WO2013143133A1 - 全基因组扩增方法及其应用 - Google Patents

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WO2013143133A1
WO2013143133A1 PCT/CN2012/073348 CN2012073348W WO2013143133A1 WO 2013143133 A1 WO2013143133 A1 WO 2013143133A1 CN 2012073348 W CN2012073348 W CN 2012073348W WO 2013143133 A1 WO2013143133 A1 WO 2013143133A1
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whole genome
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sequencing
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吴汉杰
侯勇
徐讯
王俊
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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    • C12P19/28—N-glycosides
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    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention relates to whole genome amplification methods and their applications. More specifically, the present invention relates to a method for amplifying a whole genome sample, a method for sequencing a whole genome, a method for determining whether an abnormal state exists in a whole genome, a device for amplifying a whole genome sample, and performing a whole genome The device being sequenced and the system that determines if there is an abnormal state in the genome. Background technique
  • WGA Whole Genome Amplification
  • Dop-PCR Degenerate Oligonucleotide-Primed PCR
  • MDA Multiple Displacement Amplification
  • the present invention aims to solve at least one of the technical problems existing in the prior art.
  • PCR-based whole genome amplification methods such as primers for degenerate oligonucleotide primer PCR (DOP-PCR), consist of a specific nucleotide sequence at the 3' and 5' ends and a middle 6 random nucleotides.
  • the PCR procedure is to perform a few rigorous amplifications of the first cycle at low annealing temperatures and then increase the annealing temperature for tens of cycles of stringent amplification. Since the 3' end of the DOP-PCR primer is designed based on the sequence of high frequency appearing in the genome, it can be annealed to the genome multiple times under the initial low stringency amplification conditions, thereby universally amplifying the genome.
  • the product of low stringency amplification is then amplified again in the next round of stringent amplification.
  • the primers for DOP-PCR have multiple annealing sites throughout the genome, the same amount of primers and DNA polymerases reach saturation in the first few cycles and enter a linear growth phase.
  • the inventors found that its linear growth characteristics are particularly relevant for subsequent studies of copy number differences. Lee.
  • the inventors have further found that DOP-PCR has a large influence on the coverage of subsequent genomes due to the need to fragment the sample genome in advance and then add amplification adapters to both sides of the fragment. The inventors found that using the DOP-PCR method, the coverage genomic region currently available is only up to 30%.
  • MDA Multiple displacement amplification
  • Phi29 DNA polymerase initiates replication simultaneously at the annealing binding site.
  • Phi29 DNA polymerase synthesizes DNA along the DNA template and replaces the complementary strand of the template. The replaced complementary strand becomes a new template and is amplified by random primer binding.
  • the Phi 29 DNA polymerase used in the MDA reaction has strong template binding ability to the template, and can continuously amplify the 10Kb DNA template without dissociation from the template, and the enzyme also has a 3 ' ⁇ 5' excision. Enzyme activity ensures high fidelity of DNA replication.
  • the invention proposes a method of amplifying a whole genome sample.
  • the method comprises: performing the first amplification reaction on the whole genome sample to obtain a first amplification product; and performing the second amplification reaction on the first amplification product to obtain the first a second amplification product, wherein the first amplification reaction is one of a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reaction, and the second amplification reaction is an amplification reaction selected from PCR and a constant temperature amplification reaction Another one.
  • the method for amplifying a whole genome sample it is possible to reduce the chimera produced by the constant temperature amplification reaction and to reduce the amplification bias while ensuring high coverage of the genome.
  • the amplified product obtained by using the amplification method of the present invention can be used for analyzing chromosome number-based copy number variation (e.g., chromosome addition, deletion, and transfer) in the genome.
  • the amplification method according to an embodiment of the present invention can be used to simultaneously perform detection of various abnormal states in a micro sample, such as simultaneously performing detection of a single nucleotide polymorphism SNP and a copy number variation CNV, thereby Provide more comprehensive information on the variability of the genome.
  • the invention proposes a method for sequencing a whole genome.
  • the method comprises: a method for amplifying a whole genome sample according to the method described above, The set of samples is amplified to obtain a whole genome amplification product; a whole genome sequencing library is constructed for the whole genome amplification product; and the whole genome sequencing library is sequenced.
  • the method for sequencing a whole genome according to an embodiment of the present invention can be effectively used for analyzing chromosome number-based copy number variation in a genome by using a sequencing result obtained by using an amplification product obtained by a specific amplification method (such as chromosome addition, deletion and transfer).
  • the sequencing result obtained by the sequencing method according to the embodiment of the present invention can be used to simultaneously perform detection of various abnormal states in a small amount of samples, such as simultaneously completing single nucleotide polymorphism SNP and copy number variation CNV.
  • the detection of the genome thus provides more comprehensive information.
  • the invention proposes a method of determining whether an abnormal state exists in a whole genome.
  • the method comprises: sequencing the whole genome according to the method for sequencing a whole genome as described above to obtain sequencing data; and determining the whole genome based on the sequencing data Whether there is an abnormal state in the middle.
  • a method for determining whether an abnormal state exists in a whole genome according to an embodiment of the present invention, based on a whole genome amplification product obtained by an amplification method according to an embodiment of the present invention, which can truly reflect a genome-wide condition, can effectively analyze a genome Chromosome-based copy number variation (eg, chromosomal addition, deletion, and transfer), and simultaneous detection of multiple abnormal states in a small sample, such as simultaneous completion of single nucleotide polymorphism SNPs and copy number variation CNV The detection of the genome thus provides more comprehensive information.
  • a genome Chromosome-based copy number variation eg, chromosomal addition, deletion, and transfer
  • simultaneous detection of multiple abnormal states in a small sample such as simultaneous completion of single nucleotide polymorphism SNPs and copy number variation CNV
  • the invention provides an apparatus for amplifying a whole genome sample.
  • the apparatus comprises a first amplification unit, the first amplification unit being adapted to perform the first amplification reaction on the whole genome sample to obtain a first amplification product; a unit, the second amplification unit is coupled to the first amplification unit, and is adapted to perform a second amplification reaction on the first amplification product to obtain a second amplification product, wherein the An amplification unit is adapted to perform one selected from the group consisting of a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reaction, the second amplification unit being adapted to perform another one selected from the group consisting of a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reactionkind.
  • a method for amplifying a whole genome sample according to an embodiment of the present invention can be effectively implemented, thereby being capable of reducing a high coverage of a genome Chimera produced by constant temperature amplification reaction and reduced amplification bias.
  • the resulting amplification product can be used to analyze chromosome-based copy number variation in the genome (such as chromosome addition, deletion and transfer), and can also be used to simultaneously detect multiple abnormal states in a small amount of sample, such as At the same time, the detection of single nucleotide polymorphism SNP and copy number variation CNV is completed, so that the variation of the genome provides more comprehensive information.
  • the invention proposes an apparatus for sequencing a whole genome.
  • the apparatus comprises: a whole genome amplification device, wherein the whole genome amplification device is a device for amplifying a whole genome sample as described above; a sequencing library construction device, the sequencing library construction device With the whole A genomic amplification device is ligated and is adapted to construct a whole genome sequencing library for the whole genome amplification product; and a sequencing device adapted to sequence the whole genome sequencing library.
  • An apparatus for sequencing a whole genome can efficiently implement a method for sequencing a whole genome, thereby obtaining a sequencing result obtained by using an amplification product obtained by a specific amplification method, It can be effectively used to analyze chromosome-based copy number variation in the genome (eg, chromosome addition, deletion, and transfer). And the obtained sequencing result can be used for simultaneously detecting a plurality of abnormal states in a small amount of samples, such as simultaneously detecting the single nucleotide polymorphism SNP and the copy number variation CNV, thereby providing more variation of the genome.
  • the invention proposes a system for determining whether an abnormal state exists in a whole genome.
  • the system comprises: a whole genome sequencing device, the whole genome sequencing device for sequencing the whole genome described above, for sequencing the whole genome to obtain sequencing data; An analytical device coupled to the whole genome sequencing device and adapted to determine whether an abnormal state is present in the whole genome based on the sequencing data.
  • a system for determining whether an abnormal state exists in a whole genome can effectively implement a method of determining whether an abnormal state exists in a whole genome, thereby being capable of efficiently analyzing a copy number variation in a genome in a genome (for example, Chromosomal addition, deletion and transfer), and can detect multiple abnormal states simultaneously in a small amount of samples, such as simultaneous detection of single nucleotide polymorphism SNPs and copy number variants CNV, so that genomic variation provides more Comprehensive information.
  • the invention proposes a kit for amplifying a whole genome.
  • the method includes: a first reagent for performing one of a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reaction; and a second reagent for performing the Another type of PCR amplification reaction and isothermal amplification reaction, wherein the first reagent and the second reagent are respectively disposed in different containers.
  • FIG. 1 shows a flow chart of a method for amplifying a whole genome sample according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 shows a schematic flow diagram of a method for sequencing whole genomes in accordance with one embodiment of the present invention
  • FIG. 3 is a flow chart showing a method of determining whether an abnormal state exists in a whole genome according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 4 is a schematic view showing the structure of an apparatus for amplifying a whole genome sample according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 5 is a view showing the structure of an apparatus for sequencing a whole genome according to an embodiment of the present invention
  • Figure 7 shows a Circos diagram of 2, 4, 8, 16 hour MDA amplification of YH lymphocytes in accordance with one embodiment of the present invention
  • Figure 8 shows an Circos diagram of the effect of combining MDA and DOP-PCR amplification methods on amplification bias in one embodiment of the present invention
  • Figure 9 shows a comparison of M21 effect of T21 and YH lymphocytes according to one embodiment of the present invention
  • Figure 10 shows the addition of ODP-PCR after testing for different durations of MDA reaction on T21 lymphocytes according to one embodiment of the present invention. Result;
  • Figure 11 is a partial enlarged view of Figure 10.
  • first and second as used herein are used for descriptive purposes only and are not to be construed as indicating or implying a relative importance or implicitly indicating the number of technical features indicated. Thus, features defining “first” and “second” may include one or more of the features, either explicitly or implicitly. In the description of the present invention, “multiple” means two or more unless otherwise specifically defined.
  • connection shall be understood broadly, and may be either a fixed connection, a detachable connection, or an integral connection, unless otherwise specifically defined and defined;
  • the connection may also be an electrical connection; it may be directly connected, or may be indirectly connected through an intermediate medium, and may be internal communication between the two elements.
  • specific meanings of the above terms in the present invention can be understood on a case-by-case basis.
  • the present invention has been completed based on the following findings of the inventors:
  • PCR-based whole genome amplification methods such as primers for degenerate oligonucleotide primer PCR (DOP-PCR), consist of a specific nucleotide sequence at the 3' and 5' ends and a middle 6 random nucleotides.
  • the PCR procedure is to perform a few rigorous amplifications of the first cycle at low annealing temperatures and then increase the annealing temperature for tens of cycles of stringent amplification. Since the 3' end of the DOP-PCR primer is designed based on the sequence of high frequency appearing in the genome, it can be annealed to the genome in multiple initial conditions of low stringency amplification, thereby universally amplifying the genome.
