B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-lnhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die
Herstellung von Aminosäuren und Nukleotiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Vektoren enthaltend ein für in seiner feedback-lnhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym kodierendes Gen und deren Verwendung für die Herstellung von Aminosäuren und Nukleoditen. Aminosäuren finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie, in der Lebensmittelindustrie und ganz besonders in der Tierernährung Anwendung. Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, sowie von Enterobakterien, insbesondere Escherichia coli, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbes-serungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel lonen- austauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorga- nismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und die Aminosäuren produzieren. Ebenfalls werden Methoden der rekombi- nanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von L-Aminosäure produzierenden Stämmen eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
Die Synthese von Aminosäuren in Mikroorganismen erfolgt über Synthesewege, die Aminosäurebiosynthesewege oder auch Aminosäuresynthesewege oder auch Synthesewege genannt werden. Diese Synthesewege bestehen aus einzelnen Schritten bei denen die
Aminosäure aus Vorstufen synthetisiert wird. Diese Vorstufen werden im Zentralstoffwechsel zur Verfügung gestellt. Es sind zum Beispiel Pyruvat, alpha-Ketoglutarat, Oxalacetat, Pentosephosphat, AcetylCoA, Erythrosephosphat, Phosphoenolpyruvat oder Phosphoglycerat. Desweiteren werden zur Synthese der Aminosäuren aus Vorstufen über die Sythesewege NADPH2, NH4+ und reduziertes Tetrahydrofolat benötigt. Die Synthese der Aminosäuren aus Vorstufen über Synthesewege in coryneformen Bakterien und Enterobakterien ist dem
Fachmann bekannt. Dies betrifft die Aminosäuren L-Alanin, L-Valin, L-Leucin, L-Asparagin, L-Aspartat, L-Lysin, L-Methionin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Histidin, L-Glutamat, L-Glutamin, Prolin, Glycin, L-Arginin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Serin und L-Cystein. Die Synthese der Aminosäuren ist besonders gut untersucht in Escherichia coli und Corynebac- terium glutamicum.
Die Synthesewege bestehen aus einer Reihe von durch Enzyme katalysierten Reaktionen und sie sind streng reguliert. Eine besonders strenge Regulation erfolgt durch feedback- resistente Enzyme. In Wildtypstämmen verhindern strikte Regulationsmechanismen die über den Eigenbedarf hinausgehende Produktion von Stoffwechselprodukten wie Aminosäuren und deren Abgabe ins Medium. Die Konstruktion von aus Herstellersicht organischchemischen Verbindungen überproduzierenden Stämmen erfordert deshalb diese Stoffwechselregulationen zu überwinden. Diese feedback-resistenten Enzyme katalysieren bevorzugt Eingangsreaktionen der Synthesewege oder Verzweigungspunkte der Synthesewege. Dabei erfolgt die Regulation oft über das Endprodukt des Synthesewegs, also die Ami- nosäure L-Alanin, L-Valin, L-Leucin, L-Asparagine, L-Aspartat, L-Lysin, L-Methionin, L- Threonin, L-Isoleucin, L-Histidin, L-Glutamat, L-Glutamin, Prolin, Glycin, L-Arginin, L- Tryptophan, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Serin und L-Cystein.
Es können auch Intermediate regulierend eingreifen, wie O-Acetyl serin, O-Acetylhomoserin, O-Succinylserin, O-Succinylhomoserin oder Adenosylmethionin. Die Regulation ist derart, dass bei einer erhöhten Konzentration der genannten Aminosäuren oder Intermediate das jeweilige Enzym des Synthesewegs oder auch die feedback-resistenten Enzyme des Synthesewegs, gehemmt werden.
Beispiele für Enzyme von Synthesewegen nach dem Stand der Technik, deren Bildung in der Zelle feedback- gesteuert ist und die für sie kodierenden Gene, sind in Tabelle 1 darge- stellt. Ferner sind die EC Nummern angegeben, die die jeweilige Reaktion bezüglich der
Substrate und Produkte des Mechanismus 'der Schlüsselreaktion charakterisieren. Weiterhin sind die Zugangsnummern für Sequenzen der regulierten feedback-resistenten Enzyme des Wiltyps von E. coli und C. glutamicum angegeben. Die Nukleotidsequenzen dieser Gene und die kodierten Polypeptidsequenzen sind in öffentlichen Datenbanken hinterlegt. So für C. glutamicum im National Center for Biotechnology Information (NCBI) database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) unter den Zugangsnummern NC_003450.2 and BX927148.1 bis BX927157.1. Die Nukleotidsequenzen dieser Gene und die kodierten Polypeptidsequenzen von E. coli sind durch Blattner et al. beschrieben (Science 277: 1453- 1462 (1997)) und hinterlegt im National Center for Biotechnology Information (NCBI) databa- se of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) unter den Zugangsnummer
NC_000913.2. Zugang besteht ebenso über die Datenbank UniProtKB/Swiss-Prot European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg.
Tabelle 1 : Beispiele für feedback-inhibierte Enzyme, deren sie charakterisierende Enzymklassifikationsnummern und die für sie kodierenden Gene, sowie die beispielhaften
Zugangsnummern der Gene für E. coli und C. glutamicum.
Enzym EC Nummer Gen Zugangs- Nr. Zugangs- Nr.
E. coli C. glutamicum
2-lsopropylmalatsynthase EC 2.3.3.13 leuA EG 11226 YP_224548
Acetohydoxysäuresynthase EC 2.2.1.6 ilvN EG 10502 YP_225560.1
Acetohydoxysäuresynthase EC 2.2.1.6 ilvB EG 10494 YP_225561.1
Acetohydoxysäuresynthase EC 2.2.1.6 ilvl EG 10500 YP_225560.1
Acetohydoxysäuresynthase EC 2.2.1.6 ilvH EG 10499 YP_225561.1
Acetylg I utamatsynthase EC 2.3.1.1 argA EG 10063 YP_225682.1
Anthranilatsynthase EC 4.1.3.27 trpD EG11027 YP_227281.1
Anthranilatsynthase EC 4.1.3.27 trpE EG11028 YP_227280.1
Asparaginsynthetase B EC 6.3.5.4 asnB NP_415200.1 NC_006958.1
Aspartate transcarbamylase EC 2.1.3.2 pyrB NP_418666 Q8NQ38
Aspartate transcarbamylase EC 2.1.3.2 pyrl NP_418665.1 Q8NQ38
Aspartatkinase EC 2.7.2.4 lysC EG 10550 P26512.2
Aspartatkinase EC 2.7.2.4 metL EG 10590 P26512.2
Aspartatkinase EC 2.7.2.4 thrA EG10998 P26512.2
ATP-Phosphoribosyltransferase EC 2.4.2.17 hisG EG 10449 Q9Z472.2
Carbamoyl-phosphatsynthetase EC 6.3.5.5 carA EG10134 Q8NSR1.1
Carbamoyl-phosphatsynthetase EC 6.3.5.5 carB NP_414574.1 P58939.1
Chorismatmutase I EC 5.4.99.5 tyrA EG 11039 BAB98246.1
Chorismatmutase II EC 5.4.99.5 pheA EG 10707 YP_227138.1
Cysteinsynthase EC 2.5.1.47 cysK NP_416909.1 CBV01938.1
Cysteinsynthase EC 2.5.1.47 cysM NP_416916.1 CBF99279.1
D-3-phosphoglycerate dehydroge- EC 1.1.1.95 serA NP_417388.1 AEA48241.1 nase
3-Desoxy-D-Arabino-Heptulosonat- EC 4.1.2.15 aroG NP_415275.1 CAC25920.1 7-Phosphat-Synthase
Dihydrodipicolinatsynthase EC 4.2.1.52 dapA NP_416973.1 CAA37940.1
Glutamatdehydrogenase EC 1.4.1.4 gdh NP_416275.1 NP_601279.1
Glutamatsynthase EC 1.4.1.13 gltB NP_417679.2 YP_224481.1
Glutamatsynthase EC 1.4.1.13 gltD NP_417680.1 YP_226992.1
Glutaminsynthetase EC 6.3.1.2 glnA NP_418306.1 YP_226471.1
Glutamylkinase EC 2.7.2.11 proB NP_414777.1 YP_226601.1
Homocysteintransmethylase EC 2.1.1.14 metE NP_418273.1 CAF19845.1
Homoserin O-aceyltransferase EC 2.3.1.46 metX NP_417417.1 NP_600817.1
Homoserin O-succinyltransferase EC 2.3.1.46 metA NP_418437.1 YP_225473.1
Homoserindehydrogenase EC 1.1.1.3 metL EG 10590 CAF19887.1
Homoserindehydrogenase EC 1.1.1.3 thrA EG 10998 NP_414543.1
Methioninsynthase EC 2.1.1.13 metH NP_418443.1 NP_600723.1
Phosphoribosylpyrophosphatsyn- EC 2.7.6.1 prs NP_415725.1 YP_225235.1 thetase
Prephenatdehydrogenase 1 EC 1.3.1.12 pheA NP_417090.1 CAF20922.1
Prephenatdehydrogenase II EC 1.3.1.12 tyrA EG 11039 YP_227138.1
Pyrrolin-5-carboxylatreductase EC 1.5.1.2 proC NP_414920.1 NP_599658.1
Ribose 1 ,5-bisphosphokinase EC 2.7.4.23 phnN NP_418518.1 NP_600170
Serinacetyl(succinyl)transferase EC 2.3.1.30 cysE NP_418064.1 NP_601761.1
Threoninammonia-Iyase EC 4.3.1.19 ilvA NP_418220.1 NP_601328.2
Tyrosinaminotransferase EC 2.6.1.57 tyrB NP_418478.1 NP_599471.2
Ausgehend von der Wildform der in Tabelle 1 beispielhaft genannten feedback-gesteuerten Enzyme besteht der Bedarf, eine Deregulation der Enzymaktivität zu erreichen, um die Produktion von Zielverbindungen, wie beispielsweise Aminosäuren, Nukleodiden, Aminosäure- derivaten oder Intermediate der Synthesewege zu verbessern.
