WO2014076338A1 - Uso de un agente fotosensible capaz de producir especies reactivas de oxígeno en la preparación de un medicamento útil para la terapia fotodinámica de una enfermedad relacionada con células madre, uso "in vitro" y composición farmacéutica - Google Patents

Uso de un agente fotosensible capaz de producir especies reactivas de oxígeno en la preparación de un medicamento útil para la terapia fotodinámica de una enfermedad relacionada con células madre, uso "in vitro" y composición farmacéutica Download PDF

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Jesús ESPADA REGALADO
Elisa CARRASCO CERRO
María Inmaculada CALVO SANCHEZ
Alfonso BLAZQUEZ-CASTRO
Angeles Juarranz De La Fuente
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Universidad Autonoma De Madrid
Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
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Definitions

  • the present invention relates to a second medical indication of Reactive Oxygen Species (ROS) in the medical field of stem cell related diseases in a subject.
  • ROS Reactive Oxygen Species
  • Photodynamic Therapy is a therapeutic modality of widespread clinical use for the treatment of different skin diseases, including cancer.
  • PDT is based on the exogenous administration of photosensitive compounds (FS) or precursors thereof that accumulate by different mechanisms preferentially in the target tissues.
  • FS photosensitive compounds
  • the irradiation of the tissue with light of suitable wavelength, generally in the red region of the spectrum ( ⁇ > 600 nm) for greater tissue penetration, and in the presence of intracellular oxygen induces the production of reactive oxygen species ("Reactive" Oxygen Species ", ROS), especially singlet oxygen.
  • ROS reactive oxygen species
  • the rapid intracellular accumulation of ROS above a critical threshold promotes strong photosensitization that induces cell death.
  • AAL 5-Aminolevulinic acid
  • MAL methylated methylaminolevulinate derivative
  • TFD-MAL treatment is widespread in clinical dermatology, particularly for the treatment of actinic keratosis and basal cell carcinoma. It has been described that experimental treatment with exogenous sources of ROS in low amounts, such as hydrogen peroxide, can promote cell proliferation in in vitro cultures (Boonstra J, Post JA. "Molecular events associated with reactive oxygen species and cell cycle progression in mammalian cells ". Gene 337: 1-13, 2004), including potential neural progenitor cells grown by the neurosphere system (Le Belle JE et al.” Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levéis that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K / Akt-dependent manner ", Cell Stem Cell. 8: 59-71, 2011).
  • the inventors describe an experimental procedure that uses TFD-MAL to induce an endogenous production of ROS in the hair follicle capable of activating the epidermal stem cells contained in this niche.
  • This stimulation of epidermal stem cells is due to transcriptional activation by ROS in the target tissue of genes of the prolactin 2 family, also known as proliferins, particularly proliferin-2 or Prl2c3.
  • proliferins particularly proliferin-2 or Prl2c3.
  • Prl2c3 a potential role for Prl2c3 has been proposed in the in vitro expansion of hematopoietic stem cells (Choong ML et al. "A novel role for proliferin-2 in the ex vivo expansion of hematopoietic stem cells", FEBS Lett. 550 : 155-62, 2003)
  • the " ⁇ n vivo" stimulation of genes of the proliferin family by ROS associated with an activation of epidermal stem cells is a surprising and relevant discovery
  • an essential limitation is the generation time of a functional cutaneous equivalent, which requires the "ex vivo" expansion of the epidermal progenitors and the stratification of the epidermal component in contact with air.
  • inadequately long times in the production of equivalents for autograft pose an immediate risk for the patient, which requires the use of alternative therapies such as grafts of corpse skin or synthetic equivalents little humanized.
  • alternative therapies such as grafts of corpse skin or synthetic equivalents little humanized.
  • the artificial skin generation time is directly related to its production cost. Therefore, a problem that arises in the art is to develop an experimental procedure to accelerate these processes during the formation of the cutaneous equivalent.
  • the solution provided by the present invention is a treatment by a TFD method capable of inducing endogenous ROS production and the activation of epidermal stem cells.
  • the present invention is the use of a photosensitive agent, or its precursor, capable of producing reactive oxygen species in the preparation of a medicament useful for the treatment by photodynamic therapy of a disease related to the stem cells in a subject, preferably stem cells.
  • a photosensitive agent or its precursor, capable of producing reactive oxygen species in the preparation of a medicament useful for the treatment by photodynamic therapy of a disease related to the stem cells in a subject, preferably stem cells.
  • stem cells are hematopoietic stem cells.
  • photosensitive agent means a compound capable of producing ROS in the presence of oxygen when irradiated with light of a suitable wavelength, which is administered exogenously or produced by the organism itself from a precursor .
  • precursor of a photosensitive agent is understood as a compound administered exogenously from which a photosensitive compound results in the cell.
  • ROS reactive Oxygen Species
  • Photodynamic Therapy or PDT is understood as a procedure whereby the production of ROS in a target tissue is induced after promoting the accumulation in said tissue of a photosensitive agent and irradiating it in the presence of oxygen with light of a suitable wavelength
  • Diseases related to stem cells are understood as those diseases that present with functional defects in homeostatic tissue maintenance and, consequently, directly imply a loss or functional deregulation of the activity of said stem cells ( Wagers, AJ. "The stem cell niche in regenerative medicine.” Céll Stem Cell, 10: 362-369, 2012).
  • said photosensitive agent is protoporphyrin IX (PplX).
  • said precursor of a photosensitive agent is a precursor of PplX, more preferably still 5-aminolevulinic acid or its chemical derivatives, and among these chemical derivatives the most preferable is methylaminolevulinate (MAL).
  • MAL methylaminolevulinate
  • “chemical derivative" of 5- aminolevulinic acid (AAL) is understood as an organic compound that contains the basic chemical structure of the AAL by presenting one or more substituents or chemical radicals in any of the atoms of said basic structure.
  • AAL 5- aminolevulinic acid
  • said subject on which photodynamic therapy is applied is a mammal, preferably human.
  • the invention describes an adapted methodology of PDT that allows generating a controlled and endogenous production of ROS specifically in the prominent region of the hair follicle.
  • epidermal stem cells contained in this niche, an acceleration of hair growth, an increase in collagen in the dermis and an induction in the expression of prolactin family 2 genes ( proliferinas), in particular of Prl2c3.
  • proliferinas proliferin family 2 genes
  • Prl2c3 proliferinas
  • Epidermal stem cells are responsible for the homeostatic maintenance of the skin, and their activity is related to all dermatoses that affect the homeostasis of the skin, cancerous or not, as well as aging-related processes such as wrinkles or hair loss. and the healing of wounds and burns.
  • said stem cell related disease is a dermatosis or skin disease, more preferably cancer and even more preferably a carcinoma.
  • basal cell squamous cell carcinoma, Bowen's disease, extramammary Paget's disease, melanoma or Gorlin syndrome; or collagen diseases, adermatoglipia, acrocordon, a hair follicle disease, preferably alopecia, Bloom syndrome, atopic dermatitis, dyschromias, hair dysplasia, bullous epidermolysis, stretch marks, photoallergy, hemangiomas, hyperpigmentation, ichthyosis, follicular mucinosis, necrobiosis, lipoidicus psoriasis, keratosis, seborrhea, Graham-Little syndrome, loose anagen hair syndrome, vitiligo, xerosis or degenerative processes associated with normal or pathological aging.
  • basal cell squa
  • Another preferable embodiment of the invention is the use of a photosensitive agent, or its precursor, capable of producing ROS, and at least one other therapeutic agent in the preparation of a medicament useful for the treatment by PDT of a disease related to the stem cells in a subject, preferably epidermal.
  • Another more preferable embodiment of the invention is the use of a photosensitive agent, or its precursor, capable of producing ROS for "in vitro" activation of stem cells, and yet another embodiment, for "in vitro” production of proteins of the prolactin family 2, more preferably still proliferin-2.
  • activation of stem cells is understood as the stimulation of proliferation and / or of the functional differentiation programs of stem cells.
  • the stimulation of stem cells according to the present invention has a direct potential application in the area of bio-engineering for the acceleration of the growth of skin equivalents of epidermal or dermo-epidermal component (artificial skins) used in regenerative medicine and as substrates to prove viability.
  • Biological of pharmacological and cosmetic compounds. So a technological embodiment of the invention is the use of a photosensitive agent, or its precursor, capable of producing ROS for the generation of dermo-epidermal or epidermal skin equivalents.
  • the therapeutic use of the invention can also be expressed as a method of treatment by PDT of a disease related to stem cells, preferably epidermal stem cells, in a preferably human subject, which comprises administering to said subject affected by the disease a therapeutically amount.
  • Effective of a photosensitive agent or its precursor capable of producing ROS.
  • it is a method of treatment by PDT of a disease related to the stem cells, which comprises administering a therapeutically effective amount of a pharmaceutical composition of a photosensitive agent or its precursor, capable of producing ROS to a preferably human subject in need. her.
  • the most preferable embodiment of the invention is a method of treatment by PDT of a disease related to epidermal stem cells in a human, which comprises administering to said human affected by the disease a therapeutically effective amount of methylaminolevulinate.
  • the therapeutic use of the invention can also be expressed as a photosensitive agent or its precursor, capable of producing ROS for use in the treatment by PDT of a disease related to stem cells in a subject, preferably epidermal stem cells. Another embodiment is that they are hematopoietic stem cells.
  • Another embodiment of the invention is a photosensitive agent or its precursor, capable of producing ROS and at least one other therapeutic agent for use in the treatment by PDT of a disease related to stem cells in a subject, preferably epidermal stem cells.
