WO2013100721A1 - 라이신 및 트립토판 잔기가 ４번 반복된 신규한 항균 및 항진균 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

라이신 및 트립토판 잔기가 ４번 반복된 신규한 항균 및 항진균 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a novel antibiotic peptide, in which lysine and tryptophan residues are repeated four times, and an antimicrobial and antifungal pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient.
  • Bacterial infections are one of the most common and fatal causes of human disease. Unfortunately, the abuse of antibiotics has resulted in antibiotic resistance of bacteria. Indeed, the rate at which bacteria are resistant to new antibiotics occurs much faster than the rate at which new antibiotic analogs are developed. . For example, enterococcus faecalis can threaten life? e «3 ⁇ 43 ⁇ 4 s Bacterial species such as Mycobacterium-to M. tuberculosis (yco /? Ac er / iffl tuberculosis) and Pseudomonas her rugi Labor (fte / c cwas 1 aeruginosa) have raised resistance to all antibiotics known so far (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).
  • the first is the phenotypic resistance that occurs when the growth rate decreases in all bacteria (Tuomanen E., Revs. Infect. Dis., 3, S279). S291, 1986), the second is genetic resistance by mutations in certain bacteria.
  • the basic phenomenon is that down regulation occurs, which decreases the activity of the autolysine enzyme, which is transient when it is externally resistant to external stimuli, Persistent cases of genetic resistance with mutations that cause changes.
  • the simplest case of genetic resistance is due to a deficiency of the autolysine enzyme, which has not been clinically found to be resistant to the deficiency of this autolytic enzyme for a variety of unclear reasons. Found in Tolerance consists of a process that modulates the activity of the autolysine enzyme (Tuomanen et al., J. infect. Dis., 158, 36-43, 1988).
  • bacteria can kill neighboring bacteria by synthesizing peptides or bacteriocin peptides or small organic molecules. These bacteria are classified into three types according to their structural characteristics. The first is lantibiotics, the second is nonlantibiotics and the third is secreted by signal peptides (Cintas et al., J. Bad., 180, 1988-1994, 1998). Animals, including insects, can also produce peptide antibiotics themselves (Bevins et al., Ann. Rev. Biochem., 59, 395-414, 1990), which can be divided into three groups according to structure.
  • the first is a cysteine-rich ⁇ -sheet peptide
  • the second is a c (helical amphiphilic peptide molecule
  • the third is a proline-rich peptide.
  • antimicrobial peptides have various structures depending on the amino acid sequence, the most common of which is the antimicrobial peptide found in the Like cecropin, it is free of cysteine residues and forms an amphiphilic alpha helix.
  • cecropin A, CA has high antimicrobial activity but low antifungal and anticancer activity (Boman, HG and Hultmark, D., Annu. Rev. Microbiol., 41: 103, 1987).
  • the present inventors synthesized peptides having various lengths by repeating lysine and tryptophan residues 2 to 5 times, of which SEQ ID NO: (KW) 4 has excellent antibacterial activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and antibiotic-resistant strains, and has excellent antifungal activity against pathogenic fungi and antibiotic-resistant fungi by affecting the inner membrane of harmful microorganisms. Since it does not appear, the present invention was completed by confirming the functions as a safe antibacterial and antifungal agent to the human body.
  • the present inventors found antimicrobial activity against (KW) 3 in which lysine and tryptophan residues were repeated three times (Gopal R, Kim YJ, Seo CH, Hahm KS, Park Y., J Pept Sc 2011; 17: 329-). 334), (KW) 4 of the present invention showed a very high antibacterial activity of up to 16 times in the general strain, up to 8 times in the antibiotic resistance strain, and also excellent antifungal activity than (KW) 3 . Thus, (KW) 4 was found to be a peptide with much better antibacterial and antifungal activity than (KW) 3 .
  • Still another object of the present invention is to provide an antimicrobial and antifungal composition using the antimicrobial and antifungal peptides.
  • the present invention provides an antibacterial or antifungal template of lysine and tryptophan residues repeated four times.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for antimicrobial or antifungal containing the tempide as an active ingredient.
  • the present invention provides a cosmetic composition for the antimicrobial or antifungal composition containing the template as an active ingredient.
  • the present invention is a non-toxic pesticide containing the tempide as an active ingredient to provide.
  • the present invention also provides a preservative for preserving medicines, cosmetics, food or feed containing the peptide as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for inhibiting bacteria or fungi comprising the step of treating the pharmaceutical composition in an effective amount of the antimicrobial or antifungal pharmaceutical composition for pathogenic bacteria or fungi.
  • the present invention also provides a method for treating a disease caused by a pathogenic bacterium or fungus, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical composition for an antifungal or antifungal agent to a subject having a disease caused by a pathogenic bacterium or a fungus. do.
  • the present invention also provides a method for preventing a disease due to pathogenic bacteria or fungi, comprising administering to the individual a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical composition for antibacterial or antifungal.
  • the present invention provides a use of the peptide in the manufacture of a pharmaceutical composition for antibacterial or antifungal.
  • the present invention provides a use of the 3 ⁇ 4 Tide in the production of a cosmetic composition for antibacterial or antifungal.
  • the present invention also provides a use of the peptide in the manufacture of nontoxic pesticides.
  • the present invention provides a use of the peptide in the manufacture of a preservative for preserving medicines, cosmetics, food or feed.
  • the present invention also provides the peptides used for the inhibition of pathogenic bacteria or fungi.
  • the present invention provides the peptide used for the treatment or prevention of diseases caused by pathogenic bacteria or fungi.
  • Antimicrobial and antifungal peptides having four repeats of lysine and tryptophan residues of the present invention have excellent antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and antibiotic-resistant strains by affecting the inner membrane of harmful microorganisms.
  • antifungal activity almost no cytotoxicity, it can be usefully used as pharmaceutical compositions, cosmetic compositions, pesticides, food preservatives, cosmetic preservatives and pharmaceutical preservatives using the same.
  • 1 is a diagram showing the peptide and sequence used in the present invention.
  • a and B of Figure 2 is a graph measuring the maximum fluorescence emission wavelength of tryptophan residues in peptides for analysis of the concentration according to the concentration of the peptide of the present invention in water and phosphate buffered solution, C and D in phosphate buffered solution For the secondary structure analysis of the peptide is a graph confirmed by using circular dichroism spectroscopy (CD).
  • CD circular dichroism spectroscopy
  • Figure 3 is a diagram showing the location of the peptide by treating the bacteria after labeling the peptide of the present invention with fluorescent material to be.
  • FIG. 4 shows the effect and concentration of the peptide of the present invention on the bacterial membrane. It is a graph analyzing the sterilization time.
  • 5 is a graph confirming the degree of release and fluorescence of the fluorescent material to determine whether the peptide of the present invention acts on bacteria-like double membrane.
  • Figure 6 shows the peptide of the present invention in the presence of bacteria-like double membrane This is a graph confirmed by using circular dichroism (CD) for the secondary structure analysis of.
  • Figure 7 is an antibiotic resistant E. coli 0? coli CCARM 1229) shows the activity of the electron micrograph.
  • the present invention provides antimicrobial and antifungal peptides in which lysine (Lys) and tryptophan residues are repeated four times.
  • the peptide is specifically composed of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, shows little cytotoxicity and is composed of a minimum amino acid size of 8-mer Oner), which is short in length and is easy to synthesize, and the hydrophobic region is increased so that the affinity is increased. It is not limited to, but having.
  • the peptide specifically has antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and antibiotic-resistant bacteria
  • the Gram-positive bacteria are Bacillus subtilis (fec // s subtilis), Staphylococcus aureus. Urea aureus) and Listeria monocytogenes (/ s er / a monocytogenes)
  • the Gram-negative bacteria are ⁇ fl (Escherichia coli), Pseudomonas aeruginosa (/ seflbffo as aeruginosa) and Salmonella typhimurium typhi ⁇ rium ⁇ and any of the antibiotic resistant strains are E. coli (Coli CCARM 1229, 1238), Salmonella (5.
  • CCARM 8007, 8009, 8013 Staphylococcus (5. aureus CCARM . 3089, 3090, 3108, 3114, 3126) having antimicrobial activity against any one selected from the group consisting of, but not limited to All.
  • the peptide specifically has antifungal activity against pathogenic fungi and antibiotic resistant fungi, and more specifically the pathogenic fungi are Candida albicans albicans, Candida catenate (C. catenulate, C. inter idia, C. rugosa, C. glabrata and C. mel ibiosica
  • Candida albicans albicans CCARM 14001, 14007, 14020 have antifungal activity, but is not limited thereto.
  • the peptide is specifically antibiotic resistant E. coli 0 ?. coli CCARM 1229) and antibiotic resistant Staphylococcus aureus (5. aureus CCARM 3090), which acts by binding to the outside of the bacteria, and when treated with antibiotic-resistant E. coli (coli CCARM 1229) It is not limited to roughening and damaging the surface of the film, causing a bulge phenomenon.
  • MIC Minimum Inhibitory Concentration
  • Gram-positive bacteria used at this time were Bacillus subtilis (fec /// i / s subtil is), Staphylococcus aureus (S ⁇ oAr ⁇ ocras aureus), and Listeria monocytogenes (/ sier / a monocytogenes A).
  • Gram-negative bacteria are Escherichia coli 03 ⁇ 4c? Er / c? / A coli), Pseudomonas aeruginosa (/ 3 ⁇ 4eo «as aeruginosa) and Salmonella typhimurium
  • Antibiotic resistant strains are E. coli (£. Coli CCARM 1229, 1238), Salmonella (5. typhimuriiun CCARM 8007, 8009, 8013) and Staphylococcus (5. aureus CCARM 3089, 3090, 3108, 3114, 3126).
  • the SEQ ID NO: 3 peptide of the present invention in the general strain showed up to 64 times higher than the SEQ ID NO: 1 peptide of the control group 16 times than SEQ ID NO: 2, 8 times higher than SEQ ID NO: 4, resistant strains
  • the highest antimicrobial activity was up to 32 times, 8 times, and 8 times higher (see Table 1). Therefore, it was confirmed that the peptide of the present invention showed excellent antimicrobial activity in both Gram-positive bacteria / negative bacteria and antibiotic resistant strains.
  • the present inventors in order to measure the antifungal activity of the peptide of the present invention, pathogenic fungi Candida albicans (Ca / Wa albicans), Candida catenulate (C. catenulate), Candida intermedia (C. interim ' dl a ), C. rugosa, Candida glabrata and Candida melibiosica ((..
  • the inventors of the present invention in order to confirm whether the peptide of the present invention exhibits cytotoxicity, it was found that the SEQ ID NO: 3 peptide of the present invention shows little cytotoxicity (see Table 4). ).
  • SEQ ID NO: 3 peptide is water
  • SEQ ID NO: 4 Rap Tide was confirmed that the phenomenon occurs in the phosphate aqueous solution (see Fig. 2).
  • the present inventors confirmed by confocal laser scanning microscopy to confirm the position of the peptide of the present invention to which part of the E. coli, SEQ ID NO: 3 peptide is antibiotic resistant E. coli 05 CO / / CCARM 1229) and antibiotic resistant Staphylococcus aureus (5. aureus CCARM 3090) was confirmed to bind to the outside (see Figure 3).
