JP2008539184A

JP2008539184A - ワクチン

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Publication number: JP2008539184A
Application number: JP2008508156A
Authority: JP
Inventors: コロー，ブリジット，デジレ，アルベルト
Original assignee: グラクソスミスクラインバイオロジカルズソシエテアノニム
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-24
Publication date: 2008-11-13
Also published as: EP1877086A2; SG159525A1; MX2007013472A; WO2006114312A3; AR054259A1; KR20080005585A; EA013326B1; EA200702079A1; AU2006239422A1; WO2006114312A2; NO20075194L; CA2606092A1; US20090181052A1

Abstract

HPV感染および/または疾患の予防方法であって、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチン、ならびに該第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分を含まないが少なくとも１種の他の発癌性HPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンを送達することを含み、該第１および第２のワクチンはいずれの順序でも送達でき、適切な時間間隔をあけて送達される、前記方法。

Description

本発明は、ヒトパピローマウイルス(HPV)ワクチンに関する。

パピローマウイルスは、種特異性の高い小型DNA腫瘍ウイルスである。これまで、100以上の別個のヒトパピローマウイルス(HPV)遺伝子型が記載されている。HPVは、一般的に皮膚(例えば、HPV-1および-2)または粘膜面(例えば、HPV-6および-11)のいずれかに特異的で、通常、数ヶ月または数年間続く良性腫瘍(疣)を引き起こす。このような良性腫瘍は、関与する個人にとっては苦痛であり得るが、一部の例外を除いて生死に関わるものではない。

一部のHPVは、癌にも関連し、発癌性HPV型として知られている。HPVとヒト癌との最も強い明確な関連性としては、HPV-16およびHPV-18と、子宮頸癌との間に存在するものがある。子宮頸癌は、発展途上国で最もよくある悪性腫瘍であり、世界中で毎年約500,000の新患が生じている。
癌を引き起こし得る他のHPV型は、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68型である。16および18 型は、子宮頸癌との関連性が最も高い型である。31および45型は、癌の危険性との関連性が次に高い型である(Munoz N、Bosch FX、de Sanjose Sら、International Agency for Research on Cancer Multicenter Cervical Cancer Study Group. N Engl J Med 2003；348: 518-27)。

HPVウイルス様粒子(VLP)は、HPV治療のための可能性のあるワクチンとして提案されてきた。動物による研究から、VLPは、他のHPV型の感染に対して交差防御をもたらさないことが示されている。例えば、Suzich、J.A.ら、Proc Natl Acad Sci、92:11553-11557、1995およびBreitburd、Seminars in Cancer Biology、vol 9、1999、pp 431-445を参照されたい。

WO2004/056389は、HPV16、18 VLPワクチンが16および18以外のHPV型による感染に対して交差防御をもたらすことができると開示している。統計的に有意な防御が、特定のHPV型のグループに対して認められた。

複数のHPV型に対して防御するワクチンが未だに必要とされている。

本発明は、HPV感染および/または疾患に対して防御するためのワクチン接種スケジュールに関し、このスケジュールは、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチンと、第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分を含まないが少なくとも１つの他の発癌性HPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンとの送達を含み、該第１および第２のワクチンはいずれの順序でも送達され得、かつ適切な間隔をあけて送達される。

本発明は、さらに、HPV感染または疾患に対して防御するためのワクチン接種スケジュールに関し、このスケジュールは、少なくともHPV16およびHPV18に由来するL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチンを送達し、そして適切な間隔をあけた後に、第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分を含まないが少なくとも１つの他の発癌性HPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンを送達することを含む。

本発明は、さらに、HPV感染および/または疾患の予防方法であって、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチンと、第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分を含まないが少なくとも１つの他の発癌性HPV型に由来するL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンとを送達することを含み、該第１および第２のワクチンはいずれの順序でも送達でき、適切な時間間隔をあけて送達される、前記方法に関する。

本発明はまた、HPV感染および/または疾患の予防方法であって、少なくともHPV16およびHPV18に由来するL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチンを送達し、そして適切な間隔をあけた後、第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分は含まないが少なくとも１つの他の発癌性HPV型に由来するL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンを送達することを含む前記方法に関する。

本発明はまた、本発明のワクチン組成物自体に関する。

本発明はまた、本発明の第１および第２のワクチン組成物を含むキットに関する。

一態様において、本発明は、１種の第１のHPV型に由来するHPV L1タンパク質またはその免疫原性断片の、第２の異なるHPV型に由来するHPV L1タンパク質またはその免疫原性断片により生成される免疫応答を増強するための医薬の製造における使用に関する。一態様において、上記第２のHPV型由来のL1タンパク質またはその断片はウイルス様粒子の形態であり、同じくウイルス様粒子の形態である上記第１のHPV型由来のL1タンパク質またはその断片により生成される応答を増強するために使用される。

本発明はまた、HPV16に対する応答を増強するための、好ましくはVLPの形態の、HPV16ではないHPV株に由来するHPV L1の使用に関する。

本発明はまた、HPV18に対する応答を増強するための、好ましくはVLPの形態の、HPV18ではないHPV株に由来するL1の使用に関する。

一態様では、免疫応答を増強するための株は、HPV31、HPV45およびHPV52等の、実施例１においていくらかのレベルの交差防御が認められる株である。

偶発的および持続的感染の両方に対してHPV16およびHPV18がもたらす交差防御の一般的な存在が、特定のHPV型のグループに関連して評価されて、WO2004/056389に開示されている。

驚くべきことに、本発明者らは、特定の(HPV16、HPV18ではない)HPV型に対する交差防御が、(これらの型に対するHPV16およびHPV18ワクチンの効力により評価した際に)特定の他の(HPV16、HPV18ではない)HPV型に対してよりも高いことを見出した。交差防御は、異なるHPV型により引き起こされる感染(偶発的もしくは持続的)および/または疾患に対して１種のHPV型を含むワクチンによりもたらされる防御と考えることもできる。交差防御はワクチン効力(V.E.)を考慮することによって評価し得る。ここで、V.E.は、所与の型について、ワクチンによる感染または疾患に対する防御の、プラシーボ群と比較した改善％である。

感染は、偶発的感染又は持続的感染であり得る。疾患は、HPV感染に関連する異常細胞診であるASCUS、CIN1、CIN2、CIN3または子宮頸癌であり得る。感染は、例えばPCRにより評価することができる。疾患は、組織学的検査またはp16等のバイオマーカーの分析により評価し得る。
交差防御がプラシーボにより得られるものより統計的に有意に高い場合に、いくらかのレベルの交差防御が存在すると考えられる。交差防御のレベルは、ワクチン中に存在しないHPV型により引き起こされる感染または疾患に対するHPVワクチンのワクチン効力により測定した場合に、プラシーボと比較して0％より大きく、最大20％、最大40％、最大60％、最大70％、最大80％、または80％を上回ることが適切である。

このような知見は、ワクチン設計およびワクチン接種スケジュールの設計について潜在的な意味を持つ。

例えば、交差防御が認められる型を、同種防御を提供すると同時に互いに対する初回免疫または追加免疫として適切な間隔をあけて使用することができ、所与のHPV型のいずれかに対するワクチン接種数を減らし得る。

本発明は、HPV感染または疾患に対して防御するためのワクチン接種スケジュールであって、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチンと、第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分を含まないが少なくとも１種の他の発癌性HPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンとを送達することを含み、該第１および第２のワクチンはいずれの順序でも送達でき、適切な間隔をあけて送達される、前記スケジュールに関する。

