WO2014024989A1

WO2014024989A1 - クマルアミドの製造方法

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Publication number: WO2014024989A1
Application number: PCT/JP2013/071544
Authority: WO
Inventors: 淳平岸本; 淳南野; 栗原　宏征; 山田　勝成
Original assignee: 東レ株式会社
Priority date: 2012-08-10
Filing date: 2013-08-08
Publication date: 2014-02-13
Also published as: CA2880972A1; US20150218087A1; CA2880972C; US9527802B2; BR112015002466B1; JPWO2014024989A1; BR112015002466A2

Abstract

　セルロース系バイオマスをアンモニアを含む処理剤で処理して得られるクマルアミドの回収方法を確立することを課題とする。本発明のクマルアミドの製造方法は、セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤で処理してアンモニア処理バイオマスを得る前処理工程と、前記アンモニア処理バイオマスを、少なくとも水を含む溶媒に浸漬して、前記アンモニア処理バイオマス中のクマルアミドを前記溶媒中に溶出せしめ、クマルアミド溶液を得る抽出工程と、前記クマルアミド溶液中のクマルアミドを結晶として析出させ、クマルアミド結晶を得る晶析工程と、を含むことを特徴とする。

Description

クマルアミドの製造方法

　本発明は、セルロース系バイオマスからクマルアミドを製造するクマルアミドの製造方法に関する。

　糖を原料とした化学品の発酵生産プロセスは、種々の工業原料生産に利用されている。現在、発酵原料となる糖としては、例えば、さとうきび、澱粉、テンサイなどの食用原料に由来するものが工業的に使用されている。しかしながら、今後は世界人口の増加により食用原料が不足し、価格が高騰することが懸念され、再生可能な非食用資源、すなわちセルロース系バイオマスから効率的に糖液を製造するプロセスの構築が課題となっている。

　セルロース系バイオマスは、主に芳香族系重合物のリグニンと、単糖の重合物であるセルロースやヘミセルロースを含む。セルロース系バイオマスを原料とした糖液の製造方法として、例えば、濃硫酸などを用いて直接原料であるセルロース系バイオマスを加水分解する方法や、セルロース系バイオマスに予め蒸煮処理、微粉砕処理、希硫酸処理などの前処理を施してセルロースやヘミセルロースをリグニンから脱離した後、セルラーゼ等の糖化酵素により加水分解を行う前処理－酵素糖化法等がある。

　前処理－酵素糖化法は、一般に、直接原料を加水分解する方法と比べて環境負荷が小さいという利点を有する一方、糖の収率は低い。そこで、環境負荷が小さく、かつ高い糖収率が得られる前処理方法として、アンモニアを含む処理剤を用いた前処理方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

特開２００８－１６１１２５号公報

　しかしながら、前述のアンモニアを含む処理剤を用いた前処理方法によりセルロース系バイオマスの酵素糖化効率が向上することが知られている一方で、アンモニアを含む処理剤を用いた前処理方法によりセルロース系バイオマス中で起こる化学反応や、その結果として生じる特有の化合物について十分な検討はなされていなかった。

　本発明ではかかる状況を鑑み、アンモニアを含む処理剤で処理して得られるセルロース系バイオマス由来の物質を同定し、その回収方法について確立することを課題とする。

　上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明者らは、セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤で処理したアンモニア処理バイオマス中の化合物について鋭意検討を行った。その結果、アンモニアを含む処理剤で前処理したアンモニア処理バイオマスには、セルロース系バイオマス由来の化合物としてクマルアミドが含まれることを見いだすとともに、アンモニア処理バイオマスから高純度のクマルアミドを抽出する方法を見いだし、本発明を完成した。

　すなわち、本発明は以下の［１］～［１０］の構成を有する。
［１］　セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤で処理してアンモニア処理バイオマスを得る前処理工程と、
　前記アンモニア処理バイオマスを、少なくとも水を含む溶媒に浸漬して、前記アンモニア処理バイオマス中のクマルアミドを前記溶媒中に溶出せしめ、クマルアミド溶液を得る抽出工程と、
　前記クマルアミド溶液中のクマルアミドを結晶として析出させ、クマルアミド結晶を得る晶析工程と、を含むことを特徴とする、クマルアミドの製造方法。
［２］　前記晶析工程で回収されるクマルアミド結晶は、純度９０％以上であることを特徴とする、［１］に記載のクマルアミドの製造方法。
［３］　前記抽出工程で使用する前記溶媒の温度は、４０℃以上であることを特徴とする、［１］または［２］に記載のクマルアミドの製造方法。
［４］　前記抽出工程で使用する溶媒は、少なくとも１種の極性有機溶媒を含むことを特徴とする、［１］～［３］のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。
［５］　前記溶媒は、前記極性有機溶媒として少なくともエタノールを含むことを特徴とする、［４］に記載の糖液の製造方法。
［６］　前記晶析工程は、前記クマルアミド溶液から結晶を析出させる前に、前記クマルアミド溶液を逆浸透膜に通じて濾過し、非透過液としてクマルアミド濃縮液を回収する濃縮工程を含むことを特徴とする、［１］～［５］のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。
［７］　前記逆浸透膜に通じて濾過するクマルアミド溶液の液温が２０℃以上であることを特徴とする、［６］に記載のクマルアミドの製造方法。
［８］　前記晶析工程は、前記クマルアミド溶液を１５℃以下に冷却してクマルアミドの結晶を析出させることを特徴とする、［１］～［７］のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。
［９］　前記抽出工程は、前記アンモニア処理バイオマスを溶媒に浸漬する際、糖化酵素を添加することによりアンモニア処理バイオマスの加水分解を行うことを特徴とする、［１］～［８］のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。
［１０］前記晶析工程は、前記クマルアミド溶液から結晶を析出させる前に、前記クマルアミド溶液をナノろ過膜に通じて濾過し、透過液としてクマルアミド精製液を回収する精製工程を含むことを特徴とする、［１］～［９］のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。