  • the product of low stringency amplification is then amplified again in the next round of stringent amplification.
  • the primers for DOP-PCR have multiple annealing sites throughout the genome, the same amount of primers and DNA polymerases reach saturation in the first few cycles and enter a linear growth phase.
  • the inventors have found that its linear growth characteristics are particularly advantageous for subsequent studies of copy number differences.
  • DOP-PCR has a large influence on the coverage of subsequent genomes due to the need to fragment the sample genome in advance and then add amplification adapters to both sides of the fragment. The inventors found that using the DOP-PCR method, the coverage genomic region currently achieved is only up to 30%.
  • MDA Multiple displacement amplification
  • Phi29 DNA polymerase initiates replication simultaneously at the annealing binding site.
  • Phi29 DNA polymerase synthesizes DNA along the DNA template and simultaneously replaces the complementary strand of the template. The replaced complementary strand becomes a new template and is amplified by random primer binding.
  • the Phi 29 DNA polymerase used in the MDA reaction has strong template binding ability to the template, and can continuously amplify the 10Kb DNA template without dissociating from the template, and the enzyme also has 3 ' ⁇ 5 ' exo Enzyme activity ensures high fidelity of DNA replication.
  • the method comprises:
  • S100 Performing a first amplification reaction on the whole genome sample to be amplified, thereby obtaining a first amplification product.
  • S200 after obtaining the first amplification product, performing the second amplification reaction on the obtained first amplification product, from While obtaining the second amplification product, the obtained second amplification product can constitute an amplified whole genome.
  • the first amplification reaction and the second amplification reaction are each one selected from the group consisting of a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reaction.
  • the first amplification reaction is different from the type of the second amplification reaction
  • the first amplification reaction is one selected from the group consisting of a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reaction
  • the second amplification reaction is selected from the group consisting of Another type of PCR amplification reaction and constant temperature amplification reaction, for example, the first amplification reaction is a PCR-based amplification reaction, and the second amplification reaction is a constant temperature amplification reaction.
  • amplification products obtained by using the amplification method of the present invention can be used to analyze copy number variation (eg, chromosome addition, deletion, and transfer) in chromosomes in a genome.
  • the amplification method according to an embodiment of the present invention can be used to simultaneously perform detection of various abnormal states in a micro sample, such as simultaneously performing detection of a single nucleotide polymorphism SNP and a copy number variation CNV, thereby Genomic variation provides more comprehensive information.
  • PCR-based amplification reaction is not particularly limited, and may be selected from interspersed repetitive sequence (IRS) PCR according to an embodiment of the present invention.
  • RIS interspersed repetitive sequence
  • LA-PCR linker adapter technique PCR
  • DOP-PCR degenerate oligonucleotide primer PCR
  • PEP primer extension preamplification
  • PEP primer extension preamplification
  • PEP primer extension preamplification
  • I-PEP improved PEP
  • LMP ligation-mediated PCR
  • LMP a, single cell comparative genomic hybridization
  • SCOMP PCR b
  • PRSG random cut genomic DNA
  • linker-mediated PCR linker-ligation PCR
  • DOP-PCR is used as a PCR-based amplification reaction
  • amplification of DOP-PCR relies on a set of oligonucleotides with a 3'-end random sequence and a 5'-end partial immobilization sequence. These primers are designed to be able to anneal relatively uniformly.
  • DOP-PCR can be performed by using a commercially available kit such as Sigma. Implemented by the GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit.
  • the term "constant temperature amplification reaction” used may also be referred to as “non-PCR-based linear amplification", and the specific type thereof is not particularly limited.
  • the isothermal amplification reaction may be at least selected from the group consisting of a strand displacement amplification reaction (SDA), a multiple strand displacement amplification reaction (MDA), and a T7-based linear amplification reaction.
  • SDA strand displacement amplification reaction
  • MDA multiple strand displacement amplification reaction
  • T7-based linear amplification reaction a T7-based linear amplification reaction.
  • MDA utilizes a thermophilic DNA polymerase (also referred to herein as: Phi29 enzyme) cloned from Bacillus subtilis phage phi29 and an anti-exonuclease six-base random oligonucleotide primer for isothermal DNA. Amplification. Since the Phi29 enzyme has the property of strand displacement, this whole genome amplification method is called multiple displacement amplification (MDA). MDA technology uses random primers to anneal to template DNA at multiple sites, and Phi29 DNA polymerase initiates replication at multiple sites in the DNA. It synthesizes DNA along the DNA template, while replacing the complementary strand of the template, and the replaced complementary strand becomes a new template for amplification.
  • Phi29 enzyme also referred to herein as: Phi29 enzyme
  • the amplification system containing the cell genome can be incubated at a constant temperature of 30 ° C for 16 hours, and then heated to 65 ° C for 10 minutes to terminate the reaction, thereby completing the MDA amplification reaction.
  • MDA amplification can be achieved by commercial kits, for example by using Qiagen's REPLI-g Mini Kit.
  • the type of whole genome sample that can be used for amplification according to the method of the embodiment of the present invention is not particularly limited. According to the amplification method of the embodiment of the present invention, it is possible to efficiently amplify a trace amount of the whole genome group sample.
  • the whole genome sample used is a whole genome sample from a single cell.
  • the order of the constant temperature amplification reaction and the PCR-based amplification reaction is not particularly limited.
  • the first amplification reaction is a constant temperature amplification reaction
  • the second amplification reaction is a PCR-based amplification reaction, that is, first, a constant temperature amplification reaction is performed, and then, the expansion of the constant temperature amplification reaction is performed.
  • the product is subjected to a PCR-based amplification reaction.
  • the first amplification reaction may be at least one selected from the group consisting of SDA, MDA, and RCA
  • the second amplification reaction may be selected from the group consisting of LA-PCR, DOP-PCR, PEP, and At least one of the groups of LA-PCR.
  • MDA is first performed, followed by DOP-PCR, i.e., the first amplification reaction is MDA, and the second amplification reaction is DOP-PCR.
  • the progress time of the first amplification reaction and the second amplification reaction is not particularly limited, and according to an embodiment of the present invention, the first amplification reaction may be performed for 15 minutes to 2 hours, preferably 1 -2 hours. Thereby, the efficiency of amplification of whole genome samples can be further improved.
  • an embodiment of the present invention includes:
  • the whole genome sample is subjected to amplification amplification according to the method described above to obtain a whole genome amplification product.
  • the step of extracting the whole genome sample from the single cell, and optionally the step of isolating the single cell from the biological sample may be further included.
  • whole genome sequence information can be efficiently obtained from single cells isolated from biological samples.
  • the type of whole genome is extracted from a single cell without particular limitation.
  • the type of biological sample that can be used as a source of whole genome samples is not particularly limited.
  • the biological sample that can be used is selected from the group consisting of blood and urine.
  • At least one of liquid, saliva, tissue, germ cells, blastomeres and embryos can be conveniently obtained from an organism, and can be specifically sampled for certain diseases to obtain specific analytical means for certain specific diseases.
  • separating the single cells from the biological sample is performed by at least one selected from the group consisting of a dilution method, a mouth pipette separation method, a micromanipulation, a flow cytometry, and a microfluidic method.
  • the step of lysing the single cells to release the whole genome of the single cells may be further included.
  • a method which can be used for lysing a single cell and releasing a whole genome is not particularly limited as long as single cell lysis can be preferably sufficiently lysed.
  • the single cell can be cleaved with an alkaline lysate and the whole genome of the single cell can be released. The inventors have found that this can effectively lyse single cells and release the whole genome, and the released whole genome can improve the accuracy when sequencing, thereby further improving the efficiency of determining single cell chromosome aneuploidy.
  • the whole genome sequencing library can be sequenced using at least one selected from the group consisting of Illumina Hiseq2000, ABI SOLiD, Roche 454, and single molecule sequencing devices.
  • Illumina Hiseq2000 the group consisting of Illumina Hiseq2000, ABI SOLiD, Roche 454, and single molecule sequencing devices.
  • Those skilled in the art can select different methods for constructing a whole genome sequencing library according to the specific scheme of the genome sequencing technology used. For details on constructing the whole genome sequencing library, refer to the protocol provided by the manufacturer of the sequencing instrument, such as Illumina, for example. See Illumina Corporation Multiplexing Sample Preparation Guide (Part #1005361; Feb 2010) or Paired-End SamplePrep Guide (Part #1005063; Feb 2010), which is incorporated herein by reference.
  • the method for sequencing a whole genome according to an embodiment of the present invention can be effectively used for analyzing chromosome number-based copy number variation in a genome by using a sequencing result obtained by using an amplification product obtained by a specific amplification method (such as chromosome addition, deletion and transfer).
  • a sequencing result obtained by the sequencing method according to the embodiment of the present invention can be used to simultaneously perform detection of various abnormal states in a small amount of samples, such as simultaneously completing single nucleotide polymorphism SNP and copy number variation CNV. The detection, thus the genomic variation, provides more comprehensive information.
  • the invention proposes a method of determining whether an abnormal state exists in a whole genome.
  • the method comprises:
  • the whole genome is sequenced to obtain sequencing data according to the method for sequencing the whole genome as described above; S500: After obtaining the sequencing data, determining whether an abnormal state exists in the whole genome based on the sequencing data.
  • a method for determining whether an abnormal state exists in a whole genome according to an embodiment of the present invention, based on a whole genome amplification product obtained by an amplification method according to an embodiment of the present invention, which can truly reflect a genome-wide condition, can effectively analyze a genome Chromosome-based copy number variation (eg, chromosomal addition, deletion, and transfer), and simultaneous detection of multiple abnormal states in a small sample, such as simultaneous completion of single nucleotide polymorphism SNPs and copy number variation CNV The detection, thus the genomic variation, provides more comprehensive information.
  • a method of determining an abnormal state by analyzing the sequencing data is not particularly limited.
  • whether or not an abnormal state exists in the genome can be determined by plotting a genomic Circos map based on the sequencing data.
  • the type of the abnormal state is not particularly limited and may be at least one selected from the group consisting of a SNP and a CNV. Details on mapping genomic Circos can be found on the Circos official website at http://circos.ca/guide/genomic/. The use of Circos to map genomic data is widely used, in short, using Circos at 16 Jun The updated version of ⁇ .55-1 in 2011, the summary steps for mapping the genomic Circos are as follows:
  • the invention provides an apparatus for amplifying a whole genome sample.
  • the apparatus 1000 includes a first amplification unit 100 and a second amplification unit 200, wherein the first amplification unit 100 is adapted to perform a first amplification reaction on a whole genome sample, according to an embodiment of the present invention,
  • the second amplification unit 200 is coupled to the first amplification unit 100 and is adapted to perform a second amplification reaction on the obtained first amplification product to obtain a second amplification product
  • the first amplifying unit 100 is adapted to perform one selected from the group consisting of a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reaction
  • the second amplification unit 200 is adapted to perform a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reaction.