  • the inventors of the present invention in order to determine whether the peptide of the present invention actually acts on the E. coli membrane, and how quickly it acts on the killing of bacteria by the peptide, analysis of degree of depolarization, confirmation of the action on the intracellular membrane, and measurement of cell death over time was done.
  • the SEQ ID No. 1 peptide did not depolarize the antibiotic resistant Escherichia coli (coli CCARM 1229) and the antibiotic resistance Staphylococcus aureus (5. aureus CCARM 3090), and the SEQ ID No. 2 peptide was about 2 at 50 ⁇ .
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 Compared to the depolarization of the peptides SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 it was confirmed that the depolarization of about 80% of both bacteria at 25 ⁇ M (see Fig. 4A and ⁇ ).
  • SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 peptides were confirmed to affect E. coli (£ ⁇ coli) and Staphylococcus aureus (5. aureus) intima (see Fig. 4 C and D), sequence It was confirmed that the No. 3 peptide showed faster activity in the antibiotic resistant Escherichia coli (.coli CCARM 1229) and the antibiotic resistant Staphylococcus aureus S. ai / r «; sCCARM3090) compared to the SEQ ID NO: 4 peptide (Fig. E and F of 4).
  • the present inventors using a spectrofluorometer to determine whether the peptide of the present invention actually acts on bacteria and erythrocyte-like liposomes, and magnifies bacteria-like liposomes, SEQ ID NO: 3 peptide And both SEQ ID NO: 4 peptides
  • P-G La-phosphatidylglycerol
  • the inventors of the present invention using the polar dichroism spectroscopy (circular dichroism, CD) in order to determine how the structure of the peptide of the present invention differs in bacteria and erythrocyte-like liposome components, bacteria and erythrocytes- In the similar liposome components, the SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 peptides did not form any structure, whereas the SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 peptides were confirmed to have changed in structure by folding (see FIG. 6). In particular, such a phenomenon is an important factor when destroying the bacterial membrane.
  • CD polar dichroism spectroscopy
  • the inventors of the present invention using a scanning electron micrograph (scanning electron micrograph) in order to determine how the peptide of the present invention acts on antibiotic-resistant E. coli (col / CCARM 1229), SEQ ID NO: 3
  • scanning electron micrograph scanning electron micrograph
  • the lysine and tryptophan peptides of the present invention are repeated 4 times, showing excellent antibacterial and antifungal activity by affecting the inner membrane of harmful microorganisms, and having little cytotoxicity, and thus can be usefully used as a safe antibacterial agent to the human body.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for antibacterial and antifungal containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention is the 3 ⁇ 4 tide of the antimicrobial or antifungal pharmaceutical composition It provides a use for manufacturing.
  • the present invention also provides the peptide used for the inhibition of pathogenic bacteria or fungi.
  • the present invention provides a method for inhibiting bacteria or fungi comprising the step of treating the pharmaceutical composition in an effective amount of the antimicrobial or antifungal pharmaceutical composition for pathogenic bacteria or fungi.
  • the pharmaceutical composition specifically has antimicrobial activity against Gram-positive bacteria, Gram-negative bacteria and antibiotic resistant strains, and more specifically, the Gram-positive bacteria are Bacillus subtilis (fec77 / "s subtills), Staphylococcus aureus. (5? A ococ «/ s aureus) and Listeria monocytogenes a / se / a monocytogenes), wherein the Gram-negative bacteria are Escherichia coli G3 ⁇ 4c? E / c /?
  • E. coli Cold CCARM 1229, 1238
  • Salmonella Salmonella
  • Staphylococcus 5. aureus CCARM 3089, 3090, 3108, 3114, 3126
  • E. coli Cold CCARM 1229, 1238
  • Salmonella Salmonella
  • Staphylococcus 5. aureus CCARM 3089, 3090, 3108, 3114, 3126
  • the pharmaceutical composition is specifically to have antifungal activity against pathogenic fungi and antibiotic resistant bears, more specifically the pathogenic fungi are Candida albicans ( ⁇ / 3 ⁇ 4 // a3 ⁇ 4 albicans), Candida catenate ( ⁇ Catenulate, C. intermidia, Candida lugosa, C. glabrata, and C. mel ibiosica — selected from the group consisting of: Any one of the above and the antibiotic-resistant bearish antler has antifungal activity against Candida albicans (C. albicans CCm 14001, 14007, 14020), but is not limited thereto.
  • Candida albicans ⁇ / 3 ⁇ 4 // a3 ⁇ 4 albicans
  • Candida catenate ⁇ Catenulate, C. intermidia, Candida lugosa, C. glabrata, and C. mel ibiosica — selected from the group consisting of: Any one of the above and the antibiotic-resistant bearish antler has antifungal activity against Candida albican
  • Peptides repeated 4 times lysine and tryptophan of the present invention is harmful It not only shows excellent antibacterial and antifungal activity through affecting the inner membrane of the microorganism but also has little cytotoxicity, so it can be usefully used as a pharmaceutical composition for antibacterial and antifungal.
  • the novel peptides of the present invention can be administered parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical formulations.
  • the novel peptides of the present invention can be administered in various parenteral formulations, and when formulated, diluents or excipients such as conventional stratifiers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. may be used. It is prepared.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • the non-aqueous solvent and the suspending solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as eurib oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, uriringe glycerogelatin and the like can be used.
  • novel peptides of the present invention can be used in combination with a variety of carriers accepted as pharmaceuticals, such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran to increase stability or absorption.
  • carriers accepted as pharmaceuticals such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran to increase stability or absorption.
  • Antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, small molecule proteins or other stabilizers can be used as medicaments.
  • the effective dose of the novel peptide of the present invention is 0.01 to 100 mg / kg, preferably 0.1 to 10 mg / kg, and may be administered once to three times a day.
  • the present invention also provides a method for treating a disease caused by a pathogenic bacterium or fungus, comprising administering a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical composition for an antifungal or antifungal agent to a subject having a disease caused by a pathogenic bacterium or a fungus. to provide.
  • the present invention also provides a method for preventing a disease due to pathogenic bacteria or fungi, comprising administering to the individual a pharmaceutically effective amount of the pharmaceutical composition for antibacterial or antifungal.
  • the present invention also provides the peptides used for the treatment or prevention of diseases caused by pathogenic bacteria or fungi.
  • the total effective amount of the novel peptides of the present invention may be administered to the patient in a single dose, such as in the form of bolus or by infusion for a relatively short period of time.
  • the iple does may be administered by a long-term fractional treatment protocol. Since the concentration is determined in consideration of various factors such as the age and health status of the patient as well as the route and frequency of treatment of the drug, in view of this point, the present invention can be used by those skilled in the art. Appropriate effective dosages for the particular use of the novel peptides as pharmaceutical compositions may be determined.
  • the present invention also provides an antimicrobial and antifungal cosmetic composition containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the tempide in the production of a cosmetic composition for antibacterial or antifungal.
  • the lysine and tryptophan of the present invention is repeated 4 times the peptide not only exhibits excellent antimicrobial and antifungal activity through affecting the inner membrane of harmful microorganisms, and can be usefully used as a cosmetic composition for antibacterial and antifungal since there is little cytotoxicity.
  • Cosmetic composition of the present invention in addition to the novel 3 ⁇ 4 Tide as an active ingredient
  • Ingredients commonly used in cosmetic compositions include, for example, conventional auxiliaries such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavors, and carriers.
  • Cosmetic compositions of the present invention may be prepared in any formulation conventionally prepared in the art, for example, solutions, suspensions, emulsions, pastes, gels, creams, lotions, powders, soaps surfactant-containing cleansing , Oils, powder foundations, emulsion foundations, wax foundations and sprays, and the like, but are not limited thereto. Specifically, it may be prepared in the form of a flexible lotion (skin), nourishing lotion (milk lotion), nourishing cream, massage cream, essence, eye cream, cleansing cream, cleansing foam, cleansing water, pack, spray or powder. .
  • the carrier component is animal oil, vegetable oil, wax, paraffin, starch, tragacanta, cellulose derivative, polyethylene glycol, silicone, bentonite, silica, talc or zinc oxide. This can be used.
  • lactose, talc, silica, aluminum hydroxide, chamo silicate or polyamide powder may be used, in particular, in the case of a spray, additionally chlorofluorohydrocarbon, propane Propellant such as butane or dimethyl ether.
  • a solvent, solubilizer or emulsifier is used as the carrier component, for example water, ethane, isopropane, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene.
  • a liquid diluent such as water, ethane or propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, Suspending agents such as polyoxyethylene sorbitan and polyoxyethylene sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxy, bentonite, aga or tragacanta and the like can be used.
  • the formulation of the present invention is a surfactant-containing cleansing agent, as a carrier component, an aliphatic alcohol sulfate, an aliphatic alcohol ether sulfate, a sulfosuccinic acid monoester, an isethionate, an imidazolinium derivative, a methyltaurate, a sarcosinate, a fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives, or ethoxylated glycerol fatty acid esters can be used.
  • the present invention also provides a nontoxic pesticide containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention also provides a use of the peptide in the manufacture of nontoxic pesticides.
  • the lysine and tryptophan peptides of the present invention are repeated four times, as well as exhibit excellent antibacterial and antifungal activity through affecting the inner membrane of harmful microorganisms, and can be usefully used as a nontoxic pesticide because there is little cytotoxicity.
  • the present invention also provides a pharmaceutical, cosmetics, food or feed preservatives containing the peptide of the present invention as an active ingredient.
  • the present invention provides a use of the peptide in the manufacture of a preservative for preserving medicines, cosmetics, food or feed.
  • the lysine and tryptophan peptides repeated 4 times of the present invention exhibit excellent antibacterial and antifungal activity through the influence on the inner membrane of harmful microorganisms, and also have almost no cytotoxicity. It can be usefully used as a preservative.
  • Food preservatives, cosmetic preservatives and pharmaceutical preservatives are additives used to prevent the deterioration, decay, discoloration and chemical change of foods and medicines. These include fungicides and antioxidants and inhibit the growth of microorganisms such as bacteria, bears and yeasts. Functional antibiotics such as inhibiting or sterilizing the growth of decay microorganisms in food and pharmaceuticals are included.
  • the present inventors In order to measure the antimicrobial activity of the peptide prepared in ⁇ Example 1>, the present inventors first measured the MIC value which is the minimum concentration of the peptide cells are not cleaved.
  • Staphylococcus aureus (5 D / zy / oa? Ca / s ai / r / s)
  • Listeria monocytogenes (/ se / a monocytogenes) as a gram-negative bacterium (Escherichia coli), Pseudomonas aeruginosa (/ 3 ⁇ 4 «3 ⁇ 4w «?
  • the peptide of SEQ ID NO: 3 of the present invention in the general strain was up to 64 times compared to SEQ ID NO: 1 peptide of the control group 16 times compared to SEQ ID NO: 2, 8 times higher than SEQ ID NO: 4 Antimicrobial activity was shown, and antibiotic resistance strains were found to exhibit high antimicrobial activity of up to 32-fold, 8-fold, and 8-fold higher (Table 1).
  • Table 1 the peptide of SEQ ID NO: 3 of the present invention in the general strain was up to 64 times compared to SEQ ID NO: 1 peptide of the control group 16 times compared to SEQ ID NO: 2, 8 times higher than SEQ ID NO: 4 Antimicrobial activity was shown, and antibiotic resistance strains were found to exhibit high antimicrobial activity of up to 32-fold, 8-fold, and 8-fold higher (Table 1).