Die Bedeutung solcher feedback-resistenter Enzyme, deren Regulation beseitigt ist und die somit zur Verbesserung der Leistungsfähigkeit von Mikroorganismen beitragen, ist bekannt und es sind feedback-resistente Allele die gegenüber dem Wildtypgen Mutationen tragen beschrieben. So ist in DE102008040352A1 und EP000002147972A1 beschrieben, dass Allele von aroG die für 3-Desoxy-D-Arabino-Heptulosonat-7-Phosphat-Synthase kodieren zu verbesserter Tryptophanbildung führen. Weiterhin ist z. B. ein rekombinantes, L-Lysin produzierendes Bakterium bekannt, das ein lysC Allel mit feedback-resistenter Aspartatkinase enthält (EP0381527A1 ). Ebenso ist ein rekombinantes, L-Phenylalanin produzierendes Bakterium mit feedback-resistenter Prephenatdehydrogenase beschrieben (EP088424A2). Auch ist ein leuA Allel beschrieben, das für eine mutierte Isopropylmalatsynthase kodiert sowie ein Mikroorganismus, der L-Leucin produziert (EP000001568776B1 ). Eine mutierte Acetolaktatsynthase mit einer Mutation in der llvN Untereinheit und ein Mikroorganismus der L-Valin überproduziert ist in EP07017918.9 beschrieben. Auch für das Enzym Acetylglutama- tesynthase ist ein Allel beschrieben, das gegenüber dem Wildtypenzym feedback-Resistenz gegenüber Arginin aufweist, und es sind Stämme beschrieben die mit dem Allel mehr L- Arginin produzieren (US 7169586 B2). Mutierte Allele der Phosphoribosylpyrophosphat- synthetase und Methoden zur L-Histidinbildung sind beschrieben (EP 1529839 A1 ). Es ist auch bekannt, dass die L-Histidinbiosyntheseenzyme, die durch hisG und hisBHAFI kodiert
sind, durch L-Histidin inhibiert werden und deshalb kann die Fähigkeit zur Produktion von L- Histidin auch durch Einführen einer Mutation, die eine Resistenz gegen die Rückkopplungshemmung verleiht, in ATP-Phosphoribosyltransferase wirksam erhöht werden (russische Patente Nr. 2003677 und 2119536). Mit der Carbamoyl-phosphatsynthetase als Enzym konnte eine verbesserte Argininbildung erreicht werden (EP000001026247A). Auch führte das Einbringen eines cysE-Allels, das für eine Serin-O-Acetyl-Transferase mit einer verminderten feedback-Hemmung durch L-Cystein kodiert, zu einer Steigerung der Cystein- Produktion (US6218168B1 ; Nakamori et al., 1998, Appl. Env. Microbiol. 64: 1607-1611 ; Takagi et al., 1999, FEBS Lett. 452: 323-327). Durch ein feedback-resistentes CysE-Enzym wird die Bildung von O-Acetyl-L-Serin, der direkten Vorstufe von L-Cystein, weitgehend vom L-Cystein-Spiegel der Zelle entkoppelt.
Zur Beseitigung der Kontrollmechanismen und Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das Threonin-Analogon alpha-Amino-beta-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie z. B. L-Threonin produzieren. Resistenz gegen das Tryptophan-Analogon 5-Methyl-DL-Tryptophan (5-MT) zeichnet zum Beispiel einen Stamm aus, der L-Tryptophan produziert (DE 102008040352 A1 ). Auch wiesen Stämme die gegen 4-aza-D,L-leucine or 3-hydroxy-D,L-leucine, ß-2- thienylalanine, 3-hydroxyleucine, 4-azaleucine und 5,5,5-trifluoroleucine resistent waren eine feedback-resistente Isopropylmalatdehydrogenase auf (EP1568776A2, EP 1067191 A2). Es sind Stämme beschrieben deren Acetolaktatsynthasen durch Nutzung der Inhibitoren
Sulphonylurea und Imidazolinone reduzierte feedback-Hemmung aufweisen (CA 2663711 A1 ). Auch gelang es durch Selektion langsam wachsender Mutanten Stämme mit argA Alle- len zu gewinnen die zur L-Argininbildung geeignet sind (US 7169586 B2). Ebenso konnten über die Resistenz vermittelnden Substanzen 5-Azauracil, 6-Azauracil, 2-Thiouracil, 5- Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5-Azacytosine, 6-Azacytosine, Argininhydroxamat, 2-Thiouracil und 6-Azauracil (Japanese Patent 49-126819) Argininbildner gewonnen werden. Durch Nutzung von Pyrimidinanaloga, wie Azidothymidine oder Azidodeoxyuridine ist es möglich, Stämme zu gewinnen, in denen feedback-resistente Enzyme wie z.B. die Aspartattranscar- bamoylase des gemeinsamen Synthesewegs von L-Histidin, Purin und Pyrimidinmutiert sind (US 5213972). Durch Nutzung von Lysinanaloga, wie S-(2-aminoethyl)-cysteine gelang es lysC Allele zu gewinnen oder durch Nutzung von Methioninanaloga, wie alpha-methyl- Methionine, Ethionine, Norleucine, N-Acetylnorleucine, S-Trifluoromethylhomocysteine, 2- Amino-5-heprenoit acid, Seleno-methionine, Methioninesulfoxamine, Methoxine, 1-
Aminocyclopentancarboxysäure Stämme mit Allelen die vermehrt L-Methionin akkumulieren (EP 1745138 B1 ). Durch Verwendung von 1 ,2,4,-Triazole-D-alanin konnte die feedback-
Hemmung des HisG Allels hisG13 aufgehoben werden und damit Stämme gewonnen werden deren Leistungseigenschaft verbessert war (Mizukami T et al., Biosci Biotechnol Bio- chem. 1994 Apr,58(4):635-8).
Ein großer Nachteil der bisherigen Gewinnung von in ihrer feedback-Resistenz geminderten Enzymen ist der Einsatz von Analoga, wie zum Beispiel alpha-Amino-beta-
Hydroxyvaleriansäure, 5-Methyl-DL-Tryptophan, 4-aza-D,L-leucine oder 3-hydroxy-D,L- leucine, β-2-thienylalanin, 3-hydroxyleucine, 4-azaleucin, 5,5,5-trifluoroleucin, Sulphonylurea, Imidazolinon, 5-Azauracil, 6-Azauracil, 2-Thiouracil, 5-Fluorouracil, 5-Bromouracil, 5- Azacytosine, 6-Azacytosine, Argininhydroxamat, 2-Thiouracil, 6-Azauracil, Azidothymidin, Azidodeoxyuridin, S-(2-aminoethyl)-cystein, alpha-methyl-Methionin, Ethionin, Norleucin, N- Acetylnorleucin, S-Trifluoromethylhomocystein, 2-Amino-5-heprenoitsäure, Seleno- methionin, Methioninesulfoxamin, Methoxine, 1-Aminocyclopentancarboxysäure, 1 ,2,4,- Triazole-D-alanin und die Isolation gegen solche Analoga resistenten Mutanten. Ein weiterer großer Nachteil bisheriger Verfahren zur Gewinnung von feedback-resistenten Enzymen und deren Nutzung um die Leistungsfähigkeit der Mikroorganismen zu verbessern ist es, dass viele Stämme nach ungerichteter Mutagenese und Einsatz von Analoga auf verbesserte Leistungsfähigkeit getestet werden müssen, da Analogaresistenz verschiedenste Ursachen haben kann, wie z.B. verbesserten Abbau des Analogons oder auch verbesserten Export des Analogons, was eine feedback-Resistenz vortäuschen kann und was dazu führt, dass kein neues feedback-resistentes Enzym gewonnen werden konnte und kein Stamm mit verbesserter Leistungseigenschaft vorliegt. Deswegen können bisherige Techniken die gezielte Gewinnung von feedback-resistenten Enzymen zu isolieren, die die Aufgabe haben, die Leistungsfähigkeit von Mikroorganismen zur Herstellung von Aminosäuren verbessern, nur teilweise, beziehungsweise unvollkommen oder auch gar nicht lösen.
