ES2703332T3 - Uso de un agente fotosensible capaz de producir especies reactivas al oxígeno en la producción de un medicamento para la terapia fotodinámica de una enfermedad relacionada con células madre, uso in vitro, y composición farmacéutica - Google Patents
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Abstract
La presente invención es el uso de un agente fotosensible, o su precursor, capaz de producir especies reactivas de oxígeno (ROS) en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento por terapia fotodinámica (TFD) de una enfermedad relacionada con las células madre en un sujeto, preferiblemente células madre epidérmicas.
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de un agente fotosensible capaz de producir especies reactivas del oxígeno en la producción de un medicamento para la terapia fotodinámica de una enfermedad relacionada con células madre, uso in vitro, y composición farmacéutica
Campo técnico
La presente invención se refiere al uso de la protoporfirina IX, o un precursor de la misma, capaz de producir especies reactivas del oxígeno, para la activación in vitro de células madre epidérmicas.
Antecedentes
La terapia fotodinámica (PDT) es una modalidad terapéutica ampliamente usada en la práctica clínica para el tratamiento de diferentes patologías de la piel, incluyendo el cáncer.
La PDT se basa en la administración exógena de compuestos fotosensibles (PS) o precursores de los mismos que se acumulan por medio de diferentes mecanismos preferiblemente en los tejidos diana. Irradiar el tejido con luz que tiene una longitud de onda adecuada, generalmente en la región roja del espectro (A >600 nm) para mayor penetración en tejido, y en presencia de oxígeno intracelular, induce la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), particularmente oxígeno singlete. La rápida acumulación intracelular de ROS por encima de un umbral crítico promueve una fuerte fotosensibilización que induce la muerte de células.
El ácido 5-aminolevulínico (ALA), y en mayor extensión su derivado metilado, aminolevulinato de metilo (MAL), son dos de los compuestos usados más ampliamente en la práctica clínica en protocolos dermatológicos con PDT. Su bajo peso molecular determina una alta absorción a través de la epidermis, que permite la aplicación tópica de los mismos. Estos compuestos no son fotoactivos en sí mismos, pero actúan como precursores de protoporfirina IX (PplX) PS, endógena. Una vez absorbidos por la célula, se incorporan a la ruta biosintética metabólica del grupo hemo, promoviendo una acumulación anómala de PplX que puede durar entre horas y días, con la fotosensibilización posterior del tejido diana. El tratamiento con PDT-MAL está extremadamente extendido en dermatología clínica, particularmente para el tratamiento de la queratosis actínica y carcinoma de células basales. Se ha descrito que el tratamiento experimental con una cantidad pequeña de fuentes de ROS exógenas, tales como peróxido de hidrógeno, puede promover proliferación de células en cultivos in vitro (Boonstra J, Post JA. "Molecular events associated with reactive oxygen species and cell cycle progression in mammalian cells". Gene 337:1-13, 2004), que incluye posibles células progenitoras neurales que crecen mediante el sistema de neuroesferas (Le Belle JE et al. "Proliferative neural stem cells have high endogenous ROS levels that regulate self-renewal and neurogenesis in a PI3K/Akt-dependant manner", Cell Stem Cell. 8:59-71,2011).
Sin embargo, hasta ahora no ha habido evidencia experimental que indique una relación causal entre la producción de ROS endógenas en un tejido y activación funcional de un tipo de célula madre contenida en dicho tejido que implique consecuencias fisiológicas, con posible uso clínico, farmacológico o cosmético. Esto se debe en gran medida a la inexistencia de un método experimental "in vivo", que permita inducir la producción controlada de ROS endógenas en un tejido.
Tampoco hay datos experimentales que indiquen que la acumulación de ROS endógenas en tejidos pueda ser parte de un proceso homeostático normal dependiente de manera funcional de células madre. En cambio, todos los resultados experimentales que muestran una acumulación de ROS "in vivo" en tejidos indican que esta acumulación es anómala y está asociada con condiciones patológicas y procesos de envejecimiento (Valco M et al. "Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease", Int. J. Biochem. Cell Biol. 39: 44-84, 2007). Del mismo modo, el tratamiento tópico de un tejido con fuentes de ROS exógenas, en ningún caso no puede considerarse biológicamente equivalente a la producción fisiológica de ROS endógenas.