  • Table 1 Table 1
  • the MIC value of the minimum concentration of the peptide which does not divide cells is measured, and the pathogenic fungi Candida albicans /? ' ⁇ albicans), Candida catenulate (C. catenulate), Candida Intermediate :. intermidia), Candida lugosa rugosa, Candida glabrata ( ⁇ glabrata), Candida melibiosica melibiosica) ⁇ Micro titrate by incubating in optimal media and diluting to a cell concentration of 2 ⁇ 10 5 cells / m Plates were inoculated.
  • Peptides synthesized in ⁇ Example ⁇ and melittin used as a positive control Peptides were diluted 1/2 fold from 128 ⁇ / well (wel l) in 10 mM sodium phosphate solution (pH 7.2) as solution 1 and complete phosphate solution as solution 2, and then added to the plate at 37 °. C was incubated for 18 to 24 hours, and the absorbance was measured at a wavelength of 620 ran using a micro titrate plate reader to determine the MIC value of each strain, and the results are shown in Table 2 below.
  • the SEQ ID NO: 3 peptide of the present invention was confirmed that the antifungal activity was good regardless of the type of the solution used in the experiment, in the case of the SEQ ID NO: 4 peptide phosphoric acid described as the solution 2 It was confirmed that the activity was better in the buffer solution condition (Table 2).
  • Example ⁇ 2 ⁇ 2> MIC was confirmed using RMPI 1640 solution and antibiotic resistant Candida albicans (C. albicans CCARM 14001, 14007, 14020). The results are shown in Table 3 below.
  • Phosphate buffered saline solution phosphate buffered saline, PBS, H
  • the SEQ ID No. 1, 2, and 3 peptides of the present invention showed little cytotoxicity, whereas the SEQ ID No. 4 peptide used as a positive control showed very high cytotoxicity. 4).
  • the present inventors In order to confirm whether the peptide of the present invention exhibits a lump in aqueous solution, the present inventors first examined the lumps of the peptide at various concentrations in two aqueous solutions. Tryptophan amino acid constituting the peptide has a fluorescence property, it can be confirmed the aggregation phenomenon.
  • the peptides at various concentrations (1-18 ⁇ ) were prepared to be present in water and phosphate buffered solution. Then, the change in fluorescence emission was recorded using a spectrofluorometer (Perkin-Elmer LS55). The excitation wavelength used in the measurement is 280 ran, and the emission wavelength is 300 to 400 ran.
  • SEQ ID NO: 3 peptides of the invention in phosphate wancheung aqueous solution is a graph which is substantially consistent regardless of the concentration, a "SEQ ID NO: 4 peptide is changed to the graph to the concentration causing, as shown in 2 of C and D It was confirmed (C and D of FIG. 2). Therefore, as in the result of B of FIG. 2, the peptide of SEQ ID NO: 3 did not occur in the aqueous solution of phosphate, but the peptide of SEQ ID NO: 4 was confirmed to occur.
  • CCARM 1229 and antibiotic resistant Staphylococcus aureus (5. aureus CCARM 3090) were each incubated in optimal medium and then buffered using aqueous solution 1 (20 mM glucose, 5 mM HEPES and pH 7.3). Washed twice. Each bacterium was lysed using buffered aqueous solution 2 (20 mM glucose, 5 mM HEPES, 0.1 M KC1 and pH 7.3) so that the absorbance was 0.05 at 600 nm. 1 ⁇
  • 3,3'-diethylthiodicarbocyanine iodide (3,3'-diethylthiodicarbocyanine iodide, DiSC3-5) was added and reacted until the baseline fluorescent value was stabilized. Thereafter, various concentrations of the peptide were treated to record the change in fluorescence emission.
  • the excitation wavelength used for the measurement was 622 nm and the emission wave length was 670 nm.
  • each of E. coli and Staphylococcus aureus were cultured in an optimal medium and lysed in a phosphate buffered solution at a concentration of 2 10 7 cells /. 1 ⁇ M of SYT0X green (molecular probe) and the cells were reacted for 10 minutes and treated with 12.5 ⁇ M of the peptides to measure the fluorescence generated for one hour.
  • the excitation wavelength used for the measurement is 485 ran and the emission wavelength is 520 ran.
  • the value obtained by treating 0.1% Triton X-100 was regarded as 100%, and the relative degree of fluorescence was confirmed.
  • the SEQ ID No. 4 peptide had the highest emission fluorescence value at 30 minutes in Escherichia coli, 20 minutes in Staphylococcus aureus, and the SEQ ID No. 3 peptide was 56 in E. coli. In the minute, Staphylococcus aureus, the emission fluorescence value was the highest around 30 minutes, so it was confirmed that SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 peptides affect the inner membrane of Escherichia coli and Staphylococcus aureus (Fig. 4). C and d).
  • antibiotic-resistant E. coli 0 ?. coli CCARM 1229 and antibiotic resistant Staphylococcus aureus (5. aureus CCARM 3090) were each incubated in optimal medium.
  • the cells of 2 10 5 cells were treated with the peptide at twice the concentration of MIC and MIC, reacted for 0, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50 and 60 minutes, and then reacted with a certain amount of agar.
  • the medium was plated. At 37 ° C
  • Example 7 Whether the peptides interact with bacteria and erythrocyte-like liposomes ⁇ 7-1> Confirmation of peptides with bacteria and erythrocyte-like liposomes Confirm that the peptides of the present invention actually act on bacteria and erythrocyte-like liposomes To this end, we first produced bacteria and red blood cell-like liposomes. Most coli membranes
  • La-phosphatidylglycerol (PG) is used, and red blood cells (human red blood cells) membrane is mainly composed of eggyolk L_a-phosphatidylcholine (PC) and cholesterol (cholesterol, CH).
  • PE and PG dissolved in chloroform solution were prepared in a ratio of 7: 3
  • PC and CH were prepared in a ratio of 10: 1, and then placed in a glass tube to remove moisture and lyophilized.
  • Place a buffer solution of calcein fluorescent sample 70 mM calcein, phosphate buffered saline, pH 7.4
  • calcein fluorescent sample 70 mM calcein, phosphate buffered saline, pH 7.4
  • Fluorescent liposomes containing 2.5 ⁇ lipids were reacted with various concentrations of peptide (0.03-1 ⁇ ) for 25 minutes.
  • the fluorescence value of the emitted fluorescent sample was measured with a spectrofluorometer.
  • the excitation wavelength used for the measurement was 480 ran and the emission wavelength was 520 ran.
  • 100% release value was expressed using 0.W Triton X-100, and was calculated according to Equation 2 below to compare the release value of each peptide. [Equation 2]
  • F absorbance after peptide treatment
  • F0 absorbance after complete solution treatment
  • Ft absorbance after 0.1% Triton X-100 treatment.
  • both the SEQ ID NO: 3 and the SEQ ID NO: 4 peptides acted on bacteria-like liposomes, thereby releasing many fluorescent samples.
  • SEQ ID NO 3 showed a release degree of less than half at the same concentration as compared to SEQ ID NO 4 peptide (A and B of FIG. 5).
  • PE and PG dissolved in a chloroform solution were prepared in a ratio of 7: 3, and then placed in a glass tube to remove moisture and lyophilized. After completing the process of freezing and dissolving the complete phosphate aqueous solution in the glass tube using liquid nitrogen, and then passed through a 0.2 filtration membrane, it was recovered. Aggregation was measured by absorbance of 405 ran by adding peptides of 5, 10, 20 and 40 ⁇ to 400 ⁇ liposomes.
  • SEQID No. 4 peptide was confirmed to further aggregate liposomes compared to SEQ ID NO. 3 peptide (FIG. 5C).
  • Example 8 Structural Analysis of Peptides in Bacteria and Erythrocyte-Like Liposomes
  • the structure of the peptide in the presence of liposomes of the artificial membrane component was analyzed by using polar dichroism spectroscopy (circular dichroism, CD). After mixing 1 ⁇ liposomes and 50 ⁇ peptide, the mixture was injected into a CD cuvette and analyzed in the wavelength region of 190 to 250 nm.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • the capsules were prepared by layering the gelatine capsules according to a conventional method for producing a capsule.

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Abstract

본 발명은 라이신 및 트립토판 잔기가 4번 반복되는 항균 및 항진균 펩타이드에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 라이신 및 트립토판 잔기가 4번 반복되는 항균 및 항진균 펩타이드가 유해 미생물의 내막에까지 영향을 미치는 것을 통하여 그람 양성균, 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 항균 활성이 뛰어나며 병원성 진균 및 항생제 내성 곰팡이에 대하여 탁월한 항진균 활성을 가질 뿐만 아니라 세포독성이 거의 나타나지 않으므로 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물, 화장료 조성물, 농약, 식품방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
라이신 및 트립토판 잔기가 4번 반복된 신규한 항균 및 항진균 펩타이드 및 이의 용도
【기술분야】
본 발명은 라이신 및 트립토판 잔기가 4번 반복된 신규한 항생 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성 (resistance)이 야기되었다. 실제로， 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빨리 일어난다. . 예를 들면， 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 >? e «¾¾ s
Figure imgf000003_0001
마이코박테리움 투버쿨로시스 ( yco/?ac er/iffl tuberculosis) 및 슈도모나스 애루기노사 (fte /c cwas1 aeruginosa) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다 (Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998).
항생제에 대한 내성 (tolerance)은 항생제에 대한 저항성 (resistance)과는 구별되는 현상인데， 1970년대에
^S—코^스 Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다 (Tomasz et al . , Nature, 227, 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin)과 같은 세균의 자가분해 (autolyt ic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데， 페니실린의 경우에 있어서 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이지만， 또한 세균이 이 효소의 활성을 억제하여 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.
세균이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다 (Handwerger and Tomasz, Rev. In fee. Dis. , 7， 368-386, 1985). 아을러， 내성은 항생제에 대한 세균의 저항성이 발생할 선행조건이라고 간주하는데, 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 항생제에 대한 저항성을 보이는 모든 세균들은 그 항생제에 대한 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로 (Liu and Tomasz, J. Infect. Dis. , 152, 365-372, 1985)， 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다. 작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두 가지로 구분되는데， 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장 속도가 감소할 때 일어나는 외형적 (phenotypic) 내성이며 (TuomanenE., Revs. Infect. Dis., 3, S279ᅳ S291, 1986) ,두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은, 오토라이신 효소의 활성을 감소시키는 조절 (down regulation)이 일어나는 것인데， 이러한 조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이지만, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 명백하게， 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소의 결손으로 생긴 경우인데， 확실하지 않은 여러 가지 이유로， 이러한 자가분해 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상에서 발견되는 내성은 오토라이신 효소의 활성을 외형적으로 조절하는 과정으로 이루어진다 (Tuomanen et al . , J. infect. Dis. , 158, 36-43, 1988).
상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 대한 저항성을 나타내는 세균을 제거하기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며， 오토라이신 효소의 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다.