Es ist daher die Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Vektoren, enthaltend ein Gen, kodierend für ein in seiner feedback-lnhibierung gemindertes oder ausgeschaltetes Enzym, zu schaffen, mit dem feedback-resistente Enzyme oder Enzyme, die in ihrer Inhibierung gegenüber der Wildform gemindert sind und die dafür kodierende Desoxyribonukleinsäure zuverlässiger, schneller und besser bereitgestellt werden können. Weiterhin sollen feedback-resistente Enzyme oder in ihrer Inhibierung geminderte Enzyme und die für sie kodierende Desoxyribonukleinsäuren zur Verfügung gestellt werden.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 und der Nebenansprüche wird die Aufgabe gelöst durch die im kennzeichnenden Teil angegebenen Merkmale.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, feedback-resistente Enzyme oder gegenüber der Wildform in ihrer Inhibierung geminderte Enzyme sowie die für sie kodierende Desoxyribonukleinsäure und Vektoren enthaltend diese Desoxyribonukleinsäure be-
reitzustellen bzw. zu gewinnen. Das Verfahren ist genauer, zuverlässiger und schneller als die Methoden nach dem Stand der Technik, da eine feedback-Resistenz oder Minderung der feedback-Resistenz durch die Verfahrensweise nicht vorgetäuscht wird, sondern in direktem kausalem Zusammenhang mit den durchgeführten Methoden festgestellt wird.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Im Folgenden soll die Erfindung in ihrer allgemeinen Form beschrieben werden.
- In einem ersten Schritt wird das feedback- sensitive Gen der Wildform eines Mikroorganismus als Ausgangsorganismus, beispielsweise eines Bakteriums oder einer Hefe in vitro mutagenisiert und mit einem Vektor ligiert.
- Mit dem Ligationsansatz wird ein Mikroorganismus transformiert und es wird eine
Vektorgenbank erhalten. Dabei ist der zur Transformation benutzte Mikroorganismus, der einen Metabolitsensor enthält, der bei erhöhter Metabolitkonzentration zur Synthese eines Fluoreszenzproteins führt.
- Im nachfolgenden Schritt werden Mikroorganismen mit der höchsten Fluoreszenz ausgewählt, und deren Vektoren isoliert. Es können auch Mikroorganismen ausgewählt werden, die eine durch den Metabolitsensor bedingte Fluoreszenz aufweisen, die im Vergleich zu dem Ausgangsorganismus der das Gen der Wildform enthält erhöht ist.
Mit diesen Verfahrensschritten kann ermittelt werden, welche Mutante die höchste oder eine erhöhte Produktion des gewünschten Produkts hervorbringt.
Die nach diesem Verfahren isolierten Vektoren enthalten Gene, die für in ihrer feedback- Inhibierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme kodieren. Diese in den Vektoren enthaltenen Gene, die für in ihrer feedback-lnhibierung ausgeschaltete oder geminderte Enzyme kodieren, können nach dem Fachmann bekannten Verfahren zur Produktion von Aminosäuren, Nukleotiden oder Intermediaten benutzt werden. Hierfür können beispielhaft die nachfolgende, dem Fachmann bekannte, Verfahrensschritte durchgeführt werden.
Die Gene, die für in ihrer feedback-lnhibierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme kodieren, können auf dem Vektor in den Produktionsstamm eingeführt werden, der dann zur besseren Produktion des gewünschten Produktes befähigt ist.
Alternativ können die Gene, die für in ihrer feedback-lnhibierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme kodieren in Vektoren eingebaut werden, die bereits zur Pro-
duktion des gewünschten Produktes dienen und zu einer zusätzlichen Steigerung der Produktbildung führen.
- In einer weiteren Ausführungsform können die Gene, die für in ihrer feedback- Inhibierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme kodieren in das Chromosom des Produktionsstammes eingeführt werden, der dann zur besseren Produktion des gewünschten Produktes befähigt ist.
Unter einem feedback-sensitiven Gen im Sinne der Erfindung ist eine Desoxyribonukleinsäure zu verstehen, die für ein Enzym kodiert, das feedback-inhibiert wird. Dabei ist es egal, ob die feedback-lnhibierung durch das gebildete Produkt oder durch ein bei der Produktion entstehendes Intermediat erfolgt.
Unter dem Begriff„Wildform" im Sinne der Erfindung, ist ein Gen oder ein Gen aus einem Stamm zu verstehen, das noch nicht mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verändert wurde oder das bereits einer erfindungsgemäßen Veränderung unterzogen wurde, und dessen kodierende Enzymaktivität noch weiter gesteigert werden soll, das also als Ausgangsgen für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden soll. Dabei kann es sich um ein natürlich vorkommendes Gen oder um ein Gen aus einem Stamm, der genetisch verändert wurde, handeln und das bzw. der als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäß durchführte Muta- genese dient.
Die Mutagenisierung kann dabei vorzugsweise durch ungerichtete Methoden durchgeführt werden, wie beispielsweise durch eine fehlerhafte Polymerasekettenreaktion, die nach dem Stand der Technik bekannt sind.
Bei dem Ausgangsorganismus aus dem das zu verändernde Gen bezogen wird, kann es sich um jeden beliebigen Mikroorganismus handeln, der ein Gen für ein Protein enthält, welches feedback-reguliert bzw. feedback-inihibiert wird, beispielsweise um ein Bakterium, wie ein Corynebakterium, ein Enterobakterium oder eine Hefe, wie beispielsweise Saccha- romyces cerevisiae. Insbesondere können Corynebakterium glutamicum oder ein E. coli als Ausgangsorganismus eingesetzt werden.
Beispielhaft aber nicht beschränkend können für die in Tabelle I genannten Organismen und deren Gene und Enzyme für eine erfindungsgemäße Veränderung herangezogen werden.
Die in Tabelle 1 offenbarten Aminosäuresequenzen der feedback-gesteuerten Enzyme und die Nukleinsäuresequenzen der für sie kodierenden Gene als Ausgangsmaterialien für das erfindungsgemäße Verfahren umfassen erfindungsgemäß auch solche Sequenzen, die eine Homologie (auf Aminosäureebene) bzw. Identität (auf Nukleinsäureebene, exklusive der natürlichen Degeneration) größer als 70%, vorzugsweise 80%, mehr bevorzugt 85% (in
Bezug auf die Nukleinsäuresequenz) bzw. 90% (auch in Bezug auf die Polypeptide), bevorzugt größer als 91%, 92%, 93% oder 94%, mehr bevorzugt größer als 95% oder 96% und besonders bevorzugt größer als 97%, 98% oder 99% (in Bezug auf beide Arten von Sequenzen) zu einer dieser Sequenzen aufweisen, sofern die Wirkungsweise bzw. Funktion und Zweck einer solchen Sequenz erhalten bleibt. Der Ausdruck "Homologie" (oder Identität) wie hierin verwendet, kann durch die Gleichung H (%) = [1-V/X]x 100, definiert werden, worin H Homologie bedeutet, X die Gesamtzahl an Nukleobasen/Aminosäuren der Vergleichssequenz ist und V die Anzahl an unterschiedlichen Nukleobasen/Aminosäuren der zu betrachtenden Sequenz bezogen auf die Vergleichssequenz ist. Auf jeden Fall sind mit dem Begriff Nukleinsäuresequenzen, welche für Polypeptide kodieren, alle Sequenzen umfasst, die nach Maßgabe der Degeneration des genetischen Codes möglich erscheinen. Selbiges gilt auch für alle anderen möglichen Gene oder Enzyme, die erfindungsgemäß verändert werden sollen und die nicht in Tabelle 1 aufgelistet sind.
Die prozentuale Identität zu den Aminosäuresequenzen, die in dieser Beschreibung durch die Zugangsnummer (Acession No.) in Tabelle 1 gegeben sind, kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren vom Fachmann ohne weiteres ermittelt werden. Ein geeignetes Programm, das erfindungsgemäß eingesetzt werden kann, ist BLASTP (Altschul et a\.. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402).
