WO2013191225A1 - 粘膜免疫賦活化剤及びhpv感染症治療用経口医薬組成物 - Google Patents
粘膜免疫賦活化剤及びhpv感染症治療用経口医薬組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2013191225A1 WO2013191225A1 PCT/JP2013/066893 JP2013066893W WO2013191225A1 WO 2013191225 A1 WO2013191225 A1 WO 2013191225A1 JP 2013066893 W JP2013066893 W JP 2013066893W WO 2013191225 A1 WO2013191225 A1 WO 2013191225A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- hpv
- polypeptide
- mucosal
- pharmaceutical composition
- derived
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0053—Mouth and digestive tract, i.e. intraoral and peroral administration
- A61K9/006—Oral mucosa, e.g. mucoadhesive forms, sublingual droplets; Buccal patches or films; Buccal sprays
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
- A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/01—DNA viruses
- C07K14/025—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/28—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Vibrionaceae (F)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/335—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Lactobacillus (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/34—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Corynebacterium (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
- A61K2039/542—Mucosal route oral/gastrointestinal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
- A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Definitions
- the present invention relates to a mucosal immunostimulator and an oral pharmaceutical composition for treating HPV infection, and more specifically, a mucosal immunostimulant containing a mucosal adjuvant and a herbal medicine having nourishing tonic, and an HPV vaccine,
- the present invention relates to an oral pharmaceutical composition for the treatment of HPV infection, which contains a traditional Chinese medicine having nourishing tonic.
- HPV Human papillomavirus
- the HPV infection is clearly related to vulvar cancer, anal cancer, oral cancer, vaginal cancer, penile cancer, pharyngeal cancer, and warts (genital warts).
- the preventive vaccine against HPV infection is considered effective.
- HPVs especially HPV16 and HPV18 account for about 65% of the onset causes of the cervical cancer in Japanese women, especially about 90% of the onset causes of cervical cancer in the twenties.
- the bivalent vaccine (trade name: Serelix) specific to the HPV16 and the HPV18 (see Patent Document 1)
- a tetravalent vaccine (trade name: Gardasil) specific to HPV6 and HPV11, which accounts for about 90% of the causes of the development of warts, is used (see Patent Document 2).
- Both of these two vaccines contain the HPV-derived L1 protein virus-like particles.
- the HPV E7 protein has the ability to bind to the Rb protein, and inhibits the binding between the transcription factor E2F and the Rb protein by binding to the Rb protein.
- the E2F released from the Rb protein is activated and shifts the cell cycle from the G1 phase to the S phase.
- another protein of HPV, E6 protein binds to p53 protein and promotes ubiquitination, whereby the p53 protein is degraded. From these facts, the functions of the E7 protein and the E6 protein are expected to cause the cells infected with the HPV to avoid the cell cycle checkpoint mechanism and the apoptosis controlled by the p53 protein, leading to canceration. It was done.
- HPV E7 and E6 mRNAs are always highly expressed in cervical cancer cells. Moreover, when the expression of HPV E6 and E7 in cervical cancer cells is suppressed by antisense or the like, the proliferation activity of the cervical cancer cells is suppressed. Furthermore, it has been shown that the cervical cancer cells in which the expression of E6 and E7 is suppressed by antisense or the like have lost their tumorigenic potential even when transplanted into mice. From the above, it is clear that E6 and E7 of the HPV are deeply functionally involved in the pathology and carcinogenic process of the cervical cancer and other HPV related cancers.
- CIN cervical intraepithelial neoplasia
- squamous metaplasia squamous epithelialization of spare cells in the vagina
- HPV infection of the resulting epithelial basal cells is thought to be the origin of cervical cancer.
- the HPV DNA infected with epithelial basal cells is about several tens to one hundred copies per cell, and the expression of E6 and E7 is low.
- the HPV proliferation to the basal cells is brought into a continuous state, and a change that the expression of the E6 and the E7, which have been at low levels, is continuously increased is considered to occur. It is done. Expression of E6 and E7 is very low in CIN1 (mild dysplasia), whereas high expression is observed in CIN2 (moderate dysplasia) and CIN3 (high dysplasia). The continuous enhancement of E7 expression is thought to occur at the CIN1 stage.
- HPV infection is controlled by the immune response of the host, and in fact, the incidence of cervical cancer is high in women with a reduced immune response, such as HIV-infected persons and organ transplant patients. It has also been reported.
- the host immune response to viruses such as HPV consists of a non-specific mechanism called innate immunity that operates immediately after infection by the function of cell groups such as NK cells and macrophages, and interferon, and another virus antigen specific There is a mechanism called acquired immunity, which is a typical immune response. Acquired immunity is an immune mechanism that works several days after infection, and is divided into humoral immunity and cellular immunity. It is considered that the immune response related to the elimination of HPV infection is mainly a cellular response caused by the NK cells and the cytotoxic T cells (CTLs) involved in the cellular immunity.
- CTLs cytotoxic T cells
- the NK cell is an immune cell that operates at an early stage of the HPV infection.
- HPV-specific cellular immunity delayed allergic reaction of HPV16 to the E7 protein correlates with CIN regression, and helper T cells specific for E7 play an important function in controlling HPV infection.
- E7-specific cellular immunity is expressed not only in the spleen but also in the mucosa by orally administering to the mouse the vaccine (LacE7), which is expressed in Lactobacillus casei and killed by heat treatment, and then dried and powdered. It was shown that a response can be induced (see Non-Patent Document 5).
- the present inventors conducted an exploratory clinical trial on the precancerous lesion (CIN) of the cervical cancer with respect to the formulated LacE7, and examined safety evaluation and pathological effectiveness.
- CIN precancerous lesion
- the induction of E7 specific cellular immunity in cervical lymphocytes and peripheral blood was also analyzed.
- the mucosal immune system existing in the local mucosa plays an important role in the host defense mechanism it is conceivable that.
- humoral immunity in the local mucosa secretory IgA antibodies play an important role.
- the production of the IgA antibody is controlled by cytokines such as transforming growth factor (TGF) - ⁇ , interleukin (IL) -4 and IL-6 secreted from B cells, T cells and macrophages,
- TGF transforming growth factor
- IL interleukin
- IL-6 interleukin-6 secreted from B cells, T cells and macrophages
- CTL cytotoxic T cells
- the Chinese medicines Juzentaihoto, Hochuekkito, and mucosal adjuvant are already known as mucosal immunostimulators that activate humoral immunity, which is one of the acquired immunity in the mucosa.
- Kakachi in influenza infection, Kakachi has no direct growth inhibitory effect on influenza virus, but instead has therapeutic effects such as antipyretic effect, pneumonia improvement effect, and mortality reduction.
- the amount of IFN in the serum increases, then the amount of IL-1 ⁇ increases, and the amount of prostaglandin E 2 increases by increasing the cyclooxygenase activity in the brain.
- Fever Whereas aspirin inhibits the cyclooxygenase, Kakachi exhibits an antipyretic effect by suppressing the production of IL-1 ⁇ induced by the IFN.
- Juzentaihoto and Hochuekkito are Chinese medicines used for the treatment of postoperative, post-illness, postpartum, exhaustion due to chronic diseases, accumulation of fatigue, general malaise when weakened due to summer thinness, loss of appetite, etc. is there.
- the Juzen-taiho-to is used for anemia, while Hochuekki-to has a slight fever, a cough, night sweats, palpitation, etc. when a cold person has a cold. Used to improve symptoms and constitution.
- Both Juzentaihoto and Hochuekkito have also been shown to activate the humoral immune mechanism by B cells in the mucous membrane of the intestine and trachea (Patent Document 3 and Non-Patent Document 6). reference). That is, it has been clarified that Juzentaihoto and Hochuekkito are mucosal immunity activation agents that activate the humoral immunity of the mucosa.
- Sho-ji-ko-to and Shosei-ryu are also used for the treatment and prevention of infectious diseases, which are also thought to activate the immune system of the host.
- an adjuvant in immunology is a reagent that is used to enhance antigenicity (immunity promotion) by being injected with an antigen, and it remains long by insolubilizing the antigen. Is gradually released over a long period of time, and inflammation is caused in the part to which the antigen is administered, so that macrophages gather and the antigen is easily phagocytosed, thereby promoting antigen presentation and activating immune cells.
- the mechanism of their action is various and many are unknown.
- Kampo medicines that have so-called nourishing tonic effects such as Kakachi, Juzen Daiyuto, Hochuekkito, Shojikutou, and Shoseiryuto are also broad adjuvants in that they also have an effect of enhancing humoral immunity. You can say that.
- cholera toxin cholera toxin
- CT cholera toxin
- LT heat-labile toxin of toxigenic Escherichia coli
- VT verotoxin of enterohemorrhagic Escherichia coli
- DT diphtheria toxin
- PT pertussis toxin
- mucosal adjuvants derived from bacteria exhibit excellent adjuvant effects in the mucosa and the whole body, they have been shown to exhibit serious side effects such as optic nerve palsy, so that they can be used for human treatment as they are. Can not. Therefore, recently, a mutant mucosal adjuvant capable of avoiding the side effects has been newly developed and made available.
- ⁇ GalCer ⁇ -galactosylceramide
- CpG oligonucleotide phospholipid and apoposide
- Pulmonary surfactant protein-C pulmonary Surfactant Protein-C, SP-C, also known as Surfacten
- SP-B pulmonary surfactant protein-B
- IFN- ⁇ Double-stranded RNA and activity-amplified TNF mutants
- the present invention contains a traditional Chinese medicine having a nutritional tonic action and a mucosal adjuvant, which can be administered in combination with a virus vaccine and a bacterial vaccine such as an HPV vaccine, which has a sufficient effect on activation of cellular immunity in the mucosa.
- HPV vaccine that can be used to treat mucosal immunostimulants and cervical cancer, vulvar cancer, anal cancer, oral cancer, vaginal cancer, penile cancer, pharyngeal cancer and their precancerous lesions, and warts
- Another object of the present invention is to provide an oral pharmaceutical composition for the treatment of HPV infection, which comprises an HPV E7 polypeptide and a traditional Chinese medicine having a nourishing tonic.
- the present inventors have made extensive studies and obtained the following findings. That is, the present inventors obtained the HPV vaccine and a traditional Chinese medicine having nourishing tonic effect such as Juzentaihoto or Hochuekkito, which has been known to enhance humoral immunity as a Chinese medicine adjuvant. It was newly found out that the cell-mediated immunity specific to the HPV vaccine in the spleen is enhanced by the combined administration. Further, the HPV vaccine-specific cellularity in the mucosal part is administered by combining the HPV vaccine, a traditional Chinese medicine having nourishing tonic action such as Juzentaihoto or Hochuekkito, and a mucosal adjuvant.
- a mucosal immunostimulant containing a traditional Chinese medicine with nourishing tonic such as Juzentaihoto and Hochuekkito and a mucosal adjuvant functions as an effective mucosal immunity stimulator for HPV vaccines Moreover, the effect as a mucosal immunity activation agent with respect to other virus vaccines and bacterial vaccines is expected.
- the mucosal immunity stimulating agent of the present invention is characterized by containing a traditional Chinese medicine having a nourishing tonic and a mucosal adjuvant.
- the oral pharmaceutical composition for the treatment of HPV infection of the present invention is characterized by containing an E7 polypeptide of HPV and a traditional Chinese medicine having a nourishing tonic.
- the above-mentioned problems can be solved and the above-mentioned object can be achieved, and combined administration with a virus vaccine and a bacterial vaccine such as an HPV vaccine, which has a sufficient effect on activation of cellular immunity in the mucosa.
- Mucosal immunostimulant containing nourishing tonic herbal medicine and mucosal adjuvant, cervical cancer, vulvar cancer, anal cancer, oral cancer, vaginal cancer, penile cancer, pharyngeal cancer and their precancers It is possible to provide an oral pharmaceutical composition for the treatment of HPV infection, which contains an EPV polypeptide of HPV as an HPV vaccine and a herbal medicine having a nutritional tonic effect, which can be used for the treatment of lesions and warts.
- FIG. 1 is a graph showing the effect on systemic and mucosal type 1 T cell responses by simultaneous administration of Juzentaihoto (JTT) or Hochuekkito (HET) in oral administration of LacE7. is there.
- FIG. 2 shows the effect on systemic and mucosal type 1 T cell responses by simultaneous administration of Juzentaihoto (JTT) or Hochuekkito (HET) and LTB in oral administration of LacE7
- FIG. 3A is a diagram showing the influence on systemic humoral immune response by simultaneous administration of Juzentaihoto (JTT) or Hochuekkito (HET) and LTB in oral administration of LacE7. .
- FIG. 1 is a graph showing the effect on systemic and mucosal type 1 T cell responses by simultaneous administration of Juzentaihoto (JTT) or Hochuekkito (HET) in oral administration of LacE7. is there.
- FIG. 2 shows the effect on systemic and mucosal
- FIG. 3B is a diagram showing the influence on the humoral immune response in the mucosa by simultaneous administration of Juzentaihoto (JTT) or Hochuekkito (HET) and LTB in oral administration of LacE7.
- FIG. 4A is a diagram showing the effect on type 1 cell response in mucosa by simultaneous administration of Juzentaihoto (JTT) or Hochuekkito (HET) and LTB in oral administration of LacE7.
- FIG. 4B is a graph showing the effect on mucosal type 2 T cell response by simultaneous administration of Juzentaihoto (JTT) or Hochuekkito (HET) and LTB in oral administration of LacE7. is there.
- FIG. 5 is a diagram showing the effect on the mucosal E7-specific type 1 T cell response by simultaneous administration of Hochuekkito (HET) and ⁇ -galactosylceramide ( ⁇ GalCer) or LTB in oral administration of LacE7. is there.
- FIG. 6 shows that E7-specific CTL is induced in the endothelium of the intestinal mucosa by oral administration of LacE7.
- FIG. 7 is a diagram showing that E7-specific CTL is induced in the endothelium of the intestinal mucosa by oral administration of LacE7.
- the immunostimulant of the present invention contains at least a traditional Chinese medicine (immuno-enhanced Chinese medicine) having nourishing tonicity (immunity enhancing action) and a mucosal adjuvant, and contains other components appropriately selected as necessary.
- Juzen-taiho-to is a kind of Chinese herbal medicine, jaundice, carrots, cinnamon bark, toki, river kyu, peonies, juku yellow. ), Sardine or white squirrel, sage licorice, and licorice.
- the Juzen-taiho hot water may be a commercially available product, and examples of the commercial product include Tsumura Juzen-taiho-to extract granule (identification code: Tsumura / 48).
- the Hochuekkito is a kind of Chinese herbal medicine, jaundice, carrots, cocoons or birch, toki, licorice, saiko, chimpi, taiso, ginger, and It consists of hemp.
- JP magnesium stearate and JP lactose hydrate may be added.
- the Hochuekkito may be a commercially available product, and examples of the commercially available product include Tsumura Hochuekkito extract granules (identification code: Tsumura / 41).
- ⁇ Mucosal adjuvant> there is no restriction
- those that further enhance the acquired immunity specific to oral vaccines derived from proteins such as viruses and bacteria are preferred.
- examples include bacterial toxins, synthetic ceramides ( ⁇ GalCer), CpG oligonucleotides, SP-C (Surfacten), SP-B, IFN- ⁇ (wild type or mutant), double stranded RNA and activity amplified TNF mutants. They may be used alone or in combination of two or more.
- Adjuvants derived from bacterial toxins are preferred in that they are frequently used as mucosal adjuvants.
- Synthetic ceramide ( ⁇ GalCer), CpG oligonucleotide, SP-C (Surfacten), SP-B, IFN- ⁇ (wild type or mutant type), double-stranded RNA and activity amplification type in that it is not derived from a bacterial toxin Adjuvants such as TNF mutants are preferred, and among them, the synthetic ceramide ( ⁇ GalCer) is more preferred in that the adjuvant effect on humans has been confirmed.
- the bacterial toxin and the synthetic ceramide ( ⁇ GalCer) are preferable in that an adjuvant effect on a plurality of antigens is known.
- Bacterial toxin-derived adjuvant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include polypeptides derived from CT, LT, VT, DT, PT and the like. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. Among these, a mutant bacterial toxin-derived adjuvant into which a mutation has been introduced in advance so as not to cause serious side effects upon oral administration to humans is preferable.
- mutant bacterial toxin-derived adjuvant is not particularly limited as long as it does not cause serious side effects in oral administration to humans, and can be appropriately selected according to the purpose.
- mutant CT examples include a mutant LT, a mutant VT, a mutant DT, and a mutant PT.
- mutant CT, the mutant LT, the mutant VT, the mutant DT, and the mutant PT include, for example, literature (International Publication No. WO 98/042375, International Publication No. 00/037609, International Publication No. 2006/100108). , International Publication No. 1996/006627). These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
- LTB polypeptide-- There is no restriction
- the LTB polypeptide is derived from the B subunit (LTB) of LT and has a mucosal adjuvant effect, and is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose. Examples include proteins.
- the LTB is toxic in the form of the LT A subunit (LTA) and the dimer (holotoxin), whereas the LTB alone is not toxic. Nevertheless, it has been shown that the LTB protein alone functions as an adjuvant in the mucosa by oral or nasal administration (WO 99/026654).
- the LTB polypeptide can also be used as a mucosal adjuvant in the production of an oral vaccine to be administered to humans.
- the LTB polypeptide may be a commercially available product, and examples of the commercially available product include heat-stable enterotoxin B subunit (LTB) derived from Escherichia coli (catalog number: E8656).
- LTB heat-stable enterotoxin B subunit
- Synthetic Ceramide ( ⁇ GalCer) Sponge-derived agelafins were isolated by screening for natural compounds that show anti-tumor effects in an in vivo assay using gallbladder mice. Furthermore, the said synthetic ceramide ((alpha) GalCer) was acquired as a derivative
- the synthetic ceramide ( ⁇ GalCer) is also a mucosal adjuvant since it has been reported that IgA production can be induced in the nose by nasal administration.
- the synthetic ceramide ( ⁇ GalCer) may be a commercially available product, and examples of the commercially available product include ⁇ -galactosylceramide (KRN7000) manufactured by Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.
- Carrier There is no restriction
- the dosage form is not particularly limited as long as it can be administered orally.
- oral solid preparations tablettes, coated tablets, granules, powders, capsules, etc.
- oral liquid preparations internal solutions, syrups, elixirs). Agent
- the mucosal immunity stimulating agent can be orally administered to a patient.
- the mucosal immunity stimulating agent activates cellular immunity specific to the antigen administered before, after or simultaneously with the mucosa of the patient.
- the antigen that is orally administered before, after, or simultaneously with the mucosal immunity stimulating agent is not particularly limited except that it is a peptide derived from a virus or a bacterium and usable as a vaccine.
- the said antigen may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
- HPV-related cancers such as cervical cancer
- HPV-derived polypeptide a polypeptide derived from HPV (HPV-derived polypeptide) is preferred as an antigen.
- HPV-derived polypeptide is not particularly limited as long as it has antigenicity, and can be appropriately selected according to the purpose.
- the full-length HPV-derived protein may be used.
- the HPV-derived polypeptide may have a mutation that deletes, substitutes or adds 1 to several amino acids.
- the said HPV origin polypeptide may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
- a manufacturing method for using the said HPV origin polypeptide as a vaccine there is no restriction
- the bacterium used for the host is not particularly limited and can be selected according to the purpose. Examples thereof include yeast, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and lactic acid bacteria. Lactic acid bacteria are preferable, and among the lactic acid bacteria, Lactobacillus genus is more preferable.
- Lactobacillus casei is particularly preferable in that the ability to induce helper T cell type 1 (Th1) cells has been confirmed.
- An expression vector suitable for expression in the host bacterium can be appropriately selected.