한편， 세균은 박테리오신 (bacteriocin)이라는 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신들은 구조적 특징에 따라 세 가지로 구분된다. 첫 번째는 란티바이오틱스 (lantibiotics)이며 두 번째는 비 (非)란티바이오틱스 (nonlantibiotics)이고 세 번째는 신호 펩타이드 (signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다 (Cintas et al., J. Bad., 180, 1988-1994， 1998). 곤충을 포함하여， 동물 역시 펩타이드 항생제를 자체적으로 생산할 수 있는데 (Bevins et al.， Ann. Rev. Biochem. , 59， 395-414, 1990), 구조에 따라 세 개의 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한 (cysteine-rich) β-쉬트 (sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 c (ᅳ회전형 (helical)의 양친화성 펩타이드 분자이며， 세 번째는 프를린이 풍부한 (proline-rich) 펩타이드이다 (Mayasaki -e a/., Int. J. Antiwicrob. Agents, 9， 269-280, 1998). 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다 (Boman, H. G.， Cell, 65： 205, 1991； Boman, H. G.， Annu. Rev. Microbiol., 13:61， 1995). 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데 이들 구조 중 가장 흔한 것은 곤층에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀 (cecropin)과 같이 시스테인 (cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파나선형을 형성하는 구조이다.
따라서 양친화성 펩타이드의 항균활성에 대해서 많은 연구가 이루어졌으며， 이를 이용해 세균에 대한 항생제를 개발하려는 연구들이 많이 시도되었다. 멜리틴 (melittin)은 벌독의 성분 중 고형분의 50¾ 이상을 차지하는 펩타이드로서 카르복시 말단이 아미노화 (ami dat ion) 되어 있고 진핵세포에 대하여 세포독성이 매우 커 고등동물세포를 낮은 농도에서도 잘 파괴하고， 미생물인 그람 음성균 및 그람양성균에 대해서도 항균 활성이 높다고 보고되었다 (Habermann, E：.， Science, 177： 314, 1972； Steiner, H., et al., Nature, 292： 246, 1981； Tosteson, M. T. , et al ., Biochemistry, 228： 337, 1987). 그 이외 HP(2-20)와 유사한 아미노산 서열을 가지고 있는 세크로핀 계열의 양친화성 펩타이드는 초파리에서 처음 발견되었고， 그 후 누에 번데기 및 돼지의 작은 창자에서도 발견되었는데， 이 중 세크로핀 A(cecropin A, CA)는 항균활성은 높으나 항진균 및 항암활성은 미미한 것으로 보고되었다 (Boman, H. G. and Hultmark, D. , Annu. Rev. Microbiol. , 41： 103， 1987).
또한 상기한 양친화성 펩타이드의 활성에 관한 연구와 더불어， 그들이 갖는 아미노산 서열 및 단백질 구조 등의 특성을 살펴보면， 그 서열상의 특성이 항균 활성과 매우 밀접한 관련이 있음을 확인할 수 있다. 예를 들어 아르기닌을 라이신으로 대체하면 활성은 남아있지만 진핵세포 독성은 감소한다는 보고가 있다 (Epand RF, Lehrer RI， Waring A, WangW, Maget-Dana R, Lelievre D, Epand RM. , Bioploymers 2003； 71： 2-16.； Park Y, Lee DG, Jang SH, Woo ER, Jeong HG, Choi CH, Hahm KS. , Biochim. Biophys. Acta 2003； 1645： 172-182.). 게다가， 라이신 잔기로만 구성된 강한 합성 항균 펩타이드는 양친화적 구조의 극성 표면에 놓이고 음이은성 지질 상단부와 작용하게 된다. 이는 미생물에 대한 특이성의 원인이 된다 (DatheM, SchumannM, WieprechtT, WinklerA, BeyermannM , Krause E, Matsuzaki , Murase 0, Bienert M. , Biochemistry 1996； 35： 12612-12622.； Song YM„ Park Y, Lim SS, Yang ST, Woo ER, Park IS, Lee JS, Kim JI, Hahm KS, Kim Y, Shin SY. , Biochemistry 2005 44： 12094-12106.； GopalR, ParkSC, HaKJ; ChoSJ , KimSW, SongPI , NahJW, ParkY, Hahm KS., J. Pept. Sci. 2009; 15： 589-594.). 이에， 본 발명자들은 라이신 및 트립토판 잔기가 2내지 5번 반복적으로 존재하여 다양한 길이를 갖는 펩타이드를 합성하였으며， 그들 중 서열번호 3의 (KW)4는 유해 미생물의 내막에까지 영향을 미치는 것을 통해 그람 양성균，그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 우수한 항균 활성이 가지며 병원성 진균 및 항생제 내성 곰팡이에 대하여 탁월한 항진균 활성을 가질 뿐만 아니라 세포독성이 거의 나타나지 않으므로， 인체에 안전한 항균제 및 항진균제로서의 기능을 확인함으로써， 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 라이신 및 트립토판 잔기가 3번 반복된 (KW)3에 대하여 항균활성을 알아보았으나 (Gopal R, Kim YJ， Seo CH, Hahm KS, Park Y. , J Pept Sc 2011； 17： 329-334) , 본 발명의 (KW)4는 (KW)3보다 일반균주에서는 최대 16배， 항생제 내성 균주에서는 최대 8배 이상의 매우 높은 항균 활성을 나타내었고, 항진균 활성 또한 뛰어난 것을 확인하였다. 따라서， (KW)4는 (KW)3보다 항균 및 항진균 활성이 매우 뛰어난 펩타이드임을 밝혔다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 라이신 및 트립토판 잔기가 4번 반복되는 항균 및 항진균 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균 및 항진균 펩타이드를 이용한 항균 및 항진균용 조성물을 제공하는 것이다. 【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 라이신 및 트립토판 잔기가 4번 반복되는 항균 또는 항진균 템타이드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 템타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 템타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균용 화장료 조성물을 제공한다.
또한，본 발명은 상기 템타이드를 유효성분으로 함유하는 무독성 농약을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약품 , 화장품， 식품 또는 사료 보존용 방부제를 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 병원성 세균 또는 진균의 억제를 위해 세균 또는 진균에 처리하는 단계를 포함하는 세균 또는 진균의 억제 방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환 예방 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 펩타이드를 항균 또는 항진균용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ¾타이드를 항균 또는 항진균용 화장료 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 펩타이드를 무독성 농약의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 펩타이드를 의약품， 화장품， 식품 또는 사료 보존용 방부제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 병원성 세균 또는 진균의 억제를 위해 사용되는 상기 펩타이드를 제공한다.
아울러， 본 발명은 병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 상기 펩타이드를 제공한다. 【유리한 효과]
본 발명의 라이신 및 트립토판 잔기가 4번 반복되는 항균 및 항진균 펩타이드는 유해 미생물의 내막에까지 영향을 미치는 것을 통해， 그람 양성균, 그람 음성균 및 항생제 내성 균주에 대하여 우수한 항균 활성을 가지며 병원성 진균 및 항생제 내성 곰광이에 대하여 탁월한 항진균 활성을 가질 뿐만 아니라 세포독성이 거의 나타나지 않음을 확인함으로써， 이를 이용한 약학적 조성물， 화장료 조성물, 농약, 식품방부제， 화장품 보존제 및 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명에 사용된 펩타이드 및 서열을 나타낸 도이다.
도 2의 A및 B는 물과 인산완충수용액에서 본 발명의 펩타이드의 농도에 따른 웅집현상 분석을 위하여 펩타이드 내 트립토판 잔기의 최대 형광 방출 파장을 .측정한 그래프이고， C 및 D는 인산완충수용액에서 펩타이드의 2차 구조 분석을 위하여 원편광 이색성 분광 측정법 (circular dichroism, CD)을 이용해 이를 확인한 그래프이다.
A ： 물에서 ( )4 및 (KW)5의 형광 방출 파장 최대 값
B ： 인산완충수용액에서 (KW)4 및 (CT)5의 형광 방출 파장 최대 값—
* (KW)4(參)， (KW)5(A)
C 인산완층수용액에서 (KW)4구조
D ： 인산완층수용액에서 (KW)5 구조
* 25 μΜ (；參)， 50 μΜ (麵)， 100 μΜ(Α), 150 μΜ(^) 도 3은 본 발명의 펩타이드를 형광 물질로 표지한 뒤 세균에 처리하여 펩타이드의 작용 위치를 확인한 도이다.
Α ： 항생제 내성 대장균 (£. c // CCARM 1229)
B ： 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus CCARM 3090) 도 4는 본 발명의 펩타이드가 세균의 막에 미치는 영향과 농도에 따른 살균작용 시간을 분석한 그래프이다.
A ： 항생제 내성 대장균 (£\ coli CCARM 1229) 막의 탈분극정도 분석 B ： 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus CCARM 3090) 막의 탈분극정도 분석
C ： 대장균 ( coli) 세포내막 작용분석
D ： 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus) 세포내막 작용분석
E ： 항생제 -내성 대장균 ( . coli CCARM 1229) 살균력 분석
F ： 항생제 -내성 스태필로코쿠스 아우레우스 C5". aureus CCARM 3090) 살균력 분석
* A내지 D: (KW)2(^), (KW)3(빼)， (KW)4(參)， (KW)5(A), Melittin(O)
.E 및 F: (KW)4의 MKX口)， (KW)4의 2MICXᅀ)， (KW)5의 MKX薩)， (KW)5의
2MIC(A) ,
도 5는 본 발명의 펩타이드가 박테리아 -유사 이중 막에 작용하는지 확인하기 위하여 형광물질 방출정도와 웅집력을 확인한 그래프이다.
Α ： PE:PG(7:3, w/w)
B ： PC:CH(10:1, w/w)
C ： PE:PG(7:3, w/w)
* (KW)2(^), (KW)3(画)， ( W)4(#), (KW)5(A) 도 6은 본 발명의 펩타이드가 박테리아 -유사 이중막이 존재하는 상태에서 펩타이드의 2차 구조 분석을 위하여 원편광 이색성 분광 측정법 (circular dichroism, CD)을 이용해 이를 확인한 그래프이다.
A ： PE:PG(7:3, w/w)
B ： PC:CH(10:1, w/w)
* (KW)2(^), (KW)3(B), ( W)4(#), (KW)5(A)
도 7은 본 발명의 펩타이드를 항생제 내성 대장균 0?. coli CCARM 1229)에 처리하여 활성을 확인한 전자현미경 사진이다. A ： 음성 대조군 (처리하지 않았음)
B ： (KW)4
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 라이신 (Lys) 및 트립토판 (Tryptophan) 잔기가 4번 반복되는 항균 및 항진균 펩타이드를 제공한다.