Los inventores describen un método experimental que usa PDT-MAL para inducir la producción de ROS endógenas en el folículo piloso capaces de activar las células madre epidérmicas contenidas en este nicho. Esta estimulación de células madre epidérmicas se debe a la activación transcripcional de genes de la familia 2 de prolactina, también conocida como proliferinas, particularmente proliferina-2 o Prl2c3, en el tejido diana mediante ROS. Teniendo en cuenta que se ha propuesto una función potencial para Prl2c3 en la expansión in vitro de células madre hematopoyéticas (Choong ML et al. "A novel role for proliferin-2 in the ex vivo expansion of hematopoietic stem cells", Fe Bs Lett. 550:155-62, 2003), la estimulación "in vivo" de genes de la familia de proliferina mediante ROS asociada con la activación de célula madre epidérmica es un descubrimiento sorprendente e importante por pleno derecho.
En la técnica actual, uno de los usos más extendidos de células madre epidérmicas en el área de la bioingeniería es la generación de equivalentes de piel que tienen un componente epidérmico o dermoepidérmico (Shevchenko RV et al. "A review de tissue-engineered skin bioconstructs available for skin reconstruction", J. R. Soc. Interface 7:229-58,
2010). Estos equivalentes de piel o pieles artificiales tienen aplicaciones muy importantes en medicina regenerativa, fundamentalmente para el tratamiento de quemaduras y heridas profundas y ampliamente extendidas. El tratamiento ideal para lesiones de este tipo es un autoinjerto con equivalentes de piel de diferentes tipos generados a partir de la propia piel del paciente. Dadas las restricciones establecidas en la Unión Europea (Directiva 2010/63/UE) y otros países, relativas al uso de animales experimentales, otra aplicación fundamental de equivalentes de piel es el uso de los mismos como modelos biológicos para probar la viabilidad y toxicidad de compuestos farmacéuticos y cosméticos.
Una limitación esencial en aplicaciones de este tipo es el tiempo para generar un equivalente de piel funcional, que requiere la expansión de progenitores epidérmicos y estratificación del componente epidérmico "ex vivo" en contacto con el aire. En un entorno clínico, tiempos excesivamente largos en la producción de equivalentes de autoinjerto suponen un riesgo inmediato para el paciente, haciendo necesario el uso de terapias alternativas tales como injertos de piel de cadáveres o equivalentes sintéticos no humanos. En farmacología y cosmética, el tiempo para generar piel artificial está directamente relacionado con su coste de producción. Por tanto, un problema que surge en la técnica se refiere al desarrollo de un método experimental para acelerar estos procesos durante la formación del equivalente de piel.
Por tanto, el problema que surge en la técnica se refiere al desarrollo de métodos que sean más específicos y eficaces que los métodos actuales para generar equivalentes de piel. La solución proporcionada por la presente invención es el uso de protoporfirina IX, o un precursor de la misma, capaz de producir especies reactivas del oxígeno, para la activación in vitro de células madre epidérmicas y por tanto para la producción de equivalentes de piel.
Descripción
La presente invención se refiere al uso del agente fotosensible protoporfirina IX (PpIX), o el precursor del mismo, capaz de producir ROS para la activación "in vitro" de células madre, y otra realización adicional es el uso del mismo para producir proteínas de la familia 2 de prolactinas "in vitro", incluso más preferiblemente proliferina-2.
El término "agente fotosensible" se entiende en el presente documento como un compuesto que es capaz de producir ROS en presencia de oxígeno tras ser irradiado con luz que tiene una longitud de onda adecuada y se administra de manera exógena o se produce por el propio cuerpo a partir de un precursor.
El término "precursor de un agente fotosensible" se entiende en el presente documento como un compuesto que se administra de manera exógena y da lugar a un compuesto fotosensible en la célula.
El término "especies reactivas del oxígeno" o ROS se entiende en el presente documento como compuestos que tienen radicales libres e iones de oxígeno y peróxidos.
