WO2013086927A1 - 人胰岛素类似物及其酰化衍生物 - Google Patents

人胰岛素类似物及其酰化衍生物 Download PDF

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WO2013086927A1
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human insulin
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insulin
precursor
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孙飘扬
张连山
刘佳建
袁纪军
方春钱
孙长安
袁恒立
王亚里
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上海恒瑞医药有限公司
江苏恒瑞医药股份有限公司
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Definitions

  • the present invention relates to a human insulin analog and an acylated derivative thereof, a process for the preparation thereof, and a pharmaceutical composition comprising the same and an acylated derivative thereof, and its use as a therapeutic agent, particularly as a therapeutic agent for diabetes.
  • Background technique
  • Diabetes Mellitus is a common metabolic endocrine disorder characterized by the absolute or relative lack of insulin in the body, or the chronic hyperglycemia caused by the insensitivity of the target tissue to insulin, accompanied by disorders of glucose, fat and protein metabolism.
  • Clinical chronic, systemic metabolic syndrome It is caused by the interaction of genetic and environmental factors, involving various systems of the human body, including cardiovascular and cerebral vascular, kidney, eye, nerve and other organ complications, which seriously endanger human health and is a lifelong disease.
  • Diabetes has become a common and frequently-occurring disease. It is the third major threat to human life after cancer and cardiovascular and cerebrovascular diseases. It is a challenge for all human beings, and it harms people's lives and health regardless of race and country.
  • IDF International Diabetes Federation
  • the total number of people with diabetes increased four-fold in the mid-1980s to the mid-1990s, reaching 120 million.
  • the number of people with diabetes worldwide was 246 million, of which 46% were 40-59 years old. It is estimated that by 2025, the number of diabetic patients worldwide will increase to 380 million, accounting for 7.1% of the world's adult population.
  • Type I diabetes insulin-dependent diabetes mellitus
  • type 2 diabetes non-insulin-dependent diabetes mellitus
  • Type I diabetes is mostly in children and adolescents. The peak incidence is 12 years old, accounting for less than 10% of total diabetes patients.
  • Type II diabetes occurs mostly in adults, accounting for more than 90% of all diabetic patients. The exact pathological mechanism of diabetes is still unknown, and there is no cure.
  • Drug treatment and control are currently the focus of diabetes treatment. In addition to a small number of patients with type 2 diabetes who can control their condition through diet and exercise therapy, most patients require medication.
  • Therapeutic drugs include proprietary Chinese medicines and western medicines. Western medicine dominates, mainly two major types of drugs: protein peptide drugs represented by insulin and analogs and oral small molecule anti-diabetes drugs.
  • the diabetes drug market reached US$18.6 billion in 2005, an increase of 11.5% over the previous year. In 2006, it was $21.2 billion, an increase of 14%. In 2007, it was US$24.1 billion, an increase of 13.7%, ranking 5th in the global pharmaceutical market. It is expected to grow at a rate of 15 to 20% per year. According to Research and Markets, insulin and its analogues accounted for 40.1% of the total diabetes drug market, oral hypoglycemics accounted for 58%, and the remaining 1.9% market share was dominated by other drugs.
  • EP 0 425 482 B1 discloses an insulin analogue having a His or Tyr substitution at the B25 position.
  • EP0419504B1 discloses an insulin analogue which has a substitution at B3, a Gin substitution at A5 or A15, or an Asn substitution at A18 or A21.
  • US5008241A discloses an insulin analog having a specific amino acid substitution at A21 with a specific amino acid substitution at A4, A17, B13 or B21.
  • U.S. Patent 5,164,366 A discloses the deletion of an insulin analog at position B24, B25, B26 or B27.
  • CN1195777C discloses insulin analogs substituted on A8, A9, A10, B30.
  • U.S. Patent No. 7,193,035 B2 discloses a crystalline form of a substituted insulin analog in B3 and at least in B27, B28 or B29.
  • CN1780854 discloses an AO (Arg) A21(Gly)B31(Arg)B32(;Arg) insulin analog.
  • a novel diabetes therapeutic agent having excellent properties, more particularly, a novel human insulin analog and an acylated derivative thereof, and a method of preparing the same.
  • a pharmaceutical composition containing the same, and the use of the human insulin derivative in the treatment of diabetes are particularly, and the use of the human insulin derivative in the treatment of diabetes.
  • a first aspect of the invention provides a human insulin-like organism or a physiologically tolerated salt thereof, comprising human insulin having the following sequence
  • B chain FVB 3 QH FYB 27 B 28 B 29 B 30 B 31 B 32 ;
  • a 21 may be N or G;
  • B 3 may be K, D or N;
  • B 27 can be E, T, D, or K
  • B 28 may be E, D, P or K;
  • B 29 may be E, K or P;
  • B 30 can be K, R, E, T or missing;
  • B 31 , B 32 may be R or a single deletion or both,
  • a 21 is N
  • B 3 is N: B 31 B 32 is missing, B 27 B 28 B 29 B 3 () is not ⁇ , ⁇ or TDKT;
  • B 3Q B 31 B 32 is missing, B 27 B 28 B 29 is not TPK;
  • B 28 and B 29 are P or K, ⁇ 3 . It is ⁇ or missing, ⁇ 31 , ⁇ 32 is R or a deletion; more preferably B 28 B 29 is PK.
  • B 3 of the B chain is K: Preferred B 28 , B 29 is P or E, B 3 . Is E or R, B 31 is R or a deletion, B 32 is deleted; more preferably B 28 B 29 is PE.
  • the human insulin analog or a physiologically tolerated salt thereof provided by the present invention wherein the sequence A chain and B chain of the human insulin analog are linked by a disulfide bond (A7-B7, A20-B19), and A6 in the A chain. And All are linked by a disulfide bond; the sequence is selected from, but not limited to, the sequence as described below:
  • the present invention also provides a preferred example of the above human insulin analog or physiologically tolerated salt thereof, wherein the human insulin analog is PEGylated to obtain the PEGylated insulin of the present invention; the molecular weight of the PEG molecule is 5 -100 KD, preferably 10-80 KD, more preferably 15-45 KD, most preferably 20-40 KD; the PEG molecule is branched or linear.
  • the present invention also provides a method for preparing a human insulin analog or a physiologically tolerated salt thereof, which comprises constructing an expression vector, transforming into a host cell, and isolating and purifying the expression precursor product by chemical or/and enzymatic method from before expression.
  • the insulin analog is released from the body product; the human insulin analog is optionally further PEGylated to obtain the PEGylated insulin of the present invention, and the PEGylation is preferably a chemical acylation modification method, including an acylating reagent. Synthesis, acylation of amino groups in human insulin analogs and removal of protecting groups in the acylation group.
  • R2 is a peptide of 0-5 amino acid residues, and the amino acid residue peptide consists of alanine (A), lysine (K), and arginine (R);
  • ⁇ and ⁇ are the ⁇ chain and B chain corresponding to the insulin analog, respectively.
  • the expression precursor product is preferably:
  • the invention also provides a DNA-sequence encoding the expression precursor product of the insulin analog.
  • the present invention also provides an expression vector comprising the DNA-sequence.
  • the invention also provides a host cell transformed with any of the expression vectors described.
  • the host cell described therein is preferably a bacterium, more preferably Escherichia coli.
  • the host cell described therein is also preferably a yeast, more preferably Pichia pastoris, or Saccharomyces cerevisiae.
  • the present invention also provides an insulin derivative which is linked at the N-terminus of the insulin A and B-chain (X-amino or at the ⁇ -amino group of the lysine (K) residue of B3, B27-B30
  • the acylation modifying group forms an acylated insulin having the following formula:
  • S is insulin, or an insulin analogue as described in the first aspect above;
  • -W-X-Y-Z is an acylation modifying group of an insulin analog, wherein W is:
  • X is:
  • a further preferred embodiment of the insulin derivative of the present invention wherein the acylation modifying group -W-X-Y-Z is linked to the ?-amino group of the lysine (K) residue of the parent insulin B3, B27-B30.
  • a further preferred embodiment of the insulin derivative of the present invention wherein the acylation modifying group -W-X-Y-Z is linked to the parent insulin oxime and the B-chain N-terminal ⁇ -amino group.
  • acylation modifying group -W-X-Y-Z is preferably selected from the group consisting of
  • the present invention also provides a pharmaceutical preparation comprising the insulin analog of the present invention and/or a physiologically tolerated salt thereof, or an insulin derivative as described above.
  • the pharmaceutical preparation described therein contains a soluble, amorphous and/or crystalline form of an insulin analog and/or a physiologically tolerated salt thereof.
  • the pharmaceutical preparation described therein contains a long-acting adjuvant, and the long-acting adjuvant and the drug are present in a co-crystallized manner.
  • the invention also provides an injectable solution having insulin activity comprising the above-described pharmaceutical preparation in dissolved form.
  • the present invention also provides the insulin analog and/or physiologically tolerated salt thereof, or the insulin derivative as described above, in the preparation of a medicament for treating diabetes, hyperglycemia, obesity or insulin resistance the use of.
  • the invention also provides the use of the insulin analog and/or physiologically tolerated salt thereof for the preparation of a fast-acting and/or long-acting pharmaceutical preparation having insulin activity.
  • the invention provides a novel recombinant human insulin analog, which has good modification effect, better drug activity, and provides more selective drugs for clinical treatment of diabetes.
  • A is adenine
  • C is cytosine
  • G is guanine
  • T is thymine
  • Human insulin analog means human insulin in which one or more amino acid residues in human insulin have been deleted and/or replaced by other amino acid residues, or contains additional amino acid residues, ie, more than 51 amino acid residues. Human insulin.
  • Insulin derivative in the present invention, refers to an acylated modifying group attached to the N-terminus of the insulin A and B-chain (X-amino group or at the ⁇ -amino group of the lysine residue of B3, B27-B30).
  • An acylated insulin is formed which has the general formula: SWXYZ; wherein each code is as defined in the specification.
  • PEGylated insulin refers to a human insulin analog that is PEGylated; the PEG molecule has a molecular weight of 5 to 100 KD, preferably 10 to 80 KD, more preferably 15 to 45 KD, and most preferably 20 to 40 KD;
  • the PEG molecule is branched or linear; in the present invention, PEG (20KD) insulin means that the molecular weight of PEG bound to each human insulin analog subunit is 20KD; PEG (30KD) insulin is expressed with each human insulin analog The molecular weight of PEG is 30KD; PEG (branched 40KD) insulin is expressed and The PEG bound by each human insulin analog subunit is a branched PEG having a molecular weight of 40 kD.
  • Long-acting adjuvant refers to protamine sulfate.
  • a fast-acting pharmaceutical preparation having insulin activity means a preparation of a human insulin analog having a fast-acting insulin activity or a physiologically tolerated salt thereof.
  • Long-acting pharmaceutical preparation having insulin activity means a preparation of a human insulin analog having long-acting insulin activity or a physiologically tolerated salt thereof.
  • the sequence design of the invention is based on the protein amino acid sequence of native human insulin.
  • the full length consists of two chains, A and B chains.
  • the A and B chains are linked by a disulfide bond, and there is also a disulfide bond in the A chain, and a total of three disulfide bonds are indicated by a line.
  • the amino acid number on each chain is named according to the following rules: For example, the amino acids 1-21 of the A chain are labeled as Al, A2, A3. B chain 1-30 amino acids are labeled as Bl, B2, B3.... Further, if amino acids are added to the N-terminus of the A and B chains, the labels are A0, A (-l), A (-2), respectively.
  • the identified amino acid is represented by the amino acid code, and the position where the substitution or deletion is indeterminate is indicated by the amino acid number of the position, as shown by the formula of the human insulin analog of the present invention.
  • B (1-29) used refers to a B chain shortened by human insulin B1 to B29
  • B (1-30) refers to a B chain of human insulin B1 to B30
  • B (1-31) is Refers to the B chain of human insulin B1 to B31
  • B ( 1-32) refers to the B chain of human insulin B1 to B32
  • a ( 1-21 ) refers to the A chain of human insulin
  • a ( 0-21 ) means The human insulin A chain with an amino acid residue at the AO position.
  • the substitution residue in the human insulin molecule is represented by the amino acid number referring to human insulin.
  • A(l-21) human insulin refers to a human insulin analog substituted by D at the 3 position of the B chain.
  • the sequence shorthand B (l-30), AG-21) refers to natural human insulin;
  • B(l-29), A(l-21) refers to human insulin deleted at B30;
  • ⁇ (1-21) means that the ⁇ 3 position is replaced by ⁇
  • ⁇ 29 ⁇ 30 is the recombinant human insulin substituted by EE (Example 6) unless otherwise stated.
  • the B chain and the A chain are disulfide bonds between A ( 7) Cys and B ( 7) Cys , and disulfide between A ( 20 ) Cys and B ( 19 ) Cys .
  • the keys are linked together.
  • the A chain contains an internal disulfide bond between A ( 6) Cys and A ( 11 ) Cys.
  • the step of transforming a host cell with recombinant DNA as described in the present invention can be carried out by a conventional technique well known to those skilled in the art.
  • the obtained transformant can be cultured by a conventional method to express the polypeptide encoded by the gene of the present invention.
  • the medium used in the culture may be selected from various conventional media depending on the host cell used.
  • the cultivation is carried out under conditions suitable for the growth of the host cells.
  • the chemical and/or enzymatic methods for releasing the insulin analog from the expression precursor product can be carried out by conventional techniques well known to those skilled in the art, such as trypsin, carboxypeptidase 8, lysine endopeptidase C and the like.
  • Figure 1 Schematic diagram of the cloning method of recombinant human insulin B (1-30), A (1-21) precursor.
  • Figure 2. Electrophoresis pattern of PCR identification of recombinant human insulin B (1-30), A (1-21) precursor clone insert.
  • Figure 3. Comparison of in vivo long-acting activity test results of HS061 and HS060.
  • YPD medium (1L) (1% yeast powder, 2% peptone, 2% glucose):
  • Minimal glucose medium (1L) (1.34% YNB; 4 X 10- 5% biotin; 2% glucose): 1, 800mL water autoclaved 20min, (formulated as a tablet, may be prior to sterilization, was added 15 ⁇ 20g of agar);
  • Example 1 Preparation of recombinant human insulin B (1-30), A (1-21) and B (1-29), RA (1-21) Step 1: Recombinant human insulin B (l-30), A (l-21) Cloning and expression of precursors
  • KOD kit for the first round of PCR synthesis (TOYOBO, Cat. KOD-201 50 ⁇ system: 5 L lOx KOD buffer, 2 ⁇ 2mM dNTPs, 1.5 L primer 1 (10 ⁇ ), 1.5 L primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 2 ⁇ , 25 mM MgS0 4 , 38 L ddH 2 0.
  • the amplification procedure is 94 °C for 2 min, 94 °C for 30 sec, 55 V for 30 sec, 68 °C for 30 sec, after 25 cycles of amplification, then 68 °C.
  • the PCR amplification procedure was terminated by incubation for 2 min.
  • the synthesized 85 nucleotide PCR product 1 was identified and recovered on a 1.2% agarose gel.
  • the second round of PCR was synthesized using a 50 ⁇ system: 5 ⁇ 10x KOD buffer, 2 L 2mM dNTPs, ⁇ product 1, 1.5 ⁇ primer 3 (10 ⁇ ), 1.5 ⁇ primer 4 (10 ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 2 ⁇ , 25 mM MgS0 4 , 37 L ddH 2 0.
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 ° C for 30 sec, and 68 ° C for 30 sec. After 25 cycles of amplification, incubation was further carried out at 68 ° C for 2 min to end the PCR amplification procedure.
  • the synthesized 155 nucleotide PCR product 2 was identified and recovered on a 1.2% agarose gel.
  • the third round of PCR was synthesized using a 50 ⁇ system: 5 ⁇ 10x KOD buffer, 2 L 2mM dNTPs, ⁇ product 2, 1.5 ⁇ primer 4 (10 ⁇ ), 1.5 ⁇ primer 5 (10 ⁇ ), 0.5 ⁇ KOD plus, 2 ⁇ 25mM MgS0 4 , 37 L ddH 2 0.
  • the synthesis procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 ° C for 30 sec, 68 ° C for 30 sec, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for 2 min to end the PCR amplification procedure. Identification and recovery on a 1.2% agarose gel gave product 3.
  • the product 3 was ligated to the T vector using a T vector kit ( Takara, Cat. D 103 A), and then digested with EcoR I /Xho KNew England Biolabs, Cat. R0101S/R0146V), and the obtained fragment was subjected to 1.2%.
  • the agarose gel was recovered and ligated to the pPIC9K expression vector (Invitrogen, Cat. K1750-01) using T4 ligase (New England Biolabs, Cat. M0202S). The structure is shown in Figure 1.
  • the resulting recombinant expression vector was sequenced by Invitrogen to verify the product 3 comprising the human insulin-30), A (l-21) precursor encoding gene sequence, as follows:
  • 3M sodium acetate expression vector Recombinant human precursor in the above step 5-10 ⁇ ⁇ insulin obtained linearized with Sail (Takata, Cat. D1080a) , then added 1/10 volume of 2 volumes of absolute ethanol . After thorough mixing, place at -20 ° C for 2 hr. The mixture was centrifuged at high speed (13,000 rpm) for 5 min, the supernatant was removed, and the precipitate was washed twice with 75% ethanol. The precipitate was inverted and air-dried, and then dissolved in l( ⁇ L ddH 2 0. The linearized plasmid was mixed with 80 ⁇ electrotransformed competent cells (Pichia GS115, Invitrogen, Cat.
  • 1 X 10 5 cells were plated on YPD plates (0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0 mg/mL) of different concentrations of G418 (GIBCO, Cat. 11811-031), and cultured at 30 ° C for 5 days to form colonies.
  • a total of 30 monoclonal clones were selected from different concentrations and identified by PCR (Polymerase chain reaction).
  • PCR identification of recombinant human insulin B (l-30), AG-21) precursor clone insert The G418-resistant colony was identified by PCR. Place 18 ⁇ L of the bacterial solution in a 1.5 mL centrifuge tube and add 2 lytic enzyme (5 U/L) (Sigma, Cat. L2524) at 30 °C. Incubate for 10 min. The sample was then placed at -80 °C for 10 min for complete lysis. Identification by KOD kit (TOYOBO, Cat.
  • KOD-201) 25 ⁇ PCR system 2.5 ⁇ 10X reaction buffer, 1.5 ⁇ 25 mM MgCl 2 , 2.5 ⁇ 2 mM dNTPs, 1 ⁇ 5 ' A0X1 Primer (10 ⁇ / ⁇ ), 1 ⁇ 3 ' AOX1 primer (10 pmol ⁇ L), O ⁇ KOD polymerase, 15 ⁇ ddH 2 0, 1 ⁇ cell lysate.
  • the mixed system was placed in a PCR instrument (Eppendorf, Model 22331). The amplification procedure was 94 °C for 30 sec, 55 °C for 30 sec, 68 °C for 4 min, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 °C for 10 min to end PCR amplification.
  • the lO L PCR product was identified using a 1.0% agarose gel (Sigma, A9539). The results are shown in Figure 2, and two distinct bands of amplification can be seen. The large band of 2.2 Kb is the AOX gene carried by GS115 itself, and the small band of 635 bp is the inserted foreign gene. Lane 6 in Figure 2 is clone 1001-17. Clone 1001-17 was selected for further use.
  • the single colony of clone No. 1001-17 was cultured in 50 mL of BMGY medium, and cultured at 30 ° C, 250 rpm overnight.
  • the OD 6 (K) value was measured the next day and should be between 2 and 6.
  • the cells were harvested by centrifugation at a low speed (1,500 g) for 5 min at room temperature using a centrifuge (Beckman Coulter) and resuspended in BMMY medium to an OD 6 (K) of 1.0.
  • a total volume of 1/200 of 100% methanol (final concentration of 0.5%) was added to the medium and incubated at 28 ° C, 250 rpm for 72 hr, with a total volume of 1/200 of 100% methanol added per 24 hr.
  • Step 2 Fermentation of recombinant human insulin B (l-30), A (l-21) precursor
  • the glycerol bacteria lmL of the above strains were inserted into lOOmL BMGY medium, and cultured at 30 ° C, 220 r / min (rpm) for 20 hr.
  • the strain After a period of adaptation (10-12hr), the strain enters the exponential growth phase.
  • the stirring speed and ventilation By continuously increasing the stirring speed and ventilation, the DO>30% required for the growth of the cells is satisfied, and the rotation speed is increased by 50-100 rpm each time. Automatically add 25% industrial ammonia to control the pH at the set point.
  • the above fermentation broth was concentrated by conventional ultrafiltration, and purified by SP Sepharose FF (GE, cat. 17-0729-10) and Q Sepharose FF (GE, cat. 17-0510-10).
  • the purified product was analyzed by HPLC (Waters e2695-2489 liquid chromatography, column: phenomenex, Jupiter, C18, 250 x 4.6 mm, 5 ⁇ , 30 ⁇ ) with a purity greater than 90%.
  • HPLC Waters e2695-2489 liquid chromatography, column: phenomenex, Jupiter, C18, 250 x 4.6 mm, 5 ⁇ , 30 ⁇
  • the above purified product was adjusted to pH 9.0 with 50 mM Tris, and digested with trypsin (sigma, Cat. T1426) and CPB (Sigma, C9584). The progress of the reaction was analyzed by HPLC. After the digestion was completed, 1 M HCL was added to adjust the pH to 2 to terminate the reaction. Reversed phase preparation (Jupiter C4, 10 ⁇ , 30 ⁇ , 50 X 250 mm) gave the next two insulin products:
  • Example 2 Preparation of recombinant human insulin B (l-29), A (l-21) Step 1: Cloning and expression of recombinant human insulin B (l-29), A (l-21) precursor
  • B (l-29), A (l-21) were subjected to site-directed mutagenesis by polymerase chain reaction (PCR), and the single-stranded DNA fragment was synthesized by Invitrogen as a site-directed mutagenesis primer sequence as follows:
  • Primer 1 5' CTTCTACACACCCAAGCGTGGCATTGTGGAAC 3* SEQ ID NO.
  • Primer 2 5' GTTCCACAATGCCACGCTTGGGTGTGTAGAAG 3* SEQ ID NO.