- the host bacterium can be transformed with an expression vector (HPV-derived polypeptide expression vector) containing a nucleic acid encoding the HPV-derived polypeptide by a transformation method appropriately selected according to the purpose.
- the HPV-derived polypeptide can be expressed or secreted outside the cell surface of the host bacterium by appropriately selecting the expression vector.
- HPV origin polypeptide expression vector HPV origin polypeptide expression host bacteria
- the HPV-derived polypeptide polypeptide may be purified from the culture of the HPV-derived polypeptide-expressing host bacterium after culture, but the HPV-derived polypeptide-expressing host bacterium is used as it is as a vaccine. You can also When the HPV-derived polypeptide-expressing host bacterium is used as a vaccine as it is, it may be killed by heat-treating the cells according to the purpose. After the killed HPV-derived polypeptide-expressing host bacterium is recovered from the medium, it can be used as a vaccine after being dried and powdered. The dried and powdered product can be stored at a low temperature until use. Moreover, what added the said HPV origin polypeptide to the powder which killed Lactobacillus casei can also be used as a vaccine.
- HPV E7 polypeptide-- As the HPV-derived polypeptide, the HPV E7 polypeptide is preferred. There is no restriction
- HPV E7 polypeptide only needs to have antigenicity, and may be, for example, a full-length E7 protein.
- mutant E7 polypeptides derived from mutant E7 may be used as the E7 polypeptide.
- the mutant E7 polypeptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
- the mutant E7 polypeptide may be bound to Rb protein by deleting, substituting or adding one to several amino acids. Examples include those that have lost their sex.
- the mutant E7 polypeptide may be used alone or in combination of two or more.
- E7 protein binding to Rb protein corresponding to 21st Asp, 24th Cys and 26th Glu in wild type E7 protein (SEQ ID NO: 1) of HPV16 Those in which the amino acid residue involved in is substituted with another amino acid residue are preferred.
- HPV16 wild-type E7 protein SEQ ID NO: 1, wherein the 21st Asp, 24th Cys and 26th Glu are all substituted with Gly
- the mucosal immunity stimulating agent of the present invention enhances specific immunity, particularly cellular immunity against the vaccine when orally administered together with a vaccine such as viral antigen or bacterial antigen that is orally administered as an immunogen. To do.
- the oral pharmaceutical composition for the treatment of HPV infection of the present invention comprises at least HPV E7 polypeptide and a traditional Chinese medicine (immunity-enhancing Chinese medicine) having a nourishing tonic action (ie, an immune enhancing effect), which is appropriately selected as necessary. Contains other ingredients.
- HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV39, HPV45, HPV51 which belongs to the high risk group regarding cancer.
- those derived from E7 of at least one of HPV16 and HP18 are more preferable, and those derived from E7 of HPV16 are particularly preferable.
- HPV E7 polypeptide only needs to have antigenicity, and may be, for example, a full-length E7 protein.
- mutant E7 polypeptides derived from mutant E7 may be used as the E7 polypeptide.
- the mutant E7 polypeptide is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
- the mutant E7 polypeptide may be bound to Rb protein by deleting, substituting or adding one to several amino acids. Examples include those that have lost their sex.
- the mutant E7 polypeptide may be used alone or in combination of two or more.
- E7 protein binding to Rb protein corresponding to 21st Asp, 24th Cys and 26th Glu in wild type E7 protein (SEQ ID NO: 1) of HPV16 Those in which the amino acid residue involved in is substituted with another amino acid residue are preferred.
- HPV16 wild-type E7 protein SEQ ID NO: 1, wherein the 21st Asp, 24th Cys and 26th Glu are all substituted with Gly
- the manufacturing method etc. which use a chemical synthesis or a gene recombination technique are mentioned.
- these production methods a production method by gene recombination using a transformed bacterium is preferable in terms of cost.
- the bacterium used for the host is not particularly limited and can be selected according to the purpose. Examples thereof include yeast, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and lactic acid bacteria. Lactic acid bacteria are preferable, and among the lactic acid bacteria, Lactobacillus genus is more preferable.
- Lactobacillus casei is particularly preferable in that the ability to induce helper T cell type 1 (Th1) cells has been confirmed.
- An expression vector suitable for expression in the host bacterium can be appropriately selected.
- the host bacterium can be transformed with an expression vector containing a nucleic acid encoding the E7 polypeptide (E7 expression vector) by a transformation method appropriately selected according to the purpose.
- the E7 polypeptide can be expressed or secreted extracellularly on the cell surface or in the cell of the host bacterium by appropriately selecting the expression vector.
- a method for culturing a host bacterium transformed with the E7 expression vector (E7 expression host bacterium) is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
- the E7 polypeptide may be purified from the culture of the E7-expressing host bacterium after culturing, but the E7-expressing host bacterium may be used as it is as a vaccine.
- the E7-expressing host bacterium When the E7-expressing host bacterium is used as a vaccine as it is, it may be killed by heat-treating the cell body according to the purpose. After the dead E7-expressing host bacteria are recovered from the medium, the dried and powdered bacteria can be used as a vaccine. The dried and powdered product can be stored at a low temperature until use.
- what added the said E7 polypeptide to the powder which killed Lactobacillus casei can also be used as a vaccine.
- the other components are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose within a range not impairing the effects of the present invention.
- examples thereof include a mucosal adjuvant and a pharmaceutically acceptable carrier. .
- mucosal adjuvant >> there is no restriction
- those that further enhance oral vaccine-specific humoral immunity and cellular immunity such as the E7 polypeptide of the HPV in cooperation with the Juzentaihoto and the Hochuekkito are preferred.
- examples include bacterial toxins, synthetic ceramides ( ⁇ GalCer), CpG oligonucleotides, SP-C (Surfacten), SP-B, IFN- ⁇ (wild type or mutant), double stranded RNA and activity amplified TNF mutants. They may be used alone or in combination of two or more.
- Bacterial toxin-derived adjuvants are preferred in that they are frequently used as mucosal adjuvants.
- Synthetic ceramide ( ⁇ GalCer), CpG oligonucleotide, SP-C (Surfacten), SP-B, IFN- ⁇ (wild type or mutant type), double-stranded RNA and activity amplification type in that it is not derived from a bacterial toxin Adjuvants such as TNF mutants are preferred, and among them, the synthetic ceramide ( ⁇ GalCer) is more preferred in that the adjuvant effect on humans has been confirmed.
- the bacterial toxin and the synthetic ceramide ( ⁇ GalCer) are preferable in that an adjuvant effect on a plurality of antigens is known.
- the mucosal adjuvant is not an essential component, but when added, the effect of the oral pharmaceutical composition for treating HPV infection can be remarkably enhanced. And preferably contained.
- the bacterial toxin-derived adjuvant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include polypeptides derived from CT, LT, VT, DT, PT and the like. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together. Among these, a mutant bacterial toxin-derived adjuvant into which a mutation has been introduced in advance so as not to cause serious side effects upon oral administration to humans is preferable.
- mutant bacterial toxin-derived adjuvant-- The mutant bacterial toxin-derived adjuvant is not particularly limited as long as it does not cause serious side effects in oral administration to humans, and can be appropriately selected according to the purpose.
- mutant CT Examples include a mutant LT, a mutant VT, a mutant DT, and a mutant PT.
- mutant CT, the mutant LT, the mutant VT, the mutant DT, and the mutant PT include, for example, literature (International Publication No. WO 98/042375, International Publication No. 00/037609, International Publication No. 2006/100108). , International Publication No. 1996/006627). These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
- LTB polypeptide There is no restriction
- the LTB polypeptide is as described above.
- Carrier >> There is no restriction
- the dosage form is not particularly limited except that it can be administered orally.
- oral solid preparations tablettes, coated tablets, granules, powders, capsules, etc.
- oral liquid preparations internal solutions, syrups, elixirs) Etc.
- the oral pharmaceutical composition for treating HPV infection activates cellular immunity specific to HPV E7 polypeptide (HPV vaccine) in mucosa of patients such as cervical cancer precancerous lesion patients and cervical cancer patients Can be used to let
- Example 1 ⁇ Mouse immunity for in vivo analysis> Oral immunization of mice with the LacE7 formulation Adachi et al. , Vaccine, 2010, vol. 28, pp. This was carried out according to the method described in 2810-2817. At that time, if necessary, Juzen Taiyoto (hereinafter referred to as “JTT”) and Hochuekkito (hereinafter referred to as “HET”), and if necessary, LTB polypeptide or synthetic ceramide ( ⁇ GalCer). Mice were orally administered.
- JTT Juzen Taiyoto
- HET Hochuekkito
- the LacE7 preparation was produced according to a known method (Poo H. et al., Int. J. Immunol., 2006, vol. 119, pp. 1702-1709). Briefly, HPV16-derived mutant E7 protein (consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having three amino acid residues in the Rb binding site of wild-type E7 protein substituted) is used as a helper T cell 1 It was introduced into Lactobacillus casei, which has been confirmed to be capable of inducing type (Th1 cells), using an expression vector. The recombinant (LacE7) after culture was killed by heat. LacE7 purified from the medium was washed several times with distilled water, dried and powdered (LacE7 preparation), and stored at 4 ° C. until use. The LacE7 formulation was insoluble in aqueous solvents.
- LTB polypeptide oral administration to mice >> The LTB polypeptide was orally administered together with the LacE7 formulation at 10 ⁇ g per animal on the third day of each course.
- LTB polypeptide a heat-stable enterotoxin B subunit (LTB) derived from Escherichia coli (catalog number: E8656) from Sigma-Aldrich was used.
- ⁇ GalCer Synthetic ceramide ( ⁇ GalCer) was orally administered together with the LacE7 preparation at 2 ⁇ g per animal on the third day of each course.
- synthetic ceramide ( ⁇ GalCer) ⁇ -galactosylceramide (KRN7000) manufactured by Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. was used.
- mice inoculated with the LacE7 preparation were dissected and the intestinal epithelium was recovered as a mucosal tissue.
- the intestinal epithelium was fixed in phosphate buffered saline (PBS) containing 4% paraformaldehyde for 1 hour at room temperature, then rinsed with PBS, and OCT compound (Tissue-Tek (registered trademark), Sakura Finetek, Zoeterwood). (Netherlands), samples were embedded and frozen and stored at -80 ° C.
- Cryostat Cryostat (CM1510S, Leica) was used to prepare frozen sections (thickness 6 ⁇ m) and placed on a slide glass for immunohistochemical analysis.
- tissue debris was removed with a BD Falcon (trademark) cell strainer (BD Biosciences, USA), and then a 15 mL tube overlaid with 70% by mass and 40% by mass of Percoll PLUS was used. Discontinuous concentration gradient centrifugation was performed. About 10 7 to 10 8 cells are overlaid and centrifuged at 600 ⁇ g for 20 minutes at room temperature, so that mucosal lymphocytes (95% survival rate) are present at the interface of 70% and 40% Percoll PLUS. ) Gathered. Spleen cells were obtained by slowly tearing the spleen in PBS. Lumpy debris was removed by centrifugation. About 5 ⁇ 10 6 to 10 ⁇ 10 6 mucosal lymphocytes and about 10 7 spleen cells were obtained from each mouse, respectively.
- ⁇ ELISPOT assay> A 50 ⁇ L suspension of intestinal mucosal lymphocytes or spleen cells (5 ⁇ 10 6 cells / mL) was incubated with antigen presenting cells at 37 ° C. for 24 hours. 50 ⁇ L of spleen cells (5 ⁇ 10 6 cells / mL) were treated with mitomycin and washed 3 times with PBS.
- the amino acid sequence from the 49th to the 57th amino acid sequence of the E7 protein reported as the CTL epitope in the E7 protein (SEQ ID NO: 1) of HPV16
- anti-mouse IFN- ⁇ antibody for example, 10 ⁇ L of synthetic peptide (1 ⁇ g / mL), mitogen (phorbol myristate acetate 40 ng / mL + ionomycin 4 ⁇ g / mL), or medium alone (control) (for example, , ELIIP plate, Millipore Corporation, USA).
- the number of IFN- ⁇ positive spots on the 96-well plate was analyzed.
- a computer-aided video imaging analysis system of KS ELISPOT Carl Zeiss Vision, Germany
- IgG in serum and IgA in intestinal lavage fluid were quantified using an ELISA quantification set (Betyl Laboratories, USA) for mouse IgG or mouse IgA.
- the amounts of IgG and IgA specific for the HPV16 E7 protein are quantified using the His tag-added E7 protein as an antigen.
- the method followed the manufacturer protocol. Briefly, a 96-well plate (eg, Immunoplate, Nunk, Denmark) is 100 ng / well His tag-E7 (suspended in a coating buffer of 50 mM carbonate-bicarbonate pH 9.6) at 4 ° C. Coat by putting it overnight.
- cleaning liquid diluted 2 times was applied with respect to the said plate which performed the blocking process.
- a peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody or anti-mouse IgA antibody was added to each well as a secondary antibody (diluted 1: 60,000 times and 1: 20,000 times, respectively) and incubated at 37 ° C. for 1 hour. Absorbance was measured at 450 nm after washing and color treatment. Serum and intestinal lavage fluid from non-immunized mice served as negative controls.
- the anti-E7 antibody titer was shown as anti-E7 IgG / total IgG or anti-E7 IgA / total IgA (relative value).
- cytokine concentration in the intestinal lavage fluid was measured using a mouse Th1 / Th2 ELISA Ready SET Go (registered trademark) Kit (BD Biosciences, USA) after pooling five mice.
- IFN- ⁇ was used as a cytokine expressed by Th1 cells
- IL-4 was used as a cytokine expressed by Th2 cells. The same measurement was repeated at least 3 times for each sample.
- ELISPOT and ELISA data are shown as mean ⁇ standard deviation. These values or relative values were compared between immunized groups (each group was 5 mice). At that time, a two-sided Student t-test was performed. A p value of ⁇ 0.05 was considered significant.
- E7 protein-specific cytotoxic T cells E7-specific CTL
- T-Select mouse MHC Tetramer manufactured by Medical Biological Research Institute, Inc.
- the MCH and E7 peptide complex was biotinylated and tetramerized with phycoerythrin-labeled streptavidin to produce an E7-specific MHC tetramer.
- E7 peptide a synthetic peptide (1 ⁇ g / mL) consisting of the amino acid sequence from the 49th to the 57th amino acid sequence of E7 protein reported as a CTL epitope in the E7 protein of HPV16 (SEQ ID NO: 1) was used.
- an intestinal epithelium section was prepared from a mouse orally administered with LacE7, and E7 peptide recognition MHC was detected using the E7-specific MHC tetramer, or two using the E7-specific MHC tetramer and anti-CD8 antibody. Double staining was performed. Specifically, the intestinal epithelial slice sample was permeabilized with PBS containing 0.1% by weight Triton-X100 for 30 minutes, and then the sample was rinsed and permeated with PBS containing 5% by weight skim milk for 30 minutes. It was.
- E7-specific MHC tetramer obtained by diluting the E7-specific MHC tetramer (dilution ratio 1:25) and optionally 1:50 (Rat Anti-Mouse CD8a / Lyt-2 FITC (Clone 53-6.7), Beckman Coulter. , Inc.) and incubated overnight at 4 ° C.
- the E7-specific MHC tetramer and antibody were diluted with PBS containing 1% by weight skim milk and 0.1% by weight Triton X100.
- mice in each group were orally administered LacE7 alone, or LacE7 and JTT or HET.
- intestinal mucosal lymphocytes and spleen cells were collected to examine the effects of JTT and HET on mucosal and systemic immunity.
- E7-CTL epitope recognized by CD4 + and CD8 + T cells of C57BL / 6 mice. Therefore, a synthetic peptide consisting of an amino acid sequence corresponding to the E7-CTL epitope site was used in the ELISPOT assay of the type 1 T cell response to the E7 protein of HPV16.
- mice immunized with LacE7 increased the number of E7-specific IFN- ⁇ producing cells in both mucosal lymphocytes and spleen compared to mice that were not immunized.
- Oral immunization with LacE7 increased levels of E7-specific IFN- ⁇ producing cells more prominently in mucosal lymphocytes than in the spleen (approximately 1.5-fold to 2-fold).
- co-administration of LacE7 with JTT or HET markedly increased E7-specific type 1 T cell responses in the spleen (FIG. 1).
- JTT and HET the effect of enhancing humoral immunity by using as a preventive vaccine adjuvant has been suggested.
- JTT and HET enhance systemic cellular immunity, which is a new finding by the present inventors.
- the type 1 T cell response in the mucosa the remarkable effect by simultaneous oral administration of the JTT or the HET with LacE7 was not observed (FIG. 1).
- JTT and HET remarkably increase systemic and mucosal type 1 T cell responses by oral vaccine when administered simultaneously with LTB.
- the ratio of anti-E7 antibody to total IgG or total IgA represents the systemic and mucosal humoral immune response to E7 protein, respectively.
- the amount ratio of mice not immunized with LacE7 was 1, and the ratio was shown.
- the anti-E7 IgG antibody titer in the serum was increased 7 times or more.
- LBT had little effect on the anti-E7 IgG antibody titer.
- mice immunized with LacE7 the amounts of both IFN- ⁇ and IL-4 in the intestinal lavage fluid were significantly increased compared to mice that were not immunized.
- LacE7 and JTT were administered simultaneously, the amounts of both IFN- ⁇ and IL-4 were increased three-fold.
- LacE7 and HET or LTB were co-administered, no significant difference was observed from the case where LacE7 alone was administered alone.
- LTB was administered simultaneously with LacE7 and JTT or HET, the amount of IFN- ⁇ increased 6 to 8 times and the amount of IL-4 increased 3 to 4 times (FIG. 4A, FIG. 4B).
- JTT has a stronger effect on mucosal type 1 response by oral vaccine than HET.
- type 1 T cell response and type 2 T cell response induce cellular immunity and humoral immunity in the mucous membranes of JTT and HET, respectively, unlike cellular immunity and humoral immunity, respectively.
- type 1 T cell response and type 2 T cell response induce cellular immunity and humoral immunity in the mucous membranes of JTT and HET, respectively, unlike cellular immunity and humoral immunity, respectively.
- ⁇ Adjuvant effect of Chinese medicine and synthetic ceramide on mucosal immune response In the simultaneous administration of E7 protein, Chinese medicine and mucosal adjuvant, it was examined whether an increase in type 1 T cell response in the mucosa was observed even when ⁇ GalCer, which is a mucosal adjuvant that can be used clinically, was used. Therefore, ⁇ GalCer was administered simultaneously with the JTT during the LacE7 oral administration period instead of the LTB polypeptide, and the level of E7-specific type 1 T cell response was examined by ELISPOT assay.
- the level of E7-specific type 1 T cell response in mucosal lymphocytes of mice was increased by co-administration of LacE7 and LTB polypeptide compared to LacE7 alone, and further increased HET
- LacE7 and LTB polypeptide when administered simultaneously with the LacE7 and the LTB polypeptide, a tendency to increase as compared with the simultaneous administration of the LacE7 and the LTB polypeptide was observed (FIG. 5).
- ⁇ GalCer significantly increases the type 1 T cell response in the mucosa by the oral vaccine when administered simultaneously with LTB.
- E7 protein-specific cytotoxic T cells E7-specific CTL
- E7-specific CTL E7 protein-specific cytotoxic T cells
- E7 peptide-specific MHC was detected in the mucosal surface and the lamina intestinal epithelium, which is a mucosal tissue. Therefore, induction of E7-specific CTL was observed, and it was further revealed that E7-specific CTL infiltrates into mucosal tissue. This result indicates that oral administration of LacE7 induces E7-specific mucosal immunity.