El término "terapia fotodinámica" o PDT se entiende en el presente documento como un método a través del que se induce la producción de ROS en un tejido diana después de promover la acumulación de un agente fotosensible en dicho tejido e irradiarlo en presencia de oxígeno con luz que tiene una longitud de onda adecuada.
En una realización preferida, dicho precursor de un agente fotosensible es un precursor de PpIX, incluso más preferiblemente ácido 5-aminolevulínico o los derivados químicos del mismo, y lo más preferible entre estos derivados químicos es aminolevulinato de metilo (MAL).
El término "derivado químico" de ácido 5-aminolevulínico (ALA) se entiende en el presente documento como un compuesto orgánico que contiene la estructura química básica de ALA que tiene uno o más sustituyentes o radicales químicos en uno de los átomos de dicha estructura básica.
El término "activación de célula madre" se entiende en el presente documento como la estimulación de proliferación de células madre y/o programas de diferenciación funcional.
La invención describe una metodología adaptada para PDT que permite generar una producción de ROS endógenas controlada, específicamente en la región prominente del folículo piloso. Esto da como resultado la activación de la proliferación de las células madre epidérmicas contenidas en este nicho, aceleración del crecimiento capilar, un aumento de colágeno dérmico e inducción de la expresión de genes de la familia 2 de prolactinas (proliferinas), particularmente Prl2c3.
La estimulación de células madre según la presente invención tiene una aplicación potencial directa en el área de la bioingeniería para acelerar el crecimiento de equivalentes de piel que tienen un componente epidérmico o dermoepidérmico (pieles artificiales) usados en medicina regenerativa y como sustratos para probar la viabilidad biológica de compuestos farmacológicos y cosméticos. Por tanto, una realización tecnológica de la invención es el uso de un agente fotosensible, o el precursor del mismo, capaz de producir ROS para generar equivalentes de piel epidérmicos o dermoepidérmicos.
Otra realización preferida es el agente fotosensible de la invención protoporfirina IX (PpIX), o el precursor del mismo, capaz de producir ROS, para la activación "in vitro" de células madre, y otra realización preferida adicional es aquella para producir proteínas de la familia 2 de prolactinas, incluso más preferiblemente proliferina-2, "in vitro".
En este sentido, aún otra realización adicional es el agente fotosensible, o el precursor del mismo, capaz de producir ROS, de la invención, para generar equivalentes de piel epidérmicos o dermoepidérmicos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra que la PDT induce proliferación de células en la región prominente del folículo piloso.
Se detectaron las células marcadas generadas (células de retención de marcador, LRC, Label Retaining Cells) por medio de la administración de inyecciones en serie de análogo de timidina, BrdU, a ratones neonatos y análisis posterior a los 50 días, y se cuantificaron mediante inmunofluorescencia en preparaciones "in toto" de epidermis de cola de ratones adultos. Se observó un aumento significativo en las LRC en la región prominente del folículo piloso (HF) en fase telógena dos días después del tratamiento (PDT 2d) con respecto a los controles, lo que indica la estimulación de la proliferación de las células madre epidérmicas del HF en respuesta al tratamiento. Las barras indican el error estándar. Barra de escala: 100 pm. ***: Significativo, p <0,001.
La figura 2 muestra que la PDT induce cambios morfológicos transitorios en la piel.
A: En las secciones histológicas de la piel dorsal del lomo, se observó una hiperplasia transitoria en la epidermis dos días después de la estimulación fotodinámica, y remitió seis días después de dicha estimulación. Las regiones resaltadas en los recuadros superiores se muestran con detalle en los recuadros inferiores.
B: La fluorescencia de eosina muestra un aumento en la densidad de fibras de colágeno de la dermis observado 6 días después de la PDT. Tinción: H-E. Barra de escala: 20 pm.
La figura 3 muestra que la PDT induce crecimiento capilar.
A: Se rasuraron dos áreas separadas de la piel del lomo de los ratones y se aplicó Metvix® por vía tópica en la región derecha, mientras que la región izquierda, usada como control, se dejó sin tratar. Se comprobó la producción de PpIX en la región tratada con Metvix® (día 0) por medio de emisión de fluorescencia roja bajo excitación con luz UV. Después de la PDT, se observó crecimiento capilar acelerado en la región de piel tratada con respecto al control (días 7 a 26).