適切な間隔は7日、2週間、4週間、6週間、8週間、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、6ヶ月、1年であり得る。その場合、ワクチン接種スケジュールは、例えば、0、1ヶ月；0、2ヶ月；0、4ヶ月；または0、6ヶ月であり得る。一般的に適切な間隔は、例えば抗体価または細胞性免疫の測定により、二番目に送達されるワクチンの追加免疫効果を認めることができるものである。一般的に、適切な間隔は、例えば第２のワクチンの送達の前に、血清抗体価で測定した場合に、ワクチンの送達により一次免疫応答が誘発されているものである。一態様では、適切な間隔は、一次応答(典型的に抗体応答)のピークの直後である。一態様では、この間隔は、初回ワクチン接種から2〜26週間、適切には2〜22週間、2〜18週間、2〜14週間、2〜12週間、2〜10週間、2〜8週間、2〜6週間、そして一態様では初回ワクチン接種から１ヵ月である。

発癌性HPV型としては、HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68が挙げられる。

交差防御は、第１のワクチンの少なくとも１種の成分と、第２のワクチンの１種の成分との間で認められることが適切である。このように、第１のワクチンはHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含むことが適切であり、第２のワクチンはHPV31、HPV45またはHPV52由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含むことが適切である。

一態様では、第１のワクチンは、HPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む。別の態様では、第１のワクチンは、HPV型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68の１種以上等の、追加のHPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む。一態様では、HPV型はHPV33である。

別の態様では、第２のワクチンは第１のワクチンの少なくともHPV16および18抗原を含まず、本明細書においてHPV16および/またはHPV18との交差防御の相互作用を有することが示されたHPV型(適当なのはHPV31および/または45および/または52)由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む。第２のワクチンは、HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68の１種以上等の、追加の型を含み得る。

一態様では、第２のワクチンは、HPV31および/またはHPV45由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む。さらなる態様では、第２のワクチンは、52型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む。

さらなる態様では、第２のワクチンは、58型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む。

したがって、本発明は、HPV31由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含むが、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片は含まないワクチン組成物に関する。

本発明はまた、HPV45由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含むが、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片をを含まないワクチン組成物に関する。

本発明はまた、HPV52に由来するL1タンパク質またはその免疫原性断片を含むが、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含まないワクチン組成物に関する。

別の態様では、第２のワクチンは、第１のワクチンの抗原を含む全てのHPV L1を含まない。適切には、第１および第２のワクチンは、同一のL1タンパク質または同一の完全タンパク質断片を共有しない。誤解を招かないために、第１および第２のワクチンで使用されるL1タンパク質またはL1断片中には、類似または同一の領域が存在し得る。しかし、第１および第２のワクチンの両方において完全なL1またはその断片のいずれかである同一の抗原を使用することは、本態様においては好ましくない。

一態様では、第１および第２のワクチンは、同じHPV型に由来するHPV L1タンパク質またはその免疫原性断片を共有しない。

一態様では、第１のワクチンの成分は、HPV16およびHPV18等、系統発生的に密接に関係しないHPV種を含む。

一態様では、第２のワクチンの成分は、HPV31およびHPV45等、系統発生的に密接に関係しないHPV種を含む。

系統発生的に密接に関係しない型は、de Villiersら、Virology. 2004 Jun 20;324(1):17-27により評価された際に異なる種群に属する。

適切には、第１のワクチン成分中のHPV16および/またはHPV18成分は、第２のワクチン中の少なくとも１種のHPV型により引き起こされるHPV感染および/または疾患に対して防御する。

適切には、本発明の第１および第２のワクチンは、以下のHPV型由来のHPV L1 VLPを含む:
第１のワクチン HPV16、HPV18およびHPV33の組合せ。第１のワクチンはHPV58をさらに含み得る。

第２のワクチン HPV31、HPV45、ならびに場合により（任意に）HPV52および/またはHPV58、の組合せ。

適切には、二番目に送達されるワクチンは、一番目に送達されるワクチン中の少なくとも１種の成分に対する免疫応答を増強する。免疫応答の増強は、例えば、ELISA等の当該分野において標準的な方法を使用して抗体価により、適切に測定できる。

一態様では、HPV L1タンパク質またはその免疫原性断片を使用して、異なるHPV型に対して先に生じさせた交差反応性抗体を増強する。

一態様では、本発明は、第１のHPV型に由来するL1タンパク質またはその免疫原性断片の、第２の異なるHPV型に対する免疫応答を増強するための使用に関する。

一態様では、本発明は、１種のHPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片の、同種HPV型に対する免疫応答を増強するための使用に関する。

一態様では、本発明は、1種のHPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片の、第2の異なるHPV型に対する免疫応答を増強するための使用であって、該第2の型が該第1の型と系統発生的に関連している、前記使用に関する。HPV型間の系統発生関係は当該分野で周知である(例えば、de Villersら、Virology. 2004 Jun 20;324(1):17-27を参照)。この文献では、パピローマウイルスが系統発生的に関係する異なる種に分類されることが理解できる。例えば、種16には16、31、33型がある。種７には18および45型がある。

別の態様では、本発明は、L1タンパク質またはその断片を含むHPV16ワクチンに対する(によって生成される)免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV31 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用に関する。

別の態様では、本発明は、L1タンパク質またはその断片を含むHPV16ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV52 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用に関する。

別の態様では、本発明は、L1タンパク質またはその断片を含むHPV18ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV45 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用に関する。

別の態様では、本発明は、L1タンパク質またはその断片を含むHPV45ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV18 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用に関する。

別の態様では、本発明は、L1タンパク質またはその断片を含むHPV31ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV16 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用に関する。

別の態様では、本発明は、L1タンパク質またはその断片を含むHPV52ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV16 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用に関する。

本発明は、一態様において、HPV感染または疾患に対して防御するためのワクチン接種スケジュールであって、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチンを送達し、そして適切な間隔をあけた後、第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分を含まないが少なくとも１種の他の発癌性HPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンを送達することを含む、前記ワクチン接種スケジュールに関する。本発明のこの態様において、上で定義した第１および第２のワクチンの成分は、逆の順序でも送達できる。例として、送達されるべき第１のHPVはHPV31およびHPV45抗原を含み、他方、送達されるべき第２のワクチンはHPV16およびHPV18抗原を含み得る。

本発明のワクチンは、本発明の制約内で、他の抗原性の発癌性型(例えば HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)、皮膚型(例えば5、8型)および生殖器疣型(6、11)等の、他のHPV型由来の抗原をさらに含むことができる。

適切には、各ワクチンは、ワクチン中に存在するHPV型の持続的感染に対して防御可能である。

適切には、各ワクチンは、ワクチン中に存在するHPV型の偶発的感染に対して防御可能である。

偶発的および持続的子宮頸部感染は実施例１で定義する。

各ワクチンは、適切にはワクチン中に存在しない型（HPV31、45または52等）により引き起こされる、HPV感染に関連する細胞学的異常(例えば、ASCUS、CIN1、CIN2、CIN3、子宮頸癌)に対して防御可能であることが適切である。

皮膚型(特にHPV5および8)ならびに生殖器疣に関連する型（HPV6および11等）等の追加のHPV型由来のL1タンパク質またはタンパク質断片は、本発明のワクチンに含まれ得る。6および11型は、本明細書において発癌性型と考えない。

一態様では、ワクチンは、HPV L1タンパク質成分を、好ましくはウイルス様粒子として、異なる量で含むことができる。一態様では、HPV16およびHPV18 VLPは、HPV33または58等の他の発癌性型よりも高い用量で提供し得る。一態様では、HPV16およびHPV18 L1のみのVLPは、ヒトに使用する場合、一用量あたり20μgで提供される。他のHPV VLPは、ヒトに使用する場合にさらに低い用量（一用量あたり15または10μg等）で使用し得る。

本発明の一態様では、ワクチンは、HPV初期抗原、例えばHPV E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7およびE8からなる群より選択される抗原を含み得る。代替的な態様では、ワクチンは、HPV初期抗原、例えばHPV E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7およびE8からなる群より選択される抗原を欠く場合がある。