Die in Tabelle 1 offenbarten Nukleinsäuresequenzen der kodierenden Gene für feedback- sensitive.Enzyme umfassen erfindungsgemäß auch Nukleinsäuresequenzen die mit den angegebenen hybridisieren. Anleitungen zur Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" der Firma Boehrin- ger Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41 : 255-260 (1991 )). Die Hybridisierung findet unter stringenten Bedingungen statt, das heißt, es werden nur Hybride gebildet, bei denen Sonde, beispielsweise die zum Gen komplementäre Nukleotidsequenz, und Zielsequenz, d. h. die mit der Sonde behandelten Polynukleotide, mindestens 70% identisch sind. Es ist bekannt, dass die Stringenz der Hybridisierung einschließlich der Waschschritte durch Variieren der Pufferzusammensetzung, der Temperatur und der Salzkonzentration beeinflusst bzw. bestimmt wird. Die Hybridisierungsreaktion wird im Allgemeinen bei relativ niedriger Stringenz im Vergleich zu den Waschschritten durchgeführt (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996). Für die Hybridisierungsreaktion kann beispielsweise ein Puffer entsprechend 5xSSC-Puffer bei einer Temperatur von ca. 50°C - 68°C eingesetzt werden. Dabei können Sonden auch mit Polynukleotiden hybridisieren, die weniger als 70% Identität zur Sequenz der Sonde aufweisen. Solche Hybride sind weniger stabil und werden durch Waschen unter stringenten Bedingungen entfernt. Dies kann beispielsweise durch Senken
der Salzkonzentration auf 2xSSC und gegebenenfalls nachfolgend 0,5xSSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland, 1995) erreicht werden, wobei eine Temperatur von ca. 50°C - 68°C, ca. 52°C - 68°C, ca. 54°C - 68°C, ca. 56°C - 68°C, ca. 58°C - 68°C, ca. 60°C - 68°C, ca. 62°C - 68°C, ca. 64°C - 68°C, ca. 66°C - 68°C eingestellt wird. Vorzugsweise werden die Waschschritte bei Temperaturen von ca. 62°C - 68°C, bevorzugt von 64°C - 68°C oder ca. 66°C - 68°C, besonders bevorzugt von ca. 66°C - 68°C durchgeführt. Es ist gegebenenfalls möglich die Salzkonzentration bis auf eine Konzentration entsprechend 0,2xSSC oder 0,1xSSC zu senken. Durch schrittweise Erhöhung der Hybridisierungstemperatur in Schritten von ca. 1 - 2°C von 50°C bis 68°C können Polynukleotidfragmente die für feedback-sensitive Enzyme kodieren isoliert werden, die beispielsweise mindestens 70% oder mindestens 80% oder mindestens 90% bis 95% oder mindestens 96% bis 98% oder mindestens 99% Identität zur Sequenz der eingesetzten Sonde besitzen. Weitere Anleitungen zur Hybridisierung sind in Form sogenannter Kits am Markt erhältlich (z.B. DIG Easy Hyb von der Firma Roche Diagnostics GmbH, Mann- heim, Deutschland, Catalog No. 1603558). Analog können auch andere nicht in Tabelle 1 genannte Aminosäuresequenzen und für sie kodierende Gene hybridisiert als Ausgangsmaterial für die erfindungsgemäße veränderten feedback-resistenten Gene eingesetzt werden.
Als Vektoren können alle bekannten Plasmidkörper, Transposons, Insertionselemente oder Phagen als Rohmaterial eingesetzt werden, in die die mutagenisierten Gene inseriert wur- den. Beispielhaft aber nicht beschränkend, können Vektoren die sich von pACYC184 (Bartolome et al.; Gene 102, 75-78 (1991 )), oder pTrc99A (Amann et al.: Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101 (Vocke and Bastia, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21 ): 6557-6561 (1983)) ableiten, verwendet werden. Derartige genetische Systeme sind beispielsweise in den Patentschriften US 4,822,738, US 5,804,414 und US 5,804414 be- schrieben. In gleicher weise können auch Vektoren wie pZ1 , pXZ10142,pEKEx2, pEKEx3, oderpEC-t19mob2 (zitiert im " Handbook of Corynebacterium glutamicum" (Herausgeber: L. Eggeling und M. Bott)) verwendet werden, die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden.
Als Metabolitsensoren können bekannte Metabolitsensoren, wie beispielsweise pSenLys, pSenArg, pSenSer, pSenOAS oder pJC1-lrp-brnF-eyfp eingesetzt werden. Der Metabolit- sensor umfasst eine für ein Autofluoreszenzprotein kodierende Gensequenz, wobei die Expression des Autofluoreszenzproteins von der intrazellulären Konzentration eines bestimmten Metaboliten abhängig ist. Dabei erfolgt die Kontrolle der Expression der für das Autofluoreszenzprotein kodierenden Gensequenz in Abhängigkeit von der intrazellulären Konzentration des bestimmten Metaboliten auf der Ebene der Transkription. In Abhängigkeit von der intrazellulären Konzentration des jeweiligen Metaboliten wird mithin mehr oder weni-
ger mRNA gebildet, die in den Ribosomen unter Bildung des Autofluoreszenzproteins trans- latiert werden kann.
Der zur Transformation benutzte Mikroorganismus kann jeder beliebige Mirtoorganismus sein. Beispielhaft können Bakterien, Hefen oder Enterobakterien, beispielsweise E. coli, Corynebakterium glutamicum oder Saccharomyces cerevisiae genannt werden.
Dabei ist der zur Transformation benutzte Mikroorganismus ein Mikroorganismus, der einen Metabolitsensor enthält, der bei einer Metabolitkonzentration, die höher ist als die Metabolit- konzentration, die in dem Ausgangsorganismus vorliegt, zur Synthese eines Fluoreszenzpro- teins führt.
Zur Transformation können die Vektoren enthaltend Gene, die für in ihrer feedback- Inihibierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme kodieren, eingebracht werden. Diese können direkt aus der Selektion mittels Metabolitsensoren gewonnen werden. Bei der Ausführungsform bei der die Gene, die für in ihrer feedback-lnihibierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme kodieren, in andere Vektoren eingebracht werden, die bereits zur Produktion des gewünschten Produkts dienen kann es sich um Vektoren handeln, die bereits zur Produktion des gewünschten Produktes eingesetzt werden und die bereits Gene enthalten, die die Produktionseigenschaft des für die Produktion eingesetzten Mikroorganis- m us verbessern.
Bei der Ausführungsform bei der die Gene, die für in ihrer feedback- Inhibierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme kodieren in das Chromosom des Produktionsstammes eingeführt werden, der dann zur besseren Produktion des gewünschten Produktes befähigt ist, kann die Insertion nach der dem Fachmann bekannten Methoden an jede beliebige Stelle im Chromosom stattfinden.
Als Produktionsstamm können alle in der Biotechnologie eingesetzten Stämme verwendet werden, in die die Plasmide, die die mutagenisierten Gene, die für feedback-resistente Enzyme oder in ihrer feedback-Sensitivität gemindert sind, kodieren eingeführt wurden. Bei- spielhaft können coryneforme Bakterien, Enterobakterien oder Hefen, wie beispielsweise E.coli, Corynebakterium glutamicum, oder Saccharomyces cerevisiae genannt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann grundsätzlich für die Bereitstellung jedes interessierenden Enzyms und der dafür kodierenden Desoxyribonukleinsäure eingesetzt werden, dass der Inhibierung entweder vollkommen entzogen wird oder dessen feedback-lnhibierung zumindest gemindert werden soll.
Beispielhaft aber nicht beschränkend können die in Tabelle 1 genannten Enzyme und jede der für sie kodierende Desoxyribonukleinsäure als erfindungsgemäß zu verändernde Materialien genannt werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Herstellung von Aminosäuren und derer Derivate, Nukleotide oder Intermediate von Synthesewegen als Produkte gegenüber dem Stand der Technik verbessert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Produktion von Aminosäuren und derer Derivate, Nukleotide oder Intermediate von Synthesewegen die von den entsprechenden Mikroorganismen vor der erfindungsgemäßen Veränderung nicht oder nur in geringem Maß produziert wurden.
Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Nukleinsäuren und Enzyme können für die Herstellung von diesen gewünschten Produkten verwendet werden und sind bezüglich ihrer Funktion aktiver.
Im Folgenden soll die Erfindung im Einzelnen beispielhaft aber nicht beschränkend näher beschrieben werden.