  • Another preferable embodiment is the photosensitive agent of the invention, or its precursor, capable of producing ROS for "in vitro” activation of stem cells, and yet another preferable embodiment is that it is for "in vitro" production of family proteins. 2 of prolactin, more preferably still proliferin-2.
  • yet another embodiment is the photosensitive agent, or its precursor, capable of producing ROS of the invention, for the generation of dermo-epidermal or epidermal skin equivalents.
  • the present invention relates to methods for functionally activating stem cells that can be applied in regenerative medicine for the treatment and recovery of skin wounds caused by burns, abrasions or other types of epithelial damage.
  • the invention represents the definitive technological advantage over grafting techniques that allows in situ stimulation of the hair follicle stem cells to contribute to epithelial regeneration without removing them from their own niche, thus eliminating all risks associated with external manipulation.
  • the results of the examples provided (Example 8) indicate that PDT is capable of inducing the activation and mobilization of epidermal stem cells resident in the prominent region towards the hair bulb region, from where they promote hair growth.
  • compositions comprising a cosmetic or pharmaceutically effective amount of a photosensitive agent, or its precursor, and at least one excipient or adjuvant
  • a preferable embodiment of the invention is that the photosensitive agent of said composition is protoporphyrin IX; or that the precursor of said photosensitive agent is 5- aminolevulinic acid or its chemical derivatives, and among these chemical derivatives preferably methylaminolevulinate (MAL).
  • MAL methylaminolevulinate
  • the photosensitive agent of the invention is incorporated into a vehiculization system or a cosmetically or pharmaceutically acceptable sustained release system selected from the group consisting of liposomes, mixed liposomes, oleosomes, niosomes, etosomes microcapsules, microcapsules, nanocapsules, sponges, cyclodextrins, vesicles, micelles, mixed surfactant micelles, mixed phospholipid-surfactant micelles, millospheres, microspheres, nanospheres, lipospheres, microemulsions, nanoemulsions, miniparticles, miliparticles, microparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles, nanoparticles
  • the cosmetic or pharmaceutical composition of the invention be present in a formulation selected from the group consisting of creams, multiple emulsions, anhydrous compositions, aqueous dispersions, oils, milks, balms, foams, lotions, gels, cream gels, hydroalcoholic solutions, hydro-glycol solutions, hydrogels, liniments, serums, soaps, shampoos, conditioners, serums, ointments, mousses, ointments, powders, bars, pencils, vaporizers, aerosols, capsules, gelatin capsules, soft capsules, hard capsules, tablets, Sugar-coated tablets, granulated forms, chewing gums, solutions, suspensions, emulsions, syrups, polysaccharide films, jellies and gelatin.
  • a formulation selected from the group consisting of creams, multiple emulsions, anhydrous compositions, aqueous dispersions, oils, milks, balms, foams, lotions, gels, cream gels,
  • said composition is incorporated into a product selected from the group consisting of dark circles, makeup funds, make-up lotions, cleansing milks, eye shadows, lipsticks, lip gloss, lip balm and powder.
  • the photosensitive agent of the inventive composition, or its precursor is incorporated into a fabric, a non-woven fabric or a product sanitary, preferably selected from the group consisting of bandages, gauze, t-shirts, socks, socks, underwear, girdles, gloves, diapers, pads, dressings, bedspreads, wipes, adhesive patches, non-adhesive patches, occlusive patches, microelectric patches and facial masks .
  • the adjuvant of the composition of the invention is selected from the group consisting of heat shock proteins, other agents that stimulate the synthesis of heat shock proteins, inhibitors of aggregation of acetylcholine receptors, agents that inhibit muscle contraction, anticholinergic agents, elastase inhibitors, matrix metalloprotease inhibitors, melanin synthesis stimulating or inhibiting agents, bleaching or depigmenting agents, propigmentation agents, self-tanning agents, anti-aging agents, NO-inhibitors synthase, 5a-reductase inhibitors, lysyl- and / or prolyl hydroxylase inhibitors, antioxidant agents, free radical capture and / or atmospheric anti-pollution agents, carbonyl reactive species capture agents, anti-glycation agents, antihistamine agents, agents antiv rals, antiparasitic agents, emulsifying agents, emollients, organic solvents, liquid propellants, skin conditioners, humectants, moisture-retaining
  • Said anti-wrinkle agents and / or anti-aging agents are selected from the group consisting of Acetyl Hexapeptide-8, Acetyl Heptapeptide-4, Acetyl Octapeptide-3, Pentapeptide-18, Acetyl Hexapeptide-25, Diaminopropionoyl Tripeptide-33, Tripeptide-10 Citrullide, Acetyl -5, Acetyl Tripeptide-30 Citrulline, Acetyl Tetrapeptide-30, Dimethylmethoxy Cromanol, Dimethylmethoxy Cromanil Palmitate, Pseudoalteromones ferment extract, Ca2 + channel antagonists, retinol and its derivatives, idebenone and its derivatives, Coenzyme Q10 and its derivatives, boswellic acid and its derivatives, GHK and its derivatives and / or salts, carnosine and its derivatives, DNA repair enzymes, chloride channel agonists, the Hydrolyzed Wheat Protein mixture, Hydrolyze
  • said healing and / or re-epithelial stimulating agent or healing and / or re-epithelializing agent is selected from the group consisting of Pseudoalteromones and Tripeptide-10 Citrulline ferment extract.
  • said adjuvant is of synthetic origin or is a plant extract or comes from a biotechnological process or comes from a combination of a synthetic procedure and a biotechnological process.
  • Labeled cells (Label Retaining Cells, LRCs) generated by administration of serial injections of the thymidine analogue BrdU to neonatal mice and subsequent analysis at 50 days were detected, and quantified by immunofluorescence in "in toto" assemblies of tail tail epidermis adult mice
  • a significant increase in CRFs was observed in the prominent region of the hair follicle (FP) in telogén two days after treatment (PDT 2d) with respect to controls, indicating a stimulation of the proliferation of epidermal stem cells of FP in treatment response
  • the bars indicate the typical error. Scale bar: 100 ⁇ . ***: significant, P ⁇ 0.001.
  • Eosin fluorescence reveals an increase in the density of collagen fibers in the dermis observed 6 days after PDT. Staining: H-E. Scale bar: 20 ⁇ ⁇ .
  • PDT causes changes in the expression and localization of proliferin-2 in the skin. Immunofluorescence in histological sections of skin showed an increased expression of proliferin-2 in the epidermis after the application of TFD-MAL and a Novel nuclear localization of this protein as a result of the treatment. Scale bar: 50 ⁇ .
  • FIG. 6 Growth induction and "in vitro" expansion of epidermal stem cells by Prlc3.
  • Mouse skin epidermal stem cells were isolated and grown in conditioned culture medium containing high amounts of Prl2c3 or in control medium. In these cultures, the number of colonies with a minimum of four cells was quantified after seven days, an indicator of sustained proliferative activity. The results indicated a significant increase in the number of colonies in the cultures of epidermal stem cells treated with growth medium conditioned by Prl2c3.
  • mice 10-day-old neonatal C57BL / 6 line mice were used for epidermal stem cell screening experiments, and 7-week-old adults for the remaining trials.
  • the animals used in each experiment were bait brothers and comparisons were established between individuals of the same sex, to avoid differences attributable to this factor.
  • the experiments were carried out in accordance with the regulations governing the handling and care of laboratory animals (Royal Decree 1201/2005).
  • mice's back was shaved and depilatory cream (Veet®) was applied.
  • MAL methylated derivative of ALA
  • Methodvix®, Galderma a commercial cream
  • the endogenous production of PplX in the skin of the back was verified by the emission of red fluorescence characteristic of the PplX under excitation with ultraviolet (UV) light of 407 nm, using a digital camera provided with two lamps of said wavelength.
  • UV ultraviolet
  • the animals were anesthetized by injection intraperitoneal (ip) of a 3: 1 solution of Imalgene 500 (Merial) and Domtor (Pfizer) (50 ⁇ / mouse; 0.864 mg of ketamine hydrochloride and 0.005 mg of medetomidine hydrochloride per 10 g of body weight).
  • the 636 nm red light irradiation was performed uniformly on the dorsal surface of the tail and the spine for 3.5 min, using a 36 J / cm2 diode lamp (Aktilite®) located about 5 cm from the animal.
  • the animals After exposure to red light, the animals received a subcutaneous injection of Antisedan (Pfizer) 2: 1 with respect to the volume of Domtor administered, and were kept on thermal blankets until full recovery. After each test determined by the time the animals were sacrificed by C0 2 chamber and the skin was processed for the various analyzes.
  • Pfizer Antisedan
  • Example 3 Epidermal stem cell mapping identified as "Label Retaining Cells” (LRCs).
  • Neonatal mice received an i.p. injection once a day for four consecutive days. of 50 mg / kg of BrdU body weight (Sigma-Aldrich) (80 ⁇ ⁇ of BrdU 6.25 .mg / ml) in PBS, in order to extensively label the DNA in all skin cells.
  • the epidermal stem cells were identified based on the low replication rate that characterizes them as those cells capable of retaining the BrdU brand ("Label Retaining Cells", LRCs) for a prolonged period of time due to sporadic replication of your DNA.
  • LRCs Label Retaining Cells
  • the identification and quantification of LRCs after TFD-MAL treatment was carried out by immunofluorescence in in toto assemblies of tail epidermis that were observed in a confocal microscope.
  • Example 4 Skin processing, histology and immunofluorescence. Immediately after sacrificing the animal, the tail was separated from the body and a scalpel incision was made in the ventral zone of the animal, the skin being manually cleaved into a single piece. This was incubated in 10 ml of 5 mM EDTA in PBS for 6 h at 37 ° C and then the epidermis was separated from the dermis with the help of tweezers.