一態様では、本発明のワクチン成分は三価である(３種の異なる発癌性HPV型由来のHPV L1またはその断片を含む)。さらなる態様では、ワクチンは四価である。さらなる態様では、ワクチンは五価である。さらなる態様では、ワクチンは六価である。さらなる態様では、ワクチンは七価である。さらなる態様では、ワクチンは八価である。より高い価数も本明細書において想定される。さらなる態様では、ワクチンは、発癌性HPV型に関して少なくとも四価、または少なくとも五価、または少なくとも六価、または少なくとも七価、または少なくとも八価である。さらなる態様では、本発明の組合せワクチンは、それらの間で、4種、5種、6種、7種、8種、9種または10種の異なるHPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含んでいる。

ワクチン中のHPV成分の組合せは、HPV成分のいずれの免疫原性にも有意に影響を与えないことが好ましい。特に、本発明の組合せ中のHPV抗原間で生物学的に関連した干渉が無く、その結果、本発明の組合せワクチンが、ワクチン中の各HPV遺伝子型による感染に対して効果的な防御をもたらし得ることが好ましい。適切には、組合せ中の所与のHPV型に対する免疫応答は、個々に測定した場合の同じHPV型に対する免疫応答の少なくとも50％、好ましくは100％、または実質的に100％である。HPV16およびHPV18に対する応答について、本発明の組合せワクチンは、HPV16/HPV18組合せワクチンにより提供される免疫応答の少なくとも50％の免疫応答を刺激することが好ましい。適切には、本発明のワクチンにより生成される免疫応答は、各HPV型の防御効果がそのまま認められるレベルにある。免疫応答は、例えば、前臨床またはヒト実験のいずれかにおいて抗体応答により適切に測定され得る。抗体応答の測定は当該分野で周知であり、(例えば)WO03/077942に開示されている。

本発明のワクチンまたは組成物がL1の免疫原性断片を含む場合、HPV L1の適切な免疫原性断片はL1の末端切断、欠失、置換または挿入変異体を含む。このような免疫原性断片は、適切には、(必要に応じてアジュバント化した際に)L1タンパク質の誘導の元となるHPV型由来のL1タンパク質（ウイルス様粒子等）を認識可能である免疫応答を生じることが可能である。

一態様では、HPV16の適切な免疫原性断片は、HPV31およびHPV52の少なくとも１種に対して交差防御が可能であり、本発明の一態様では両方に対して交差防御可能である。

別の態様では、HPV18の適切な免疫原性断片は、HPV45に対する交差防御が可能である。

HPV16および/またはHPV18の免疫原性断片より得ることができる交差防御は、例えば実施例１に概説するように、ヒトでの治験により評価できる。

同様に、本発明の異なるワクチンは、ワクチンが免疫原性であることを確認するための標準的な技術を用いて、例えば、実施例１と同様に、または標準的な前臨床モデルにおいて、テストできる。

適切な免疫原性L1断片としては、末端切断型L1タンパク質が挙げられる。一態様では、末端切断は、核局在化シグナルを除去する。別の態様では、末端切断はＣ末端の末端切断である。さらなる態様では、Ｃ末端の末端切断は、50未満のアミノ酸（40アミノ酸未満等）を除去する。L1がHPV16由来の場合、別の態様において、Ｃ末端の末端切断は、HPV16 L1から34個のアミノ酸を除去する。L1がHPV18由来の場合、さらなる態様において、Ｃ末端の末端切断はHPV18 L1から35個のアミノ酸を除去する。

一態様では、HPV16配列は以下の配列である:(配列番号：1)

別の態様では、本発明は、上記アミノ酸配列を有するHPV16 L1のみから構成されるウイルス様粒子、およびそのようなVLPを含む組成物に関する。

HPV16配列は、例えば、適切に末端切断された、WO9405792またはUS6649167に開示されているものであり得る。適切な末端切断は、配列比較により評価した場合に上に示したのと同等の位置で末端切断される。

一態様では、HPV18配列は以下の配列である:(配列番号：2)

別の態様では、本発明は、上記アミノ配列を有するHPV18 L1のみから構成されるウイルス様粒子、およびそのようなVLPを含む組成物に関する。

代替的なHPV18配列がWO9629413に開示されており、これは適切には末端切断することができる。適切な末端切断は、配列比較により評価した場合に上に示したのと同等の位置で末端切断される。

他のHPV16およびHPV18配列は当該分野で周知であり、本発明における使用に適し得る。

L1タンパク質が別のHPV型に由来する場合、DNAまたはタンパク質配列アライメントに基づいて、HPV16およびHPV18について作製されたものに対応するＣ末端末端切断型を使用してもよい。
例えば、HPV31、HPV45、HPV52、HPV58、HPV33の適切な末端切断型は、一態様において、配列アライメントにより評価された場合に上記のものと同等のL1タンパク質のＣ末端部分を除去することによっても作製できる。

血清型31由来の末端切断型L1のヌクレオチド配列(配列番号：5)

別の態様では、本発明は、上記配列にコードされるアミノ配列を有するHPV31 L1のみから構成されるウイルス様粒子、およびそのようなVLPを含む組成物に関する。

血清型45由来の末端切断型L1のヌクレオチド配列(配列番号：6)

別の態様では、本発明は、上記配列によりコードされるアミノ配列を有するHPV45 L1のみから構成されるウイルス様粒子、およびそのようなVLPを含む組成物に関する。

本発明のL1タンパク質または断片は、任意に、L1タンパク質とL2または初期タンパク質との融合体等の、融合タンパク質の形態であり得る。

HPV L1タンパク質は、適切には、カプソマーまたはウイルス様粒子(VLP)の形態である。一態様では、HPV VLPが本発明で使用され得る。HPV VLP、およびVLPの作製方法は、当該分野で周知である。VLPは典型的にウイルスのL1および任意にL2構造タンパク質から構築される。例えば、WO9420137、US5985610、W09611272、US6599508B1、US6361778B1、EP 595935を参照されたい。L1またはL1＋L2 VLP等、交差防御を提供するいずれの適切なHPV VLPも本発明において使用できる。

適切には、VLPはL1のみのVLPである。

VLP形成は、例えば、電子顕微鏡法およびダイナミックレーザ光散乱等の、標準的技術により評価できる。

VLPは、完全長 L1タンパク質を含み得る。一態様では、VLPを形成するために使用するL1タンパク質は上記したような末端切断型L1タンパク質である。
VLPは、酵母細胞または昆虫細胞(例えばバキュロウイルス細胞)等の任意の適切な細胞基質において作製でき、VLPの調製技術はWO9913056、US6416945B1、US6261765B1、US6245568およびこれらの文献中の参考文献(これらの文献の全内容は参照により本明細書に組み入れる)等、当該分野で周知である。

VLPは、適切には、より安定および/または均一なパピローマウイルスVLPを提供できる分解および再構成技術により作製される。例えば、McCarthyら、1998 「Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Virus like Particles in Vitro」 J. Virology 72(1):33-41は、VLPの均一な調製物を得るための、昆虫細胞から精製された組換えL1 HPV11 VLP細胞の分解および再構成を記載している。WO9913056およびUS6245568もHPV VLPを作製するための分解/再構成プロセスを記載している。

一態様では、HPV VLPは、WO9913056またはUS6245568に記載されるように作製される。

本発明のHPV L1は、これに限定されるものではないが、任意の供給源由来の解毒化脂質Ａおよび脂質Ａの非毒性誘導体、サポニン、ならびにTH1型応答を刺激可能な他の試薬等の、アジュバントまたは免疫刺激剤と組み合せることができる。

腸内細菌性リポ多糖類(LPS)が免疫系の強力な刺激因子であることは長いこと知られていたが、アジュバントにおけるその使用は、その毒性作用のために縮小されてきた。還元末端グルコサミンからコア炭水化物基およびリン酸塩を除去して作られたLPSの非毒性誘導体モノホスホリル脂質Ａ(MPL)がRibiら(1986、Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins、Plenum Publ. Corp.、NY、p407-419)に記載されており、以下の構造を有する:

MPLの別の解毒化形は、二糖骨格の３位からアシル鎖を除去することにより生じ、3-O-脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ(3D-MPL)と呼ばれる。これは、GB2122204Bで教示される方法により精製および調製することができ、この文献はジホスホリル脂質Ａおよびその3-O-脱アシル化変異体の調製も開示している。