B: Las secciones histológicas teñidas con H-E de muestras de piel dorsal obtenidas 26 días después del tratamiento mostraron el progreso de la fase anágena de los HF en la piel tratada con PDT. Barra de escala: 100 pm.
La figura 4 muestra que la PDT causa cambios en expresión génica de piel.
A: Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real, basados en muestras de piel del lomo de ratones tratados y sus controles correspondientes mostraron la inducción de Prl2c3 ARNm que codifica para proliferina-2, dos días después de aplicar PDT-Ma L.
B: No se observaron cambios significativos en la expresión de Prl2c3 ARNm seis días después del tratamiento. Se usó ARN ribosomal 18S como ARN endógeno para normalización y se calculó la cuantificación relativa (RQ) basada en el control. ***: Significativo, p <0,001.
La figura 5 muestra que la PDT causa cambios en la expresión y localización de proliferina-2 en la piel. La inmunofluorescencia en secciones de piel histológicas mostró una expresión aumentada de proliferina-2 en la epidermis después de aplicar PDT-MAL y una nueva localización nuclear de esta proteína como resultado del tratamiento. Barra de escala: 50 pm.
La figura 6 muestra la inducción de crecimiento de células madre epidérmico "in vitro" y expansión mediante Prlc3. Se aislaron células madre epidérmicas de piel de ratón y se hicieron crecer en un medio de cultivo acondicionado que contiene grandes cantidades de Prl2c3 o en un medio de control. El número de colonias con al menos cuatro células, que indica actividad proliferativa sostenida, se cuantificó en estos cultivos después de siete días. Los resultados indicaron un aumento significativo en el número de colonias en los cultivos de células madre epidérmicas tratados con medio de crecimiento acondicionados de Prl2c3.
Realizaciones preferidas
Se proporcionan los siguientes ejemplos para mostrar la presente invención de una manera ilustrativa pero no limitativa.
Ejemplo 1: Animales experimentales
Se usaron ratones neonatos de diez días de la línea C57BL/6 para los experimentos de mareaje de células madre epidérmicas, y se usaron ratones adultos de 7 semanas para el resto de las pruebas. Los animales usados en cada experimento eran de la misma camada y se establecieron las comparaciones entre individuos del mismo sexo para evitar diferencias atribuibles a este factor. Se realizaron los experimentos según las regulaciones que rigen el manejo y cuidado de animales de laboratorio (Real Decreto 1201/2005).
Ejemplo 2: Aplicación de terapia fotodinámica
Se rasuró la piel del lomo de los ratones y se aplicó crema de afeitado (Veet®). Al día siguiente se administró el derivado metilado de ALA (MAL) en la piel del lomo y la cola en forma de crema comercial (Metvix®, Galderma) y se incubó en la oscuridad durante 5 horas, después de las cuales se eliminó el exceso de Metvix® lavando con PBS. Se comprobó la producción de PplX endógena en la piel del lomo usando la característica de emisión fluorescente roja de PplX bajo excitación con una luz UV a 407 nm, usando una cámara digital dotada de dos lámparas de dicha longitud de onda. Luego se anestesiaron los animales por medio de inyección intraperitoneal (i.p.) de una disolución 3:1 de Imalgene 500 (Merial) y Domtor (Pfizer) (50 pl/ratón; 0,864 mg de clorhidrato de quetamina y 0,005 mg de clorhidrato de medetomidina por 10 gramos de peso corporal). Se llevó a cabo irradiación con una luz roja a 636 nm uniformemente sobre la superficie dorsal de la cola y el lomo durante 3,5 minutos usando una lámpara de diodo de 36 J/cm2 (Aktilite®) ubicada a 5 cm del animal. Después de exposición a la luz roja, los animales recibieron una inyección subcutánea de Antisedan (Pfizer) 2:1 con respecto al volumen administrado de Domtor, y se mantuvieron en mantas térmicas hasta recuperación completa. Una vez finalizado el tiempo determinado para cada prueba, se sacrificaron los animales en una cámara de CO2 y se procesó la piel para diferentes análisis.