  • the epidermis samples were divided transversely into two portions: one was frozen at -80 ° C for RNA extraction and the other was fixed in 3.7% formaldehyde in PBS for 48 h at 4 ° C, washed in PBS and stored in PBS-0.02% sodium azide for the preparation of "in toto" assemblies. On the other hand, the skin of the loin was removed and fixed in 3.7% formaldehyde in PBS for at least 48 h at 4 ° C.
  • the blocked samples were incubated overnight at 4 ° C with a polyclonal antibody (Santa Cruz Biotechnology) against prolactin family 2 proteins (proliferins), including proliferin-2 (Prl2c3). They were then washed in PBS and incubated with the corresponding secondary antibody coupled to Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Finally, the samples were washed in PBS and mounted with Vectashield (Vector Labs) containing 5 ng / ml of DAPI (Merck).
  • the tail epidermis pieces were incubated with 1N HCI (45 min at 37 ° C) and with Tris-Borato-EDTA (5 min at room temperature), performing two Brief washings with distilled water after each incubation. They were subsequently permeabilized and blocked in PTG buffer (0.5% Triton X-100, 0.2% gelatin in PBS) for 1 h at room temperature, after which they were incubated with the primary anti-BrdU mouse monoclonal antibody conjugated to isothiocyanate of fluorescein (FITC) (Roche), overnight at 37 ° C. They were then washed repeatedly in PBS and mounted with Vectashield-DAPI.
  • 1N HCI 45 min at 37 ° C
  • Tris-Borato-EDTA 5 min at room temperature
  • Immunofluorescence samples were analyzed in a Leica TCS-SP2-AOBS spectral confocal microscope, using the excitation lasers of 488 nm for the FITC, 633 nm for the Cy3 and UV for the DAPI. Three-dimensional reconstructions were carried out with the help of the LCS Suite version 2.61 (Leica) program and subsequently processed with the Photoshop CS3 Extended version 10.0.1 (Adobe) program. The histological sections stained with HE were analyzed in an Olympus BX61 fluorescence microscope coupled to an Olympus DP50 digital capture camera, using clear field and blue excitation light (BP 460-490 excitation filter and BA 520IF barrier filter).
  • BP 460-490 excitation filter and BA 520IF barrier filter clear field and blue excitation light
  • Example 5 RNA extraction from Prl2c3, analysis of large-scale gene expression patterns and qRT-PCR
  • RNA concentration and purity were determined by spectrophotometry (Nanodrop ND1000, Nanodrop Technologies).
  • the large-scale gene expression analysis was performed using arrays ("arrays") of Agilent Technologies (Agilent.SingleColor. 14868).
  • Real-time quantitative PCR expression analysis was performed using the 7900HT Fast Real Time PCR Applied Biosystems system with SYBR Green.
  • Example 6 Induction of proliferation of stem cells resident in the prominent region of the hair follicle by TFD-MAL treatment.
  • the hair follicle (FP) was used as a model, whose prominent region is the main reservoir of skin stem cells.
  • Stem cells were identified thanks to their low characteristic proliferation rate, which allows the retention of a BrdU nuclear mark for a prolonged period of time after serial administration of the nucleotide analogue in neonatal age, allowing them to be identified as LRCs (Braun et al, "Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualization of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis ". Development.
  • Example 7 Induction of transient hyperplasia in the epidermis and increase in the density of collagen fibers in the dermis by TFD-MAL treatment.
  • the large-scale morphological changes produced by TFD-MAL were characterized in histological sections of dorsal skin of the back stained with HE. The analysis of these sections indicated that the treatment induces a transient hyperplasia in the epidermis, observing the most obvious response 2 days after treatment and reverting to a normal state 7 days after it (Fig. 2A).
  • Fig. 2A There were also very marked changes in the morphology of the dermis, which presented a strong increase in the density of collagen fibers 7 days after the MAL-TFD treatment, characterized as an increase in the specific fluorescent emission of eosin when intercalated into the collagen fibers (Espada et al. "Selective fluorescence of eosinophilic structures in grasshopper and mammalian testis stained with haematoxylin-eosin" Histochemistry 99: 385-390, 1993) (Fig. 2B).
  • Example 8 Acceleration of hair growth by the TFD-MAL treatment.
  • Example 9 Specific induction of the Prl2c3 gene by TFD-MAL treatment.
  • RNA microarrays using mRNA obtained from the loin skin and of the epidermis of the tail.
  • the Prl2c3 gene product was identified as the mRNA whose expression was most strongly modified in response to the TFD-MAL treatment, a result that was validated by qRT-PCR (Fig. 4).
  • Immunolocalization of Prl2c3 protein in histological sections of dorsal skin showed a low intensity and diffuse pattern in cytoplasm in the epidermis of control animals, while the increase in expression levels after treatment was confirmed, revealing a novel nuclear location. of this protein in animals subjected to TFD-MAL (Fig. 5).
  • Example 10 Induction of the growth and expansion "in vitro" of epidermal stem cells by a culture medium containing high amounts of Prl2c3.
  • the Prl2c3 cDNA was isolated by RT-PCR, subsequent cloning into the pcDNA3.1A expression vector and transfection of this vector into HEK293T cells.
  • the culture medium conditioned by the growth of cells transfected with the cloned vector contained on average up to 10 times more Prlc3 protein than a control medium of cells transfected with the empty vector.
  • epidermal stem cells were isolated from mouse skin according to established protocols (Espada et al. "Nuclear envelope defects cause stem cell dysfuction in premature-aging mice" J. Cell Biol. 181: 27, 35, 2008). These cultures were treated with conditioned medium. Cultures with conditioned medium showed a significantly higher number of colonies of more than 4 cells than the control cultures, treated with cell medium transfected with the empty vector (Fig. 6).

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Abstract

La presente invención es el uso de un agente fotosensible, o su precursor, capaz de producir especies reactivas de oxígeno (ROS) en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento por terapia fotodinámica (TFD) de una enfermedad relacionada con las células madre en un sujeto, preferiblemente células madre epidérmicas.

Description

USO DE UN AGENTE FOTOSENSIBLE CAPAZ DE PRODUCIR ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO EN LA PREPARACIÓN DE UN MEDICAMENTO ÚTIL PARA LA TERAPIA FOTODINÁMICA DE UNA ENFERMEDAD RELACIONADA CON CÉLULAS MADRE, USO "IN VITRO" Y COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA
Campo de la Invención
La presente invención refiere a una segunda indicación médica de Especies Reactivas de Oxígeno ("Reactive Oxygen Species", ROS) en el campo médico de las enfermedades relacionadas con células madre en un sujeto.
Antecedentes
La Terapia Fotodinámica (TFD) es una modalidad terapéutica de uso clínico muy extendido para el tratamiento de distintas patologías cutáneas, incluyendo el cáncer. La TFD se basa en la administración exógena de compuestos fotosensibles (FS) o precursores de los mismos que se acumulan por distintos mecanismos de forma preferente en los tejidos diana. La irradiación del tejido con luz de longitud de onda adecuada, generalmente en la región roja del espectro (λ>600 nm) para una mayor penetración en el tejido, y en presencia de oxígeno intracelular induce la producción de especies reactivas de oxígeno ("Reactive Oxygen Species", ROS), en especial oxígeno singlete. La rápida acumulación intracelular de ROS por encima de un umbral crítico promueve una fuerte fotosensibilización que induce muerte celular.
El ácido 5-aminolevulínico (AAL) y, en mayor medida, su derivado metilado metilaminolevulinato (MAL), son dos de los compuestos más utilizados en la clínica en protocolos dermatológicos con TFD. Su bajo peso molecular determina una elevada absorción a través de la epidermis permitiendo su aplicación tópica. Estos compuestos no son fotoactivos por sí mismos, pero actúan como precursores del FS endógeno protoporfirina IX (PplX). Una vez absorbidos por la célula se incorporan en la ruta metabólica de biosíntesis del grupo hemo promoviendo una acumulación anormal de PplX que puede durar entre horas y días, con la consecuente fotosensibilización del tejido diana. El tratamiento TFD-MAL está muy extendido en dermatología clínica, en particular para el tratamiento de la queratosis actínica y el carcinoma basocelular. Se ha descrito que el tratamiento experimental con fuentes exógenas de ROS en bajas cantidades, como el peróxido de hidrógeno, puede promover la proliferación celular en cultivos in vitro (Boonstra J, Post JA. "Molecular events associated with reactive oxygen species and cell cycle progression in mammalian cells". Gene 337:1- 13, 2004), incluyendo potenciales células progenitoras neurales crecidas mediante el sistema de neurosferas (Le Belle JE et al. "Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levéis that regúlate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt- dependant manner", Cell Stem Cell. 8:59-71 , 2011 ).
Sin embargo, no existe hasta el momento ninguna evidencia experimental que indique una relación causal entre una producción endógena de ROS en un tejido y la activación funcional de algún tipo de célula madre contenida en dicho tejido que implique consecuencias fisiológicas, con potencial uso clínico, farmacológico o cosmético. En gran medida esto se debe a que no existe ningún procedimiento experimental "in vivo" que permita inducir una producción controlada de ROS endógena en un tejido.