3D-MPLの適切な形態は、直径0.2μm未満の小さい粒径を有するエマルジョンの形態であり、その製造方法はWO94/21292に開示されている。モノホスホリル脂質Ａおよび界面活性剤を含む水性製剤はWO9843670A2に記載されている。

本発明の組成物中に製剤化されるべき細菌性リポ多糖類に由来するアジュバントは、細菌供給源から精製および加工できるか、あるいは合成のものであってもよい。例えば、精製されたモノホスホリル脂質ＡがRibiら1986(前掲)に記載されており、サルモネラ・エスピー（Salmonella sp.）から誘導される3-O-脱アシル化モノホスホリルまたはジホスホリル脂質ＡがGB2220211およびUS4912094に記載されている。他の精製および合成リポ多糖類が記載されている(Hilgersら、1986、Int.Arch.Allergy.Immunol.、79(4):392-6；Hilgersら、1987、Immunology、60(1):141-6；およびEP0 549 074 B1)。一態様では、細菌性リポ多糖類アジュバントは3D-MPLである。

このように、本発明において使用し得るLPS誘導体は、LPSまたはMPLまたは3D-MPLと構造が類似する免疫刺激剤である。本発明の別の態様では、LPS誘導体は、MPLの上記構造の小部分であるアシル化単糖であり得る。

サポニンは: Lacaille-Dubois、MおよびWagner H.(1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386)において教示されている。サポニンは、植物および海洋動物界に広く分布するステロイドまたはトリテルペン配糖体である。サポニンは、振ると泡立つコロイド溶液を水中で形成すること、およびコレステロールを沈殿させることが知られている。サポニンが細胞膜付近にある場合、これらは孔に似た構造を膜に作り、これが膜を破裂させる。赤血球の溶血は、この現象の一例であり、これは、全てではないが特定のサポニンの性質である。

サポニンは、全身投与用のワクチン中のアジュバントとして知られている。個々のサポニンのアジュバントおよび溶血作用は、当該分野で幅広く研究されている(Lacaille-DuboisおよびWagner、前掲)。例えば、Quil A(南アメリカの木であるキラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する)およびその画分はUS 5,057,540および「Saponins as vaccine adjuvants」Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2):1-55；およびEP0 362 279 B1に記載されている。Quil Aの画分を含む免疫刺激複合体(ISCOMS)と呼ばれる粒子構造は溶血性であり、ワクチンの製造に使用されている(Morein、B.、EP0 109 942 B1；WO 96/11711；WO 96/33739)。溶血サポニンQS21およびQS17(HPLC精製されたQuil A画分)は強力な全身性アジュバントとして記載されており、それらの製造方法は米国特許第5,057,540号およびEP0 362 279 B1に開示されている。全身性ワクチン接種の研究に使用されてきた他のサポニンとしては、ジプソフィリア属(Gypsophila)およびサポナリア属(Saponaria)等の他の植物種から誘導されるものが挙げられる(Bomfordら, Vaccine, 10(9):572-577、1992)。

増強された系は、非毒性脂質Ａ誘導体とサポニン誘導体との組合せ、特にWO94/00153に開示されるQS21と3D-MPLとの組合せ、またはWO 96/33739に開示されるQS21がコレステロールで抑えられたより反応原性の低い組成物を含む。
水中油型エマルジョン中にQS21および3D-MPLを含む特に強力なアジュバント製剤がWO 95/17210に記載されており、このアジュバントの使用は本発明の一態様を構成する。

したがって、本発明の一実施形態では、解毒化脂質Ａまたは脂質Ａの非毒性誘導体でアジュバント化した、より適切にはモノホスホリル脂質Ａまたはその誘導体でアジュバント化した、ワクチンが提供される。

一態様では、ワクチンは、サポニン、例えばQS21をさらに含む。

一態様では、製剤は水中油型エマルジョンをさらに含む。本発明はまた、本発明のL2ペプチドを3D-MPL等の製薬上許容可能な賦形剤と共に混合することを含む、ワクチン製剤の製造方法を提供する。

本発明のワクチン製剤に含まれ得る追加の成分としては、本明細書に記載するオクトキシノールおよびポリオキシエチレンエステル等の非イオン性界面界面活性剤、特にt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Triton X-100)およびポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(Tween 80)；ならびに本明細書に記載する胆汁酸塩またはコール酸誘導体、特にデオキシコール酸ナトリウムまたはタウロデオキシコレートが挙げられる。したがって、本発明の一態様では、製剤は3D-MPL、Triton X-100、Tween 80およびデオキシコール酸ナトリウムを含み、これらをL2抗原調製物と組み合わせて適切なワクチンを提供し得る。

本発明の一実施形態では、ワクチンはコレステロール、サポニンおよびLPS誘導体を含む小胞アジュバント製剤を含む。この点について、アジュバント製剤は適切には、コレステロールを含む単層小胞(適切にはジオレオイルホスファチジルコリンを含む脂質二重層を有する)を含み、サポニンおよびLPS誘導体は脂質二重層と会合しているかまたは脂質二重層に埋め込まれている。一態様では、これらのアジュバント製剤はサポニンとしてQS21、およびLPS誘導体として3D-MPLを含み、QS21:コレステロールの比率が1:1〜1:100重量/重量であり、一態様において1:5重量/重量の比率である。このようなアジュバント製剤は、EP0 822 831 B(この開示は参照により本明細書に組み入れる)に記載されている。

適切には、本発明のワクチンはアルミニウムと組み合わせられて使用され、アルミニウムアジュバント上に安定的に吸着しているかまたは部分的に吸着している。適切には、アジュバントはアルミニウム塩であり、これはリン酸アルミニウムおよび3D MPL等の3D MPLと組み合わせてもよい。任意に3D MPLと組み合わせられた水酸化アルミニウムも適している。

本発明の別の態様では、ワクチンは、HPV VLPとアルミニウム塩またはアルミニウム塩＋3D MPLとの組合せを含む。水酸化アルミニウムはアルミニウム塩として適している。

ワクチンはまた、アルミニウムまたはアルミニウム化合物を安定化剤として含み得る。

別の態様では、アジュバントは、水中油型エマルジョンアジュバントと3D MPLとの組合せであり得る。一態様では、水中油型エマルジョンは、代謝性油、ステロールおよび乳化剤を含む。
本発明のワクチンは、経口(例えばWO9961052 A2を参照)、局所、皮下、粘膜(典型的に膣内)、静脈内、筋内、鼻腔内、舌下、皮内送達および坐薬を介した送達等の様々な経路のいずれかにより提供し得る。

任意に、ワクチンは、他のHPV抗原または非HPV抗原と共に製剤化または同時投与することもできる。適切には、これらの非HPV抗原は、単純ヘルペスウイルス、EBV、クラミジアおよびHIV等の性感染症等の他の疾患に対する防御をもたらし得る。ワクチンはHSV由来のgDまたはその末端切断型を含むことが特に好ましい。このようにして、ワクチンはHPVおよびHSVの両方に対する防御をもたらす。

ワクチン成分の投与量は、個体の症状、性別、年齢および体重、ワクチンの投与経路およびHPVに応じて異なる。量は、VLP型の数によっても異なり得る。適切には、送達は、免疫学的な防御応答を生じるのに適したワクチン量である。適切には、各ワクチン用量は、各VLPを1〜100μg、一態様では5〜80μg、別の態様では各VLPを5〜30μg、別の態様では各VLPを5〜20μg、さらに別の態様では5μg、6μg、10μg、15μgまたは20μg含む。

本発明の全てのワクチンについて、一態様では、ワクチンを、10〜15歳（例えば10〜13歳）の青年期女子のワクチン接種のために使用する。しかし、15歳を超えるより高齢の女子および成人女性もワクチン接種し得る。ワクチンは、異常なパパニコラウスミアを患う女性もしくはHPVによる病巣の除去手術後の女性、またはHPV癌型について血清反応陰性およびDNA陰性である女性にも投与し得る。