  • the first amplification unit 100 is adapted to perform a thermostatic amplification reaction and the second amplification unit 200 is adapted to perform a PCR-based amplification reaction.
  • the first amplification unit 100 is adapted to perform MDA and the second amplification unit 200 is adapted to perform MAP-PCR.
  • a method of amplifying a whole genome sample according to an embodiment of the present invention can be effectively implemented, thereby being able to secure a high genome
  • the chimera produced by the constant temperature amplification reaction is reduced and the amplification bias is reduced.
  • the obtained amplification product can be used to analyze chromosome-based copy number variation in the genome (such as chromosome addition, deletion and transfer), and can also be used to simultaneously perform detection of various abnormal states in a small sample, such as At the same time, the detection of single nucleotide polymorphism SNP and copy number variation CNV is completed, so that the variability of the genome provides more comprehensive information.
  • the invention proposes an apparatus 10000 for sequencing a whole genome.
  • the apparatus 10000 comprises: a whole genome amplification device 1000, a sequencing library construction device 300, and a sequencing device 400.
  • whole genome amplification device 1000 is a device for amplifying whole genome samples as described above.
  • the single cell separation unit and the single cell lysis unit may be further included, wherein the single cell separation unit is for separating single cells from the biological sample, and the single cell lysis unit is for receiving the isolated single cells and lysing the single cells Single cells, in order to release the whole genome of the single cells.
  • the single cell separation unit may comprise means adapted to perform at least one selected from the group consisting of: dilution method, oral pipette separation method, display: operation, flow cytometry, and ⁇ : flow control law.
  • sequencing library construction device 300 is coupled to whole genome amplification device 1000 and is adapted to construct a whole genome sequencing library for whole genome amplification products; sequencing device 400 is adapted to sequence a whole genome sequencing library.
  • the sequencing device may include at least one selected from the group consisting of Illumina Hiseq2000, ABI SOLiD, Roche 454, and a single molecule sequencing device.
  • an apparatus for sequencing a whole genome can efficiently implement a method for sequencing a whole genome, thereby obtaining an amplification product obtained by using a specific amplification method.
  • the sequencing results can be effectively used to analyze chromosome-based copy number variation in the genome (eg, chromosome addition, deletion, and transfer).
  • the obtained sequencing result can be used to simultaneously detect a plurality of abnormal states in a small amount of samples, such as simultaneously detecting the single nucleotide polymorphism SNP and the copy number variation CNV, thereby providing more variation in the genome.
  • the invention proposes a system 100000 for determining whether an abnormal state exists in a whole genome.
  • the system comprises: a whole genome sequencing device 10000 and an analysis device 500.
  • whole genome sequencing device 10000 is the apparatus described above for sequencing whole genomes to sequence the whole genome and obtain sequencing data.
  • Analytical device according to an embodiment of the invention 500 is coupled to a whole genome sequencing device 10000 and is adapted to determine whether an abnormal state exists in the whole genome based on the obtained sequencing data.
  • the type of the analysis device 500 is not particularly limited.
  • a genomic map of genomics suitable for mapping based on sequencing data can be employed to determine if an abnormal state exists in the genome.
  • a system for determining whether an abnormal state exists in a whole genome can effectively implement a method of determining whether an abnormal state exists in a whole genome, thereby being capable of efficiently analyzing a copy number variation in a genome in a genome (for example, Chromosomal addition, deletion and transfer), and can detect multiple abnormal states simultaneously in a small amount of samples, such as simultaneous detection of single nucleotide polymorphism SNPs and copy number variants CNV, so that genomic variation provides more Comprehensive information.
  • a copy number variation in a genome in a genome for example, Chromosomal addition, deletion and transfer
  • the invention proposes a kit for amplifying a whole genome.
  • the method includes: a first reagent for performing one of a PCR-based amplification reaction and a constant temperature amplification reaction; and a second reagent for performing the Another type of PCR amplification reaction and isothermal amplification reaction, wherein the first reagent and the second reagent are respectively disposed in different containers.
  • the lymphocyte lineage in a healthy Asian male donor was used as a single cell collection material using the donor "Yanhuang", the first Asian sequence published in 2008.
  • the medium containing the cells was washed with a PBS solution by high-speed centrifugation and removal of the supernatant, and finally the cells were resuspended in an appropriate amount of PBS solution.
  • the obtained cell suspension was transferred to a culture medium, and a cell separation operation was performed using an oral pipette under an inverted microscope. The separated cells were treated according to the amplification method shown in Table 1.
  • the DOP-PCR reaction process comprises: after collecting the cells, adding a cleavage and fragmentation buffer to which the proteinase K component has been added, lysing the cells and releasing the genome, and the genome is further interrupted into nucleic acid fragments. Subsequently, single cell library preparation buffer, library stabilization solution and corresponding biological enzymes (all from the kit: GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit) were added and incubated at 16 ° C, 24 ° C and 37 ° C respectively. After 20 minutes, the reaction was finally terminated at 75 ° C for 5 minutes.
  • the obtained amplification reaction product was added to the amplification mixture and the whole genome amplification DNA was intoxicated (all from the kit: Sigma's GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit), and then PCR reaction: 95 ° C for 3 minutes, 25
  • the DNA was amplified by circulating at 94 ° C for 30 seconds and at 65 ° C for 5 minutes. After completion of the reaction, the DNA product can be used directly for downstream applications or stored at -20 °C.
  • Qiagen's REPLI-g Mini Kit to achieve, in short: first use the alkaline lysate (ALB) containing potassium hydroxide to lyse the cells, then use DLB buffer (from the kit: REPLI-g Mini Kit) was used to prepare a nucleic acid denaturation buffer, and the sample was added to the sample for 3 minutes at room temperature for denaturation reaction. After the amplification reaction buffer containing Phi 29 polymerase was added to the sample, it was incubated at 30 ° C for 16 hours, and finally the polymerase was inactivated at 65 ° C for 10 min to terminate the reaction.
  • ALB alkaline lysate
  • DLB buffer from the kit: REPLI-g Mini Kit
  • the DNA product can be used directly for downstream applications or stored at -20 °C.
  • the genomic products obtained after treatment according to different amplification methods were constructed, and the sequencing library was constructed according to the short insert library construction method provided by the manufacturer of the Illumina Hiseq2000 platform. In short, it includes:
  • the DNA product was disrupted to the insert of interest using a Covaris ultrasonic interrupter, followed by end-repair, end-added A bases, and a Pair-end standard universal flowcell linker attached to the Illumina sequencing platform.
  • the product of the ligated link was amplified for 10 cycles with primers labeled with Index.
  • the product is enriched according to library concentration, enabling multiple test libraries to be sequenced on the same lane on the same flowcell.
  • the reaction is differentiated according to the respective added labels (Index) after the data is generated, thereby obtaining sequencing data of each sample.
  • the original down data fastq. file is processed through preliminary processing. After removing the pollution data, low quality data and adaptor, input SOAP software for sequence assembly, and the sequencing depth and coverage of the sample genome can be obtained. The results are shown in Table 2.
  • covered area refers to the depth value of the genomic region covered by the sequencing data greater than or equal to one filtered sequence; the term “average depth of the whole genome” indicates the sequence of the genome to be aligned (not necessarily covering the entire genomic region of the species) divided by the genome-wide ratio of the entire species; the term “coverage” means greater than or equal to the genome-wide ratio of the genomic region covered by a filtered sequence; The depth median value means that all reads are sorted by depth from high to low, taking the depth of the read in the middle of the sequence.
  • the YH lymphocyte single cell whole genome was amplified by MDA combined with DOP-PCR (samples MDA1-DOP-2.2 and MDA2-DOP-2.3), and the whole genome average depth and coverage test values were significantly higher than The values obtained by genomic amplification using DOP-PCR (sample DOP-2.1) or MDA (sample MDA16-2.4) alone.
  • Example 2 Whole genome amplification method for reducing amplification bias
  • the inventors In order to reduce the amplification bias brought about by MDA, the inventors first performed a reaction time for reducing MDA.
  • the normal MDA reaction time is 16 hours, and usually the MDA reaction time is divided into 4 gradients of 2 hours, 4 hours, 8 hours, and 16 hours, respectively.
  • the inventors used YH lymphocyte cells to pick single cells and amplified them according to the above MDA reaction time, and constructed a whole genome double-end library for sequencing.
  • the resulting cellular genome Circos is shown in Figure 7. As shown in Fig. 7, the Circos diagram has a total of 5 ⁇ , the outermost ⁇ is the karyotype information, and the YH lymphocyte single cell after the MDA reaction is 2, 4, 8, and 16 hours from the outside to the inside.
  • the genomic amplification situation as can be seen from Figure 7, as the MDA amplification time increases, the difference in coverage of genomic amplification will gradually increase.
  • the inventors have found that the occurrence of amplification differences is due to the amplification characteristics of MD A.
  • the random primers in the reaction solution are randomly bound to the template strand, and the number of primers bound on the allele and at different genomic positions is not necessarily equal, and the number of amplification products is gradually increased after prolonged amplification.
  • the difference in GC content in the genomic sequence also has a certain effect on the binding of random primers to the template.
  • Circos diagram obtained by testing the effects of the combination of MDA and DOP-PCR amplification methods on amplification bias is shown in Fig. 8.
  • Circos represents YH lymphocyte single cell DDOP-PCR, MDA-'j, DOP-PCR, DOP-PCR after MDA for two hours, and 16-hour MDA from outside to inside. , a total of four amplification protocols amplified sample genome coverage.
  • Example 3 Using a somatic cell in a trisomy 21 trial to validate a new method for reducing amplification bias to demonstrate that the combination of MDA and DOP-PCR was able to detect a wide range of CNVs in the genome, the researchers pooled peripheral blood lymphocytes from a donor of a trisomy 21 syndrome for single-cell amplification testing. The whole genome of the T21 and YH donors was first subjected to whole genome amplification, and the genomic Circos of each sample was obtained according to the method described above, as shown in Fig. 9. As shown in Fig.
  • the Circos diagram shows T21 lymphocytes from 16 hours to MDA and T21 lymphocytes after 30 minutes of MDA, and half of the volume was taken out for 16 hours, and MDA and YH lymphocytes were 16 hours after MDA. It can be seen from Fig. 9 that if only two MLA amplification methods are used for the two kinds of lymphocytes, due to the existence of a very obvious amplification bias, it is impossible to distinguish a large range of CNV from the level of a single cell, that is, in the two cells. Significant differences in genomic folds were found on chromosome 21.
  • the inventors set up an experimental design of DOP-PCR reaction after different time length MDA reactions, and once again performed whole genome amplification of lymphoid cells from T21 to obtain each sample.
  • the genomic Circos is shown in Figure 10.