　本発明によれば、セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤で処理したアンモニア処理バイオマスより、高純度のクマルアミドを得ることができる。

図１は、発明に係るクマルアミドの製造方法の一例を示すフローチャートである。図２は、アンモニア処理バイオマス抽出液中の芳香族化合物をＨＰＬＣにて分析した結果を示す図である。図３は、アンモニア処理バイオマス抽出液のピーク１のＵＶ吸収スペクトルを示す図である。図４は、クマルアミド標品のＵＶ吸収スペクトルを示す図である。図５は、アンモニア処理バイオマス抽出液のピーク２のＵＶ吸収スペクトルを示す図である。図６は、フェルラアミド標品のＵＶ吸収スペクトルを示す図である。図７は、糖化反応中の反応液上清に含まれるクマルアミド濃度の経時変化を示す図である。図８は、抽出工程における懸濁液上清に含まれるクマルアミドの濃度の経時変化を示す図である。図９は、さまざまな温度における逆浸透膜によるクマルアミドの濃縮の際の操作圧の経時変化を示す図である。

　以下、本発明について図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、下記の発明を実施するための形態により本発明が限定されるものではない。

　本発明に係るクマルアミドの製造方法について、図面を参照して説明する。図１は、本発明に係るクマルアミドの製造方法の一例を示すフローチャートである。図１に示すように、本発明に係るクマルアミドの製造方法は、以下の工程を含む。
（１）セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤で処理して、アンモニア処理バイオマスを得る前処理工程（ステップＳ１）
（２）前記アンモニア処理バイオマスを、少なくとも水を含む溶媒に浸漬して、前記アンモニア処理バイオマス中のクマルアミドを前記溶媒中に溶出せしめ、クマルアミド溶液を得る抽出工程（ステップＳ２）
（３）前記クマルアミド溶液中のクマルアミドを結晶として析出させ、クマルアミド結晶を得る晶析工程（ステップＳ３）

　以下、本発明を実施するための形態について工程順に説明する。
（１）前処理工程
　まず、本発明の前処理工程では、セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤で処理し、アンモニア処理バイオマスを得る。本明細書において、セルロース系バイオマスとは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー（トウモロコシの茎葉）、コーンコブ（トウモロコシの芯）、ビートパルプ、綿実殻、パーム空果房、稲わら、麦わら、竹、笹などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナ、ポプラなどの樹木、廃建材などのことである。

　一般に、セルロース含有バイオマスの前処理方法としては、蒸煮処理、微粉砕処理、爆砕処理、硫酸などの酸性溶液による酸処理、水酸化ナトリウムなどアルカリ溶液によるアルカリ処理、アンモニア（ＮＨ_３）による処理、酵素処理、アミノ基（ＮＨ_２）を含む化合物による処理などが挙げられる。これらの前処理方法の中でも、本発明の前処理工程においては、アンモニアを含む処理剤を用いてセルロース系バイオマスを前処理する。従来からセルロース系バイオマスの前処理によってクマル酸が生じることは知られていたが、セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤を用いて前処理した場合、クマルアミドが生じることは確認されていなかった。アンモニアを含む処理剤による前処理により、セルロース含有バイオマス由来のクマル酸がアンモニアによってアミド化され、クマルアミドを生じると考えられる。

　本発明の前処理工程において使用するアンモニアを含む処理剤としては、アンモニア以外に、アミノ基を含む化合物を使用することができ、アンモニアやアミノ基を含む化合物とその他の化合物を複数組み合わせて使用してもよい。アミノ基を含む化合物としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ヒドラジン、エチレンジアミン、プロパンジアミン、ブタンジアミンなどが挙げられる。その他の化合物としては、例えば、二酸化炭素、窒素、エチレン、メタン、エタン、プロパン、エタン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、トルエン、ベンゼン、フェノール、ジオキサン、キシレン、アセトン、クロロホルム、四塩化炭素、エタノール、メタノール、プロパノール、ブタノールなどが挙げられる。

　本発明において、アンモニアを含む処理剤は、液体、気体、気液混合相のいずれであってもよい。液体、気体、気液混合相のいずれの状態のアンモニアを用いた場合でも酵素糖化効率に優れたセルロース系バイオマスを得ることができる。また、アンモニアを含む処理剤は、超臨界アンモニア流体又は亜臨界アンモニア流体でもよい。超臨界アンモニア流体を用いて処理する方法としては、特に制限はなく、例えば、セルロース系バイオマスとアンモニアとを、オートクレーブ等の反応器内に導入し、反応器内を加熱加圧して、アンモニアを超臨界状態にすることにより行うことができる。

　本発明においては、収穫したセルロース系バイオマスはそのまま前処理工程に使用してもよいが、セルロース系バイオマスを予め裁断、粉砕等して、平均粒子径が所定の大きさ以下のセルロース系バイオマスの粒子としてから前処理工程に使用してもよい。セルロース系バイオマスの粒子径を予め小さくしておくことで、取り扱いが容易となると共に、アンモニアを含む処理剤による処理の効率の向上を図ることができる。

　セルロース系バイオマスの粒子の粒子径としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、５ｍｍ径以下が好ましく、１ｍｍ径以下がより好ましく、０．１ｍｍ径以下が更に好ましい。セルロース系バイオマスの粒子の粒子径が、５ｍｍ径を超えると、後述の抽出工程においてクマルアミドの水への溶出が不十分となることがある。セルロース系バイオマスの粒子の粒子径が上記範囲内の場合には、クマルアミドの水への溶出を十分にでき、またアンモニアを含む処理剤の使用量を少なくできる。

　本発明においては、収穫したセルロース系バイオマスをそのまま使用してアンモニアを含む処理剤を用いて前処理してもよいが、これに限定されるものではなく、前処理工程に用いるアンモニアを含む処理剤の回収を図る観点から、セルロース系バイオマスを乾燥してから前処理工程で使用するようにしてもよい。