Tampoco existen datos experimentales indicando que una acumulación de ROS endógena en tejidos pueda ser parte de un proceso homeostático normal funcionalmente dependiente de células madre. Al contrario, todos los resultados experimentales que muestran una acumulación "in vivo" de ROS en tejidos indican que esta acumulación es anormal y está asociada a condiciones patológicas y procesos de envejecimiento (Valko M et al. "Free radicáis and antioxidants in normal physiological functions and human disease", Int. J. Biochem. Cell Biol. 39: 44-84, 2007). Así mismo, el tratamiento tópico de un tejido con fuentes exógenas de ROS no puede considerarse en ningún caso biológicamente equivalente a una producción fisiológica de ROS endógeno. Los inventores describen un procedimiento experimental que utiliza TFD-MAL para inducir una producción endógena de ROS en el folículo piloso capaz de activar las células madre epidérmicas contenidas en este nicho. Esta estimulación de las células madre epidérmicas se debe a la activación transcripcional por ROS en el tejido diana de genes de la familia prolactina 2, también conocidos como proliferinas, particularmente proliferina-2 o Prl2c3. Teniendo en cuenta que se ha propuesto un papel potencial para Prl2c3 en la expansión in vitro de células madre hematopoyéticas (Choong ML et al. "A novel role for proliferin-2 in the ex vivo expansión of hematopoietic stem cells", FEBS Lett. 550:155-62, 2003), la estimulación" ¡n vivo" de genes de la familia proliferina por ROS asociada a una activación de células madre epidérmicas resulta un descubrimiento sorprendente y relevante por sí mismo.
En la técnica actual, uno de los usos más extendidos de las células madre epidérmicas en el área de la bioingeniería es la generación de equivalentes cutáneos de componente epidérmico o dermo-epidérmico (Shevchenko RV et al. "A review of tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction", J. R. Soc. Interface 7:229-58, 2010). Estos equivalentes cutáneos o pieles artificiales tienen aplicaciones muy importantes en medicina regenerativa, fundamentalmente para el tratamiento de quemaduras y heridas de gran extensión y profundidad. El tratamiento ideal para este tipo de lesiones es el autoinjerto con equivalentes cutáneos de diversos tipos generados a partir de piel del propio paciente. Dadas las restricciones establecidas en la Unión Europea (Directiva 2010/63/UE) y otros países para el uso de animales de experimentación, otra aplicación fundamental de los equivalentes cutáneos es su uso como modelos biológicos para probar la viabilidad y toxicidad de compuestos farmacéuticos y cosméticos.
En este tipo de aplicaciones una limitación esencial es el tiempo de generación de un equivalente cutáneo funcional, que requiere la expansión "ex vivo" de los progenitores epidérmicos y la estratificación del componente epidérmico en contacto con el aire. En clínica los tiempos excesivamente prolongados en la producción de equivalentes para autoinjerto suponen un riesgo inmediato para el paciente, que obliga a utilizar terapias alternativas como injertos de piel de cadáver o equivalentes sintéticos poco humanizados. En farmacología y cosmética, el tiempo de generación de piel artificial está directamente relacionado con su coste de producción. Por ello, un problema que se plantea en la técnica es desarrollar un procedimiento experimental para acelerar estos procesos durante la formación del equivalente cutáneo. Por otro lado, distintas evidencias experimentales indican que muchas patologías cutáneas, incluyendo distintos tipos de cáncer, alopecia y procesos como el envejecimiento pueden ser debidos a un defecto en la actividad de las células madre epidérmicas, y en particular de las que residen en el nicho del folículo piloso. Una limitación fundamental en el abordaje clínico de estas enfermedades es que los tratamientos disponibles actualmente son sintomáticos y no específicos, es decir que no están destinados a modular funcíonalmente la actividad de las células madre epidérmicas. El problema que se plantea en la técnica, por tanto, es desarrollar procedimientos más específicos y efectivos que los actuales para generar equivalentes cutáneos y tratar enfermedades relacionadas con células madre. La solución que aporta la presente invención es un tratamiento por un procedimiento TFD capaz de inducir la producción endógena de ROS y la activación de células madre epidérmicas.
Descripción
La presente invención es el uso de un agente fotosensible, o su precursor, capaz de producir especies reactivas de oxígeno en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento por terapia fotodinámica de una enfermedad relacionada con las células madre en un sujeto, preferiblemente células madre epidérmicas. En otra realización de la invención dichas células madre son células madre hematopoyéticas.
En la presente solicitud se entiende por "agente fotosensible" aquel compuesto capaz de producir ROS en presencia de oxígeno al ser irradiado con luz de una longitud de onda adecuada, que es administrado de forma exógena o producido por el propio organismo a partir de un precursor.
En la presente solicitud se entiende por "precursor de un agente fotosensible" aquel compuesto administrado por vía exógena del que resulta en la célula un compuesto fotosensible.
En la presente solicitud se entiende por "Especies Reactivas de Oxígeno" o ROS, los compuestos que presentan iones y radicales libres de oxígeno y peróxidos. En la presente solicitud se entiende por "Terapia Fotodinámica" o TFD a un procedimiento por el cual se induce la producción de ROS en un tejido diana después de promover la acumulación en dicho tejido de un agente fotosensible e irradiarlo en presencia de oxígeno con luz de una longitud de onda adecuada.
En la presente solicitud se entiende por "enfermedades relacionadas con células madre" aquellas enfermedades que cursan con defectos de funcionamiento en el mantenimiento homeostático de los tejidos y que, en consecuencia, implican directamente una pérdida o desregulación funcional de la actividad de dichas células madre (Wagers, AJ. "The stem cell niche in regenerative medicine". Céll Stem Cell, 10:362-369, 2012).
En una realización preferible de la invención, dicho agente fotosensible es protoporfirina IX (PplX). En otra realizacón preferible dicho precursor de un agente fotosensible es un precursor de PplX, más preferiblemente aún ácido 5- aminolevulínico o sus derivados químicos, y entre estos derivados químicos el más preferible es el metilaminolevulinato (MAL). En la presente solicitud se entiende por "derivado químico" del ácido 5- aminolevulínico (AAL) un compuesto orgánico que contiene la estructura química básica del AAL presentando uno o más sustituyentes o radicales químicos en alguno de los átomos de dicha estructura básica. Otra realización preferible del uso de la invención es que dicho sujeto sobre el que se aplica la terapia fotodinámica es un mamífero, preferiblemente humano.
La invención describe una metodología adaptada de TFD que permite generar una producción controlada y endógena de ROS específicamente en la región prominente del folículo piloso. Como consecuencia, se produce una activación de la proliferación de las células madre epidérmicas contenidas en este nicho, una aceleración del crecimiento del pelo, un incremento de colágeno en la dermis y una inducción en la expresión de genes de la familia 2 de la prolactina (proliferinas), en particular de Prl2c3. Las células madre epidérmicas son las responsables del mantenimiento homeostático de la piel, y su actividad está relacionada con todas las dermatosis que afectan a la homeóstasis de la piel, cancerosas o no, así como a procesos relacionados con el envejecimiento como arrugas o caída del pelo y a la cicatrización de heridas y quemaduras.
De forma que otra realización preferible más es que dicha enfermedad relacionada con las células madre es una dermatosis o enfermedad de la piel, más preferiblemente cáncer y más preferiblemente aún un carcinoma . basocelular, carcinoma espinocelular, enfermedad de Bowen, enfermedad de Paget extramamaria, melanoma o síndrome de Gorlin; o enfermedades del colágeno, adermatoglifia, acrocordón, una enfermedad del folículo piloso preferiblemente alopecia, síndrome de Bloom, dermatitis atópica, discromías, displasia pilosa, epidermólisis bullosa, estrías, fotoalergia, hemangiomas, hiperpigmentación, ictiosis, mucinosis folicular, necrobiosis lipoídica, nevus, psoriasis, queratosis, seborrea, síndrome de Graham-Little, síndrome del cabello anágeno suelto, vitíligo, xerosis o procesos degenerativos asociados al envejecimiento normal o patológico. En otra realización preferible más dicho medicamento se administra por vía tópica.
Otra realización preferible de la invención es el uso de un agente fotosensible, o su precursor, capaz de producir ROS, y al menos otro agente terapéutico en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento por TFD de una enfermedad relacionada con las células madre en un sujeto, preferiblemente epidérmicas.
Otra realización preferible más de la invención es el uso de un agente fotosensible, o su precursor, capaz de producir ROS para la activación "in vitro" de células madre, y otra realización más, para la producción "in vitro" de proteínas de la familia 2 de la prolactina, más preferiblemente aún proliferina-2.
En la presente solicitud se entiende por "activación de células madre" a la estimulación de la proliferación y/o de los programas de diferenciación funcional de células madre. La estimulación de células madre según la presente invención tiene una aplicación potencial directa en el área de la bioingenería para la aceleración del crecimiento de equivalentes cutáneos de componente epidérmico o dermo-epidérmico (pieles artificiales) utilizados en medicina regenerativa y como substratos para probar la viabilidad biológica de compuestos farmacológicos y cosméticos. De forma que una realización tecnológica de la invención es el uso de un agente fotosensible, o su precursor, capaz de producir ROS para la generación de equivalentes cutáneos dermo-epidérmicos o epidérmicos.
El uso terapéutico de la invención también se puede expresar como un método de tratamiento por TFD de una enfermedad relacionada con las células madre, preferiblemente células madre epidérmicas, en un sujeto preferiblemente humano, que comprende administrar a dicho sujeto afectado por la enfermedad una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente fotosensible o su precursor, capaz de producir ROS. En una realización preferible es un método de tratamiento por TFD de una enfermedad relacionada con las células madre, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica de un agente fotosensible o su precursor, capaz de producir ROS a un sujeto preferiblemente humano en necesidad de ella. En este sentido, la realización más preferible de la invención es un método de tratamiento por TFD de una enfermedad relacionada con las células madre epidérmicas en un humano, que comprende administrar a dicho humano afectado por la enfermedad una cantidad terapéuticamente efectiva de metilaminolevulinato. ,
El uso terapéutico de la invención también se puede expresar como un agente fotosensible o su precursor, capaz de producir ROS para uso en el tratamiento por TFD de una enfermedad relacionada con las células madre en un sujeto, preferiblemente células madre epidérmicas. Otra realización es que sean células madre hematopoyéticas.