- LacE7 vaccine containing either Juzentaihoto or Hochuekkito is not only a CIN3 patient, but also a cervical cancer patient, another HPV related cancer patient, and the HPV related The possibility of having a therapeutic effect on patients with precancerous lesions of cancer can be expected. Furthermore, a LacE7 vaccine containing either Juzentaihoto or Hochuekkito containing an appropriate immune adjuvant can be expected to have a superior therapeutic effect.
- the mucosal immunity activation agent of this invention is suitable for activating mucosal immunity by using together with virus vaccines and bacterial vaccines, such as HPV vaccine.
- the oral pharmaceutical composition for the treatment of HPV infection of the present invention is suitable for use as a therapeutic vaccine by administering it to a patient with HPV infection.
- a mucosal immunity stimulating agent characterized by containing a traditional Chinese medicine having a nourishing tonic and a mucosal adjuvant.
- ⁇ 3> Wild-type polypeptide or mutant polymorphism derived from cholera toxin (CT), Escherichia coli heat-labile toxin (LT), verotoxin (VT), diphtheria toxin (DT), and pertussis toxin (PT)
- CT cholera toxin
- LT Escherichia coli heat-labile toxin
- VT verotoxin
- DT diphtheria toxin
- PT pertussis toxin
- the mucosal immune activating agent according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 2>, which is at least one of a polypeptide selected from the group consisting of peptides and a synthetic ceramide ( ⁇ GalCer).
- the mucosal adjuvant is the mucosal immune stimulating agent according to ⁇ 3>, wherein the mucosal adjuvant is one of LT B subunit (LTB) polypeptide and synthetic ceramide ( ⁇ GalCer).
- LTB LT B subunit
- ⁇ GalCer synthetic ceramide
- ⁇ 5> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein when administered orally, the cellular mucosa of a patient activates cellular immunity specific to an antigen that is orally administered before, after, or simultaneously. It is a mucosal immunostimulator.
- the antigen is a mucosal immune activating agent according to ⁇ 5>, which is a polypeptide derived from human papillomavirus (HPV).
- the polypeptide derived from HPV is the mucosal immunity stimulating agent according to the above ⁇ 6>, which has a mutation that deletes, substitutes or adds 1 to several amino acids.
- the HPV-derived polypeptide is contained in a powder obtained by killing a recombinant Lactobacillus casei in which an HPV-derived polypeptide is expressed, or a powder obtained by killing Lactobacillus casei.
- the mucosal immune activating agent according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 7>, which is added.
- HPV-derived polypeptide is a mucosal immune activating agent according to any one of ⁇ 6> to ⁇ 8>, wherein the polypeptide is an HPV E7 polypeptide.
- HPV E7 polypeptide is a mucosal immune activating agent according to ⁇ 9> derived from HPV16.
- HPV E7 polypeptide is the mucosal immune activating agent according to ⁇ 10>, which comprises the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- An oral pharmaceutical composition for treating HPV infection comprising an E7 polypeptide of HPV and a Chinese herbal medicine having a nourishing tonic.
- the E7 polypeptide of HPV is an oral pharmaceutical composition for treating HPV infection according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 14> derived from HPV16.
- HPV E7 polypeptide has a mutation that deletes, substitutes, or adds 1 to several amino acids, and the oral pharmaceutical composition for treating HPV infection according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 15> It is.
- the E7 polypeptide of HPV is an oral pharmaceutical composition for the treatment of HPV infection according to ⁇ 16>, comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
- the HPV E7 polypeptide is contained in a powder obtained by killing a recombinant Lactobacillus casei expressing the HPV E7 polypeptide, or a powder obtained by killing Lactobacillus casei.
- the oral pharmaceutical composition for treating HPV infection according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 17> which is added.
- ⁇ 19> The oral pharmaceutical composition for treating HPV infection according to any one of ⁇ 12> to ⁇ 18>, wherein cellular immunity specific to HPV E7 polypeptide is activated in the mucosa of a patient.
- the patient is the oral pharmaceutical composition for treating HPV infection according to ⁇ 19>, wherein the patient is any one of a cervical cancer precancerous lesion patient and a cervical cancer patient.
- the mucosal adjuvant is at least one of a polypeptide selected from the group consisting of a wild-type polypeptide or a mutant polypeptide derived from CT, LT, VT, DT, and PT, and a synthetic ceramide ( ⁇ GalCer).
- the mucosal adjuvant is the oral pharmaceutical composition for treating HPV infection according to the above ⁇ 21>, wherein the mucosal adjuvant is one of LTB polypeptide and synthetic ceramide ( ⁇ GalCer).
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Botany (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
Abstract
粘膜免疫賦活化剤は、滋養強壮作用を有する漢方薬及び粘膜アジュバントを含有する。HPV感染症治療用経口医薬組成物は、HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを少なくとも含む。
Description
本発明は、粘膜免疫賦活化剤及びHPV感染症治療用経口医薬組成物に関し、更に詳しくは、粘膜アジュバントと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有する粘膜免疫賦活化剤、並びにHPVワクチンと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有するHPV感染症治療用経口医薬組成物に関する。
ヒトパピローマウイルス(HPV)はDNAウイルスであって、現在まで100種類以上の異なる型が報告されている。前記HPVは皮膚(例えばHPV-1、HPV-2)や粘膜表面(例えばHPV-6、HPV-11)に感染することで、数ヶ月から数年単位で存在する良性腫瘍(イボ)を形成する。
更に、前記HPVの一部(例えばHPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33)は、粘膜に長期間感染することで、悪性腫瘍を引き起こす。
更に、前記HPVの一部(例えばHPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33)は、粘膜に長期間感染することで、悪性腫瘍を引き起こす。
女性特有の癌として乳癌に次いで罹患率が高い子宮頚癌については、そのほぼ100%が、前記HPVの生殖器への長期間感染により発症するものであり、世界で50万人、日本でも1万5千人の新規患者が毎年報告されている。
子宮頚癌による年間の死亡者数は、世界で27万人、日本でも3,500人に達する。
理論的には、前記HPVの感染の全てを未然に防ぐことができれば、前記子宮頚癌は完全に根絶することができる。
子宮頚癌による年間の死亡者数は、世界で27万人、日本でも3,500人に達する。
理論的には、前記HPVの感染の全てを未然に防ぐことができれば、前記子宮頚癌は完全に根絶することができる。
前記HPVの感染は、前記子宮頚癌以外にも、外陰癌、肛門癌、口腔癌、腟癌、陰茎癌、咽頭癌、そして尖圭コンジローマ(性器イボ)にも関連していることが明らかになっており、これらの癌及び性感染症の予防のために、前記HPVの感染に対する予防ワクチンは有効であると考えられる。
前記HPVの中でも、特にHPV16とHPV18が、日本人女性の前記子宮頚癌の発症原因の約65%、特に20代では子宮頚癌の発症原因の約90%を占めている。
前記HPV16と前記HPV18は、前記外陰癌に先行してみられる外陰上皮内腫瘍の高度病変においても発症原因の50%弱を占め、更に前記膣癌に進行する可能性のある膣上皮内腫瘍の発症の85%にも関連していることが知られている。
前記HPV16と前記HPV18は、前記外陰癌に先行してみられる外陰上皮内腫瘍の高度病変においても発症原因の50%弱を占め、更に前記膣癌に進行する可能性のある膣上皮内腫瘍の発症の85%にも関連していることが知られている。
今日、HPV感染予防ワクチン、特に前記子宮頚癌に対する予防ワクチンとして、前記HPV16と前記HPV18に特異的な2価ワクチン(商標名:サーバリックス)(特許文献1参照)と、前記HPV16、前記HPV18に加え、尖圭コンジローマの発症原因の約90%を占めるHPV6及びHPV11にも特異的な4価ワクチン(商標名:ガーダシル)(特許文献2参照)が使用されている。これら2つのワクチンのいずれも、前記HPV由来のL1たんぱく質ウイルス様粒子を含んでいる。
しかしながら、より広範囲の前記HPVに対する予防ワクチンが開発され、それが世界中の前記HPVに未感染の思春期女性に100%適用されない限り、前記子宮頚癌及びその前癌病変をもつ患者がいなくなることは期待できない。そのため、現在においても、子宮頚部細胞診のコストだけでも膨大なものとなっている。
インビトロにおいて、前記HPVのE7タンパク質はRbタンパク質との結合能を有し、前記Rbタンパク質と結合することで、転写因子E2Fと前記Rbタンパク質の結合を阻害する。その結果、前記Rbタンパク質から遊離した状態にある前記E2Fは活性化され、細胞の細胞周期をG1期からS期へ移行させる。
一方、前記HPVのもうひとつのタンパク質、E6タンパク質は、p53タンパク質と結合してユビキチン化を促進することで、前記p53タンパク質は分解される。
これらのことから、前記E7タンパク質及び前記E6タンパク質の機能により、前記HPVに感染した細胞は細胞周期チェックポイントの機構や前記p53タンパク質が制御しているアポトーシスを回避し、癌化に至ることが予想された。
一方、前記HPVのもうひとつのタンパク質、E6タンパク質は、p53タンパク質と結合してユビキチン化を促進することで、前記p53タンパク質は分解される。
これらのことから、前記E7タンパク質及び前記E6タンパク質の機能により、前記HPVに感染した細胞は細胞周期チェックポイントの機構や前記p53タンパク質が制御しているアポトーシスを回避し、癌化に至ることが予想された。
実際に、子宮頚癌細胞においては、HPVのE7及びE6のmRNAが常に高発現している。
また、子宮頚癌細胞におけるHPVのE6、E7の発現をアンチセンスなどで抑制すると、前記子宮頚癌細胞の増殖活性は抑制される。
更に、アンチセンスなどでE6及びE7の発現を抑制した前記子宮頚癌細胞は、マウスに移植しても、その造腫瘍能を失っていることも示されている。
以上のことから、前記HPVのE6及びE7が前記子宮頚癌、及びその他のHPV関連癌の病態や発癌過程に機能的に深く関与することは明らかである。
また、子宮頚癌細胞におけるHPVのE6、E7の発現をアンチセンスなどで抑制すると、前記子宮頚癌細胞の増殖活性は抑制される。
更に、アンチセンスなどでE6及びE7の発現を抑制した前記子宮頚癌細胞は、マウスに移植しても、その造腫瘍能を失っていることも示されている。
以上のことから、前記HPVのE6及びE7が前記子宮頚癌、及びその他のHPV関連癌の病態や発癌過程に機能的に深く関与することは明らかである。
前記HPV感染による前記子宮頚癌の前癌病変である子宮頚部上皮内腫瘍(Cervical intraepithelial neoplasia;CIN)の多くが子宮の移行帯と呼ばれる部分に発生する。前記移行帯において、子宮膣部(子宮頚部の下半分、膣に突き出している部分)にびらんが生じたときの修復時には扁平上皮化生(膣内の予備細胞の扁平上皮化)が起こる。その際、生じた上皮の基底細胞へのHPV感染が子宮頚癌の起源であると考えられている。
上皮の基底細胞に感染した、前記HPVのDNAは細胞1個あたり数十から百コピー程度であって、前記E6、前記E7の発現は少ない。
通常の前記HPVの感染初期における前記E6、前記E7の発現が低い状態において、前記子宮頚癌の発症の高リスク群に属する前記HPVを含め、前記HPVの多くは潜伏状態となり、前記HPVの増殖は止まっている。
子宮頚部HPV感染のうち、浸潤癌に進行するのはそのうちの0.13%以下であるという報告が米国疾病予防管理センターによってなされている。
上皮の基底細胞に感染した、前記HPVのDNAは細胞1個あたり数十から百コピー程度であって、前記E6、前記E7の発現は少ない。
通常の前記HPVの感染初期における前記E6、前記E7の発現が低い状態において、前記子宮頚癌の発症の高リスク群に属する前記HPVを含め、前記HPVの多くは潜伏状態となり、前記HPVの増殖は止まっている。
子宮頚部HPV感染のうち、浸潤癌に進行するのはそのうちの0.13%以下であるという報告が米国疾病予防管理センターによってなされている。
一方、前記子宮頚癌の発生過程では、基底細胞への前記HPVの増殖が持続状態に至り、低レベルであった前記E6と前記E7の発現が持続的に亢進されるという変化が生じると考えられる。
前記E6と前記E7の発現は、CIN1(軽度異形成)では非常に低いのに対して、CIN2(中度異形成)とCIN3(高度異形成)では高発現が認められることから、前記E6と前記E7の発現の持続的な亢進は前記CIN1の段階で起こると考えられる。
前記E6と前記E7の発現は、CIN1(軽度異形成)では非常に低いのに対して、CIN2(中度異形成)とCIN3(高度異形成)では高発現が認められることから、前記E6と前記E7の発現の持続的な亢進は前記CIN1の段階で起こると考えられる。
前記HPVの感染が制御されるのは、宿主の免疫応答によると考えられ、実際に、HIV感染者や臓器移植患者など、免疫応答が低下している女性では前記子宮頚癌の発症率が高いことも報告されている。
HPVなどのウイルスに対する宿主の免疫応答は、NK細胞やマクロファージなどの細胞群やインターフェロンが機能することで、感染直後より作動する自然免疫と呼ばれる非特異的な機構と、それとは別のウイルス抗原特異的な免疫応答である獲得免疫と呼ばれる機構がある。
前記獲得免疫は、感染後数日してから働く免疫機構であって、液性免疫と細胞性免疫に分けられる。
HPVの感染排除に関する免疫応答は、前記NK細胞と前記細胞性免疫に関わる細胞障害性T細胞(CTL)による細胞性の応答が主体であると考えられている。
前記獲得免疫は、感染後数日してから働く免疫機構であって、液性免疫と細胞性免疫に分けられる。
HPVの感染排除に関する免疫応答は、前記NK細胞と前記細胞性免疫に関わる細胞障害性T細胞(CTL)による細胞性の応答が主体であると考えられている。
前記NK細胞は、前記HPVの感染の初期に作動する免疫細胞である。
一方、HPV特異的細胞免疫に関しては、前記HPV16の前記E7タンパク質に対する遅延型アレルギー反応がCIN退縮と相関すること、前記E7に特異的なヘルパーT細胞が前記HPVの感染制御に重要な機能を担っていることが示されている(非特許文献1参照)。
一方、HPV特異的細胞免疫に関しては、前記HPV16の前記E7タンパク質に対する遅延型アレルギー反応がCIN退縮と相関すること、前記E7に特異的なヘルパーT細胞が前記HPVの感染制御に重要な機能を担っていることが示されている(非特許文献1参照)。
既に述べてきたように、前記HPVの前記E6タンパク質と前記E7タンパク質、その中でも特に前記E7タンパク質が、HPV関連癌に対する治療用ワクチンの開発においてとても魅力的なターゲットであると考えられる。
これまでにも前記HPVの前記E7タンパク質を抗原とした前記治療用ワクチンが既にいくつか開発されているものの、それらが患者子宮頚部の前癌病変(前記CIN)や癌細胞を排除することまでは示されてはおらず、実際に治療効果をもったワクチンの開発が強く望まれていた(非特許文献2~4参照)。
これまでにも前記HPVの前記E7タンパク質を抗原とした前記治療用ワクチンが既にいくつか開発されているものの、それらが患者子宮頚部の前癌病変(前記CIN)や癌細胞を排除することまでは示されてはおらず、実際に治療効果をもったワクチンの開発が強く望まれていた(非特許文献2~4参照)。
最近、本発明者らは、前記HPV16の前記E7タンパク質において、前記Rbタンパク質との結合に関与する第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluを全てGlyに置換した変異型E7タンパク質を、Lactobacillus caseiに発現させ、熱処理により死菌化したものを乾燥、粉末化したワクチン(LacE7)をマウスに経口投与することで、脾臓だけでなく、粘膜においてもE7特異的細胞性免疫応答を誘導できることを示した(非特許文献5参照)。
更に、本発明者らは、製剤化LacE7に関して、前記子宮頚癌の前記前癌病変(CIN)に対する探索的臨床試験を実施し、安全性の評価と病理学的有効性を検討した。
また、子宮頚部リンパ球、末梢血中のE7特異的細胞性免疫の誘導についても解析した。
また、子宮頚部リンパ球、末梢血中のE7特異的細胞性免疫の誘導についても解析した。
HPV16陽性の前癌病変(CIN3)患者7人で、1カプセル(250mg)1日1回5日間経口投与を1クールとして、1カプセル/日投与群(n=1)、2カプセル/日投与群(n=3)、4カプセル/日投与群(n=3)で、第1、2、4、8週の合計4クール、LacE7製剤の投与を実施した。
その結果、前記1カプセル/日投与群及び前記2カプセル/日投与群は試験終了後に円錐切除となったが、前記4カプセル/日投与群は、前記CIN3が完全消失し、その後の憎悪も認められなかった。
その結果、前記1カプセル/日投与群及び前記2カプセル/日投与群は試験終了後に円錐切除となったが、前記4カプセル/日投与群は、前記CIN3が完全消失し、その後の憎悪も認められなかった。
免疫学的解析では、前記子宮頚部リンパ球中に前記HPV16に対する前記E7特異的細胞性免疫の誘導(E7特異的IFN-γ産生細胞、E7特異的グランザイムB産生細胞の誘導)が認められた。
病理学的にも、投与前の前記前癌病変にみられなかった、前記前癌病変内への著明なリンパ球の浸潤が認められた。
したがって、本発明者らが開発した前記LacE7は、前記前癌病変(CIN3)患者に対する初の治療ワクチンとなりうることが期待されている。
病理学的にも、投与前の前記前癌病変にみられなかった、前記前癌病変内への著明なリンパ球の浸潤が認められた。
したがって、本発明者らが開発した前記LacE7は、前記前癌病変(CIN3)患者に対する初の治療ワクチンとなりうることが期待されている。
しかしながら、前記前癌病変患者だけでなく、子宮頚癌患者に対しても十分な臨床効果を持つ治療用のHPVワクチンとして、未だ満足なものが見出させていないのが現状である。
即ち、依然として、子宮頚癌患者に対しても十分な臨床効果を持つ治療用HPVワクチンが提供されていないという問題がある。
また、より少量、短期間の前記LacE7の経口投与や、前記LacE7以外のHPVワクチンの経口投与によっても、効果的に前記HPVに対する獲得免疫を誘導する方法、特に粘膜でのHPV特異的細胞性免疫誘導方法が未開発であるという問題もある。
即ち、依然として、子宮頚癌患者に対しても十分な臨床効果を持つ治療用HPVワクチンが提供されていないという問題がある。
また、より少量、短期間の前記LacE7の経口投与や、前記LacE7以外のHPVワクチンの経口投与によっても、効果的に前記HPVに対する獲得免疫を誘導する方法、特に粘膜でのHPV特異的細胞性免疫誘導方法が未開発であるという問題もある。
前記HPVやHIVなどのウイルスを含む多くの病原体は、粘膜を介して宿主に侵入し感染が成立することから、局所粘膜に存在する粘膜免疫系が宿主の感染防御機構において重要な役割を果たしていると考えられる。
前記局所粘膜における液性免疫に関しては、分泌型のIgA抗体が重要な役割を果たしている。
前記IgA抗体は、B細胞やT細胞、マクロファージから分泌される、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、インターロイキン(IL)-4やIL-6などのサイトカインによってその産生が制御されており、それら液性因子の機能が前記粘膜における前記液性免疫の維持・調節に重要である。
前記局所粘膜における液性免疫に関しては、分泌型のIgA抗体が重要な役割を果たしている。
前記IgA抗体は、B細胞やT細胞、マクロファージから分泌される、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、インターロイキン(IL)-4やIL-6などのサイトカインによってその産生が制御されており、それら液性因子の機能が前記粘膜における前記液性免疫の維持・調節に重要である。
近年、前記局所粘膜における免疫として、細胞障害性T細胞(CTL)を中心とした細胞性免疫応答が、消化管や生殖器の粘膜において誘導されることが明らかにされている。抗原特異的な前記CTLの活性化にはインターフェロン(IFN)-γなどが関与している。
漢方薬である十全大補湯と補中益気湯、及び粘膜アジュバントは、粘膜において獲得免疫の一つである液性免疫を賦活化する粘膜免疫賦活化剤として既に知られている。
漢方薬(和漢生薬)の中には、漢方医学における「傷寒論」にあるように感染症の治療にも用いられる一群の生薬がある。
現代において、前記漢方薬は風邪やインフルエンザ、ウイルス性肝炎、ヘリコバクターピロリ感染などの各種感染症や感染症関連疾患の治療に使用され、有効性も示されている。その作用は、原因ウイルスや原因細菌に対する直接的な作用だけでなく、免疫調節作用を通じた生態防御機構の増強によることが多い。