一態様では、本発明のワクチンは男性をワクチン接種するために使用される。

一態様では、ワクチンは、例えば、それぞれ０、１ヶ月計画または０、６ヶ月計画の２回服用計画で送達される。ワクチン接種計画は、5〜10年後、例えば10年後の追加免疫注射を組み込んでもよい。

一態様では、本発明は、(例えば)互いに異なる第１のワクチンおよび第２のワクチンを送達し、その後、該第１または第２のワクチンの１種以上または全てのHPVエレメントを含む第３のワクチンを送達する、３回用量用ワクチンに関する。一態様では、第１および第２のワクチンはHPV L1成分に関して完全に異なる。

例えば、第１のワクチンは、HPV16およびHPV18 L1タンパク質を含むかまたはそれから構成され得る。第２のワクチンはHPV31およびHPV45 L1タンパク質から構成され得る。第３のワクチンは４種全てのHPV型、すなわちHPV16、18、31および45由来のL1タンパク質を含み得る。

別の態様では、本発明は、(例えば)互いに異なる第１のHPVワクチンおよび第２のHPVワクチンを送達し、その後、第１または第２のワクチンのいずれのHPV L1成分も含まない第３のワクチンを送達する、３回用量用ワクチンに関する。

一態様では、ワクチンは液体ワクチン製剤であるが、凍結乾燥して、投与前に再構成してもよい。

特許出願および取得特許を含む本出願中の全ての参考文献の教示を、参照により完全にに本明細書に組み入れる。

本発明のワクチンは、上述したような特定のHPV成分を含む。本発明のさらなる態様では、ワクチンは上記成分から構成されるか、または実質的に構成される。

本発明で使用する「ワクチン」という用語は、(場合により、適切に製剤化またはアジュバント化された場合に)ヒト等の個体において免疫応答を誘発可能な免疫原性成分を含む組成物を指す。ワクチンは、１種以上のHPV型により引き起こされる偶発的感染または持続的感染または細胞学的異常(ASCUS、CIN1、CIN2 CIN3もしくは子宮頸癌等)に対する防御的免疫応答を適切に引き出す。

ここで、本発明を例示する以下の実施例により本発明を説明する。

行った実験の正確な詳細は、Harperら、the Lancet. 2004 Nov 13;364(9447):1757-65に記載されている。

まとめると、15〜25歳の健康な女性を、HPV16およびHPV18 L1 VLPの混合物で免疫した。参加した女性は、1)HPV-16およびHPV-18について血清反応陰性；2)子宮頸部の高リスクHPV感染について陰性(HPV PCRにより検出)；3)これまでの性交渉相手が６人未満、および4)正常なPAPスメアであった。

混合物は、0.5 ml用量当たり、20μgのHPV-16 L1 VLP、20μgのHPV-18 L1 VLPを含み、500μgの水酸化アルミニウムおよび50μgの3D MPLでアジュバント化した。プラシーボ群には500μgの水酸化アルミニウムのみを注射した。
特定の癌HPV型に対するワクチン効力(V.E.)を評価した。ここでV.E.とは、プラシーボ群と比較した場合の、ワクチンによる感染または疾患に対する防御の改善％である。

ワクチン群および対照群において様々な癌型に特異的な核酸の存在を検出することにより交差防御を評価した。WO03014402およびその中の参考文献に記載の技術を用いて特にHPV DNAの非特異的増幅について検出を行い、その後WO 99/14377およびKleterら[Journal of Clinical Microbiology(1999)、37 (8): 2508-2517](参照により、これらの内容全体を本明細書に具体的に組み入れる)に記載されるようにLiPA系を使用して、DNA型を検出した。

しかし、サンプル中のHPV DNAの検出のために、目的のHPV型それぞれに特異的なプライマーを使用した型特異的PCR等の任意の適切な方法が使用できる。適切なプライマーは当業者に知られているか、または発癌性HPV型の配列が知られている場合は簡単に構築できる。

完全を期すために、ここにLancetの論文の方法の節を詳細に再現する:
本研究の主目的は、ELISAによりHPV-16/18について血清反応陰性であり、かつPCRによりHPV-16/18 DNAについて陰性であることが最初に示された参加者において、6〜18ヶ月の間、HPV-16、HPV-18またはその両者(HPV-16/18)による感染の予防におけるワクチン効力を評価することであった。第２の目的は以下を含んだ：すなわち、6〜18ヶ月および6〜27ヶ月の間の、HPV-16/18による持続的感染の予防におけるワクチン効力の評価、ならびにHPV-16/18感染に関連する、細胞学的に確認済みの軽度扁平上皮内病変(LSIL)、高度扁平上皮内病変(HSIL)、および組織学的に確認済みのLSIL(CIN 1)、HSIL(CIN 2もしくは3)扁平上皮細胞癌または腺癌の予防におけるワクチン効力の評価。HPV-16/18感染に関連する意義未確定の異型扁平上皮細胞(ASCUS)の細胞診の予防を事後的に予後分析に加えた。

PCRにより病巣組織中で検出されたHPV-16/18DNAに関連する病理組織学的評価項目CIN 1および2の予備分析も行った。他の目的は、ワクチンの免疫原性、安全性、および忍容性の評価を含んでいた。

北アメリカ(カナダおよび米国)ならびにブラジルの調査員は、2000年の7月〜12月に行ったHPV断面疫学調査への以前の参加または広告を通じてこの効力調査のための女性を募集した。

32の調査場所それぞれについて、施設内治験審査委員会から、プロトコール、同意書および修正の承認を受けた。女性達は、調査への参加および膣鏡診に対する個別の同意書に署名した。18歳未満の女性については、親の同意および参加者の承諾を義務付けた。

調査は２段階であった：すなわち、ワクチン接種および18ヶ月目で終わる追跡調査の初期段階；ならびに27ヶ月目で終わる盲検追跡調査の延長段階。

初期段階(0〜18ヶ月目)に適格な女性には、性交渉相手が６人以下、異常なPapテストまたは子宮頸部の除去もしくは切除処置の経験がなく、外因性コンジロームの治療を現在受けていない15〜25歳の健康な女性；ならびに調査への参加の90日前にELISAによりHPV-16およびHPV-18抗体について細胞学的に陰性でかつ血清反応陰性であり、かつPCRにより14の高リスクHPV型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68)についてHPV-DNA-陰性であった、15〜25歳の健康な女性が含まれた。

初期段階の調査を最も早く終了し、参加後に子宮頸部の除去もしくは切除療法または子宮摘出を受けなかった女性が、調査の延長段階(18〜27ヶ月)への参加に適格であった。

手順
二価HPV-16/18ウイルス様粒子ワクチン(GlaxoSmithKline Biologicals、Rixensart、Belgium)の各回分は、20μgのHPV-16 L1ウイルス様粒子および20μgのHPV-18 L1ウイルス様粒子を含んだ。それぞれの型のウイルス様粒子は、一回分バイアルに入った500μg水酸化アルミニウムおよび50μg 3-脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ(MPL、Corixa、Montana、USA)を含むAS04アジュバントと共に、ヨウトガ(Spodoptera frugiperda)Sf-9およびキャベツルーパー(Trichoplusia ni)Hi-5細胞基質で作製した。プラシーボは、一用量当たり、500μgの水酸化アルミニウムを含み、見た目はHPV-16/18ワクチンと同じであった。調査参加者の全員が、0.5 mL用量のワクチンまたはプラシーボを０ヶ月目、１ヶ月目および６ヶ月目に受けた。
医療提供者は、スクリーニング時、ならびに6、12および18ヶ月目に、細胞診およびHPV DNA検査のために、(PreservCyt、Cytyc Corporation、Boxborough、MA、USA中で洗浄した)子宮頸部ブラシおよびへらを用いて子宮頸部標本を得た。０および６ヶ月目、そしてその後３ヶ月ごとに、女性達は、HPV DNA検査用に(PreservCytに入った)２本の直列綿棒で頸膣管サンプルを自身で得た[DM Harper、WW Noll、DR BelloniおよびBF. Cole、Randomized clinical trial of PCR-determined human papillomavirus detection methods: self-sampling versus clinician-directed-biologic concordance and women's preferences. Am J Obstet Gynecol 186 (2002)、pp. 365-373]。中央調査所(Quest Diagnostics、Teterboro、NJ、USA)は、1991 Bethesda分類系を使用して細胞診結果(ThinPrep、Cytyc Corporation)を報告した。