  • the site-directed mutagenesis process was carried out using the recombinant vector finally obtained in Example 1 as a template, using a KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 ⁇ L system: 2.5 ⁇ L 10 ⁇ KOD buffer, 2.5 ⁇ L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) ), ⁇ Primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 ⁇ L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , 16 L ddH 2 0.
  • a KOD kit TOYOBO, Cat. KOD-201
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 ° C for 30 sec, 68 ° C l lmin, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for l lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Dpnl NEB, Cat. R0176L
  • the resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • Electroporation of an expression vector of recombinant human insulin B (l-29), A (l-21) precursor The electroporation of the recombinant human insulin precursor expression vector was the same as in Example 1.
  • the G418 selection of recombinant human insulin precursor clones was the same as in Example 1.
  • Step 2 Fermentation of recombinant human insulin B (l-29), A (l-21) precursor
  • the clone fermentation was selected from No. 006-15.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • B(l-27)-K-E-R, A(l-21) was subjected to site-directed mutagenesis by polymerase chain reaction (PCR), and Invitrogen synthesized 2 single-stranded DNA fragments as site-directed mutagenesis primer sequences as follows:
  • SEQ ID NO. 53 Site-directed mutagenesis procedure
  • the recombinant vector finally obtained in Example 1 was used as a template, using KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 ⁇ L system: 2.5 ⁇ L 10 ⁇ KOD buffer, 2.5 ⁇ L 2 mM dNTPs, ⁇ ⁇ Primer 1 (10 ⁇ ), ⁇ Primer 2 ( ⁇ ), 0.5 ⁇ L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , 16 L ddH 2 0.
  • KOD kit TOYOBO, Cat. KOD-201
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 ° C for 30 sec, 68 ° C l lmin, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for l lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Dpnl NEB, Cat. R0176L
  • the resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • Electroporation of an expression vector for recombinant human insulin B (l-27)-K-E-R, A (l-21) precursor same as in Example 1.
  • the clone fermentation was selected from No. 064-6.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • Step 4 Enzymatic digestion and purification of the fermentation product
  • Example 4 Preparation of recombinant human insulin B (l-27)-KE, A(l-21) Step 1: Cloning of recombinant human insulin B (l-27)-KE, A(l-21) precursor and Expression
  • SEQ ID NO. 55 The site-directed mutagenesis process was carried out using the recombinant vector finally obtained in Example 1 as a template, using a KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 ⁇ L system: 2.5 ⁇ L 10 ⁇ KOD buffer, 2.5 ⁇ L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) ), ⁇ Primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , 16 L ddH 2 0.
  • a KOD kit TOYOBO, Cat. KOD-201
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 ° C for 30 sec, 68 ° C l lmin, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for l lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Dpnl NEB, Cat. R0176L
  • the resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • Recombinant human insulin B (l-27)-K-E, A (l-21) precursor clone G418 was screened as in Example 1.
  • Step 3 Separation and purification of the fermentation product The separation and purification of the fermentation product were the same as in Example 1.
  • the product obtained is:
  • B(l-27)-K-P-E, AG-21) was subjected to site-directed mutagenesis by polymerase chain reaction (CPCR). Two single-stranded DNA fragments were synthesized by Invitrogen as site-directed mutagenesis primers.
  • CPCR polymerase chain reaction
  • Primer 1 5' GGTTTCTTTTACACCAAGCCTGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
  • SEQ ID NO. 57 The site-directed mutagenesis process was carried out using the recombinant vector finally obtained in Example 1 as a template, using a KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 ⁇ M system: 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) ), ⁇ Primer 2 ( ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , l6 ⁇ ddH 2 0.
  • a KOD kit TOYOBO, Cat. KOD-201
  • 25 ⁇ M system 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) ), ⁇ Primer 2 ( ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , l6 ⁇ ddH 2 0.
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 ° C for 30 sec, 68 ° C l lmin, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for l lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Dpnl NEB, Cat. R0176L
  • the resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • the G418 of the recombinant human insulin B (l-27)-K-P-E, A (l-21) precursor clone was screened as in Example 1.
  • PCR identification of recombinant human insulin BG-27)-KPE, AG-21) precursor clone insert PCR of recombinant human insulin B (l-27)-KPE, A(l-21) precursor clone insert Identification same as the example
  • Step 2 Fermentation of recombinant human insulin B(l-27)-K-P-E, A(l-21) precursor
  • the molecular weight of LC-MS analysis is 6102, and the theoretical molecular weight is 6102 ( Step 4: Enzymatic digestion and purification of fermentation products)
  • B(l-2)-KB(4-28)-EE, A(21) was subjected to site-directed mutagenesis by polymerase chain reaction (PCR), and a single-stranded DNA fragment was synthesized by Invitrogen as a site-directed mutagenesis primer.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Primer 1 5* GAGAAAAGATTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGG 3*
  • SEQ ID NO. 61 The site-directed mutagenesis process was carried out using the recombinant vector finally obtained in Example 1 as a template, using a KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 ⁇ M system: 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) ), ⁇ Primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , 16 L ddH 2 0.
  • a KOD kit TOYOBO, Cat. KOD-201
  • 25 ⁇ M system 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) ), ⁇ Primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , 16 L ddH 2 0.
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 ° C for 30 sec, 68 ° C l lmin, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for l lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Produced in PCR After directly adding Dpnl (NEB Cat. R0176L) to ⁇ for 1 hour, the cells were transformed with TOP 10 competent cells to obtain the desired plasmid. The resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • Electroporation of expression vector of recombinant human insulin ⁇ (1-2)- ⁇ - ⁇ (4-28)- ⁇ - ⁇ , ⁇ (1-21) precursor recombinant human insulin B02)-K-BC4- 28) -EE, A (21) precursor expression vector electrotransformation with the same example lo
  • the clone fermentation was selected from No. 070-4.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • the separation and purification of the fermentation product were the same as in Example 1.
  • the product obtained is: N SEQ ID NO. 21 ,
  • the molecular weight of LC-MS analysis is 6117, and the theoretical molecular weight is 6117 ( Step 4: Enzymatic digestion and purification of fermentation products)
  • Step 1 Cloning and expression of recombinant human insulin B(l-27)-D-K-E, A(l-21) precursor
  • B(l-27)-D-K-E, AG-21) was subjected to site-directed mutagenesis by polymerase chain reaction (CPCR), and a single-stranded DNA fragment was synthesized by Invitrogen as a site-directed mutagenesis primer.
  • CPCR polymerase chain reaction
  • Primer 1 5' GGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
  • the site-directed mutagenesis process was carried out using the recombinant vector finally obtained in Example 1 as a template, using a KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 ⁇ M system: 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) ), ⁇ Primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , 16 L ddH 2 0.
  • a KOD kit TOYOBO, Cat. KOD-201
  • 25 ⁇ M system 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) ), ⁇ Primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 L KOD plus, 25 mM MgS0 4 , 16 L ddH 2 0.
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 30 sec, 68 ° C l lmin, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for l lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Dpnl NEB, Cat. R0176L
  • the resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • Electroporation of recombinant human insulin B (l-27)-DKE, A (l-21) precursor expression vector recombinant human insulin B (l-27)-DKE, A (l-21) precursor
  • the electroporation of the expression vector was the same as in Example 1.
  • the G418 of the recombinant human insulin B (l-27)-D-K-E, A (l-21) precursor clone was screened as in Example 1.
  • PCR identification of recombinant human insulin B (l-27)-DKE, A (l-21) precursor clone insert recombinant human insulin B (l-27)-DKE, A (l-21) precursor clone PCR identification of the insert is the same as the example
  • the clone fermentation was selected from No. 068-4.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • Step 4 Enzymatic digestion and purification of the fermentation product
  • the site-directed mutagenesis primer used in step 1 the sequence is as follows:
  • Primer 1 5* GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3*
  • SEQ ID NO The site-directed mutagenesis of SEQ ID NO is exemplified by the recombinant vector (SEQ ID N0.38) of B(l-27)-D-K-E, A(l-21).
  • Step 2 Select clone 115-1.
  • the fermentation method was the same as in Example 1.
  • the separation and purification of the fermentation product in the step 3 is the same as in the first embodiment.
  • the product obtained is:
  • the site-directed mutagenesis process uses the KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 L system: 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 ( ⁇ ), primer 2 ( ⁇ ), 0.5 L KOD plus , ⁇ 25mM MgS0 4 , 16 L ddH 2 0.
  • the amplification procedure was 94 °C for 2 min, 94 °C for 30 sec, 55 °C for 30 sec, 68 °C for 1 min, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 °C for 1 lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Dpnl (NEB, Cat. R0176L) was directly added to the PCR product for 1 hour, and then transformed with TOP10 competent cells to obtain a desired plasmid. The resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • the linked recombinant plasmids were sequenced by Invitrogen to obtain human insulin B(l-2)-DB(4-30)-RR, A(l-20)-G and B(l-2)-DB (The gene sequence of 4-30)-R, RA(l-20)-G precursor product is as follows:
  • Recombinant human insulin B(l-2)-DB(4-30)-RR, A(l-20)-G ⁇ B(l-2)-DB(4-30)-R, RA(l-20 PCR identification of the -G precursor clone insert was identical to Example 1.
  • clone No. 073-16 was selected.
  • the clone fermentation was selected from No. 073-16.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • Primer 1 5' CTTTTACACCCCTGAAAGAAGAGGTATCGTTGAG 3'
  • the site-directed mutagenesis process was carried out using the vector obtained in Example 6 as a template, using a KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 ⁇ L system: 2.5 ⁇ L 10 ⁇ KOD buffer, 2.5 ⁇ L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) , ⁇ Primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 ⁇ KOD plus, ⁇ 25 mM MgS0 4 , ddH 2 0.
  • a KOD kit TOYOBO, Cat. KOD-201
  • 25 ⁇ L system 2.5 ⁇ L 10 ⁇ KOD buffer, 2.5 ⁇ L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ) , ⁇ Primer 2 (10 ⁇ ), 0.5 ⁇ KOD plus, ⁇ 25 mM MgS0 4 , ddH 2 0.
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 30 sec, 68 ° C l lmin, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for l lmin to end the PCR amplification procedure.
  • DpnKNEB, Cat. R0176L was directly added to the PCR product, and after digestion for 1 hour, the cells were transformed with TOP10 competent cells to obtain the desired plasmid. The resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis. 2. Sequence analysis results:
  • the electrotransformation of the expression vector of the precursor is the same as in Example 1.
  • the clone fermentation was selected from No. 072-16.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • the human insulin B(l-2)-KB(4-28)-ERR, A(l-21) disulfide bond configuration is: one is A20-B19; the other two are A6, A7, Al 1 Paired with B7 Cys.
  • Example 10 recombinant human insulin B(l-2)-DB(4-29), A(l-21) and ⁇ B(l-2)-DB(4-29), RA(l-21) Preparation step 1: Recombinant human insulin B(l-2)-DB(4-29), A(l-21) and ⁇ B(l-2)-DB(4-29), before RA(1-21) Cloning and expression of the body
  • B(l-2)-DB(4-29), A(l-21) and BB(l-2)-DB(4-29), RA(l-21) precursors were polymerase chain reaction (PCR)
  • the method was carried out by site-directed mutagenesis, and two single-stranded DNA fragments were synthesized by Invitrogen as site-directed mutagenesis primers.
  • the sequences are as follows:
  • Primer 1 5' CTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATG 3'
  • Sequence analysis results Sequence analysis of the ligated recombinant plasmid by Invitrogen gave the encoding human insulin B(l-2)-DB(4-29), A(l-21) and BB(l-2)-DB(4-29) , RA (l-21) precursor product gene sequence, such as
  • Recombinant human insulin B (l-2)-DB (4-29), A (l-21) and BB (l-2)-DB (4-29), RA (l-21) precursor clone insert PCR was identified as in Example 1.
  • clone 087-1 was selected.
  • the clone fermentation was selected in 087-1.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • Step 3 product, digested with Lys-C (Sigma, P3428). Inverted to prepare the following digested product two: human insulin B (l-2)-D-B (4-29), R-A (l-21):
  • Example 11 Preparation of recombinant human insulin B (l-27)-KE, A(l-20)-G Step 1: Cloning and expression of recombinant human insulin B (l-27)-KE, A(l-20)-G precursor
  • the B(l-27)-KE, A(l-20)-G precursor was subjected to site-directed mutagenesis by polymerase chain reaction (PCR), and two single-stranded DNA fragments were synthesized by Invitrogen as site-directed mutagenesis primers. as follows:
  • Primer 1 5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
  • the site-directed mutagenesis process was carried out using the recombinant vector obtained in Example 4 as a template, using a KOD kit.
  • the electroporation of the expression vector was the same as in Example 1.
  • PCR identification of recombinant human insulin BG-27)-KE, A(l-20)-G precursor clone insert recombinant human insulin B (l-27)-KE, A(l-20)-G PCR identification of the somatic clone insert was identical to Example 1. For further use, clone 094-4 was selected.
  • the clone fermentation was selected from No. 094-4.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • Example 12 Preparation of recombinant human insulin B(l-2)-KB(4-28)-EE, A(l-20)-G Step 1: Recombinant human insulin B(l-2)-KB(4- 28)-EE, A(l-20)-G precursor cloning and expression 1.
  • the site-directed mutagenesis process was carried out using the recombinant vector obtained in Example 6 as a template, using a KOD kit (TOYOBO Cat. KOD-201) 25 L system: 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 ( ⁇ ) , Primer 2 ( ⁇ ), 0.5 L KOD plus, ⁇ 25mM MgS0 4 , 16 ⁇ ddH 2 0.
  • the amplification procedure was 94 °C for 2 min, 94 °C for 30 sec, 55 °C for 30 sec, and 68 °C for 1 min.
  • the cells were incubated at 68 °C for 1 lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Dpnl NEB Cat. R0176L
  • TOP10 competent cells TOP10 competent cells to obtain a desired plasmid.
  • the resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • the electrotransformation of the expression vector of the -EE, A(l-20)-G precursor is the same as in Example 1.
  • the clone fermentation was selected from No. 093-15.
  • the fermentation method was the same as in Example 1. Step 3: Separation and purification of the fermentation product
  • the enzyme digestion, preparation, purification methods are the same as in the examples, 1. After optimizing the digestion reaction system, the following digestion products were prepared by reverse phase reaction:
  • Example 13 recombinant human insulin B(l-2)-DB(4-29)-R, A(l-20)-G, B(l-2)-DB(4-29), A(l- 20) Preparation of -G and B(l-2)-DB(4-29), RA(l-20)-G Step 1: Recombinant human insulin B(l-2)-DB(4-29)-R , A(l-20)-G, B(l-2)-DB(4-29), A(l-20)-G and B(l-2)-DB(4-29), RA(l -20) Cloning and expression of the -G precursor
  • Primer 1 5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
  • the site-directed mutagenesis process was carried out using the recombinant vector obtained in Example 10 as a template, using a KOD kit (TOYOBO, Cat. KOD-201) 25 ⁇ M system: 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ), ⁇ primer 2 ( ⁇ ), 0.5 L KOD plus, l ⁇ L 25 mM MgS0 4 , l6 ⁇ ddH 2 0.
  • a KOD kit TOYOBO, Cat. KOD-201
  • 25 ⁇ M system 2.5 L 10x KOD buffer, 2.5 L 2 mM dNTPs, ⁇ primer 1 (10 ⁇ ), ⁇ primer 2 ( ⁇ ), 0.5 L KOD plus, l ⁇ L 25 mM MgS0 4 , l6 ⁇ ddH 2 0.
  • the amplification procedure was 94 ° C for 2 min, 94 ° C for 30 sec, 55 ° C for 30 sec, 68 ° C l lmin, amplification for 25 cycles, and incubation at 68 ° C for l lmin to end the PCR amplification procedure.
  • Dpnl NEB, Cat. R0176L
  • the resulting recombinant expression vector was sent to Invitrogen for vector sequence analysis.
  • the linked recombinant plasmid was sequenced by Invitrogen to obtain human insulin B(l-2)-DB(4-29)-R, A(l-20)-G, B(l-2)-DB ( 4-29), A(l-20)-G and B(l-2)-DB(4-29), RA (l-20)-G precursor product gene sequences are as follows:
  • Recombinant human insulin B(l-2)-DB(4-29)-R, A(l-20)-G, B(l-2)-DB(4-29), A(l-20)-G PCR identification of the B(l-2)-DB(4-29), RA(l-20)-G precursor clone insert was identical to Example 1.
  • clone 096-4 was selected.
  • the clone fermentation was selected from No. 096-4.
  • the fermentation method was the same as in Example 1.
  • Step 3 Separation and purification of the fermentation product
  • the separation and purification of the fermentation product were the same as in Example 1.
  • the product obtained is:
  • the molecular weight of the product obtained by LC-MS analysis was 5,807, which was consistent with a theoretical molecular weight of 5,806.67.
  • the method of digestion, preparation and purification is the same as in Example 1. After optimizing the digestion reaction system, the following digestion products were prepared in reverse phase:
  • the molecular weight of the product obtained by LC-MS analysis was 5651, which was consistent with the theoretical molecular weight of 5,650.48.
  • the product of Step 3 (096-4 fermentation) was digested in the same manner as in Example 10 except that the product was digested. Reversed preparation of the following three products:
  • the hexadecandioic acid (5.0 g, 17.48 mmol) was dissolved in anhydrous methanol (50 mL), cooled to -10 ° C with liquid nitrogen, and then thionously C 20 min, the reaction was slowly warmed to reflux and maintained for 4 hr. The reaction was quenched, and the reaction mixture was cooled to room temperature and evaporated to dryness.
  • Dimethyl hexadecandioate (5.0 g, 15.92 mmol) was dissolved in anhydrous methanol (50 mL), and a solution of methanol dissolved Ba(H) 2 '8H 2 0 (5.0 g, 15.8 mmol) was added dropwise to ten In the dimethyl hexadecandioate, the reaction solution was slowly warmed to 30 ° C and the mixture was stirred for 24 hr.
  • EtOAc EtOAc
  • the monomethyl hexadecanedioate (2.0 g, 6.67 mmol) was dissolved in DCM (50 mL) and then HOSU (0.92 g, 8.0 mmol), after dissolution, DCC (2.06 g, 10 mmol) was added and stirred at room temperature for 24 hr. After filtering the reaction mixture, the organic phase was washed three times with 200 mL of EtOAc EtOAc. EtOAc. .
  • Methylhexadecandioyl-Glu-OMe 0.3 g, 0.677 mmol was dissolved in DCM (20 mL), EtOAc (EtOAc (EtOAc) After use
  • the precursor saponification solution was diluted with acetonitrile to make the organic phase content about 30% (v:v), using a 0.45 ⁇ filter. After filtration, it was purified by RP-HPLC.
  • the reversed phase column was Luna C18, 250 ⁇ 25 mm, 5 ⁇ , ⁇ , mobile phase ⁇ was 0.1% TFA/H 2 O, mobile phase B was 0.1% TFA/ACN, within 60 min.
  • the product was eluted with a gradient of 35% to 65% of a B phase at a flow rate of 20 mL/min, and the target product was collected, and lyophilized to give 3.6 mg (yield: 97.9%).
  • the structure of the obtained product was as follows.
  • H-Glu-OMe (3.4 g, 21.64 mmol) was dissolved in 5 mL of purified water and then added to a solution of 16-hydroxyhexadecanoyl succinimidyl ester in THF (50 mL), and DIEA (2.8 g, 21.64 mmol) Stir at room temperature for 24 hr. The reaction mixture was filtered and concentrated under reduced pressure. EtOAc mjjjjjjjjjjjjjjjjjj Chromatography and concentration gave 2.5 g (45%) of 16-hydroxyhexadecyl-Glu-OMe, ESI-MS: 417 ([M+H] + ). 16-Hydroxyhexadecanoyl-Glu-OMe (1.0 g, 2.4 mmol) was dissolved in DCM (20 mL), EtOAc (EtOAc,EtOAc. Filter, use
  • the above precursor saponification solution was diluted with acetonitrile to make the organic phase content about 30% (v:v), filtered through a 0.45 ⁇ filter, and purified by RP-HPLC, wherein the reverse phase column was Luna C18, 250 ⁇ 25 mm, 5 ⁇ , ⁇ , the mobile phase ⁇ is 0.1% TFA/H 2 0, the mobile phase B is 0.1% TFA/ACN, and the product is eluted with a 35%-65% Phase B gradient at a flow rate of 20 mL/min over 60 min and the target product is collected. The product was freeze-dried to 10 mg (purity: 94.3%).
  • the resulting molecular structure is as follows.
  • B28D-N £B29 -(N a -(HOC(CH 2 ) I 5 CO)-Y-G1U)-B30E human insulin has a molecular weight of 6237.52 as determined by ESI-MS, and a theoretical molecular weight of 6237.17.
  • H-Lys(Fmoc)-OMe (4.33 g, 11.29 mmol) was dissolved in 5 mL of purified water and then added to a solution of methylhexadecandioic acid succinimidyl ester (3.0 g, 7.55 mmol) in THF (50 mL). DIEA ( 1.46 g, 11.29 mmol) was added and stirred at room temperature for 24 hr.
  • Methylhexadecandioyl-Lys(Fmoc)-OMe (5.0 g, 7.52 mmol) was dissolved in THF (80 mL). The organic layer was dissolved in ethyl acetate (100 mL), and then evaporated. After filtration and concentration under reduced pressure, the obtained solid was dissolved with chloroform (lOOmL), then succinic anhydride (11.34 g, 113.4 mmol) and N,N-diisopropylethylamine (14.1 g, 113.4 mmol). . The reaction solution was washed three times with 100 ° C purified water (100 mL), and the organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate for 30 min.
  • Recombinant B(l-27)-DKE, A(l-21) human insulin 50 mg, 8.5 mmol was added to 10 mL of 10 mM HCl and the pH was adjusted to about 10.5 with a 0.2 M NaOH solution.