現代において、前記漢方薬は風邪やインフルエンザ、ウイルス性肝炎、ヘリコバクターピロリ感染などの各種感染症や感染症関連疾患の治療に使用され、有効性も示されている。その作用は、原因ウイルスや原因細菌に対する直接的な作用だけでなく、免疫調節作用を通じた生態防御機構の増強によることが多い。
現代医療においては、細菌感染症の治療には抗生物質が用いられ、ウイルス感染症の予防にはワクチンが一般的に用いられる。これに対して、前記漢方薬の一部は宿主側の免疫能力を高めることによる感染防御効果をもつことが知られている。
例えばインフルエンザ感染において、葛根湯はインフルエンザウイルスに対する直接的な増殖抑制効果は認められないが、その代わりに、解熱効果や肺炎の改善効果、死亡率の低下などの治療効果を奏する。
マウスに前記インフルエンザウイルスを経鼻感染させると血清中のIFNの量が上昇し、次いでIL-1αの量が上昇し、脳内シクロオキシゲナーゼ活性が上昇することで、プロスタグランジンE2の量が上昇して発熱する。
アスピリンが前記シクロオキシゲナーゼを阻害するのに対して、前記葛根湯は前記IFNにより誘導される前記IL-1αの産生を抑制することで解熱効果を呈する。
マウスに前記インフルエンザウイルスを経鼻感染させると血清中のIFNの量が上昇し、次いでIL-1αの量が上昇し、脳内シクロオキシゲナーゼ活性が上昇することで、プロスタグランジンE2の量が上昇して発熱する。
アスピリンが前記シクロオキシゲナーゼを阻害するのに対して、前記葛根湯は前記IFNにより誘導される前記IL-1αの産生を抑制することで解熱効果を呈する。
十全大補湯や補中益気湯は、術後、病後、産後、慢性疾患による消耗、疲労の蓄積、夏痩せなどで衰弱した際の全身倦怠感、食欲不振などの治療に用いられる漢方薬である。前記十全大補湯が貧血などにも用いられるのに対して、前記補中益気湯は風邪が長引いたとき、虚弱な人が風邪を引いたときの微熱、咳、寝汗、動悸などの症状の改善や体質の改善に用いられる。
前記十全大補湯や前記補中益気湯は、いずれも腸管や気管の粘膜においてB細胞による液性免疫機構を活性化することも示されている(特許文献3、及び非特許文献6参照)。即ち、十全大補湯及び補中益気湯は、粘膜の液性免疫を賦活化する粘膜免疫賦活化剤であることが明らかになっている。
前記十全大補湯や前記補中益気湯は、いずれも腸管や気管の粘膜においてB細胞による液性免疫機構を活性化することも示されている(特許文献3、及び非特許文献6参照)。即ち、十全大補湯及び補中益気湯は、粘膜の液性免疫を賦活化する粘膜免疫賦活化剤であることが明らかになっている。
その他、小紫胡湯や小青竜湯なども感染症の治療や予防に使用されるが、これらも宿主の免疫機構を活性化させると考えられている。
免疫学において一般的にアジュバントと呼ばれるものは、抗原とともに注射されることによって、抗原性の増強(免疫促進)に使用される試薬であって、前記抗原を不溶化することで長くとどめて、前記抗原を徐々に長期間遊離させることや、前記抗原を投与した部分に炎症を起こさせることで、マクロファージが集まり、前記抗原が貪食されやすくなることで、抗原提示を促進することや、免疫細胞を活性化させることなどが考えられているが、それらの作用機構は様々であって不明なものも多い。
前記葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などのいわゆる滋養強壮作用を有する漢方薬も、液性免疫の増強効果を有する点において、広義のアジュバントであるといえる。
前記葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などのいわゆる滋養強壮作用を有する漢方薬も、液性免疫の増強効果を有する点において、広義のアジュバントであるといえる。
粘膜アジュバントとしてよく知られているのは、細菌由来のコレラ毒素(cholera toxin:CT)と毒素原性大腸菌の易熱性毒素(heat-labile enterotoxin:LT)、腸管出血性大腸菌のベロ毒素(verotoxin:VT)、ジフテリア毒素(diphteria toxin:DT)、百日咳毒素(pertussis toxin:PT)で、それらは免疫原性が強く実験上は最も効果的なアジュバントである。
細菌由来の前記粘膜アジュバントはいずれも、粘膜及び全身において優れたアジュバント効果を発揮するものの、視神経麻痺などの重篤な副作用を呈することが明らかになっている為、そのままヒトの治療に用いることはできない。
そこで、最近になって、前記副作用を回避できる変異型粘膜アジュバントが新たに開発され、利用可能になっている。
そこで、最近になって、前記副作用を回避できる変異型粘膜アジュバントが新たに開発され、利用可能になっている。
また、細菌由来の野生型と変異型の前記粘膜アジュバント以外にも、副作用がなく、臨床で使用可能な粘膜アジュバントとして、合成セラミドであるαGalCer(α-galactosylceramide)、CpGオリゴヌクレオチド、リン脂質とアポタンパク質からなる生体界面活性剤からなる肺サーファクタントタンパク質-C(pulmonary Surfactant Protein-C,SP-C、別名:サーファクテン)、肺サーファクタントタンパク質-B(SP-B)、野生型又は変異型IFN-α、二本鎖RNA、並びに活性増幅型TNF変異体などが使用可能である(特許文献4~6、及び非特許文献7~11参照)。
しかしながら、前記HPVなどのウイルス及び細菌の感染防御あるいは感染症の治療において、前記ウイルス及び前記細菌に対するワクチンと併用投与する粘膜免疫賦活化剤として、未だ満足なものが見出せていないのが現状である。
即ち、依然として、粘膜において細胞性免疫の賦活化に十分な効果をもつ、HPVワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用投与可能な粘膜免疫賦活化剤が提供されていないという問題がある。
即ち、依然として、粘膜において細胞性免疫の賦活化に十分な効果をもつ、HPVワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用投与可能な粘膜免疫賦活化剤が提供されていないという問題がある。
R. Hopfl et al., Lancet, 2000, vol.356, pp.1985-1986
C.L. Trimble and I.H. Frazer, Lancet Oncol., 2009, vol.10, pp.975-980
H. Poo et al., Int J. Cancer, 2006, vol.119, pp.1702-1709
N.G. Cortess-Perez et al., Vaccine,2007, vol.25, pp.6581-6588
K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol.28, pp.2810-2817
H. Kiyohara et al., Evid. Based Complement. Alternat. Med., 2006, vol.3, pp.459-467
A. Dalpke et al., Immunology, 2001, vol.204, pp.667-676
D. Mizuno et al., Vaccine, 2011, vol.29, pp.5368-5378
H. Kayamuro et al., Biomaterials, 2009, vol.30, pp.5869-5876
H.Fujita et al., J. Immunol., 2009, vol.183, pp.254-260
Y.Morishima et al., Eur. J. Immunol., 2005, vol.35, pp.2803-2814
本発明は、従来における前記諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、粘膜における細胞性免疫の賦活化に十分な効果をもつ、HPVワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用投与可能な、滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有する粘膜免疫賦活化剤、並びに子宮頚癌や外陰癌、肛門癌、口腔癌、腟癌、陰茎癌、咽頭癌とそれらの前癌病変、及び尖圭コンジローマの治療に使用可能な、HPVワクチンとしてのHPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有するHPV感染症治療用経口医薬組成物を提供することも目的とする。
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下の知見を得た。
即ち、本発明者らは、前記HPVワクチンと、漢方アジュバントとして液性免疫増強効果は知られていた、前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬とを併用投与することで、脾臓における前記HPVワクチン特異的な細胞性免疫が増強されることを新たに見出した。更に前記HPVワクチンと、前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを併用投与することで、粘膜部分における前記HPVワクチン特異的な細胞性免疫応答が増強されることも新たに見出した。前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有する粘膜免疫賦活化剤は、HPVワクチンに対する効果的な粘膜免疫賦活化剤として機能するだけでなく、他のウイルスワクチン及び細菌ワクチンに対する粘膜免疫賦活化剤としての効果が期待される。
即ち、本発明者らは、前記HPVワクチンと、漢方アジュバントとして液性免疫増強効果は知られていた、前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬とを併用投与することで、脾臓における前記HPVワクチン特異的な細胞性免疫が増強されることを新たに見出した。更に前記HPVワクチンと、前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを併用投与することで、粘膜部分における前記HPVワクチン特異的な細胞性免疫応答が増強されることも新たに見出した。前記十全大補湯や前記補中益気湯などの滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有する粘膜免疫賦活化剤は、HPVワクチンに対する効果的な粘膜免疫賦活化剤として機能するだけでなく、他のウイルスワクチン及び細菌ワクチンに対する粘膜免疫賦活化剤としての効果が期待される。
本発明は、本発明者らによる前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段は、以下の通りである。即ち、
本発明の粘膜免疫賦活化剤は、滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有することを特徴とする。
本発明のHPV感染症治療用経口医薬組成物は、HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有することを特徴とする。
本発明の粘膜免疫賦活化剤は、滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有することを特徴とする。
本発明のHPV感染症治療用経口医薬組成物は、HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有することを特徴とする。
本発明によると、従来における前記諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、粘膜における細胞性免疫の賦活化に十分な効果をもつ、HPVワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用投与可能な、滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有する粘膜免疫賦活化剤、並びに子宮頚癌や外陰癌、肛門癌、口腔癌、腟癌、陰茎癌、咽頭癌とそれらの前癌病変、及び尖圭コンジローマの治療に使用可能な、HPVワクチンとしてのHPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有するHPV感染症治療用経口医薬組成物を提供することができる。
(粘膜免疫賦活化剤)
本発明の免疫賦活化剤は、滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬(免疫増強漢方薬)と粘膜アジュバントとを少なくとも含み、必要に応じて適宜選択したその他の成分を含む。
本発明の免疫賦活化剤は、滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する漢方薬(免疫増強漢方薬)と粘膜アジュバントとを少なくとも含み、必要に応じて適宜選択したその他の成分を含む。
<免疫増強漢方薬>
滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する前記免疫増強漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、十全大補湯と補中益気湯が好ましい。
滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する前記免疫増強漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、十全大補湯と補中益気湯が好ましい。
<<十全大補湯>>
前記十全大補湯は、漢方薬の一種で、黄耆(オウギ)、人参(ニンジン)、桂皮(ケイヒ)、当帰(トウキ)、川きゅう(センキュウ)、芍薬(シャクヤク)、熟地黄(ジオウ)、蒼朮(ソウジュツ)又は白朮(ビャクジュツ)、茯苓(ブクリョウ)、及び甘草(カンゾウ)からなる。例えば、日局オウギ3.0g、日局ニンジン3.0g、日局ケイヒ3.0g、日局トウキ3.0g、日局センキュウ3.0g、日局シャクヤク3.0g、日局ジオウ3.0g、日局ソウジュツ3.0g、日局ブクリョウ3.0g及び日局カンゾウ1.5gを混合した混合生薬5.0gを全量7.5g中に含有するものであってもよく、更に前記混合生薬以外に日局ステアリン酸マグネシウムと日局乳糖水和物などが添加されていてもよい。
前記十全大補湯としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、ツムラ十全大補湯エキス顆粒(識別コード:ツムラ/48)などが挙げられる。
前記十全大補湯は、漢方薬の一種で、黄耆(オウギ)、人参(ニンジン)、桂皮(ケイヒ)、当帰(トウキ)、川きゅう(センキュウ)、芍薬(シャクヤク)、熟地黄(ジオウ)、蒼朮(ソウジュツ)又は白朮(ビャクジュツ)、茯苓(ブクリョウ)、及び甘草(カンゾウ)からなる。例えば、日局オウギ3.0g、日局ニンジン3.0g、日局ケイヒ3.0g、日局トウキ3.0g、日局センキュウ3.0g、日局シャクヤク3.0g、日局ジオウ3.0g、日局ソウジュツ3.0g、日局ブクリョウ3.0g及び日局カンゾウ1.5gを混合した混合生薬5.0gを全量7.5g中に含有するものであってもよく、更に前記混合生薬以外に日局ステアリン酸マグネシウムと日局乳糖水和物などが添加されていてもよい。
前記十全大補湯としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、ツムラ十全大補湯エキス顆粒(識別コード:ツムラ/48)などが挙げられる。
<<補中益気湯>>
前記補中益気湯は漢方薬の一種で、黄耆、人参、蒼朮又は白朮、当帰、甘草、柴胡(サイコ)、陳皮(チンピ)、大棗(タイソウ)、生姜(ショウキョウ)、及び升麻(ショウマ)からなる。例えば、日局オウギ4.0g、日局ニンジン4.0g、日局ソウジュツ4.0g、日局トウキ3.0g、日局カンゾウ1.5g、日局サイコ2.0g、日局チンピ2.0g、日局タイソウ2.0g、日局ショウキョウ0.5g、及び日局ショウマ1.0gを混合した混合生薬5.0gを全量7.5g中に含有するものであってよく、更に前記混合生薬以外に日局ステアリン酸マグネシウムと日局乳糖水和物などが添加されていてもよい。
前記補中益気湯としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、ツムラ補中益気湯エキス顆粒(識別コード:ツムラ/41)などが挙げられる。
前記補中益気湯は漢方薬の一種で、黄耆、人参、蒼朮又は白朮、当帰、甘草、柴胡(サイコ)、陳皮(チンピ)、大棗(タイソウ)、生姜(ショウキョウ)、及び升麻(ショウマ)からなる。例えば、日局オウギ4.0g、日局ニンジン4.0g、日局ソウジュツ4.0g、日局トウキ3.0g、日局カンゾウ1.5g、日局サイコ2.0g、日局チンピ2.0g、日局タイソウ2.0g、日局ショウキョウ0.5g、及び日局ショウマ1.0gを混合した混合生薬5.0gを全量7.5g中に含有するものであってよく、更に前記混合生薬以外に日局ステアリン酸マグネシウムと日局乳糖水和物などが添加されていてもよい。
前記補中益気湯としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、ツムラ補中益気湯エキス顆粒(識別コード:ツムラ/41)などが挙げられる。
<粘膜アジュバント>
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ウイルスや細菌などのタンパク質に由来する経口ワクチン特異的な獲得免疫を更に増強するものが好ましい。例えば、細菌毒素、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP-C(サーファクテン)、SP-B、IFN-α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA及び活性増幅型TNF変異体が挙げられ、それらを1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
細菌毒素に由来するアジュバント(細菌毒素由来アジュバント)が、従前より粘膜アジュバントとして頻繁に使用されている点で好ましい。
細菌毒素に由来しないという点においては、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP-C(サーファクテン)、SP-B、IFN-α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA及び活性増幅型TNF変異体などのアジュバントが好ましいが、それらの中でも、前記合成セラミド(αGalCer)がヒトに対するアジュバント効果が確認されている点でより好ましい。
複数の抗原に対するアジュバント効果が知られている点では、前記細菌毒素と前記合成セラミド(αGalCer)が好ましい。
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ウイルスや細菌などのタンパク質に由来する経口ワクチン特異的な獲得免疫を更に増強するものが好ましい。例えば、細菌毒素、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP-C(サーファクテン)、SP-B、IFN-α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA及び活性増幅型TNF変異体が挙げられ、それらを1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
細菌毒素に由来するアジュバント(細菌毒素由来アジュバント)が、従前より粘膜アジュバントとして頻繁に使用されている点で好ましい。
細菌毒素に由来しないという点においては、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP-C(サーファクテン)、SP-B、IFN-α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA及び活性増幅型TNF変異体などのアジュバントが好ましいが、それらの中でも、前記合成セラミド(αGalCer)がヒトに対するアジュバント効果が確認されている点でより好ましい。
複数の抗原に対するアジュバント効果が知られている点では、前記細菌毒素と前記合成セラミド(αGalCer)が好ましい。
<<細菌毒素由来アジュバント>>
前記細菌毒素由来アジュバントしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、CT、LT、VT、DT、PTなどに由来するポリペプチドが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
前記細菌毒素由来アジュバントしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、CT、LT、VT、DT、PTなどに由来するポリペプチドが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
-変異型細菌毒素由来アジュバント-
前記変異型細菌毒素由来アジュバントとしては、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、変異型CT、変異型LT、変異型VT、変異型DT、変異型PTなどが挙げられる。
変異型CT、変異型LT、変異型VT、変異型DT、変異型PTとしては、例えば、既に文献(国際公開第98/042375号、国際公開第00/037609号、国際公開第2006/100108号、国際公開第1996/006627号)に記載されているものが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記変異型細菌毒素由来アジュバントとしては、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、変異型CT、変異型LT、変異型VT、変異型DT、変異型PTなどが挙げられる。
変異型CT、変異型LT、変異型VT、変異型DT、変異型PTとしては、例えば、既に文献(国際公開第98/042375号、国際公開第00/037609号、国際公開第2006/100108号、国際公開第1996/006627号)に記載されているものが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
--LTBポリペプチド--
前記LTに由来するポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、LTBポリペプチドが好ましい。前記LTBポリペプチドは、LTのBサブユニット(LTB)に由来し、粘膜アジュバント効果をもつこと以外には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、全長であるLTBタンパク質などが挙げられる。
前記LTBは、LTのAサブユニット(LTA)と2量体(ホロトキシン)の形では毒性を示すが、前記LTBは単独では毒性を持たない。
それにも関わらず、経口や経鼻投与により、前記LTBタンパク質は単独で粘膜においてアジュバントとして機能することが示されている(国際公開第99/026654号)。
したがって、ヒトへ投与する経口ワクチンの製造においても、前記LTBポリペプチドを粘膜アジュバントとして使用することが可能である。
前記LTBポリペプチドとしては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、シグマアルドリッチ株式会社の易熱性エンテロトキシンBサブユニット(LTB)大腸菌由来(カタログ番号:E8656)などが挙げられる。
前記LTに由来するポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、LTBポリペプチドが好ましい。前記LTBポリペプチドは、LTのBサブユニット(LTB)に由来し、粘膜アジュバント効果をもつこと以外には、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、全長であるLTBタンパク質などが挙げられる。
前記LTBは、LTのAサブユニット(LTA)と2量体(ホロトキシン)の形では毒性を示すが、前記LTBは単独では毒性を持たない。
それにも関わらず、経口や経鼻投与により、前記LTBタンパク質は単独で粘膜においてアジュバントとして機能することが示されている(国際公開第99/026654号)。
したがって、ヒトへ投与する経口ワクチンの製造においても、前記LTBポリペプチドを粘膜アジュバントとして使用することが可能である。
前記LTBポリペプチドとしては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、シグマアルドリッチ株式会社の易熱性エンテロトキシンBサブユニット(LTB)大腸菌由来(カタログ番号:E8656)などが挙げられる。
<<合成セラミド(αGalCer)>>
胆癌マウスを用いたin vivoアッセイで抗腫瘍効果を示す天然化合物のスクリーニングにより、海綿由来のアゲラフィン類が単離された。更に、より抗腫瘍効果が強い前記アゲラフィン類の誘導体として、前記合成セラミド(αGalCer)は取得された。その後の研究で、前記合成セラミド(αGalCer)は、抗原提示細胞に取り込まれた後に、NK細胞とT細胞の両方のキャラクターを持つNKT細胞と会合して、IFN-γ及びIL-4の産生を誘導することから、いわゆるアジュバントであることが示されている。前記合成セラミド(αGalCer)は、経鼻投与することで、鼻でIgA産生を誘導することができることが報告されていることから粘膜アジュバントでもある。
前記合成セラミド(αGalCer)としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、協和発酵キリン株式会社のα-galactosylceramide(KRN7000)などが挙げられる。
胆癌マウスを用いたin vivoアッセイで抗腫瘍効果を示す天然化合物のスクリーニングにより、海綿由来のアゲラフィン類が単離された。更に、より抗腫瘍効果が強い前記アゲラフィン類の誘導体として、前記合成セラミド(αGalCer)は取得された。その後の研究で、前記合成セラミド(αGalCer)は、抗原提示細胞に取り込まれた後に、NK細胞とT細胞の両方のキャラクターを持つNKT細胞と会合して、IFN-γ及びIL-4の産生を誘導することから、いわゆるアジュバントであることが示されている。前記合成セラミド(αGalCer)は、経鼻投与することで、鼻でIgA産生を誘導することができることが報告されていることから粘膜アジュバントでもある。
前記合成セラミド(αGalCer)としては、市販品であってもよく、該市販品としては、例えば、協和発酵キリン株式会社のα-galactosylceramide(KRN7000)などが挙げられる。
<その他の成分>
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。
<<担体>>
前記担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記粘膜免疫賦活化剤の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記粘膜免疫賦活化剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
前記担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記粘膜免疫賦活化剤の剤型等に応じて適宜選択することができる。また、前記粘膜免疫賦活化剤中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