プロトコールガイドラインは、ASCUSの報告が２回、あるいは重大性が未確定の異型腺細胞であるLSILもしくはHSIL、扁平上皮細胞癌、腺癌in situまたは腺癌の報告が1回あった後に、膣鏡診を推奨した。これらのガイドラインは、あらゆる疑いのある病巣についての生検も推奨した。

中央組織学調査室は、臨床管理のために、ホルマリンで固定した組織標本から初期診断を行った。３人の病理学者パネルがその後、HPV-16およびHPV-18に関連する病巣についてCIN系を用いて合意診断を行った。この合意診断は、病巣HPV DNAのPCR検出用の顕微切除時に採った切片の再検討も含んだ。

細胞診標本(MagNaPure Total Nucleic Acid system、Roche Diagnostics、Almere、Netherlands)および子宮頸部生検標本(プロテイナーゼＫ抽出)から単離されたHPV DNAを、精製されたトータルDNAのアリコートから、L1遺伝子の65bp領域を増幅するSPF10広域スペクトルプライマーで増幅した[B Kleter、LJ van Doorn、J ter Scheggetら、Novel short-fragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses. Am J Pathol 153 (1998)、pp. 1731-1739: LJ van Doorn、W Quint、B Kleterら、Genotyping of human papillomavirus in liquid cytology cervical specimens by the PGMY line blot assay and the SPF(10) line probe assay. J Clin Microbiol 40 (2002)、pp.979-983、ならびにWG Quint、G Scholte、LJ van Doorn、B Kleter、PH SmitsおよびJ. Lindeman、Comparative analysis of human papilloma virus infections in cervical scrapes and biopsy specimens by general SPF(10) PCR and HPV genotyping. J Pathol 194 (2001)、pp. 51-58]。増幅産物を、DNA酵素免疫測定法により検出した。ラインプローブアッセイ(LiPAキットHPV INNO LiPA HPV遺伝子型決定アッセイ、SPF-10系バージョン1、Innogenetics、Gent、Belgium、Labo Bio-medical Products、Rijswijk、Netherlands製)により、25種のHPV遺伝子型(6、11、16、18、31、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、70および74)を検出した[B Kleter、LJ van Doorn、L Schrauwenら、Development and clinical evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol 37(1999)、pp. 2508-2517]。DNA酵素免疫測定法により陽性であった全ての標本を型特異的HPV-16およびHPV-18 PCRによりテストした。HPV-16型特異的PCRプライマーはE6/E7遺伝子の92 bpのセグメントを増幅し、HPV-18型特異的PCRプライマーはL1遺伝子の126 bpセグメントを増幅した[MF Baay、WG Quint、J Koudstaalら、Comprehensive study of several general and type-specific primer pairs for detection of human papillomavirus DNA by PCR in paraffin-embedded cervical carcinomas. J Clin Microbiol 34 (1996)、pp. 745-747]。

HPV-16/18による偶発的子宮頸部感染は、治験の間のHPV-16またはHPV-18に関する少なくとも１回の陽性PCR結果として定義し、HPV-16/18による持続的感染を、少なくとも６ヶ月の間をあけた同じウイルス遺伝子型に関する少なくとも２回の陽性HPV-DNA PCRアッセイとして定義した[H Richardson、G Kelsall、P Tellierら、The natural history of type-specific human papillomavirus infections in female university students. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 12(2003)、pp.485-490、ならびにAB Moscicki、JH Ellenberg、S FarhatおよびJ. Xu、Persistence of human papillomavirus infection in HIV-infected and -uninfected adolescent girls: risk factors and differences、by phylogenetic type. J Infect Dis 190 (2004)、pp.37-45]。HPV-DNAのテスト結果は、調査の間調査員には伏せ、細胞学的および組織学的診断のみを臨床管理の目的で公開した。分析は、子宮頸部標本、および子宮頸部と自身で得た頸膣管との組合せ標本のHPV-16/18 DNA結果を含んだ。

0、1、6、7、12および18ヶ月目に免疫原性の評価のために調査参加者から血清を集収した。HPV-16およびHPV-18ウイルス様粒子に対する抗体についての血清学的検査をELISAにより行った。組換え型HPV-16またはHPV-18ウイルス様粒子を抗体検出用のコーティング抗原として使用した(webappendix http://image.thelancet.com/extras/04art10103webappendix.pdfを参照)。血清反応陽性を、HPV-16については８ELISA単位/mLおよびHPV-18については７ELISA単位/mLに設定したアッセイ切捨て力価以上の力価として定義した。典型的な天然力価を、先の疫学調査でELISAによりHPV-16またはHPV-18について血清反応陽性であることがわかった女性から得た血液サンプルを使用して測定した。

女性は、ワクチン接種の後最初の７日間以内に体験した症状をダイアリーカードに、症状の強さを三段階スケールで記録した。さらに、女性達は、ワクチン接種後最初の30日以内の全ての有害な事象を面接により調査員に報告した。深刻な有害事象および妊娠の情報は調査を通して集収した。

統計学的方法
12ヶ月にわたるHPV-16およびHPV-18型感染の両方の累積発生率を６％と仮定し、治療群当たり500人の女性が、０を上回るワクチン効力の95％CIの下限を評価するのに80％検定力(80% power)を与えると仮定した。18ヶ月間にわたる80％の維持率を仮定した。効力、安全性および免疫原性についての暫定的な分析を、将来の調査を計画する目的のためだけに行った；オブライアンおよびフレミング法を使用して、暫定分析後の最終分析のためにα値を調整した(全体α＝0・05；両側検定)[PC O'BrienおよびTR. Fleming、A multiple testing procedure for clinical Trials. Biometrics 35(1979)、pp.549-556]。

有効なアルゴリズムによる層別ブロック無作為化を、インターネット無作為システムで集中的に行った(centralised)。層別は年齢(15〜17、18〜21および22〜25歳)、ならびに地域(北アメリカおよびブラジル)に従った。各ワクチン用量は、調査員によりコンピューター無作為化システムに入力された特定の参加者情報に基づいて無作為に選択された数字であるとみなした。治療の割り当ては、調査員および長期追跡調査に参加している女性には伏せたままである。

治療意図型コーホート(intention-to-treat cohort)およびプロトコール通り型のコーホート(according-to-protocol cohort)を図に示す(図中、分析から除外する理由をランク順に一覧している)；２つ以上の除外基準に当てはまる女性は最も高いランキング基準に従い１回しか数えなかった。治療意図型分析およびプロトコール通り型分析に参加した参加者のセットをコーホートと呼んだが、プロトコール通り型に含める被験体を制限するために使用する情報は追跡調査後に初めて知ることができた。

効力について、プロトコール通り型および治療意図型の両方の分析を行った。プロトコール通り型18ヶ月分析におけるワクチン効力の計算は、ワクチン接種群対プラシーボ群におけるHPV-16/18感染した参加者の割合に基づいた。ワクチン効力は１からこれらの２つの割合の比率を引いたものと定義した；95％ CIは効力推定値の精度を判定した。ｐ値をフィッシャーの両側正確確率検定で計算した。一致率(corresponding rate)は、結果を有する事象数をリスクのある参加者の数により割ったものとして表した。プロトコール通り型18ヶ月コーホートには、計画的な３回用量のワクチンを受け、図に示すプロトコールを満たした参加女性が含まれた。