　本発明の前処理方法として、セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤で処理する方法を用いているが、上述の他のセルロース系バイオマスの前処理方法を併用してもよい。

（２）クマルアミド抽出工程
　本発明の抽出工程では、前処理工程で得たアンモニア処理バイオマスを溶媒に浸漬し、アンモニア処理バイオマス中のクマルアミドを溶媒中に溶出せしめる。本発明の抽出工程では、アンモニア処理バイオマスからのクマルアミド抽出に使用する溶媒は、少なくとも水を含むことを特徴とする。溶媒として、水を含まない純粋なエタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒を使用した場合、クマルアミドはほとんど抽出されない。これは、セルロース系バイオマス由来のクマルアミドが、セロオリゴ糖、キシロオリゴ糖やペクチンなど水溶性の化合物で覆われており、これらの化合物が有機溶媒に不溶な為、クマルアミドが抽出されないものと考えられるが、その理由は明確ではない。クマルアミドの抽出に使用する水としては特に制限はないが、純水、水道水、工業用水、河川水、雨水などが好ましく使用される。また、本発明によりクマルアミドを回収した残液を、後述の逆浸透膜処理により再生した水も好ましく使用される。

　また、抽出工程で使用する溶媒は、水のほかに極性有機溶媒を含んでもよい。溶媒が、水に加えて極性有機溶媒を含むことにより、クマルアミドの抽出量を増大させる効果がある。極性有機溶媒としては、エタノール、アセトニトリル、メタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、エチレングリコール、アセトン、アクリロニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。溶媒は、上記の極性有機溶媒を１種類または２種類以上含んでいてもよいが、少なくともエタノールまたはアセトニトリルを含むことが好ましく、エタノールを含むことがより好ましい。クマルアミド抽出に使用する溶媒は、極性有機溶媒を１～５０体積％の割合で含むことが好ましい。溶媒中の極性有機溶媒の割合が、１体積％未満ではクマルアミド抽出量の増大効果が十分でない場合があり、また、５０体積％を超える場合、それ以上極性有機溶媒濃度を高めてもクマルアミド抽出量は増大しないばかりでなく、リグニンなどバイオマス中の水不溶性成分を抽出してしまい、クマルアミドの純度が低下してしまうことがあるためである。また、後述の晶析工程において、晶析に先立ち、クマルアミドを後述のナノろ過膜に通じて濾過してより精製する場合や、後述の逆浸透膜に通じて濾過してより濃縮する場合には、水中に含まれる極性有機溶媒濃度は１～１０体積%であることが好ましい。１０体積％以上の濃度では、ナノろ過膜や逆浸透膜が、極性有機溶媒によって損傷してしまうことがある。

　本発明の抽出工程において、アンモニア処理バイオマスを溶媒に浸漬する際には、糖化酵素を適宜添加することにより、アンモニア処理バイオマスを加水分解してもよい。アンモニア処理バイオマスを糖化酵素により加水分解しながら抽出を行なうことにより、バイオマス内部に存在するクマルアミドが抽出され、クマルアミドの収率を向上させることができる。

　本明細書において、糖化酵素（セルラーゼ）とは、セルロースおよび／またはヘミセルロース、特にキシランを分解する活性を有する酵素の総称であり、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼ、β－グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β－キシロシダーゼ、キシログルカナーゼなどを例示することができる。本発明において使用するセルラーゼとしては、一般的なセルラーゼを使用できるが、好ましくは、結晶性セルロースの分解活性を有するセロビオハイドロラーゼ、あるいはエンドグルカナーゼを含む糖化酵素であることが好ましい。こうした糖化酵素として、トリコデルマ属細菌由来の糖化酵素が好適である。トリコデルマ属細菌とは、糸状菌に分類される微生物であり、細胞外に、多種のセルラーゼを大量に分泌する微生物である。

　本発明の抽出工程において、アンモニア処理バイオマスの溶媒への浸漬方法は特に限定されず、攪拌混合を行う方法と、静置する方法などが挙げられるが、攪拌混合を行うほうがより効率よくクマルアミドを抽出することができるため、好ましい。また、特に前述のセルラーゼ添加によるバイオマス加水分解を行う場合は、攪拌混合を行うほうがバイオマス加水分解の効率が高められ、クマルアミドの抽出効率はより高められるため、好ましい。

　本発明の抽出工程において、アンモニア処理バイオマスの溶媒への浸漬時間は特に限定されないが、1分から６０分が好ましい。1分未満ではクマルアミドの抽出が十分ではない場合があり、６０分を超える場合はそれ以上時間をかけてもクマルアミドの抽出の効率は上がらないためである。ただし、抽出工程において、前述の糖化酵素添加によるバイオマス加水分解を行う場合は、時間と共にアンモニア処理バイオマス中のセルロースやヘミセルロースが分解され、より多くのクマルアミドが液中に溶出する。したがって、この場合の浸漬時間は、２時間～２４時間とし、十分にアンモニア処理バイオマスを加水分解させることが好ましい。

　本発明の抽出工程において、アンモニア処理バイオマスを溶媒に浸漬し、クマルアミドを抽出する際の温度としては特に制限はないが、４０～８０℃が好ましい。４０℃以上においてクマルアミドが格段に効率よく抽出されるためである。これは、アンモニア処理バイオマス中のクマルアミドを取り囲むリグニンやタンニン、多糖、オリゴ糖などが、同温度にて溶解あるいは遊離するためだと推察されるが、理由は明確ではない。また、８０℃を超えてもクマルアミド抽出の効率が向上せず、更に１００℃を超える場合、熱によりアンモニア処理バイオマス中の多糖やリグニンなどが分解を起こし、ヒドロキシメチルフルフラール（ＨＭＦ）、フルフラール、蟻酸、酢酸、バニリンなどの不純物を生じるため好ましくない。