상기 펩타이드는 구체적으로 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되고 세포독성을 거의 나타내지 않으며 8-머 Oner)의 최소 아미노산 크기로 구성되어 길이가 짧아 합성이 용이하며， 소수성 영역이 증가하여 양친화성을 갖는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한， 상기 펩타이드는 구체적으로 그람 양성균， 그람 음성균 및 항생제 내성 균쥬에 대하여 항균 활성을 갖는 것이고， 보다 구체적으로 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸리스 (fec// /s subtilis) , 스태필로코쿠스 아우레우스 aureus) 및 리스테리아 모노사이토젠스 ( /s er/a monocytogenes로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나, 상기 그람 음성균은 ^fl ( Escherichia coli) , 슈도모나스 에루기노사 (/seflbffo as aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움 typhi匪 rium ^로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 상기 항생제 내성 균주는 대장균류 ( coli CCARM 1229, 1238)， 살모넬라류 (5. typhimuriuni CCARM 8007, 8009, 8013) 및 스태필로코쿠스류 (5. aureus CCARM.3089, 3090, 3108, 3114, 3126)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 대하여 항균 활성을 갖는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 펩타이드는 구체적으로 병원성 진균 및 항생제 내성 곰팡이에 대하여 항진균 활성을 갖는 것이고， 보다 구체적으로 상기 병원성 진균은 캔디다 알비칸스 albicans), 캔디다 카테뉴레이트 (C. catenulate) , 캔디다 인터미디아 (C. inter idia) , 캔디다 루고사 (C. rugosa) , 캔디다 글라브라타 (C. glabrata) 및 캔디다 멜리비오시카 (C. mel ibiosica)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 상기 항생제 내성 곰광이는 캔디다 알비칸스 :. albicans CCARM 14001, 14007, 14020)에 대하여 항진균 활성을 갖는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러， 상기 펩타이드는 구체적으로 항생제 내성 대장균 0?. coli CCARM 1229) 및 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus CCARM 3090)의 외부에 결합하여 작용하고 상기 균들의 내막에까지 영향을 미치며 항생제 내성 대장균 ( coli CCARM 1229)에 처리하였을 때 상기 균의 표면을 거칠게 하고 손상을 입히며， 웅집현상을 유발하는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명자들은 신규한 항균 및 항진균 펩타이드를 제조하기 위하여， 라이신 및 트립토판 두 종류의 아미노산으로만 구성된， 서열이 단순하고 짧은 길이의 펩타이드를 합성하였다. 그 결과， 라이신 및 트립토판 잔기가 두 번 반복된 (KW)2(서열번호 1)， 세 번 반복된 (KW)3(서열번호 2), 네 번 반복된 (KW)4(서열번호 3) 및 다섯 번 반복된 (KW)5(서열번호 4)을 합성하였다 (도 1 참조).
또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여， 대조군으로 본 발명의 펩타이드와는 다른 길이의 (KW)n (n=2,3 또는 5) 및 멜리틴 (meliUin) 펩타이드를 사용하여 각 균주의 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도 (Minimal Inhibitory Concentration, 이하 "MIC"라 약칭함)를 측정하여 관찰하였다. 이 때 사용한 그람 양성균은 바실러스 서브틸리스 (fec///i/s subtil is) , 스태필로코쿠스 아우레우스 (S ^oAr ^ocras aureus) 및 리스테리아 모노사이토젠스 ( /sier/a monocytogenes A고， 그람 음성균은 대장균 0¾c?er/c?/a coli) , 슈도모나스 에루기노사 (/¾eo « as aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움
typh rhiw)
Figure imgf000012_0001
, 항생제 내성 균주는 대장균류 (£. coli CCARM 1229, 1238)， 살모넬라류 (5. typhimuriiun CCARM 8007, 8009, 8013) 및 스태필로코쿠스류 (5. aureus CCARM 3089, 3090, 3108， 3114, 3126)이다. 그 결과， 일반균주에서 본 발명의 서열번호 3펩타이드는 대조군의 서열번호 1펩타이드에 비해 최대 64배 서열번호 2에 비해 16배， 서열번호 4에 비해 8배 이상의 높은 항균 활성을 나타냈으며， 내성 균주에서는 차례로 최대 32배， 8배 , 8배 이상의 높은 항균 활성을 나타냈다 (표 1 참조). 따라서， 본 발명의 펩타이드는 그람 양성균 /음성균 및 항생제 내성 균주 모두에서 우수한 항균활성을 나타내었다는 것을 확인하였다.
또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여 , 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (Ca/ Wa albicans) , 캔디다 카테뉴레이트 (C. catenulate) , 캔디다 인터미디아 (C. interim' dl a) , 캔디다 루고사 (C. rugosa) ,캔디다 글라브라타 ( glabrata)및 캔디다 멜리비오시카 ((：. melibiosica) 및 항생제 내성 곰팡이인 항생게 -내성 캔디다 알비칸스 ( \ alb/cans CA 14001, 14007， 14020)를 사용하여 MIC값을 측정하였다. 그 결과 병원성 진균에 대하여 본 발명의 서열번호 3 펩타이드는 실험에 사용한 용액의 종류에 상관없이 활성이 좋음을 확인할 수 있었고，서열번호 4펩타이드의 경우 인산완충수용액 조건에서 보다 활성이 좋음을 확인할 수 있었으며 (표 2 참조)， 항생제 내성 곰광이에 대하여 서열번호 3 및 서열번호 4의 펩타이드가 활성이 좋음을 확인하였다 (표 3 참조).
또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여， 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사한 결과, 본 발명의 서열번호 3 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않음을 알 수 있었다 (표 4 참조).
또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드의 웅집현상 및 구조를 분석하기 위하여 분광 형광계 (spectrofluorometer) 및 원편광 이색성 분광 측정법 (circular dichroism, CD)을 이용하여 분석한 결과， 서열번호 3 펩타이드는 물 및 인산완층수용액에서 웅집현상이 나타나지 않았으나， 서열번호 4 랩타이드는 인산완층수용액에서 웅집현상이 일어남을 확인하였다 (도 2 참조).
보한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 대장균의 어느 부분에 작용하는지 그 위치를 확인하기 위하여 공초점 레이저 현미경 (confocal laser scanning microscopy)을 이용하여 확인한 결과， 서열번호 3 펩타이드는 항생제 내성 대장균 05 CO//CCARM 1229)및 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus CCARM 3090)의 외부에 결합하고 있음을 확인하였다 (도 3 참조).
또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 대장균 막에 실제로 작용하는지， 또한 펩타이드에 의한 박테리아의 사멸에 얼마나 빨리 작용하는지 확인하기 위하여， 탈분극정도 분석， 세포내막에의 작용확인, 시간에 따른 세포사멸측정을 하였다. 그 결과， 서열번호 1 펩타이드는 항생제 내성 대장균 ( coli CCARM 1229) 및 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus CCARM 3090)에서 탈분극 시키지 못하였고, 서열번호 2 펩타이드는 50 μΜ에서 약 2 정도의 탈분극 현상이 나타난 것에 비해 서열번호 3및 서열번호 4 펩타이드는 상기 두 세균 모두 25 μΜ에서 80% 정도의 탈분극 현상이 나타났음을 확인하였다 (도 4의 Α및 Β참조). 그리고， 서열번호 3및 서열번호 4 펩타이드는 대장균 (£\ coli) 및 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus)^ 내막에까지 영향을 미치는 것을 확인하였으며 (도 4의 C및 D참조), 서열번호 3 펩타이드가 서열번호 4 펩타이드에 비해 항생제 내성 대장균 ( . coli CCARM 1229)및 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 S. ai/r«;sCCARM3090)에서 그 활성을 빠르게 나타내었음을 확인하였다 (도 4의 E 및 F 참조).
또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 박테리아 및 적혈구 -유사 리포좀에 실제로 작용하는지, 박테리아ᅳ유사 리포좀을 웅집시키는지 확인하기 위하여，분광 형광계 (spectrofluorometer)를 이용하여 알아본 결과,서열번호 3 펩타이드 및 서열번호 4 펩타이드 모두
L-a-포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine, PE) 및
L-a-포스파티딜글리세를 (L-a-phosphatidylglycerol, PG)이 7:3의 비율일 때는 박테리아 -유사 리포좀에 작용였지만, 난황 (egg yolk)
L-a-포스파티딜콜린 (L-a-phosphatidylcholine, PC)및 콜레스테를 (cholesterol , CH)이 10:1의 비율일 때는 서열번호 3 펩타이드가서열번호 4 펩타이드에 비해 동일한 농도에서 절반 이하의 방출정도를 나타냄을 확인하였다 (도 5의 A 및 B 참조). 그리고， 서열번호 4 펩타이드는 서열번호 3 펩타이드에 비해 리포좀을 더 웅집시키는 결과를 확인하였다 (도 5의 C 참조).
또한， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 박테리아 및 적혈구 -유사 리포좀 성분에서 그 구조가 어떻게 달라지는지 확인하기 위하여， 편광 이색성 분광 측정법 (circular dichroism, CD)을 이용하여 알아본 결과， 박테리아 및 적혈구 -유사 리포좀 성분에서 서열번호 1 및 서열번호 2 펩타이드는 어떤 구조를 형성하지 못한 반면， 서열번호 3 및 서열번호 4 펩타이드는 접혀지는 방법으로 구조에 변화가 일어났음을 확인하였다 (도 6 참조). 특히, 상기와 같은 현상은 박테리아의 막을 파괴할 때 중요한 인자가 된다.
아울러， 본 발명자들은 본 발명의 펩타이드가 항생제 내성 대장균 ( col/ CCARM 1229)에 작용하여 어떻게 활성을 나타내는지 확인하기 위하여， 주사형 전자 현미경 (scanning electron micrograph)을 이용하여 알아본 결과, 서열번호 3 펩타이드를 처리하였을 때 매끄러운 상기 항생제 내성 대장균의 표면이 거칠어지고 손상을 입었으며, 응집현상이 나타남을 확인하였다 (도 7 참조).
그러므로， 본 발명의 라이신 및 트립토판이 4번 반복되는 펩타이드는 유해 미생물의 내막에까지 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 및 항진균 활성올 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 거의 없으므로 인체에 안전한 항균제로 유용하게 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 및 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 ¾타이드를 항균 또는 항진균용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다 .