-剤型-
前記剤型としては、経口投与できるものである以外、特に制限はなく、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)などが挙げられる。
前記剤型としては、経口投与できるものである以外、特に制限はなく、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)などが挙げられる。
<用途>
前記粘膜免疫賦活化剤は、患者に対して経口で投与することができる。その場合、前記粘膜免疫賦活化剤は、患者の粘膜において、その前後又は同時に投与される抗原に特異的な細胞性免疫を賦活化する。
前記粘膜免疫賦活化剤は、患者に対して経口で投与することができる。その場合、前記粘膜免疫賦活化剤は、患者の粘膜において、その前後又は同時に投与される抗原に特異的な細胞性免疫を賦活化する。
<<抗原>>
前記粘膜免疫賦活化剤に対して、その前後又は同時に経口投与される前記抗原としては、ウイルス又は細菌に由来し、ワクチンとして使用できるペプチドである以外、特に制限はない。前記抗原は、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。子宮頚癌などのHPV関連癌に対する治療用途においては、抗原としてHPVに由来するポリペプチド(HPV由来ポリペプチド)が好ましい。
前記粘膜免疫賦活化剤に対して、その前後又は同時に経口投与される前記抗原としては、ウイルス又は細菌に由来し、ワクチンとして使用できるペプチドである以外、特に制限はない。前記抗原は、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。子宮頚癌などのHPV関連癌に対する治療用途においては、抗原としてHPVに由来するポリペプチド(HPV由来ポリペプチド)が好ましい。
-HPV由来ポリペプチド-
前記HPV由来ポリペプチドとしては、抗原性を有するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、HPV由来タンパク質の全長であってもよい。また、前記HPV由来ポリペプチドは、1から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有するものであってもよい。前記HPV由来ポリペプチドは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記HPV由来ポリペプチドとしては、抗原性を有するものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、HPV由来タンパク質の全長であってもよい。また、前記HPV由来ポリペプチドは、1から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有するものであってもよい。前記HPV由来ポリペプチドは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記HPV由来ポリペプチドをワクチンとして使用するための製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成や遺伝子組換え技術を用いる製造方法などが挙げられる。
これら製造方法の中でも、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる製造方法がコストなどの点で好ましい。
前記宿主に用いる細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などが挙げられるが、乳酸菌が好ましく、乳酸菌の中でもLactobacillus属がより好ましく、ヘルパーT細胞1型(Th1)細胞の誘導能が確認されている点で、Lactobacillus caseiが特に好ましい。
宿主細菌における発現に適した発現ベクターは適宜選択することができる。
前記HPV由来ポリペプチドをコードする核酸を含んだ発現ベクター(HPV由来ポリペプチド発現ベクター)を用いて、目的に応じて適宜選択した形質転換方法で、前記宿主細菌を形質転換することができる。
前記HPV由来ポリペプチドは、前記発現ベクターを適宜選択することで、前記宿主細菌の細胞表面若しくは細胞内に発現、又は細胞外に分泌させることができる。
前記HPV由来ポリペプチド発現ベクターで形質転換された宿主細菌(HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌)の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ワクチンとして使用するために、培養後の前記HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌の培養物から前記HPV由来ポリペプチドポリペプチドを精製してもよいが、前記HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用することもできる。
前記HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用する際には、目的に応じて菌体を熱処理するなどして死菌化してもよい。
死菌化した前記HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌を培地から回収した後に、乾燥・粉体状にしたものをワクチンとして使用することができる。
使用するまで、前記乾燥・粉体状にしたものを低温で保存することができる。
また、Lactobacillus caseiを死菌化させた粉体に、前記HPV由来ポリペプチドを添加したものを、ワクチンとして使用することもできる。
これら製造方法の中でも、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる製造方法がコストなどの点で好ましい。
前記宿主に用いる細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などが挙げられるが、乳酸菌が好ましく、乳酸菌の中でもLactobacillus属がより好ましく、ヘルパーT細胞1型(Th1)細胞の誘導能が確認されている点で、Lactobacillus caseiが特に好ましい。
宿主細菌における発現に適した発現ベクターは適宜選択することができる。
前記HPV由来ポリペプチドをコードする核酸を含んだ発現ベクター(HPV由来ポリペプチド発現ベクター)を用いて、目的に応じて適宜選択した形質転換方法で、前記宿主細菌を形質転換することができる。
前記HPV由来ポリペプチドは、前記発現ベクターを適宜選択することで、前記宿主細菌の細胞表面若しくは細胞内に発現、又は細胞外に分泌させることができる。
前記HPV由来ポリペプチド発現ベクターで形質転換された宿主細菌(HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌)の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ワクチンとして使用するために、培養後の前記HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌の培養物から前記HPV由来ポリペプチドポリペプチドを精製してもよいが、前記HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用することもできる。
前記HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用する際には、目的に応じて菌体を熱処理するなどして死菌化してもよい。
死菌化した前記HPV由来ポリペプチド発現宿主細菌を培地から回収した後に、乾燥・粉体状にしたものをワクチンとして使用することができる。
使用するまで、前記乾燥・粉体状にしたものを低温で保存することができる。
また、Lactobacillus caseiを死菌化させた粉体に、前記HPV由来ポリペプチドを添加したものを、ワクチンとして使用することもできる。
--HPVのE7ポリペプチド--
前記HPV由来ポリペプチドとしては、前記HPVのE7ポリペプチドが好ましい。前記HPVのE7ポリペプチドとしては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、癌に関しての高リスク群に属するHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82、HPV26、HPV53及びHPV63からなる群より選択される少なくとも1つのHPVのE7に由来するものがより好ましい。
これらの中でも、HPV16及びHP18の少なくともいずれか1つのHPVのE7に由来するものが特に好ましく、HPV16のE7に由来するものが最も好ましい。
前記HPVのE7ポリペプチドは、抗原性を有するものであればよく、例えば、全長E7タンパク質であってもよい。
前記E7ポリペプチドとして、野生型E7に由来するものの他に、変異型E7に由来する変異型E7ポリペプチドを使用してもよい。
前記HPV由来ポリペプチドとしては、前記HPVのE7ポリペプチドが好ましい。前記HPVのE7ポリペプチドとしては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、癌に関しての高リスク群に属するHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82、HPV26、HPV53及びHPV63からなる群より選択される少なくとも1つのHPVのE7に由来するものがより好ましい。
これらの中でも、HPV16及びHP18の少なくともいずれか1つのHPVのE7に由来するものが特に好ましく、HPV16のE7に由来するものが最も好ましい。
前記HPVのE7ポリペプチドは、抗原性を有するものであればよく、例えば、全長E7タンパク質であってもよい。
前記E7ポリペプチドとして、野生型E7に由来するものの他に、変異型E7に由来する変異型E7ポリペプチドを使用してもよい。
---変異型E7ポリペプチド---
前記変異型E7ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、1から数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されることで、Rbタンパク質との結合性を失ったものなどが挙げられる。前記変異型E7ポリペプチドは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これら変異型E7ポリペプチドの中でも、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)における第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluに相当する、E7タンパク質のRbタンパク質との結合に関与するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換したものが好ましい。例えば、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)の前記第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluの全てをGlyに置換したものとして、HPV16の変異型E7タンパク質(配列番号2)が挙げられる。
前記変異型E7ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、1から数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されることで、Rbタンパク質との結合性を失ったものなどが挙げられる。前記変異型E7ポリペプチドは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これら変異型E7ポリペプチドの中でも、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)における第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluに相当する、E7タンパク質のRbタンパク質との結合に関与するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換したものが好ましい。例えば、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)の前記第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluの全てをGlyに置換したものとして、HPV16の変異型E7タンパク質(配列番号2)が挙げられる。
本発明の粘膜免疫賦活化剤は、免疫原として経口投与されるウイルス抗原や細菌抗原などのワクチンと共に経口投与された場合に、前記ワクチンに対して特異的な獲得免疫、特に細胞性免疫を増強する。
(HPV感染症治療用経口医薬組成物)
本発明のHPV感染症治療用経口医薬組成物は、HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用(即ち免疫増強効果)を有する漢方薬(免疫増強漢方薬)とを少なくとも含み、必要に応じて適宜選択したその他の成分を含む。
本発明のHPV感染症治療用経口医薬組成物は、HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用(即ち免疫増強効果)を有する漢方薬(免疫増強漢方薬)とを少なくとも含み、必要に応じて適宜選択したその他の成分を含む。
<HPVのE7ポリペプチド>
前記HPVのE7ポリペプチドとしては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、癌に関しての高リスク群に属するHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82、HPV26、HPV53及びHPV63からなる群より選択される少なくとも1つのHPVのE7に由来するものが好ましい。
これらの中でも、HPV16及びHP18の少なくともいずれか1つのHPVのE7に由来するものがより好ましく、HPV16のE7に由来するものが特に好ましい。
前記HPVのE7ポリペプチドは、抗原性を有するものであればよく、例えば、全長E7タンパク質であってもよい。
前記E7ポリペプチドとして、野生型E7に由来するものの他に、変異型E7に由来する変異型E7ポリペプチドを使用してもよい。
前記HPVのE7ポリペプチドとしては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、癌に関しての高リスク群に属するHPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68、HPV73、HPV82、HPV26、HPV53及びHPV63からなる群より選択される少なくとも1つのHPVのE7に由来するものが好ましい。
これらの中でも、HPV16及びHP18の少なくともいずれか1つのHPVのE7に由来するものがより好ましく、HPV16のE7に由来するものが特に好ましい。
前記HPVのE7ポリペプチドは、抗原性を有するものであればよく、例えば、全長E7タンパク質であってもよい。
前記E7ポリペプチドとして、野生型E7に由来するものの他に、変異型E7に由来する変異型E7ポリペプチドを使用してもよい。
<<変異型E7ポリペプチド>>
前記変異型E7ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、1から数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されることで、Rbタンパク質との結合性を失ったものなどが挙げられる。前記変異型E7ポリペプチドは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これら変異型E7ポリペプチドの中でも、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)における第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluに相当する、E7タンパク質のRbタンパク質との結合に関与するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換したものが好ましい。例えば、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)の前記第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluの全てをGlyに置換したものとして、HPV16の変異型E7タンパク質(配列番号2)が挙げられる。
前記変異型E7ポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、1から数個のアミノ酸が欠失、置換あるいは付加されることで、Rbタンパク質との結合性を失ったものなどが挙げられる。前記変異型E7ポリペプチドは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これら変異型E7ポリペプチドの中でも、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)における第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluに相当する、E7タンパク質のRbタンパク質との結合に関与するアミノ酸残基を別のアミノ酸残基に置換したものが好ましい。例えば、HPV16の野生型E7タンパク質(配列番号1)の前記第21番目のAsp、第24番目のCys及び第26番目のGluの全てをGlyに置換したものとして、HPV16の変異型E7タンパク質(配列番号2)が挙げられる。
前記E7ポリペプチドをワクチンとして使用するための製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、化学合成や遺伝子組換え技術を用いる製造方法などが挙げられる。
これら製造方法の中でも、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる製造方法がコストなどの点で好ましい。
前記宿主に用いる細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などが挙げられるが、乳酸菌が好ましく、乳酸菌の中でもLactobacillus属がより好ましく、ヘルパーT細胞1型(Th1)細胞の誘導能が確認されている点で、Lactobacillus caseiが特に好ましい。
宿主細菌における発現に適した発現ベクターは適宜選択することができる。
前記E7ポリペプチドをコードする核酸を含んだ発現ベクター(E7発現ベクター)を用いて、目的に応じて適宜選択した形質転換方法で、前記宿主細菌を形質転換することができる。
前記E7ポリペプチドは、前記発現ベクターを適宜選択することで、前記宿主細菌の細胞表面若しくは細胞内に発現、又は細胞外に分泌させることができる。
前記E7発現ベクターで形質転換された宿主細菌(E7発現宿主細菌)の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ワクチンとして使用するために、培養後の前記E7発現宿主細菌の培養物から前記E7ポリペプチドを精製してもよいが、前記E7発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用することもできる。
前記E7発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用する際には、目的に応じて菌体を熱処理するなどして死菌化してもよい。
死菌化した前記E7発現宿主細菌を培地から回収した後に、乾燥・粉体状にしたものをワクチンとして使用することができる。
使用するまで、前記乾燥・粉体状にしたものを低温で保存することができる。
また、Lactobacillus caseiを死菌化させた粉体に前記E7ポリペプチドを添加したものを、ワクチンとして使用することもできる。
これら製造方法の中でも、形質転換細菌を用いる遺伝子組換えによる製造方法がコストなどの点で好ましい。
前記宿主に用いる細菌としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができ、例えば、酵母、大腸菌、枯草菌、乳酸菌などが挙げられるが、乳酸菌が好ましく、乳酸菌の中でもLactobacillus属がより好ましく、ヘルパーT細胞1型(Th1)細胞の誘導能が確認されている点で、Lactobacillus caseiが特に好ましい。
宿主細菌における発現に適した発現ベクターは適宜選択することができる。
前記E7ポリペプチドをコードする核酸を含んだ発現ベクター(E7発現ベクター)を用いて、目的に応じて適宜選択した形質転換方法で、前記宿主細菌を形質転換することができる。
前記E7ポリペプチドは、前記発現ベクターを適宜選択することで、前記宿主細菌の細胞表面若しくは細胞内に発現、又は細胞外に分泌させることができる。
前記E7発現ベクターで形質転換された宿主細菌(E7発現宿主細菌)の培養方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ワクチンとして使用するために、培養後の前記E7発現宿主細菌の培養物から前記E7ポリペプチドを精製してもよいが、前記E7発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用することもできる。
前記E7発現宿主細菌をそのままワクチンとして使用する際には、目的に応じて菌体を熱処理するなどして死菌化してもよい。
死菌化した前記E7発現宿主細菌を培地から回収した後に、乾燥・粉体状にしたものをワクチンとして使用することができる。
使用するまで、前記乾燥・粉体状にしたものを低温で保存することができる。
また、Lactobacillus caseiを死菌化させた粉体に前記E7ポリペプチドを添加したものを、ワクチンとして使用することもできる。
<免疫増強漢方薬>
滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する前記免疫増強漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、十全大補湯と補中益気湯が好ましい。
滋養強壮作用(免疫増強作用)を有する前記免疫増強漢方薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、葛根湯、十全大補湯、補中益気湯、小紫胡湯、小青竜湯などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、十全大補湯と補中益気湯が好ましい。
<<十全大補湯>>
前記十全大補湯については、上記の通りである。
前記十全大補湯については、上記の通りである。
<<補中益気湯>>
前記補中益気湯については、上記の通りである。
前記補中益気湯については、上記の通りである。
<その他の成分>
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粘膜アジュバント、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。また、前記医薬組成物中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
前記その他の成分としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、粘膜アジュバント、医薬的に許容され得る担体などが挙げられる。また、前記医薬組成物中の前記その他の成分の含有量としても、特に制限はなく、目的に応じて、適宜選択することができる。
<<粘膜アジュバント>>
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記十全大補湯や前記補中益気湯と協調して、前記HPVの前記E7ポリペプチドなどの経口ワクチン特異的な液性免疫と細胞性免疫を更に増強するものが好ましい。例えば、細菌毒素、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP-C(サーファクテン)、SP-B、IFN-α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA及び活性増幅型TNF変異体が挙げられ、それらを1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
細菌毒素由来アジュバントが、従前より粘膜アジュバントとして頻繁に使用されている点で好ましい。
細菌毒素に由来しないという点においては、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP-C(サーファクテン)、SP-B、IFN-α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA及び活性増幅型TNF変異体などのアジュバントが好ましいが、それらの中でも、前記合成セラミド(αGalCer)がヒトに対するアジュバント効果が確認されている点でより好ましい。
複数の抗原に対するアジュバント効果が知られている点では、前記細菌毒素と前記合成セラミド(αGalCer)が好ましい。
前記HPV感染症治療用経口医薬組成物に関して、前記粘膜アジュバントは必須の成分ではないが、添加されることで、前記HPV感染症治療用経口医薬組成物の効果を顕著に増強することができる点で、含有することが好ましい。
前記粘膜アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、前記十全大補湯や前記補中益気湯と協調して、前記HPVの前記E7ポリペプチドなどの経口ワクチン特異的な液性免疫と細胞性免疫を更に増強するものが好ましい。例えば、細菌毒素、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP-C(サーファクテン)、SP-B、IFN-α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA及び活性増幅型TNF変異体が挙げられ、それらを1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
細菌毒素由来アジュバントが、従前より粘膜アジュバントとして頻繁に使用されている点で好ましい。
細菌毒素に由来しないという点においては、合成セラミド(αGalCer)、CpGオリゴヌクレオチド、SP-C(サーファクテン)、SP-B、IFN-α(野生型又は変異型)、二本鎖RNA及び活性増幅型TNF変異体などのアジュバントが好ましいが、それらの中でも、前記合成セラミド(αGalCer)がヒトに対するアジュバント効果が確認されている点でより好ましい。
複数の抗原に対するアジュバント効果が知られている点では、前記細菌毒素と前記合成セラミド(αGalCer)が好ましい。
前記HPV感染症治療用経口医薬組成物に関して、前記粘膜アジュバントは必須の成分ではないが、添加されることで、前記HPV感染症治療用経口医薬組成物の効果を顕著に増強することができる点で、含有することが好ましい。
-細菌毒素由来アジュバント-
前記細菌毒素由来アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、CT、LT、VT、DT、PTなどに由来するポリペプチドが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