　本発明の抽出工程において、クマルアミドの抽出に使用する溶媒の量に特に制限はないが、アンモニア処理バイオマス乾燥質量１ｋｇに対して、２～３０ｋｇの溶媒を使用することが好ましい。抽出に使用する溶媒の量がアンモニア処理バイオマス乾燥質量１ｋｇに対して２～３０ｋｇの範囲内であれば、アンモニア処理バイオマス中のクマルアミドを十分に抽出することができる。抽出に使用する溶媒の量が、アンモニア処理バイオマス乾燥質量１ｋｇに対して２ｋｇ未満ではアンモニア処理バイオマス中のクマルアミドを十分抽出できず、またほとんどの溶媒（水）がアンモニア処理バイオマス中に吸収されてしまい、クマルアミド溶液の回収が困難になることがある。また、抽出に使用する溶媒の量が、アンモニア処理バイオマス乾燥質量１ｋｇに対して３０ｋｇを超える場合、それ以上溶媒の量を増やしてもクマルアミドの抽出量に対して効果がないばかりでなく、後述の晶析工程におけるクマルアミドの濃縮の際に処理する溶媒の量が増えてしまい、経済的に不利である。

（３）晶析工程
　本発明の晶析工程において、抽出工程で得られるクマルアミド溶液中のクマルアミドを過飽和状態とすることによってクマルアミド結晶を析出せしめ、クマルアミドを回収する。一般に晶析とは、溶質濃度を高めるか、溶質の溶解度を低下させるか、あるいはこれらを組み合わせることなどにより、溶質が溶解度以上に溶けた溶液状態、すなわち過飽和状態とすることにより、溶質を結晶として析出・成長させ、回収する方法を指す。一般的な晶析方法としては、溶質濃度を高める方法として加熱蒸発、減圧乾燥、凍結乾燥などが挙げられ、溶解度を低下させる方法として冷却、化学反応、加圧などが挙げられる。本発明の晶析工程における晶析方法は特に限定されず、これらを使用することができる。なお、抽出工程で得たクマルアミド溶液には固形物が多量に含まれているため、クマルアミドの晶析に先立ってこれらの固形物を除去しておくことが好ましい。固形物の除去方法は特に限定されないが、遠心分離、フィルタープレス、ベルトフィルター、精密ろ過、メッシュスクリーンによるろ過、不織布によるろ過およびその組み合わせなどが挙げられる。上記の中でも、精密ろ過はミクロンオーダーの粒子を除去することができ、晶析時のクマルアミド純度を高めることができるので、固形物除去の最終段は精密ろ過とすることが好ましい。

　本発明の晶析工程において、クマルアミド溶液から結晶を析出させる前に、クマルアミド溶液をあらかじめ濃縮する濃縮工程を行なうことが好ましい。クマルアミド溶液の濃縮方法は特に限定されないが、省エネルギーで高濃縮できる膜分離、すなわちクマルアミド溶液を膜に通じて濾過して、非透過液側でクマルアミドを濃縮する方法が好ましく用いられる。なお、膜分離によってクマルアミドの濃縮を行う場合、膜分離中にクマルアミド結晶が析出してしまうと膜が目詰まりを引き起こすため、膜分離中にはクマルアミドを析出させないように制御することが好ましい。

　クマルアミドを膜分離によって濃縮する分離膜としては、逆浸透膜を使用できる。逆浸透膜とはＲＯ膜とも呼ばれるものであり、「一価のイオンを含めて脱塩機能を有する膜」と一般的に定義される膜である。逆浸透膜は、数オングストロームから数ナノメートル程度の超微小空隙を有していると考えられる膜で、主として海水淡水化や超純水製造などイオン成分除去に用いられる。本発明においては、クマルアミドを非透過側に阻止する一方で、水分を透過側に除去して、クマルアミド溶液を濃縮する目的で逆浸透膜を使用できる。また、クマルアミド溶液を濃縮する際に透過側に除去された水は、ほとんど不純物を含まないため、様々な用途に再利用することができる。例えば前述のクマルアミド抽出工程に使用する溶媒として再利用することも可能である。逆浸透膜としては、例えば、ＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載のものを使用することができる。

　クマルアミド溶液の濃縮に使用する逆浸透膜の形状は特に限定されず、中空糸膜モジュール、平膜、スパイラルモジュールが使用できるが、なかでもスパイラルモジュールが好ましく使用できる。スパイラルモジュールは一般に耐圧性が高いためクマルアミドを高度に濃縮でき、また有効膜面積が大きいことにより処理量も大きいためである。

　逆浸透膜を用いてクマルアミドを濃縮する際のクマルアミド溶液の温度は２０～５０℃が好ましい。２０℃以上では、クマルアミドの析出が起こりにくく膜の目詰まりを生じず、一方、２０℃未満ではクマルアミドの析出が格段に起こりやすく、膜が目詰まりを生じやすい。また、５０℃を超える温度でクマルアミドの濃縮を続けると、膜の劣化が早まることがある。

　クマルアミド溶液を濃縮した後のクマルアミド溶液の晶析には、前述の一般的な晶析方法を使用できるが、中でも冷却が好ましく用いられる。クマルアミド溶液の冷却により晶析を行なう場合、比較的温和な冷却温度で、高純度のクマルアミドを収率よく回収できるためである。この理由としては、アンモニア処理バイオマスから抽出される他の物質と比較し、クマルアミドは溶解度の温度依存性が高いためであると考えられるが、明確ではない。

　本発明の晶析工程において、クマルアミド溶液の冷却の温度としては、１５℃以下とすることが好ましい。１５℃以下であればクマルアミド結晶の析出・成長が著しいためである。

　本発明の晶析工程において、冷却の期間は特に限定されないが、５時間～１０日が好ましい。５時間未満の場合クマルアミド結晶の析出・成長が乏しく、クマルアミド回収量は少なくなる。一方１０日間を超える場合は、それ以上はほとんど結晶が析出・成長せず、クマルアミド回収量は増加しないため、やはり好ましくない。