En el caso de experimentos de inducción capilar funcional, se rasuró primero la piel del lomo en dos áreas separadas y se aplicó Metvix® solo en la región derecha, dejando la mitad izquierda como control.
Ejemplo 3: Marcaje de células madre epidérmicas identificadas como células de retención de marcador (LRC, Label Retaining Cells)
Las células madre epidérmicas se marcaron e identificaron según el protocolo de Braun (Braun et al, "Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualization of label-retaining cells in wholemounts de mouse epidermis". Development. 130:5241-55, 2003). Los ratones neonatos recibieron una inyección i.p. de 50 mg/kg de peso corporal de BrdU (Sigma-Aldrich) (80 pl de 6,25 mg/ml BrdU) en PBS una vez al día durante cuatro días consecutivos, de modo que pueda marcarse exhaustivamente el ADN en todas las células de la piel. Después de 7 semanas, se identificaron las células madre epidérmicas en base a la baja tasa de replicación que las caracteriza como células capaces de retener el marcador BrdU (células de retención de marcador, LRC) durante un periodo de tiempo prolongado debido a la replicación esporádica de su ADN. La identificación y cuantificación de LRC después del tratamiento con PDT-MAL se llevó a cabo mediante de inmunofluorescencia en preparaciones "in toto" de epidermis de cola que se observaron bajo un microscopio confocal.
Ejemplo 4: Tratamiento de la piel, histología e inmunofluorescencia
Inmediatamente después de sacrificar el animal, se separó la cola del cuerpo y se realizó una incisión con un bisturí en el área ventral del mismo, siendo separada la piel a mano en una única pieza. Se incubó la piel en 10 ml de EDTA 5 mM en PBS durante 6 horas a 37 °C y entonces se separó la epidermis de la dermis con la ayuda de fórceps. Se dividieron transversalmente las muestras de epidermis en dos porciones: una se congeló a -80 °C para extracción de ARN y la otra se fijó en formaldehído al 3,7 % en PBS durante 48 horas a 4 °C, se lavaron en p Bs y almacenaron en PBS-azida de sodio al 0,02 % para la preparación de preparaciones "in toto".
Por otro lado, se eliminó la piel del lomo y se fijó en formaldehido al 3,7 % en PBS durante al menos 48 horas a 4 °C. Entonces se embebieron en parafina siguiendo protocolos normalizados y se prepararon secciones histológicas de 4 pm que se tiñeron con hematoxilina-eosina (HE) o se trataron para inmunofluorescencia (IF), usando en este último caso portaobjetos tratados con poli(L-lisina). Para pruebas de IF, se empaparon las secciones desparafinadas e hidratadas en Triton X-100 al 0,1 % en PBS, se eliminó la autofluorescencia mediante incubación con NH4 Cl 50 mM (10 minutos a temperatura ambiente), y se bloquearon en seroalbúmina bovina al 0,3 % (BSA, Sigma) en PBS (1 hora a temperatura ambiente). Se incubaron las muestras bloqueadas durante la noche a 4 °C con un anticuerpo policlonal (Santa Cruz Biotechnology) que es específico contra proteínas de la familia 2 de prolactinas (proliferinas), incluyendo proliferina- 2 (Prl2c3). Entonces se lavaron en PBS y se incubaron con el anticuerpo secundario acoplado a Cy3 correspondiente (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Finalmente, se lavaron las muestras en PBS y se montaron con Vectashield (Vector Labs) conteniendo 5 ng/ml de DAPI (Merck). Para la detección de LRC mediante inmunofluorescencia en preparaciones "in toto", se incubaron los fragmentos de epidermis de la cola con HCl 1 N (45 minutos a 37 °C) y con tris-borato-EDTA (5 minutos a temperatura ambiente), realizando los lavados breves respectivos con agua destilada después de cada incubación. Entonces se empaparon y bloquearon en un tampón de pTg (Triton X-100 al 0,5 %, gelatina al 0,2 % en PBS) durante 1 hora a temperatura