  • ⁇ ⁇ - (; methylhexadecandioyl)- ⁇ ⁇ -(3-propionyl-OSu) lysine methyl ester (16.4 mg, 25.6 mmol) was dissolved in 10 mL of acetonitrile and added to the above B (l -27)-DKE, A (l-21) The reaction was started in a recombinant human insulin solution, and the reaction process was controlled by RP-HPLC. After 40 min, the pH of the solution was adjusted to about 2.2 with 10% HCl to terminate the reaction to obtain a crude precursor solution.
  • the above crude precursor solution was diluted with water to make the organic phase content about 30% (v:v), filtered through a 0.45 ⁇ filter and purified by RP-HPLC, wherein the reverse phase column was Luna C18, 250 ⁇ 25 mm, 5 ⁇ , ⁇ , mobile phase ⁇ is 0.1% TFA/H 2 0, mobile phase B is 0.1% TFA/ACN, and the product is eluted with a 38%-68% phase B gradient at a flow rate of 20 mL/min over 60 min and the target product is collected.
  • the acetonitrile in the precursor purification solution was concentrated under reduced pressure, and the pH was adjusted to 8.0 with a 10% NaOH solution. Saponification was started by adding 0.2 M NaOH in an equal volume of ice bath, and the saponified product was analyzed by RP-HPLC. After reacting for 50 minutes, 10% was added. HC1 terminates the reaction.
  • the above precursor saponification solution was diluted with acetonitrile to make the organic phase content about 30% (v:v), filtered through a 0.45 ⁇ filter, and purified by RP-HPLC, wherein the reverse phase column was Luna C18, 250 ⁇ 25 mm, 5 ⁇ , ⁇ , the mobile phase ⁇ is 0.1% TFA/H 2 0, the mobile phase B is 0.1% TFA/ACN, and the product is eluted with a 35%-65% Phase B gradient at a flow rate of 20 mL/min over 60 min and the target product is collected. The product was freeze-dried to 4.0 mg (purity: 94.5%).
  • the resulting molecular structure is as follows.
  • Example 17 Preparation of N sB29 -(N a -(HOOC(CH 2 ) 14 CO)fGlu)-Des(B30) Human Insulin (HS060) Recombinant DesCB30) Human Insulin (50 mg, 8.76 mmol) (Example 2 In place of B (l-27)-DKE, A(l-21) (sequence 6) human insulin in Example 14, the remaining method was the same as in Example 14 to prepare ⁇ 29 - (N a -(HOOC (CH 2 )I 4 CO)-Y-Glu)-Des (B30) human insulin.
  • N £B29 -(N a -(HOOC(CH 2 )i 4 CO)-Y-Glu)-Des(B30) human insulin was determined by ESI-MS to have a molecular weight of 6103.9, which is consistent with a theoretical molecular weight of 6103.5.
  • Example 18 Preparation of N sB3 -(N a -(HOOC(CH 2 ) 14 CO)fGlu)-B29E-B30E Human Insulin (HS605) Recombinant B(l-2)-KB(4-28)-EE , A(l-21) human insulin (27.2 mg, 4.65 mmol) (Example 6) Instead of BCl-27)-DKE, A(21) human insulin in Example 14, the remaining method was the same as in Example 14 to prepare N sB3 - (N a -(HOOC(CH 2 ) 14 CO)fGlu)-B29E-B30E human insulin.
  • N sB3 -(N a -(HOOC(CH 2 ) 14 CO)fGlu)-B29E-B30E human insulin has a molecular weight of 6249 as determined by ESI-MS, and a theoretical molecular weight of 6248.23.
  • N a -(HOOC(CH 2 )i 4 CO)-N !: -(OCCH 2 CH 2 CO-(N !:B3 -B29E-B30E human insulin) -Lys-OH has a molecular weight of 6248 as determined by ESI-MS, And the theoretical molecular weight of 6247.4.
  • Example 20 Preparation of N sB3 -(N a -(HOC(CH 2 ) 15 CO)fGlu)-B29E-B30E Human Insulin (HS607 ) Recombinant B(l-2)-KB(4-28)-EE , A(l-21) human insulin (27.2 mg, 4.65 mmol) (Example 6) Instead of B (l-27)-DKE, A(l-21) human insulin in Example 15, the remaining method is the same as in Example 15 Preparation of N sB3 -(N a -(HOC(CH 2 ) 15 CO)fGlu)-B29E-B30E human insulin.
  • N £B3 -(N a -(HOC(CH 2 )i 5 CO)-Y-Glu)-B29E-B30E human insulin has a molecular weight of 6236 as determined by ESI-MS, which is consistent with a theoretical molecular weight of 6234.3.
  • Example 21 Preparation of N £B3 -(N a -(HOOC(CH 2 )i 4 CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21G Human Insulin (HS608) Recombinant B(l-2)-KB (4-28)-EE, A(l-20)-G human insulin (24.3 mg, 4.19 mmol) (Example 12) Instead of B (l-27)-DKE, A (l-21) in Example 14 Human insulin, the same procedure as in Example 14 was carried out to prepare N sB3 -(N a -(HOOC(CH 2 ) 14 CO)fGlu)-B29E-B30E, A21 G human insulin.
  • A21 G human insulin has a molecular weight of 6192.5 as determined by ESI-MS, and a theoretical molecular weight of 6190.5.
  • Example 22 N a -(HOOC(CH 2 )i 4 CO)-N !: -(OCCH 2 CH 2 CO-(N !:B3 -B29E-B30E, A21G human insulin)) -Lys-OH (HS609 Preparation Replacing B (l-27) in Example 16 with recombinant B(l-2)-KB(4-28)-EE, A(l-20)-G human insulin (24.1 mg, 4.16 mmol) (Example 12) )-DKE, A(l-21) human insulin, the other method is the same as in the preparation of ⁇ ⁇ -( ⁇ [( ⁇ 2 ) 14 ⁇ [ ⁇ )- ⁇ ⁇ -( ⁇ [[ ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ -( ⁇ ⁇ 3 - ⁇ 29 ⁇ - ⁇ 30 ⁇ , A21G human insulin)) -Lys-OH.
  • Example 23 Preparation of N £B3 -(N a -(HOC(CH 2 )i 5 CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21G Human Insulin (HS610) Recombinant B(l-2)-KB (4-28)-EE, A(l-20)-G human insulin (24.8 mg, 4.28 mmol) (Example 12) Instead of B (l-27)-DKE, A (l-21) in Example 15 Human insulin, the same procedure as in Example 15 was carried out to prepare N sB3 -(N a -(HOC(CH 2 ) 15 CO)fGlu)-B29E-B30E, A21 G human insulin.
  • A21 G human insulin has a molecular weight of 6177 as determined by ESI-MS, and a theoretical molecular weight of 6176.5.
  • the final reaction product was diluted 10 times with solution A (20 mM Gly H3.0, solution B: 20 mM Gly pH 3.0 1 M NaCl), and then equilibrated with A column for 5 column volumes to start linear gradient elution. It is 0 ⁇ 100% B/20 column volume.
  • the eluted peak was collected and desalted by an ultrafiltration concentrating tube trapped at 10 KD and concentrated to obtain the target product, abbreviated as PEG (20KD)-156.
  • the final reaction product was diluted 10 times with solution A (20 mM Gly pH 3.0, solution B: 20 mM Gly pH 3.0 1 M NaCl), and then equilibrated with A column for 5 column volumes to start linear gradient elution. It is 0 ⁇ 100% B/20 column volume.
  • the eluted peak was collected and desalted by an ultrafiltration concentrating tube retained at 10 KD and concentrated to obtain the target product, PEG (30KD) -156 for short.
  • PEG (30KD) B(l-2)-K-B(4-28)-E-E A(l-21) insulin was prepared in the same manner as in the above step 1, and the target product was obtained, abbreviated as PEG (30KD) -107. It was identified by the method shown in the step 2, and the obtained molecule was reduced by DTT (10 mM), and no change in the A chain was detected, and the hydrophobicity of the B chain was greatly increased. It was confirmed that the modification position was at B3K.
  • the molecular structure of the resulting modified product is as follows:
  • the final reaction product was diluted 10 times with solution A (20 mM Gly pH 3.0, solution B: 20 mM Gly pH 3.0 lM NaCl), and then equilibrated with A column for 5 column volumes to start linear gradient elution.
  • the gradient was 0 to 100% B/20 column volume.
  • the eluted peak was collected and desalted by an ultrafiltration concentrating tube with a 10 KD cut-off and concentrated to obtain the target product, abbreviated as PEG (40KD) -156.
  • PEG (40KD) B(l-2)-K-B(4-28)-E-E, A(l-21) insulin was prepared in the same manner as in the above step 1, and the target product, PEG (40KD)-107, was obtained.
  • the obtained molecule was reduced by DTT (10 mM), and no change in the A chain was detected, and the hydrophobicity of the B chain was greatly increased. It was confirmed that the modification position was at B3K.
  • the molecular structure of the resulting modified product is as follows:
  • Test Example 1 Binding of human insulin analogues to insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGF1-R)
  • the relative binding strength of the human insulin analog of the present invention to the insulin receptor and the insulin-like growth factor-1 receptor is determined by a receptor competitive binding assay.
  • Cell membranes expressing the insulin receptor and insulin-like growth factor-1 receptor were extracted from IM-9 and H19-7 cells (ATCC), respectively. 5 X 10 8 cells were collected, washed with PBS and resuspended in cell lysate (50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl, protease inhibitor (Roche)) to a cell density of 6 X 10 7 cells. /mL, placed on ice. The mixture was treated with an electric homogenizer at 25,000 rpm for 10 sec, treated twice with low speed centrifugation (2000 g, 15 min), and the supernatant was collected.
  • cell lysate 50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 150 mM NaCl, protease inhibitor (Roche)
  • the precipitated fraction was resuspended in an appropriate amount of cell lysate, and the above homogenization step was repeated. Repeat three times and combine the three supernatants.
  • the supernatant was centrifuged at high speed (4 ° C, 35000 rpm, 60 min), the supernatant was removed, and the precipitate was partially resuspended in an appropriate amount of cell lysate to obtain a membrane protein for the experiment.
  • the membrane protein extracted from IM-9 cells is insulin receptor, referred to as IM-9 cell membrane protein;
  • the membrane protein extracted from H19-7 cells is insulin-like growth factor-1 receptor, referred to as H19-7 cell membrane protein, for Protein concentration was quantified by the Bradford method.
  • Table 1 Determination of the binding of insulin and its analogues to insulin receptor (IR) and insulin-like growth factor receptor 1 (IGFl-R)
  • the experimental drug Humulin R (Lilly Egypt, HRE046, 100 IU/mL) was prepared with 0.05 N HC1 to prepare l lU/mL (0.05 mg / kg), and then diluted with 0.9% NaCl to 0, 0.01, 0.02, 0.04, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64 IU/mL solution.
  • the blood glucose level (mmol/L) of each mouse was measured 1 hour after administration.
  • the measured blood glucose values are expressed as a percentage of the blood glucose level before administration.
  • a drug reaction (hypoglycemia) curve was drawn using Graphpad Prism 5 to obtain an ED 5Q value (IU / kg or mg / kg), that is, a subcutaneous injection of the drug required for 50% of the maximum hypoglycemic reaction.
  • Relative activity refers to the activity of each human insulin analog ED 5Q relative to Des(B30)-hI.
  • Des (B30)-hI was used as a control, and Des(B30)-hI was ED 5 for each test. The value is set to 1.
  • SCXK (; Shanghai) 2008-0016, 18-20 g, Serving environment: SPF level.
  • the ICR male rats were taken for 3 days in a laboratory environment at a temperature of 20-25 °C and a humidity of 40-60%. Fasting for 8 hr before the experiment. 100 mg/kg STZ was intraperitoneally injected to complete the rat model of diabetes. After 2 days, the fasting blood glucose level was measured, and the blood glucose was greater than ll.
  • the rats of 1 mmol/1 were diabetic rats. Blood glucose was measured after weighing at the beginning of the experiment (tail cutting, using Roche blood glucose meter and corresponding blood glucose) Test strip detection, the same below), randomly grouped according to the blood sugar level, 43 in each group.
  • the test drug was formulated to the desired concentration, and the blood glucose level of each rat was measured at various time points after subcutaneous injection. Calculate the long-term index IP ( Index of Prolongation ) based on blood glucose values
  • Humulin R Recombinant human insulin injection is a product of Lilly.
  • Detemir injection is a product of Novo Nordisk.
  • test compound is an insulin derivative, that is, an acylated human insulin analog, as follows:
  • Test Example 4 Determination of the binding capacity of PEGylated insulin to insulin receptor (IR) First, the test method is the same as test case 1.
  • PEG (20KD) insulin PEG (20KD) -107 represents PEG (20KD) with a molecular weight of 20KD. B(l-2)-KB(4-28)-EE, A(l-21) insulin; PEG (20KD) -156 represents PEG (20KD) B (l-27)-DKE, A (l-21) insulin. See Example 24 for details.
  • test method is the same as test case 3.
  • PEG (20KD) insulin PEG (20KD) - 107 represents PEG (20KD) with a molecular weight of 20KD. B(l-2)-KB(4-28)-EE, A(l-21) insulin; PEG ( 20KD) -156 indicates PEG (20KD) B (l-27)-DKE, A (l-21) insulin. See Example 24 for details.
  • PEG (30KD) insulin PEG (30KD) -107 means PEG (30KD) B (l-2)-KB (4-28)-EE, A (l-21) insulin; PEG (30KD) - 156 represents PEG (30KD) B (l-27)-DKE, A (l-21) insulin. See Example 25 for details.
  • PEG (40KD) insulin PEG (40KD) -107 means PEG (branched 40KD) B (l-2)-KB (4-28)-EE, A (l-21) insulin; PEG (40KD -156 indicates PEG (branched 40KD) B (l-27)-DKE, A (l-21) insulin. See Example 26 for details.

Abstract

本发明提供一种人胰岛素类似物及其酰化衍生物和生理耐受盐，本发明还提供给了上述胰岛素类似物的制备方法及其作为治疗剂，特别是作为糖尿病治疗剂的用途。

Description

人胰岛素类似物及其酰化衍生物
技术领域
本发明涉及一种人胰岛素类似物及其酰化衍生物，其制备方法及含有该类似物 及其酰化衍生物的药物组合物， 以及其作为治疗剂特别是作为糖尿病治疗剂的用 途。 背景技术
糖尿病 （Diabetes Mellitus, DM)是一种常见的代谢内分泌疾病， 是由于体内 胰岛素绝对或相对缺乏， 或靶组织对胰岛素不敏感而引起的慢性高血糖为特征的 伴随糖、 脂肪和蛋白质代谢紊乱的临床慢性、 全身性代谢综合症。 它由遗传和环 境因素相互作用而引起， 涉及人体各个系统， 包括心脑血管、 肾、 眼、 神经等脏 器并发症， 严重危害人类健康， 是一种终生疾病。
糖尿病已成为一种常见病、 多发病， 是继癌症、 心脑血管病之后， 第三大威 胁人类生命的疾病， 是全人类的挑战， 其对人们生命健康的危害不分种族和国家。 据国际糖尿病联盟（IDF)的统计，上个世纪八十年代中期至九十年代中期十年间， 糖尿病患者总量增长 4倍， 达到 1.2亿。 2007年全球糖尿病患者人数为 2.46亿， 其中 46%为 40-59岁劳动力人口。 预计到 2025年全世界糖尿病患者将增加到 3.8 亿， 占到世界成年人口的 7.1%。
据 ADA (American Diabetes Association, 美国糖尿病联合会） 2011年 1月公 布的数据， 美国已有 2560万糖尿病患者， 占美国人口的 8.3%。在美国庞大的医疗 费用中， 每 10美元中就有一美元为糖尿病支出！ 我国糖尿病患病率近 20年来显 著增加。 流行病学调查显示糖尿病患病率 2002年以前在 4%以下。 近期一项全 国糖尿病流行病学调查结果表明，我国成人（20岁以上）糖尿病患病率超过 10% ! 总体糖尿病患病率为 9.7%。 目前有超过 9200万的糖尿病患者， 另外还有 1 亿 5000人将成为患者， 已超过印度， 成为全球拥有糖尿病患者最多的国家。
糖尿病主要分为胰岛素依赖型糖尿病 （I 型糖尿病）、 非胰岛素依赖性糖尿病 (II 型糖尿病） 以及其他特殊类型糖尿病。 I型糖尿病多为儿童和青少年， 发病高 峰为 12岁， 占总糖尿病患者 10%以内。 II型糖尿病多发于成年人， 占总糖尿病患 者 90%以上。 糖尿病的准确病理机制目前还未知， 尚无根治的办法。 药物治疗及 控制是目前糖尿病治疗的重点。 除了小部分 II型糖尿病病人可以经饮食和运动治 疗控制病情外， 绝大部分病人都需要进行药物治疗。 治疗药物包括中成药和西药。 而西药占主导地位， 主要有两大类药物： 以胰岛素及类似物为代表的蛋白质多肽 类药物和口服小分子抗糖尿病药物。
随着糖尿病全球患者数量急剧增加， 全球糖尿病药物市场规模也急速增长。 据统计， 2005年糖尿病药物市场达到 186亿美元， 较上年增长 11.5%。 2006年为 212亿美元， 增长 14%。 2007年为 241亿美元， 增长 13.7%， 在全球药品市场中排 名第 5位。 预计每年以 15〜20%的速度增长。 据 Research and Markets公司报告显 示胰岛素及其类似物占整个糖尿病药物市场比例达 40.1%， 口服降糖药占 58%，剩 余的 1.9%的市场份额由其他药物占据。
目前已公开了一系列在天然人胰岛素序列的不同位点上有氨基酸取代的胰岛 素类似物的专利申请。 EP0425482B1公开了一种在 B25位上有 His或 Tyr取代的 胰岛素类似物。 EP0419504B1公开了一种在 B3有取代， 同时在 A5或 A15有 Gin 取代， 或在 A18或 A21有 Asn取代的胰岛素类似物。 US5008241A公开了一种在 A21有特定氨基酸取代， 同时在 A4、 A17、 B13或 B21有特定氨基酸取代的胰岛 素类似物。 US5164366A公开了在 B24、 B25、 B26或 B27位其中有一位缺失的胰 岛素类似物。 CN1195777C公开了在 A8、 A9、 A10、 B30上有取代的胰岛素类似 物。 US7193035B2公开了在 B3和至少在 B27、 B28或 B29中的一位有取代的胰岛 素类似物晶型。 CN1780854公开了一种 AO (Arg) A21(Gly)B31(Arg)B32(;Arg)胰岛 素类似物。
尽管如此， 为达到更好的改性效果， 以获得更好的药效， 降低和胰岛素样生 长因子一 (IGF- I ) 受体的结合活性， 提供更多的选择性药物， 仍需更多的改性 胰岛素类似物， 以用于糖尿病治疗。 发明内容