　本発明の晶析工程において、クマルアミドの晶析または前記逆浸透膜によるクマルアミド溶液の濃縮に先立ち、クマルアミド溶液をナノ濾過膜に通じて濾過し、透過液としてクマルアミド精製液を得る精製工程を行なってもよい。精製工程を行なうことにより、クマルアミド溶液から不純物を除去することができ、晶析の際に得られるクマルアミド結晶の純度を向上することができる。ナノ濾過膜とは、ナノフィルター（ナノフィルトレーション膜、ＮＦ膜）とも呼ばれるものであり、「一価のイオンは透過し、二価のイオンを阻止する膜」と一般に定義される膜である。ナノ濾過膜は、数ナノメートル程度の微小空隙を有していると考えられる膜で、主として、水中の微小粒子や分子、イオン、塩類等を阻止するために用いられる。本発明では、クマルアミド溶液をナノろ過膜に供することにより、糖を初めとするバイオマス由来の不純物を非透過側に阻止する一方で、クマルアミド溶液を透過側へと透過させることによりクマルアミド溶液が精製される。ナノ濾過膜としては、例えば、ＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載のものを使用することができる。

　精製工程で使用するナノ濾過膜の形状としては特に限定されず、前述の逆浸透膜と同様の形状のものを使用できる。

　晶析により得られたクマルアミド結晶は、固液分離により回収される。固液分離方法は特に限定されず、遠心分離、フィルタープレス、精密ろ過、メッシュスクリーンによるろ過、不織布によるろ過、濾紙によるろ過およびその組み合わせなどが使用できる。

　本発明の晶析工程において、回収されるクマルアミド結晶の純度は、９０％以上が好ましく、９５％以上がより好ましく、９７％以上が更に好ましい。

　本発明の晶析工程において、前記固液分離により回収されたクマルアミド結晶は、そのまま乾燥させても９０％以上の高純度となるが、水洗浄により更に純度を向上できる。クマルアミドは水への溶解度に乏しく、水洗いによって水溶性の不純物が優先的に取り除かれるためである。水洗いの温度は特に限定されないが、５～２０℃が好ましい。５℃未満では、水溶性の不純物の溶解度が乏しいために十分に不純物が除去されず、一方、２０℃を超えるとクマルアミドの溶解度が上昇し、クマルアミドの収率が低下してしまうためである。なお、クマルアミド結晶の純度は、後述の実施例の参考例２の方法によって測定することができる。

　また、クマルアミド結晶は水洗いに先立って粉砕することにより、更に不純物除去の効率を高めることができる。粉砕の方法は特に限定されないがハンマーミル、ウイングミル、ボールミル、石臼、乳鉢、あるいはその組み合わせなどが使用できる。

　水洗浄後のクマルアミド結晶は、上述の固液分離方法などにより再度回収される。また、前述の水洗浄や粉砕、固液分離による回収は適宜組み合わせてもよく、また繰返し行ってもよい。繰り返し実施することにより更にクマルアミドの純度を高めることができる。

（参考例１）ＨＰＬＣ分析条件
　本実施例において、溶液中の有機酸、芳香族化合物の濃度は、以下のＨＰＬＣ条件により分析を行った。

（１）有機酸分析条件
　溶液中の酢酸の濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。
機器：日立高速液体クロマトグラフ　Ｌａｃｈｒｏｍ　ｅｌｉｔｅ（株式会社日立製作所製）
カラム：ＧＬ－Ｃ６１０Ｈ－Ｓ（株式会社日立製作所製）
移動相：３ｍＭ　過塩素酸
反応液：ブロモチモールブルー溶液
検出方法：ＵＶ－ＶＩＳ検出器
流速　移動相：０．５ｍＬ／ｍｉｎ　　反応液：０．６ｍＬ／ｍｉｎ
温度：６０℃

（２）芳香族化合物分析
　溶液中の芳香族化合物（クマル酸、クマルアミド、フェルラアミド）の濃度は、下記に示すＨＰＬＣ条件で、標品との比較により定量した。また、同時に各検出ピークのＵＶ吸収スペクトル（測定波長：２００ｎｍ～４００ｎｍ）を得た。
機器：日立高速液体クロマトグラフ　Ｌａｃｈｒｏｍ　ｅｌｉｔｅ（株式会社日立製作所製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　２．５μｍ　Ｈｙｄｒｏ‐ＲＰ　１００Ａ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）
検出方法：Ｄｉｏｄｅ　Ａｒｒａｙ　検出器
流速：０．６　ｍＬ／ｍｉｎ
温度：４０℃

（参考例２）クマルアミド純度・収率の測定
　本発明の晶析工程により得られたクマルアミド結晶全量を５ｋＰａにて約６時間減圧乾燥し、乾燥クマルアミド結晶を得た。乾燥クマルアミド結晶全量を乳鉢で十分すりつぶしたあと、更に５ｋＰａにて一昼夜減圧乾燥を行い、乾燥クマルアミド粉体を得た。乾燥クマルアミド粉体全量の質量を、電子天秤を用いて測定後、乾燥クマルアミド粉体の一部を精密天秤にて１０００ｍｇ計りとり、５０体積％アセトニトリル／水混合溶液に溶解後、５００ｍＬ容量のメスフラスコ内で、５０体積％アセトニトリル／水混合溶液を用いて標線までメスアップした。得られた溶液を、純水を使用して２０倍希釈した溶液中のクマルアミド濃度を、参考例１に従って分析後、クマルアミド純度を下記式（１）に従って算出した。また、クマルアミド収率を下記式（２）に従って算出した。なお、投入バイオマス乾燥質量とは、本発明の抽出工程に供したアンモニア処理バイオマス全量の乾燥質量のことである。
クマルアミド純度（％）＝クマルアミド濃度測定値（ｍｇ／Ｌ）／１００（ｍｇ／Ｌ）×１００・・・（１）
クマルアミド収率（ｍｇ／ｋｇ）＝乾燥クマルアミド粉体質量（ｍｇ）×クマルアミド純度（％）／（投入バイオマス乾燥質量（ｋｇ）×１００）・・・（２）。