ambiente, después de lo cual se incubaron con el anticuerpo monoclonal primario anti-BrdU de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Roche) durante la noche a 37 °C. Entonces se lavaron repetidamente en PBS y se montaron con Vectashield-DAPI. Se analizaron las muestras de inmunofluorescencia bajo un microscopio confocal espectral, Leica TCS-SP2-AOBS, usando láseres de excitación de 488 nm para FITC, 633 nm para Cy3 y UV para dAp I. Se realizaron reconstrucciones tridimensionales con la ayuda de LCS Suite versión 2.61 (Leica) y luego se procesaron con Photoshop CS3 Extended version 10.0.1 (Adobe). Las secciones histológicas teñidas con HE se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia Olympus BX61 acoplado a una cámara digital Olympus DP50, usando campo claro y luz de excitación azul (filtro de excitación BP 460-490 y filtro de barrera BA 520IF). Ejemplo 5: Extracción de ARN de Prl2c3, análisis a gran escala de patrones de expresión génica y qRT-PCR Se realizó la purificación de ARN de Prl2c3 de la epidermis de la cola y la piel del lomo mediante extracción orgánica con reactivo de aislamiento TriPureTM (Roche) seguido de purificación por columna (RNeasy Mini kit, QIAGEN). Se rompió el tejido con un par de tijeras y se homogenizó en TriPure con Politron (PT 1200 E, Kinematica). El tejido homogeneizado se separó en fases con cloroformo:isoamilo (Merck) y el ARN de la fase acuosa se purificó en columna. Se determinó la concentración y pureza del ARN (A260:A280 razón >1,8) mediante espectrofotometría (Nanodrop ND1000, Nanodrop Technologies). El análisis a gran escala de expresión génica se realizó mediante series de Agilent Technologies (Agilent.SingleColor. 14868). Los análisis de PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) de la expresión se llevaron a cabo usando 7900HT Fast Real Time PCR con SYBR Green de Applied Biosystems.
Resultados:
Ejemplo 6: Inducción de la proliferación de las células madre encontradas en la región prominente del folículo piloso mediante tratamiento con PDT-MAL
Para analizar el efecto del tratamiento con PDT-MAL en la actividad de células madre epidérmicas, el folículo piloso (HF), la región prominente de la que constituye el principal depósito de células madre de piel, se usó como modelo. Se identificaron las células madre en base a su tasa de proliferación baja característica que permite retener un marcador BrdU nuclear durante un período de tiempo prolongado después de la administración en serie del análogo de nucleótido en neonatos, que permite identificarlos como LRC (Braun et al, "Manipulation de stem cell proliferation and lineage commitment: visualization de label-retaining cells in wholemounts de mouse epidermis". Development.
130:5241-55, 2003; Cotsarelis et al, "Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis". Cell 61, 1329-37, 1990). Tal como se muestra en la figura 1, el análisis de inmunofluorescencia en preparaciones "in toto" de la epidermis de la cola de ratones de control y ratones sometidos a PDT-MAL mostraron un aumento significativo (p <0,001) en el número de LRC en la región prominente de los HF.