  • the Circos diagram shows 1. DOP-PCR amplification from outside to inside; 2. 16-hour MDA amplification; 3. MDA after 15 minutes plus DOP-PCR amplification; 4. MDA after 30 minutes plus DOP- PCR amplification; 5. MDA 30 minutes after taking out half of the volume of product and then 16 hours of MDA amplification; 6. MDA 60 minutes after adding DOP-PCR amplification; 7.
  • MDA 30 minutes after removal of half a volume of product and then DOP-PCR amplification As shown in Figure 10, for T21 lymphocyte single cell expansion, the addition of DOP-PCR amplification after MDA of different durations revealed that the baseline at position 21 of the genome was up-regulated, indicating that the chromosome 21 was aligned. The genomic sequence of the position is more than the adjacent chromosome. The most obvious ones are: 3. MDA 15 minutes after adding DOP-PCR amplification; 4. MDA 30 minutes after adding DOP-PCR amplification; 6. MDA 60 minutes after adding DOP-PCR amplification and ⁇ . MDA 30 minutes after removal of half volume The product was further subjected to DOP-PCR amplification.
  • Figure 11 is a partial enlarged view of Figure 10, in which the T21 cells were subjected to an MDA reaction followed by a DOP-PCR reaction, a geos partial map of the genome.
  • MD A plus DOP-PCR has the advantage of reducing the amplification bias.
  • lymphocyte lineage from the first Asian genomic sequence donor was first used, for MDA and
  • DOP-PCR Two whole genome amplification methods, DOP-PCR, were explored, demonstrating that the amplification method of the present invention can reduce amplification bias.
  • peripheral blood from a 21-slice female patient after erythrocyte lysate is added to lyse and remove the nucleated red blood cells, the collected lymphocytes are sorted by a single pipette through a mouth pipette operation, and then collected. Single lymphocytes were subjected to DOP-PCR, MDA, and a combination of both for genome-wide amplification.
  • the amplified product is then sequenced by a second-generation sequencing technique, and the distribution of the statistical sequence on the genomic chromosome, from the single At the level of the cells, the difference between the 21 trisomy and the healthy individual genome is distinguished.
  • the whole genome amplification method of the present invention can reduce amplification bias. Therefore, the above examples demonstrate that the detection of large-scale chromosome addition, deletion and metastasis in the genome can be completed by only obtaining a small amount of samples, and the genomic level is provided for clinical diagnosis and treatment; on the other hand, simultaneous realization on a small sample can be realized.
  • the detection of SNP and CNV conditions provides more comprehensive information for studying the variability of genomes such as tumor cells.
  • the method for amplifying a whole genome sample of the present invention a method for sequencing a whole genome, a method for determining whether an abnormal state exists in a whole genome, a device for amplifying a whole genome sample, a device for sequencing a whole genome, and A system for determining whether there is an abnormal state in the whole genome can effectively amplify, sequence, and analyze the whole genome, and can reduce amplification preference.

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Abstract

提出了对全基因组样本进行扩增的方法、对全基因组进行测序的方法、确定全基因组中是否存在异常状态的方法、对全基因组样本进行扩增的装置、对全基因组进行测序的设备、确定全基因组中是否存在异常状态的系统。其中，对全基因组样本进行扩增的方法包括：将全基因组样本进行第一扩增反应，以便获得第一扩增产物；将第一扩增产物进行第二扩增反应，以便获得第二扩增产物，其中，第一扩增反应是基于PCR的扩增反应和恒温扩增反应的一种，第二扩增反应是基于PCR的扩增反应和恒温扩增反应的另一种。

Description

全基因组扩增方法及其应用 优先权信息
无 技术领域
本发明涉及全基因组扩增方法及其应用。 更具体的， 本发明涉及对全基因组样本进 行扩增的方法、 对全基因组进行测序的方法、 确定全基因组中是否存在异常状态的方法、 对全基因组样本进行扩增的装置、 对全基因组进行测序的设备以及确定全基因组中是否 存在异常状态的系统。 背景技术
目前， 全基因组扩增技术（ Whole genome amplification, WGA )是一种从有限 DNA 或者单个细胞中产生足量 DNA 的体外扩增方法。当前科学家们共开发了两种基本原理 不同的策略来实现 WGA的扩增， 分别为基于 PCR方法的扩增策略和恒温扩增策略。 其中最具代表性的方法包括简并寡核苷酸引物 PCR ( Degenerate Oligonucleotide-Primed PCR, DOP-PCR ) 和多重置换扩增 （ Multiple Displacement Amplification, MDA ) 。
然而目前， 全基因组扩增技术仍有待改进。 发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
基于 PCR的全基因组扩增方法， 例如简并寡核苷酸引物 PCR ( DOP-PCR ) 的引物 由其 3'和 5'端的特异核苷酸序列和中间的 6 个随机核苷酸构成。其 PCR 程序是首先 在低退火温度下进行几个循环的低严谨扩增，然后再提高退火温度进行几十个循环的严 谨扩增。 由于 DOP-PCR引物 3'端的设计的是基于基因组中高频出现的序列， 因此， 在 初始进行的低严谨扩增条件下能与基因组多处退火，从而将基因组普遍扩增。 然后在下 一轮的严谨扩增中又将低严谨扩增的产物再次放大。 由于 DOP-PCR的引物在整个基因 组上有多个退火位点， 因此相同量的引物和 DNA聚合酶在前几个循环内便达到饱和而 进入线性增长期。 并且， 发明人发现， 其线性增长的特性对后续研究拷贝数差异尤其有 利。 但是， 发明人进一步发现 DOP-PCR由于需要预先将样品基因组片段化， 再于片段 两边加上扩增用接头， 对后续基因组的覆盖度产生较大的影响。 发明人发现应用 DOP-PCR 方法， 目前能够达到的覆盖度基因组区域最高只有 30%。
相对于 DOP-PCR 技术， 多重置换扩增（MDA ) 目前被公认为最好的单细胞全基因 组扩增方法。 MDA利用随机引物与模板 DNA在多个位点退火结合 Phi29 DNA 聚合酶 在退火结合位点同时起始复制。 Phi29 DNA聚合酶沿着 DNA 模板合成 DNA, 同时取 代模板的互补链，被置换的互补链又成为新的模板，被随机引物结合上进行扩增 。 MDA 反应所釆用的 Phi 29 DNA 聚合酶对于模板有很强的模板结合能力， 能连续扩增 10Kb 的 DNA 模板而不从模板上解离， 同时这种酶还具有 3 '→5'外切酶活性， 可以保证 DNA复制的高保真性。 因此^:量的 DN A样品经过 MD A扩增后， 最终可以获得大量 高分子量、 扩增倾向性和突变积累程度低的高质量 DNA。 但是， 本发明的发明人发现， 尽管 MDA为核型分析、 比较基因杂交和基因组测序提供了简易和高效的解决方案，但 MDA的固有特性在某些领域也会造成应用瓶颈。 发明人发现来源于外源 DNA的污染 或反应液中随机引物的非特异性背景扩增在很大程度上影响了从浓度测量上判断 MDA 的效果， 这使得需要同时使用相对应物种的 PCR结果来评估 MDA效果； 并且， 由于 Phi29聚合酶的扩增特性而产生的嵌合体对后续进行基因组中的拷贝数变异（ copy number variant, CNV ) 分析造成了极大的干扰。