Otra realización más de la invención es un agente fotosensible o su precursor, capaz de producir ROS y al menos otro agente terapéutico para uso en el tratamiento por TFD de una enfermedad relacionada con las células madre en un sujeto, preferiblemente células madre epidérmicas.
Otra realización preferible es el agente fotosensible de la invención, o su precursor, capaz de producir ROS para la activación "in vitro" de células madre, y otra realización preferible más es que sea para la producción "in vitro" de proteínas de la familia 2 de la prolactina, más preferiblemente aún proliferina-2.
En este sentido, aún otra realización más es el agente fotosensible, o su precursor, capaz de producir ROS de la invención, para la generación de equivalentes cutáneos dermo-epidérmicos o epidérmicos.
La presente invención refiere a métodos para activar funcionalmente células madre que pueden ser aplicados en medicina regenerativa para el tratamiento y recuperación de heridas en la piel provocadas por quemaduras, abrasiones u otros tipos de dañó epitelial. La invención representa la ventaja tecnológica definitiva sobre las técnicas de injerto que permite la estimulación in situ de las células madre del folículo piloso para contribuir a la regeneración epitelial sin extraerlas de su propio nicho, eliminando así todo riesgo asociado a la manipulación externa. Los resultados de los ejemplos aportados (Ejemplo 8) indican que la TFD es capaz de inducir la activación y movilización de las células madre epidérmicas residentes en la región prominente hacia la región del bulbo piloso, desde donde promueven el crecimiento del pelo. Se propone además su aplicación para el tratamiento alternativo de úlceras, heridas crónicas de tamaño mediano o pequeño, así como para el tratamiento de patologías cutáneas asociadas a una disfunción o pérdida de células madre epidérmicas. También su uso como coadyuvante en tratamientos de dermatología estética tras la realización de intervenciones quirúrgicas en zonas expuestas y visibles, y en pacientes sometidos a procedimientos de cirugía estética.
Otras realizaciones preferibles de la invención refieren a la composición cosmética o farmacéutica que comprende una cantidad cosmética o farmacéuticamente eficaz de un agente fotosensible, o su precursor, y al menos un excipiente o adyuvante
R cosmética o farmacéuticamente aceptable. En este sentido, una realización preferible de la invención es que el agente fotosensible de dicha composición sea la protoporfirina IX; o bien que el precursor de dicho agente fotosensible sea el ácido 5- aminolevulínico o sus derivados químicos, y entre estos derivados químicos preferiblemente el metilaminolevulinato (MAL).
Otra realización preferible es que el agente fotosensible de la invención, o su precursor, se encuentre incorporado a un sistema de vehiculización o a un sistema de liberación sostenida cosmética o farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo formado por liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas fosfolípido-tensioactivo, miliesferas, mícroesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas, nanopartículas sólidas lipídicas y soportes lipidíeos nanoestructurados.
Otra realización preferible más es que la composición cosmética o farmacéutica de la invención se presente en una formulación seleccionada del grupo formado por cremas, emulsiones múltiples, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones, geles, geles crema, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, serums, ungüentos, mousses, pomadas, polvos, barras, lápices, vaporizadores, aerosoles, cápsulas, cápsulas de gelatina, cápsulas blandas, cápsulas duras, comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, formas granuladas, gomas de mascar, soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, films de polisacáridos, jaleas y gelatina.
En otra realización preferible, dicha composición se encuentra incorporada a un producto seleccionado del grupo formado por correctores de ojeras, fondos de maquillaje, lociones desmaquillantes, leches desmaquillantes, sombras de ojos, barras de labios, brillos labiales, protectores labiales y polvos.
En otra realización más, el agente fotosensible de la composición de la invencón, o su precursor, se encuentra incorporado en un tejido, un tejido-no-tejido o un producto sanitario, preferiblemente seleccionado del grupo formado por vendas, gasas, camisetas, medias, calcetines, ropa interior, fajas, guantes, pañales, compresas, apositos, cubrecamas, toallitas, parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos, parches microeléctricos y mascarillas faciales.
Una realización preferible es que el adyuvante de la composición de la invención esté seleccionado del grupo formado por proteínas de choque térmico, otros agentes estimuladores de la síntesis de las proteínas de choque térmico, inhibidores de la agregación de los receptores de acetilcolina, agentes inhibidores de la contracción muscular, agentes anticolinérgicos, agentes inhibidores de elastasa, agentes inhibidores de las metaloproteasas de matriz, agentes estimuladores o inhibidores de la síntesis de melanina, agentes blanqueantes o despigmentantes, agentes propigmentantes, agentes autobronceantes, agentes antienvejecimiento, agentes inhibidores de la NO-sintasa, agentes inhibidores de la 5a-reductasa, agentes inhibidores de lisil- y/o prolil-hidroxilasa, agentes antioxidantes, agentes capturadores de radicales libres y/o anticontaminación atmosférica, agentes capturadores de especies reactivas carbonilo, agentes antiglicación, agentes antihistamínicos, agentes antivírales, agentes antiparasitarios, agentes emulsionantes, emolientes, disolventes orgánicos, propelentes líquidos, acondicionadores de la piel, humectantes, sustancias que retienen la humedad, alfahidroxiácidos, betahidroxiácidos, hidratantes, enzimas epidérmicas hidrolíticas, vitaminas, aminoácidos, proteínas, pigmentos o colorantes, tintes, polímeros gelificantes, espesantes, tensioactivos, suavizantes, agentes antiarrugas, agentes capaces de disminuir o tratar las bolsas bajo los ojos, agentes exfoliantes, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, agentes fungistáticos, agentes bactericidas, agentes bacteriostáticos, agentes estimuladores de la síntesis de macromoléculas dérmicas o epidérmicas y/o capaces de inhibir o prevenir su degradación, agentes estimuladores de la síntesis de colágeno, agentes estimuladores de la síntesis de elastina, agentes estimuladores de la síntesis de decorina, agentes estimuladores de la síntesis de laminina, agentes estimuladores de la síntesis de defensinas, agentes estimuladores de la síntesis de aquaporinas, agentes estimuladores de la síntesis de ácido hialuronico, agentes estimuladores de la síntesis de fibronectina, agentes estimuladores de la síntesis de sirtuínas, agentes estimuladores de la síntesis de lípidos y componentes del estrato córneo, ceramidas, ácidos grasos, agentes inhibidores de la degradación de colágeno, agentes inhibidores de la degradación de elastina, agentes inhibidores de proteasas de serina como catepsina G, agentes estimuladores de la proliferación de fibroblastos, agentes estimuladores de la proliferación de queratinocitos, agentes estimuladores de la proliferación de adipocitos, agentes estimuladores de la proliferación de melanocitos, agentes estimuladores de la diferenciación de queratinocitos, agentes estimuladores de la diferenciación de adipocitos, agentes inhibidores de la acetilcolinesterasa, agentes dermorelajantes, agentes estimuladores de la síntesis de glicosaminoglicanos, agentes antihiperqueratosis, agentes comedolíticos, agentes antipsoriasis, agentes reparadores del ADN, agentes protectores del ADN, estabilizantes, agentes antiprurito, agentes para el tratamiento y/o cuidado de pieles sensibles, agentes reafirmantes, agentes antiestrías, agentes astringentes, agentes reguladores de la producción de sebo, agentes lipolíticos o estimuladores de la lipólisis, agentes anticelulíticos, agentes antiperspirantes, agentes estimuladores de la cicatrización, agentes coadyuvantes de la cicatrización, agentes estimuladores de la reepitelización, agentes coadyuvantes de la reepítelización, factores de crecimiento de citoquínas, agentes calmantes, agentes antiinflamatorios y/o analgésicos, agentes anestésicos, agentes que actúen sobre la circulación capilar y/o la microcirculación, agentes estimuladores de la angiogénesis, agentes inhibidores de la permeabilidad vascular, agentes venotónicos, agentes que actúen sobre el metabolismo de las células, agentes destinados a mejorar la unión dermis-epidermis, agentes inductores del crecimiento del cabello, agentes inhibidores o retardantes del crecimiento del cabello, agentes retardantes de la caída del cabello, conservantes, perfumes, agentes quelantes, extractos vegetales, aceites esenciales, extractos marinos, agentes provenientes de un procedimiento de biofermentación, sales minerales, extractos celulares, filtros solares y agentes fotoprotectores de naturaleza orgánica o mineral activos contra los rayos ultravioleta A y/o B, o mezclas de ellos.
Dichos agentes antiarrugas y/o agentes antienvejecimiento se seleccionan del grupo formado por Acetil Hexapéptido-8, Acetil Heptapéptido-4, Acetil Octapéptido-3, Pentapéptido-18, Acetil Hexapéptído-25, Diaminopropionoil Tripéptido-33, Tripéptido- 10 Citrulina, Acetil Tetrapéptido-5, Acetil Tripéptido-30 Citrulina, Acetil Tetrapéptido- 30, Dimetilmetoxi Cromanol, Dimetilmetoxi Cromanil Palmitato, extracto del fermento de Pseudoalteromonas, antagonistas del canal de Ca2+, retinol y sus derivados, idebenona y sus derivados, Coenzima Q10 y sus derivados, ácido boswélico y sus derivados, GHK y sus derivados y/o sales, carnosina y sus derivados, enzimas reparadores del ADN, agonistas de canales de cloruro, la mezcla de Proteína de Trigo Hidrolizada, Proteína de Soja Hidrolizada y Tripéptido-1 , la mezcla de Lisina HCI, Lecitina y Tripéptido-10 Citrulina y la mezcla de Extracto de Fermento de Pseudoalteromonas, Proteína de Trigo Hidrolizada, Proteína de Soja Hidrolizada, Tripéptido-10 Citrulina y Tripéptido-1.