（実施例１）クマルアミド結晶の製造・同定
［Ａ．アンモニア処理バイオマス抽出物結晶の作製］
（１）前処理工程
（１．１）セルロース系バイオマスの粉砕処理
　セルロース系バイオマスとしてエリアンサスを用いた。前記エリアンサスを４ｍｍの目開きを有するスクリーンで粒度を制御しながらカッターミルを用いて粉砕した。レーザー回折法で測定した平均粒子径（ｄ５０）は、約９７５μｍであった。粉砕後のエリアンサスを、温度４０℃、５ｋＰａの減圧下にて一昼夜乾燥した。乾燥後のエリアンサスの含水率は乾燥後のエリアンサスの質量を基準として０．５質量％程度であった。

（１．２）セルロース系バイオマスのアンモニアを含む処理剤での処理
　（１．１）で得られた粉砕・乾燥後のエリアンサス（セルロースチップ）を、アンモニアを含む処理剤としてのアンモニアにより前処理を行った。内容積が約５Ｌの攪拌装置を備えたステンレス・スチール製オートクレーブに、前記セルロースチップを２００ｇ充填した。次に、オートクレーブ内への加圧窒素ガスの導入／脱圧を繰り返して、オートクレーブ内の空気を除去し、窒素ガスへと置換した。その後このオートクレーブを１２０℃まで昇温した。昇温後、オートクレーブ内を脱圧し、更に減圧にして窒素ガスを排気した。一方、別途の圧力容器に加圧アンモニアを導入し、１２０℃よりやや高い温度までこのアンモニアを昇温した。その後、前記オートクレーブと前記圧力容器とを連結する配管に設置したバルブを開くことにより、前記オートクレーブに、温度１２０℃において圧力１．２ＭＰａとなるようにアンモニアを導入した。この温度、圧力条件にて２．５時間、攪拌下にセルロースチップをアンモニアにより処理した。その後、脱圧してアンモニアを排出し、更に窒素ガスをオートクレーブに流通させてセルロースチップ粒子中に残留したアンモニアを除去し、前処理バイオマスを得た。これをアンモニア処理バイオマスとして用いた。

（２）抽出工程
　（１．２）で得たアンモニア処理バイオマス乾燥質量１ｋｇに、抽出溶媒として９ｋｇの水を添加し、２０℃にて３０分間攪拌した。攪拌後の懸濁液を、アンモニア処理バイオマス抽出液として以下の工程に使用した。

（３）晶析工程
（３．１）精製・濃縮
　（２）抽出工程で得た前記アンモニア処理バイオマス抽出液に含まれる固形物をフィルタープレス処理（藪田産業製、ＭＯ－４）により除去して精製工程を行なった。更に、細孔径０．２２μｍの精密ろ過膜に供することにより、ミクロンオーダーの不溶性粒子を除去した。このようにして得られた液を、常圧下で過熱・沸騰させ、液量がおよそ半分になるまで溶媒を蒸発させることにより濃縮工程（加熱蒸発）を行なった。

（３．２）晶析
　（３．１）で濃縮したアンモニア処理バイオマス抽出液を、１５℃で１日間放置したところ、結晶の析出が確認された。前記結晶を、目開き５００μｍの篩にて分離した。このようにして得られた結晶に、１Ｌの水を加え、常温にて懸濁した後、再度目開き５００μｍの篩にて分離した。得られた結晶を、５０℃にて一昼夜乾燥させ、更に１０ｋＰａにて約６時間減圧乾燥を行い、乾燥結晶を得た。

［Ｂ．アンモニア処理バイオマス抽出物の同定］
　（２）抽出工程で得られたアンモニア処理バイオマス抽出液を、参考例１の有機酸分析条件に記載のＨＰＬＣ条件にて分析した結果、主要な有機酸成分として、酢酸が含まれることが分かった。また、同様に参考例１の芳香族化合物分析条件に記載のＨＰＬＣ条件にて分析した結果、図２に示すように、主要なピークが３つ（ピーク１、ピーク２、ピーク３）検出された。

　これらのうち、ピーク３は、クマル酸標品のＨＰＬＣ溶出時間と一致したためクマル酸であることが判明した。また、残り２つの化合物（ピーク１、ピーク２）の溶出時間は、セルロース系バイオマス前処理物に含まれる芳香族化合物として知られているＨＭＦ（ヒドロキシメチルフルフラール）、フルフラール、バニリン、アセトバニロン、フェルラ酸、コニフェリルアルデヒド、グアヤコールのいずれの標品とも一致しなかった。そこで、ＨＰＬＣによりこれら２種のピーク（ピーク１、ピーク２）を分取し、ＬＣ／ＭＳ（ＬＣＭＳ‐ＩＴ‐ＴＯＦおよびＬＣ２０Ａ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）にて分子量を分析した。
　その結果、分子量はそれぞれ１６３．０６３、１９３．０７４であることが判明した。種々のバイオマス中にはクマル酸、フェルラ酸が含まれることが知られており、これらはアンモニア分子と縮合反応してそれぞれクマルアミド、フェルラアミドを生成することが予想される。クマルアミド、フェルラアミドの構造式から算出される分子量は、各々１６３．１７２、１９３．１９８であり、上記ＬＣ／ＭＳで得られた分子量と一致することから、アンモニア処理バイオマス抽出液に含まれる残りの２種のピーク（ピーク１およびピーク２）は、クマルアミド、フェルラアミドであることが推定された。