在本发明的第一方面， 本发明提出了一种对全基因组样本进行扩增的方法。 根据本 发明的实施例， 该方法包括： 将所述全基因组样本进行第一扩增反应， 以便获得第一扩 增产物； 将所述第一扩增产物进行第二扩增反应， 以便获得第二扩增产物， 其中， 所述 第一扩增反应是基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的一种， 所述第二扩增反应是选 自 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的另一种。 利用根据本发明实施例的对全基因组样 本进行扩增的方法， 能够在保障对基因组高覆盖度的前提下， 减少恒温扩增反应产生的 嵌合体及减低扩增偏向性。 并且发明人发现， 通过使用本发明的扩增方法所得到的扩增 产物能够用于分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况 (例如染色体添加、 缺失 和转移）。 并且， 根据本发明的实施例的扩增方法， 可以用于在微量样品中同时完成多 种异常状态的检测， 诸如同时完成对单核苷酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测， 从而为基因组的变异情况提供更全面的信息。
在本发明的第二方面， 本发明提出了一种用于对全基因组进行测序的方法。 根据本 发明的实施例， 该方法包括： 根据前面所述对全基因组样本进行扩增的方法， 对全基因 组样本进行扩增， 以便获得全基因组扩增产物； 针对所述全基因组扩增产物， 构建全基 因组测序文库； 以及对所述全基因组测序文库进行测序。根据本发明实施例的对全基因 组进行测序的方法通过使用特定的扩增方法所得到的扩增产物所得到的测序结果，可以 有效地用于分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况（例如染色体添加、缺失和 转移）。 并且， 根据本发明的实施例的测序方法所得到的测序结果， 可以用于在微量样 品中同时完成多种异常状态的检测， 诸如同时完成对单核苷酸多态性 SNP与拷贝数变 异 CNV的检测， 从而基因组的变异情况提供更全面的信息。
在本发明的第三方面， 本发明提出了一种确定全基因组中是否存在异常状态的方法。 根据本发明的实施例， 该方法包括： 根据前面所述用于对全基因组进行测序的方法， 对所 述全基因组进行测序， 以便获得测序数据； 以及基于所述测序数据， 确定所述全基因组中 是否存在异常状态。 根据本发明实施例的确定全基因组中是否存在异常状态的方法， 基于 根据本发明实施例的扩增方法所得到的可以真实反映全基因组状况的全基因组扩增产物， 能够有效地分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况（例如染色体添加、 缺失和 转移）， 并且可以在微量样品中同时完成多种异常状态的检测， 诸如同时完成对单核苷 酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测， 从而基因组的变异情况提供更全面的信息。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种对全基因组样本进行扩增的装置。根据本发 明的实施例， 该装置包括第一扩增单元， 所述第一扩增单元适于将所述全基因组样本进 行第一扩增反应， 以便获得第一扩增产物； 第二扩增单元， 所述第二扩增单元与所述第 一扩增单元相连， 并且适于将所述第一扩增产物进行第二扩增反应， 以便获得第二扩增 产物， 其中， 所述第一扩增单元适于进行选自基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的 一种，所述第二扩增单元适于进行选自基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的另一种。 利用根据本发明实施例的对全基因组样本进行扩增的装置，能够有效地实施根据本发明 实施例的对全基因组样本进行扩增的方法， 从而能够在保障对基因组高覆盖的前提下， 减少恒温扩增反应产生的嵌合体及减低扩增偏向性。并且所得到的扩增产物能够用于分 析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况（例如染色体添加、 缺失和转移） ， 也可 以用于在微量样品中同时完成多种异常状态的检测， 诸如同时完成对单核苷酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测， 从而基因组的变异情况提供更全面的信息。
在本发明的第五方面， 本发明提出了一种用于对全基因组进行测序的设备。 根据本 发明的实施例， 该设备包括： 全基因组扩增装置， 所述全基因组扩增装置为前面所述的 对全基因组样本进行扩增的装置； 测序文库构建装置， 所述测序文库构建装置与所述全 基因组扩增装置相连， 并且适于针对所述全基因组扩增产物， 构建全基因组测序文库； 以及测序装置， 所述测序装置适于对所述全基因组测序文库进行测序。根据本发明实施 例的用于对全基因组进行测序的设备， 能够有效地实施用于对全基因组进行测序的方 法，从而通过使用特定的扩增方法所得到的扩增产物所得到的测序结果， 可以有效地用 于分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况 （例如染色体添加、 缺失和转移） 。 并且所得到的测序结果， 可以用于在微量样品中同时完成多种异常状态的检测，诸如同 时完成对单核苷酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测，从而基因组的变异情况提供 更全面的信息。
在本发明的第六方面， 本发明提出了一种确定全基因组中是否存在异常状态的系统。根 据本发明的实施例， 该系统包括： 全基因组测序设备， 所述全基因组测序设备为前面所述 用于对全基因组进行测序的设备， 用于对全基因组进行测序， 以便获得测序数据； 以及分 析设备， 所述分析设备与所述全基因组测序设备相连， 并且适于基于所述测序数据， 确定 所述全基因组中是否存在异常状态。 根据本发明的实施例的确定全基因组中是否存在异常 状态的系统能够有效地实施确定全基因组中是否存在异常状态的方法， 从而能够有效地分 析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况（例如染色体添加、 缺失和转移） ， 并且 可以在微量样品中同时完成多种异常状态的检测，诸如同时完成对单核苷酸多态性 SNP 与拷贝数变异 CNV的检测， 从而基因组的变异情况提供更全面的信息。
在本发明的第七方面， 本发明提出了一种用于扩增全基因组的试剂盒。 根据本发明的 实施例， 该包括： 第一试剂， 所述第一试剂用于进行基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反 应的一种； 第二试剂， 所述第二试剂用于进行基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的另 一种， 其中， 所述第一试剂和所述第二试剂分别设置在不同的容器中。 利用根据本发明的 实施例的用于扩增全基因组的试剂盒， 能够有效地实施根据本发明实施例的对全基因组样 本进行扩增的方法， 从而实现对全基因组进行有效扩增。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得 明显， 或通过本发明的实践了解到。 附图说明
本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明 显和容易理解， 其中：
图 1 显示了根据本发明一个实施例的对全基因组样本进行扩增的方法的流程示意 图；
图 2 显示了根据本发明一个实施例的用于对全基因组进行测序的方法的流程示意 图；
图 3 显示了根据本发明一个实施例的确定全基因组中是否存在异常状态的方法的流 程示意图；
图 4显示了根据本发明一个实施例的对全基因组样本进行扩增的装置的结构示意图； 图 5显示了根据本发明一个实施例的用于对全基因组进行测序的设备的结构示意图； 图 6 显示了根据本发明一个实施例的确定全基因组中是否存在异常状态的系统的结 构示意图；
图 7显示了根据本发明一个实施例的 2、4、8、16小时 MDA扩增 YH淋巴细胞的 Circos 图；
图 8显示了 #居本发明一个实施例的测试 MDA与 DOP-PCR两种扩增方法相结合对 扩增偏向性的影响的 Circos图；
图 9显示了根据本发明一个实施例的 T21与 YH淋巴细胞 MD A效果对照； 图 10显示了根据本发明一个实施例的在 T21淋巴细胞上测试不同时长的 MDA反应 后加上 D0P-PCR的结果； 以及
图 11是图 10的局部放大图。
发明详细描述
下面详细描述本发明的实施例， 所述实施例的示例在附图中示出， 其中自始至终相
图描述的实施例是示例性的， 旨在用于解释本发明， 而不能理解为对本发明的限制。
在本文中所使用的术语 "第一" 、 "第二" 仅用于描述目的， 而不能理解为指示或 暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。 由此， 限定有 "第一" 、 "第 二" 的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。 在本发明的描述中， 除非 另有说明， "多个" 的含义是两个或两个以上， 除非另有明确的限定。
在本文中， 除非另有明确的规定和限定， 术语 "相连" 、 "连接" 等术语应做广义 理解， 例如， 可以是固定连接， 也可以是可拆卸连接， 或一体地连接； 可以是机械连接， 也可以是电连接； 可以是直接相连， 也可以通过中间媒介间接相连， 可以是两个元件内 部的连通。对于本领域的普通技术人员而言， 可以根据具体情况理解上述术语在本发明 中的具体含义。 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
基于 PCR的全基因组扩增方法， 例如简并寡核苷酸引物 PCR ( DOP-PCR ) 的引物 由其 3'和 5'端的特异核苷酸序列和中间的 6 个随机核苷酸构成。其 PCR 程序是首先 在低退火温度下进行几个循环的低严谨扩增，然后再提高退火温度进行几十个循环的严 谨扩增。 由于 DOP-PCR引物 3'端的设计的是基于基因组中高频出现的序列， 因此， 在 初始进行的低严谨扩增条件下能与基因组多处退火，从而将基因组普遍扩增。 然后在下 一轮的严谨扩增中又将低严谨扩增的产物再次放大。 由于 DOP-PCR的引物在整个基因 组上有多个退火位点， 因此相同量的引物和 DNA聚合酶在前几个循环内便达到饱和而 进入线性增长期。 并且， 发明人发现， 其线性增长的特性对后续研究拷贝数差异尤其有 利。 但是， 发明人进一步发现 DOP-PCR 由于需要预先将样品基因组片段化， 再于片段 两边加上扩增用接头， 对后续基因组的覆盖度产生较大的影响。 发明人发现应用 DOP-PCR 方法， 目前能够达到的覆盖度基因组区域最高只有 30%。
相对于 DOP-PCR 技术， 多重置换扩增 （MDA ) 目前被公认为最好的单细胞全基 因组扩增方法。 MDA利用随机引物与模板 DNA在多个位点退火结合 Phi29 DNA 聚合 酶在退火结合位点同时起始复制。 Phi29 DNA聚合酶沿着 DNA模板合成 DNA, 同时 取代模板的互补链， 被置换的互补链又成为新的模板， 被随机引物结合上进行扩增 。 MDA反应所釆用的 Phi 29 DNA 聚合酶对于模板有很强的模板结合能力， 能连续扩增 10Kb 的 DNA 模板而不从模板上解离， 同时这种酶还具有 3 '→5 '外切酶活性， 可以保 证 DNA复制的高保真性。 因此微量的 DNA样品经过 MDA扩增后， 最终可以获得大 量高分子量、 扩增倾向性和突变积累程度低的高质量 DNA。 但是， 本发明的发明人发 现，尽管 MD A为核型分析、比较基因杂交和基因组测序提供了简易和高效的解决方案， 但 MDA的固有特性在某些领域也会造成应用瓶颈。 发明人发现来源于外源 DNA的污 染或反应液中随机引物的非特异性背景扩增在很大程度上影响了从浓度测量上判断 MDA 的效果， 这使得需要同时使用相对应物种的 PCR结果来评估 MDA效果； 并且， 由于 Phi29聚合酶的扩增特性而产生的嵌合体对后续进行基因组中的拷贝数变异（ copy number variant,CNV ) 分析造成了极大的干扰。
下面， 参考图 1 , 对根据本发明实施例的一种对全基因组样本进行扩增的方法进行 描述。 根据本发明的实施例， 该方法包括：