Gegenstand der Erfindung sind Allele von Genen, die für gegenüber der Wildform in ihrer feedback-lnhibierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme kodieren die mittels Metabo- litsensoren gewonnen werden, wobei die Wildtypallele plasmidkodiert vorliegen, die nach in vitro Mutagenese in Mikroorganismen, bevorzugt coryneforme Bakterien und Enterobakte- rien, eingebracht werden die den Metabolitsensor enthalten, und Einzelzellen erzeugt wer- den, beziehungsweise isoliert werden, die als Zelle erkannt wird die ein nicht mehr reguliertes Enzym enthält.
Metabolitsensoren ermöglichen den direkten Nachweis erhöhter intrazellulärer Aminosäurekonzentrationen in Einzelzellen coryneformer Bakterien, wie zum Beispiel Corynebacterium glutamicum und in Enterobakterien, wie zum Beispiel Escherichia coli (WO201 1138006 ). Weiterhin ermöglichen Metabolitsensoren die Detektion erhöhter intrazellulärer Aminosäurekonzentrationen von L-Valin, L-Leucin, L-Asparagin, L-Lysin, L-Methionin, L-Threonin, L- Isoleucin, L-Histidin, L-Glutamat, L-Glutamin, Prolin, L-Arginin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L- Phenylalanin, L-Serin und L-Cystein, besonders bevorzugt die von L-Histidin, L-Arginin, L- Lysin, L-Leucin.
Metabolisensoren ermöglichen auch den Nachweis erhöhter Konzentrationen von Intermedi- aten, wie beispielsweise Intermediaten der Aminosäure oder Nukleotidsynthese, wie beispielsweise O-Acetylserin, O-Acetylhomoserin, Cystathionin, Orotidine-5'-Phosphat, 5- Phosphoribosyldiphosphat, oder lnosin-5'-phosphat.
Das Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäß veränderten Enzyme ist dadurch ge- kennzeichnet, dass die Gene bzw. Allele deren feedback-lnhibierung aufgehoben oder ver-
mindert werden soll vektorkodiert, vorzugsweise plasmidkodiert vorliegen, und nicht chromosomal kodiert sind. Die Gene, bzw. Allele der Enzyme, die erfindungsgemäß verändert werden sollen sind insbesondere die, der Aminosäuresynthesewege leuA.ilvN, ilvB.ilvl, ilvH, argA.trpD, trpE, asnA, asnB.pyrB, pyrl, lysC, metL, thrA, hisG, carA, carB, tyrA, pheA, cysK, cysM, serA, aroG, dapA, gdh, gltB, gltD, glnA, proB, metE, metX, metA.metL, gnd, zwf, thrA, metH, prs, pheA, tyrA, proC, prs, cysE, ilvA, tyrB, bevorzugt lysC, hisG, argB, cysE und leuA. Diese Gene werden in vitro nach bekannten Verfahren mutagenisiert. Die Nukleotidsequen- zen dieser Gene und die kodierten Polypeptidsequenzen von C. glutamicum sind beschrieben in EP-A-1108790 und auch hinterlegt im National Center for Biotechnology Information (prs) database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) unter den Zugangsnummern NC_003450.2 und BX927148.1 bis BX927157.1. Die Nukleotidsequenzen dieser Gene und die kodierten Polypeptidsequenzen von E. coli sind durch Blattner et al. beschrieben (Science 277: 1453-1462 (1997)) und hinterlegt im National Center for Biotechnology Information (NCBI) database of the National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) unter den Zugangsnummer NC_000913.2. Die Peptide deren feedback-lnhibierung erfindungsgemäß zu verringern oder auszuschalten ist schließen auch jene ein, die mindestens 90 bis 95%, insbesondere 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% identisch mit den Polypeptiden der Enzyme LeuA, llvN, llvB, IM, IlvH, ArgA, TrpD, TrpE, AsnA, AsnB, PyrB, Pyrl, LysC, MetL, ThrA, HisG, CarA, CarB, TyrA, PheA, CysK, CysM, SerA, AroG, DapA, Gdh, GltB, Gnd, Zwf, OpcA, GltD, GlnA, ProB, MetE, MetX, MetA, MetL, Gnd, Zwf, ThrA, MetH, Prs, PheA, TyrA, ProC, Prs, CysE, IlvA, TyrB, bevorzugt LysC, HisG, ArgB, CysE, und LeuA sind. Diese Erfindung bezieht sich auch auf die Nukleotidsequenzen ilvN, ilvB.ilvl, ilvH, argA, trpD, trpE, asnA, asnB, pyrB, pyrl, lysC, metL, thrA, hisG, carA, carB, tyrA, pheA, cysK, cysM, serA, aroG, dapA, gdh, gltB, gltD, glnA, proB, metE, metX, metA, metL, gnd, zwf, thrA, metH, prs, pheA, tyrA, proC, prs, cysE, ilvA, tyrB, bevorzugt lysC, hisG, argB, cysE und leuA, und solche Sequenzen, die mindestens 70%, vorzugsweise 80%, mehr bevorzugt 85% (in Bezug auf die Nukleinsäuresequenz) bzw. 90%, bevorzugt größer als 91 %, 92%, 93% oder 94%, mehr bevorzugt größer als 95% oder 96% und besonders bevorzugt größer als 97%, 98% oder 99% Homologie zu einer dieser Sequenzen aufweisen, so- fern die Wirkungsweise bzw. Funktion und Zweck einer solchen Sequenz erhalten bleibt oder identisch dazu ist.
Zur Einführung der ortsunspezifischen Mutationen in die plasmidkodierten Gene der Enzyme wird bevorzugt eine in vitro Mutagenese unter Zuhilfenahme einer fehlerhaften Polymerase- kettenreaktion (PCR) und einer Amplifikationstechnik durchgeführt. Dabei wird das zu mutie- rende Gen einer PCR unter Verwendung einer Polymerase unterzogen, die abhängig von den Bedingungen der Reaktion einzelne Nucleotide gegenüber der Wildform falsch in die synthetisierten Gene einbaut (Tindali, K.R. and T.A. Kunkel, Fidelity of DNA synthesis by the
Thermus aquaticus DNA Polymerase. Biochemistry, 1988. 27(16): p. 6008-13). Eine häufige Variante dieser Methode beinhaltet die Verwendung von Mangan(ll)-lonen oder von Nukleo- tidanaloga im PCR Ansatz (Cadwell R. C et al. (1992) PCR Methods Appl. 2:28-33./Leung D. W. et al. (1989) Techniques 1 :11-15). Diese Techniken zur Mutationseinführung werden als "Error-Prone-PCR (epPCR)" bezeichnet (Labrou NE. Random mutagenesis methods for in vitro directed enzyme evolution. Curr Protein Pept Sei. 2010;11 :91-100). Die Mutationen können beispielsweise Punktmutationen sein, es können z.B. Substitutionen, Deletionen oder Insertionen durch die Polymerase erzeugt werden. Die Mutationsrate beträgt zwischen 1-40 Mutationen pro 1 kb, bevorzugt 1-5 Mutationen pro 1 kb.
Die Vektoren, vorzugsweise Plasmide die die erfindungsgemäß erhaltenen Mutationen in Genen der Enzyme enthalten werden anschließend durch Transformation in einen Mikro- roorganismus, wie beispielsweise E. coli, C. glutamicum oder Saccharomyces cerevisiae eingebracht. Der Begriff Transformation umfasst sämtliche Methoden zur Übertragung von Polynukleotiden, insbesondere DNA, in einen gewünschten Mikroorganismus. Hierzu gehö- ren unter anderem die Verwendung von isolierter DNA bei der Transformation, Elektrotrans- formation bzw. Elektroporation, die Übertragung durch Zellkontakt wie bei der Konjugation oder die Übertragung von DNA mittels Partikelbeschuss.
Im nachfolgenden Verfahrensschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens werden einzelne transformierte Zellen in der Zellsuspension mit erhöhter intrazellulärer Konzentration von Metaboliten gegenüber der Wildform des durch den Metabolitsensor detektierbaren Metaboliten durch Nachweis der intrazellulären Fluoreszenz identifiziert. Dazu wird die Zellsuspension elektromagnetischer Strahlung in derjenigen Frequenz ausgesetzt, welche das Autofluoreszenzprotein des Metabolitsensors zur Emission von Licht anregt. Als Autofluoreszenzprotein bevorzugt sind Proteine, die aus Gensequenzen abgelesen werden, welche für fluores- zierende Proteine beispielsweise der Gattung Aequora, wie das Green Fluorescent Protein (GFP), und Varianten davon, die in einem anderen Wellenlängenbereich fluoreszieren (z.B. Yellow Fluorescent Protein, YFP; Blue Fluorescent Protein, BFP; Cyan Fluorescent Protein, CFP) oder deren Fluoreszenz verstärkt ist (enhanced GFP oder EGFP, beziehungsweise EYFP, EBFP oder ECFP), kodieren. Ferner können erfindungsgemäß auch Gensequenzen verwendet werden, welche für andere autofluoreszierende Proteine, z.B. DsRed, HcRed,
AsRed, AmCyan, ZsGreen, AcGFP, ZsYellow, wie sie von BD Biosciences, Franclin Lakes, USA, bekannt sind, kodieren. Das besonders bevorzugte Autofluoreszenzprotein ist dabei EYFP bzw. das dafür kodierende Gen.