En otra realización preferible dicho agente estimulador de la cicatrización y/o reepitelización o agente coadyuvante de la cicatrización y/o reepitelización se selecciona del grupo formado por extracto de fermento de Pseudoalteromonas y Tripéptido-10 Citrulina.
En otra realización más preferible, dicho adyuvante es de origen sintético o es un extracto vegetal o proviene de un procedimiento de biotecnológico o proviene de una combinación de un procedimiento sintético y un procedimiento biotecnológico.
Breve descripción de las Figuras
Figura 1. La TFD induce proliferación celular en la región prominente del folículo piloso.
Se detectaron las células marcadas (Label Retaining Cells, LRCs) generadas mediante administración de inyecciones seriadas del análogo de timidina BrdU a ratones neonatos y posterior análisis a los 50 días, y cuantifícaron por inmunofluorescencia en montajes "in toto" de epidermis de la cola de ratones adultos. Se observó un incremento significativo de LRCs en la región prominente del folículo piloso (FP) en telogén dos días después del tratamiento (TFD 2d) con respecto a los controles, lo que indica una estimulación de la proliferación de las células madre epidérmicas del FP en respuesta al tratamiento. Las barras indican el error típico. Barra de escala: 100 μιτι. ***: significativo, P<0,001.
Figura 2. La TFD induce cambios morfológicos transitorios en la piel.
A: En los cortes histológicos de piel dorsal del lomo se observó una hiperplasia transitoria en la epidermis a los dos días del estímulo fotodinámico, que revirtió seis días después del mismo. Las regiones destacadas en los paneles superiores se muestran en detalle en los inferiores.
B: La fluorescencia de la eosina revela un incremento en la densidad de fibras de colágeno de la dermis observado 6 días después de la TFD. Tinción: H-E. Barra de escala: 20 μπ\.
Figura 3. La TFD induce el crecimiento del pelo.
A: Se rasuraron dos zonas independientes de la piel del dorso de los ratones y se aplicó tópicamente Metvíx® sobre la región derecha, mientras que la izquierda, utilizada como control, se mantuvo sin tratar. Se comprobó la producción de PplX en la región tratada con Metvíx® (Día 0) mediante la emisión de fluorescencia roja bajo excitación con luz ultravioleta. Tras la TFD, se observó un crecimiento acelerado del pelo en la región de piel tratada con respecto a la control (Día 7 a 26).
B: Los cortes histológicos teñidos con H-E de muestras de piel dorsal obtenidas 26 días después del tratamiento mostraron el avance de la fase de anagén de los FPs en la piel tratada con TFD. Barra de escala: 100 /vm. Figura 4. La TFD provoca cambios en la expresión génica de la piel.
A: El análisis por PCR cuantitativa a tiempo real a partir de muestras de piel del lomo de ratones tratados y sus correspondientes controles mostró la inducción del mRNA de Prl2c3, que codifica la proliferina-2, dos días después de la aplicación de TFD- MAL.
B: Seis días después del tratamiento no se observaron cambios significativos en la expresión del mRNA Prl2c3. Para la normalización se utilizó como endógeno el RNA ribosómico 18S y la cuantificación relativa (RQ) se calculó en base al control. ***: significativo, P<0,001.
Figura 5. La TFD provoca cambios en la expresión y localización de proliferina-2 en la piel. La inmunofluorescencia en cortes histológicos de piel mostró un aumento de expresión de proliferina-2 en la epidermis tras la aplicación de TFD-MAL y una novedosa localización nuclear de esta proteína como consecuencia del tratamiento. Barra de escala: 50 μιη.
Figura 6. Inducción del crecimiento y expansión "in vitro" de células madre epidérmicas por Prlc3. Se aislaron células madre epidérmicas de piel de ratón y se crecieron en medio de cultivo condicionado conteniendo altas cantidades de Prl2c3 o en medio control. En estos cultivos se cuantificó a los siete días el número de colonias con un mínimo de cuatro células, indicador de actividad proliferativa sostenida. Los resultados indicaron un incremento significativo en el número de colonias en los cultivos de células madre epidérmicas tratados con medio de crecimiento condicionado por Prl2c3.
Modos de Realización Preferente
Con la intención de mostrar la presente invención de un modo ilustrativo aunque en ningún modo limitante, se aportan los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1 : Animales de experimentación
Se emplearon ratones de la línea C57BL/6 neonatos de diez días de edad para los experimentos de mareaje de células madre epidérmicas, y adultos de 7 semanas para el resto de ensayos. Los animales empleados en cada experimento fueron hermanos de carnada y las comparaciones se establecieron entre individuos del mismo sexo, para evitar diferencias atribuibles a este factor. Los experimentos se realizaron conforme a las normativas que regulan la manipulación y cuidado de los animales de laboratorio (Real Decreto 1201/2005).
Ejemplo 2: Aplicación de la terapia fotodinámica.
Se rasuró la piel del lomo de los ratones y se aplicó crema depilatoria (Veet®). Al día siguiente, se administró sobre la piel del lomo y de la cola el derivado metilado del ALA (MAL) en forma de crema comercial (Metvix®, Galderma) y se incubó en oscuridad durante 5 h, tras lo cual se eliminó el exceso de Metvix® lavando con PBS. La producción endógena de PplX en la piel del lomo se comprobó por la emisión de fluorescencia roja característica de la PplX bajo excitación con luz ultravioleta (UV) de 407 nm, utilizando una cámara digital provista de dos lámparas de dicha longitud de onda. A continuación, los animales fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal (i.p.) de una solución 3:1 de Imalgene 500 (Merial) y Domtor (Pfizer) (50 μΙ/ratón; 0,864 mg de clorhidrato de ketamina y 0,005 mg de clorhidrato de medetomidina por cada 10 g de peso corporal). La irradiación con luz roja de 636 nm se realizó uniformemente sobre la superficie dorsal de la cola y el lomo durante 3,5 min, utilizando una lámpara de diodos de 36 J/cm2 (Aktilite®) situada a unos 5 cm del animal. Tras la exposición a luz roja, los animales recibieron una inyección subcutánea de Antisedan (Pfizer) 2:1 con respecto al volumen de Domtor administrado, y se mantuvieron sobre mantas térmicas hasta su total recuperación. Transcurrido el tiempo determinado por cada ensayo, los animales fueron sacrificados en cámara de C02 y la piel se procesó para los distintos análisis.
En el caso de los experimentos funcionales de inducción capilar, la piel del lomo se rasuró previamente en dos zonas separadas y se aplicó Metvix® únicamente en la región derecha, manteniendo la mitad izquierda como control.
Ejemplo 3: Mareaje de células madre epidérmicas identificadas como "Label Retaining Cells" (LRCs).
Las células madre epidérmicas se marcaron e identificaron según el protocolo de Braun (Braun el al, "Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis". Development. 130:5241-55, 2003). Los ratones neonatos recibieron una vez al día, durante cuatro días consecutivos, una inyección i.p. de 50 mg/Kg de peso corporal BrdU (Sigma-Aldrich) (80 μ\ de BrdU 6,25 .mg/ml) en PBS, con el fin de marcar extensivamente el DNA en todas las células de la piel. Al cabo de 7 semanas, las células madre epidérmicas se identificaron en función de la baja tasa de replicación que las caracteriza como aquellas células capaces de retener la marca de BrdU ("Label Retaining Cells", LRCs) durante un período prolongado de tiempo debido a la replicación esporádica de su DNA. La identificación y cuantificación de LRCs después del tratamiento TFD-MAL se llevó a cabo mediante inmunofluorescencia en montajes in toto de epidermis de la cola que se observaron en un microscopio confocal.
Ejemplo 4: Procesamiento de la piel, histología e inmunofluorescencia. Inmediatamente después de sacrificar al animal, se separó la cola del cuerpo y se realizó una incisión con bisturí en la zona ventral de la misma, escindiéndose manualmente la piel en una única pieza. Ésta se incubó en 10 mi de EDTA 5 mM en PBS durante 6 h a 37°C y, a continuación, se separó la epidermis de la dermis con ayuda de unas pinzas. Las muestras de epidermis se dividieron transversalmente en dos porciones: una se congeló a -80°C para la extracción de RNA y la otra se fijó en formaldehído 3,7% en PBS durante 48 h a 4°C, se lavaron en PBS y se almacenaron en PBS-azida sódica 0,02% para la preparación de montajes "in toto". Por otra parte, se extrajo la piel del lomo y se fijó en formaldehído 3,7% en PBS durante al menos 48 h a 4°C. A continuación, se incluyeron en parafina siguiendo los protocolos habituales y se elaboraron secciones histológicas de 4 //m que fueron teñidas con hematoxilina-eosina (HE) o procesadas para inmunofluorescencia (IF), utilizando en este último caso portaobjetos tratados con poli L-lisina. Para los ensayos de IF, las secciones desparafinadas e hidratadas se permeabilizaron en Tritón X-100 0,1 % en PBS, se eliminó la autofluorescencia mediante incubación con NH4CI 50 mM (10 min a temperatura ambiente) y se bloquearon en albúmina de suero bovino (BSA, Sigma) 0,3% en PBS (1 h a temperatura ambiente). Las muestras bloqueadas se incubaron toda la noche a 4°C con un anticuerpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology) contra proteínas de la familia 2 de la prolactina (proliferinas), incluyendo la proliferina-2 (Prl2c3). Seguidamente se lavaron en PBS y se incubaron con el correspondiente anticuerpo secundario acoplado a Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Por último, las muestras se lavaron en PBS y se montaron con Vectashield (Vector Labs) conteniendo 5 ng/ml de DAPI (Merck). Para la detección de LRCs mediante inmunofluorescencia en montajes in toto, las piezas de epidermis de la cola se incubaron con HCI 1 N (45 min a 37°C) y con Tris-Borato- EDTA (5 min a temperatura ambiente), efectuando sendos lavados breves con agua destilada después de cada incubación. Posteriormente fueron permeabilizadas y bloqueadas en tampón PTG (0,5% Tritón X-100, 0,2% gelatina en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente, tras lo cual se incubaron con el anticuerpo primario monoclonal de ratón anti-BrdU conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Roche), durante toda la noche a 37°C. A continuación, se lavaron repetidamente en PBS y se montaron con Vectashield-DAPI. Las muestras de inmunofluorescencia se analizaron en un microscopio confocal espectral Leica TCS-SP2-AOBS, empleando los láseres de excitación de 488 nm para el FITC, 633 nm para el Cy3 y UV para el DAPI. Las reconstrucciones tridimensionales se realizaron con ayuda del programa LCS Suite versión 2.61 (Leica) y posteriormente fueron procesadas con el programa Photoshop CS3 Extended versión 10.0.1 (Adobe). Las secciones histológicas teñidas con HE se analizaron en un microscopio de fluorescencia Olympus BX61 acoplado a una cámara de captura digital Olympus DP50, utilizando campo claro y luz de excitación azul (filtro de excitación BP 460-490 y filtro de barrera BA 520IF).