S100: 将需要扩增的全基因组样本进行第一扩增反应， 从而获得第一扩增产物。 S200: 在得到第一扩增产物之后， 将所得到的第一扩增产物进行第二扩增反应， 从 而获得第二扩增产物， 所获得的第二扩增产物可以构成经过扩增的全基因组。 根据本发明的实施例， 第一扩增反应和第二扩增反应均为选自基于 PCR 的扩增反 应和恒温扩增反应的一种。 其中， 第一扩增反应与第二扩增反应的类型不同， 第一扩增 反应为选自基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的一种， 而第二扩增反应是选自基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的另一种， 例如， 第一扩增反应为基于 PCR的扩增反 应， 而第二扩增反应为恒温扩增反应。 由此， 利用根据本发明实施例的对全基因组样本 进行扩增的方法， 能够在保障对基因组高覆盖的前提下， 减少恒温扩增反应产生的嵌合 体及减低扩增偏向性。 并且发明人发现， 通过使用本发明的扩增方法所得到的扩增产物 能够用于分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况 (例如染色体添加、 缺失和转 移）。 并且， 根据本发明的实施例的扩增方法， 可以用于在微量样品中同时完成多种异 常状态的检测， 诸如同时完成对单核苷酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测，从而 基因组的变异情况提供更全面的信息。
在本文中， 所使用的术语 "基于 PCR 的扩增反应" 的具体类型并不受特别限制， 才艮据本发明的实施例， 可以为选自散布重复序列 PCR ( interspersed repetitive sequence (IRS) PCR (重复序列 （Alu重复））、连接子-接头技术 PCR( linker adapter technique PCR (LA-PCR) ) 、 简并寡核苷酸引物 PCR ( DOP-PCR ) 、 引物延伸预扩增 （PEP ) 、 DOP 和 PEP改进版 （从低量 DNA的 DOP-PCR得到长产物 （ LL-DOP-PCR ) 、 改进的 PEP (I-PEP) ) 、 连接介导 PCR ( LMP ) ( a、 单细胞比较基因组杂交 PCR ( SCOMP PCR ) ； b、随机剪切基因组 DNA ( PRSG )接头连接介导 PCR (接头 -连接 PCR ) )以及 Ominplex 扩增的至少一种。根据本发明的实施例，优选釆用 DOP-PCR作为基于 PCR的扩增反应。 DOP-PCR的扩增依赖于一套带有 3'端随机序列和 5'端部分固定序列的寡核苷酸实现。 这些引物被设计成能够相对均匀地退火结合到 DNA样品之中。 在寡核苷酸结合到固定 序列的时候，这些产物就可以在聚合酶的作用下进行延伸和扩增。根据本发明的实施例， DOP-PCR可以通过使用商业化的试剂盒， 例如 Sigma公司的 GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit实现。
根据本发明的实施例， 所使用的术语 "恒温扩增反应" 也可以称为 "非基于 PCR 的线性扩增反应 （ non-PCR-based linear amplification ) " , 其具体类型不受特别限制。 根据本发明的实施例， 恒温扩增反应可以为选自链置换扩增反应 （ SDA )、 多重链置换 扩增反应 （MDA ) 以及基于 Τ7的线性扩增反应 （T7-based linear amplification ) 的至少 一种。 根据本发明的实施例， 优选釆用多重链置换扩增反应， 即 MDA作为恒温扩增反 应。 MDA利用从枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis )噬菌体 phi29中克隆出的嗜温 DNA聚合 酶（在本文中也简称为： Phi29 酶）和抗外切酶的六碱基随机寡核苷酸引物进行等温 DNA 扩增。由于 Phi29酶具有链置换的特性，所以该全基因组扩增方法称作多重置换扩增（ MDA )。 MDA技术是利用随机引物在多个位点与模板 DNA退火， Phi29 DNA聚合酶在 DNA的多个 位点同时起始复制。 它沿着 DNA模板合成 DNA, 同时取代模板的互补链， 被置换的互补 链又成为新的模板来进行扩增。 根据本发明的实施例， 可以在包含细胞基因组的扩增体系 在 30 °C恒温条件下孵育 16个小时， 再升温至 65 °C 10分钟终止反应， 从而完成 MDA扩增 反应。 MDA扩增则可以通过商业化的试剂盒，例如通过使用 Qiagen公司的 REPLI-g Mini Kit 来实现。
根据本发明的实施例， 可以用于根据本发明实施例的方法进行扩增的全基因组样本 的类型并不受特别限制。根据本发明的实施例的扩增方法， 能够有效地扩增微量的全基 因组样本。 因而， 根据本发明的实施例， 所釆用的全基因组样本为来自单细胞的全基因 组样本。
根据本发明的实施例， 恒温扩增反应和基于 PCR 的扩增反应的先后顺序并不受特 别限制。 根据本发明的具体实施例， 第一扩增反应是恒温扩增反应， 第二扩增反应是基 于 PCR的扩增反应， 即首先进行恒温扩增反应， 接下来， 将恒温扩增反应的扩增产物 进行基于 PCR的扩增反应。 根据本发明的一些实施例， 第一扩增反应可以为选自包括 SDA、 MDA和 RCA的组的至少一种，第二扩增反应可以为选自包括 LA-PCR、 DOP-PCR、 PEP和 LA-PCR的组的至少一种。 根据本发明的具体实例， 首先进行 MDA, 接下来进 行 DOP-PCR, 即第一扩增反应是 MDA, 而第二扩增反应是 DOP-PCR。 根据本发明的 实施例， 第一扩增反应和第二扩增反应的进行时间并不受特别限制，根据本发明的实施 例， 第一扩增反应可以进行 15分钟 -2小时， 优选进行 1 -2小时。 由此， 可以进一步提 高对全基因组样本进行扩增的效率。
在本发明的第二方面， 本发明提出了一种用于对全基因组进行测序的方法。 参考图 2 , #居本发明的实施例， 该方法包括：
首先， 根据前面所述的方法， 对全基因组样本进行扩增样本进行扩增， 以便获得全 基因组扩增产物。根据本发明的实施例， 可以进一步包括从单细胞提取全基因组样本的 步骤， 以及任选地 包括从生物样本分离单细胞的步骤。 由此， 可以有效地从生物样本 分离的单细胞获得全基因组序列信息。根据本发明的实施例，从单细胞提取全基因组的 类型并不受特别限制。根据本发明的实施例， 可以作为全基因组样本来源的生物样本的 类型并不受特别限制。 根据本发明的具体实施例， 可以釆用的生物样本为选自血液、 尿 液、 唾液、 组织、 生殖细胞、 卵裂球和胚胎的至少一种。 由此， 可以方便地从生物体获 取这些样本， 并且能够具体地针对某些疾病釆取不同的样本， 从而针对某些特殊疾病釆取 特定的分析手段。 根据本发明的一个实施例， 从生物样本分离单细胞是通过选自稀释法、 口吸管分离法、 显微操作、 流式细胞分离术、 微流控法的至少一种进行的。 由此， 能够有 效便捷地获得生物样本的单细胞， 以便实施后续操作。 任选地， 根据本发明的实施例， 可 以进一步包括对所述单细胞进行裂解， 以便释放所述单细胞的全基因组的步骤。 根据本发 明的一些示例， 可以用于裂解单细胞并释放全基因组的方法不受特别限制， 只要能够将单 细胞裂解优选充分裂解即可。 根据本发明的具体示例， 可以利用碱性裂解液将所述单细胞 裂解并释放所述单细胞的全基因组。 发明人发现， 这样能够有效地裂解单细胞并释放出全 基因组， 并且所释放的全基因组在进行测序时， 能够提高准确率， 从而进一步提高了确定 单细胞染色体非整倍性的效率。
S300: 接下来， 在得到全基因组扩增产物之后， 针对所得到的全基因组扩增产物， 构建全基因组测序文库。
S400: 对所述全基因组测序文库进行测序。 由此， 能够有效地获取单细胞的全基因组 信息， 从而进一步提高了确定单细胞染色体非整倍性的效率。 根据本发明的实施例， 可以 利用选自 Illumina Hiseq2000、 ABI SOLiD、 Roche 454和单分子测序装置的至少一种对全基 因组测序文库进行测序。 本领域技术人员可以根据釆用的基因组测序技术的具体方案选择 不同的构建全基因组测序文库的方法， 关于构建全基因组测序文库的细节， 可以参见测序 仪器的厂商例如 Illumina公司所提供的规程， 例如参见 Illumina公司 Multiplexing Sample Preparation Guide ( Part#1005361; Feb 2010 )或 Paired-End SamplePrep Guide ( Part#1005063; Feb 2010 ), 通过参照将其并入本文。
根据本发明实施例的对全基因组进行测序的方法通过使用特定的扩增方法所得到 的扩增产物所得到的测序结果，可以有效地用于分析基因组中以染色体为单位的拷贝数 变异情况 (例如染色体添加、 缺失和转移）。 并且， 根据本发明的实施例的测序方法所得 到的测序结果， 可以用于在微量样品中同时完成多种异常状态的检测，诸如同时完成对 单核苷酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测，从而基因组的变异情况提供更全面的 信息。
因而， 在本发明的第三方面， 本发明提出了一种确定全基因组中是否存在异常状态的 方法。 根据本发明的实施例， 该方法包括：
根据前面所述用于对全基因组进行测序的方法， 对所述全基因组进行测序， 以便获得 测序数据； 以及 S500: 在得到测序数据后， 基于所述测序数据， 确定所述全基因组中是否存在异常状态。 根据本发明实施例的确定全基因组中是否存在异常状态的方法， 基于根据本发明实施例的 扩增方法所得到的可以真实反映全基因组状况的全基因组扩增产物， 能够有效地分析基因 组中以染色体为单位的拷贝数变异情况 (例如染色体添加、 缺失和转移）， 并且可以在微 量样品中同时完成多种异常状态的检测， 诸如同时完成对单核苷酸多态性 SNP与拷贝 数变异 CNV的检测，从而基因组的变异情况提供更全面的信息。根据本发明的实施例， 通过对测序数据进行分析， 而确定异常状态的方法， 并不受特别限制。 根据本发明的实 施例， 可以通过基于测序数据绘制基因组 Circos图， 从而确定基因组是否存在异常状 态。 根据本发明的实施例， 异常状态的类型并不受特别限制， 可以为选自 SNP和 CNV 的至少一种。 关于绘制基因组 Circos图的细节可以参见 Circos的官方网站教程 http://circos.ca/guide/genomic/, 使用 Circos作图分析基因组数据的方法被广泛釆用， 简 言之， 使用 Circos在 16 Jun 2011 更新的版本 νΟ.55-1 , 绘制基因组 Circos图简要步骤如 下：
1、 根据需要将基因组按照一定的大小 （在发明的实施例中使用 10K和 100K窗口）分 成 n个区域， 计算每个区域中想要计算的值（如： 基因组含量， 序列中 GC含量， 基因个数 等）， 生成 Circos所需的数据文件；
2、 根据需要， 配置 Circos的配置文件。 可以设置图形的颜色， 字体， 尺寸， 类型 （点 状图， 条形图， 曲线图， Heatmap等）， 输入的数据文件等；
3、 运行 Circos, 即可得到因组 Circos图。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种对全基因组样本进行扩增的装置。参考图 4 , 根据本发明的实施例， 该装置 1000包括第一扩增单元 100和第二扩增单元 200 , 其中， 第一扩增单元 100适于将全基因组样本进行第一扩增反应， 以便获得第一扩增产物； 第 二扩增单元 200与第一扩增单元 100相连，并且适于将所得到的第一扩增产物进行第二 扩增反应， 以便获得第二扩增产物， 其中， 第一扩增单元 100适于进行选自基于 PCR 的扩增反应和恒温扩增反应的一种， 第二扩增单元 200适于进行选自基于 PCR的扩增 反应和恒温扩增反应的另一种。根据本发明的实施例， 第一扩增单元 100适于进行恒温 扩增反应， 第二扩增单元 200适于进行基于 PCR的扩增反应。 根据本发明具体实施例， 第一扩增单元 100适于进行 MDA, 第二扩增单元 200适于进行 D0P-PCR。