因此， 本发明的目的是为了提供一种新型的具有优良性能的糖尿病治疗药物， 更具体地， 新型的人胰岛素类似物及其酰化衍生物， 以及制备所述类似物及衍生 物的方法， 含有它们的药物组合物， 和所述人胰岛素衍生物在糖尿病治疗中的应 用。
本发明的第一方面提供一种人胰岛素类似生物或其生理耐受盐，包括具有下式 序列的人胰岛素
A链： A0GIVEQ
B链： FVB3QH
Figure imgf000003_0001
FYB27B28B29B30 B31 B32;
其中， A。可以是 R， 也可以缺失； A21可以是 N或 G;
B3可以是 K、 D或 N;
B27可以是 E、 T、 D、 或 K;
B28可以是 E、 D、 P或 K;
B29可以是 E、 K或 P;
B30可以是 K、 R、 E、 T或者缺失； B31、 B32可以是 R或者单个缺失或两者缺失，
其中当所述的 A。缺失， A21是 N， B3是 N时： B31B32缺失， B27B28B29B3()不 是 ΤΡΚΤ、 ΤΚΡΤ或 TDKT;
或者 B3Q B31B32缺失， B27B28B29不是 TPK;
又或者当 A。缺失， 21是 83是 K， Β31Β32缺失时， Β27Β28Β29Β3。不是 ΤΕΚΤ; 又或者当 Α。缺失， A21是 G， B3是 N时， B27B28B29B3。B31B32不是 TPKTR 。 优选地， 其中 B3、 B27-B30位氨基酸残基中只有一个是赖氨酸 （K) 残基。 当 A链的 A。缺失， B链的 B3是 N时： 优选的 B28是 E或 D， B29 E、 K或 P， B3。 R、 E或者缺失， B31、 B32缺失； 更优选的当 B3。 B31B32缺失时， B28B29 是 KE。
当 B链的 B3是 D时： 优选的 B28、 B29是 P或 K， Β3。是 Τ或者缺失， Β31、 Β32是 R或者缺失； 更优选的 B28B29是 PK。
当 Α链的 Α。缺失， B链的 B3是 K时： 优选的 B28、 B29是 P或 E， B3。是 E或 R， B31是 R或者缺失， B32缺失； 更优选的 B28B29是 PE。
本发明所提供的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其中所述的人胰岛素类似 物的序列 A链和 B链以二硫键 （A7-B7, A20-B19) 相连， A链内 A6和 All以二 硫键相连； 所述的序列选自， 但不限于如下所述的序列：
Figure imgf000004_0001
B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPER -R-R, A(l-21)
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN B(l-2)-D-B(4-29),
10 B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK A(l-21)
A链： RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN B(l-2)-D-B(4-29),
11 B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK R-A(l-21)
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG B(l-27)-K-E,
12 B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE A(l-20)-G
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG B(l-2)-K-B(4-28)-E
13 B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE -E, A(l-20)-G
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG B(l-2)-D-B(4-29)-R
14 B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK , A(l-20)-G
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG B(l-2)-D-B(4-29),
15 B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK A(l-20)-G
A链： RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG B(l-2)-D-B(4-29),
16 B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK R-A(l-20)-G
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG B(l-27)-D-K-E,
17 B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE A(l-20)-G
本发明还提供一种上述人胰岛素类似物或其生理耐受盐的优选例， 其中所述 的人胰岛素类似物被 PEG化， 得到本发明的 PEG化胰岛素； 所述的 PEG分子的分 子量为 5-100 KD， 优选 10-80 KD， 更优选 15-45KD, 最优选 20-40KD; 所述的 PEG 分子为支链型或直链型。
本发明还提供一种人胰岛素类似物或其生理耐受盐的制备方法， 包括构建表 达载体， 转化至宿主细胞中的表达， 分离纯化表达前体产物， 用化学或 /和酶方法 从表达前体产物中释放所述胰岛素类似物； 所述的人胰岛素类似物任选进一步被 PEG化， 得到本发明的 PEG化胰岛素， 所述的 PEG化优选为化学酰化修饰方法， 包括酰化试剂的合成， 人胰岛素类似物中氨基的酰化和酰化集团中保护基的脱除。
其中所述的表达前体产物的通式 （I) 为：
A-Rl-B I
其巾：
R2 为 0-5个氨基酸残基肽段，该氨基酸残基肽段由丙氨酸（A)、赖氨酸（K)、 精氨酸 （R) 组成；
Α、 Β分别为所述胰岛素类似物对应的 Α链和 B链。
所述的表达前体产物优选为：
SEQ ID NO. 19， SEQ ID NO. 20，
.YQLENYO SEQ ID NO. 21 , LYQLENYCG SEQ ID NO. 77。 本发明还提供编码所述的胰岛素类似物的表达前体产物的 DNA-序列。
本发明还提供含有所述的 DNA-序列的表达载体。
本发明还提供所述的任一项表达载体转化的宿主细胞。
其中所述的宿主细胞优选为细菌， 更优选为大肠杆菌。
其中所述的宿主细胞也优选为酵母菌， 更优选为毕赤酵母， 或酿酒酵母。 本发明还提供一种胰岛素衍生物，在所述的胰岛素 A和 B-链 N-末端的 (X-氨基 或者在 B3、 B27-B30的赖氨酸 （K) 残基的 ε-氨基处连接了酰化修饰基团， 形成 了酰化胰岛素， 该酰化胰岛素具有如下通式：
S-W-X-Y-Z
其中 S为胰岛素， 或如上述第一方面所述的胰岛素类似物；
-W-X-Y-Z为胰岛素类似物的酰化修饰基团， 其中 W为：
• 具有 -OC(CH2)mCO-的二酰基结构， 其中 m为 2〜10之间整数， 该结构以 其羧酸基团之一和母体胰岛素或其类似物的 A-链或 B-链 N-末端氨基酸残 基的 α-氨基或 Β-链上存在的 Lys残基的 ε-氨基形成酰胺键；
• 侧链上带有羧基的 （X-氨基酸残基或含有侧链上带有羧基的 （X-氨基酸组成 的 2-4肽， 其中该残基或肽与母体胰岛素或其类似物的 Α-链或 Β-链 Ν-末 端氨基酸残基的 α-氨基或 Β-链上存在的 Lys残基的 ε-氨基形成酰胺键连 接；
X为：
• -CO-;
• 含羧酸基团的二氨基化合物， 该化合物以其氨基之一与 W中的羧基形成酰 胺键连接；
a) 当 W为氨基酸残基或 2-4肽时， 上述 X基团通过 -CO-与 W上的氨基形成酰 胺键， 或
b) 当 W为二酰基结构时， 上述 X基团以其氨基基团之一与二酰基结构连接； Y为:
• -A(CH2)m-, 其中 m为 6-32的整数， A为不存在或 CO-;
• 酰基二价烃链，其中含有 1、2或 3个 -CH = CH-基团和足以在链上获得 10-32 个碳原子总数的 -CH2-基团；
• 通式 -B(CH2)VC6H4(;CH2)W-的二价烃链，其中 V和 w为整数或其中一为 0，使 得 V与 w之后在 6-30的范围， B为不存在或 CO-; a) 当 X为 CO-时 A或 B为不存在， 或
b) 当 X为二氨基化合物时 A或 B为 CO-;
Z为：
參 -OH;
參 -NH2;
• -COOH;
Figure imgf000007_0001
• -P03H。
本发明中胰岛素衍生物又一优选例， 其中酰化修饰基团 -W-X-Y-Z与母体胰岛 素 B3、 B27-B30的赖氨酸 （K) 残基的 ε-氨基连接。
本发明中胰岛素衍生物又一优选例， 其中酰化修饰基团 -W-X-Y-Z与母体胰岛 素 Α和 B-链 N-末端 α-氨基连接。
本发明中胰岛素衍生物又一优选例， 其中 S为胰岛素类似物， 选自以下组：
Α链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l
B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID N0.9
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2
B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16 本发明中胰岛素衍生物又一优选例， 其中酰化修饰基团 -W-X-Y-Z优选自下组
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu;
Na-(HO(CH2)i5CO)-Y-Glu;
Να-(ΗΟΟ〔(〔Η2)14〔0)-Νε-(3-酰基丙酸 *)-Lys
(*处为胰岛素连接点）。
本发明中胰岛素衍生物又一优选例， 其选自下组中：
Β28Ο-ΝεΒ29-(Ν°-(ΗΟ(Χ(〔Η2)14〔Ο)-Υ-Ο ι)-Β30Ε人胰岛素 （代号： HS061); Β28Ο-ΝεΒ29-(Ν°-(ΗΟ(〔Η2)15〔Ο)-Υ-ΟΚι)-Β30Ε人胰岛素 （代号： HS062); N a -(HOOC(CH2)i4CO)-N ' -(OCCH2CH2CO-(B28D-N ' B29-B30E 人胰 岛 素)) -Lys-OH (代号： HS067);
ΝεΒ3-(Ν°-(ΗΟ(Χ(〔Η2)14〔Ο)-Υ-Ο ι)-Β29Ε-Β30Ε人胰岛素 （代号： HS605); Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E人胰岛素)) -Lys-OH (代号： HS606); Νε Β3-(Ν°-(Η(Χ (〔Η2)15〔Ο)- Υ -Ο ι)-Β29Ε-Β30Ε人胰岛素 （代号： HS607); N e B3-(N a -(HOOC(CH2)i4CO)- Y -Glu)-B29E-B30E, A21G 人胰岛素 （代号： HS608);
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E, A21G 人胰 岛 素)) -Lys-OH (代号： HS609);
N ' B3-(N a -(HOC(CH2)i5CO)- Y -Glu)-B29E-B30E, A21G 人胰岛素 (代号: HS610) o
本发明还提供药物制剂， 其含有本发明所述的的胰岛素类似物和 /或其生理耐 受盐， 或含有如前所述的胰岛素衍生物。
其中所述的药物制剂， 含有溶解的、 非晶型的和 /或结晶形式的胰岛素类似物 和 /或其生理耐受盐。
其中所述的药物制剂， 含有长效佐剂， 所述的和长效佐剂与药物以共结晶的 方式存在。
本发明还提供具有胰岛素活性的可注射的溶液， 其含有溶解形式的上述的药 物制剂。
本发明还提供所述的胰岛素类似物和 /或其生理耐受盐， 或含有如前所述的胰 岛素衍生物， 在制备治疗 Π型糖尿病、 高血糖症、 肥胖症或胰岛素抵抗症的药物 中的用途。
本发明还提供所述的胰岛素类似物和 /或其生理耐受盐在制备速效和 /或长效 的具有胰岛素活性的药物制剂中的用途。
本发明提供了新型的重组人胰岛素类似物， 具有良好的改性效果， 更好的药 物活性， 为临床提供更多的选择性药物， 用于糖尿病治疗。
术语 本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如 J.biol.chem, 243, p3558(1968)中所述。
在 DNA序列中， A为腺嘌呤， C为胞嘧啶， G为鸟嘌呤， T为胸腺嘧啶。
"人胰岛素类似物"是指人胰岛素中的一个或多个氨基酸残基已被删除和 /或 被其他氨基酸残基替换的人胰岛素， 或包含附加氨基酸残基， 即 51个氨基酸残基 以上的人胰岛素。
"胰岛素衍生物"， 在本发明中指在胰岛素 A和 B-链 N-末端的 (X-氨基或者在 B3、 B27-B30的赖氨酸残基的 ε-氨基处连接了酰化修饰基团， 形成了酰化胰岛素， 该酰化胰岛素具有如下通式： S-W-X-Y-Z; 其中各代码定义如说明书中所定义。
"PEG化胰岛素"， 指被 PEG化的人胰岛素类似物； 所述的 PEG分子的分子 量为 5-100 KD， 优选 10-80 KD， 更优选 15-45KD, 最优选 20-40KD; 所述的 PEG 分子为支链型或直链型； 本发明中 PEG (20KD)化胰岛素表示与每个人胰岛素类 似物亚基结合的 PEG分子量为 20KD; PEG (30KD) 化胰岛素表示与每个人胰岛 素类似物亚基结合的 PEG分子量为 30KD; PEG (分支型 40KD)化胰岛素表示与 每个人胰岛素类似物亚基结合的 PEG是分子量为 40KD的支链型 PEG。
"长效佐剂"指硫酸鱼精蛋白。
"速效的具有胰岛素活性的药物制剂"指具有速效胰岛素活性的人胰岛素类似 物或其生理耐受盐的制剂。
"长效的具有胰岛素活性的药物制剂"指具有长效胰岛素活性的人胰岛素类似 物或其生理耐受盐的制剂。
本发明的序列设计基于天然人胰岛素的蛋白质氨基酸序列。 全长由 A和 B链 两条链组成。 A和 B链以二硫键连接， A链内还有一个二硫键， 共 3个二硫键， 均以连线标出。 每条链上的氨基酸序号按如下规则命名： 如 A链 1-21位氨基酸分 别标为 Al， A2, A3......。 B链 1-30位氨基酸分别标为 Bl， B2， B3......。 此夕卜， 如果在 A和 B链的 N端添加氨基酸的话，其标记分别为 A0， A ( -l )， A ( -2) ......，
B ( 0)， B ( -1 )， B ( -2) ......等。 如果在 A和 B链的 C端添加氨基酸的话， 其标 记分别为 A22, A23 , ......， B31 , B32......等。 在具体表示人胰岛素衍生物通式 时， 确定的氨基酸用氨基酸代码表示， 有不确定替代或删除的位置用该位的氨基 酸序号表示， 如本发明的人胰岛素类似物通式所示。
本发明实施例中， 所用的 B ( 1-29) 是指人胰岛素 B1到 B29縮短的 B链， B ( 1-30) 是指人胰岛素 B1到 B30的 B链， B ( 1-31 ) 是指人胰岛素 B1到 B31的 B链， B ( 1-32) 是指人胰岛素 B1到 B32的 B链； A ( 1-21 ) 是指人胰岛素的 A 链， A ( 0-21 ) 是指在 AO位加一个氨基酸残基的人胰岛素 A链。 根据本发明的具 体实施例， 在人胰岛素分子中的取代残基是用参照于人胰岛素的氨基酸序号表示 的。 例如， B(l-2)-D-B(4-30)， A(l-21 )人胰岛素指一个在 B链 3位上 N被 D所取 代的人胰岛素类似物。序列简写 B(l-30)， AG-21)指天然人胰岛素； B(l-29)， A(l-21) 是指 B30位缺失的人胰岛素； B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， Α(1-21)是指 Β3位为 Κ所取 代， Β29Β30为 EE所取代的重组人胰岛素 （实施例六） ， 除非另外加以说明。 此 夕卜， 与人胰岛素一样， B链和 A链是由 A ( 7) Cys和 B ( 7) Cys之间的二硫键， A (20) Cys和 B ( 19) Cys之间的二硫键联结起来的。 同时 A链含有 A ( 6) Cys 和 A ( 11 ) Cys间的内二硫键。
本发明中所述的用重组 DNA转化宿主细胞的步骤可用本领域技术人员熟知的 常规技术进行。 获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的 多肽。 根据所用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适 于宿主细胞生长的条件下进行培养。 从表达前体产物中释放所述胰岛素类似物的 化学和 /或酶方法可用本领域技术人员熟知的常规技术进行， 比如胰蛋白酶、 羧肽 酶8、 赖氨酸内肽酶 C等。 附图说明
图 1、 重组人胰岛素 B(1-30)，A(1-21)前体的克隆方法示意图。 图 2、 重组人胰岛素 B(1-30)，A(1-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定电泳图。 图 3、 HS061和 HS060体内长效活性检测结果比较。
图 4、 HS062和 HS060体内长效活性检测结果比较。
图 5、 HS067和 HS060体内长效活性检测结果比较。
图 6、 PEG (20kD)化 B(l-27)-D-K-E， A(l-21) (PEG(20kD)-156)和 PEG(20kD) 化 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21) (PEG(20kD)-107) 胰岛素体内长效活性检测 结果。
图 7、 PEG(30kD 107 -> PEG(40kD)- 107、 PEGi30kD}-156. PEG(40kD)^156 体内长效活性检测结果。 具体实施方式
以下结合实施例进一步描述解释本发明， 但这些实施例并非意味着限制本发 明的范围。
本发明中所用部分试剂配方如下：
YPD培养液 （1L) ( 1%酵母粉， 2%蛋白胨， 2%葡萄糖）：
1、 将 10g酵母粉， 20g蛋白胨溶于 900mL水中；
2、 高压蒸气灭菌 20min;
3、 加入 lOOmL无菌的 20%的葡萄糖。
基本葡萄糖培养基 （1L) ( 1.34%YNB; 4 X 10— 5% 生物素； 2%葡萄糖）： 1、 800mL水高压蒸气灭菌 20min， （如配制平板， 可在灭菌前， 加入 15〜20g 的琼脂）；
2、 冷却至 60°C， 随后加入：
lOOmL无菌的 10X YNB; 2mL无菌的 0.02%的生物素和 lOOmL无菌的 20% 的葡萄糖。
BMMY液体培养基 （1L):
1、 将 10g酵母粉、 20g蛋白胨溶于 700mL水中；
2、 高压蒸气灭菌 20min;
3、 冷却至室温， 随后加入以下物质混匀：
lOOmL无菌的 1M磷酸钾缓冲液 pH6.0， lOOmL无菌的 10X YNB, 2mL无菌 的 0.02% 生物素， lOOmL无菌的 5% 甲醇。
诱导表达培养基 （1L) (BMGY):
1、 将 10g酵母粉、 20g蛋白胨溶于 700mL水中；
2、 高压蒸气灭菌 20min;
3、 冷却至室温， 随后加入以下物质混匀：
lOOmL无菌的 1M磷酸钾缓冲液 pH6.0， lOOmL无菌的 10X YNB, 2mL无菌 的 0.02% 生物素， lOOmL无菌的 10%甘油。 本发明实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如 Sambrook等人， 分子克隆： 实验室手册 (New York: cold spring harbor laboratory press, 1989) 中所述的条件， 毕赤酵母表达实验手册 （版本： 10 April 2009) ， 或 按照商品制造厂商所建议的条件。 未注明具体来源的试剂， 为市场购买的常规试 剂。 本发明下述实施例中提及的分子量的单位均为道尔顿 （Dalton) 。 实施例
实施例 1、 重组人胰岛素 B(1-30)，A(1-21)和 B(1-29)，R-A(1-21)的制备 步骤 1： 重组人胰岛素 B(l-30)， A(l-21)前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素 B(l-30)， A(l-21)前体的表达载体的构建：
重组人胰岛素 B(l-30)， A(l-21)前体编码基因用聚合酶链反应 （PCR)的方法进 行 3轮合成，由 Invitrogen公司合成 5段单链 DNA片段作为 PCR引物，序列如下： 引物 1 :
3 SEQ ID NO. 45 引物 2:
SEQ ID NO. 46 引物 3 :
SEQ ID NO. 47 引物 4:
SEQ ID NO. 48 引物
3 SEQ ID NO. 49。
第 1轮 PCR的合成用 KOD试剂盒（TOYOBO, Cat. KOD-201 50μ 体系： 5 L lOx KOD缓冲液， 2μΙ 2mM dNTPs, 1.5 L引物 1 (10μΜ)， 1.5 L引物 2 (10μΜ)， 0.5 L KOD plus, 2 \, 25mM MgS04, 38 L ddH20。 扩增程序为 94 °C 2min, 94 °C 30sec, 55 V 30sec， 68 °C 30sec，扩增 25个循环后，再 68°C孵育 2min以结束 PCR 扩增程序。 合成的 85个核苷酸 PCR产物 1用 1.2%琼脂糖凝胶鉴定并回收。
第 2轮 PCR的合成用 50μ 体系： 5μ 10x KOD缓冲液，2 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^ 产物 1， 1.5μ 引物 3 (10μΜ)， 1.5μ 引物 4 (10μΜ)， 0.5 L KOD plus, 2 \, 25mM MgS04，37 L ddH20。扩增程序为 94°C 2min, 94°C 30sec, 55 °C 30sec, 68°C 30sec, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 2min以结束 PCR扩增程序。合成的 155个核苷酸 的 PCR产物 2用 1.2%琼脂糖凝胶鉴定并回收。
第 3轮 PCR的合成用 50μ 体系： 5μ 10x KOD缓冲液，2 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^ 产物 2， 1.5μ 引物 4 (10μΜ)， 1.5μ 引物 5 (10μΜ)， 0.5μΙ KOD plus, 2μΙ 25mM MgS04，37 L ddH20。合成程序为 94°C 2min, 94°C 30sec, 55°C 30sec, 68°C 30sec, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 2min以结束 PCR扩增程序。 用 1.2%琼脂糖凝胶 鉴定并回收， 得到产物 3。
产物 3用 T载体试剂盒（ Takara, Cat. D 103 A)连接到 T载体上，再用 EcoR I /Xho KNew England Biolabs, Cat. R0101S/R0146V)进行双酶切，得到的目的片段经 1.2% 琼脂糖凝胶回收，用 T4连接酶 （New England Biolabs, Cat.M0202S)连接到 pPIC9K 表达载体 （Invitrogen, Cat. K1750-01 )上。 结构如图 1所示。
所得到的重组表达载体由 Invitrogen 公司作序列分析， 验证包含人胰岛素 -30)， A(l-21)前体编码基因序列的产物 3， 序列如下：
Figure imgf000012_0001
CAACTAG SEQ ID NO. 32。
2、 重组人胰岛素 B(l-30)， A(l-21)前体表达载体的转化：
将 5-10μ§的上述步骤中得到的重组人胰岛素前体的表达载体用 Sail (Takata, Cat. D1080a)进行线性化， 再加入 1/10体积的 3M醋酸钠， 2倍体积的无水乙醇。 充分混合后， 放置于 -20°C， 2hr。 混合物高速离心 （13，000rpm) 5min， 去处上清， 用 75%乙醇清洗沉淀 2次。将沉淀倒置晾干后， 用 l(^L ddH20溶解。将线性化的 质粒与 80μ 电转化感受态细胞 （毕赤酵母 GS115, Invitrogen, Cat. K1750-01 ) 混 合转入电转化杯（Bio Rad, Cat. 1652086)中，并置冰浴 5min。将电转化仪（Bio Rad Micropulser) 参数设至 2 kV， 25Ω， 200 uF, 进行电转化。 结束后迅速加入 1 mL 冰浴的 D-Sorbitol (生工生物工程有限公司） 混合， 将 100-30(^L 混合物涂布于 MD培养板上， 30°C培养 3d至形成菌落。
3、 重组人胰岛素前体克隆的 G418筛选：
用 3mL YPD 培养液洗脱 MD 培养板上的菌落， 重悬， 并用分光光度仪 (Beckman, DU800 )测定重悬的细胞浓度（ 1 OD6QQ = 5 X 107个 cell/mL) 。将 1 X 105个细胞涂在不同浓度 G418 (GIBCO, Cat. 11811-031 ) 的 YPD培养板上 (0.25、 0.5、 1.0、 2.0、 4.0 mg/mL) ， 30°C培养 5d至形成菌落。 从不同浓度上挑选单克隆 共 30个， 进行重组片段 PCR (Polymerase chain reaction) 鉴定。
4、 重组人胰岛素 B(l-30)， AG -21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定： 利用 PCR方法对 G418抗性的菌落进行插入片段的鉴定。 将 18 μL菌液放置 于 1.5mL离心管内， 并加入 2 溶胞酶 （5 U/ L) ( Sigma, Cat. L2524) ， 30°C 孵育 10min。 然后将样品放置于 -80°C lOmin 进行完全裂解。 用 KOD 试剂盒 ( TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μ PCR体系进行鉴定： 2.5 μ 10X反应缓冲液， 1.5 μΐ 25 mM MgCl2， 2.5 μΐ 2mM dNTPs, 1 μΐ 5 ' A0X1 引物 （10 ρτηοΐ/μΐ), 1 μ 3 ' AOX1 引物 （10 pmol^L), O^ KOD聚合酶， 15 μ ddH20， 1 μ 细胞裂解液。 将混合体系放置于 PCR仪（Eppendorf, 22331型）中，扩增程序为 94 °C 30sec， 55 °C 30sec， 68°C4min, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 lOmin以结束 PCR扩增程序。 取 lO L PCR产物用 1.0%琼脂糖凝胶（Sigma, A9539)进行鉴定。 结果见图 2， 可 以看见 2条明显的扩增条带。 2.2 Kb的大条带为 GS115自身所带的 AOX基因， 635 bp的小条带为插入的外源基因。 图 2中泳道 6为克隆 1001-17号。 为进一步的使 用选择了克隆 1001-17号。
5、 重组人胰岛素 B(l-30)， A(l-21)前体的表达和鉴定：
将克隆 1001-17号单菌落于 50mL BMGY培养基， 30°C、 250 rpm培养过夜。 第二天检测 OD6(K)值， 应处于 2-6之间。 于室温用离心机（Beckman Coulter)低速 ( l，500g) 离心 5min收集细胞， 并用 BMMY培养基重悬至 OD6(K)为 1.0。 在培养 基中加入 1/200总体积的 100%甲醇 （终浓度为 0.5%) ， 并于 28°C、 250 rpm培养 72hr, 其中每 24hr补加 1/200总体积的 100%甲醇。 诱导结束后， 用离心机低速 ( l,500g) 离心并收集上清。 SDS-PAGE (Invitrogen, Cat. No. 456- 1083 ) 电泳结 果表明 1001-17号表达了前体蛋白， 挑选其进行下一步发酵。 步骤 2： 重组人胰岛素 B(l-30)， A(l-21)前体的发酵
1、 菌种： 1001-17号表达菌株。
2、 5L发酵罐发酵操作流程：
2.1菌种活化与培养：
取上述菌种的甘油菌 lmL接入 lOOmL BMGY培养基中， 30 °C， 220r/min(rpm) 培养 20hr。
2.2接种：
接种量为 5%， 并加入 0.4%已消毒好的 PTM1溶液。 开始发酵。
2.3初始发酵培养阶段：
菌种经过一段适应期 （10-12hr) 后进入指数生长期， 通过不断加大搅拌转速 和通气量满足菌体生长所需的 DO>30%，转速每次调高 50-100rpm。 自动流加 25% 工业氨水将 pH控制在设定值。
2.4甘油补料生长阶段：
初始培养基中底物消耗完 （18-24hr) 后， 开始流加 50 %甘油， 并且使之处于 限制性速率。
2.5甲醇诱导阶段： 甘油过渡相菌体生长 4〜6h后， 停止补甘油， 维持饥饿状态 30min， 让甘油彻 底耗尽， 然后补入甲醇开始诱导。 96hr后停止发酵下罐。 步骤 3 : 发酵产物分离纯化
取上述发酵液常规超滤浓縮后， 过 SP Sepharose FF(GE, cat.17-0729- 10)和 Q Sepharose FF (GE, cat.17-0510-10)层析柱纯化。 纯化产物用 HPLC分析 （Waters e2695-2489液相仪，色谱柱： phenomenex, Jupiter, C18, 250 x 4.6 mm, 5μηι, 30θΑ)， 纯度大于 90%。 所得表达前体产物：
SEQ ID NO. 22
LC-MS (液相质谱） 分析分子量为： 6074， 和理论分子量 6074—致。 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
上述纯化产物用 50mM Tris调节 pH 至 pH9.0，用胰蛋白酶（sigma, Cat.T1426) 和 CPB(Sigma， C9584) 酶切。 HPLC分析反应进程。 待酶切完全后， 加入 1M HCL 调节 pH至 2以终止反应。反相制备 （Jupiter C4, 10 μηι, 30θΑ, 50 X 250 mm)得以 下两个胰岛素产物：
产物一， 重组人胰岛素 B(1-30)，A(1-21) (简称 hi) ：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT , SEQ ID NO. 5
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5807， 和理论分子量 5807.7—致。 产物二， 重组人胰岛素 B(l-29)， R-A(l-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO. 78
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 4
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5863， 和理论分子量 5862.7—致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
分别取上述制备好的产物一和二， 用 GluC (Sigma，P6181) 37°C 酶切反应 4h。 反应完成后加入 lM HC1 2ul终止反应， LC-MS分析产物。 结果如下：
人胰岛素 B(l-30)， A(l-21) 二硫键结构分析结果：
Figure imgf000014_0001
上述结果证实重组人胰岛素 B(l-30)， A(l-21)二硫键构型为： 一个是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al l和 B7位 Cys两两配对而成。
人胰岛素 B(l-29)， R-A(l-21)二硫键结构分析结果:
Figure imgf000015_0002
上述结果证实重组人胰岛素 B(l-29)， R-A(l-21)二硫键构型为：
A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 2、 重组人胰岛素 B(l-29)， A(l-21)的制备 步骤 1： 重组人胰岛素 B(l-29)， A(l-21)前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素 B(1-29)，A(1-21)前体的表达载体的构建：
B(l-29), A(l-21)用聚合酶链反应 （PCR)的方法进行定点突变完成， 由 Invitrogen公司合成 2单链 DNA片段作为定点突变引物序列如下：
引物 1 : 5' CTTCTACACACCCAAGCGTGGCATTGTGGAAC 3* SEQ ID NO.