또한 본 발명은 병원성 세균 또는 진균의 억제를 위해 사용되는 상기 펩타이드를 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 병원성 세균 또는 진균의 억제를 위해 세균 또는 진균에 처리하는 단계를 포함하는 세균 또는 진균의 억제 방법을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 구체적으로 그람 양성균, 그람 음성균 및 항생제 내성 균쥬에 대하여 항균 활성을 갖는 것이고， 보다 구체적으로 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸리스 (fec77/"s subtills) , 스태필로코쿠스 아우레우스 (5 ?A ococ«/s aureus) 및 리스테리아 모노사이토젠스 a/s e /a monocytogenes)^ 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나， 상기 그람 음성균은 대장균 G¾c?e /c/?/<3 coli) , 슈도모나스 에루기노사 (/¾ecfoHowas aeruginosa) 및 살모넬라
Figure imgf000016_0001
typhimuriuiii)으 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 상기 항생제 내성 균주는 대장균류 ( coli CCARM 1229， 1238) , 살모넬라류 (5. typhi murium CCARM 8007, 8009, 8013) 및 스태필로코쿠스류 (5. aureus CCARM 3089, 3090, 3108, 3114, 3126)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나에 대하여 항균 활성을 갖는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한， 상기 약학적 조성물은 구체적으로 병원성 진균 및 항생제 내성 곰광이에 대하여 항진균 활성을 갖는 것이고, 보다 구체적으로 상기 병원성 진균은 캔디다 알비칸스 (< /¾//a¾ albicans) , 캔디다 카테뉴레이트 (<：. catenulate) , 캔디다 인터미디아 (C. intermidia) , 캔디다 루고사 ((；. rugosa) , 캔디다 글라브라타 (C. glabrata) 및 캔디다 멜리비오시카 (C. mel ibiosica) — 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 및 상기 항생제 내성 곰광이는 캔디다 알비칸스 (C. albicans CCm 14001, 14007， 14020)에 대하여 항진균 활성을 갖는 것이나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 라이신 및 트립토판이 4번 반복되는 펩타이드는 유해 미생물의 내막에까지 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 거의 없으므로 항균 및 항진균용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 신규한 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉， 본 발명의 신규한 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제， 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제, 현탁제， 유제， 동결건조제제， 좌제가 포함된다. , 비수성용제， 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위템솔 (witepsol), 마크로골, 트원 (tween) 61， 카카오지， 리우린지 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 신규한 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체 (carrier)와 흔합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스， 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트， 아스코르브 산 (ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제 (antioxidants), 킬레이트화제 (chelating agents) , 저분자 단백질 또는 다른 안정화제 (stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 신규한 펩타이드의 유효용량은 0.01 내지 100 mg/kg이고， 바람직하게는 0.1 내지 10 mg/kg 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 상기 펩타이드를 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 펩타이드의 총 유효량은 블루스 (bolus)형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입 (infusion)등에 의해 단일 투여량 (single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (隱 iple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (f ract ionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때， 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 또한， 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 및 항진균용 화장료 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 템타이드를 항균 또는 항진균용 화장료 조성물의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 라이신 및 트립토판이 4번 반복되는 펩타이드는 유해 미생물의 내막에까지 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 거의 없으므로 항균 및 항진균용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로 상기 신규한 ¾타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며 예컨대 항산화제， 안정화제， 용해화제， 비타민 , 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제， 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어， 용액， 현탁액， 유탁액， 페이스트， 겔， 크림， 로션， 파우더， 비누ᅳ 계면활성제 -함유 클렌징, 오일， 분말 파운데이션， 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다. 본다 상세하게는， 유연 화장수 (스킨)， 영양 화장수 (밀크로션), 영양 크림， 맛사지 크림, 에센스, 아이크림， 클렌징 크림， 클렌징 포음, 클렌징 워터， 팩， 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유， 왁스， 파라핀， 전분， 트라가칸타， 셀를로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜， 실리콘, 벤토나이트， 실리카， 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스， 탈크， 실리카， 알루미늄 히드록시드, 칼슴 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물， 에탄을， 이소프로판을, 에틸 카보네이트， 에틸 아세테이트， 벤질 알코올， 벤질 벤조에이트， 프로필렌글리콜, 1，3-부틸글리콜 오일， 글리세를 지방족 에스테르， 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물， 에탄을 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코을, 폴리옥시에틸렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미소 결정성 셀를로오스， 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트， 아가또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코을 설페이트， 지방족 알코을 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트， 이미다졸리늄 유도체， 메틸타우레이트， 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트， 알킬아미도베타인， 지방족 알코을， 지방산 글리세리드， 지방산 디에탄올아미드， 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에록실화 글리세를 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 또한， 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 무독성 농약을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 펩타이드를 무독성 농약의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 라이신 및 트립토판이 4번 반복되는 펩타이드는 유해 미생물의 내막에까지 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 거의 없으므로 무독성 농약으로 유용하게 사용될 수 있다. . 또한， 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약품ᅳ 화장품， 식품 또는 사료 보존용 방부제를 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 펩타이드를 의약품， 화장품， 식품 또는 사료 보존용 방부제의 제조에 이용하는 용도를 제공한다.
본 발명의 라이신 및 트립토판이 4번 반복되는 펩타이드는 유해 미생물의 내막에까지 영향을 미치는 것을 통해 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 거의 없으므로 의약품， 화장품，식품 또는 사료 보존용 방부제로 유용하게 사용될 수 있다. 식품의 방부제， 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질， 부패， 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균， 곰광이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 식품의 방부제 및 화장품， 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다. 농작물의 병층해를 박멸하기 위한 농약 역시 해로운 미생물의 증식을 억제하고 인체에 무해하여야사람이 농약을 살포한 농작물을 안전하게 섭취할 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 펩타이드의 합성 및 분리정제
본 발명자들은 라이신 (Lys) 및 트립토판 (Tryptophan) 반복구조를 갖는 펩타이드를 합성하기 위하여，
Fmoc(9-플루오레닐ᅳ메특시카르보닐) (9-fkiorenylmethoxy carbonyl)을 아미노기 보호 용기로 이용한 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법을 사용하였다 (Merrifield, RB. , J. Am. Chew. Soc, 85, 2149， 1963). 구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실말단이 -N¾ 형태인 펩타이드는 링크 아미드 MBHA-레진 (Rink Amide MBHA_Resin)을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실말단이 -0H 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-왕 레진 (Wang Resin)을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링 (coup ling)에 의한 펩타이드 사슬 (chain)의 연장은 DCC(N-하이드록시밴조 트리아졸 (HOBt )ᅳ디사이클로-핵시카르보이미드) (N-hydroxybenzo triazole(HOBt)-dicycl으 hexycarbodiiinide)법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmocᅳ아미노산을 커플링 (coupling) 시킨 후, MP (20% 피페리딘 /N-메틸 피롤리돈) (20% pi eridine/N-methyl pyrol idone)용액으로 Fmoc기를 제거하고 MP 및 DCM (디클로로메탄) (dichoromethane)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에
TFA (트리플루오로아세트산 ) ( t r i Π uoroacet i c
acid)ᅳ페놀 (phenol)-티오아니졸 (thioanisole)-물 (¾0)-트리이소프로필실란 (tri isopropylsilane) (85： 5： 5: 2.5： 2.5, vol. /vol.) 용액을 가하고 2내지 3시간 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후， 디에틸 에테르 (diethylether)로 펩타이드를 침전시켰다. 상기의 방법으로 얻은 크루드 (crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토 니트릴 농도구배 (acetonitrile gradient)에서 정제형 역상 (reverse phase , RP)-HPLC 컬럼 (c 画 n Delta Pak, C18 300A, 15， 19.0隱 30 cm, Waters)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6N HC1로 110°C에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축 하고， 0.02N HC1에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.
그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 원하는 아미노산 서열을 가진 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다 (도 1). <실시예 2> 펩타이드의 항생활성 축정
<2-1>박테리아에서 생육 최소저해농도 측정
상기 <실시예 1>에서 제조된 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여， 먼저 본 발명자들은 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 MIC 값을 측정하였다. 항균 활성 측정을 위하여 그람 양성균으로써 바실러스 서브틸리스 G C77/ subtil is) , 스태필로코쿠스 아우레우스 (5 D/zy/oa?ca/s ai/r /s)와 리스테리아 모노사이토젠스 ( /s e /a monocytogenes)를, 그람 음성균으로써 ^장균 (Escherichia coli) , 슈도모나스 에루기노사 (/¾«¾w«?3S aeruginosa)^ 살모넬라 티피뮤리움 (53///¾¾?e//a typhimurium) , 항생제 내성 균주로써 대장균류 (£. coli CCARM 1229 , 1238 )，살모넬라류 ( S. typhimurium CCARM 8007, 8009, 8013), 스태필로코쿠스류 (5. aureus CCARM 3089, 3090, 3108, 3114, 3126)를 사용하였으며 각각의 최적 배지에서 배양한 다음 2χ105 세포 / 의 균체 농도로 회석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 상기 <실시예 1>에서 합성한 펩타이드 및 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드를 각각 200 μΜ/웰 (well) 부터 1/2배씩 인산나트륨완층수용액 (sodium phosphate buffer) 및 인산완층수용액 (phosphate buffered saline, PBS)에 각각 회석하여 '플레이트에 첨가한 후 37°C에서 18 내지 24시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 풀레이트 판독기를 이용하여 620 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였으며， 그 결과를 인산나트륨완층수용액 및 인산완층수용액을 구분하여 하기 표 1에 나타내었다 (괄호 안의 수치는 인산완층수용액에 희석한 경우임).
그 결과， 표 1에서 보는 바와 같이 일반균주에서 본 발명의 서열번호 3의 펩타이드는 대조군의 서열번호 1펩타이드에 비해 최대 64배ᅳ서열번호 2에 비해 16배， 서열번호 4에 비해 8배 이상의 높은 항균 활성을 나타냈으며， 항생제 내성 균주에서는 차례로 최대 32배, 8배， 8배 이상의 높은 항균 활성을 나타냈다는 것을 확인하였다 (표 1). 【표 1】
박테리아 균에 대한 펩타이드의 생육 최소저해농도
Figure imgf000023_0001
Figure imgf000024_0001
<2-2>곰광이에서 생육 최소저해농도 측정
상기 <실시예 1>에서 제조된 펩타이드의 곰광이에서 항진균 활성을 측정하기 위하여，먼저 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 MIC값을 측정하고， 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 /? 'ώ albicans) , 캔디다 카테뉴레이트 (C. catenulate) , 캔디다 인터미디아 ：. intermidia) , 캔디다 루고사 rugosa) , 캔디다 글라브라타 ( \ glabrata) , 캔디다 멜리비오시카 melibiosica)^ 각각의 최적 배지에서 배양한 다음 2χ105 세포 /m의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종하였다. 상기 <실시예 ^에서 합성한 펩타이드 및 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드를 용액 1로 기 재되는 10mM 인산 나트륨 용액 (pH 7.2)과 용액 2로 기 재되는 인산완층수용액에 각각 128 μΜ/웰 (wel l ) 부터 1/2배씩 희석하여 플레이트에 첨가한 후 37°C에서 18 내지 24시간 동안 배양하였고 , 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기를 이용하여 620 ran의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주의 MIC 값을 결정하였으며， 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
그 결과， 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명의 서 열번호 3 펩타이드는 실험에 사용한 용액의 종류에 상관없이 항진균 활성 이 좋음을 확인할 수 있었고， 서 열번호 4 펩타이드의 경우 용액 2로 기 재되는 인산완충수용액 조건에서 더 활성 이 좋음을 확인할 수 있었다 (표 2) .
【표 2】
곰광이에 대한 펩타이드의 생육 최소저해농도
생육 최소저 해농도 0ι M)
미 생물 종류 서 열번호 1 서 열번호 2 서 열번호 3 서 열번호 4 멜리 틴 용액 1 용액 2 용액 1 용액 2 용액 1 용액 2 용액 1 용액 1 용액 2
C. 알비칸스 >128 >128 8 32 8 ' 8 16 8 4 4
C . 카테뉴레이트 >128 >128 8 16 8 8 32 8 4 8
C. 인터미디아 >128 >128 8 32 8 8 32 4 4 4
C. 루고사 >128 >128 8 32 8 8 32 8 4 8
C. 글라브라타 >128 >128 16 32 8 8 16 4 4 4
C. 멜리버오시카 >128 >128 8 32 8 8 32 8 4 8 또한， 본 발명의 펩타이드의 항생제 내성 곰광이 균에서 의 항진균 활성을 측정하기 위하여， 상기 실시 예 <2ᅳ2>의 방법으로 RMPI 1640 용액 및 항생제 내성 캔디다 알비칸스 ( C. albicans CCARM 14001 , 14007 , 14020)를 .사용하여 MIC를 확인하였고， 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
그 결과，표 3에서 보는 바와 같이 서 열번호 3 및 서 열번호 4 펩타이드가 항진균 활성 이 좋음올 확인하였다 (표 3) . .【표 3】
항생제ᅳ내성 곰광이에 대한 펩타이드의 생육 최소저해농도
생육 최소저해농도 (n M)
미생물 종류 서열번호 1 서열번호 2 서열번호 3 서열번호 4 멜리틴 H"
C. 알비칸스
>128 >128 32 8 16 >128 CCARM 14001
C. 알비칸스
>128 >128 32 16 8 >128 CCARM 14007
C. 알비칸스
>128 >128 32 8 8 >128 CCARM 14020
<실시예 3> 펩타이드의 세포 독성 측정
본 발명의 펩타이드가 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여， 본 발명자들은 상기 펩타이드의 적혈구 파괴능을 조사하였다. 사람의 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산완충수용액 (phosphate buffered saline, PBS, H
7.0)으로 희석하고 여기에 200 μΜ/웰 부터 1/2의 농도로 항균 접합 펩타이드를 연속적으로 희석하여 370C에서 1시간 동안 반웅시 ¾ 후， 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈의 양을， 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 조사하기 위하여 1% 트리톤 X-100을 사람의 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였고， 1¾ 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하여 이를 각 항균 접합 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.