前記細菌毒素由来アジュバントとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、CT、LT、VT、DT、PTなどに由来するポリペプチドが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
これらの中でも、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないようにあらかじめ変異が導入された変異型細菌毒素由来アジュバントが好ましい。
--変異型細菌毒素由来アジュバント--
前記変異型細菌毒素由来アジュバントとしては、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、変異型CT、変異型LT、変異型VT、変異型DT、変異型PTなどが挙げられる。
変異型CT、変異型LT、変異型VT、変異型DT、変異型PTとしては、例えば、既に文献(国際公開第98/042375号、国際公開第00/037609号、国際公開第2006/100108号、国際公開第1996/006627号)に記載されているものが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
前記変異型細菌毒素由来アジュバントとしては、ヒトへの経口投与において重篤な副作用を生じないものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、変異型CT、変異型LT、変異型VT、変異型DT、変異型PTなどが挙げられる。
変異型CT、変異型LT、変異型VT、変異型DT、変異型PTとしては、例えば、既に文献(国際公開第98/042375号、国際公開第00/037609号、国際公開第2006/100108号、国際公開第1996/006627号)に記載されているものが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
---LTBポリペプチド---
前記LTに由来するポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、LTBポリペプチドが好ましい。前記LTBポリペプチドについては、上記の通りである。
前記LTに由来するポリペプチドとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、LTBポリペプチドが好ましい。前記LTBポリペプチドについては、上記の通りである。
-合成セラミド(αGalCer)-
前記合成セラミド(αGalCer)については、上記の通りである。
前記合成セラミド(αGalCer)については、上記の通りである。
<<担体>>
前記担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬組成物の剤型等に応じて適宜選択することができる。
前記担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する前記医薬組成物の剤型等に応じて適宜選択することができる。
-剤型-
剤型としては、経口投与できるものである以外、特に制限はなく、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)などが挙げられる。
剤型としては、経口投与できるものである以外、特に制限はなく、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)などが挙げられる。
<用途>
前記HPV感染症治療用経口医薬組成物は、子宮頚癌前癌病変患者及び子宮頚癌患者などの患者の粘膜において、HPVのE7ポリペプチド(HPVワクチン)に特異的な細胞性免疫を賦活化させるために使用できる。
前記HPV感染症治療用経口医薬組成物は、子宮頚癌前癌病変患者及び子宮頚癌患者などの患者の粘膜において、HPVのE7ポリペプチド(HPVワクチン)に特異的な細胞性免疫を賦活化させるために使用できる。
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
(実施例1)
<インビボ解析のためのマウスの免疫>
マウスのLacE7製剤による経口免疫は、K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol.28, pp.2810-2817に記載の方法に従って行った。その際、必要に応じて、十全大補湯(以下「JTT」という)と補中益気湯(以下「HET」という)、更に必要に応じて、LTBポリペプチド又は合成セラミド(αGalCer)をマウスに経口投与した。
<インビボ解析のためのマウスの免疫>
マウスのLacE7製剤による経口免疫は、K. Adachi et al., Vaccine, 2010, vol.28, pp.2810-2817に記載の方法に従って行った。その際、必要に応じて、十全大補湯(以下「JTT」という)と補中益気湯(以下「HET」という)、更に必要に応じて、LTBポリペプチド又は合成セラミド(αGalCer)をマウスに経口投与した。
<<LacE7製剤の製造>>
LacE7製剤は公知の方法に従って製造した(Poo H. et al.,Int.J.Immunol.,2006,vol.119,pp.1702-1709)。簡単に述べると、HPV16由来の変異型E7タンパク質(配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなる、野生型E7タンパク質のRb結合部位の3つのアミノ酸残基が置換されたもの)を、ヘルパーT細胞1型(Th1細胞)の誘導能が確認されているLactobacillus caseiに発現ベクターを用いて導入した。培養後の組換え体(LacE7)は、熱で死菌化した。培地から精製したLacE7を蒸留水で何度か洗浄した後、乾燥・粉体化し(LacE7製剤)、使用するまで4℃で保存した。前記LacE7製剤は水性溶媒に不溶性であった。
LacE7製剤は公知の方法に従って製造した(Poo H. et al.,Int.J.Immunol.,2006,vol.119,pp.1702-1709)。簡単に述べると、HPV16由来の変異型E7タンパク質(配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなる、野生型E7タンパク質のRb結合部位の3つのアミノ酸残基が置換されたもの)を、ヘルパーT細胞1型(Th1細胞)の誘導能が確認されているLactobacillus caseiに発現ベクターを用いて導入した。培養後の組換え体(LacE7)は、熱で死菌化した。培地から精製したLacE7を蒸留水で何度か洗浄した後、乾燥・粉体化し(LacE7製剤)、使用するまで4℃で保存した。前記LacE7製剤は水性溶媒に不溶性であった。
<<マウスへのLacE7製剤の経口投与>>
6週齢の雌SPF C67BLマウス(日本クレア株式会社)に対して、前記LacE7製剤を経口投与することで免疫した。
1匹当たり1.0mgの前記LacE7製剤を第1週、第2週、第4週、及び第6週の合計4クール投与した。全ての投与は、前記LacE7製剤を200μLのPBSに懸濁したものを経胃チューブを用いて、毎週連続5日間、1日1回3時間の絶食後に行った。
6週齢の雌SPF C67BLマウス(日本クレア株式会社)に対して、前記LacE7製剤を経口投与することで免疫した。
1匹当たり1.0mgの前記LacE7製剤を第1週、第2週、第4週、及び第6週の合計4クール投与した。全ての投与は、前記LacE7製剤を200μLのPBSに懸濁したものを経胃チューブを用いて、毎週連続5日間、1日1回3時間の絶食後に行った。
<<マウスへの十全大補湯と補中益気湯の経口投与>>
1日1匹当たり40mgのJTT(ツムラ株式会社製)又はHET(ツムラ株式会社製)を、5gの粉末飼料に混ぜた状態で、1つのゲージに入っている5匹のマウスそれぞれに完全に摂取させた。LacE7製剤が投与される6週間(第1週~第6週)の間、毎日JTT又はHETのいずれかを摂取させた。
1日1匹当たり40mgのJTT(ツムラ株式会社製)又はHET(ツムラ株式会社製)を、5gの粉末飼料に混ぜた状態で、1つのゲージに入っている5匹のマウスそれぞれに完全に摂取させた。LacE7製剤が投与される6週間(第1週~第6週)の間、毎日JTT又はHETのいずれかを摂取させた。
<<マウスへのLTBポリペプチド経口投与>>
LTBポリペプチドは、前記LacE7製剤と一緒に1匹当たり10μg、毎クールの3日目に経口投与した。LTBポリペプチドとしては、シグマアルドリッチ株式会社の易熱性エンテロトキシンBサブユニット(LTB)大腸菌由来、(カタログ番号:E8656)を用いた。
LTBポリペプチドは、前記LacE7製剤と一緒に1匹当たり10μg、毎クールの3日目に経口投与した。LTBポリペプチドとしては、シグマアルドリッチ株式会社の易熱性エンテロトキシンBサブユニット(LTB)大腸菌由来、(カタログ番号:E8656)を用いた。
<<マウスへのαGalCer経口投与>>
合成セラミド(αGalCer)は、前記LacE7製剤と一緒に1匹当たり2μg、毎クールの3日目に経口投与した。合成セラミド(αGalCer)としては、協和発酵キリン株式会社のα-galactosylceramide(KRN7000)を用いた。
合成セラミド(αGalCer)は、前記LacE7製剤と一緒に1匹当たり2μg、毎クールの3日目に経口投与した。合成セラミド(αGalCer)としては、協和発酵キリン株式会社のα-galactosylceramide(KRN7000)を用いた。
<脾臓、腸洗浄液、末梢血試料、及び粘膜組織の回収>
前記LacE7製剤の最後の接種から1週間後(接種開始から7週目)に、リンパ球、血清、及び腸洗浄液を回収した。
前記LacE7製剤を接種した5匹のマウスを解剖し、脾臓、腸、及び末梢血を採取した。前記脾臓は、HBSS(Hanks’ Balanced Salt Solution)で洗浄した。前記腸は、排泄物を除いた後、腸管内部をプロテアーゼ阻害剤を加えたHBSS10mLで洗浄し、回収した液を腸洗浄液とした。回収した血清と腸洗浄液は-80℃で保存した。
前記LacE7製剤の最後の接種から1週間後(接種開始から7週目)に、リンパ球、血清、及び腸洗浄液を回収した。
前記LacE7製剤を接種した5匹のマウスを解剖し、脾臓、腸、及び末梢血を採取した。前記脾臓は、HBSS(Hanks’ Balanced Salt Solution)で洗浄した。前記腸は、排泄物を除いた後、腸管内部をプロテアーゼ阻害剤を加えたHBSS10mLで洗浄し、回収した液を腸洗浄液とした。回収した血清と腸洗浄液は-80℃で保存した。
同様に、前記LacE7製剤を接種した25匹のマウスを解剖し、粘膜組織として腸管上皮を回収した。前記腸管上皮を、4%パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中にて室温で1時間固定した後、PBSですすぎ、OCTコンパウンド(Tissue-Tek(登録商標)、Sakura Finetek、Zoeterwoude、オランダ)にサンプルを包埋して凍結させ、-80℃で保存した。クライオスタット(CM1510S、Leica)を用いて凍結切片(厚み6μm)を作製し、免疫組織学解析のためにスライドグラスに載せた。
<マウスの脾臓細胞及び粘膜リンパ球の調製>
腸は縦方向に切開して10質量% FBS、100units/mL ペニシリン、及び100μg/mL ストレプトマイシンを添加したRPMI1640(10質量% 非働化牛胎児血清、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、50mM 2-メルカプトエタノール含有)培地で37℃、30分間激しく振とうした。回収した細胞懸濁液は、BDファルコン(商標)セルストレーナー(BDバイオサイエンス株式会社,米国)で組織残屑を除き、次いで、70質量%と40質量%のPercoll PLUSを重層した15mLチューブを用いた不連続濃度勾配遠心を行った。約107個~108個の細胞を上に重層し、600×g、室温で20分間遠心することで、70質量%と40質量%のPercoll PLUSの界面に粘膜リンパ球(生存率95%)が集まった。
脾臓細胞は、PBSの中で脾臓をゆっくりと裂くことで得られた。塊状の残屑は遠心で除いた。
それぞれ、約5×106個~10×106個の粘膜リンパ球と、約107個の脾臓細胞が各マウスから得られた。
腸は縦方向に切開して10質量% FBS、100units/mL ペニシリン、及び100μg/mL ストレプトマイシンを添加したRPMI1640(10質量% 非働化牛胎児血清、2mM L-グルタミン、1mM ピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、50mM 2-メルカプトエタノール含有)培地で37℃、30分間激しく振とうした。回収した細胞懸濁液は、BDファルコン(商標)セルストレーナー(BDバイオサイエンス株式会社,米国)で組織残屑を除き、次いで、70質量%と40質量%のPercoll PLUSを重層した15mLチューブを用いた不連続濃度勾配遠心を行った。約107個~108個の細胞を上に重層し、600×g、室温で20分間遠心することで、70質量%と40質量%のPercoll PLUSの界面に粘膜リンパ球(生存率95%)が集まった。
脾臓細胞は、PBSの中で脾臓をゆっくりと裂くことで得られた。塊状の残屑は遠心で除いた。
それぞれ、約5×106個~10×106個の粘膜リンパ球と、約107個の脾臓細胞が各マウスから得られた。
<ELISPOTアッセイ>
腸粘膜リンパ球又は脾臓細胞(5×106細胞/mL)の懸濁液50μLを、24時間、37℃で抗原提示細胞と共にインキュベートした。50μLの脾臓細胞(5×106細胞/mL)については、マイトマイシンで処理した後、3回PBSで洗浄した。マウスIFN-γ用ELISPOTキット(マブテックAB、スウェーデン)のメーカープロトコールに従い、HPV16のE7タンパク質(配列番号1)においてCTLエピトープとして報告されている、E7タンパク質の第49番から第57番のアミノ酸配列からなる10μLの合成ペプチド(1μg/mL)、マイトジェン(ホルボールミリステートアセテート 40ng/mL+イオノマイシン 4μg/mL)、又は培地のみ(コントロール)を、抗マウスIFN-γ抗体でコートされた96ウェルプレート(例えば、ELIIPプレート、ミリポア株式会社、USA)に滴下した。96ウェルプレート上のIFN-γ陽性のスポット数を解析した。その際、KS ELISPOT(カールツァイスビジョン社、ドイツ)のコンピュータ完全補助ビデオイメージング解析システムを用いた。
腸粘膜リンパ球又は脾臓細胞(5×106細胞/mL)の懸濁液50μLを、24時間、37℃で抗原提示細胞と共にインキュベートした。50μLの脾臓細胞(5×106細胞/mL)については、マイトマイシンで処理した後、3回PBSで洗浄した。マウスIFN-γ用ELISPOTキット(マブテックAB、スウェーデン)のメーカープロトコールに従い、HPV16のE7タンパク質(配列番号1)においてCTLエピトープとして報告されている、E7タンパク質の第49番から第57番のアミノ酸配列からなる10μLの合成ペプチド(1μg/mL)、マイトジェン(ホルボールミリステートアセテート 40ng/mL+イオノマイシン 4μg/mL)、又は培地のみ(コントロール)を、抗マウスIFN-γ抗体でコートされた96ウェルプレート(例えば、ELIIPプレート、ミリポア株式会社、USA)に滴下した。96ウェルプレート上のIFN-γ陽性のスポット数を解析した。その際、KS ELISPOT(カールツァイスビジョン社、ドイツ)のコンピュータ完全補助ビデオイメージング解析システムを用いた。
<ELISAアッセイ>
血清中のIgG及び腸洗浄液中のIgAを、マウスIgG又はマウスIgAに対するELISA定量セット(ベチル ラボラトリーズ社,米国)を用いて定量した。HPV16のE7タンパク質に対して特異的なIgGとIgAの量は、Hisタグを付加したE7タンパク質を抗原として定量する。方法はメーカープロトコールに従った。
簡単に述べると、96ウェルプレート(例えば、イムノプレート,ヌンク社,デンマーク)を100ng/ウェルHisタグ―E7(50mM 炭酸塩-重炭酸塩 pH9.6のコーティング緩衝液に懸濁)、4℃で一晩置くことでコートした。その後、ブロッキング処理を行った前記プレートに対して、2倍希釈した血清又は腸洗浄液を適用した。洗浄後に2次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体又は抗マウスIgA抗体を各ウェルに加え(それぞれ、1:60,000倍、1:20,000倍希釈)、37℃で1時間インキュベートした。洗浄、発色処理後に吸光度450nmを測定した。非免疫マウスの血清及び腸洗浄液をネガティブコントロールとした。抗E7抗体価は、抗E7 IgG/全IgG又は抗E7 IgA/全IgA(相対値)として示した。
血清中のIgG及び腸洗浄液中のIgAを、マウスIgG又はマウスIgAに対するELISA定量セット(ベチル ラボラトリーズ社,米国)を用いて定量した。HPV16のE7タンパク質に対して特異的なIgGとIgAの量は、Hisタグを付加したE7タンパク質を抗原として定量する。方法はメーカープロトコールに従った。
簡単に述べると、96ウェルプレート(例えば、イムノプレート,ヌンク社,デンマーク)を100ng/ウェルHisタグ―E7(50mM 炭酸塩-重炭酸塩 pH9.6のコーティング緩衝液に懸濁)、4℃で一晩置くことでコートした。その後、ブロッキング処理を行った前記プレートに対して、2倍希釈した血清又は腸洗浄液を適用した。洗浄後に2次抗体として、ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体又は抗マウスIgA抗体を各ウェルに加え(それぞれ、1:60,000倍、1:20,000倍希釈)、37℃で1時間インキュベートした。洗浄、発色処理後に吸光度450nmを測定した。非免疫マウスの血清及び腸洗浄液をネガティブコントロールとした。抗E7抗体価は、抗E7 IgG/全IgG又は抗E7 IgA/全IgA(相対値)として示した。
<サイトカイン濃度の測定>
腸洗浄液中のサイトカイン濃度は、5匹のマウスのものをプールしてマウスTh1/Th2 ELISA Ready SET Go(登録商標) Kit(BDバイオサイエンス株式会社,米国)を用いて測定した。Th1細胞が発現するサイトカインとしてIFN-γを、Th2細胞が発現するサイトカインとしてIL-4を測定に用いた。各サンプルに関して少なくとも3回同じ測定を繰り返した。
腸洗浄液中のサイトカイン濃度は、5匹のマウスのものをプールしてマウスTh1/Th2 ELISA Ready SET Go(登録商標) Kit(BDバイオサイエンス株式会社,米国)を用いて測定した。Th1細胞が発現するサイトカインとしてIFN-γを、Th2細胞が発現するサイトカインとしてIL-4を測定に用いた。各サンプルに関して少なくとも3回同じ測定を繰り返した。
<統計解析>
ELISPOT及びELISAのデータを平均値±標準偏差で示した。これらの値又は相対値は免疫グループ(各グループはマウス5匹)間で比較した。その際、両側ステューデントt-検定を行った。p値が<0.05の場合有意とみなした。
ELISPOT及びELISAのデータを平均値±標準偏差で示した。これらの値又は相対値は免疫グループ(各グループはマウス5匹)間で比較した。その際、両側ステューデントt-検定を行った。p値が<0.05の場合有意とみなした。
<免疫組織学的解析>
LacE7を経口投与したマウスにおけるE7タンパク質特異的な細胞障害性T細胞(E7特異的CTL)の誘導及びその組織内浸潤を、T-Select mouse MHC Tetramer(株式会社医学生物学研究所製)を用いて調べた。メーカープロトコールに従い、MCH及びE7ペプチド複合体をビオチン化し、フィコエリスリン標識化ストレプトアビジンによりこれを4量体(テトラマー)化することにより、E7特異的MHCテトラマーを作製した。E7ペプチドとして、HPV16のE7タンパク質(配列番号1)においてCTLエピトープとして報告されている、E7タンパク質の第49番から第57番のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1μg/mL)を用いた。
LacE7を経口投与したマウスにおけるE7タンパク質特異的な細胞障害性T細胞(E7特異的CTL)の誘導及びその組織内浸潤を、T-Select mouse MHC Tetramer(株式会社医学生物学研究所製)を用いて調べた。メーカープロトコールに従い、MCH及びE7ペプチド複合体をビオチン化し、フィコエリスリン標識化ストレプトアビジンによりこれを4量体(テトラマー)化することにより、E7特異的MHCテトラマーを作製した。E7ペプチドとして、HPV16のE7タンパク質(配列番号1)においてCTLエピトープとして報告されている、E7タンパク質の第49番から第57番のアミノ酸配列からなる合成ペプチド(1μg/mL)を用いた。
上述の通り、LacE7を経口投与したマウスから腸管上皮の切片を作製し、前記E7特異的MHCテトラマーを用いたE7ペプチド認識MHCの検出、又は前記E7特異的MHCテトラマー及び抗CD8抗体を用いた二重染色を行った。具体的には、前記腸管上皮の切片試料を、0.1質量%Triton-X100を含むPBSを用いて30分間透過処理した後、試料をすすぎ、5質量%スキムミルクを含むPBSで30分間浸透させた。これらを、前記E7特異的MHCテトラマー(希釈率1:25)及び場合により1:50で希釈した抗CD8抗体(Rat Anti-Mouse CD8a/Lyt-2 FITC(Clone 53-6.7)、Beckman Coulter, Inc.)と共に4℃で一晩インキュベートした。各工程について、前記E7特異的MHCテトラマー及び抗体を1質量%スキムミルク及び0.1質量%TritonX100を含むPBSで希釈した。DAPI(4’, 6-Diamidine-2-phenylindole dihydrochloride、Roche)で核を染色した後、切片をPBS/グリセロール(1/1)中に置き、蛍光顕微鏡(LSM 700、Zeiss)によって観察した。
<E7特異的1型T細胞応答における漢方薬のアジュバント効果>
HPVのE6タンパク質とE7タンパク質の発現によって不死化された細胞のクリアランスには、IFN-γを産生するCD4+ヘルパーT細胞と、HPVのE7タンパク質を認識するCD8+CTLによる、E7特異的なT細胞応答(以下「1型T細胞応答」という)が必要となる。
そこで、E7特異的な前記1型T細胞応答に対するLacE7ワクチンと漢方薬の経口投与の影響を調べるために、ELISPOTアッセイで、粘膜リンパ球及び脾臓細胞中のIFN-γ産生細胞の数を調べた(図1)。
HPVのE6タンパク質とE7タンパク質の発現によって不死化された細胞のクリアランスには、IFN-γを産生するCD4+ヘルパーT細胞と、HPVのE7タンパク質を認識するCD8+CTLによる、E7特異的なT細胞応答(以下「1型T細胞応答」という)が必要となる。
そこで、E7特異的な前記1型T細胞応答に対するLacE7ワクチンと漢方薬の経口投与の影響を調べるために、ELISPOTアッセイで、粘膜リンパ球及び脾臓細胞中のIFN-γ産生細胞の数を調べた(図1)。
各グループ5匹のマウスにLacE7単独、又はLacE7とJTT若しくはHETを経口投与した。最後の免疫から1週間後に腸管粘膜リンパ球及び脾臓細胞を採取して、粘膜及び全身性免疫に対する前記JTTと前記HETの効果を調べた。
HPV16のE7の第49番目~第57番目のアミノ酸残基部分は、C57BL/6マウスのCD4+及びCD8+T細胞によって認識されるE7-CTLエピトープとして知られている。そこで、前記HPV16の前記E7タンパク質に対する前記1型T細胞応答のELISPOTアッセイには、前記E7-CTLエピトープ部位に相当するアミノ酸配列からなる合成ペプチドを使用した。
免疫しなかったマウスと比較して、LacE7で免疫したマウスでは、粘膜リンパ球と脾臓の両方でE7特異的なIFN-γ産生細胞の数が増加した。LacE7による経口免疫は、脾臓よりも粘膜リンパ球においてより顕著に(およそ1.5倍~2倍)、E7特異的IFN-γ産生細胞のレベルを上昇させた。
更に驚くべきことに、前記LacE7を前記JTT又は前記HETと同時投与することで、脾臓におけるE7特異的な1型T細胞応答が顕著に上昇した(図1)。
HPV16のE7の第49番目~第57番目のアミノ酸残基部分は、C57BL/6マウスのCD4+及びCD8+T細胞によって認識されるE7-CTLエピトープとして知られている。そこで、前記HPV16の前記E7タンパク質に対する前記1型T細胞応答のELISPOTアッセイには、前記E7-CTLエピトープ部位に相当するアミノ酸配列からなる合成ペプチドを使用した。
免疫しなかったマウスと比較して、LacE7で免疫したマウスでは、粘膜リンパ球と脾臓の両方でE7特異的なIFN-γ産生細胞の数が増加した。LacE7による経口免疫は、脾臓よりも粘膜リンパ球においてより顕著に(およそ1.5倍~2倍)、E7特異的IFN-γ産生細胞のレベルを上昇させた。
更に驚くべきことに、前記LacE7を前記JTT又は前記HETと同時投与することで、脾臓におけるE7特異的な1型T細胞応答が顕著に上昇した(図1)。
前記JTTと前記HETに関して、予防ワクチンアジュバントとして使用することで、液性免疫を増強させる効果は示唆されていた。
しかしながら、前記JTTと前記HETが全身性の細胞性免疫を増強させることはこれまで知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
一方、粘膜における1型T細胞応答に関しては、前記JTT又は前記HETの、LacE7との同時経口投与による顕著な効果は観られなかった(図1)。
しかしながら、前記JTTと前記HETが全身性の細胞性免疫を増強させることはこれまで知られておらず、本発明者らによる新たな知見である。
一方、粘膜における1型T細胞応答に関しては、前記JTT又は前記HETの、LacE7との同時経口投与による顕著な効果は観られなかった(図1)。
<粘膜免疫反応に対する漢方薬及びLBTポリペプチドのアジュバント効果>
E7タンパク質に対する粘膜細胞の免疫応答性を最適化するためには、前記JTT又は前記HET以外にアジュバントを用いることを検討することが必要と考えられた。
そこで、LTBポリペプチドをLacE7経口投与期間中に前記JTT又は前記HETと同時に投与した。
E7タンパク質に対する粘膜細胞の免疫応答性を最適化するためには、前記JTT又は前記HET以外にアジュバントを用いることを検討することが必要と考えられた。
そこで、LTBポリペプチドをLacE7経口投与期間中に前記JTT又は前記HETと同時に投与した。
LacE7単独投与に比べ、LacE7とLTBポリペプチドの同時投与によって、マウスにおけるE7特異的な1型T細胞応答のレベルは、粘膜リンパ球及び脾臓において1.5倍~2倍上昇した(図2)。JTT又はHETを、前記LacE7及び前記LTBポリペプチドと同時に投与すると、前記LacE7と前記LTBポリペプチドの同時投与と比較して、全身性の1型T細胞応答レベルが上昇した。その効果はHETにおいて特に顕著であった。
更に期待したように、粘膜における1型T細胞応答も、LacE7とLTBの同時投与に比べ、JTT又はHETを追加で同時投与することにより2倍~2.5倍上昇した(図2)。
更に期待したように、粘膜における1型T細胞応答も、LacE7とLTBの同時投与に比べ、JTT又はHETを追加で同時投与することにより2倍~2.5倍上昇した(図2)。
即ち、JTT及びHETは、LTBと同時に投与することで、経口ワクチンによる全身性及び粘膜における1型T細胞応答を顕著に上昇させることが明らかになった。