Ejemplo 5: Extracción de RNA de Prl2c3, análisis de patrones de expresión génica a gran escala y qRT-PCR
La purificación de RNA de Prl2c3 a partir de la epidermis de la cola y de la piel del lomo se realizó mediante una extracción orgánica con TriPureTM Isolation Reagent (Roche) seguida de una purificación en columna (RNeasy Mini kit, QIAGEN). El tejido se disgregó con tijeras y se homogeneizó en TriPure con un Polytron (PT 1200 E, Kinematica). El homogeneizado se separó en fases en cloroformo:isoamílico (Merck) y el RNA de la fase acuosa se purificó por columna. La concentración y pureza del RNA (ratio A260:A280 > 1 ,8) se determinaron mediante espectrofotometría (Nanodrop ND1000, Nanodrop Technologies). El análisis de expresión génica a gran escala se realizó mediante matrices ("arrays") de Agilent Technologies (Agilent.SingleColor.14868). Los análisis de expresión por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) se llevaron a cabo utilizando el sistema de Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR con SYBR Green.
Resultados:
Ejemplo 6: Inducción de proliferación de las células madre residentes en la región prominente del folículo piloso por el tratamiento TFD-MAL.
Para analizar el efecto del tratamiento TFD-MAL en la actividad de las células madre epidérmicas se utilizó como modelo el folículo piloso (FP), cuya región prominente constituye el principal reservorio de células madre de la piel. Las células madre se identificaron gracias a su baja tasa de proliferación característica, que permite la retención de una marca nuclear de BrdU durante un período de tiempo prolongado después de la administración seriada del análogo de nucleótido en edad neonatal, permitiendo identificarlas como LRCs (Braun et al, "Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis". Development. 130:5241-55, 2003; Cotsarelis et al, "Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis". Cell 61 ,1329-37, 1990). Como se muestra en la Fig.1 , el análisis por inmunofluorescencia en montajes in toto de epidermis de la cola de ratones control y sometidos a TFD-MAL mostró un aumento significativo (P<0,001 ) del número de LRCs en la región prominente de los FPs.
Ejemplo 7: Inducción de hiperplasia transitoria en la epidermis e incremento en la densidad de fibras de colágeno en la dermis por el tratamiento TFD-MAL.
Los cambios morfológicos a gran escala producidos por TFD-MAL se caracterizaron en secciones histológicas de piel dorsal del lomo teñidas con HE. El análisis de estas secciones indicó que el tratamiento induce una hiperplasia transitoria en la epidermis, observándose la respuesta más evidente a los 2 días del tratamiento y revirtiendo a un estado normal 7 días después del mismo (Fig.2A). También se observaron cambios muy acentuados en la morfología de la dermis, que presentó un fuerte incremento en la densidad de fibras de colágeno 7 días después del tratamiento MAL-TFD, caracterizada como un aumento en la emisión fluorescente específica de la eosina al intercalarse en la fibras de colágeno (Espada et al. "Selective fluorescence of eosinophilic structures in grasshopper and mammalian testis stained with haematoxylin-eosin" Histochemistry 99:385-390, 1993) (Fig.2B).
Ejemplo 8: Aceleración del crecimiento del pelo por el tratamiento TFD-MAL.
Con el fin de analizar la dinámica de crecimiento del pelo en la piel sometida a TFD- MAL, se procedió a rasurar la piel del lomo de los ratones y se aplicó tópicamente Metvix® sobre la región dorsal derecha, manteniendo la izquierda como control, como se ha detallado en el Ejemplo 2. Transcurridas 5 horas de incubación en oscuridad se determinó la producción de PplX mediante el análisis de la emisión fluorescente roja característica de este compuesto. Los resultados obtenidos mostraron que la producción de PplX a partir de MAL en la epidermis tuvo lugar en presencia de Metvix®, como indicó la señal fluorescente observada bajo luz de excitación UV (Fig.3A, día 0). A continuación, se completó la TFD irradiando el lomo de los ratones con luz roja. La evolución observada en los días posteriores mostró un crecimiento del pelo notablemente acelerado en la mitad tratada con respecto a la piel control (F¡g.3A, días 7 a 26). Los cortes histológicos correspondientes a muestras de piel tomadas 26 días después de la TFD ponen de manifiesto el desarrollo alcanzado por los FPs (Fig.3B). Así, mientras que los FPs en la piel control se mantienen en reposo (telogén) y en ningún caso sobrepasan la dermis, en la piel tratada se aprecia el progreso de la fase de crecimiento (anagén) y la región del bulbo piloso llega a penetrar ampliamente en la capa subyacente a la dermis.
Ejemplo 9: Inducción específica del gen de la Prl2c3 por el tratamiento TFD- MAL.
Para determinar los cambios en el patrón de expresión génica inducidos en la piel por el tratamiento TFD-MAL, se llevó a cabo un análisis a gran escala en micromatrices ("arrays") de RNA utilizando mRNA obtenido a partir de la piel del lomo y de la epidermis de la cola. Mediante esta aproximación se identificó el producto del gen Prl2c3 como el mRNA cuya expresión se vio más fuertemente modificada en respuesta al tratamiento TFD-MAL, resultado que se validó por qRT- PCR (Fig.4). La inmunolocalización de la proteína Prl2c3 en cortes histológicos de piel dorsal mostró un patrón de baja intensidad y difuso en citoplasma en la epidermis de los animales control, mientras que se confirmó el incremento en los niveles de expresión tras el tratamiento, revelando una novedosa localización nuclear de esta proteína en los animales sometidos a TFD-MAL (Fig.5).
Ejemplo 10: Inducción del crecimiento y expansión "in vitro" de células madre epidérmicas por un medio de cultivo conteniendo altas cantidades de Prl2c3.
Se procedió, en primer lugar, al aislamiento del cDNA de Prl2c3 mediante RT-PCR, posterior clonaje en el vector de expresión pcDNA3.1A y transfección de este vector en células HEK293T. Mediante inmunoblot se comprobó que el medio de cultivo condicionado por el crecimiento de células transfectadas con el vector clonado contenía de media hasta 10 veces más proteína Prlc3 que un medio control de células transfectadas con el vector vacío. Posteriormente, se aislaron células madre epidérmicas a partir de piel de ratón según protocolos establecidos (Espada et al. "Nuclear envelope defects cause stem cell dysfuction in premature-aging mice" J. Cell Biol. 181 :27, 35, 2008). Estos cultivos se trataron con medio condicionado. Los cultivos con medio condicionado mostraron un número significativamente mayor de colonias de más de 4 células que los cultivos controles, tratados con medio de células transfectadas con el vector vacío (Fig. 6).

Claims

Reivindicaciones
1. Uso de protoporfirina IX, o su precursor, capaz de producir especies reactivas de oxígeno en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento por terapia fotodinámica de una enfermedad relacionada con las células madre epidérmicas en un sujeto.
2. Uso según la reivindicación 1 , en que dicho precursor de protoporfirina IX es ácido 5-aminolevulínico o sus derivados químicos.
3. Uso según la reivindicación 2, en que dicho derivado químico del ácido 5- aminolevulínico es metilamínolevulinato.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en que dicho sujeto es un mamífero.
5. Uso según la reivindicación 4, en que dicho mamífero es un humano.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en que djcha enfermedad relacionada con las células madre epidérmicas es una dermatosis.
7. Uso según la reivindicación 6, en que dicha dermatosis es una enfermedad del colágeno.
8. Uso según la reivindicación 6, en que dicha dermatosis es una enfermedad del folículo piloso.
9. Uso según la reivindicación 8, en que dicha enfermedad del folículo piloso es alopecia.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en que dicho medicamento se administra por vía tópica.
11. Uso de protoporfirina IX, o su precursor, capaz de producir especies reactivas de oxígeno, y al menos otro agente terapéutico en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento por terapia fotodinámica de una enfermedad relacionada con las células madre epidérmicas en un sujeto.
12. Uso de protoporfirina IX, o su precursor, capaz de producir especies reactivas de oxígeno para la activación "in vitro" de células madre epidérmicas.