【수학식 1】
% 적¾구파피 ^ = ( |j| g) 00 상기 식에서， 흡광도 A는 414 nm 파장에서 펩타이드 용액의 흡광도, 흡광도 B는 414 nm 파장에서 PBS의 흡광도 그리고 흡광도 C는 414 ran 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.
상기 식에 의한 200μΜ 농도에서 적혈구 파괴능의 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
그 결과， 표 4에서 보는 바와 같이 본 발명의 서열번호 1， 2 및 3 펩타이드는 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에, 양성 대조군으로 사용한 서열번호 4 펩타이드는 세포독성이 매우 높게 나타남을 확인하였다 (표 4).
【표 4】
： 적혈구 파괴능 (<¾)
서열번호 1 서열번호 2서열번호 3서열번호 4 Melittin Ampicillin Oxacillin 적혈구 파괴능 0 5 8 71 100 = 1ᅳ
<실시예 4> 펩타이드의 웅집현상 및 구조 분석
<4-1>분광 형광계 (spectrofluorometer)를 통한 웅집현상 확인
본 발명의 펩타이드가 수용액상태에서 웅집현상을 나타내는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 두 수용액 상태에서 다양한 농도의 상기 펩타이드의 웅집현상을 조사하였다. 펩타이드를 구성하는 아미노산 증 트립토판 (Tryptophan)은 형광을 띠는 성질을 지니고 있는데， 이를 이용하여 응집현상을 확인할 수 있다. 다양한 농도 (1내지 18μΜ)의 상기 펩타이드를 물 및 인산완충수용액에 내에 존재하도록 준비하였다. 이후 분광 형광계 (spectrofluorometer, Perkin-Elmer LS55)를 이용하여 형광 방출량의 변화를 기록하였다. 측정 시 사용한 여기 파장 (excitation wavelength)은 280 ran, 방출파장 (emission wavelength)은 300 내지 400 ran이다.
그 결과, 도 2의 A에서 보는 바와 같이 물에서 본 발명의 서열번호 3및 4 펩타이드는 농도의 증가와는 상관없이 그 최대형광방출 파장값이 변하지 않고 일정함을 확인하였다 (도 2의 'Α). 반면에 도 2의 Β에서 보는 바와 같이 인산완층수용액에서 본 발명의 서열번호 3 펩타이드는 최대형광방출 파장값이 변하지 않았지만，서열번호 4펩타이드는 농도가 증가할수록 파장값이 감소함을 확인하였다 (도 2의 Β). 따라서 서열번호 3 펩타이드는 두 수용액 상태에서 웅집현상이 나타나지 않으나 서열번호 4 펩타이드는 인산완충용액에서 웅집함을 확인할 수 있었다.
<4-2> 원편광 이색성 분광 측정법 (circular dichroism, CD)을 통한 웅집현상 확인
인산완충수용액에서 상기 펩타이드의 다양한 농도에 따른 웅집현상을 원편광 이색성 분광 측정법 (circular dichroism, CD)을 이용하여 분석하였다. CD 큐벳에 다양한 농도의 상기 펩타이드를 주입한 뒤， 190 내지 250 nm의 파장영역에서 분석하였다.
. 그 결과, 도 2의 C 및 D에서 보는 바와 같이 인산완층수용액에서 본 발명의 서열번호 3 펩타이드는 농도에 상관없이 그래프가 거의 일관되었으나,' 서열번호 4 펩타이드는 농도에 따라 그래프에 변화가 생김을 확인하였다 (도 2의 C 및 D). 따라서 도 2의 B에서의 결과와 마찬가지로 서열번호 3 펩타이드는 인산완층수용액에서 웅집현상이 일어나지 않았지만， 서열번호 4 펩타이드는 웅집현상이 일어남을 확인할 수 있었다.
<실시예 5> 박테리아에서의 펩타이드 작용부위 확인
본 발명의 펩타이드가 대장균의 어느 부분에 작용하는지 그 위치를 확인하기 위하여， 본 발명자들은 공초점 레이저 현미경 (confocal laser scanning microscopy)을 이용하여 확인하였다. 항생제 내성 대장균 ( . coli CCARM 1229) 및 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus CCARM 3090) 각각을 최적 배지에서 배양한 다음, 2 X 105 세포 /m£의 균체 농도로 인산완층수용액을 사용하여 희석하였다.
5-카르복시테트라메틸로다민 (5-carboxytetramethylrhodamine, TAMRA)로 표지된 상기 서열번호 3 펩타이드 12.5 μΜ을 대장균과 스태필로코쿠스 아우레우스에 처리하고 37°C에서 10분 동안 반웅시켰다. 이 후 5분간 3000g 로 원심 분리하여 두 박테리아를 회수하고 인산완충수용액으로 씻는 과정을 세 번 반복하였다. 이렇게 처리한 두 박테리아를 공초점 레이저 현미경을 통해 관찰하였다. '
그 결과， 도 3의 A 및 B에서 보는 바와 같이 본 발명의 서열번호 3 펩타이드는 항생제 내성 대장균과 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스의 외부에 결합하고 있음을 확인하였다 (도 3의 A 및 B).
<실시예 6> 대장균의 막에 미치는 펩타이드의 영향분석
<6-1>박테리아의 탈분극정도 분석
박테리아의 탈분극정도 분석을 위하여, 항생제 내성 대장균 (£. coli
CCARM 1229) 및 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus CCARM 3090) 각각을 최적 배지에서 배양한 다음, 완충 수용액 1(20 mM글루코오스 (glucose), 5 mM HEPES 및 pH 7.3)을 사용하여 2번 씻어주었다. 각각의 박테리아가 600 nm에서 흡광도가 0.05가 되도록 완충 수용액 2(20 mM 글루코오스， 5 mM HEPES, 0.1 M KC1 및 pH 7.3)를 이용하여 회석하였다. 1 μΜ의
3, 3'-디에틸티오디카보시아닌 요오드화물 (3,3'-diethylthiodicarbocyanine iodide, DiSC3-5)을 첨가한 뒤 기준치 형광수치가 안정될 때까지 반응시켰다. 이 후 다양한 농도의 펩타이드를 처리하여 형광 방출량의 변화를 기록하였다. 측정 시 사용한 여기 파장 (excitation wavelength)은 622 nm, 방출파장 ( emission wave length)은 670 nm이다.
그 결과， 도 4의 A 및 B에서 보는 바와 같이 서열번호 1 펩타이드는 두 세균에서 막을 탈분극 시키지 못하였고, 서열번호 2 펩타이드는 50 μΜ에서 약 20% 정도의 탈분극 현상이 나타났다. 그에 비해 서열번호 3 및 서열번호 4 펩타이드는 두 세균 모두 25 μΜ에서 80% 정도의 탈분극 현상미 나타났음을 확인하였다 (도 4의 Α 및 Β). <6-2>세포막 내에서의 작용 확인
세포내막에의 작용을 확인하기 위하여， 대장균 ( coli) 및 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus) 각각을 최적 배지에서 배양하고 인산완충수용액에 2 107 세포 / 의 균체 농도로 회석하였다. 1 μΜ의 SYT0X 그린 (green) (분자 프로브 (molecular probe))과 세포를 10분 동안 암반응 시키고， 12.5 μΜ의 상기 펩타이드들을 처리하여 한 시간 동안 발생되는 형광을 측정하였다. 측정 시 사용한 여기파장은 485 ran, 방출파장은 520 ran이다. 0.1% 트리톤 X-100을 처리하여 얻은 값을 100%로 간주하였고， 이에 따른 상대적인 형광발생정도를 확인하였다.
그 결과， 도 4의 C 및 D에서 보는 바와 같이 서열번호 4 펩타이드는 대장균에서는 30분， 스태필로코쿠스 아우레우스에서는 20분경에 방출 형광 값이 가장 높았으며 , 서열번호 3 펩타이드는 대장균에서 56분， 스태필로코쿠스 아우레우스에서는 30분경에 방출 형광 값이 가장 높으므로 서열번호 3 및 서열번호 4 펩타이드는 대장균과 스태필로코쿠스 아우레우스의 내막에까지 영향을 미치는 것을 확인하였다 (도 4의 C 및 D).
<6-3>시간에 따른 세포사멸 확인
시간에 따른 세포사멸을 측정하기 위하여 , 항생제 내성 대장균 0?. coli CCARM 1229) 및 항생제 내성 스태필로코쿠스 아우레우스 (5. aureus CCARM 3090) 각각을최적 배지에서 배양하였다. 2 105세포 의 균체에 MIC및 MIC의 두 배 농도의 상기 펩타이드를 처리하고， 0， 1, 3， 5， 10, 20， 30， 40, 50 및 60분 동안 반응시킨 후 일정량을 회석하여 한천배지에 도말하였다. 37°C에서
16시간 동안 배지를 배양한 뒤 생긴 콜로니의 수를 세어 그 결과를 확인하였다.
그 결과， 도 4의 E 및 F에서 보는 바와 같이 서열번호 3 펩타이드는
MIC의 농도에서는 20분, MIC의 두 배 농도에서는 10분 내에 두 내성 박테리아에 작용하여 살균효과를 나타낸 반면, 서열번호 4 펩타이드는 MIC 농도에서 50분， MIC 두 배 농도에서 평균 35분에 작용하였으므로 서열번호 3 펩타이드가 서열번호 4 펩타이드에 비해 두 내성 박테리아 모두에서 그 활성을 빠르게 나타내었음을 확인하였다 (도 4의 E 및 F).
