기능을 가지는 워셔액 탱크

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090246837A1 (en) * 2006-02-13 2009-10-01 Karen Robins Process for The Preparation of Optically Active Chiral Amines
WO2011106696A2 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for the production of l-homoalanine
WO2012007548A1 (en) * 2010-07-14 2012-01-19 Dsm Ip Assets B.V. (r)-selective amination

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DOMINIK KOSZELEWSKI ET AL.: "Synthesis of optically active amines employing recombinant w-transaminases in E. coli cells", CHEMCATCHEM, vol. 2, 2010, pages 73 - 77 *
JONG-SHIK SHIN ET AL.: "Asymmetric snythesis of chiral amines with w-transaminase", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 65, no. 2, 20 October 1999 (1999-10-20), pages 206 - 211 *
KAZUO YONAHA ET AL.: "D-amino acid aminotransferase of Bacillus sphaericus", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 250, no. 17, 1975, pages 6983 - 6989 *

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