<漢方薬アジュバントによるE7に対する液性免疫応答の増強効果>
次にLacE7の経口投与を受けたマウスにおける、漢方薬、LTB、又はその両方を同時投与することによる、HPV16のE7に対する液性免疫応答への影響を調べた(図3A、図3B)。各グループ5匹のマウスにLacE7単独、又はLacE7とJTT若しくはHETを経口投与して、最後の免疫から1週間後に腸管粘膜リンパ球及び脾臓細胞を採取した前記マウスに関して、最終免疫後1週間目に血液及び腸洗浄液も採取した。前記LacE7の経口投与による全身性及び粘膜における液性免疫に関して、血清中の抗E7 IgG抗体及び腸洗浄液中の抗E7 IgA抗体の量をサンドイッチELISAで調べた(図3A、図3B)。サンプリングにおけるバイアスを無くすために、抗E7抗体価は、サンプル中の全IgG及び全IgA量に対する相対値で表した。
次にLacE7の経口投与を受けたマウスにおける、漢方薬、LTB、又はその両方を同時投与することによる、HPV16のE7に対する液性免疫応答への影響を調べた(図3A、図3B)。各グループ5匹のマウスにLacE7単独、又はLacE7とJTT若しくはHETを経口投与して、最後の免疫から1週間後に腸管粘膜リンパ球及び脾臓細胞を採取した前記マウスに関して、最終免疫後1週間目に血液及び腸洗浄液も採取した。前記LacE7の経口投与による全身性及び粘膜における液性免疫に関して、血清中の抗E7 IgG抗体及び腸洗浄液中の抗E7 IgA抗体の量をサンドイッチELISAで調べた(図3A、図3B)。サンプリングにおけるバイアスを無くすために、抗E7抗体価は、サンプル中の全IgG及び全IgA量に対する相対値で表した。
全IgG又は全IgA量に対する抗E7抗体の量比(抗E7 IgG/全IgG、抗E7 IgA/全IgA)はそれぞれ、E7タンパク質に対する全身性及び粘膜における液性免疫応答を表している。LacE7で免疫していないマウスの前記量比を1とし、それに対する比で示した。
LacE7を単独で経口投与されたマウスにおいては、血清中の抗E7 IgG抗体価が7倍以上上昇していた。LTBをLacE7と同時投与した場合に、LBTは前記抗E7 IgG抗体価に殆ど影響を与えなかった。
それに対して、LacE7及びLTBと同時にHETを投与したマウスでは、LacE7単独、並びにLacE7とLTBが同時投与されたマウスに比べ、血清中の抗E7 IgGの抗体価が2倍上昇していた。
一方、JTTをLacE7、LTBと同時投与しても、抗E7 IgGの抗体価には殆ど影響しなかった(図3A)。
LacE7を単独で経口投与されたマウスにおいては、血清中の抗E7 IgG抗体価が7倍以上上昇していた。LTBをLacE7と同時投与した場合に、LBTは前記抗E7 IgG抗体価に殆ど影響を与えなかった。
それに対して、LacE7及びLTBと同時にHETを投与したマウスでは、LacE7単独、並びにLacE7とLTBが同時投与されたマウスに比べ、血清中の抗E7 IgGの抗体価が2倍上昇していた。
一方、JTTをLacE7、LTBと同時投与しても、抗E7 IgGの抗体価には殆ど影響しなかった(図3A)。
腸洗浄液中の抗E7 IgAに関しても、HETがLacE7とLTBと同時に投与された場合に顕著な抗体価の上昇が観られた(図3B)。
これらの結果は、HETとLBTは相乗的に、経口ワクチンによる全身性及び粘膜における液性免疫を亢進させることを強く示唆している。
これらの結果は、HETとLBTは相乗的に、経口ワクチンによる全身性及び粘膜における液性免疫を亢進させることを強く示唆している。
<LacE7による粘膜でのサイトカイン産生に対する漢方アジュバントの影響>
漢方薬をLacE7と同時に経口投与することによる、粘膜組織における1型T細胞応答を促進するサイトカイン、及びTh2細胞による細胞応答(以下「2型T細胞応答」という)を促進するサイトカインの産生を調べた。
LacE7を経口投与したマウスから得られた腸洗浄液中のIFN-γとIL-4のレベルを、それぞれ前記1型T細胞応答及び前記2型T細胞応答の指標とした。
漢方薬をLacE7と同時に経口投与することによる、粘膜組織における1型T細胞応答を促進するサイトカイン、及びTh2細胞による細胞応答(以下「2型T細胞応答」という)を促進するサイトカインの産生を調べた。
LacE7を経口投与したマウスから得られた腸洗浄液中のIFN-γとIL-4のレベルを、それぞれ前記1型T細胞応答及び前記2型T細胞応答の指標とした。
免疫していないマウスに比べ、LacE7で免疫したマウスにおいては、腸洗浄液中の前記IFN-γと前記IL-4の両方の量が顕著に上昇していた。LacE7とJTTを同時投与した場合には、IFN-γ、IL-4の両方の量が3倍上昇していた。一方、前記LacE7と前記HET又は前記LTBを同時投与した場合には、前記LacE7のみを単独投与した場合と顕著な差異は認められなかった。
LacE7と、JTT又はHETに加えて、LTBを同時に投与した場合には、IFN-γの量が6倍~8倍に、IL-4の量が3倍~4倍に上昇していた(図4A、図4B)。
LacE7と、JTT又はHETに加えて、LTBを同時に投与した場合には、IFN-γの量が6倍~8倍に、IL-4の量が3倍~4倍に上昇していた(図4A、図4B)。
即ち、サイトカイン産生を指標にした場合、経口ワクチンによる粘膜での1型細胞応答には、JTTの方がHETよりもより強い効果を持つこと、LTBを一緒に使用することで、JTTとHETの効果が更に昂進されること、及び1型T細胞応答と2型T細胞応答の両方が同じ傾向を示すことが明らかになった。
また、脾臓においては、1型T細胞応答及び2型T細胞応答はそれぞれ、細胞性免疫及び液性免疫を誘導するのとは異なり、JTT、HETの粘膜における細胞性免疫及び液性免疫の誘導効果と1型T細胞応答及び2型T細胞応答の間に顕著な相互関連性が認められなかった。
このことは、粘膜においては、Th1とTh2だけでなく、Th17など、他のT細胞も細胞性免疫及び液性免疫の誘導に関与している可能性を示唆している。
このことは、粘膜においては、Th1とTh2だけでなく、Th17など、他のT細胞も細胞性免疫及び液性免疫の誘導に関与している可能性を示唆している。
<粘膜免疫反応に対する漢方薬及び合成セラミドのアジュバント効果>
E7タンパク質と漢方薬と粘膜アジュバントとの同時投与において、臨床で使用可能な粘膜アジュバントであるαGalCerを用いた場合においても粘膜における1型T細胞応答の上昇が観察されるか調べた。
そこで、LTBポリペプチドに代えてαGalCerを、LacE7経口投与期間中に前記JTTと同時に投与し、ELISPOTアッセイによりE7特異的な1型T細胞応答のレベルを調べた。
E7タンパク質と漢方薬と粘膜アジュバントとの同時投与において、臨床で使用可能な粘膜アジュバントであるαGalCerを用いた場合においても粘膜における1型T細胞応答の上昇が観察されるか調べた。
そこで、LTBポリペプチドに代えてαGalCerを、LacE7経口投与期間中に前記JTTと同時に投与し、ELISPOTアッセイによりE7特異的な1型T細胞応答のレベルを調べた。
図2においても観察されたように、マウスの粘膜リンパ球におけるE7特異的な1型T細胞応答のレベルは、LacE7単独投与に比べ、LacE7とLTBポリペプチドの同時投与によって上昇し、更にHETを、前記LacE7及び前記LTBポリペプチドと同時に投与すると、前記LacE7と前記LTBポリペプチドの同時投与と比較して上昇する傾向が観察された(図5)。
E7タンパク質と漢方薬と粘膜アジュバントとの同時投与において、粘膜アジュバントとしてHETに代えてαGalCerを用いた場合にも、HETを用いた場合と同程度、或いはそれ以上に、マウスの粘膜リンパ球におけるE7特異的な1型T細胞応答のレベルを顕著に上昇させることが明らかとなった(図5)。なお、LacE7とαGalCerだけの同時投与は、LacE7と同等の応答であった(データは示さず)。
E7タンパク質と漢方薬と粘膜アジュバントとの同時投与において、粘膜アジュバントとしてHETに代えてαGalCerを用いた場合にも、HETを用いた場合と同程度、或いはそれ以上に、マウスの粘膜リンパ球におけるE7特異的な1型T細胞応答のレベルを顕著に上昇させることが明らかとなった(図5)。なお、LacE7とαGalCerだけの同時投与は、LacE7と同等の応答であった(データは示さず)。
即ち、αGalCerは、LTBと同時に投与することで、経口ワクチンによる粘膜における1型T細胞応答を顕著に上昇させることが明らかになった。
<LacE7によるE7特異的CTLの誘導及び組織内浸潤>
LacE7を経口投与したマウスの粘膜組織において、E7タンパク質特異的な細胞障害性T細胞(E7特異的CTL)が誘導されていることを免疫組織学的解析により調べた。その結果、粘膜組織である腸管上皮の粘膜面及び粘膜固有層において、E7ペプチド特異的MHCが検出された。したがって、E7特異的CTLの誘導が認められ、さらに、E7特異的CTLが粘膜組織内に浸潤することが明らかになった。
この結果は、LacE7の経口投与がE7特異的な粘膜免疫を誘導することを示すものである。
LacE7を経口投与したマウスの粘膜組織において、E7タンパク質特異的な細胞障害性T細胞(E7特異的CTL)が誘導されていることを免疫組織学的解析により調べた。その結果、粘膜組織である腸管上皮の粘膜面及び粘膜固有層において、E7ペプチド特異的MHCが検出された。したがって、E7特異的CTLの誘導が認められ、さらに、E7特異的CTLが粘膜組織内に浸潤することが明らかになった。
この結果は、LacE7の経口投与がE7特異的な粘膜免疫を誘導することを示すものである。
以上の結果から、十全大補湯及び補中益気湯のいずれかを含んだLacE7ワクチンは、CIN3患者だけでなく、子宮頚癌患者、更に他のHPV関連癌の患者、及び前記HPV関連癌の前癌病変患者に対しても治療効果をもつ可能性が十分期待できる。
更に適当な免疫アジュバントを含有させた、十全大補湯及び補中益気湯のいずれかを含んだLacE7ワクチンは、より優れた治療効果をもつことが期待できる。
更に適当な免疫アジュバントを含有させた、十全大補湯及び補中益気湯のいずれかを含んだLacE7ワクチンは、より優れた治療効果をもつことが期待できる。
本発明の粘膜免疫賦活化剤は、HPVワクチンなどのウイルスワクチン及び細菌ワクチンと併用することで粘膜免疫を賦活化するのに好適である。
本発明のHPV感染症治療用経口医薬組成物は、HPV感染症の患者に投与することにより、その治療用ワクチンとして使用するのに好適である。
本発明のHPV感染症治療用経口医薬組成物は、HPV感染症の患者に投与することにより、その治療用ワクチンとして使用するのに好適である。
本発明の態様としては、例えば、以下の通りである。
<1> 滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有することを特徴とする粘膜免疫賦活化剤である。
<2> 滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである前記<1>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<3> 粘膜アジュバントが、コレラ毒素(CT)、大腸菌易熱性毒素(LT)、ベロ毒素(VT)、ジフテリア毒素(DT)、及び百日咳毒素(PT)に由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド(αGalCer)のうちの少なくとも1つである前記<1>から<2>のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<4> 粘膜アジュバントは、LTのBサブユニット(LTB)ポリペプチド及び合成セラミド(αGalCer)のいずれかである前記<3>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<5> 経口で投与される場合に、患者の粘膜において、その前後又は同時に経口投与される抗原に特異的な細胞性免疫を賦活化させる前記<1>から<4>のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<6> 抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のポリペプチドである前記<5>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<7> HPV由来のポリペプチドは、1から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する前記<6>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<8> HPV由来のポリペプチドは、HPV由来のポリペプチドを発現させたLactobacillus caseiの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はLactobacillus caseiを死菌化させた粉体に添加される前記<6>から<7>のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<9> HPV由来のポリペプチドは、HPVのE7ポリペプチドである前記<6>から<8>のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<10> HPVのE7ポリペプチドは、HPV16に由来する前記<9>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<11> HPVのE7ポリペプチドは、配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなる前記<10>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<12> HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有することを特徴とするHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<13> 滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである前記<12>に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<14> 更に粘膜アジュバントを含有する前記<12>から<13>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<15> HPVのE7ポリペプチドは、HPV16に由来する前記<12>から<14>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<16> HPVのE7ポリペプチドは、1から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する前記<12>から<15>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<17> HPVのE7ポリペプチドは、配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなる前記<16>に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<18> HPVのE7ポリペプチドは、HPVのE7ポリペプチドを発現させたLactobacillus caseiの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はLactobacillus caseiを死菌化させた粉体に添加される前記<12>から<17>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<19> 患者の粘膜において、HPVのE7ポリペプチド特異的な細胞性免疫を賦活化させる前記<12>から<18>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<20> 患者は、子宮頚癌前癌病変患者及び子宮頚癌患者のいずれかである前記<19>に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<21> 粘膜アジュバントは、CT、LT、VT、DT、及びPTに由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド(αGalCer)のうちの少なくとも1つである前記<14>から<20>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<22> 粘膜アジュバントは、LTBポリペプチド及び合成セラミド(αGalCer)のいずれかである前記<21>に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<1> 滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有することを特徴とする粘膜免疫賦活化剤である。
<2> 滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである前記<1>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<3> 粘膜アジュバントが、コレラ毒素(CT)、大腸菌易熱性毒素(LT)、ベロ毒素(VT)、ジフテリア毒素(DT)、及び百日咳毒素(PT)に由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド(αGalCer)のうちの少なくとも1つである前記<1>から<2>のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<4> 粘膜アジュバントは、LTのBサブユニット(LTB)ポリペプチド及び合成セラミド(αGalCer)のいずれかである前記<3>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<5> 経口で投与される場合に、患者の粘膜において、その前後又は同時に経口投与される抗原に特異的な細胞性免疫を賦活化させる前記<1>から<4>のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<6> 抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のポリペプチドである前記<5>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<7> HPV由来のポリペプチドは、1から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する前記<6>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<8> HPV由来のポリペプチドは、HPV由来のポリペプチドを発現させたLactobacillus caseiの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はLactobacillus caseiを死菌化させた粉体に添加される前記<6>から<7>のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<9> HPV由来のポリペプチドは、HPVのE7ポリペプチドである前記<6>から<8>のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<10> HPVのE7ポリペプチドは、HPV16に由来する前記<9>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<11> HPVのE7ポリペプチドは、配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなる前記<10>に記載の粘膜免疫賦活化剤である。
<12> HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有することを特徴とするHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<13> 滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである前記<12>に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<14> 更に粘膜アジュバントを含有する前記<12>から<13>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<15> HPVのE7ポリペプチドは、HPV16に由来する前記<12>から<14>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<16> HPVのE7ポリペプチドは、1から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する前記<12>から<15>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<17> HPVのE7ポリペプチドは、配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなる前記<16>に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<18> HPVのE7ポリペプチドは、HPVのE7ポリペプチドを発現させたLactobacillus caseiの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はLactobacillus caseiを死菌化させた粉体に添加される前記<12>から<17>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<19> 患者の粘膜において、HPVのE7ポリペプチド特異的な細胞性免疫を賦活化させる前記<12>から<18>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<20> 患者は、子宮頚癌前癌病変患者及び子宮頚癌患者のいずれかである前記<19>に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<21> 粘膜アジュバントは、CT、LT、VT、DT、及びPTに由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド(αGalCer)のうちの少なくとも1つである前記<14>から<20>のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
<22> 粘膜アジュバントは、LTBポリペプチド及び合成セラミド(αGalCer)のいずれかである前記<21>に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物である。
Claims (22)
- 滋養強壮作用を有する漢方薬と、粘膜アジュバントとを含有することを特徴とする粘膜免疫賦活化剤。
- 滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである請求項1に記載の粘膜免疫賦活化剤。
- 粘膜アジュバントが、コレラ毒素(CT)、大腸菌易熱性毒素(LT)、ベロ毒素(VT)、ジフテリア毒素(DT)、及び百日咳毒素(PT)に由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド(αGalCer)のうちの少なくとも1つである請求項1から2のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤。
- 粘膜アジュバントは、LTのBサブユニット(LTB)ポリペプチド及び合成セラミド(αGalCer)のいずれかである請求項3に記載の粘膜免疫賦活化剤。
- 経口で投与される場合に、患者の粘膜において、その前後又は同時に経口投与される抗原に特異的な細胞性免疫を賦活化させる請求項1から4のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤。
- 抗原は、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のポリペプチドである請求項5に記載の粘膜免疫賦活化剤。
- HPV由来のポリペプチドは、1から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する請求項6に記載の粘膜免疫賦活化剤。
- HPV由来のポリペプチドは、HPV由来のポリペプチドを発現させたLactobacillus caseiの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はLactobacillus caseiを死菌化させた粉体に添加される請求項6から7のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤。
- HPV由来のポリペプチドは、HPVのE7ポリペプチドである請求項6から8のいずれかに記載の粘膜免疫賦活化剤。
- HPVのE7ポリペプチドは、HPV16に由来する請求項9に記載の粘膜免疫賦活化剤。
- HPVのE7ポリペプチドは、配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなる請求項10に記載の粘膜免疫賦活化剤。
- HPVのE7ポリペプチドと、滋養強壮作用を有する漢方薬とを含有することを特徴とするHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- 滋養強壮作用を有する漢方薬が、十全大補湯及び補中益気湯の少なくともいずれかである請求項12に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- 更に粘膜アジュバントを含有する請求項12から13のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- HPVのE7ポリペプチドは、HPV16に由来する請求項12から14のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- HPVのE7ポリペプチドは、1から数個のアミノ酸を欠失、置換又は付加する変異を有する請求項12から15のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- HPVのE7ポリペプチドは、配列番号2で表わされるアミノ酸配列からなる請求項16に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- HPVのE7ポリペプチドは、HPVのE7ポリペプチドを発現させたLactobacillus caseiの組換え体を死菌化させた粉体に含有される、又はLactobacillus caseiを死菌化させた粉体に添加される請求項12から17のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- 患者の粘膜において、HPVのE7ポリペプチド特異的な細胞性免疫を賦活化させる請求項12から18のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- 患者は、子宮頚癌前癌病変患者及び子宮頚癌患者のいずれかである請求項19に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- 粘膜アジュバントは、CT、LT、VT、DT、及びPTに由来する野生型ポリペプチド又は変異型ポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチド並びに合成セラミド(αGalCer)のうちの少なくとも1つである請求項14から20のいずれかに記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