由此， 利用根据本发明实施例的对全基因组样本进行扩增的装置 1000, 能够有效地 实施根据本发明实施例的对全基因组样本进行扩增的方法，从而能够在保障对基因组高 覆盖的前提下， 减少恒温扩增反应产生的嵌合体及减低扩增偏向性。 并且所得到的扩增 产物能够用于分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况 (例如染色体添加、 缺失 和转移）， 也可以用于在微量样品中同时完成多种异常状态的检测， 诸如同时完成对单 核苷酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测，从而基因组的变异情况提供更全面的信 息。本领域技术人员可以理解， 前面所描述的关于扩增方法的特征和优点也同样适用于 对全基因组样本进行扩增的装置 1000, 不再赘述。
在本发明的第五方面， 本发明提出了一种用于对全基因组进行测序的设备 10000。 根据本发明的实施例， 该设备 10000 包括： 全基因组扩增装置 1000、 测序文库构建装 置 300和测序装置 400。
根据本发明的实施例， 全基因组扩增装置 1000 为前面所述的对全基因组样本进行 扩增的装置。 根据本发明的实施例， 可以进一步包括单细胞分离单元和单细胞裂解单元， 其中， 单细胞分离单元用于从生物样本分离单细胞， 单细胞裂解单元用于接收分离的单细 胞并且裂解所述单细胞， 以便释放所述单细胞的全基因组。 根据本发明的具体实例， 单细 胞分离单元可以包括适于执行选自下列操作的至少一种的装置： 稀释法、 口吸管分离法、 显^:操作、 流式细胞分离术和^：流控法。
根据本发明的实施例， 测序文库构建装置 300与全基因组扩增装置 1000相连， 并 且适于针对全基因组扩增产物，构建全基因组测序文库； 测序装置 400适于对全基因组 测序文库进行测序。 根据本发明的实施例， 测序装置可以包括选自 Illumina Hiseq2000、 ABI SOLiD、 Roche 454和单分子测序装置的至少一种。
由此， 根据本发明实施例的用于对全基因组进行测序的设备， 能够有效地实施用于 对全基因组进行测序的方法，从而通过使用特定的扩增方法所得到的扩增产物所得到的 测序结果， 可以有效地用于分析基因组中以染色体为单位的拷贝数变异情况 (例如染色 体添加、 缺失和转移）。 并且所得到的测序结果， 可以用于在微量样品中同时完成多种 异常状态的检测， 诸如同时完成对单核苷酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测， 从 而基因组的变异情况提供更全面的信息。本领域技术人员可以理解， 前面对对全基因组 进行测序所描述的特征和优点， 也同样适用于对全基因组进行测序的设备， 不再赘述。
进一步， 在本发明的第六方面， 本发明提出了一种确定全基因组中是否存在异常状态的 系统 100000。根据本发明的实施例，该系统包括：全基因组测序设备 10000和分析设备 500。 根据本发明的实施例，全基因组测序设备 10000为前面所述用于对全基因组进行测序的设 备， 以便对所述全基因组进行测序， 并且获得测序数据。 根据本发明的实施例， 分析设备 500与全基因组测序设备 10000相连， 并且适于基于所得到的测序数据， 确定全基因组中是 否存在异常状态。 根据本发明的实施例， 分析设备 500 的类型并不受特别限制。 根据本发 明的具体实施例， 可以釆用适于基于测序数据绘制基因组 Circos图， 从而确定基因组是 否存在异常状态。
根据本发明的实施例的确定全基因组中是否存在异常状态的系统能够有效地实施确定 全基因组中是否存在异常状态的方法，从而能够有效地分析基因组中以染色体为单位的拷 贝数变异情况 (例如染色体添加、 缺失和转移）， 并且可以在微量样品中同时完成多种异 常状态的检测， 诸如同时完成对单核苷酸多态性 SNP与拷贝数变异 CNV的检测，从而 基因组的变异情况提供更全面的信息。 本领域技术人员， 可以理解， 前面针对确定全基 因组中是否存在异常状态的方法所描述的特征和优点仍适用于确定全基因组中是否存在异 常状态的系统， 不再赘述。
在本发明的第七方面， 本发明提出了一种用于扩增全基因组的试剂盒。 根据本发明 的实施例， 该包括： 第一试剂， 所述第一试剂用于进行基于 PCR的扩增反应和恒温扩增 反应的一种； 第二试剂， 所述第二试剂用于进行基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的 另一种， 其中， 所述第一试剂和所述第二试剂分别设置在不同的容器中。 利用根据本发明 的实施例的用于扩增全基因组的试剂盒， 能够有效地实施根据本发明实施例的对全基因组 样本进行扩增的方法， 从而实现对全基因组进行有效扩增。
需要说明的是， 根据本发明实施例的对全基因组扩增的方法是本申请的发明人经过艰 苦的创造性劳动和优化工作才完成的。 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。 本领域技术人员将会理解， 下面的实施 例仅用于说明本发明， 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件的， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考 J.萨姆布鲁克等著， 黄培堂等译的《分 子克隆实验指南》， 第三版， 科学出版社）或者按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注 明生产厂商者， 均为可以通过市购获得的常规产品， 例如可以釆购自 Illumina公司。
实施例 1:
1.1单细胞全基因组测序测试
使用已于 2008 年发布的第一个亚洲人序列的供体 "炎黄"， 一位亚洲健康男性供体中 的淋巴细胞系作为单细胞釆集材料。 首先， 向长势良好的淋巴细胞培养基中加入适量胰酶 消化贴壁细胞， 之后通过添加培养基来终止消化反应， 并收集含有所需的淋巴细胞的培养 基。 通过高速离心与去除上清液的去杂质方法， 以 PBS溶液冲洗含有细胞的培养基， 最后 以适量 PBS溶液重悬细胞。 将所得到的细胞悬液转移到培养亚上， 在倒置显 镜下利用口 吸管进行细胞分离操作。 将分离后的细胞按照表 1所示的扩增方法进行处理。
YH淋巴单细胞的样品名称及具体处理方法
Figure imgf000014_0001
具体地 DOP-PCR反应过程包括： 釆集细胞后， 加入已添加蛋白酶 K成分的裂解和片段 化緩冲液， 使细胞裂解并释放出基因组， 基因组进而被打断成核酸片段。 随后加入单细胞 文库预备緩冲液、 文库稳定溶液和相应的生物酶（均来自试剂盒： GenomePlex® Single Cell Whole Genome Amplification Kit ), 分别在 16°C、 24°C和 37°C中恒温孵育 20分钟， 最终以 75 °C5分钟结束反应，。将所得到的扩增反应产物加入扩增混合液及全基因组扩增 DNA聚合 醉 (均来自试剂盒： Sigma公司的 GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit )后， 以 PCR反应： 95 °C3分钟， 25个循环的 94°C30秒和 65 °C 5分钟扩增 DNA。 反应 完成后 DNA产物可直接用于下游应用或保存在 -20 °C中。
另外，若釆用 MDA进行全基因组扩增，则使用 Qiagen公司的 REPLI-g Mini Kit来实现， 简言之： 先使用含有氢氧化钾的碱性裂解液（ALB )对细胞进行裂解， 随后用 DLB緩冲液 (来自试剂盒： REPLI-g Mini Kit )配制核酸变性緩冲液， 加入样品中常温变性 3分钟后加入 中和緩冲液终止变性反应。 配制含有 Phi 29聚合酶的扩增反应緩冲液加到样品中后， 以 30 °C恒温孵育 16小时， 最后 65 °C lOmin使聚合酶失活终止反应。 反应完成后 DNA产物可直 接用于下游应用或保存在 -20 °C中。 接下来， 将按照不同的扩增方法处理后所得的基因组产 物，根据 Illumina Hiseq2000平台制造商所提供的的短插入片段文库构建方法构建测序文库。 简言之， 包括：
使用 Covaris超声波打断仪将 DNA产物打断到目的插入片段， 随后进行末端修复、 末 端加上 A碱基， 连接 Illumina测序平台的 Pair-end标准通用 flowcell接头。 连上接头的产 物以加上 Index标签的引物进行 10个循环的扩增。 在对产物凝胶电泳并切胶纯化后， 根据 文库浓度对产物进行富集，使多个测试文库能够在同一张 flowcell上的同一 lane上实现测序 反应， 在数据产生之后再根据各自所添加的标签（Index ) 加以区分， 从而得到各个样品的 测序数据。
在获得测序数据之后， 将原始的下机数据 fastq.文件通过初步处理， 在去除污染数据、 低质量数据和 adaptor后， 输入 SOAP软件进行序列组装， 即可得出样品基因组的测序深度 和覆盖度情况， 结果示于表 2中。
表 2 YH淋巴单细胞使用 DOP-PCR和 MDA的测试数据
Figure imgf000015_0001
在本文中所使用的术语 "所覆盖区域" 代表测序数据在大于或等于一条过滤后的测序 序列覆盖到的基因组区域的深度值； 术语 "全基因组的平均深度" 表示将比对上基因组的 序列 （不一定能够覆盖到该物种全体的基因组区域） 除以整个物种基因组大小的比值； 术 语 "覆盖率" 表示大于或等于一条过滤后的测序序列覆盖到的基因组区域所占全基因组的 比率； "深度中位值" 表示将所有的 reads按照深度由高到低排序， 取排在序列中间的 read 的深度。
从表 2可看出， 利用 MDA结合 DOP-PCR对 YH淋巴单细胞全基因组进行扩增 （样品 MDA1-DOP-2.2和 MDA2-DOP-2.3 ), 全基因组平均深度及覆盖率测试数值明显高于单独利 用 DOP-PCR (样品 DOP-2.1 )或 MDA (样品 MDA16-2.4 )进行基因组扩增所获得的数值。
1.2单细胞水平上全基因组的多重置换扩增与兼并寡核苷酸引物 PCR扩增效果比较 如 1.1部分所述， 研究人员对来自 YH淋巴细胞系的单个淋巴细胞分别使用了多重置换 扩增（MDA )和简并寡核苷酸引物 PCR ( DOP-PCR )的全基因组扩增方法。 以 PE100的文 库测序 0. IX的数据量， 得出基本数据如下：
表 3 单细胞 MDA和 DOP-PCR扩增效果比较
Figure imgf000015_0002
覆盖率 0.67% 12.44% 深度中位值 1 1
由此可见， MDA方法在基因组覆盖度上有明显的优势， DOP-PCR丢失了很大一部分的 基因组信息。另外，发现 MD A会存在随机 I物间的非特异扩增和嵌合体的形成。而 DOP-PCR 则存在基因组覆盖度不足和扩增产物长度偏短等缺点。 实施例 2: 降低扩增偏向性的全基因组扩增方法
为了降低由 MDA带入的扩增偏向性， 发明人首先进行了减少 MDA的反应时间。 普通 的 MDA反应时间为 16小时， 通常 MDA反应时间共作 4个梯度， 分别为 2小时、 4小时、 8小时和 16小时。 发明人釆用 YH淋巴细胞系细胞挑取单细胞后按照上述的 MDA反应时 间分别进行扩增， 并构建全基因组双末端文库进行测序。 得到的细胞基因组 Circos 图示于 图 7。 如图 7所示， 该 Circos图共有 5圏， 其中最外圏为染色体核型信息， 从外到内分别是 扩增时间为 2、 4、 8、 16小时的 MDA反应后 YH淋巴单细胞的基因组扩增情况， 从图 7中 可以看出， 随着 MDA扩增时间的增加， 基因组扩增的覆盖度差异会逐渐增大。
发明人发现， 扩增差异的出现是由于 MD A的扩增特性造成的。 反应液中的随机引物随 机地结合到模板链上， 在等位基因上及不同基因组位置上结合的引物数量不一定相等， 在 长时间的扩增后会逐渐加大扩增产物的数量差异。 同时，基因组序列中 GC含量的差异也会 对随机引物与模板的结合造成一定的影响。