50
引物 2: 5' GTTCCACAATGCCACGCTTGGGTGTGTAGAAG 3* SEQ ID NO.
51
定点突变过程以实施例 1 最终获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒 ( TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μL体系： 2.5μL 10x KOD缓冲液， 2.5μL 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， ΙμΙ^引物 2 (10μΜ), 0.5μL KOD plus, 25mM MgS04， 16 L ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产 物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOP10感受态细胞 转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 B(l-29)，
A(l-
Figure imgf000015_0001
CAACTAG SEQ ID NO. 33 ο 3、 重组人胰岛素 B(l-29)， A(l-21)前体的表达载体的电转化： 重组人胰岛素前体表达载体的电转化同实施例 1。
4、 重组人胰岛素 B(l-29)， A(l-21)前体克隆的 G418筛选：
重组人胰岛素前体克隆的 G418筛选同实施例 1。
5、 重组人胰岛素前体克隆插入片段的 PCR鉴定：
重组人胰岛素前体克隆插入片段的 PCR鉴定同实施例 1。 为进一步的使用选 择了克隆 006-15号。
6、 重组人胰岛素 B(l-29)， A(l-21)前体的表达和鉴定：
重组人胰岛素前体的表达鉴定同实施例 1。 结果表明 006-15号克隆表达了目 的蛋白， 挑选其进行以下发酵。 步骤 2： 重组人胰岛素 B(l-29)， A(l-21)前体的发酵
选 006-15号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3 : 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得表达前体产物:
SEQ ID NO. 23 <
LC-MS分析分子量为： 5844.7， 理论分子量为 5846.2( 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 1。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物：
重组人胰岛素 B(l-29)， A(l-21) (简称 Des(B30)-hI) ：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO. 78
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5578， 和理论分子量 5578—致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-29)， A(l-21) 二硫键结构分析结果:
Figure imgf000016_0001
IV RGFFYTPK 1015 1015 上述结果证实人胰岛素 B(l-29)， A(l-21)二硫键构型为： 一个是 A20-B19; 另 外两个由 A6、 A7、 Al l和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 3、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21)的制备 步骤 1： 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21)前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21)前体的表达载体的构建：
B(l-27)-K-E-R, A(l-21)用聚合酶链反应 (PCR)的方法进行定点突变完成， Invitrogen公司合成 2单链 DNA片段作为定点突变引物序列如下：
Figure imgf000017_0001
SEQ ID NO. 53 定点突变过程以实施例 1 最终获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒 (TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μL体系： 2.5μL 10x KOD缓冲液， 2.5μL 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， ΙμΙ^引物 2 (ΙΟμΜ), 0.5μL KOD plus, 25mM MgS04， 16 L ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产 物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOP10感受态细胞 转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 -27)-K-E-R, A(l-21)前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000017_0002
CAACTAA SEQ ID NO. 34。
3、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21)前体的表达载体的电转化： 同实施例 1。
4、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21)前体克隆的 G418筛选：
同实施例 1。
5、 重组人胰岛素 BG-27)-K-E-R， Α(1-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定： 方法同实施例 1。 为进一步的使用， 选择了克隆 064-6号。
6、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21)前体的表达和鉴定： 方法同实施例 1， 结果表明 064-6号克隆表达了目的蛋白。 挑选其进行发酵。 步骤 2 : 重组人胰岛素前体的发酵
选 064-6号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3 : 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKEIL
步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
上述纯化产物用 50mM Tris调节 pH至 pH9.0，用胰蛋白酶（sigma, Cat. T1426 ) 酶切。 HPLC分析反应进程。 待酶切完全后， 加入 1M HC1调节 pH至 2以终止反 应。 反相制备 CJupiter C4， 10 μηι，30θΑ，50 X 250 mm)得以下酶切产物：
人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKER, SEQ ID NO. 6
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5894， 和理论分子量 5894.7—致。 步骤 5 : 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21) 二硫键结构分析结果:
Figure imgf000018_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-27)-K-E-R， A(l-21)二硫键构型为：
A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 4、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)的制备 步骤 1： 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素前体的表达载体的构建： B(l-27)-K-E, AG-21)用聚合酶链反应 CPCR)的方法进行定点突变完成， 由 Invitrogen公司合成 2单链 DNA片段作为定点突变引物， 序列如下： 引物 1 : 5' GGTTTCTTTTACACCAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO. 54 引物 2： 5* CAACGATACCTCTTTTTTCCTTGGTGTAAAAGAAACC 3*
SEQ ID NO. 55。 定点突变过程以实施例 1 最终获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒 (TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μL体系： 2.5μL 10x KOD缓冲液， 2.5μL 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， ΙμΙ^引物 2 (10μΜ)， 0.5 L KOD plus, 25mM MgS04， 16 L ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产 物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOP10感受态细胞 转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 -27)-K-E, A(l-21)前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000019_0001
AA SEQ ID N0.35。
3、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)前体的表达载体的电转化：
重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)前体的表达载体的电转化同实施例 1。 4、 重组人胰岛素 B027)-K-E， A( 21)前体克隆的 G418筛选：
重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)前体克隆 G418筛选同实施例 1。
5、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定： 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定同实施例 1。 为进一步的使用， 选择了克隆 062-6号。
6、 重组人胰岛素 Β(1-27)-Κ-Ε，Α(1-21)前体的表达和鉴定：
重组人胰岛素前体的表达鉴定同实施例 1， 结果表明 062-6号克隆表达了预期 蛋白， 挑选其进行以下发酵。 步骤 2 : 重组人胰岛素前体的发酵
选 062-6号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3 : 发酵产物分离纯化 发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为:
N SEQ ID NO. 25 <
LC-MS分析分子量为： 6004.91， 理论分子量为 6006.3 < 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 1。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物：
人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID NO. 7
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5738.54， 和理论分子量 5738.8—致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)二硫键结构分析结果:
Figure imgf000020_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-21)二硫键构型为： 一个是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al l和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 5、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)的制备 步骤 1 : 重组人胰岛素 Β(1-27)-Κ-Ρ-Ε，Α(1-21) 前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体的表达载体的构建：
B(l-27)-K-P-E, AG-21)用聚合酶链反应 CPCR)的方法进行定点突变完成， 由 Invitrogen公司合成 2条单链 DNA片段作为定点突变引物， 序列如下：
引物 1 : 5' GGTTTCTTTTACACCAAGCCTGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID NO. 56 引物 2: 5* CAACGATACCTCTTTTTTCAGGCTTGGTGTAAAAGAAACC 3*
SEQ ID NO. 57 ο 定点突变过程以实施例 1 最终获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒 ( TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μΐ体系： 2.5 L 10x KOD缓冲液， 2.5 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， ΙμΙ^引物 2 (ΙΟμΜ), 0.5 L KOD plus, 25mM MgS04， l6μ ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产 物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOPIO感受态细胞 转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 -27)-K-P-E, A(l-21)前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000021_0001
CTAA SEQ ID NO. 36
3、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体的表达载体的电转化： 重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体质粒的电转化同实施例 1。
4、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体克隆的 G418筛选：
重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体克隆的 G418筛选同实施例 1。
5、 重组人胰岛素 BG-27)-K-P-E， AG-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定： 重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定同实施例
1。 为进一步的使用选择了克隆 61-5号。
6、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体的表达和鉴定：
重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体的表达鉴定同实施例 1， 结果表明 061-5号表达了预期的蛋白， 挑选其进行以下发酵。 步骤 2： 重组人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)前体的发酵
选 061-5号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3 : 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为:
N SEQ ID NO. 26
LC-MS分析分子量为 6102， 和理论分子量 6102—致 ( 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 1。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物： 人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPE, SEQ ID NO. 8
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. 1。 LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5835， 和理论分子量 5835.7—致。 步骤 5 : 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)二硫键结构分析结果:
Figure imgf000022_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-27)-K-P-E， A(l-21)二硫键构型为： 一个是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 6、 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)的制备 步骤 1： 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)前体的克隆和表达 1、 重组人胰岛素前体的表达载体的构建：
B(l-2)-K-B(4-28)-E-E, A( 21)用聚合酶链反应 (PCR)的方法进行定点突变完 成， 由 Invitrogen公司合成单链 DNA片段作为定点突变引物， 序列如下：
引物 1： 5* GAGAAAAGATTCGTCAAGCAGCACTTGTGTGG 3*
SEQ ID NO. 58 引物 2: 5* CCACACAAGTGCTGCTTGACGAATCTTTTCTC 3*
SEQ ID NO. 59 引物 3 : 5* GTTTCTTTTACACCCCTGAAGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3*
SEQ ID NO. 60 引物 4: 5* CAACGATACCTCTTTTTTCTTCAGGGGTGTAAAAGAAAC 3*
SEQ ID NO. 61。 定点突变过程以实施例 1 最终获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒 ( TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μΐ体系： 2.5 L 10x KOD缓冲液， 2.5 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， ΙμΙ^引物 2 (10μΜ), 0.5 L KOD plus, 25mM MgS04， 16 L ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产 物中直接加入 Dpnl (NEB Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOP 10感受态细胞转 化， 得到目的质粒。 所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 -2)-K-B(4-28)-E-E, A(l-21 )前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000023_0001
CTAA SEQ ID N0.37。
3、 重组人胰岛素 Β(1-2)-Κ-Β(4-28)-Ε-Ε，Α(1-21)前体的表达载体的电转化： 重组人胰岛素 B02)-K-BC4-28)-E-E， A( 21)前体的表达载体电转化同实施例 l o
4、 重组人胰岛素 B02)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)前体克隆的 G418筛选： 重组人胰岛素 B02)-K-BC4-28)-E-E， A( 21)前体克隆的 G418筛选同实施例 1。
5、 重组人胰岛素 B02)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴 定：
重组人胰岛素 B02)-K-BC4-28)-E-E， A( 21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定同 实施例 1。 为进一步的使用选择了 070-4号克隆。
6、 重组人胰岛素 Β(1-2)-Κ-Β(4-28)-Ε-Ε，Α(1-21)前体的表达和鉴定： 重组人胰岛素 B02)-K-BC4-28)-E-E， A( 21)前体的表达鉴定同实施例 1。结果 表明 070-4号表达了预期蛋白。 挑选其进行以下发酵。 步骤 2： 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)前体的发酵
选 070-4号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3 : 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为: N SEQ ID NO. 21 ,
LC-MS分析分子量为 6117， 和理论分子量 6117—致 ( 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 1。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物：
人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21):
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE, SEQ ID N0.9 GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5850， 和理论分子量 5850.7—致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21) 二硫键结构分析结果:
Figure imgf000024_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)二硫键构型为： 一个是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 7、重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21) 禾卩 B(l-27)-D-K-E, A(l-20)-G 的制备 一、 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)的制备
步骤 1： 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素前体的表达载体的构建：
B(l-27)-D-K-E, AG-21)用聚合酶链反应 CPCR)的方法进行定点突变完成， 由 Invitrogen公司合成单链 DNA片段作为定点突变引物， 序列如下：
引物 1 : 5' GGTTTCTTTTACACCGATAAGGAAAAAAGAGGTATCGTTG 3'
SEQ ID N0.62 引物 2: 5* CAACGATACCTCTTTTTTCCTTATCGGTGTAAAAGAAACC 3*
SEQ ID N0.63。 定点突变过程以实施例 1 最终获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒 (TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μΐ体系： 2.5 L 10x KOD缓冲液， 2.5 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， ΙμΙ^引物 2 (10μΜ), 0.5 L KOD plus, 25mM MgS04， 16 L ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec, 55 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产 物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOP10感受态细胞 转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果： 由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 -27)-D-K-E, A(l-21)前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000025_0001
3、 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体的表达载体的电转化： 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体的表达载体的电转化同实施例 1。
4、 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体克隆的 G418筛选：
重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体克隆的 G418筛选同实施例 1。
5、 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定： 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定同实施例
1。 为进一步的使用， 选择了克隆 068-4号。
6、 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体的表达和鉴定：
重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体的表达鉴定同实施例 1。 结果表明 068-4号表达了预期蛋白。 挑选其进行以下发酵。 步骤 2: 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)前体的发酵
选 068-4号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3: 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为：
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKEK
步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 1。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物：
人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21):
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE, SEQ ID NO.10
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5853.6， 和理论分子量 5853—致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)二硫键结构分析结果: 片段号 肽段 ： LC- MS分子量 理论分子量
I GIVE 417.2 416.47
QCCTSICSLYQLE
II 2968.8 2969.39
FVNQHLCGSHLVE
NYCN
III 1378.3 1377.55 ALYLVCGE
IV RGFFYTDKE 1162.6 1162.27 上述结果证实人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)二硫键构型为：
A20-B19; 另外两个由 A6， A7, Al l和 B7位 Cys两两配对而成。 二、 重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-20)-G的制备
重复重组人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)的制备步骤 1到步骤 3， 不同之处 在于所用引物及模板：
1、 步骤 1中所用的定点突变引物， 序列如下：
引物 1： 5* GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3*
SEQ ID N0.66 引物 2: 5* CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3*
SEQ ID N0 定点突变过程以 B(l-27)-D-K-E，A(l-21)的重组载体 (SEQ ID N0.38)为模版。
2、 步骤 2选 115-1号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。
3、 步骤 3中发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为：
CG SEQ ID N0
4、 步骤 4中发酵产物的酶切、 制备、 纯化方法同实施例 1。 优化酶切反应体 系后， 反相制备得以下酶切产物：
人胰岛素 B(l-27)-D-K-E， A(l-20)-G:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE, SEQ ID NO.10
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
5、 步骤 5中酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1， 证实本实施例得到的 产物构型正确。 实 施例 8 、 重 组 人胰 岛 素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G 和
B(l-2)-D-B(4-30)-R, R-A(l-20)-G 的制备 步骤 1 :重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-30)-R， R-A(l-20)-G前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素前体的表达载体的构建： B(l-2)-D-B(4-30)-R-R, A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-30)-R， R-A(l-20)-G前体用聚 合酶链反应 (PCR)的方法进行定点突变完成， 由 Invitrogen公司合成 4条单链 DNA 片段作为定点突变引物， 序列如下： 3*
SEQ ID N0.64
3*
SEQ ID N0.65 引物 3: 5* GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3*
SEQ ID N0.66 引物 4: 5* CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3*
SEQ ID N0.67。 定点突变过程采用 KOD试剂盒（TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 L体系： 2.5 L 10x KOD缓冲液， 2.5 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (ΙΟμΜ), 引物 2 (ΙΟμΜ), 0.5 L KOD plus, ΙμΙ^ 25mM MgS04， 16 L ddH20。 扩增程序为 94 °C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec， 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr 后，用 TOP10感受态细胞转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen 公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R, A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-30)-R， R-A(l-20)-G前体产物的基 因序列如下：
Figure imgf000027_0001
TTAA SEQ ID N0.39。
3、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G 禾卩 B(l-2)-D-B(4-30)-R R-A(l-20)-G前体的表达载体的电转化：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G 禾卩 B(l-2)-D-B(4-30)-R R-A(l-20)-G前体的表达载体的电转化同实施例 1。
4、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G 禾卩 B(l-2)-D-B(4-30)-R R-A(l-20)-G前体克隆的 G418筛选：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G 禾卩 B(l-2)-D-B(4-30)-R
R-AO20)-G前体克隆的 G418筛选同实施例 1。 5、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G 禾卩 B(l-2)-D-B(4-30)-R, R-A(l-20)-G前体克隆插入片段的 PCR鉴定：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G 禾卩 B(l-2)-D-B(4-30)-R, R-A(l-20)-G前体克隆插入片段的 PCR鉴定同实施例 1。 为进一步的使用， 选择了 克隆 073-16号。