- 粘膜アジュバントは、LTBポリペプチド及び合成セラミド(αGalCer)のいずれかである請求項21に記載のHPV感染症治療用経口医薬組成物。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020177003069A KR101887040B1 (ko) | 2012-06-20 | 2013-06-19 | 점막 면역 부활화제 및 hpv 감염증 치료용 경구 의약 조성물 |
KR1020157001417A KR101705268B1 (ko) | 2012-06-20 | 2013-06-19 | 점막 면역 부활화제 및 hpv 감염증 치료용 경구 의약 조성물 |
JP2014521497A JP6014666B2 (ja) | 2012-06-20 | 2013-06-19 | 粘膜免疫賦活化剤及びhpv感染症治療用経口医薬組成物 |
EP13806404.3A EP2865390B1 (en) | 2012-06-20 | 2013-06-19 | Mucosal immunity-stimulating agent, and oral pharmaceutical composition for treating hpv infection |
CN201380032594.8A CN104379170B (zh) | 2012-06-20 | 2013-06-19 | 粘膜免疫刺激剂及hpv感染症治疗用经口药物组合物 |
US14/576,933 US20150098959A1 (en) | 2012-06-20 | 2014-12-19 | Mucosal Immunity-Stimulating Agent, and Oral Pharmaceutical Composition for Treating HPV Infection |
HK15107087.2A HK1206599A1 (en) | 2012-06-20 | 2015-07-24 | Mucosal immunity-stimulating agent, and oral pharmaceutical composition for treating hpv infection hpv |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012138943 | 2012-06-20 | ||
JP2012-138943 | 2012-06-20 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
US14/576,933 Continuation US20150098959A1 (en) | 2012-06-20 | 2014-12-19 | Mucosal Immunity-Stimulating Agent, and Oral Pharmaceutical Composition for Treating HPV Infection |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2013191225A1 true WO2013191225A1 (ja) | 2013-12-27 |
Family
ID=49768819
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2013/066893 WO2013191225A1 (ja) | 2012-06-20 | 2013-06-19 | 粘膜免疫賦活化剤及びhpv感染症治療用経口医薬組成物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20150098959A1 (ja) |
EP (1) | EP2865390B1 (ja) |
JP (1) | JP6014666B2 (ja) |
KR (2) | KR101705268B1 (ja) |
CN (1) | CN104379170B (ja) |
HK (1) | HK1206599A1 (ja) |
WO (1) | WO2013191225A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016121865A1 (ja) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | 国立大学法人東京大学 | 乳酸菌含有組成物、hpv感染症及びhpv関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物、及び粘膜免疫誘導剤 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106421673B (zh) * | 2016-12-13 | 2020-01-24 | 上海世道健康科技有限公司 | 一种治疗hpv病毒感染的中药组合物及其制备方法 |
CN111560330B (zh) * | 2020-05-12 | 2022-04-26 | 天津科技大学 | 一种具有免疫调节、抗炎和抗宫颈癌作用的干酪乳杆菌及应用 |
CN114306500A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-04-12 | 苏州源流铭医疗科技有限公司 | 一种新型中成药配方 |
CN115137791B (zh) * | 2022-08-09 | 2023-04-28 | 杭州师范大学 | 治疗气虚湿热型hpv感染的中药组合物及其制备方法 |
Citations (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996006627A1 (en) | 1994-08-26 | 1996-03-07 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant |
WO1998042375A1 (en) | 1997-03-21 | 1998-10-01 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial adp-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
WO1999026654A1 (en) | 1997-11-25 | 1999-06-03 | Duphar International Research B.V. | Vaccines with an ltb adjuvant |
WO2000037609A2 (en) | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Boyce Thompson Institute For Plant Research At Cornell | Orally immunogenic bacterial enterotoxins expressed in transgenic plants |
WO2000045841A2 (en) | 1999-02-05 | 2000-08-10 | Merck & Co., Inc. | Human papilloma virus vaccine formulations |
WO2003078455A2 (en) | 2002-03-18 | 2003-09-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Virus like particle from papillomavirus and their use in vaccine |
WO2004028561A1 (ja) | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | 免疫応答誘導方法 |
JP2005500336A (ja) * | 2001-07-25 | 2005-01-06 | ニューヨーク・ユニバーシティ | 感染および癌に対するワクチンのためのアジュバントとしてのグリコシルセラミドの使用 |
JP2005097267A (ja) | 2003-08-11 | 2005-04-14 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン |
JP2006070217A (ja) | 2004-09-03 | 2006-03-16 | Kitasato Inst:The | オウギ属植物地上部由来の多糖および生体防御機能賦活化剤 |
WO2006100108A1 (en) | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Fermentation process for the production of diphtheria toxin |
WO2007018152A1 (ja) | 2005-08-05 | 2007-02-15 | The University Of Tokushima | IgA抗体の選択的産生からIgA及びIgG両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100403642B1 (ko) * | 2001-06-11 | 2003-10-30 | (주)명보그로브 | 미끄럼방지용 속건성 고무 조성물과 그 제조방법 |
GB0314682D0 (en) * | 2003-06-24 | 2003-07-30 | Isis Innovation | Materials and methods relating to the modulation of T cell response to soluble antigen |
-
2013
- 2013-06-19 JP JP2014521497A patent/JP6014666B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2013-06-19 KR KR1020157001417A patent/KR101705268B1/ko active IP Right Grant
- 2013-06-19 KR KR1020177003069A patent/KR101887040B1/ko active IP Right Grant
- 2013-06-19 WO PCT/JP2013/066893 patent/WO2013191225A1/ja unknown
- 2013-06-19 EP EP13806404.3A patent/EP2865390B1/en active Active
- 2013-06-19 CN CN201380032594.8A patent/CN104379170B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-12-19 US US14/576,933 patent/US20150098959A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-07-24 HK HK15107087.2A patent/HK1206599A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996006627A1 (en) | 1994-08-26 | 1996-03-07 | The Administrators Of The Tulane Educational Fund | Mutant enterotoxin effective as a non-toxic oral adjuvant |
WO1998042375A1 (en) | 1997-03-21 | 1998-10-01 | Chiron Corporation | Detoxified mutants of bacterial adp-ribosylating toxins as parenteral adjuvants |
WO1999026654A1 (en) | 1997-11-25 | 1999-06-03 | Duphar International Research B.V. | Vaccines with an ltb adjuvant |
JP2001523729A (ja) * | 1997-11-25 | 2001-11-27 | デユフアー・インターナシヨナル・リサーチ・ベー・ブイ | Ltbアジュバントを含むワクチン |
WO2000037609A2 (en) | 1998-12-22 | 2000-06-29 | Boyce Thompson Institute For Plant Research At Cornell | Orally immunogenic bacterial enterotoxins expressed in transgenic plants |
WO2000045841A2 (en) | 1999-02-05 | 2000-08-10 | Merck & Co., Inc. | Human papilloma virus vaccine formulations |
JP2005500336A (ja) * | 2001-07-25 | 2005-01-06 | ニューヨーク・ユニバーシティ | 感染および癌に対するワクチンのためのアジュバントとしてのグリコシルセラミドの使用 |
WO2003078455A2 (en) | 2002-03-18 | 2003-09-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Virus like particle from papillomavirus and their use in vaccine |
WO2004028561A1 (ja) | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. | 免疫応答誘導方法 |
JP2005097267A (ja) | 2003-08-11 | 2005-04-14 | Handai Biseibutsubiyou Kenkyukai | 粘膜免疫誘導アジュバントを含む新規ワクチン |
JP2006070217A (ja) | 2004-09-03 | 2006-03-16 | Kitasato Inst:The | オウギ属植物地上部由来の多糖および生体防御機能賦活化剤 |
WO2006100108A1 (en) | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Fermentation process for the production of diphtheria toxin |
WO2007018152A1 (ja) | 2005-08-05 | 2007-02-15 | The University Of Tokushima | IgA抗体の選択的産生からIgA及びIgG両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン |
Non-Patent Citations (19)
Title |
---|
A. DALPKE ET AL., IMMUNOLOGY, vol. 204, 2001, pages 667 - 676 |
ADACHI K ET AL.: "Oral immunization with a Lactobacillus casei vaccine expressing human papillomavirus (HPV) type 16 E7 is an effective strategy to induce mucosal cytotoxic lymphocytes against HPV16 E7.", VACCINE., vol. 28, no. 16, 17 February 2010 (2010-02-17), pages 2810 - 2817, XP055182241 * |
C. L. TRIMBLE; I. H. FRAZER, LANCET ONCOL., vol. 10, 2009, pages 975 - 980 |
CYONG J ET AL.: "Immunomodulatory action of Kampo tonics and its potential mode of action in aged mice, Journal of traditional medicines", vol. 15, no. 5, 27 February 1999 (1999-02-27), pages 280 - 281, XP008175991 * |
D. MIZUNO ET AL., VACCINE, vol. 29, 2011, pages 5368 - 5378 |
H. FUJITA ET AL., J. IMMUNOL., vol. 183, 2009, pages 254 - 260 |
H. KAYAMURO ET AL., BIOMATERIALS, vol. 30, 2009, pages 5869 - 5876 |
H. KIYOHARA ET AL., EVID. BASED COMPLEMENT. ALTERNAT. MED., vol. 3, 2006, pages 459 - 467 |
H. POO ET AL., INT J. CANCER, vol. 119, 2006, pages 1702 - 1709 |
K. ADACHI ET AL., VACCINE, vol. 28, 2010, pages 2810 - 2817 |
KOICHIRO SAITO: "Koto Nyutoshusho", JOHNS, vol. 27, no. 9, 1 September 2011 (2011-09-01), pages 1460 - 1462, XP008175909 * |
MATSUMOTO T ET AL.: "Hochuekkito, a Kampo (traditional Japanese herbal) Medicine, Enhances Mucosal IgA Antibody Response in Mice Immunized with Antigen-entrapped Biodegradable Microparticles.", EVID BASED COMPLEMENT ALTERNAT MED., vol. 7, no. 1, 29 October 2007 (2007-10-29), pages 69 - 77, XP008175992 * |
MATSUMOTO T ET AL.: "Orally administered Kampo (Japanese herbal) medicine, ''Juzen-Taiho- To'' modulates cytokine secretion in gut associated lymphoreticular tissues in mice.", PHYTOMEDICINE., vol. 6, no. 6, January 2000 (2000-01-01), pages 425 - 430, XP055182238 * |
N. G. CORTESS-PEREZ ET AL., VACCINE, vol. 25, 2007, pages 6581 - 6588 |
NORITO TAKEMOTO ET AL.: "Effect of TJ-48 on murine cellular immunity", JAPANESE JOURNAL OF INFLAMMATION, vol. 9, no. 1, 1989, pages 49 - 52, XP003034247 * |
POO H. ET AL., INT. J. IMMUNOL., vol. 119, 2006, pages 1702 - 1709 |
R. HOPFL ET AL., LANCET, vol. 356, 2000, pages 1985 - 1986 |
TAGUCHI A ET AL.: "Adjuvant effect of Japanese herbal medicines on the mucosal type 1 immune responses to human papillomavirus (HPV) E7 in mice immunized orally with Lactobacillus-based therapeutic HPV vaccine in a synergistic manner.", VACCINE., vol. 30, no. 36, 21 June 2012 (2012-06-21), pages 5368 - 5372, XP028428427 * |
Y. MORISHIMA ET AL., EUR. J. IMMUNOL., vol. 35, 2005, pages 2803 - 2814 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016121865A1 (ja) * | 2015-01-30 | 2016-08-04 | 国立大学法人東京大学 | 乳酸菌含有組成物、hpv感染症及びhpv関連腫瘍の少なくともいずれかの治療用経口医薬組成物、及び粘膜免疫誘導剤 |
KR20170115066A (ko) | 2015-01-30 | 2017-10-16 | 고쿠리츠다이가쿠호징 도쿄다이가쿠 | 유산균 함유 조성물, hpv 감염증 및 hpv 관련 종양 중 적어도 어느 하나의 치료용 경구 의약 조성물, 및 점막 면역 유도제 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20170017006A (ko) | 2017-02-14 |
US20150098959A1 (en) | 2015-04-09 |
CN104379170A (zh) | 2015-02-25 |
JPWO2013191225A1 (ja) | 2016-05-26 |
HK1206599A1 (en) | 2016-01-15 |
JP6014666B2 (ja) | 2016-10-25 |
KR101887040B1 (ko) | 2018-08-09 |
KR20150023812A (ko) | 2015-03-05 |
KR101705268B1 (ko) | 2017-02-09 |
EP2865390A4 (en) | 2016-04-06 |
EP2865390A1 (en) | 2015-04-29 |
EP2865390B1 (en) | 2019-08-21 |
CN104379170B (zh) | 2017-05-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Frazer et al. | Phase 1 study of HPV16-specific immunotherapy with E6E7 fusion protein and ISCOMATRIX™ adjuvant in women with cervical intraepithelial neoplasia | |
Das et al. | Prospects and prejudices of human papillomavirus vaccines in India | |
AU2008257792B2 (en) | HPV epitopes targeted by T cells infiltrating cervical malignancies for use in vaccines | |
JP6014666B2 (ja) | 粘膜免疫賦活化剤及びhpv感染症治療用経口医薬組成物 | |
JP5888823B2 (ja) | 皮内hpvペプチドワクチン接種 | |
US20050287161A1 (en) | Vaccine | |
TW200840869A (en) | Papillomavirus vaccine | |
EP3254693B1 (en) | Lactic-acid-bacteria-containing composition, oral pharmaceutical composition for treating hpv infection and/or hpv-associated tumors, and mucosal immunity-inducing agent | |
JP2004531540A (ja) | Hiv抗原並びにhsv抗原及び/又はhpv抗原を含む多価ワクチン | |
JP2011037902A (ja) | パピローマウイルス感染の治療方法 | |
AU2005253723B2 (en) | Vaccine against HPV16 and HPV18 and at least another HPV type selected from HPV 31, 45 or 52 | |
JP2008539184A (ja) | ワクチン | |
Brun et al. | Targeted immunotherapy of high‑grade cervical intra‑epithelial neoplasia: Expectations from clinical trials | |
WO2004052395A1 (en) | L2-peptide of the human papillomavirus associated with virus-like particles | |
Bell et al. | Chemoprevention and vaccines: a review of the nonsurgical options for the treatment of cervical dysplasia | |
Su et al. | Adjuvant effect of docetaxel on HPV16 L2E6E7 fusion protein vaccine in a mouse model | |
US7858098B2 (en) | Vaccine | |
CN112409478A (zh) | 一种广谱hpv抗体及其制备方法和应用 | |
US20180250378A1 (en) | Combination of therapeutic vaccine and pd-1-related blockade for treating human papillomavirus-associated diseases | |
JP2013512914A (ja) | ヒトパピローマウイルス(hpv)により発症された腫瘍性又は癌性病変に対するワクチン、処置、用途及び方法 | |
CA2606206A1 (en) | Vaccine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 13806404 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2014521497 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 20157001417 Country of ref document: KR Kind code of ref document: A |