Gemäß einer besonderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt im Anschluss, vorzugsweise im unmittelbaren Anschluss an das Identifizieren der Zellen ein weiterer Verfahrensschritt, in dem die identifizierten Zellen aus der Zellsuspension abgetrennt werden, wobei dieses Abtrennen vorzugsweise mittels Durchflusszytometrie (FACS =
fluorescence activated cell sorting), ganz besonders bevorzugt mittels Hochdurchflusszyto- metrie (HT-FACS = high througput fluorescence activated cell sorting) erfolgt. Einzelheiten zur Analyse von Zellsuspensionen mittels Durchflusszytometrie können beispielsweise Sack U, Tarnok A, Rothe G (Hrsg): Zelluläre Diagnostik. Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der Durchflusszytometrie, Basel, Karger, 2007, Seiten 27 - 70 entnommen werden.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es daher möglich, in einer Zellsuspension in der Transformanten vorliegen, die eine Genbank plasmidkodierter Enzyme enthält, gezielt diejenigen Zellen zu isolieren, in denen feedback-resistente Enzyme zu einer gesteigerten intrazellularen Konzentration eines bestimmten Metaboliten führt.
Gegenstand der Erfindung ist die Nutzung solcherart gewonnener feedback-resistenter Enzyme oder in ihrer feedback-Sensitivität geminderter Enzyme und der für sie kodierenden Gene zur Verbesserung der Leistungseigenschaft von Mikroorganismen. Dies geschieht indem die durch das Verfahren gewonnen Vektoren, für die hier beispielhaft aber nicht ein- schränkend im Folgenden Plasmide angeführt werden, die für feedback-resistente Enzyme oder in ihrer feedback-Sensitivität geminderte Enzyme, kodieren, unmittelbar in den Mikroorganismus eingebracht werden. Dazu werden die Plasmide nach bekannten Verfahren isoliert und der zu verbessernde Mikroorganismus wird mit diesen Plasmiden transformiert. Der Begriff Transformation umfasst sämtliche Methoden zur Übertragung von Polynukleotiden, insbesondere DNA, in ein gewünschtes Bakterium. Hierzu gehören unter anderem die Verwendung von isolierter DNA bei der Transformation, Elektrotransformation bzw. Elektropora- tion, die Übertragung durch Zellkontakt wie bei der Konjugation oder die Übertragung von DNA mittels Partikelbeschuss.
In einer weiteren Ausführungsform werden die durch das Verfahren gewonnenen Gene, die für feedback-resistente Enzyme oder in ihrer feedback-Sensitivität geminderte Enzyme, kodieren, zunächst in andere Plasmide eingebracht, die beispielsweise bereits zusätzliche Gene enthalten die bereits die Leistungseigenschaft des Mikroorganismus verbessern, oder die auch einen Replikationsursprung enthalten der die Replikation des Plasmids in dem zu verbessernden Mikroorganismus ermöglicht. Solche Plasmide sind dem Fachmann bekannt, wie beispielsweise in Enterobacteriaceae replizierbare Plasmidvektoren, wie z.B. von pA-
CYC184 abgeleitete Kloniervektoren ( Bartolome et al.; Gene 102: 75-78 (1991 )), pTrc99A ( Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)) oder pSC101 -Derivate ( Vocke und Bastia; Procee- dings of the National Academy of Sciences USA 80(21 ): 6557-6561 (1983)) oder auch Plasmide die in Corynebacterien und verwandten Organismen replizieren und im Handbook of Corynebacterium glutamicum (eds. Eggeling and Bott), in Kapitel 23 Seiten 535-66 angeführt sind oder in der EP 1097998 B1 oder auch die kommerziell erhätlichen Plasmide für Bacillus
Stämme von MoBiTech GmbH, Lotzestrasse 22a, 37083 Goettingen oder auch die für Lac- tobacillus beschriebenen (Wang TT, Lee BH, 1997, Crit Rev Biotechnol. Plasmids in Lacto- bacillus. 17(3):227-72) oder kommerziell erhältlichen Plasmide (MoBiTech GmbH, Lotzestrasse 22a, 37083 Goettingen). In einer weiteren Ausführungsform werden die durch das Verfahren gewonnenen Gene, die für feedback-resistente Enzyme oder in ihrer feedback-Sensitivität geminderte Enzyme, kodieren in das Genom des zu verbessernden Mikroorganismus eingebracht. Dies ist beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) oder in der WO03/040373 beschrieben. Bei dieser Methode wird das Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in dem Wirt dessen Leistungseigenschaften verbessert werden sollen nicht replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 ( Simon et al., Bio/Technology 1 , 784-791 (1983)), pK18mob oder pK19mob ( Schäfer et al., Gene 145, 69- 73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wl, USA), pCR2.1-TOPO ( Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534- 541 (1993)), pEM1 ( Schrumpf et al, 1991 , Journal of Bacteriology 173:4510-4516) oder pBGS8 ( Spratt et al.,1986, Gene 41 : 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor der das für das feedback-resistente Enzym oder in ihrer feedback-Sensitivität geminderte Enzym kodiert, sowie gegebenfalls einschließlich die Expressions- und/oder Regulationssignale, und die Randbereiche des Gens, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm dessen Leistungseigenschaft verbessert werden soll überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiology Letters 123, 343-347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines "cross over"-Ereignisses enthält der resultierende Stamm eine Kopie des heterologen Gens einschließlich des Plasmidvektors an dem gewünschten Genort des Chromosoms von beispielsweise Corynebakterium glutamicum oder E. coli, der über die homologen Nukleotid- Sequenzen auf dem Plasmid vorbestimmt war. Mittels eines geeigneten zweiten, eine Excisi- on bewirkenden "cross-over"-Ereignisses im Zielgen bzw. in der Zielsequenz erreicht man den Einbau nur des Gens des feedback-resistenten oder in seiner feedback-Sensitivität geminderten Enzyms.
Gegenstand der Erfindung sind in ihrer feedback-lnihbierung geminderte oder ausgeschalte- te Enzyme und die dafür kodierenden Gene, die zu einer gesteigerten intrazellulären Konzentration eines bestimmten Metaboliten, insbesondere Aminosäuren wie L-Valin, L-Leucin, L-Asparagin, L-Lysin, L-Methionin, L-Threonin, L-Isoleucin, L-Histidin, L-Glutamat, L-
Glutamin, Prolin, L-Arginin, L-Tryptophan, L-Tyrosin, L-Phenylalanin, L-Serin und L-Cystein, führen. Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Enzyme der L-Lysinsynthese und ganz besonders auch feedback-resistente Aspartatkinasen die zu L-Lysin führen. Ebenso sind Gegenstand der Erfindung in ihrer feedback-lnihbierung geminderte oder ausgeschaltete Enzyme und die dafür kodierenden Gene die zu einer gesteigerten Konzentration von Inter- mediaten der Aminosäure- oder Nukleotidsynthese führen, wie beispielsweise O-Acetylserin, O-Acetylhomoserin, Cystathionin, Orotidine-5'-Phosphat, 5-Phosphoribosyldiphosphat oder lnosin-5'-phosphat. So können beispielhaft Mutationen in dem Aspartatkinasegen lysC in den Nukleotidpositio- nen 60, 61 , 233, 556 und 982 so wie in SEQ. ID. NO. 9 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen 20, 21 , 78, 186, 328 so wie in SEQ. ID. NO. 10 angegeben oder in den Nukleotid- positionen 60, 61 , 932, 1196, so wie in SEQ. ID. NO. 11 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 20,21 ,311 ,399 so wie in SEQ. ID. NO. 12 angegeben oder in der Nukleotidposition 61 , so wie in SEQ. ID. NO. 13 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 21 so wie in SEQ. ID. NO. 14 angegeben oder in den Nukleotidposi- tionen 61 , 833, 839, so wie in SEQ. ID. NO. 15 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 21 , 278, 280 so wie in SEQ. ID. NO. 16 angegeben oder in den Nukleotid- positionen 61 , 833, 839, 1172 so wie in SEQ. ID. NO. 33 angegeben, mit den Aminosäure- austauschen in den Positionen 21 , 278, 280, 391 so wie in SEQ. ID. NO. 34 angegeben oder in den Nukleotidpositionen 61 und 932, so wie in SEQ. ID. NO. 17 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 21 und 311 so wie in SEQ. ID. NO. 18 angegeben oder in den Nukleotidpositionen 61 , 932, 1 196, so wie in SEQ. ID. NO. 19 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 21 , 311 , 399 so wie in SEQ. ID. NO. 20 angegeben oder in den Nukleotidpositionen 61 und 1094, so wie in SEQ. ID. NO. 21 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 21 und 365 so wie in SEQ. ID. NO. 22 angegeben oder in den Nukleotidpositionen 61 , 908 so wie in SEQ. ID. NO. 29 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 21 , 303 so wie in SEQ. ID. NO. 30 angegeben oder in den Nukleotidpositionen 715 so wie in SEQ. ID. NO. 31 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 239 so wie in SEQ. ID. NO. 32 angegeben oder in den Nukleotidpositionen 71 , 932, so wie in SEQ. ID. NO. 23 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 24, 311 so wie in SEQ. ID. NO. 24 angegeben oder in den Nukleotidpositionen 205, 370, 631 , 680, 703, 1049, 1120, so wie in SEQ. ID. NO. 25 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 69,124,211 ,
227,235,350,374 so wie in SEQ. ID. NO. 26 angegeben, der in den Nukleotidpositionen 476, 1010, 1021 , so wie in SEQ. ID. NO. 27 angegeben, mit den Aminosäureaustauschen in den Positionen 159, 337, 341 so wie in SEQ. ID. NO. 28 angegeben, erhalten werden.