6、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-30)-R， R-A(l-20)-G前体的表达和鉴定：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G 禾卩 B(l-2)-D-B(4-30)-R, R-A(l-20)-G前体的表达鉴定同实施例 1。结果表明 073-16号克隆表达了预期蛋白。 挑选其进行以下发酵。 步骤 2: 重组人胰岛素前体的发酵
选 073-16号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3: 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为：
Figure imgf000028_0001
LC-MS分析分子量为 6046.3， 和理论分子量 6045.96 —致。 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 3。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物：
产物一： 人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR, SEQ ID NO.11
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2o LC-MS分析结果所得产物的分子量为 6064.8， 和理论分子 6063.96一致。 产物二： 人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R， R-A(l-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR, SEQ ID NO.12
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.3。 LC-MS分析结果所得产物的分子量为 6064.8， 和理论分子 6063.96 一致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 BO2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G二硫键结构分析结果:
Figure imgf000028_0002
QCCTSICSLYQLE
II FVNQHLCGSHLV 2970.3 2969.39
E YCG
III 1377 1377.55
ALYLVCGE
IV RGFFYTPKTR 1428.0 1428.6 上述结果证实人月夷岛素 B(l-2)-D-B(4-30)-R-R， A(l-20)-G二硫键构型为： ― 是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。
人胰岛素 BO2)-D-B(4-30)-R， R-A(l-20)-G二硫键结构分析结果:
Figure imgf000029_0001
是 A20-B19; 另外两个由 A6， A7, Al l和 B7位 Cys两两配对而成 ; 实施例 9、 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)的制备 步骤 1： 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)前体的克隆和表达 1、 重组人胰岛素前体的表达载体的构建：
B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(l-21) 前体用聚合酶链反应 (PCR)的方法进行定点 突变完成， 由 Invitrogen公司合成 2条单链 DNA片段作为定点突变引物， 序列如 下：
引物 1 : 5' CTTTTACACCCCTGAAAGAAGAGGTATCGTTGAG 3'
SEQ ID N0.68 引物 2: 5* CTCAACGATACCTCTTCTTTCAGGGGTGTAAAAG 3*
SEQ ID N0.69。 定点突变过程以实施例 6所获得的载体为模版，采用 KOD试剂盒（TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μL体系： 2.5μL 10x KOD缓冲液， 2.5μL 2mM dNTPs, ΙμΙ^引 物 1 (10μΜ)， ΙμΙ引物 2 (10μΜ)，0.5μ KOD plus, ΙμΙ^ 25mM MgS04， ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec， 55 30sec， 68 °C l lmin,扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。在 PCR产物中直接加入 DpnKNEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOP10感受态细胞转化， 得到目的质粒。 所得到的 重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。 2、 序列分析结果:
由 Invitrogen公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素
-2)-K-B(4-28)-E-R-R, A(l-21 )前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000030_0001
3、 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)前体的表达载体的电转化： 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21) 前体的表达载体的电转化同 实施例 1。
4、 重组人胰岛素 B02)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)前体克隆的 G418筛选： 重组人胰岛素 B02)-K-BC4-28)-E-R-R， A( 21)前体克隆的 G418筛选同实施 例 1。
5、 重组人胰岛素 B02)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)前体克隆插入片段的 PCR 鉴定：
重组人胰岛素 B02)-K-BC4-28)-E-R-R， A( 21)前体克隆插入片段的 PCR鉴定 同实施例 1。 为进一步的使用， 选择了克隆 072-16号。
6、 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)前体的表达和鉴定： 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)前体的表达鉴定同实施例 1。结 果表明 072-16号表达了预期蛋白。 挑选其进行以下发酵。 步骤 2: 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)前体的发酵
选 072-16号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3: 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为：
Figure imgf000030_0002
LC-MS分析分子量为 6015.1， 和理论分子量 6015.93—致。 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 3。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物：
人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21):
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERR, SEQ ID NO.13
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 6064.8， 和理论分子量 6063.96 —致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21) 二硫键结构分析结果:
Figure imgf000031_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-R-R， A(l-21)二硫键构型为： 一个 是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 10、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21) 禾卩 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21) 的制备 步骤 1 : 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21) 禾卩 B(l-2)-D-B(4-29), R-A( 1 -21 )前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素前体的表达载体的构建：
B(l-2)-D-B(4-29), A(l-21) 禾 B B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21)前体用聚合酶链反 应 (PCR)的方法进行定点突变完成，由 Invitrogen公司合成 2条单链 DNA片段作为 定点突变引物， 序列如下：
引物 1 : 5' CTTTTACACCCCTAAGAGAGGTATCGTTGAGCAATG 3'
SEQ ID NO.70 引物 2: 5* CATTGCTCAACGATACCTCTCTTAGGGGTGTAAAAG 3*
SEQ ID N0.71 o 定点突变过程采用 KOD试剂盒（TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 L体系： 2.5 L 10x KOD缓冲液， 2.5 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， 引物 2 (ΙΟμΜ), 0.5 L KOD plus, ΙμΙ^ 25mM MgS04， 16 L ddH20。 扩增程序为 94 °C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec， 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。在 PCR产物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ消化 lhr 后，用 TOP10感受态细胞转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen 公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果： 由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-21) 禾 B B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21)前体产物的基因序列如
Figure imgf000032_0001
SEQ ID N0.41 o
3、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21) 禾卩 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21) 前体的表达载体的电转化：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21)禾 B B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21)前体 的表达载体的电转化同实施例 1。
4、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21) 禾卩 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21) 前体克隆的 G418筛选：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21)禾 B B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21)前体 克隆的 G418筛选同实施例 1。
5、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21) 禾卩 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21) 前体克隆插入片段的 PCR鉴定：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21)禾 B B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21)前体 克隆插入片段的 PCR鉴定同实施例 1。 为进一步的使用， 选择了克隆 087-1号。
6、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21) 禾卩 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21) 前体的表达和鉴定：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21)禾 B B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-21)前体 的表达鉴定方法同实施例 1。 结果表明该 087-1号克隆表达了预期蛋白。 挑选其进 行以下发酵。 步骤 2: 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21)禾卩 B(l-2)-D-B(4-29):
R-A(l-21)前体的发酵
选 087-1号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3: 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为：
Figure imgf000032_0002
LC-MS分析分子量为 5846.2， 和理论分子量 5845.74—致。 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化 酶切、 制备、 纯化方法同实施例 3。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物一： 人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21):
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.14
GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.1。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5707.53， 和理论分子量 5708—致。 步骤 3产物， 用 Lys-C ( Sigma, P3428) 酶切。 反相制备得以下酶切产物二： 人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-21):
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.14
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID N0.4。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5864.5， 和理论分子量 5863.72—致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21)二硫键结构分析结果:
Figure imgf000033_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-21)二硫键构型为:
A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。
人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-21)二硫键结构分析结果：
Figure imgf000033_0002
上述结果证实人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-21)二硫键构型为:
A20-B19; 另外两个由 A6， A7, Al l和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 11、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E，A(l-20)-G的制备 步骤 1 : 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E，A(l-20)-G前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素前体的表达载体的构建：
B(l-27)-K-E, A(l-20)-G前体用聚合酶链反应 (PCR)的方法进行定点突变完成， 由 Invitrogen公司合成 2条单链 DNA片段作为定点突变引物， 序列如下：
引物 1 : 5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID N0.72 引物 2: 5* CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3*
SEQ ID N0.73。 定点突变过程以实施例 4 所获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒
( TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μΐ体系： 2.5 L 10x KOD缓冲液， 2.5 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， ΙμΙ^引物 2 (ΙΟμΜ), 0.5 L KOD plus, 25mM MgS04， 16 L ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产 物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOP10感受态细胞 转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 B(l-27)-K-E, A(l-20)-G前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000034_0001
AAGAATTCCCTAG SEQ ID N0.42。
3、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-20)-G前体的表达载体的电转化： 重组人胰岛素 B027)-K-E， A(l-20)-G前体的表达载体的电转化同实施例 1。
4、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-20)-G前体克隆的 G418筛选：
重组人胰岛素 B027)-K-E， A(l-20)-G前体克隆的 G418筛选同实施例 1。
5、 重组人胰岛素 BG-27)-K-E， A(l-20)-G前体克隆插入片段的 PCR鉴定： 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-20)-G前体克隆插入片段的 PCR鉴定同实施例 1。 为进一步的使用， 选择了克隆 094-4号。
6、 重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-20)-G前体的表达和鉴定：
重组人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-20)-G前体的表达鉴定同实施例 1。 结果表明 094-4号表达了预期蛋白。 挑选其进行以下发酵。 步骤 2: 重组人胰岛素前体的发酵
选 094-4号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3: 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得 B027)-K-E， A(l-20)-G前体产物为:
SEQ ID NO.30。
LC-MS分析分子量为 5948， 和理论分子量 5947.85—致。 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 1。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物：
人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-20)-G:
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE, SEQ ID NO.15
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5681， 和理论分子量 5681.49—致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-20)-G二硫键结构分析结果:
Figure imgf000035_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-27)-K-E， A(l-20)-G 二硫键构型为:
A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 12、 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E，A(l-20)-G的制备 步骤 1 : 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E，A(l-20)-G前体的克隆和表达 1、 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-20)-G前体的表达载体的构建： B(l-2)-K-B(4-28)-E-E, A(l-20)-G前体用聚合酶链反应 (PCR)的方法进行定点突 变完成， 由 Invitrogen公司合成 2条单链 DNA片段作为定点突变引物，序列如下： 引物 1 : 5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID N0.74 引物 2: 5* CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3*
SEQ ID N0.75。 定点突变过程以实施例 6 所获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒 (TOYOBO Cat. KOD-201 )25 L体系：2.5 L 10x KOD缓冲液，2.5 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (ΙΟμΜ), 引物 2 (ΙΟμΜ), 0.5 L KOD plus, ΙμΙ^ 25mM MgS04， 16μΙ^ ddH20。 扩增程序为 94 °C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25 个循环后，再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。在 PCR产物中直接加入 Dpnl (NEB Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后，用 TOP10感受态细胞转化，得到目的质粒。 所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 -2)-K-B(4-28)-E-E, A(l-20)-G前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000036_0001
GGTTAAGAATTCCCTAGG
SEQ ID N0.43。
3、 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-20)-G前体的表达载体的电转化： 重组人胰岛素 B02)-K-BC4-28)-E-E， A(l-20)-G前体的表达载体的电转化同实 施例 1。
4、 重组人胰岛素 Β(1-2)-Κ-Β(4-28)-Ε-Ε， A(l-20)-G前体克隆的 G418筛选： 重组人胰岛素 B02)-K-BC4-28)-E-E， A(l-20)-G前体克隆的 G418筛选同实施 例 1。
5、 重组人胰岛素 Β(1-2)-Κ-Β(4-28)-Ε-Ε， A(l-20)-G前体克隆插入片段的 PCR 鉴定：
重组人胰岛素 B(l -2)-K-BC4-28)-E-E， A(l-20)-G前体克隆插入片段的 PCR鉴定 同实施例 1。 为进一步的使用， 选择了克隆 093-15号。
6、 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-20)-G前体的表达和鉴定： 重组人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-20)-G前体的表达鉴定同实施例 1。 结果表明 093-15号表达了预期蛋白。 挑选其进行以下发酵。 步骤 2: 重组人胰岛素前体的发酵
选 093-15号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3: 发酵产物分离纯化
发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为:
G SEQ ID NO. 20
LC-MS分析分子量为 6060， 和理论分子量 6060—致 ( 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例， 1。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物：
人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-20)-G:
FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE, SEQ ID NO.16
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID NO.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5793， 和理论分子量 5793.6—致。 步骤 5 : 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-20)-G二硫键结构分析结果:
Figure imgf000037_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-20)-G二硫键构型为： 一个 是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 Al 1和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 13、 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-20)-G的制备 步骤 1 : 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-20)-G前体的克隆和表达
1、 重组人胰岛素前体的表达载体的构建：
B(l-2)-D-B(4-29)-R, A(l-20)-G 、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G 和 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-20)-G前体用聚合酶链反应 (PCR)的方法进行定点突变完 成， 由 Invitrogen公司合成 2条单链 DNA片段作为定点突变引物， 序列如下： 引物 1 : 5' GTTGGAAAACTACTGCGGTTAAGAATTCCCTAGG 3'
SEQ ID N0.76 引物 2: 5* CCTAGGGAATTCTTAACCGCAGTAGTTTTCCAAC 3*
SEQ ID N0.67。 定点突变过程以实施例 10 所获得的重组载体为模版， 采用 KOD 试剂盒 ( TOYOBO, Cat. KOD-201 ) 25 μΐ体系： 2.5 L 10x KOD缓冲液， 2.5 L 2mM dNTPs, ΙμΙ^引物 1 (10μΜ)， ΙμΙ^引物 2 (ΙΟμΜ), 0.5 L KOD plus, lμL 25mM MgS04， l6μ ddH20。 扩增程序为 94°C 2min, 94 °C 30sec, 55 °C 30sec, 68 °C l lmin, 扩增 25个循环后， 再 68°C孵育 l lmin以结束 PCR扩增程序。 在 PCR产 物中直接加入 Dpnl (NEB, Cat. R0176L) ΙμΙ^消化 lhr后， 用 TOPIO感受态细胞 转化，得到目的质粒。所得到的重组表达载体送 Invitrogen公司进行载体序列分析。
2、 序列分析结果：
由 Invitrogen 公司对连接的重组质粒作序列分析， 得到编码人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R, A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-20)-G前体产物的基因序列如下：
Figure imgf000038_0001
AATTCCCTAGG SEQ ID N0.44。
3、重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G 和 B02)-D-B(4-29)， R-A(l-20)-G前体的表达载体的电转化：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-20)-G前体的表达载体的电转化同实施例 1。
4、重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G 禾口 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-20)-G前体克隆的 G418筛选：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G和
B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-20)-G前体克隆的 G418筛选同实施例 1。
5、重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G 和 B02)-D-B(4-29)， R-A(l-20)-G前体克隆插入片段的 PCR鉴定：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-20)-G前体克隆插入片段的 PCR鉴定同实施例 1。 为进一 步的使用， 选择了克隆 096-4号。
6、重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G 和 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-20)-G前体的表达和鉴定：
重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-29), R-A(l-20)-G前体的表达鉴定同实施例 1。结果表明 096-4号表达 了预期蛋白。 挑选其进行以下发酵。 步骤 2: 重组人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G、 B(l-2)-D-B(4-29), A(l-20)-G和 B(l-2)-D-B(4-29)， R-A(l-20)-G前体的发酵
选 096-4号克隆发酵。 发酵方法同实施例 1。 步骤 3 : 发酵产物分离纯化 发酵产物的分离纯化同实施例 1。 所得产物为:
SEQ ID N0.31 ,
LC-MS分析分子量为 5789， 和理论分子量 5788.67—致 ( 步骤 4: 发酵产物的酶切制备、 纯化
酶切、 制备、 纯化方法同实施例 3。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物一：
人胰岛素 B( 1 -2)-D-B(4-29)-R, A(l-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK , SEQ ID NO.17
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5807， 和理论分子量 5806.67—致。 酶切、 制备、 纯化方法同实施例 1。 优化酶切反应体系后， 反相制备得以下酶 切产物二：
人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-20)-G:
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.18
GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5651， 和理论分子量 5650.48 —致。 步骤 3 (096-4发酵）产物， 用与实施例 10酶切产物二相同的方法酶切。 反相制 备得以下酶切产物三：
人胰岛素8( 1 -2)-D-B(4-29), R-A( 1 -20)-G：
FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK, SEQ ID NO.18
RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.3。