13. Uso de protoporfirina IX, o su precursor, capaz de producir especies reactivas de oxígeno para la producción "in vitro" de proteínas de la familia 2 de la prolactina.
14. Uso según la reivindicación 13, en que dicha proteína de la familia 2 de la prolactina es proliferina-2.
15. Uso de protoporfirina IX, o su precursor, capaz de producir especies reactivas de oxígeno para la generación de equivalentes cutáneos dermo-epidérmicos o epidérmicos.
16. Composición cosmética o farmacéutica que comprende una cantidad cosmética o farmacéuticamente eficaz de protoporfirina IX, o su precursor, y al menos un excipiente o adyuvante cosmética o farmacéuticamente aceptable.
17. Una composición según la reivindicación 16, caracterizada por que dicho precursor de protoporfirina IX es ácido 5-aminolevulínico o sus derivados químicos.
18. Una composición según la reivindicación 17, caracterizada por que dicho derivado del ácido 5-aminolevulínico es metílaminolevulinato.
19. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizada por que dicha protoporfirina IX, o su precursor, se encuentra incorporado a un sistema de vehiculización o a un sistema de liberación sostenida cosmética o farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo formado por liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, . niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactívos, micelas mixtas fosfolípido-tensioactivo, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas, nanoparticulas sólidas lipídicas y soportes lipidíeos nanoestructurados.
20. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizada por que se presenta en una formulación seleccionada del grupo formado por cremas, emulsiones múltiples, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones, geles, geles crema, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, serums, ungüentos, mousses, pomadas, polvos, barras, lápices, vaporizadores, aerosoles, cápsulas, cápsulas de gelatina, cápsulas blandas, cápsulas duras, comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, formas granuladas, gomas de mascar, soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, films de polisacáridos, jaleas y gelatina.
21. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, caracterizada por que se encuentra incorporada a un producto seleccionado del grupo formado por correctores de ojeras, fondos de maquillaje, lociones desmaquillantes, leches desmaquillantes, sombras de ojos, barras de labios, brillos labiales, protectores labiales y polvos.
22. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 , caracterizada por que dicha protoporfirina IX, o su precursor, se encuentra incorporado en un tejido, un tejido-no-tejido o un producto sanitario.
23. Una composición según la reivindicación 22, caracterizada por que dicho tejido, tejido-no-tejido o producto sanitario se selecciona del grupo formado por vendas, gasas, camisetas, medias, calcetines, ropa interior, fajas, guantes, pañales, compresas, apositos, cubrecamas, toallitas, parches adhesivos, parches no adhesivos, parches oclusivos, parches microeléctricos y mascarillas faciales.
24. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, caracterizada por que dicho adyuvante está seleccionado del grupo formado por proteínas de choque térmico, otros agentes estimuladores de la síntesis de las proteínas de choque térmico, inhibidores de la agregación de los receptores de acetilcolina, agentes inhibidores de la contracción muscular, agentes anticolinérgicos, agentes inhibidores de elastasa, agentes inhibidores de las metaloproteasas de matriz, agentes estimuladores o inhibidores de la síntesis de melanína, agentes blanqueantes o despigmentantes, agentes propigmentantes, agentes autobronceantes, agentes antienvejecimiento, agentes inhibidores de la NO-sintasa, agentes inhibidores de la 5a-reductasa, agentes inhibidores de lisil- y/o prolil-hidroxilasa, agentes antioxidantes, agentes capturadores de radicales libres y/o anticontaminación atmosférica, agentes capturadores de especies reactivas carbonilo, agentes antiglicación, agentes antihistamínicos, agentes antivirales, agentes antiparasitarios, agentes emulsionantes, emolientes, disolventes orgánicos, propelentes líquidos, acondicionadores de la piel, humectantes, sustancias que retienen la humedad, alfahidroxiácidos, betahidroxiácidos, hidratantes, enzimas epidérmicas hidrolíticas, vitaminas, aminoácidos, proteínas, pigmentos o colorantes, tintes, polímeros gelificantes, espesantes, tensioactivos, suavizantes, agentes antiarrugas, agentes capaces de disminuir o tratar las bolsas bajo los ojos, agentes exfoliantes, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, agentes fungistáticos, agentes bactericidas, agentes bacteriostáticos, agentes estimuladores de la síntesis de macromoléculas dérmicas o epidérmicas y/o capaces de inhibir o prevenir su degradación, agentes estimuladores de la síntesis de colágeno, agentes estimuladores de la síntesis de elastina, agentes estimuladores de la síntesis de decorina, agentes estimuladores de la síntesis de laminina, agentes estimuladores de la síntesis de defensinas, agentes estimuladores de la síntesis de aquaporinas, agentes estimuladores de la síntesis de ácido hialuróníco, agentes estimuladores de la síntesis de fibronectina, agentes estimuladores de la síntesis de sirtuínas, agentes estimuladores de la síntesis de lípidos y componentes del estrato córneo, ceramidas, ácidos grasos, agentes inhibidores de la degradación de colágeno, agentes inhibidores de la degradación de elastina, agentes inhibidores de proteasas de serina como catepsina G, agentes estimuladores de la proliferación de fibroblastos, agentes estimuladores de laproliferación de queratinocitos, agentes estimuladores de la proliferación de adipocitos, agentes estimuladores de la proliferación de melanpcitos, agentes estimuladores de la diferenciación de queratinocitos, agentes estimuladores de la diferenciación de adipocitos, agentes inhibidores de la acetilcolinesterasa, agentes dermorelajantes, agentes estimuladores de la síntesis de glicosaminoglicanos, agentes antihiperqueratosis, agentes comedolíticos, agentes antipsoriasis, agentes reparadores del ADN, agentes protectores del ADN, estabilizantes, agentes antiprurito, agentes para el tratamiento y/o cuidado de pieles sensibles, agentes reafirmantes, agentes antiestrías, agentes astringentes, agentes reguladores de la producción de sebo, agentes lipolíticos o estimuladores de la lipólisis, agentes anticelulíticos, agentes antiperspirantes, agentes estimuladores de la cicatrización, agentes coadyuvantes de la cicatrización, agentes estimuladores de la reepitelización, agentes coadyuvantes de la reepitelización, factores de crecimiento de citoquinas, agentes calmantes, agentes antiinflamatorios y/o analgésicos, agentes anestésicos, agentes que actúen sobre la circulación capilar y/o la microcirculación, agentes estimuladores de la angiogénesis, agentes inhibidores de la permeabilidad vascular, agentes venotónicos, agentes que actúen sobre el metabolismo de las células, agentes destinados a mejorar la unión dermis-epidermis, agentes inductores del crecimiento del cabello, agentes inhibidores o retardantes del crecimiento del cabello, agentes retardantes de la caída del cabello, conservantes, perfumes, agentes quelantes, extractos vegetales, aceites esenciales, extractos marinos, agentes provenientes de un procedimiento de biofermentación, sales minerales, extractos celulares, filtros solares y agentes fotoprotectores de naturaleza orgánica o mineral activos contra los rayos ultravioleta A y/o B, o mezclas de ellos.
25. Una composición según la reivindicación 24, caracterizada por que dicho adyuvante se selecciona del grupo formado por agentes antiarrugas y/o agentes antienvejecimiento.
26. Una composición según la reivindicación 25, caracterizada por que dichos agentes antiarrugas y/o agentes antienvejecimiento se seleccionan del grupo formado por Acetil Hexapéptido-8, Acetil Heptapéptido-4, Acetil Octapéptido-3,
- Pentapéptido-18, Acetil Hexapéptido-25, Diaminopropionoil Tripéptido-33, Tripéptido-10 Citrulina, Acetil Tetrapéptido-5, Acetil Tripéptido-30 Citrulina, Acetil Tetrapéptido-30, Dimetilmetoxi Cromanol, Dimetilmetoxi Cromanil Palmitato, extracto del fermento de Pseudoalteromonas, antagonistas del canal de Ca2+, retinol y sus derivados, ¡debenona y sus derivados, Coenzima Q10 y sus derivados, ácido boswélico y sus derivados, GHK y sus derivados y/o sales, carnosina y sus derivados, enzimas reparadores del ADN, agonistas de canales de cloruro, la mezcla de Proteína de Trigo Hidrolizada, Proteína de Soja Hidrolizada y Tripéptido-1 , la mezcla de Lisina HCI, Lecitina y Tripéptido-10 Citrulina y la mezcla de Extracto de Fermento de Pseudoalteromonas, Proteína de Trigo Hidrolizada, Proteína de Soja Hidrolizada, Tripéptido-10 Citrulina y Tripéptido-1.
27. Una composición según la reivindicación 24, caracterizada por que dicho adyuvante se selecciona del grupo formado por agentes estimuladores de la cicatrización y/o reepitelizacion y agentes coadyuvantes de la cicatrización y/o reepitelizacion.
28. Una composición según la reivindicación 27, caracterizada por que dicho agente estimulador de la cicatrización y/o reepitelizacion o agente coadyuvante de la cicatrización y/o reepitelizacion se selecciona del grupo formado por extracto de fermento de Pseudoalteromonas y Tripéptido-10 Citrulina.
29. Una composición según la reivindicación 24, caracterizada por que dicho adyuvante se selecciona del grupo formado por agentes retardantes de la caída del cabello o inductores del crecimiento del cabello.
30. Una composición según la reivindicación 24, caracterizada por que dicho adyuvante se selecciona del grupo formado por filtros solares. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 30, caracterizada por que dicho adyuvante es de origen sintético o es un extracto vegetal o proviene de un procedimiento de biotecnológico o proviene de una combinación de un procedimiento sintético y un procedimiento biotecnológico.
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