Dabei kann auch jeweils nur einer der Nukleotid- und Aminosäureaustausche pro Allel und Enzym vorliegen oder auch mehrere, nämlich bis zu sieben, wie in SEQ. ID. NO. 25, beziehungsweise SEQ. ID. NO. 26 angegeben.
Disclaimer:
Gegenstand der Erfindung sind nicht Mutationen die aus dem nachstehend angeführten Stand der Technik bekannt sind, wie die Mutation lysC A279T die in der Anmeldung JP 1994062866-A (Sequenz 1 ) beschrieben ist oder auch lysC A279V aus JP 1994261766-A (Sequenz 3), lysC S301 F aus JP 1994261766-A (Sequenz 4), lysC T308I aus JP
1994261766-A (Sequenz 5), lysC G345D (Follettie und Sinskey, Datenbankeintrag L16848), lysC R320G, lysC G345D (Jetten et al., Datenbankeintrag L27125), lysC S301 F
(US3732144), lysC S381 F (EP0435132), lysC S317A (US5688671 (Sequenz 1 )) und auch lysC T380I (WO 01/49854).
Gegenstand der Erfindung sind auch andere Aminosäureaustausche in den durch Metabolit- sensoren identifizierten Positionen und in vergleichbaren Positionen der Enzyme. So beispielsweise in dem Aspartatkinase Enzym der SEQ. ID. NO. 28, wo in der Position 159 Val gegen Gly ausgetauscht ist, kann bevorzugt auch jede andere proteinogene Aminosäure vorhanden sein, wie Lys, Asn, Arg, Ser, Thr, lle, Met, Glu, Ala, Val, Gin, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys oder Phe. Bei dem gleichen Enzym ist in Position 337 Asn gegen Ser ausgetauscht und es kann auch jede andere proteinogene Aminosäure in dieser Position vorhanden sein, wie Lys, Asn, Arg, Thr, lle, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gin, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys oder Phe oder in Position 341 anstelle des Austausches Asp gegen Asn jede andere proteinogene Aminosäure wie Lys, Arg, Ser, Thr, lle, Met, Glu, Asp, Ala, Val, Gin, His, Pro, Leu, Tyr, Trp, Cys oder Phe.
Unter dem Ausdruck "vergleichbare Position" wird erfindungsgemäß eine Position verstanden, die durch Vergleich der Ausgangssequenz mit der Vergleichsequenz unter Anwendung eines Sequenz-Vergleichs-Programms (BLAST, Altschul et al. J. Mol. Biol. 1990, 215, 403- 410) bei der ins Auge gefassten Position der Ausgangssequenz eine Aminosäuren-Position in der Vergleichssequenz liefert, die sich von der zu vergleichenden Position um mehr als ±5, bevorzugt ±4, weiter bevorzugt ±3, noch weiter bevorzugt ±2, extrem bevorzugt ±1 und äußerst bevorzugt um keine Position unterscheidet.
Die Erfindung wird nun anhand nicht limitierender Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle gemäß der ersten Ausführungsform am Beispiel einer Zelle, bei der eine für ein Enzym kodierende Gensequenz mutiert und selektioniert wird, sodass feedback-resistente Enzyme und erfindungsgemäße Zellen mit feedback- resistenten Enzymen mit verbesserter Leistungseigenschaft erhalten werden, wobei das Enzym Aspartatkinase ist.
a) Konstruktion des Vektors pUC18-lysC und error prone PCR des Aspatatkinasegens lysC
Mit den Primerpaaren rspl (SEQ. ID. NO. 1 ) und univ (SEQ. ID. NO. 2) sowie chromosomaler DNA des Wildtyps von C. glutamicum ATCC 13032 als Template wurde das Gen lysC, das für das Enzym Aspartatkinase kodiert amplifiziert.
(SEQ. ID. NO. 1 ):
GATGGATCCGTGGCCCTGGTCGTACAGAAATATGG
(SEQ. ID. NO. 2): GATGTCGACTTAGCGTCCGGTGCCTGCATAAACG Die chromosomale DNA von C. glutamicum wurde wie bei Tauch et al. beschrieben isoliert (Tauch et al., 1995, Plasmid 33:168-179). Das Amplifikat wurde mit BamHI und Sali behandelt, und mit ebenso behandeltem pUC18 ligiert, und es wurde pUC18-lysC erhalten.
In der error prone PCR zur Einführung der Mutationen wurden 10 ng pUC18-lysC als
Template pro Reaktion eingesetzt, sowie 0,1 - 0,8mM Mn2+, wobei bei der niedrigeren Konzentration von unter < 0,2mM Mn2+ mit Mg2+, eine Gesamtkonzentration von mindestens 0,2mM eingestellt wurde. Pro Reaktion wurden x μΙ Taq Polymerase von Fermentas (Katalog Nr.: EP0401 ) zugesetzt. Als primer wurden die Polynukleotide
(SEQ. ID. NO. 3): C AC AG G AAACAG CT AT G AC C ATG
(SEQ. ID. NO. 4): CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
benutzt. Die Reaktionen wurden 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Reaktions- produkte mit BamHI und Sali behandelt und mit dem ebenso behandelten Vektor pSen- LysTK(b)-lysC ligiert. Mit den Ligationsprodukten wurde E. coli DH5amcr transformiert (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649). Zur Konstruktion des Vektors pSenLysTK(b)-lysC wurde mit den Primerpaaren LysC- PSLTKC-fw (SEQ.ID.NO. 5) und LysC-PSLTKC-rv (SEQ.ID.NO.6) sowie chromosomaler DNA des Wildtyps von C. glutamicum ATCC 13032 als Template das Gen lysC mit den vorangehenden 520bp amplifiziert. Das Amplifikat wurde mit Xhol und Sali geschnitten und in Sali geschnittenen pSenLysTK (WO201 1138006) ligiert.