　そこで、クマルアミドおよびフェルラアミド標品に関して、委託合成（委託先：ＶＳＮ社合成研究所）し、合成した標品について参考例１の芳香族化合物分析条件に記載のＨＰＬＣ条件にて分析し、溶出時間を測定した。その結果、アンモニア処理バイオマス抽出液中のピーク１と標品混合液中のクマルアミド標品の溶出時間（３．７４分）、およびアンモニア処理バイオマス抽出液中のピーク２と標品混合液中のフェルラアミド標品の溶出時間（５．２５分）が完全に一致した（図２参照）。
　ＨＰＬＣを行った際に得られた、アンモニア処理バイオマス抽出液のピーク１およびピーク２と、クマルアミド標品およびフェルラアミド標品との各々のＵＶ吸収スペクトルを図３～図６に示す。また、測定波長は２００～４００ｎｍとした。図３、４に示すように、アンモニア処理バイオマス抽出液のピーク１とクマルアミド標品とのＵＶ吸収スペクトルは一致した。また、図５、６に示すように、アンモニア処理バイオマス抽出液のピーク２とフェルラアミド標品とのＵＶ吸収スペクトルは一致した。

　以上の分析の結果より、アンモニア処理バイオマス抽出液に含まれるピーク１およびピーク２は、それぞれクマルアミド、フェルラアミドであり、アンモニア処理バイオマスには、これらの化合物が多く含まれていることが判明した。表１に、アンモニア処理バイオマス抽出液の成分分析結果を示す。

　（３）晶析工程により得られた結晶を適量溶解した５０体積％アセトニトリル／水混合溶液を、参考例１の芳香族化合物分析条件に記載のＨＰＬＣ条件にて分析した結果、単一のピークが得られ、その溶出時間はクマルアミドと一致した。また、ＨＰＬＣ分析の際に得られたピークのＵＶ吸収スペクトルは、クマルアミド標品とのＵＶ吸収スペクトルと一致した。以上より、（３）晶析工程により得られた結晶は、クマルアミド結晶であることが判明した。前記クマルアミド結晶につき、参考例２に従い純度および収率を分析した結果を表２に示す。

（実施例２）逆浸透膜によるクマルアミド濃縮
　（１）前処理工程、（２）抽出工程、および（３．１）精製・濃縮工程の精製工程まで実施例１と同様にして、アンモニア処理バイオマス抽出液を精製した。得られた液を、逆浸透膜（ＵＴＣ－８０、東レ株式会社製）を用いて、２５℃にて濾過することにより、アンモニア処理バイオマス抽出液を濃縮した。濾過は、クロスフロー濾過にて膜透過流束が０．５ｍ／日となるように操作圧を随時調節して行い、液量がおよそ半分まで濃縮された時点で終了させた。得られた濃縮液を１５℃に冷却して１日間放置したところ、結晶の析出が確認された。前記結晶を、目開き５００μｍの篩にて分離した。このようにして得られた結晶に、１Ｌの水を加え、常温にて懸濁した後、再度目開き５００μｍの篩にて分離した。得られた結晶を、５０℃にて一昼夜乾燥させ、更に１０ｋＰａにて約６時間減圧乾燥を行い、クマルアミド乾燥結晶を得た。得られたクマルアミド結晶の純度および収率を、参考例２に記載の方法により分析した結果を表２に示す。表２は、抽出工程、精製工程、および濃縮工程の違いによるクマルアミドの純度および収率をまとめたものである。表２から明らかなように、加熱蒸発法と比較して、逆浸透膜によるクマルアミド濃縮を行った場合の方がクマルアミドの収率が向上した。

（実施例３）温水によるクマルアミド抽出
　抽出工程の温度をそれぞれ１０℃、２０℃、３０℃、４０℃、５０℃、７０℃、９０℃とすること以外、実施例１の（１）前処理工程、および（２）抽出工程と同様の方法でアンモニア処理バイオマス抽出液を得た。それぞれの温度で抽出したアンモニア処理バイオマス抽出液を、参考例１記載のＨＰＬＣ条件により成分分析を行った結果を表３に示す。表３から明らかなように、バイオマス抽出液中のクマルアミド濃度は抽出時の温度が高いほど高くなるが、４０℃未満では抽出濃度が乏しく、一方４０℃以上では格段に抽出濃度が大きくなった。また、抽出濃度は７０℃でほぼ上限に達しており、それ以上温度を上げても増えなかった。

（実施例４）極性有機溶媒を含む溶媒によるクマルアミドの抽出
　抽出溶媒として１０％エタノール水溶液、１０％アセトニトリル水溶液をそれぞれ用いること以外、実施例１の（１）前処理工程、および（２）抽出工程と同様の方法でアンモニア処理バイオマス抽出液を得た。それぞれの抽出溶媒で抽出した液を、参考例１記載のＨＰＬＣ条件にて成分分析を行った結果を表４に示す。表４は、異なる抽出溶媒を使用した場合のアンモニア処理バイオマス抽出液中のクマルアミド濃度をまとめたものである。

（比較例１）純粋な有機溶媒によるクマルアミドの抽出
　抽出溶媒として純エタノール、純アセトニトリルをそれぞれ用いること以外、実施例１の（１）前処理工程、および（２）抽出工程と同様の方法でアンモニア処理バイオマス抽出液を得た。それぞれの抽出溶媒で抽出した液を、参考例１記載のＨＰＬＣ条件にて成分分析を行った結果を表４に示す。表４より明らかなように、抽出溶媒として純水を使用した実施例１に比べ、１０％エタノール、１０％アセトニトリルを使用した実施例４は、抽出液中のクマルアミド濃度が増加しており、特にエタノールでその効果は著しかった。一方、純粋なエタノール、アセトニトリルを使用した比較例１では、ほとんどクマルアミドが回収されなかった。

（実施例５）ナノろ過膜によるクマルアミドの精製
　固形物を除去した後のアンモニア処理バイオマス抽出液を、逆浸透膜による濃縮に先立ち、フィルタープレス、精密ろ過膜によりろ過した後、さらに、ナノろ過膜（ＵＴＣ－８０、東レ株式会社製）を用いて２５℃にてろ過を行い、クマルアミドを精製したこと以外、実施例２と同様の方法によりクマルアミド乾燥結晶を得た。ナノろ過膜によるろ過は、クロスフロー濾過にて膜透過流束が０．５ｍ／日となるように操作圧を随時調節して行い、操作圧が６ＭＰａに達した時点で終了した。得られたクマルアミド結晶の純度および収率を、参考例２に記載の方法により分析した結果を表２に示す。表２から明らかなように、ナノろ過膜によるクマルアミドの精製を行った実施例５は、ナノろ過膜によるクマルアミドの精製を行わなかった実施例２と比較して、クマルアミド結晶の純度が向上した。