Ejemplo 7: Inducción de hiperplasia transitoria en la epidermis e incremento en la densidad de fibras de colágeno en la dermis mediante tratamiento con PDT-MAL
Se caracterizaron los cambios morfológicos a gran escala causados por PDT-MAL en secciones histológicas de la piel dorsal del lomo teñidas con HE. El análisis de estas secciones indicó que el tratamiento induce hiperplasia transitoria en la epidermis, observándose la respuesta más obvia 2 días después del tratamiento, y remitiendo a estado normal 7 días después del tratamiento (figura 2A). También se observaron cambios muy pronunciados en la morfología de la dermis que mostraron un aumento significativo en la densidad de fibras de colágeno 7 días después del tratamiento de MAL-PDT, caracterizado por un aumento en la emisión fluorescente específica de eosina ya que ella misma se entrelaza en fibras de colágeno (Espada et al. "Selective fluorescence of eosinophilic structures in grasshopper and mammalian testis stained with haematoxilin-eosin" Histochemistry 99:385-390, 1993) (figura 2B). Ejemplo 8: Aceleración del crecimiento capilar mediante tratamiento con PDT-MAL
Para analizar las dinámicas del crecimiento capilar en la piel sometida a PDT-MAL, se rasuró la piel del lomo de los ratones y se aplicó por vía tópica Metvix® en la región dorsal derecha, dejando la izquierda como control, tal como se describió con detalle en el ejemplo 2. Después de transcurridas 5 horas de incubación en la oscuridad, se determinó la producción de PpIX mediante el análisis de las características de emisión fluorescente roja de este compuesto. Los resultados obtenidos mostraron que la producción de PpIX a partir de MAL en la epidermis tuvo lugar en presencia de Metvix®, tal como indicó la señal fluorescente observada bajo luz de excitación Uv (figura 3A, día 0). Entonces se completó la PDT irradiando el lomo de los ratones con luz roja. La progresión observada en los días posteriores mostró un crecimiento capilar significativamente acelerado en la mitad tratada con respecto a la piel de control (figura 3A, días 7 a 26). Las secciones histológicas correspondientes a las muestras de piel tomadas 26 días después de la PDT muestran claramente el desarrollo conseguido por los HF (figura 3B). Por tanto, mientras que los HF en la piel de control piel permanecen en reposo (fase telógena) y en ningún caso rebasan la dermis, se observa el progreso de la fase de crecimiento (anágena) en la piel tratada y la región del bulbo piloso penetra extensamente en la capa subyacente a la dermis.
Ejemplo 9: Inducción específica del gen Prl2c3 mediante tratamiento con PDT-MAL
Para determinar los cambios en el patrón de expresión génica inducido en la piel mediante tratamiento con PDT-MAL, se llevó a cabo un análisis de ARN de tipo microalinamiento a gran escala usando RNAm obtenido de la piel del lomo y la epidermis de la cola. Mediante este enfoque, se identificó el producto del gen Prl2c3 como el RNAm cuya expresión se observó fuertemente modificada en respuesta al tratamiento con PDT-MAL, resultado que se validó mediante qRT-PCR (figura 4). La inmunolocalización de proteína Prl2c3 en secciones de piel dorsal histológicas mostró un patrón difuso y de baja intensidad en citoplasma en la epidermis de animales de control, mientras que se confirmó el aumento en los niveles de expresión después del tratamiento, dando a conocer una nueva localización nuclear de esta proteína en animales sometidos a PDT-MAL (figura 5).
Ejemplo 10: Inducción del crecimiento "in vitro" y expansión de células madre epidérmicas mediante un medio de cultivo que contiene cantidades grandes de Prl2c3
Se aisló primero ADNc Prl2c3 mediante de RT-PCR y después se clonó en el vector de expresión pcDNA3.1A, y se transfectó este vector en células T HEK293. Se verificó mediante de inmunotransferencia que el medio de cultivo acondicionado por el crecimiento de células transfectadas con el vector clonado contenía, en promedio, hasta 10 veces más proteína Prlc3 que un medio de control que contiene células transfectadas con el vector vacío. Entonces se aislaron células madre epidérmicas de piel de ratón según protocolos establecidos (Espada et al. "Nuclear envelope defects cause stem cell dysfunction in premature-aging mice" J. Cell Biol. 181:27, 35, 2008). Se trataron estos cultivos con un medio acondicionado. Los cultivos con medio acondicionado mostraron un número significativamente mayor de colonias con más de 4 células comparados con cultivos de control tratados con medio que contiene células transfectadas con el vector vacío (figura 6).
Claims (5)
1. Uso de protoporfirina IX, o un precursor de la misma, capaz de producir especies reactivas del oxígeno, para la activación in vitro de células madre epidérmicas.
2. Uso de protoporfirina IX, o un precursor de la misma, capaz de producir especies reactivas del oxígeno, para la producción in vitro de proteínas de la familia de prolactinas 2.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que las proteínas de la familia de prolactinas 2 son proliferina-2.
4. Uso de protoporfirina IX, o un precursor de la misma, capaz de producir especies reactivas del oxígeno, para la generación de equivalentes de piel epidérmicos o dermoepidérmicos.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el precursor es ácido 5-aminolevulínico.
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