LC-MS分析结果所得产物的分子量为 5807， 和理论分子量 5806.7—致。 步骤 5: 酶切产物二硫键结构分析
酶切产物二硫键结构分析方法同实施例 1。
人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G二硫键结构分析结果:
Figure imgf000039_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G二硫键构型为： 一个是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 All和 B7位 Cys两两配对而成。
人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)， A(l-20)-G二硫键结构分析结果:
Figure imgf000040_0001
上述结果证实人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G二硫键构型为： 一个是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 All和 B7位 Cys两两配对而成。
人胰岛素 B( 1 -2)-D-B(4-29)， R-AG -20)-G二硫键结构分析结果:
Figure imgf000040_0002
上述结果证实人胰岛素 B(l-2)-D-B(4-29)-R， A(l-20)-G二硫键构型为： 一个是 A20-B19; 另外两个由 A6、 A7、 All和 B7位 Cys两两配对而成。 实施例 14、 B28D-N£B29-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-B30E人胰岛素 （
HS061 ) 的制备
1、 甲基十六烷二酰基 -GluCOSu)-OMe的制备
将十六烷二酸（5.0g， 17.48mmol)溶于无水甲醇（50mL)，用液氮冷却至 -10°C 后滴加二氯亚砜 （3.2mL， 43.7mmol)， 保持 -10°C 20min, 将反应液慢慢升温至回 流并保持 4hr。 停止反应， 将反应液冷却至室温后浓縮蒸干， 得 5.15g (94%) 十六 烷二酸二甲酯。
将十六烷二酸二甲酯 （5.0g， 15.92mmol) 溶于无水甲醇 （50mL)， 将甲醇溶 解的 Ba( H)2'8H20 (5.0g， 15.8mmol)溶液滴加到十六烷二酸二甲酯中， 将反应液 慢慢升温至 30°C并将该混合物搅拌 24hr。减压浓縮除去甲醇后将残余物溶于乙酸乙 酯并用 0.1M HC1洗涤三次， 收集有机相并用无水硫酸钠干燥， 过滤并减压浓縮， 真空干燥得 4.55g (收率 95%) 十六烷二酸单甲酯。
将十六烷二酸单甲酯（ 2.0g， 6.67mmol)溶于 DCM ( 50mL )后加入 HOSu ( 0.92g， 8.0mmol)， 溶解后加入 DCC (2.06g， lOmmol) 室温搅拌 24hr。 将反应液过滤后用 200mL O.IM HC1洗有机相三次，用无水硫酸钠干燥有机相，过滤并减压浓縮得 2.45g (92%) 甲基十六烷二酸琥珀酰亚胺酯。
用 5mL纯化水溶解 H-Glu-OMe ( 0.81g， 5.04mmol) 后加入到甲基十六烷二酸 琥珀酰亚胺酯（1.0g，2.52mmol)的 THF(50mL)溶液中，加入 DIEA(0.65g，5.04mmol) 室温搅拌 24hr。 过滤反应液并减压浓縮， 用乙酸乙酯溶解残余物后用 200mL O.IM HC1洗涤有机相三次， 收集有机相并用无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压浓縮后进行反 相高效液相色谱纯化， 浓縮后得 0.7g (63%) 甲基十六烷二酰 -Glu-OMe, ESI-MS: 444.3 ( [M+H]+)。
将甲基十六烷二酰 -Glu-OMe (0.3g， 0.677mmol)溶于 DCM (20mL),加入 HOSu ( 85.7mg， 0.745mmol)和 DCC (0.167g, 0.812mmol)后室温搅拌 24hr， 过滤后用
O.IM HC1洗涤并收集有机相， 加入无水硫酸钠干燥， 过滤后减压浓縮， 真空干燥
Figure imgf000041_0001
2、 B28D-NsB29-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B30E人胰岛素前体的制备 取重组 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素（50mg， 8.5mmol) (实施例 7)加入 10mL 10mM HC1溶解后用 0.2M NaOH溶液将其 pH调节至约 10.5。 将甲基十六烷二酰基 -Glu(OSu)-OMe ( 13.9mg, 25.6mmol)溶于 10mL乙腈后加入到上述 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素溶液中开始反应，采用 RP-HPLC对反应过程进行中控。 40min后用 10% HC1将溶液 pH调节至约 2.2终止反应得前体粗品溶液。
3、 B28D-NsB29-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B30E人胰岛素前体的纯化 将上述前体粗品溶液加入水稀释使有机相含量约 30% (v:v), 用 0.45μηι滤膜过 滤后采用 RP-HPLC对其进行纯化，其中反相柱为 Luna C18， 250x25mm, 5μηι， ΙΟθΑ, 流动相 Α为 0.1%TFA/H20， 流动相 B为 0.1%TFA/ACN， 在 60min内用 38%-68%的 B 相梯度以 20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物得前体纯化液， ESI-MS: 1570.8 ( [M+4H]4+)。
4、 B28D-NsB29-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B30E人胰岛素前体的皂化 减压浓縮除去前体纯化液中乙腈后用 10%NaOH溶液将其 pH调节至 8.0，加入等 体积冰浴的 0.2M NaOH开始皂化， 采用 RP-HPLC分析皂化产物， 反应 50min后加入 10%HC1终止反应。
5、 B28D-NsB29-(Na-(HOOC(CH2)14COh-Glu)-B30E人胰岛素前体皂化溶液的纯 化及冻干
将上述前体皂化溶液加入乙腈稀释使有机相含量约 30% (v:v), 用 0.45μηι滤膜 过滤后采用 RP-HPLC对其进行纯化， 其中反相柱为 Luna C18， 250x25mm, 5μηι， ΙΟΟΑ,流动相 Α为 0.1%TFA/H2O，流动相 B为 0.1%TFA/ACN，在 60min内用 35%-65% 的 B相梯度以 20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物， 冻干得产物 3.6mg (纯度 97.9%)。 所得产物的结构如下。
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-He-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
Figure imgf000042_0001
6、 B28D-NsB29-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B30E人胰岛素结构确证
B28D-NsB29-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B30E人胰岛素采用 ESI-MS测定分 ：为 6251.65， 和理论分子量 6251.16—致。
B28D-NsB29-(Na-(HOOC(CH2)14COh-Glu)-B30E人胰岛素用胰蛋白酶解， 酶解 产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 4865和 1403， 与 理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F2对应被修饰的 B-链片段。 证明修饰位点和 预期一致。 实施例 15、 B28D-NsB29-(Na-(HO(CH2)15CO)fGlu)-B30E人胰岛素（HS062)的 制备
1、 16-羟基十六酰基 -Glu(OSu)-OMe的制备
将 16-羟基十六烷酸（3.0g， 11.03mmol)溶于 DCM (50mL)后加入 0-(N-琥珀 酰亚胺 )-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯和 N，N-二异丙基乙胺 （1.71g， 13.2mmol), 室 温搅拌反应 24hr。过滤反应液，用 0.1M HC1洗涤有机相三次后用无水硫酸钠干燥有 机相， 减压浓縮得 3.5g (70%) 16-羟基十六烷酰琥珀酰亚胺基酯。
用 5mL纯化水溶解 H-Glu-OMe (3.4g， 21.64mmol) 后加入到 16-羟基十六烷酰 琥珀酰亚胺基酯的 THF ( 50mL) 溶液中， 加入 DIEA (2.8g， 21.64mmol) 室温搅 拌 24hr。 过滤反应液并用减压浓縮， 用乙酸乙酯溶解残余物后用 200mL 0.1M HC1 洗涤有机相三次， 收集有机相并用无水硫酸钠干燥， 过滤， 减压浓縮后进行反相 高效液相色谱纯化， 浓縮后得 2.5g (45%) 16-羟基十六酰基 -Glu-OMe， ESI-MS: 417 ( [M+H]+)。 将 16-羟基十六酰基 -Glu-OMe ( 1.0g， 2.4mmol)溶于 DCM (20mL)，加入 HOSu (0.305g， 2.65mmol)和 EDC HC1 (0.69g， 3.61mmol)后室温搅拌 24hr。 过滤， 用
0.1M HCl洗涤并收集有机相， 加入无水硫酸钠干燥， 过滤后减压浓縮， 真空干燥 得 0.9g (73%) 16-羟基十六酰基 -Glu(OSu)-OMe。 其结构式如下。
Figure imgf000043_0001
2、 B28D-NsB29-(Na-(HO(CH2)15CO)fGlu)-B30E人胰岛素前体的制备 取重组 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素 （50mg， 8.5mmol) 加入 lOmL 10mM HCl溶解后用 0.2M NaOH溶液将其 pH调节至约 10.5。 将 16-羟基十六酰基 -Glu(OSu)-OMe ( 13.2mg, 25.5mmol)溶于 10mL乙腈后加入到上述 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素溶液中开始反应，采用 RP-HPLC对反应过程进行中控。 40min后用 10% HC1将溶液 pH调节至约 2.2终止反应得前体粗品溶液。
3、 B28D-NsB29-(Na-(HO(CH2)15CO)fGlu)-B30E人胰岛素前体的纯化 将上述前体粗品溶液加入水稀释使有机相含量约 30% (v:v), 用 0.45μηι滤膜过 滤后采用 RP-HPLC对其进行纯化，其中反相柱为 Luna C18, 250x25mm, 5μηι， 10θΑ， 流动相 Α为 0.1% TFA/H20, 流动相 B为 0.1% TFA/ACN, 在 60min内用 35%-65%的 B 相梯度以 20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物得前体纯化液， ESI-MS: 1563.4 ( [M+4H]4+)。
4、 B28D-NsB29-(Na-(HO(CH2)15CO)fGlu)-B30E人胰岛素前体的皂化 减压浓縮除去前体纯化液中乙腈后用 10% NaOH溶液将其 pH调节至 8.0， 加入 等体积冰浴的 0.2M NaOH开始皂化， 采用 RP-HPLC分析皂化产物， 反应 50min后加 入 10% HC1终止反应。
5、 B28D-NsB29-(Na-(HO(CH2)15COh-Glu)-B30E人胰岛素前体皂化溶液的纯化 及冻干
将上述前体皂化溶液加入乙腈稀释使有机相含量约 30% (v:v), 用 0.45μηι滤膜 过滤后采用 RP-HPLC对其进行纯化， 其中反相柱为 Luna C18， 250x25mm, 5μηι， ΙΟΟΑ,流动相 Α为 0.1% TFA/H20,流动相 B为 0.1% TFA/ACN,在 60min内用 35%-65% 的 B相梯度以 20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物， 冻干得产物 10mg (纯度 94.3%)。 所得分子结构式如下。
Figure imgf000044_0001
6、 B28D-NsB29-(Na-(HO(CH2)15CO)fGlu)-B30E人胰岛素结构确证
B28D-N£B29-(Na-(HOC(CH2) I5CO)-Y-G1U)-B30E人胰岛素采用 ESI-MS测定分子 量为 6237.52， 和理论分子量 6237.17—致。
B28D-NsB29-(Na-(HOC(CH2)15COh-Glu)-B30E人胰岛素用胰蛋白酶酶解，酶解 产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 4865和 1389， 与 理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F2对应被修饰的 B-链片段。 证明修饰位点和 预期一致。 实施例 16、 Να-(ΗΟΟ〔(〔Η2)14〔Ο)-Νε-(Ο〔〔Η2〔Η2〔Ο-(Β28Ο-ΝεΒ29-Β30Ε人胰岛 素)) -Lys-OH ( HS067 ) 的制备
1、 Na- (甲基十六烷二酰基) -Νε-(3-酰基丙酸 -OSu)赖氨酸甲酯的制备
用 5mL纯化水溶解 H-Lys(Fmoc)-OMe ( 4.33g， 11.29mmol) 后加入到甲基十六 烷二酸琥珀酰亚胺酯（3.0g， 7.55mmol)的 THF ( 50mL )溶液中，加入 DIEA ( 1.46g， 11.29mmol ) 室温搅拌 24hr。 过滤反应液并用减压浓縮， 用乙酸乙酯溶解残余物后 用 200mL 0.1M HC1洗涤有机相三次， 收集有机相并用无水硫酸钠干燥， 过滤， 减 压浓縮后用 200mL乙腈:水 =10: 1 ( v:v ) 析晶得 5.0g ( 99.6% ) 甲基十六烷二酰基 -Lys(Fmoc)-OMe。
将甲基十六烷二酰基 -Lys(Fmoc)-OMe ( 5.0g， 7.52mmol ) 用 THF ( 80mL ) 溶 解后加入六氢吡啶 （20mL)， 室温搅拌 20min。 减压浓縮， 所得固体用乙酸乙酯 ( lOOmL) 溶解后用水洗涤三次， 有机相用无水硫酸钠干燥 30min。 过滤后减压浓 縮， 所得固体用氯仿（lOOmL )溶解后加入丁二酸酐（11.34g， 113.4mmol)和 N，N- 二异丙基乙胺 （14.1g， 113.4mmol)， 室温搅拌反应 2hr。 向反应液中加入 100 °C纯 化水 （lOOmL) 洗涤三次， 有机相用无水硫酸钠干燥 30min。 过滤， 滤液减压浓縮 后将所得固体进行反相高效液相色谱纯化， 浓縮后得 3.45g ( 84.7%) Na- (甲基十六 烷二酰基) -Νε-(3-酰基丙酸)赖氨酸甲酯， ESI-MS : 543.6 ( [Μ+Η]+)。
将 Να- (甲基十六烷二酰基) -Νε-(3-酰基丙酸)赖氨酸甲酯 （0.5g， 0.9mmol)溶于 DCM ( 50mL)， 加入 HOSu (0.116g， 2.0mmol) 和 EDC HC1 (0.265g， 2.0mmol) 后室温搅拌 48hr， 过滤后用 0.1M HCl洗涤并收集有机相， 加入无水硫酸钠干燥 30min, 过滤后减压浓縮， 真空干燥得 0.36g (63%) Να- (甲基十六烷二酰基) -Νε-(3-
Figure imgf000045_0001
2 、 Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(B28D-N!:B29-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH前体的制备
取重组 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素 （50mg， 8.5mmol) 加入 lOmL 10mM HCl溶解后用 0.2M NaOH溶液将其 pH调节至约 10.5。 将 Να- (；甲基十六烷二酰 基) -Νε-(3-酰基丙酸 -OSu)赖氨酸甲酯 （16.4mg， 25.6mmol) 溶于 10mL乙腈后加入 到上述 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)重组人胰岛素溶液中开始反应， 采用 RP-HPLC对反 应过程进行中控。 40min后用 10% HC1将溶液 pH调节至约 2.2终止反应得前体粗品溶 液。
3 、 Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(B28D-N!:B29-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH前体的纯化
将上述前体粗品溶液加入水稀释使有机相含量约 30% (v:v), 用 0.45μηι滤膜过 滤后采用 RP-HPLC对其进行纯化，其中反相柱为 Luna C18， 250x25mm, 5μηι， ΙΟθΑ, 流动相 Α为 0.1% TFA/H20， 流动相 B为 0.1 %TFA/ACN, 在 60min内用 38%-68%的 B 相梯度以 20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物得前体纯化液， ESI-MS: 1595 ( [M+4H]4+)。
4 、 Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(B28D-N!:B29-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH前体的皂化
减压浓縮除去前体纯化液中乙腈后用 10% NaOH溶液将其 pH调节至 8.0， 加入 等体积冰浴的 0.2M NaOH开始皂化， 采用 RP-HPLC分析皂化产物， 反应 50min后加 入 10%HC1终止反应。
5 、 Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(B28D-N!:B29-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH前体皂化溶液的纯化及冻干
将上述前体皂化溶液加入乙腈稀释使有机相含量约 30% (v:v), 用 0.45μηι滤膜 过滤后采用 RP-HPLC对其进行纯化， 其中反相柱为 Luna C18， 250x25mm, 5μηι， ΙΟΟΑ,流动相 Α为 0.1% TFA/H20,流动相 B为 0.1% TFA/ACN,在 60min内用 35%-65% 的 B相梯度以 20mL/min的流速洗脱产物并收集目标产物， 冻干得产物 4.0mg (纯度 94.5%)。 所得分子结构式如下。
Figure imgf000046_0001
6 、 Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(B28D-N!:B29-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH结构确证
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(B28D-N!:B29-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH ESI-MS测定分子量为 6350.68和理论分子量 6350.28—致。
用胰蛋白酶对 Να-(ΗΟΟ〔(〔Η2)14〔Ο)-Νε-(Ο〔〔Η2〔Η2〔Ο-(Β28Ο-ΝεΒ29-Β30Ε人 胰岛素)) -Lys-OH进行酶解并对酶解产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 4865和 1502， 与理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F2对应被 修饰的 B-链片段。 证明修饰位点和预期一致。 实施例 17、 NsB29-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-Des(B30)人胰岛素 （HS060 ) 的制备 用重组 DesCB30)人胰岛素 （50mg， 8.76mmol ) (实施例 2 ) 代替实施例 14中 B(l-27)-D-K-E, A(l-21) (序列 6 ) 人胰岛素， 其余方法同实施例 14制备 ΝεΒ29- (Na-(HOOC (CH2)I4CO)-Y- Glu)-Des(B30)人胰岛素。
N£B29-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-Des(B30)人胰岛素用 ESI-MS测定分子量 为 6103.9， 和理论分子量 6103.5—致。
N sB29-(N<^HOOC(CH2)14COh-Glu)-DeS(B30)人胰岛素用胰蛋白酶酶解， 酶解 产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 4865和 1256， 与 理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F2对应被修饰的 B-链片段。 证明修饰位点和 预期一致。 所得分子结构式如下。 Gly- He
Phe- Val
Figure imgf000047_0001
实施例 18、 NsB3-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B29E-B30E人胰岛素 （HS605 ) 的制备 用重组 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)人胰岛素 （27.2mg， 4.65mmol) (实施例 6 ) 代替实施例 14中 BCl-27)-D-K-E， A( 21)人胰岛素， 其余方法同实施例 14制备 NsB3-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B29E-B30E人胰岛素。
NsB3-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B29E-B30E人胰岛素用 ESI-MS测定分子量 为 6249， 和理论分子量 6248.23—致。
NsB3-(Na-(HOOC(CH2)14COh-Glu)-B29E-B30E人胰岛素用胰蛋白酶酶解， 酶 解产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 5277.2和 989， 与理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F1对应被修饰的 B-链片段。 证明修饰位点 和预期一致。 所得分子结构式如下。
Thr- Pro-Glu-Glu
Figure imgf000047_0002
实施例 19、 Na-(HOOC(CH2)14CO)-Ns-(OCCH2C¾CO-(NsB3-B29E-B30E人胰岛 素)) -Lys-OH (HS606) 的制备
用重组 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)人胰岛素（25mg， 4.27mmol) (实施例 6) 代替实施例 16中 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素， 其余方法同实施例 16制备 Να-(ΗΟΟ〔(〔Η2)14〔Ο)-Νε-(Ο〔〔Η2〔Η2〔Ο-(ΝεΒ3-Β29Ε-Β30Ε人胰岛素)) -Lys-OH。
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E 人 胰 岛 素》 -Lys-OH用 ESI-MS测定分子量为 6248， 和理论分子量 6247.4—致。
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH用胰蛋白酶酶解， 酶解产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 5376.3和 989， 与理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F1对应被 修饰的 B-链片段。 证明修饰位点和预期一致。 所得分子结构式如下。
Figure imgf000048_0001
实施例 20、 NsB3-(Na-(HOC(CH2)15CO)fGlu)-B29E-B30E人胰岛素 （HS607 ) 的制备 用重组 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)人胰岛素 （27.2mg， 4.65mmol) (实施例 6 ) 代替实施例 15中 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素， 其余方法同实施例 15制备 NsB3-(Na-(HOC(CH2)15CO)fGlu)-B29E-B30E人胰岛素。
N£B3-(Na-(HOC(CH2)i5CO)-Y-Glu)-B29E-B30E人胰岛素用 ESI-MS测定分子量 为 6236， 和理论分子量 6234.3—致。
NsB3-(Na-(HOC(CH2)15COh-Glu)-B29E-B30E人胰岛素用胰蛋白酶酶解， 酶解 产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 5263.2和 989， 与 理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F1对应被修饰的 B-链片段。 证明修饰位点和 预期一致。 所得分子结构式如下。
Figure imgf000049_0001
实施例 21、 N£B3-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21G人胰岛素 (HS608) 的制备 用重组 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E，A(l-20)-G人胰岛素 （24.3mg， 4.19mmol) (实施 例 12) 代替实施例 14中 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素， 其余方法同实施例 14制 备 NsB3-(Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B29E-B30E， A21 G人胰岛素。
N£B3-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21 G人胰岛素用 ESI-MS测定 分子量为 6192.5， 和理论分子量 6190.5—致。
N £B3-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21G人胰岛素用胰蛋白酶酶 解， 酶解产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 5219.5 和 989， 与理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F1对应被修饰的 B-链片段。 证明修 饰位点和预期一致。 所得分子结构式如下。
Figure imgf000049_0002
实施例 22、 Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E, A21G 人胰岛素)) -Lys-OH (HS609) 的制备 用重组 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E，A(l-20)-G人胰岛素 （24.1mg， 4.16mmol) (实施 例 12) 代替实施例 16中 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素， 其余方法同实施例 16制 备 Να-(ΗΟΟ〔(〔Η2)14〔Ο)-Νε-(Ο〔〔Η2〔Η2〔Ο-(ΝεΒ3-Β29Ε-Β30Ε， A21G 人 胰 岛 素)) -Lys-OH。
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E, A21G 人胰 岛 素》 -Lys-OH用 ESI-MS测定分子量为 6289， 和理论分子量 6289.6—致。
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E, A21G 人胰 岛 素)) -Lys-OH用胰蛋白酶酶解， 酶解产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 5318.5和 989， 与理论酶解片段分子量相符， 其中片段 F1对应被 修饰的 B-链片段。 证明修饰位点和预期一致。 所得分子结构式如下。 ly-Ile-1 l-Glu-Gln-C Iys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cy Is
Phe-
Figure imgf000050_0001
实施例 23、 N£B3-(Na-(HOC(CH2)i5CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21G人胰岛素 (HS610) 的制备 用重组 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E，A(l-20)-G人胰岛素 （24.8mg， 4.28mmol) (实施 例 12) 代替实施例 15中 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)人胰岛素， 其余方法同实施例 15制 备 NsB3-(Na-(HOC(CH2)15CO)fGlu)-B29E-B30E， A21 G人胰岛素。
N£B3-(Na-(HOC(CH2)i5CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21 G人胰岛素用 ESI-MS测定分 子量为 6177， 和理论分子量 6176.5—致。
N8B3-(Na-(HOC(CH2)15CO)-y-Glu)-B29E-B30E, A21G人胰岛素用胰蛋白酶 酶解， 酶解产物进行 LC-MS分析， 结果显示两个片段 F1和 F2的分子量分别为 5205.4和 989，与理论酶解片段分子量相符，其中片段 F1对应被修饰的 B-链片段。 证明修饰位点和预期一致。 所得分子结构式如下。
Figure imgf000051_0001
实施例 24 PEG ( 20KD ) 化胰岛素的制备
1. B(l-27)-D-K-E, A(l-21)胰岛素的 PEG (20KD)化
将 50mg B(l-27)-D-K-E， A(l-21)胰岛素溶于 25ml水中，用 1.0M Na2CO3水溶 液调节 pH=l 1.40， 再慢慢加入 500mg m-PEG-OSu (m-PEG-OSu溶于 10ml 乙腈和 6ml THF的混合溶剂） 的溶液， 室温搅拌反应 2hr。 反应结束后用 0.1M HCl调节 反应体系 pH=6.0淬灭反应， 减压除去有机溶剂。 反应终止后以 GE SP-Sepharose 阳离子交换凝胶纯化。反应终产物以 A液（A液 20mM Gly H3.0, B液： 20mM Gly pH3.0 1M NaCl) 10倍稀释后上样， 再以 A液平衡 5个柱体积后开始线性梯度洗 脱， 梯度为 0〜100% B/20柱体积。 收集洗脱峰以 10KD截留的超滤浓縮管脱盐并 浓縮， 得到目标产物， 简称 PEG ( 20KD ) -156。
2. B(l-27)-D-K-E, A(l-21)胰岛素的 PEG ( 20KD ) 修饰位置的鉴定
将 PEG化前后的 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)胰岛素用 GLu-C酶切， 各个酶切产 物见下表：
Figure imgf000051_0003
HPLC分析比较各个酶切产物， 发现酶切片段 F-I, F-Π和 F-III修饰前后均无 改变， 而 PEG修饰的 BG-27)-D-K-E，A(l-21)胰岛素酶切所得到的 F-IV片段疏水 性极大增加， 从而证实 PEG化位置在 B29K。 其结构如下：
Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cjys-Thr-Ser-lle-cjys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Ciys-Asn
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Asp-
Figure imgf000051_0002
3. PEG化 B02)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)胰岛素的制备同上述步骤 1， 得到目 标产物， 简称 PEG ( 20KD) -107。 用步骤 2所示方法进行鉴定， 所得分子以 DTT ( lOmM) 还原， 检测到 A链无变化， B链疏水性大大增加。 证实修饰位置在 B3K。 所得
Gly-lle u-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-' Cjys-Asn
Phe-Va
Figure imgf000052_0001
实施例 25 PEG(30KD)化胰岛素的制备
1. B(l-27)-D-K-E, A(l-21)胰岛素的 PEG (30KD)化
将 50mg B(l-27)-D-K-E, A(l-21)胰岛素溶于 25ml水， 用 l.OM Na2C03水溶液 调节 pH=11.40， 再慢慢加入 750mg m-PEG-OSu(30K) (m-PEG-OSu溶于 10ml 乙 腈和 6ml THF的混合溶剂） 的溶液， 室温搅拌反应 2hr。 反应结束后用 0.1M HC1 调节反应体系 pH=6.0 淬灭反应， 减压除去有机溶剂。 反应终止后以 GE SP-Sepharose阳离子交换凝胶纯化。 反应终产物以 A液 （A液 20mM Gly pH3.0, B液： 20mM Gly pH3.0 1M NaCl) 10倍稀释后上样， 再以 A液平衡 5个柱体积后 开始线性梯度洗脱， 梯度为 0〜100% B/20柱体积。 收集洗脱峰以 10KD截留的超 滤浓縮管脱盐并浓縮， 得到目标产物， 简称 PEG (30KD) -156。
2. B(l-27)-D-K-E, A(l-21)胰岛素的 PEG (30KD) 修饰位置的鉴定