(SEQ.ID.NO. 5):
GCCCTCGAGAAAACAAAAGGCTCAGTCGGAAGACTGGGCCTTTTGTTTTGGTACCAGC GGCAGCGTGAACATC
(SEQ.ID.NO. 6):
GCCGTCGACACGGAATTCAATCTTACGGCCTGCGGAACG
Die mit den Ligationsprodukten transformierten E. coli DH5amcr Zellen wurden auf LB Agarplatten (Lennox, 1955, Virology, 1 :190) ausplattiert, der 40 mg pro Liter Kanamycin enthielt. b) Präparation der lysC Genbank und Transformation von Corynebacterium glutamicum
Nach Übernacht Inkubation der mit den Ligationsprodukten transformierten E. coli DH5amcr Zellen wurden LB Agarplatten mit 1 ml 0.9% NaCI abgeschwemmt und die Plasmid DNA nach gängigen Methoden präpariert (Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). Mit dieser Plasmid DNA Präparation wurden elektrokompetente Zellen von C. glutamicum ATCC 13032 transformiert, so wie es bei Kirchner, O. und Tauch, A. beschrieben ist (J Biotechnol. 2003 Sep 4;104(1-3):287-99). Die transformierten Zellen wurden für 2 Stunden regeneriert, dann wurde 25 mg pro Liter Kanamycin zugesetzt und 1 :10 Verdünnungen dieser Suspension in CGXII Medium 15 Stunden inkubiert. Das CGXII Medium ist bei Keilhauer et al. in J Bacteri- ol. 1993 Sep;175(17):5595-603 beschrieben.
c) Selektion von lysC Muteinen
Zur Identifizierung und Abtrennung der Zellen mit mutierten Aspartatkinasen wurde die Zellsuspension in CGXII Medium auf eine optische Dichte unter 0.1 eingestellt und unmittelbar dem FACS A IA II high-speed cell sorter (Becton Dickinson GmbH, Tullastr. 8-12, 69126 Heidelberg) zugeführt. Die Analyse erfolgte mit den Anregungswellenlängen von 488 und 633 nm und die Detektion bei den Emissionswellenlängen von 530 ± 15 nm und 660 ± 10 nm bei einem Probedruck von 70 psi. Die Daten wurden mit der zum Gerät gehörenden Software Version BD DIVA 6.1.3 analysiert. Die Mantelflüssigkeit wurde BD FACSflow verwendet. Das elektronische gating wurde anhand des forward und backward scatters eingestellt um nicht bakterielle Partikel auszuschließen. Um EYFP-positive Zellen zu sortieren wurde die nächste Stufe des elektronischen gatings gewählt um nicht-fluoreszierende Zellen auszuschließen. Fluoreszierende Zellen wurden auf Petrischalen die brain heart infusion Agar (Difco) enthielten aussortiert.
Beispiel 2
Herstellung einer erfindungsgemäßen Zelle mit feedback-resistenten Enzymen mit verbesserter Leistungseigenschaft, wobei das Enzym Aspartatkinase ist und neue Aspartatkinase- sequenzen.
a) Lysinbildung durch isolierte Zellen mit mutierter Aspartatkinase als Enzym.
EYFP-positive, auf Petrischalen aussortierte Einzelzellen wurden in 0,75 ml CGXII Medium in Mikrotiterplatten des Typs Flowerplate angeimpft. Die Flowerplates wurden von m2p-labs GmbH (Aachen) bezogen und in einemMicrotron high-capacity microplate incubator (Infors AG) mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 990 rpm und einem Schüttelradius von 3 mm über Nacht inkubiert. Anschließend wurde in ein neues CGXII Medium in Mikrotiterplatten des
Typs Flowerplate angeimpft und nach 48 Stunden Proben zur Lysinbestimmung entnommen.
Die Lysinbestimmung erfolgte als o-Phthdialdehyd Derivat mittels Hochdruckflüssigchroma- tografie mit einem uHPLC 1290 Infinity System (Agilent) auf einer Zorbax Eclipse AAA C18 3.5 micron 4.6 x 75 mm Revered Phase Säule und einem Fluoreszenzdetektor. Als Eluenz wurde ein Gradient aus 0.01 M Na-Borat pH 8.2 mit steigender Methanolkonzentration benutzt und Detektion der fluoreszierenden Isoindolderivate erfolgte bei einer Anregungswellenlänge von 230 nm und einer Emissionswellenlänge von 450 nm. Es wurden die in Tabelle 2 gezeigten L-Lysinwerte bestimmt, die gegenüber dem Ausgangsstamm eine Verbesserung der L-Lysinbildung zeigen.
Tabelle 2: Stämme bei der die für die Aspartatkinase kodierende Gensequenz auf einem Plasmid mutiert wurde und die mittels Metabolitsensor auf verbesserte Leistungseigenschaft selektioniert wurden und vermehrt L-Lysin ausscheiden.
Stamm L-Lysin
(mM)
Ausgangsstamm ATCC13032 0,2
Stamm lysC-ls42 21 ,1
Stamm lysC-ss77 44,9
Stamm lysC-ss12 20,0
Stamm lysC-ls90 39,0
Stamm lysC-ls2 24,9
Stamm lysC-ss92 44,3
Stamm lysC-ls15 27,1
Stamm lysC-ls57 29,5
Stamm lysC-ss91 14,0
Stamm lysC-ls1 19,7
Stamm lysC-ls8 23,0
Stamm lysC-ss63 32,5
Stamm lysC-ls56 30,9
b) Bestimmung der Sequenzen der Aspartkinasen
Von den in Tabelle 2 gezeigten Stämmen wurde eine Kolonie PCR durchgeführt, so wie es bei Lee and Cooper beschrieben ist (Improved screen for bacterial colonies, Biotechniques 18(2):225-226). Dazu wurden die folgenden zwei Primer benutzt:
(SEQ.ID.NO. 7): TGAGACGCATCCGCTAAAGCC
(SEQ.ID.NO. 8): ATCTTACGGCCTGCGGAACGTG
Die Amplifikate wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit von Qiagen (Katalognummer 28104) aufgereinigt und durch das Unternehmen GATC sequenziert. Die erhaltenen DNA- Sequenzen wurden dann mit den bekannten Algorithmen bzw. dem Sequenzanalyse- Programm GCG von Butler ( Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)), dem FASTA-Algorithmus von Pearson und Lipman (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, 2444-2448 (1988)) oder dem BLAST-Algorithmus von Altschul et al. (Natura Genetics 6, 119-129 (1994)) untersucht und mit den in öffentlich zugänglichen Daten- banken (EMBL, Heidelberg, Deutschland; NCBI, Bethesda, MD, USA) vorhandenen Sequenzeinträgen verglichen.
Die Sequenzidentitätsnummern (SEQ.ID.NO.) der lysC Allele aus den jeweiligen in Tabelle 2 genannten Stämmen die die Plasmide mit dem lysC-Allelen in pSenLysTK(b) enthalten sind in Tabelle 3 angegeben. Zusätzlich sind dort auch die Sequenzidentitätsnummern
(SEQ.ID.NO.) der Aspartatkinase Polypeptidsequenzen mit angegeben. Ferner sind die Nukleotidaustausche der lysC Allele mit Angabe der Position in der Polynukleotidsequenz mit angeführt, sowie die Aminosäureaustausche der LysC Polypeptide mit Angabe der Position in der Polypeptidsequenz.
Tabelle 3: Nukleotidsequenzen und Polypeptidsequenzen des Enzyms Aspartatkinase welche zu verbesserten Leistungseigenschaften führen.
Allel Nukleoti- Polypeptid Aminosäureaus- daustausch(e) tausch(e)
SEQ. ID. lysC-ls42 a60c,a61g,a233g, SEQ. ID. LysC-ls42 R20S,N21 D,N78S, NO. 9 a556g,a982g NO. 10 I186V,K328E
SEQ. ID. lysC- a60c,a61g,c932t, SEQ. ID. LysC-ss77 R20S,N21 D,T311 I, NO. 11 ss77 gl 196t NO. 12 R399L
SEQ. ID. lysC- a61g SEQ. ID. LysC-ss12 N21 D
NO. 13 ss12 NO. 14
SEQ. ID. lysC-ls90 a61g,a833g,c839t SEQ. ID. LysC -Is90 N21 D, E278G, NO. 15 NO. 16 A280V
SEQ. ID. lysC- a61g,c932t SEQ. ID. LysC - N21 D.T311 I NO. 17 ss92 NO. 18 ss92
SEQ. ID. lysC-ls15 a61g,c932t, gl 196t SEQ. ID. LysC -Is15 N21 D.T311 I, NO. 19 NO. 20 R399L
SEQ. ID. lysC-ls57 a61g,t1094a SEQ. ID. LysC -Is57 N21 D, M365K NO. 21 NO. 22
SEQ. ID. lysC-ls8 a71g,c932t SEQ. ID. LysC -Is8 E24G, T311 I NO. 23 NO. 24
SEQ. ID. lysC- c205t,g370c,a631g, SEQ. ID. LysC - L69F,124P,211V, NO. 25 ss63 t680c,a703g,t1049c, NO. 26 ss63 L227P, 235D, a1 120g 350A.374D
SEQ. ID. lysC-ls56 t476g,a1010g, SEQ. ID. LysC -Is56 V159E, N337S, NO. 27 g1021 a NO. 28 D341 N
SEQ. ID. lysC- a61g,t908c SEQ. ID. LysC - N21 D.V303A NO. 29 ss91 NO. 30 ss91
SEQ. ID. lysC-ls1 a715g SEQ. ID. LysC -Is1 T239A
NO. 31 NO. 32
SEQ. ID. lysC-ls2 a61g,a833g,c839t, SEQ. ID. LysC -Is2 N21 D.E278G, NO. 33 a1172g NO. 34 A280V, E391G