治療意図型およびプロトコール通り型27ヶ月分析におけるワクチン効力の計算は、ワクチン接種群対プラシーボ群におけるHPV-16/18感染の事象の時間-対-発生を用いたCox比例ハザードモデルに基づいた。これは、各群における発生(accrued)人数-時間データの制御を可能にした。ワクチン効力を１−危険率で計算し、ｐ値をログランク検定を用いて計算した。一致率を、事象数を合計人数-時間により割ったものとして表した。０ヶ月目において高リスクHPV-DNAについて陰性であり、結果の測定に利用可能な任意のデータを有する、少なくとも１服のワクチンまたはプラシーボを受けた参加女性全員が、治療意図型コーホートに含まれた。プロトコール通り型27ヶ月コーホートは、プロトコール通り型18ヶ月コーホートからの結果、および延長段階(18ヶ月〜27ヶ月)の間に生じた結果を含んだ。

安全性分析のためのｐ値の計算を、フィッシャーの正確確率検定比較を用いて行った。安全性分析のためのコーホートは、少なくとも１回用量のワクチンまたはプラシーボを受け、特定の最小プロトコール要件を満たした参加女性全員を含んだ(以下の図を参照)。

0、7および18ケ月目に血清検査の結果を得て、３回用量の調査ワクチンまたはプラシーボをスケジュール通りに全て受け、採血スケジュールを満たし、かつ治験の間にHPV-16/18-DNAについて陽性とならなかった女性を含む、プロトコール通り型安全性コーホートのサブセットにおいて免疫原性を評価した。ワクチン群とプラシーボ群との血清反応陽性率を、フィッシャーの正確確率検定(p<0・001で有意と判断)で比較した。幾何平均力価をANOVAおよびクラスカル-ワリステストで比較した。

ブロック無作為化および統計学的分析を、SASバージョン8.2(SAS Institute、Cary、North Carolina)で行った。

初期分析および結果
交差防御についての初期分析の結果は、特許出願WO2004/056389(参照により、この内容全体を本明細書に組み入れる)に示されている。

初期分析は、「ITT」(少なくとも１回用量のワクチンを受けた全ての個体を示す、治療意図型(Intention To Treat)のコーホート)に対して行った。このデータを表Ａに示す。

表ＢおよびＣに示す結果は、治験の全ての基準を満たす患者についての「ATP」(プロトコール通り(According To Protocol))群に関する。表Ｂは、コーホートの少なくとも50％が第１のワクチン接種の18ヵ月後である時点で全ての患者から得たデータの中間分析である。表Ｃは、最終結果を示し、全てのデータは初回ワクチン接種(０ヶ月目)から18ケ月目の被験体から得たものである。ATP群においては、患者全員が、０、１および６ヶ月目に３回用量のワクチンを受け、６ヶ月目で血清反応陰性であった。

表Ａに示すデータに実証されるように、HPV16およびHPV18 VLPの混合物での免疫処置は、他のHPV型に対する明らかな交差防御を提供した。この時点で、サンプルサイズは厳密な統計分析を提供するには小さすぎるが、このデータは肯定的な傾向を実証し、HPV16およびHPV18 VLPでの免疫処置が他のHPV型の感染に対して有効であろうことを示唆する。

これは調査が進むに従い確認された。

表Ｂは、HPV16およびHPV18が、高リスク癌型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68の群に対して統計的に有意な交差防御を提供することを実証する。

表Ｃは、HPV-18に関係する型(非常に強い傾向を示す)以外、以下の群に対して統計的に有意な交差防御が認められることを実証する：すなわち、HPV31、35、58の群；HPV31、33、35、52、58の群；および評価した12の高リスク(非HPV-16/18)型の群。

特定の型に対する特異的な交差防御についてさらなる分析を行った。

12の高リスク癌型31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68、HPV-16に系統発生学的に関係する型(31、35および58の群；31、33、35、52および58の群)、ならびにHPV-18に系統発生学的に関係する型(45および59)に関係する感染および疾患に対するワクチン効力を評価した。

「ATP」(プロトコール通り)群に対し、治験の全基準を満たした患者について分析を行った。ATP群では、患者全員が３回用量のワクチンを、０、１および６ヶ月目に受け、６ヶ月目に血清反応陰性であった。

結果
表１に示すデータにより実証されるように、HPV16およびHPV18 VLPの混合物での免疫処置は、対照と比較して、HPV型31、52および45による偶発的感染に対して統計的に有意な交差防御をもたらした。

偶発的感染に対する統計的に有意な交差防御は、全てのHPV16関連型の群(HPV-31、33、35、52および58)、ならびに16および18を除く全ての高リスク型の群(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68)に対しても認められた。

持続的感染に対する統計的に有意な交差防御も、31および52型に対して認められ、全てのHPV16関連型の群に対しても認められた(表２を参照)。

統計的に有意な交差防御は、HPV52に関連する細胞学的異常に対して認められ、全てのHPV16 関連型(HPV-31、33、35、52および58)、ならびに16および18を除く全ての高リスク型の群(31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68)に関連する細胞学的異常に対しても認められた。

１群につき24匹のマウスを含む10のC57Bl/6マウス群を使用した。

以下の情報に従い、２回用量スケジュール（０日目および28日目）で、筋内投与(１つのマウス群は初回免疫および追加免疫の両方をNaClで行った、以下に記載せず)を使用して、マウスをワクチン接種した。

ワクチン接種は、異なるHPVウイルス様粒子の組合せを用いて行った。

４種の異なるVLPを使用した：すなわち、HPV16 L1のみのVLP、HPV18 L1のみのVLP、HPV31 L1のみのVLP、およびHPV45 L1のみのVLP。

VLPは、本質的にWO2003077942A2(参照により本明細書に完全に援用する)の開示に従って作製および精製した。

より詳細には、以下の順次的工程を用いてHPV16 VLPを精製した: すなわち、陰イオン交換クロマトグラフィー(ジメチルアミノエチル-DMAE)、陰イオン交換クロマトグラフィー(トリメチルアミノエチル-TMAE)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、濾過および別の陰イオン交換工程(この際にはジエチルアミノエチル(DEAE)工程を使用)、その後の最終濾過。同じ順次的工程を用いてHPV31 VLPを作製した。

以下の順次的工程を用いてHPV18 VLPを精製した: すなわち、陰イオン交換クロマトグラフィー(ジメチルアミノエチル-DMAE)、陰イオン交換クロマトグラフィー(トリメチルアミノエチル-TMAE)、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、濾過およびオクチルセファロースカラム(疎水性相互作用クロマトグラフィー)、その後の最終濾過。同じ順次的工程を用いてHPV45 VLPを作製した。

以下のL1配列を使用して、この実験用のVLPを作製した:
血清型16由来の末端切断型L1のヌクレオチド配列(配列番号：3)

血清型18由来の末端切断型L1のヌクレオチド配列(配列番号：4)

各抗原は、2μgの用量で使用した。HPV16、18および45VLPを吸着させた。

使用したアジュバントはAS04Dと呼び、ヒト用量の1/10であり、これは各ワクチンにつき合計5μgの3D MPLおよび50μgの水酸化アルミニウムであった。

WO00/23105に開示されるようにHPVウイルス様粒子を水酸化アルミニウムおよび3D MPLと組み合わせた。

例えば、四価16、18、31、45ワクチンにおいて、それぞれ2μgのHPV16 VLPを5μg水酸化アルミニウムに吸着させた。HPV18およびHPV45については、同じことを行った。HPV31 VLPについては、2μgのVLPを2.5μgの水酸化アルミニウムに吸着させた。

別に、5μgの3D-MPLを17.5μgの水酸化アルミニウムに吸着させた。

次いで、3D-MPLおよびVLPを混合し、追加の水酸化アルミニウムを添加して、ワクチン用量当たり50μgを得た。

ワクチン接種スケジュール:
第１の組成物第２の組成物
VLP 16/18 AS04D VLP 16/18 AS04D
VLP 16/18/31/45 AS04D VLP 16/18/31/45 AS04D
NaCl VLP 31/45 AS04D
読出し
抗体価を、当該分野で周知の古典的なELISA技術を用いて、初回ワクチン接種および２回目のワクチン接種から(それぞれＩ後およびII後)14日目に測定した。