（実施例６）抽出工程における酵素糖化
　実施例１の（１）前処理工程に記載の方法により得られたアンモニア処理バイオマス乾燥質量１ｋｇに対して水９ｋｇを添加し、これに少量の濃硫酸を加えてｐＨを５に調整した後、糖化酵素としてトリコデルマ・リーセイ由来のセルラーゼ製剤（アクセルレース・デュエット、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ社製）を、アンモニア処理バイオマス乾燥質量に対し、酵素タンパク質質量で１００分の１の量を添加し、５０℃で２４時間撹拌して糖化反応を行った。得られた懸濁液を、アンモニア処理バイオマス抽出液とし、実施例２記載の方法と同様に処理し（精製・濃縮、晶析）、乾燥クマルアミド結晶を得た。
　図７に糖化反応中の反応液上清に含まれるクマルアミド濃度の経時変化を、参考例１に従い分析した結果を示す。図７から明らかなように、酵素糖化反応が進むにつれて溶液中のクマルアミド濃度が増加していた。
　また、得られた乾燥クマルアミド結晶の純度および収率を、参考例２に記載の方法により分析した結果を表２に示す。表２から明らかなように、抽出工程において酵素糖化を行った実施例６は、酵素糖化を行わなかった実施例２と比較してクマルアミドの収率が向上した。

（実施例７）浸漬時間
　攪拌時間を２４時間とすること以外、実施例１の（１）前処理工程、および（２）抽出工程と同様の方法により、アンモニア処理バイオマスからのクマルアミド抽出を行った。図８に抽出中の懸濁液上清に含まれるクマルアミドの濃度の経時変化を、参考例１に従い分析した結果を示す。図８から明らかなように、浸漬開始６０分程度までは抽出液中のクマルアミド濃度は徐々に上昇するが、それ以降はほぼ一定の値となった。

（実施例８）晶析工程における冷却温度
　逆浸透膜による濃縮液を冷却し、１日間放置する際の温度をそれぞれ５℃、１０℃、２０℃、２５℃とすること以外、実施例２と同様の方法でクマルアミド乾燥結晶を得た。得られたクマルアミド結晶につき、参考例２の方法に従い純度および収率を測定した結果を表５に示す。表５は、晶析工程の冷却温度によるクマルアミド純度およびクマルアミド収率をまとめたものである。表５から明らかなように、冷却時の温度を１５℃とした実施例２と比較して、１０℃の場合ではクマルアミドの収率が向上しており、５℃では更に向上した。また、２０℃、２５℃の場合はどちらもクマルアミド結晶が析出しなかった。

（実施例９）濃縮工程におけるろ過時の温度
　濃縮工程において、逆浸透膜による濃縮の際の温度をそれぞれ１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃とすること以外、実施例４と同様の方法で、クマルアミド抽出液の濃縮を行った。濃縮時の操作圧の経時変化を図９に示す。なお、１０℃、１５℃、２０℃の条件ではいずれも濃縮中に結晶の析出が目視で確認された。図９から明らかなように、１０℃、１５℃のろ過温度では、２０℃、２５℃、３０℃の場合と比較して操作圧が急上昇しており、クマルアミド結晶の析出により膜目詰まりが生じたと推察された。

　本発明で得られたクマルアミドは、純度が高く、クマルアミドを出発原料とする様々な化成品生産に使用することができる。

Claims

　セルロース系バイオマスを、アンモニアを含む処理剤で処理してアンモニア処理バイオマスを得る前処理工程と、
　前記アンモニア処理バイオマスを、少なくとも水を含む溶媒に浸漬して、前記アンモニア処理バイオマス中のクマルアミドを前記溶媒中に溶出せしめ、クマルアミド溶液を得る抽出工程と、
　前記クマルアミド溶液中のクマルアミドを結晶として析出させ、クマルアミド結晶を得る晶析工程と、
　を含むことを特徴とする、クマルアミドの製造方法。
　前記晶析工程において回収されるクマルアミド結晶は、純度９０％以上であることを特徴とする請求項１に記載のクマルアミドの製造方法。
　前記抽出工程において使用する前記溶媒の温度は、４０℃以上であることを特徴とする請求項１または２に記載のクマルアミドの製造方法。
　前記抽出工程において使用する前記溶媒は、少なくとも１種の極性有機溶媒を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。
　前記溶媒は、前記極性有機溶媒として少なくともエタノールを含むことを特徴とする、請求項４に記載のクマルアミドの製造方法。
　前記晶析工程は、前記クマルアミド溶液から結晶を析出させる前に、前記クマルアミド溶液を逆浸透膜に通じて濾過し、非透過液としてクマルアミド濃縮液を回収する濃縮工程を含むことを特徴とする、請求項１～５のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。
　前記逆浸透膜に通じて濾過するクマルアミド溶液の液温は、２０℃以上であることを特徴とする請求項６に記載のクマルアミドの製造方法。
　前記晶析工程は、前記クマルアミド溶液を１５℃以下に冷却してクマルアミドの結晶を析出させることを特徴とする、請求項１～７のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。
　前記抽出工程は、前記アンモニア処理バイオマスを前記溶媒に浸漬する際、糖化酵素を添加することによりアンモニア処理バイオマスの加水分解を行うことを特徴とする、請求項１～８のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。
　前記晶析工程は、前記クマルアミド溶液から結晶を晶析させる前に、前記クマルアミド溶液をナノろ過膜に通じて濾過し、透過液としてクマルアミド精製液を回収する精製工程を含むことを特徴とする、請求項１～９のいずれかに記載のクマルアミドの製造方法。