<실시예 7> 펩타이드의 박테리아 및 적혈구 -유사 리포좀과의 작용여부 <7-1> 펩타이드의 박테리아 및 적혈구 -유사 리포좀과의 작용 확인 본 발명의 펩타이드가 박테리아와 적혈구 -유사 리포좀에 실제로 작용하는지 확인하기 위하여， 본 발명자들은 먼저 박테리아와 적혈구 -유사 리포좀을 제작하였다. 대부분의 대장균 ( coli) 막은
L-a-포스파티딜에탄올아민 (phosphat idylethanolamine, PE) 및
L-a-포스파티딜글리세를 (L-a-phosphatidylglycerol, PG)로, 적혈구 (human red blood cells)막은 난황 (eggyolk) L_a-포스파티딜콜린 (L-a-phosphatidylcholine, PC)및 콜레스테롤 (cholesterol, CH)로 주로 이루어져 있다. 클로로포름용액에 녹아있는 PE 및 PG는 7:3의 비율로, PC 및 CH는 10:1의 비율로 준비한 다음, 유리관에 담아 수분을 제거하고 동결건조시켰다. 칼세인 (calcein) 형광시료가 든 완충액 (70mM칼세인， 인산완충수용액 (phosphate buffered saline)， pH 7.4)을 해당 유리관에 담고 액체질소를 이용하여 얼리고 녹이는 과정을 아흡 차례 반복한 뒤， 리포좀 내로 들어가지 않은 형광시료를 분리하기 위하여 여과 크로마토그래피 (gel filtration chromatography)를 통과시켰다. 2.5 μΜ의 지질이 함유된 형광시료내포 리포좀은 다양한 농도의 펩타이드 (0.03 내지 1 μΜ)와 25분간 반웅시켰다. 방출된 형광시료의 형광 값을 분광 형광계 (spectrofluorometer)로 측정하였으며, 측정 시 사용한 여기파장은 480 ran, 방출파장은 520 ran이다. 100% 방출값은 0.W 트리톤 X-100을 이용하여 나타냈으며， 이를 기준으로 각 펩타이드의 방출 값을 비교하기 위하여 하기 수학식 2에 따라 계산하였다. 【수학식 2]
%형광 Χ 100
Figure imgf000032_0001
상기 식에서， F는 펩타이드 처리 후 흡광도， F0는 완층액 처리 후 흡광도, Ft는 0.1% 트리톤 X-100 처리 후 흡광도를 나타낸다. 상기 식에 의한 다양한 비율에서 형광시료 방출 정도의 결과를 알아보았다. ■
그 결과, 도 5의 A에서 보는 바와 같이 서열번호 3 및 서열번호 4 펩타이드 모두는 박테리아 -유사 리포좀에 작용하여 형광시료가 많이 방출되었다. 하지만 도 5의 B에서 보는 바와 같이 서열번호 3은 서열번호 4 펩타이드에 비해 동일한 농도에서 절반 이하의 방출정도를 나타내었음을 확인하였다 (도 5의 A 및 B).
<7-2> 펩타이드의 적혈구 -유사 리포좀 웅집 여부 확인
발명의 펩타이드가 리포좀을 웅집시키는지 확인하기 위하여 클로로포름용액에 녹아있는 PE 및 PG를 7 :3의 비율로 준비한 다음， 유리관에 담아 수분을 제거하고 동결건조시켰다. 인산완층수용액을 해당 유리관에 담고 액체질소를 이용하여 얼리고 녹이는 과정을 아흡 차례 반복한 뒤， 0.2 의 여과막을 통과시킨 후 회수하였다. 400 μΜ의 리포좀에 5， 10， 20 및 40 μΜ의 펩타이드를 첨가하여 405 ran의 흡광도로 응집정도를 측정하였다.
그 결과， 도 5의 C에서 보는 바와 같이 서열번호 4펩타이드는 서열번호 3 펩타이드에 비해 리포좀을 더 응집시키는 결과를 확인하였다 (도 5의 C).
<실시예 8>박테리아 및 적혈구 -유사 리포좀에서 펩타이드의 구조분석 본 발명의 펩타이드가 박테리아 및 적혈구ᅳ유사 리포좀 성분에서 그 구조가 어떻게 달라지는지 확인하기 위하여， 본 발명자들은 상기 실시예 <7-1〉의 방법에 따라 박테리아 및 적혈구 -유사 리포좀올 제작하였다. 이들 1 인공 막 성분의 리포좀이 존재할 때 펩타이드의 구조를 편광 이색성 분광 측정법 (circular dichroism, CD)을 이용하여 분석하였다. 1 πιΜ의 리포좀과 50 μΜ의 펩타이드를 흔합한 뒤， CD 큐벳에 흔합물을 주입하고 190 내지 250 nm의 파장영역에서 분석하였다.
그 결과, 도 6의 A 및 B에서 보는 바와 같이 PE:PG가 7:3의 비율인 박테리아 -유사 리포좀 및 PC:CH가 10:1의 비율인 적혈구 -유사 리포좀에서 서열번호 1 펩타이드 및 서열번호 2 펩타이드는 어떤 구조를 형성하지 못한 반면， 서열번호 3 펩타이드 및 서열번호 4 펩타이드는 상기 두 가지 모두의 조건에서 접혀지는 방법으로 구조에 변화가 일어났음을 확인하였다 (도 6의 A 및 B).
<실시예 9>항생제 내성 대장균에 작용하는 펩타이드
본 발명의 펩타이드가 항생제 내성 대장균 ( . col/ CCARM 1229)에 작용하여 어떻게 활성을 나타내는지 확인하기 위하여， 주사형 전자 현미경 (scanning electron micrograph)을 이용하여 확인하였다. 항생제 내성 대장균을 최적 배지에서 배양하고 인산완충수용액에 2 X 107 세포 / 의 균체 농도로 희석하였다. 12.5 μΜ의 서열번호 3 펩타이드 첨가한 다음 60분 뒤
3000g에서 5분간 침전시켰다. 침전물은 인산완충수용액을 통해 씻어주고， 다시 침전시키고 씻어주는 과정올 2희 반복하였다. 이 후 (0.2 M 나트륨카코딜산완층수용액 (sodium-cacody late buffer )(pH 7.4)을 이용한) 5% 글루타알데하이드 (glutaraldehyde) 500 峰 이용해 40C에서 3시간 동안 박테리아를 고정하고， 0.1 M나트륨카코딜산완충수용액으로 씻어주었다. 이 후 (0.1M 나트륨카코딜산완층수용액을 이용한 )1% 사산화오스뮴 (osmium tetroxide)을 처리하고 40C에서 1시간 반웅시킨 뒤 5% 슈크로스가 포함된 동일완충수용액으로 두 번 씻어주었다. 이어 20， 40, 60, 80， 95 및 100% 에탄올을 이용해 탈수시킨 뒤 건조, 코팅 시켜 주사형 전자 현미경을 통해 관찰하였다. '
그 결과, 도 7의 A에서 보는 바와 같이 펩타이드를 처리하지 않은 항생제 내성 대장균은 그 표면이 매끄러우나， 도 7의 B에서 보는 바와 같이 서열번호 3 펩타이드를 처리한 대장균은 표면이 거칠고 손상을 입었으며， 웅집현상이 나타남을 확인하였다 (도 7의 A 및 B). 하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 1>약학적 제제의 제조
<1-1>산제의 제조
<실시예 1>의 펩타이드 2g
유당 lg
상기의 성분을 흔합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2>정제의 제조
<실시예 1>의 펩타이드 lOOnig
옥수수전분 lOOrag
유 당 lOOmg
스테아린산 마그네슴 2mg
상기의 성분을 흔합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3>캡슐제의 제조
<실시예 1>의 펩타이드 lOOrag
육수수전분 lOOrag
유 당 lOOrag
스테아린산마그네슘 2mg 상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 캡술제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슬에 층전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4>환의 제조
<실시예 1>의 펩타 0 유당
글리세린
자일리를
상기의 성분을 흔합한 후， 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<1-5>과립의 제조
<실시예 1>의 펩타이드 150 nig
대두 추출물 50 nig
포도당 200 mg
전분 600 mg
상기의 성분을 흔합한후， 30%에탄올 100 mg을 첨가하여 섭씨 60oC에서 건조하여 과립을 형성한후 포에 층진하였다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
라이신 및 트립토판 잔기가 4번 반복되는 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구항 2]
제 1항에 있어서， 상기 펩타이드는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구항 3】
제 1항에 있어서， 상기 펩타이드는 그람 양성균에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구항 4】
제 3항에 있어서， 상기 그람 양성균은 바실러스 서브틸리스 0¾c/// s subtil is), 스태필로코쿠스 아우레우스 C ¾f ¾ /oa¾7«/s aureus) 및 리스테리아 모노사이토젠스 ( /sier/a monocytogenes^S— 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 ¾타이드.
【청구항 5】
제 1항에 있어서, 상기 펩타이드는 그람 음성균에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구항 6】
제 5항에 있어서, 상기 그람 음성균은 대장균 0¾c?e /c /s coli) , 슈도모나스 에루기노사 (/¾« ΗΟ 35 aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움 (5a//»o/2e//a typh mirhmi)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구항 7]
제 1항에 있어서， 상기 펩타이드는 항생제 내성 균주에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 템타이드.
【청구항 8】
제 7항에 있어서,상기 항생제 내성 균주는 대장균류(£. coli CCARM 1229 1238)， 살모넬라류 (5. typhi murium CCARM 8007, 8009, 8013) 및 스태필로코쿠스류 (5. aureus CCARM 3089, 3090, 3108, 3114, 3126)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구항 9]
제 1항에 있어서，상기 펩타이드는 병원성 진균에 대하여 항진균 활성을 갖는 것올 특징으로 하는 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구맣 10】
제 9항에 있어서， 상기 병원성 진균은 캔디다 알비칸스 ( Λ· albicans), 캔디다 카테뉴레이트 ( . catenulate) , 캔디다 인터미디아 7. intermidia) , 캔디다 루고사 (C. rugosa) , 캔디다 글라브라타 (C. glabrata) 및 캔디다 멜리비오시카 (C. melibiosica) — 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 템타이드.
【청구항 111
제 1항에 있어서,상기 펩타이드는 항생제 내성 곰팡이에 대하여 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구항 12]
제 11항에 있어서， 상기 항생제 내성 곰광이는 캔디다 알비칸스 (C. albicans CCARM 14001, 14007， 14020)인 것을 특징으로 하는 항균 또는 항진균 펩타이드 .
【청구항 13】
제 1항의 항균 또는 항진균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균용 약학적 조성물 .
[청구항 14】
제 1항의 항균 또는 항진균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균 또는 항진균용 화장료 조성물 .
【청구항 15】
제 1항의 항균 또는 항진균 템타이드를 유효성분으로 함유하는 무독성 농약 .
【청구항 16】
제 1항의 항균 또는 항진균 템타이드를 유효성분으로 함유하는 의 약품， 화장품， 식품 또는 사료 보존용 방부제 .
【청구항 17]
약학적으로 유효한 양의 제 13항의 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 병원성 세균 또는 진균의 억제를 위해 세균 또는 진균에 처 리하는 단계를 포함하는 세균 또는 진균의 억 제 방법 .
【청구항 18】 약학적으로 유효한 양의 제 13항의 항균 또는 항진균용 약학적 조성물올 병원성 세균 또는 진균에 기 인한 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균 또는 진균에 기 인한 질환 치료 방법 .
【청구항 19】
약학적으로 유효한 양의 제 13항의 항균 또는 항진균용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 병원성 세균 또는 진균에 기 인한 질환 예방 방법 ·
【청구항 20】
제 1항의 항균 또는 항진균 펩타이드를 항균 또는 항진균용 약학적 조성물의 제조에 이용하는 용도 .
【청구항 21]
제 1항의 항균 또는 항진균 ¾타이드를 항균 또는 항진균용 화장료 조성물의 제조에 이용하는 용도 .
【청구항 22】
제 1항의 항균 또는 항진균 펩타이드를 무독성 농약의 제조에 이용하는 용도 .
【청구항 23]
제 1항의 항균 또는 항진균 펩타이드를 의 약품， 화장품， 식품 또는 사료 보존용 방부제의 제조에 이용하는 용도 .
【청구항 24]
병원성 세균 또는 진균의 억 제를 위해 사용되는 제 1항의 항균 또는 항진균 펩타이드.
【청구항 25】
병원성 세균 또는 진균에 기인한 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 제 1항의 항균 또는 항진균 펩타이드.
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