細胞内染色(ICS、Roederer ら、2004 Clin. Immunol. 110:199)をII後14日目に行い、CMI応答を評価した。

結果を以下の図１〜１８に示す。図中、IおよびII後のデータは、それぞれワクチン服用IおよびII後の測定である。「I後追加免疫」とした棒線は、NaClを先に与え、その後28日目に二価または四価いずれかのワクチンを投薬した群を反映する。

図１〜９は、異なるワクチン接種計画により生成される抗体応答を示す。図１０〜１８は、異なるワクチン接種計画により生成されるCMI応答を示す。

結論
１-HPV31および45 L1 VLPを含む異種追加免疫は、HPV16および18 L1 VLP初回免疫により誘導される同種HPV16および18 L1 VLP応答を増強するのに有効である。

２-HPV31および45 L1 VLPを含む異種追加免疫は、HPV16および18 L1 VLP初回免疫により誘導される異種HPV31および45 L1 VLP応答を増強するのに有効である。

図1は、異なる初回免疫および追加免疫計画でHPV16に対して生成される抗体を示す。図2は、異なる初回免疫および追加免疫計画でHPV18に対して生成される抗体を示す。図3は、異なる初回免疫および追加免疫計画でHPV31に対して生成される抗体を示す。図4は、異なる初回免疫および追加免疫計画でHPV45に対して生成される抗体を示す。図5は、異なる初回免疫および追加免疫計画でHPV16に対して生成される抗体を示す。図6は、異なる初回免疫および追加免疫計画でHPV18に対して生成される抗体を示す。図7は、異なる初回免疫および追加免疫計画でHPV31に対して生成される抗体を示す。図8は、異なる初回免疫および追加免疫計画でHPV45に対して生成される抗体を示す。図9は、図１〜８における抗体応答の概要を示す。図10は、異なる初回免疫および追加免疫計画でのCD4+集団におけるHPV16 L1特異的Ｔ細胞の％を示す。図11は、異なる初回免疫および追加免疫計画でのCD4+集団におけるHPV18 L1特異的Ｔ細胞の％を示す。図12は、異なる初回免疫および追加免疫計画でのCD4+集団におけるHPV31 L1特異的Ｔ細胞の％を示す。図13は、異なる初回免疫および追加免疫計画でのCD4+集団におけるHPV45 L1特異的Ｔ細胞の％を示す。図14は、異なる初回免疫および追加免疫計画でのCD4+集団におけるHPV16 L1特異的Ｔ細胞の％を示す。図15は、異なる初回免疫および追加免疫計画でのCD4+集団におけるHPV18 L1特異的Ｔ細胞の％を示す。図16は、異なる初回免疫および追加免疫計画でのCD4+集団におけるHPV31 L1特異的Ｔ細胞の％を示す。図17は、異なる初回免疫および追加免疫計画でのCD4+集団におけるHPV45 L1特異的Ｔ細胞の％を示す。図18は、図１０〜１３中のCMIデータの概要を示す。

Claims

１種の第１のHPV型由来のヒトパピローマウイルスL1タンパク質またはその免疫原性断片の、異なるHPV型由来のヒトパピローマウイルスL1タンパク質またはその免疫原性断片により先に誘発された免疫応答を増強するための医薬の製造における、使用。
第２の型が系統発生的に前記第１の型と関係する、請求項１に記載の使用。
L1タンパク質またはその断片を含むHPV16ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV31もしくはHPV52 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用である、請求項１または２に記載の使用。
L1タンパク質またはその断片を含むHPV16ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV31タンパク質またはその免疫原性断片の使用である、請求項３に記載の使用。
L1タンパク質またはその断片を含むHPV16ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV52タンパク質またはその免疫原性断片の使用である、請求項３に記載の使用。
L1タンパク質またはその断片を含むHPV31またはHPV52ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV16 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用である、請求項１または２に記載の使用。
L1タンパク質またはその断片を含むHPV31ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV16 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用である、請求項６に記載の使用。
L1タンパク質またはその断片を含むHPV52ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV16 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用である、請求項６に記載の使用。
L1タンパク質またはその断片を含むHPV18ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV45 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用である、請求項１または２に記載の使用。
L1タンパク質またはその断片を含むHPV45ワクチンに対する免疫応答を増強するための医薬の製造における、HPV18 L1タンパク質またはその免疫原性断片の使用である、請求項１または２に記載の使用。
HPV感染および/または疾患に対する防御のためのワクチン接種スケジュールであって、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチンと、該第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分を含まないが少なくとも１種の他の発癌性HPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンとの送達を含み、該第１および第２のワクチンはいずれの順序でも送達でき、かつ適切な間隔をあけて送達される、前記スケジュール。
HPV感染および/または疾患の予防方法であって、少なくともHPV16およびHPV18由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第１のHPVワクチンと、該第１のワクチンのHPV16およびHPV18 L1成分を含まないが少なくとも１種の他の発癌性HPV型由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む第２のHPVワクチンとを送達することを含み、該第１および第２のワクチンはいずれの順序でも送達でき、かつ適切な時間間隔をあけて送達される、前記方法。
前記第１のワクチンが、HPV16、HPV18および任意にHPV33由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む、請求項１１または１２に記載の方法またはスケジュール。
前記第１のワクチンが、HPV58由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片をさらに含む、請求項１３に記載の方法またはスケジュール。
前記第２のワクチンが、HPV31および/またはHPV45および/またはHPV52由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法またはスケジュール。
前記第２のワクチンが、HPV31およびHPV45由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む、請求項１５に記載の方法またはスケジュール。
前記第２のワクチンが、HPV31、HPV45およびHPV52由来のL1タンパク質またはその免疫原性断片を含む、請求項１６に記載の方法またはスケジュール。
前記第１および第２のワクチンが同一のL1タンパク質またはタンパク質断片を共有しない、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の方法またはスケジュール。
前記第１のワクチン中のHPV16またはHPV18成分が、前記第２のワクチン中の少なくとも１つのHPV型により引き起こされるHPV感染および/または疾患に対して防御する、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の方法またはスケジュール。
HPV31 L1タンパク質またはその免疫原性断片と、HPV45 L1タンパク質またはその免疫原性断片との組合せを含むワクチン組成物であって、該ワクチンはHPV16もしくはHPV18 L1タンパク質またはその免疫原性断片を含まない、前記ワクチン組成物。
HPV52 L1タンパク質またはその免疫原性断片を含む、請求項２０に記載のワクチン組成物。
請求項１１に記載の第１および第２のワクチン組成物を含むキット。
前記第１のワクチン成分がHPV16およびHPV18 L1タンパク質またはその免疫原性断片を含み、前記第２のワクチン成分がHPV31およびHPV45タンパク質またはその免疫原性断片を含む、請求項２２に記載のキット。
前記HPV L1タンパク質がウイルス様粒子の形態である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用、方法、スケジュール、ワクチンまたはキット。
前記第１もしくは第２のワクチン、または両方がアジュバントを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用、方法、スケジュール、ワクチンまたはキット。
前記アジュバントが3D-MPLを含む、請求項２５に記載の使用、方法、スケジュール、ワクチンまたはキット。
前記アジュバントがアルミニウム塩を含む、請求項２５に記載の使用、方法、スケジュール、ワクチンまたはキット。
前記アジュバントがアルミニウム塩および3D MPLを含む、請求項２６または２７に記載の使用、方法、スケジュール、ワクチンまたはキット。
前記アジュバントが水中油型エマルジョンアジュバントおよび3D-MPLを含む、請求項２６に記載の使用、方法、スケジュール、ワクチンまたはキット。
前記水中油型エマルジョンが代謝性油、ステロールおよび乳化剤を含む、請求項２９に記載の使用、方法、スケジュール、ワクチンまたはキット。