将 PEG化前后的 BG-27)-D-K-E， A(l-21)胰岛素用 GLu-C酶切， 各个酶切产物 见下表：
Figure imgf000052_0002
HPLC分析比较各个酶切产物， 发现酶切片段 F-I， F-II, 和 F-III修饰前后均无 改变， 而 PEG修饰的 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)胰岛素酶切所得到的 F-IV片段疏水性 极大增加， 从而证实 PEG化位置在 B29K。 其结构如下： Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle- !ys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cjys-Asn
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Se「-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Th「-Asp-LYS-Glu
3. PEG(30KD)化 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)胰岛素的制备同上述步骤 1，得 到目标产物，简称 PEG (30KD) -107。用步骤 2所示方法进行鉴定，所得分子以 DTT ( lOmM) 还原， 检测到 A链无变化， B链疏水性大大增加。 证实修饰位置在 B3K。 所得修饰产物的分子结构如下：
Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Gjys-Thr-Ser-lle- ys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cjys-Asn
Phe-Val-Lys-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Glu
实施例 26 PEG (分支型 40KD)化胰岛素的制备 l. B(l-27)-D-K-E, A(l-21)胰岛素的 PEG (40KD)化
将 50mg BO27)-D-K-E，A( 21)胰岛素溶于 25ml水，用 1.0M Na2C03水溶液调 节 pH=11.40， 再慢慢加入1000mg m-PEG-OSu(40K) (m-PEG-OSu溶于10ml 乙腈和 6ml THF的混合溶剂） 的溶液， 室温搅拌反应 2hr。 反应结束后用 0.1M HC1调节反 应体系 pH=6.0淬灭反应， 减压除去有机溶剂。 反应终止后以 GE SP-Sepharose阳离 子交换凝胶纯化。反应终产物以 A液（ A液 20mM Gly pH3.0, B液： 20mM Gly pH3.0 lMNaCl) 10倍稀释后上样， 再以 A液平衡 5个柱体积后开始线性梯度洗脱， 梯度为 0〜100% B/20柱体积。 收集洗脱峰以 10KD截留的超滤浓縮管脱盐并浓縮， 得到目 标产物， 简称 PEG (40KD) -156。
2. B(l-27)-D-K-E, A(l-21)胰岛素的 PEG (40KD) 修饰位置的鉴定
将 PEG化前后的 BG-27)-D-K-E， A(l-21)胰岛素用 GLu-C酶切， 各个酶切产物 见下表：
Figure imgf000053_0001
HPLC分析比较各个酶切产物， 发现酶切片段 F-I， F-II, 和 F-III修饰前后均无 改变， 而 PEG修饰的 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)胰岛素酶切所得到的 F-IV片段疏水性 极大增加， 从而证实 PEG化位置在 B29K。 其结构如下:
Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-c!ys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Ciys-Asn
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-(
3. PEG(40KD)化 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)胰岛素的制备同上述步骤 1，得 到目标产物， 简称 PEG (40KD ) -107。 用步骤 2所示方法鉴定， 所得分子以 DTT ( lOmM) 还原， 检测到 A链无变化， B链疏水性大大增加。 证实修饰位置在 B3K。 所得修饰产物的分子结构如下：
Gly- lie- Val- Glu-Gln-Cys- Cjys- Thr- Ser-lle- ys-Ser-Le
Phe-Val-Lys-Gln- His-Leu- Cys-Gly- Ser-His-Leu- Val- G
Figure imgf000054_0001
-Gly- Phe- Phe-Tyr- Thr- Pro-Glu- Glu
T 〇 生物学评价
测试例 1 : 人胰岛素类似物同胰岛素受体 （IR)、 胰岛素样生长因子受体 1 ( IGF1-R) 的结合力测定
本发明的人胰岛素类似物与胰岛素受体及胰岛素样生长因子 -1受体的相对结 合强度通过受体竞争性结合实验来测定。
表达有胰岛素受体和胰岛素样生长因子 -1受体的细胞膜分别从 IM-9和 H19-7 细胞（ATCC)提取。收集 5 X 108个细胞，用 PBS洗涤后重悬于细胞裂解液中（50mM Tris-HCl, pH7.8, 150mM NaCl, 蛋白酶抑制剂 （Roche) ) ， 使细胞密度为 6 X 107 个细胞 /mL， 置于冰上。 用电动匀浆器以 25000rpm处理 10sec， 处理两次后低速离 心 （2000g， 15min) ， 收集上清。 沉淀部分重悬于适量细胞裂解液中， 重复上述 匀浆步骤。共重复三次，合并三次上清。将上清高速离心（4°C， 35000rpm, 60min)， 去掉上清， 将沉淀部分重悬于适量细胞裂解液中， 得到实验用膜蛋白。 从 IM-9细 胞中提取的膜蛋白为胰岛素受体， 简称 IM-9细胞膜蛋白； 从 H19-7细胞中提取的膜 蛋白为胰岛素样生长因子 -1受体， 简称 H19-7细胞膜蛋白， 用 Bradford法进行蛋白 浓度定量。
在胰岛素受体结合实验中，在 96孔板的每个孔加入 4(^L 125pM 的同位素 [125 1] 胰岛素（Perkin Elmer, Cat. No. 42001 OUC)， 3 g IM-9细胞膜蛋白 （50μυ和 ΙΟμ 待测的人胰岛素类似物的梯度稀释溶液。 上述溶液都配制在反应液中 （50mM Tris-HCl, pH7.8, 150mM NaCl, 0.1% BSA) 。 将上述混合液在室温轻轻振摇 lhr。 孵 育好的膜蛋白用 FilterMate Havester ( Perkin Elmer, Cat. No. S/N:DA12073369)收集 到经 0.3%的 PEI预先湿润的 MicroBeta Filtermat B膜上 （Perkin Elmer, Cat. No. 1450-521 ) 并用反应液洗涤三次后在 60°C烘箱干燥 lhr。 把干燥好的滤膜放入封膜 内， 加入 15mL闪烁液， 并密封。 最后用 Microbeta Plate Counter (Perkin Elmer, Cat. No.1450) 读数。
在胰岛素样生长因子 -1受体结合实验中， 在 96孔板的每个孔加入 4(^L 125pM 的同位素 [125 I] IGF-1， 9μ§ Η19-7细胞膜蛋白 （50μυ和 ΙΟμ 待测的人胰岛素类似 物的梯度稀释溶液。 其余步骤与胰岛素受体结合实验相同。
上述实验中得到的数据用 Graphpad Prism进行非线性拟合曲线， 得到人胰岛素 类似物物在胰岛素受体或胰岛素样生长因子 -1受体结合竞争实验中的 IC5o值 (nM)。 结果见下表。
表 1 :胰岛素及其类似物同胰岛素受体（IR)、胰岛素样生长因子受体 l (IGFl-R) 的结合力测定
Figure imgf000055_0001
注：hl， 人胰岛素； DesCB30)-hI， B30缺失人胰岛素， 均为阳性对照。
上述结果表明本发明获得的序列的结合力与阳性对照相当， 其中 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E, A(l-20)-G和 IR的结合力是 hi 1.9倍， 而它和 IGF1-R的结 合力不到 hi的十分之一， 优于阳性对照。 测试例 2: 人胰岛素类似物体内活性评价
1. 实验用 ICR雄鼠（购自西普尔 ·必凯实验动物有限公司)， 18-20g， 实验室环 境伺养 3天， 温度 20-25 °C ; 湿度 40-60 %。
2. 实验用药物 Humulin R (Lilly Egypt, HRE046, 100IU/mL), 用 0.05N HC1配 制成 l lU/mL ( 0.05 mg /kg), 再用 0.9 % NaCl稀释成 0、 0.01、 0.02、 0.04、 0.08、 0.16、 0.32、 0.64 IU/mL溶液。
3. 取雄鼠 40只， 实验前禁食 16hr。 实验开始时称重后测定基础血糖值（小鼠 剪尾， 使用罗氏血糖仪及相应的血糖试纸检测， 下同）， 根据血糖值大小随机分为 8组， 每组 5只。 每组给药剂量分别为： 0、 0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 1.6、 3.2 IU/kg (给 药体积为每 20 g体重 100 μ 。
4. 给药后 lhr测定各小鼠的血糖值 （mmol/L)。
5. 数据分析:将所测得的血糖值以给药前血糖值的百分比表示。采用 Graphpad Prism 5绘制药物反应 （降血糖） 曲线， 得到 ED5Q值 （IU /kg或 mg /kg), 即最大 降血糖反应的 50 %所需药物的皮下注射剂
6. 各人胰岛素类似物 ED5Q值见下表：
表 2: 人胰岛素类似物体内活性评价
Figure imgf000056_0001
注： 相对活性， 指各个人胰岛素类似物 ED5Q相对于 Des(B30)-hI的活性。 每次试 验以 Des(B30)-hI为对照， Des(B30)-hI的 ED5。值定为 1。
上述结果表明， 本发明的人胰岛素类似物体内活性与阳对对照相当， 其中
B(l-2)-K-B(4-28)-E-E, A(l-20)-G等体内活性比 hi (人胰岛素）、 Des(B30)-hI (B30 缺失人胰岛素） 活性提高 50%以上， 明显优于阳性对照。 测试例 3: 胰岛素衍生物体内长效效果评价
实验用 SD 大鼠， 雄性， 购自西普尔 ·必凯实验动物有限公司， 许可证：
SCXK (；沪 )2008-0016， 18-20 g， 伺养环境： SPF级。 取 ICR雄鼠， 实验室环境伺养 3天， 温度 20-25 °C ; 湿度 40-60 %。 实验前禁食 8hr。 100 mg/kg STZ腹腔注射， 完成大鼠糖尿病模型制作， 2天后测空腹血糖值，血糖大于 l l . lmmol/1的大鼠为糖 尿病大鼠。 实验开始时称重后测定血糖值 （剪尾， 使用罗氏血糖仪及相应的血糖 试纸检测， 下同）， 根据血糖值大小随机分组， 每组 43 只。 将实验用药物配成所 需浓度， 皮下注射给药后在多个时间点测定各大鼠的血糖值。 根据血糖值计算长 效指数 IP ( Index of Prolongation )
阳性对照：
1 Humulin R: 重组人胰岛素注射液为礼来公司产品。
2 Detemir: 地特胰岛素注射液为诺和诺得公司产品。
3 HS060 是诺和诺得公司三期临床分子 Degludec , NsB29-(Na-(HOOC(C H2)14CO)fGlu)-Des(B30)人胰岛素， 见实施例 17
待测化合物为胰岛素衍生物， 即酰化的人胰岛素类似物， 具体如下：
1 HS061 , B28D -ΝεΒ29- (Na-(HOOC(CH2)14CO)fGlu)-B30E， 见实施例 14
2 HS062, B28D-N£B29- (Na-(H S ΆO(CH2)i5CO)-Y-Glu)-B30E, 见实施例 15
S
3 HS067, Να-(ΗΟΟ〔(〔Η2)14〔Ο) -Νε-(Ο〔〔Η2〔Η2〔Ο-(Β28Ο-ΝεΒ29-Β30Ε人胰 岛素)) -Lys-OH， 见实施例 16
表 3结果表明 HS061(IP: 117.9)、 HS062(IP: 112.3)、 HS067(IP: 132.9)的体内长 效活性比 Detemir(IP: 100)以及 HS060(IP: 105.9)都要好，特别是 HS067维持血糖平 稳达到 12hr (结果见图 3、 图 4、 图 5 )。
表： HS060 , HS061、 HS062及 HS067体内长效活性检測结果
Hwnuliri Detemir HS060 HS061 HS062 HS067 R
剂量 (mg/kg) 0 0.04 0.2 0.1 0.1 0.1 0.1 动物数 3 3 3 3 3 3 体重 ( g ) 193 ± 17.0 172 ± 7.4 186 ±9.0 183 ± 11.2 183 ± 12.6 200 ± 14.1 191 ±9.0
AOC 21.0 69.2 76.9 74.4 65.4 57.5
—IP 0 100 105.9 117.9 112.3 132.9
O h 100.00 100.00 100.00 100.00 0.5 i 100.00 58.65 116.28 132.78
1 h 100.00 34.12 77.15 108.07 2 h 100.00 23.83 21.37 76.69 血 4 h 100.00 66.89 18.06 22.72 糖 6 h 100.00 93.29 23.16 18.27 值 8 h 100.00 107.72 29.75 22.43 (% 10 h 100.00 134.46 45.34 25.33 ) 12 h 100.00 106.64 58.35 21.84
14 h 100.00 109.79 71.81 30.36 16 h 100.00 113.82 106.55 41.82 18 h 100.00 112.82 122.73 54.38 20 h 100.00 106.38 129.23 56.30 测试例 4: PEG化胰岛素同胰岛素受体（IR) 的结合力测定 一、 测试方法同测试例 1。
二： 待测化合物：
PEG (20KD)化胰岛素： PEG (20KD) -107表示分子量 20KD的 PEG (20KD) 化 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)胰岛素； PEG (20KD) -156表示 PEG (20KD) 化 B(l-27)-D-K-E，A(l-21)胰岛素。 具体见实施例 24。
三、 PEG (20KD) 化胰岛素在胰岛素受体结合竞争实验中的 IC5Q值 （nM)结 果见如下表 4， 从下表可知本发明的优选序列经 PEG化后仍能同胰岛素受体（IR) 口
表 4: PEG化胰岛素同胰岛素受体 （IR) 的结合力测定
Figure imgf000058_0001
测试例 5: PEG化胰岛素体内长效效果评价
一： 测试方法同测试例 3。
二： 待测化合物：
1、 PEG ( 20KD )化胰岛素： PEG ( 20KD ) - 107表示分子量 20KD的 PEG ( 20KD ) 化 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)胰岛素； PEG (20KD) -156表示 PEG (20KD) 化 B(l-27)-D-K-E，A(l-21)胰岛素。 具体见实施例 24。
2、 PEG ( 30KD ) 化胰岛素： PEG ( 30KD ) -107 表示 PEG ( 30KD ) 化 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E, A(l-21)胰岛素； PEG (30KD) -156表示 PEG (30KD) 化 B(l-27)-D-K-E，A(l-21)胰岛素。 具体见实施例 25。
3、 PEG (40KD) 化胰岛素： PEG (40KD) -107表示 PEG (分支型 40KD) 化 B(l-2)-K-B(4-28)-E-E， A(l-21)胰岛素； PEG (40KD) -156表示 PEG (分支型 40KD) 化 B(l-27)-D-K-E，A(l-21)胰岛素。 具体见实施例 26。
三： 测试结果
1、 PEG (20KD) 化胰岛素体内长效效果评价结果见如下表 5、 图 6。
表 5 ： PEG ( 20KD ) 化 B(l-27)-D-K-E， A(l-21)禾 B PEG ( 20KD ) 化
B(l-2)-K-B(4-28)-E-E, A(l-21)胰岛素体内长效活性检测结果
Figure imgf000058_0002
1 h 100 45.94 96.63 109.43 101.39
2 h 100 25.26 57.24 106.92 91.03
4 h 100 58.85 32.49 105.73 58.14
6 h 100 86.49 40.98 73.21 27.32
8 h 100 138.71 86.94 43 16.52 lO h 100 152.95 112.66 25.48 16.14
12h 100 151.89 127.52 23.81 16.06
24h 100 19.09 24.21
28h 100 23.19 30.5
32h 100 30.82 33.49
34h 100 39.89 46.34
36h 100 55.94 64.5
46h 100 64.89 87.17
48h 100 103.59 113.56
50h 100 113.66 113.64
52h 100 133.77 129.07
54h 100 148.74 144.42
56h 100 153.91 149.59 结论： 表 5结果表明 PEG (20KD) -107 和 PEG (20KD) -156维持血糖平稳 时间达到 32 - 46hr， 见图 6。 两者的长效指数（IP)接近， 分别为 207.36和 204.26 (见表 5 )， 明显优于阳性对照。
2、 PEG ( 30KD ) 化胰岛素、 PEG (40KD) 化胰岛素体内长效效果评价结果 见如下表 6、 图 7。
表 6: PEG(30KD)-107 PEG(40KD)-107 PEG(30KD)-156 PEG(40KD)-156 体内 长效活性检测结果
Figure imgf000059_0001
28 100 16.79 16.32 23.12 19.47
32 100 13.82 14.38 18.00 16.22
36 100 21.29 15.02 17.74 20.28
40 100 24.64 20.74 23.01 25.44
44 100 30.52 26.78 25.04 25.79
48 100 28.49 28.51 27.41 31.25
52 100 39.14 39.00 29.26 34.18
56 100 65.78 42.57 32.61 37.64
60 100 81.03 43.12 39.00 39.85
64 100 105.43 63.25 50.70 42.13
68 100 132.02 87.42 66.91 43.95
74 100 132.73 90.82 77.16 48.04
78 100 138.56 128.71 96.09 65.20
82 100 111.74 78.79
86 100 135.91 137.17 结论： 表 6、 图 7结果表明， PEGC30KD)-107 CIP:282.5) 在小鼠体内维持血糖 平稳时间达到 48hr; PEG(40KD)-107 (IP:285.0) 在小鼠体内维持血糖平稳时间达到 60hr ; PEG(30KD)-156 (IP:289.8)在小鼠体内维持血糖平稳时间达到 56hr ; PEG(40KD)-156 ( IP:297.4) 在小鼠体内维持血糖平稳时间达到 76hr， 明显优于阳 性对照。

Claims

1、一种人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其具有下式 A链和 B链序列及结 构：
A
B
Figure imgf000061_0001
FYB27B28B29B30 B31 B32;
其中，
A0可以是 R， 也可以缺失； A21可以是 N或 G;
B3可以是 K、 D或 N;
B27可以是 E、 T、 D、 或 K;
B28可以是 E、 D、 P或 K;
B29可以是 E、 K或 P;
B30可以是 K、 R、 E、 T或者缺失；
B31、 B32可以是 R或者单个缺失或两者缺失；
条件是：
当所述的 AQ缺失， A21是 N， B3是 N时：
B31B32缺失， B27B28B29B3。不是 TPKT、 ΤΚΡΤ或 TDKT;
或者 B3Q B31B32缺失， B27B28B29不是 TPK;
当所述的 A。缺失， A21是 N， B3是 K， Β31Β32缺失时， Β27Β28Β29Β3。不是 ΤΕΚΤ; 当所述的 Α。缺失， Α2ι是 G， Β3是 Ν时， Β27Β28Β29Β3。 Β31Β32不是 TPKTR ; 当 Β3、 Β27-Β30是赖氨酸残基时， 其 ε-氨基可以是被酰化修饰的； 可选地， Α及 Β链 Ν-末端的 (X-氨基也是被酰化修饰的。
2、 如权利要求 1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其特征在于， 所 述的 B3、 B27-B30位氨基酸残基中只有一个是赖氨酸残基。 3、 如权利要求 1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其特征在于， 当 所述的 B链中 B3是N时：
β28是 Κ、 Ρ或 D;
Β29 Ε、 Κ或 Ρ;
B30 R、 E、 T或者缺失；
Β3ΐ、 Β32缺失。 4、 如权利要求 3所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其特征在于， 所 述的 B3。B31B32缺失时， B28B29是 KE。
5、 如权利要求 1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其特征在于， 所 述的 B链中 83是1)时：
8、 B29是 P或 K;
B30 ¾ R T或者缺失；
B31、 B32是 R或者缺失；
其中， B28B29优选为 PK。
6、 如权利要求 1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其特征在于， 当 Αο缺失， 所述的 Β链中 是 时：
Β28、 Β29是 Ρ或 Ε;
Β30是 Ε或 R;
Β31是 R或者缺失， Β32缺失；
其中， Β28Β29优选为 ΡΕ。
7、 如权利要求 1所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其特征在于， 所 述的 Α链和 B链序列选自如下所述的序列组合：
A链： RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID N0.4
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID N0.5
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID N0.1
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKER SEQ ID N0.6
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID N0.7
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPE SEQ ID N0.8
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l
B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.9
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10 A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2
B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR SEQ ID NO.11
A链： RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.3
B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTR SEQ ID NO.12
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. l
B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPERR SEQ ID NO.13
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO. l
B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.14
A链： RGIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID N0.4 B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.14
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKE SEQ ID NO.15 A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2
B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2
B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.17
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2
B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.18
A链： RGIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.3 B链： FVDQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK SEQ ID NO.18
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO. l O o 8、 如权利要求 1-7任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其特征在 于， 所述的人胰岛素类似物被 PEG化。 9、 如权利要求 1-8任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐， 其特征在 于所述的人胰岛素类似物被 PEG所修饰;所述的 PEG分子的分子量为 5-100 KD, 优选 10-80 KD， 更优选 15-45KD, 最优选 20-40KD; 所述的 PEG分子为支链型 或直链型。
10、一种如权利要求 1至 9任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐的 制备方法， 包括构建表达载体， 转化至宿主细胞中的表达， 分离纯化表达前体产 物， 用化学或 /和酶方法从表达前体产物中释放所述的胰岛素类似物； 任选人胰 岛素类似物被 PEG化， 所述的 PEG化优选为化学酰化修饰方法， 包括酰化试剂 的合成， 人胰岛素类似物中氨基的酰化和酰化集团中保护基的脱除。
11、一种用于制备如权利要求 1至 9任一项所述的人胰岛素类似物或其生理 耐受盐的表达前体产物， 其结构通式 （I) 为：
A-Rl-B (I)
其巾：
R1为 0-5个氨基酸残基肽段，该氨基酸残基肽段由丙氨酸（A)、赖氨酸（K)、 精氨酸 （R) 组成；
Α、 Β分别为所述胰岛素类似物对应的 Α链和 Β链。
12、 如权利要求 11 所述的表达前体产物， 其特征在于， 所述的表达前体产 物选自：
Figure imgf000064_0001
或 SEQ ID NO. 77：
13、 一种编码如权利要求 11或 12所述的表达前体产物的 DNA序列。
14、 一种含有如权利要求 13所述的 DNA序列的表达载体。
15、 一种用如权利要求 14所述的表达载体转化的宿主细胞。 16、如权利要求 15所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为细菌， 优选为大肠杆菌。
17、 如权利要求 15所述的宿主细胞， 其特征在于， 所述的宿主细胞为酵母 菌， 优选为毕赤酵母或酿酒酵母。
18、 一种胰岛素衍生物， 其特征在于， 在胰岛素 A和 B-链 N-末端的 (X-氨基 或者在 B3、 B27-B30的赖氨酸残基的 ε-氨基处连接了酰化修饰基团， 形成了酰 化胰岛素， 该酰化胰岛素具有如下通式：
S-W-X-Y-Z 其中 S为胰岛素， 或权利要求 1-7之一所述的人胰岛素类似物；
-W-X-Y-Z为人胰岛素类似物的酰化修饰基团， 其中 W为：
• 具有 -OC(CH2)mCO-的二酰基结构，其中 m为 2〜10之间的整数，该结构 以其羧酸基团之一和母体胰岛素或其类似物的 A-链或 B-链 N-末端氨基 酸残基的 α-氨基或 Β-链上存在的 Lys残基的 ε-氨基形成酰胺键； • 侧链上带有羧基的 （X-氨基酸残基或含有侧链上带有羧基的 （X-氨基酸的
2-4肽，其中该残基或肽与母体胰岛素或其类似物的 Α-链或 Β-链 Ν-末端 氨基酸残基的 α-氨基或 Β-链上存在的 Lys残基的 ε-氨基形成酰胺键连 接；
X为：
• -CO-;
• 含羧酸基团的二氨基化合物， 该化合物以其氨基之一与 W中的羧基形成 酰胺键连接；
a) 当 W为氨基酸残基或 2-4肽时， 上述 X基团通过 -CO-与 W上的氨基形成 酰胺键， 或
b)当 W为二酰基结构时， 上述 X基团以其氨基基团之一与二酰基结构连接; Y为：
• -A(CH2)m-, 其中 m为 6-32的整数， A为不存在或 CO-;
• 酰基二价烃链， 其中含有 1、 2或 3个 -CH = CH-基团和足以在链上获得
10-32个碳原子总数的 -CH2-基团；
• 通式 -BCCH2)VC6H4<;CH2)W-的二价烃链， 其中 V和 w为整数或其中一为 0， 使得 V与 w之后在 6-30的范围， B为不存在或 CO-;
a) 当 X为 CO-时 A或 B为不存在， 或
b) 当 X为二氨基化合物时 A或 B为 CO-;
Z为： 參 -OH;
參 -NH2;
• -COOH;
Figure imgf000066_0001
• -P03H。
19、如权利要求 18所述的胰岛素衍生物， 其中酰化修饰基团 -W-X-Y-Z与母 体胰岛素 B3、 B27-B30的赖氨酸残基的 ε-氨基连接。
20、如权利要求 18所述的胰岛素衍生物， 其中酰化修饰基团 -W-X-Y-Z与母 体胰岛素 Α和 B-链 N-末端 α-氨基连接。
21、 如权利要求 18所述的胰岛素衍生物， 其中 S为人胰岛素类似物， 选自 以下组：
Α链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID N0.1
B链： FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKE SEQ ID NO.10
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCN SEQ ID NO.l
B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID N0.9
A链： GIVEQCCTSICSLYQLENYCG SEQ ID N0.2
B链： FVKQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPEE SEQ ID NO.16'
22、如权利要求 18所述的胰岛素衍生物， 其中酰化修饰基团 -W-X-Y-Z选自 下组中：
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu;
Na-(HO(CH2)i5CO)-Y-Glu;
Na-OiOOC^H MCC -NS- -酰基丙酸 *)-Lys， 所述的 *处为胰岛素连接点。
23、 如权利要求 18所述的胰岛素衍生物， 其选自下组中：
B28D-N£B29-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-B30E人胰岛素；
B28D-N£B29-(Na-(HO(CH2)i5CO)-Y-Glu)-B30E人胰岛素；
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N£-(OCCH2CH2CO-(B28D-N!:B29-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH;
N£B3-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-B29E-B30E人胰岛素； N£B3-(Na-(HOC(CH2)i5CO)-Y-Glu)-B29E-B30E人胰岛素；
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E 人 胰 岛 素)) -Lys-OH;
N£B3-(Na-(HOOC(CH2)i4CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21G人胰岛素；
N£B3-(Na-(HOC(CH2)i5CO)-Y-Glu)-B29E-B30E, A21G人胰岛素；
Na-(HOOC(CH2)i4CO)-N!:-(OCCH2CH2CO-(N!:B3-B29E-B30E, A21G 人胰岛 素)) -Lys-OH。
24、一种药物制剂， 其含有如权利要求 1至 9任一项所述的人胰岛素类似物 或其生理耐受盐或含有如权利要求 18至 23任一项所述的胰岛素衍生物。
25、 如权利要求 24所述的药物制剂， 其含有溶解的、 非晶型的和 /或结晶形 式的人胰岛素类似物或其生理耐受盐。 26、 如权利要求 24所述的药物制剂， 其含有长效佐剂， 所述的长效佐剂与 药物以共结晶的方式存在。
27、 一种具有胰岛素活性的可注射的溶液， 其含有溶解形式的、 如权利要求 24所述的药物制剂。
28、一种如权利要求 1至 9任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐或 如权利要求 18至 23任一项所述的胰岛素衍生物在制备治疗 II型糖尿病、 高血 糖症、 肥胖症或胰岛素抵抗症的药物中的用途。 29、一种如权利要求 1至 9任一项所述的人胰岛素类似物或其生理耐受盐在 制备速效和 /或长效的具有胰岛素活性的药物制剂中的用途。
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