接下来，发明人在 YH淋巴单细胞上分别进行了 DOP-PCR、 MDA和 DOP-MDA相结合 的扩增方法， 并检测扩增偏差性是否降低。 其中， 测试 MDA与 DOP-PCR两种扩增方法相 结合对扩增偏向性的影响得到的细胞基因组 Circos图示于图 8。 如图 8所示， Circos中从外 到内分别表示 YH淋巴单细胞釆用 DOP-PCR、 进行 MDA—' j、时后进行 DOP-PCR、 进行 MDA两小时后 DOP-PCR, 16小时的 MDA, 共四种扩增方案扩增得到的样品基因组覆盖情 况。 可见在 16小时 MDA的圏上， 位点间的扩增倍数差异比较大。 DOP-PCR由于扩增方法 特异的原因， 复制的序列只富集在少数的区域中， 并导致区域的覆盖度迅速升高， 与相邻 的区域相比造成较大的差异。 中间两圏显示在 MDA进行一段时间后加入 DOP-PCR, 能够 在保证覆盖度的情况下减少序列的扩增偏向性，有助于单细胞 CNV的分析，后续将对 MDA 与 DOP-PCR相结合的扩增方法详细研究。 实施例 3: 使用 21三体综合征患者体细胞验证新的降低扩增偏向性方法 为了证明 MDA和 DOP-PCR结合的方法能够检出基因组中大范围的 CNV,研究人员釆 集了来自一位 21三体综合征供体的外周血淋巴细胞进行单细胞的扩增测试。 首先对釆集来 自 T21和 YH供体的单个淋巴细胞进行全基因组扩增， 并根据前面所描述的方法， 得到各 样品的基因组 Circos, 示于图 9。 如图 9所示， Circos图从外到内分别表示 T21淋巴细胞 16 小时 MDA、 T21淋巴细胞 MDA 30分钟后取出一半体积产物再进行 16小时 MDA、 YH淋 巴细胞 16小时 MDA。 由图 9可见， 若对两种淋巴细胞仅仅釆用 MDA扩增手段， 由于存在 十分明显的扩增偏向性， 会导致无法从单个细胞的水平上分辨出大范围 CNV, 即无法在两 种细胞的 21号染色体上发现明显的基因组倍数的差异。
随后， 为了降低全基因组扩增的偏向性， 发明人设置在不同时长 MDA反应之后引入了 DOP-PCR反应的实验设计， 对来自 T21的淋巴单细胞再一次进行全基因组扩增， 得到各样 品的基因组 Circos, 示于图 10。 如图 10所示， Circos图从外到内分别表示 1. DOP-PCR扩 增； 2. 16小时 MDA扩增； 3. MDA15分钟后加 DOP-PCR扩增； 4. MDA30分钟后加 DOP-PCR 扩增； 5. MDA30分钟后取出一半体积产物再进行 16小时 MDA扩增； 6. MDA60分钟后加 DOP-PCR扩增； 7. MDA30分钟后取出一半体积产物再进行 DOP-PCR扩增。 如图 10所示， 对于 T21淋巴单细胞扩增，在不同时长的 MDA后加入 DOP-PCR扩增都能发现在基因组的 21号染色体位置的基线有上抬，即表明比对上 21号染色体位置的基因组序列比相邻的染色 体都要多。 其中最明显的是： 3. MDA15 分钟后加 DOP-PCR扩增； 4. MDA30 分钟后加 DOP-PCR扩增； 6. MDA60分钟后加 DOP-PCR扩增和 Ί. MDA30分钟后取出一半体积产 物再进行 DOP-PCR扩增。 图 11是图 10的局部放大图， 即 T21细胞使用 MDA反应后加上 DOP-PCR反应， 基因组 Circos局部图。 由图 11可以看出， MD A加上 DOP-PCR在降低扩 增偏向性上的优势。
由此， 使用两种目前被广泛釆用的全基因组扩增方法相结合的方法， 能够明显观察到 21号染色体上的基因组含量较其他染色体的高，能够真实反映 T21患者在 21号染色体上比 健康对照多出额外一条染色体。
在上述实施例中， 首先使用来自首个亚洲人基因组序列供体的淋巴细胞系，对 MDA和
DOP-PCR这两种全基因组扩增方法进行了探讨， 证明了本发明的扩增方法可以减少扩增偏 向性。 随后， 使用来自一例 21三体女性病人的外周血， 在加入红细胞裂解液裂解并去除无 细胞核的红细胞后， 将收集到的淋巴细胞通过口吸管操作进行单个细胞的分选， 再对釆集 的单个淋巴细胞进行 DOP-PCR、 MDA和两者相结合的全基因组扩增。 扩增产物随后通过 第二代测序技术对全基因组序列进行测序， 统计序列在基因组染色体上的分布情况， 从单 个细胞的水平上判断区分出 21三体病人与健康个体基因组的区别。 从而证明了本发明的全 基因组扩增方法能够减少扩增偏向性。 从而上述实施例证明了只需获取少量的样品即可完 成基因组中大范围染色体添加、 缺失和转移的检测， 为临床诊疗判断提供基因组层面上的 依据； 另一方面能够实现在微量样品上同时实现 SNP与 CNV情况的探测，为研究诸如肿瘤 细胞等基因组的变异情况提供更全面的信息。 综上， 在 MDA反应中加入 DOP-PCR的全新 全基因组扩增方法， 一方面利用 MDA弥补 DOP-PCR在基因组扩增覆盖度和产物长度上的 不足； 另一方面利用 DOP-PCR的线性扩增减少 MDA中的非特异性扩增和扩增偏向性， 使 新扩增方法能够以单个细胞的水平检查出基因组中染色体个数上的增多或缺失， 为在全基 因组扩增中减少扩增偏向性提供了新的思路。 工业实用性
本发明的对全基因组样本进行扩增的方法、 对全基因组进行测序的方法、 确定全基 因组中是否存在异常状态的方法、 对全基因组样本进行扩增的装置、 对全基因组进行测 序的设备以及确定全基因组中是否存在异常状态的系统，能够有效地对全基因组进行扩增、 测序及分析， 并且能够减少扩增偏好性。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述， 本领域技术人员将会理解。 根据已 经公开的所有教导， 可以对那些细节进行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范 围之内。 本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
在本说明书的描述中， 参考术语 "一个实施例"、 "一些实施例"、 "示意性实施例"、 "示 例"、 "具体示例"、 或 "一些示例" 等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、 结 构、 材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。 在本说明书中， 对上述术语 的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。 而且， 描述的具体特征、 结构、 材料或 者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

Claims

权利要求书
1、 一种对全基因组样本进行扩增的方法， 其特征在于， 包括：
将所述全基因组样本进行第一扩增反应， 以便获得第一扩增产物；
将所述第一扩增产物进行第二扩增反应， 以便获得第二扩增产物，
其巾，
所述第一扩增反应是基于 PCR 的扩增反应和恒温扩增反应的一种， 所述第二扩增 反应是基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的另一种。
2、 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于， 所述全基因组样本为来自单细胞的 全基因组样本。
3、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述第一扩增反应是恒温扩增反应， 所述第二扩增反应是基于 PCR的扩增反应， 所述第一扩增反应为选自包括 SDA、 MDA 和 RCA的组的至少一种， 所述第二扩增反应为选自包括 LA-PCR、 DOP-PCR、 PEP和 LA-PCR的组的至少一种。
4、 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于， 所述第一扩增反应是 MDA, 所述第 二扩增反应是 DOP-PCR。
5、 根据权利要求 4所述的方法， 其特征在于， 所述第一扩增反应进行 15分钟 -2小 时。
6、 一种用于对全基因组进行测序的方法， 其特征在于， 包括：
根据权利要求 1-5任一项所述的方法， 对全基因组样本进行扩增， 以便获得全基因 组扩增产物；
针对所述全基因组扩增产物， 构建全基因组测序文库； 以及
对所述全基因组测序文库进行测序。
7、 根据权利要求 6 所述的方法， 其特征在于， 进一步包括从单细胞提取全基因组 样本的步骤。
8、 根据权利要求 7 所述的方法， 其特征在于， 从单细胞提取全基因组样本进一步 包括从生物样本分离单细胞的步骤。
9、 根据权利要求 8 所述的方法， 其特征在于， 所述生物样本为选自血液、 尿液、 唾液、 组织、 生殖细胞、 卵裂球和胚胎的至少一种。
10、 根据权利要求 8所述的方法， 其特征在于， 从生物样本分离单细胞是通过选自 稀释法、 口吸管分离法、 显微操作、 流式细胞分离术、 微流控法的至少一种进行的。
11、 根据权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 利用选自 Illumina Hiseq2000、 ABI SOLiD、 Roche 454、 和单分子测序装置的至少一种对所述全基因组测序文库进行测序。
12、 根据权利要求 6所述的方法， 其特征在于， 利用 Illumina Hiseq2000所述全基因组 测序文库进行测序。
13、 一种确定全基因组中是否存在异常状态的方法， 其特征在于， 包括：
根据权利要求 6-12任一项所述的方法， 对所述全基因组进行测序， 以便获得测序数据； 以及
基于所述测序数据， 确定所述全基因组中是否存在异常状态。
14、 根据权利要求 13所述的方法， 其特征在于， 所述异常状态为选自 SNP和 CNV的 至少一种。
15、 一种对全基因组样本进行扩增的装置， 其特征在于， 包括：
第一扩增单元， 所述第一扩增单元适于将所述全基因组样本进行第一扩增反应， 以 便获得第一扩增产物；
第二扩增单元， 所述第二扩增单元与所述第一扩增单元相连， 并且适于将所述第一 扩增产物进行第二扩增反应， 以便获得第二扩增产物，
其巾，
所述第一扩增单元适于进行基于 PCR 的扩增反应和恒温扩增反应的一种， 所述第 二扩增单元适于进行基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的另一种。
16、 根据权利要求 15 所述的装置， 其特征在于， 所述第一扩增单元适于进行恒温 扩增反应， 所述第二扩增单元适于进行基于 PCR的扩增反应。
17、根据权利要求 16所述的装置， 其特征在于， 所述第一扩增单元适于进行 MDA, 所述第二扩增单元适于进行 DOP-PCR。
18、 一种用于对全基因组进行测序的设备， 其特征在于， 包括：
全基因组扩增装置， 所述全基因组扩增装置为权利要求 15-17任一项所述的装置； 测序文库构建装置， 所述测序文库构建装置与所述全基因组扩增装置相连， 并且适 于针对所述全基因组扩增产物， 构建全基因组测序文库； 以及
测序装置， 所述测序装置适于对所述全基因组测序文库进行测序。
19、 根据权利要求 18所述的设备， 其特征在于， 进一步包括：
单细胞分离单元， 所述单细胞分离单元用于从生物样本分离单细胞； 以及 单细胞裂解单元， 所述单细胞裂解单元用于接收分离的单细胞并且裂解所述单细胞， 以 便释放所述单细胞的全基因组。
20、 根据权利要求 19所述的设备， 其特征在于， 所述单细胞分离单元包括适于执行 选自下列操作的至少一种的装置： 稀释法、 口吸管分离法、 显^:操作、 流式细胞分离术和 微流控法。
21、 根据权利要求 18 所述的设备， 其特征在于， 所述测序装置包括选自 Illumina Hiseq2000、 ABI SOLiD、 Roche 454和单分子测序装置的至少一种。
22、 根据权利要求 18所述的设备， 其特征在于， 所述测序装置为 Illumina Hiseq2000。
23、 一种确定全基因组中是否存在异常状态的系统， 其特征在于， 包括：
全基因组测序设备， 所述全基因组测序设备为权利要求 18-22任一项所述的设备， 用于 对所述全基因组进行测序， 以便获得测序数据； 以及
分析设备， 所述分析设备与所述全基因组测序设备相连， 并且适于基于所述测序数据， 确定所述全基因组中是否存在异常状态。
24、 一种用于扩增全基因组的试剂盒， 其特征在于， 包括：
第一试剂， 所述第一试剂用于进行基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的一种； 第二试剂， 所述第二试剂用于进行基于 PCR的扩增反应和恒温扩增反应的另一种， 其巾，
所述第一试剂和所述第二试剂分别设置在不同的容器中。
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