WO2013081035A1 - モーター蛋白デバイス - Google Patents

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    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57565—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving carcinoembryonic antigen [CEA]

Definitions

  • the present invention relates to a motor protein device capable of transporting a desired molecule to a destination and separating and concentrating the transported molecule.
  • Patent Document 1 describes a technology in which a single-stranded DNA for loading is bound to a carrier molecule, the cargo molecule is loaded and slid, and a cargo molecule is loaded and unloaded by forming a double-stranded nucleotide at the destination. Yes.
  • Patent Document 2 describes a molecular motor system that collects and purifies a target RNA using a microtubule bound with a binding functional nucleic acid and a substrate coated with kinesin.
  • Patent Document 3 describes a molecular motor system that selectively moves a target DNA of interest using a probe DNA-conjugated microtubule and a substrate coated with kinesin.
  • the main object of the present invention is to provide a technique for efficiently conveying, concentrating and detecting a target antigen.
  • a motor protein device includes a collection region in which a carrier molecule collects a target molecule using an antigen-antibody reaction, and an unloading in which the target molecule is unloaded from the carrier molecule using chemical equilibrium. Includes area.
  • a motor protein device includes a collection region where a carrier molecule collects a target molecule using an antigen-antibody reaction, and the target molecule from the carrier molecule using chemical equilibrium. And an unloading area for unloading the composite.
  • the unloading region includes a substance having a higher complementarity than the predetermined antibody modified to the carrier molecule and having a binding ability to the target molecule.
  • a motor protein device according to any one of the above.
  • a cancer sensor array comprising the motor protein device according to claim (12).
  • the carrier molecule collects the target molecule using the antigen-antibody reaction in the collection region, and the chemical equilibrium is used in the unloading region.
  • the target molecule can be unloaded from the carrier molecule. Since the unloading region includes a predetermined antibody having a higher supplementary force than the predetermined antibody modified to the carrier molecule in the unit surface area, the motor protein device according to the present invention carries the target molecule one after another to unload the target molecule. By unloading the region, the target molecule can be concentrated in the unloading region.
  • the motor protein device according to the present invention can efficiently transport and detect a target molecule.
  • the motor protein device according to the present invention can detect the target molecule with high sensitivity by concentrating the target molecule in the unloading region.
  • the figure which illustrates the basic composition of the motor protein device concerning one embodiment of the present invention The figure explaining that the motor protein device concerning one Embodiment of this invention concentrates a target molecule.
  • FIG. 1 is a diagram illustrating a basic configuration of a motor protein device according to an embodiment of the present invention.
  • the motor protein device 1 includes a collection region 10 and an unloading region 20. These regions are provided, for example, on a substrate on which a protein can be immobilized, and are filled with a buffer solution or the like.
  • the buffer solution may contain ATP (adenosine triphosphate) for activating the motor protein, if necessary.
  • the collection region 10 is a region where the carrier molecule 50 collects the target molecule 60 using an antigen-antibody reaction.
  • the carrier molecule 50 can be modified in advance with an antibody capable of binding to a predetermined antigen.
  • the carrier molecule 50 can include actin modified with a predetermined antibody, and the collection region 10 and the unloading region 20 can include immobilized myosin.
  • the target molecule 60 refers to a molecule that is the target of concentration / detection in the concentration / detection utilizing an antigen-antibody reaction.
  • the target molecule 60 is not particularly limited as long as it is collected by the carrier molecule 50.
  • the target molecule 60 can include a derivative obtained by chemically modifying the target molecule 60 or a modified antigen site 61 capable of binding to a predetermined antibody (see FIG. 2C). Examples include proteins, peptides, saccharides, lipids and nucleic acids. Furthermore, antigens, immunoglobulins, tumor markers, ligands, viruses, bacteria and the like can be included.
  • the unloading region 20 is a region where the target molecule 60 is unloaded from the carrier molecule 50 using chemical equilibrium.
  • the unloading region 20 can include a substance having a higher complementarity or higher concentration than the predetermined antibody modified to the carrier molecule 50 in a unit surface area and a binding ability to the target molecule 60 or the predetermined antigen.
  • the unloading region 20 includes an antibody 80 that can bind to the target molecule 60, and the chemical equilibrium is utilized by the antibody 80 having a higher supplemental force than the carrier molecule 50 or having a higher concentration.
  • the target molecule 60 can be unloaded from the carrier molecule 50.
  • the motor protein device 1 can be connected to an analysis unit 40 that detects a change in the concentration of the target molecule 60 in the unloading region 20, and can detect that the target molecule 60 has been unloaded in the unloading region 20.
  • the analysis unit 40 includes, for example, electrodes 41 and 42 as a part of the electrical detection means, and can detect the impedance of the unloading region 20 or a change in the impedance via these electrodes 41 and 42. That is, in the motor protein device 1, the concentration change of the target molecule 60 in the unloading region 20 can be detected as the impedance of the unloading region 20 or a change in the impedance.
  • the predetermined antibody can have a binding ability to at least one immunoglobulin.
  • the carrier molecule 50 of the motor protein device 1 uses the antigen-antibody reaction in the collection region 10 to collect the immunoglobulin as the target molecule 60 and then unloads the region 20. Can move up to.
  • the antibody as a target molecule 60 is unloaded due to chemical equilibrium because the antibody has a higher supplementary force or a higher concentration of antibody than the antibody modified to the carrier molecule 50 in the unit surface area. It binds to the antibody in region 20. That is, the carrier molecule 50 can unload the target molecule 60 to the unloading region 20.
  • the carrier molecules 50 continue to unload the immunoglobulin in the unloading region 20 one after another, so that the immunoglobulin is concentrated in the unloading region 20.
  • This concentration of immunoglobulin can be detected by the analysis unit 40 as a change in impedance of the unloading region 20.
  • FIG. 2 is a diagram illustrating that the motor protein device according to one embodiment of the present invention concentrates the target molecule.
  • FIG. 2A is a diagram for explaining the movement of the carrier molecule 50 to the unloading region 20.
  • FIGS. 2B and 2C are diagrams illustrating the target molecule 60 in the unloading region 20 where the carrier molecule 50 is unloaded. It is a figure explaining unloading.
  • the carrier molecule 50 transports the collected target molecule 60 along the transport path 30.
  • the conveyance path 30 is, for example, a passage provided between the collection area 10 and the unloading area 20 described above, and can include myosin 70 and the like fixed in the same manner as the collection area 10.
  • the conveyance path 30 may be a passage independent of the collection area 10 or may be a part of the collection area 10 or the unloading area 20.
  • the conveyance path 30 may include a plurality of passages that reach the unloading region 20.
  • the analysis unit 40 illustrated in FIG. 2A includes analysis circuits 45, 46, and 47 as electrical detection means.
  • the analysis circuit 45 is used to measure the impedance of the unloading region 20 via the electrodes 41 and 42.
  • the analysis circuit 46 is used to measure the impedance of the reference region 25 via the electrodes 43 and 44.
  • the reference region 25 is provided in the same manner as the unloading region 20 except that it does not contain the antibody 80 described above.
  • the analysis circuit 47 is used to measure the difference between the impedance of the unloading region 20 measured by the analysis circuit 45 and the impedance of the reference region 25 measured by the analysis circuit 46.
  • the unloading region 20 has an antibody 80 having a higher supplementary force than the carrier molecule 50 or a high concentration of antibody 80 immobilized thereon. Therefore, when the carrier molecule 50 reaches the unloading region 20, the target molecule 60 that binds to the antibody 80 increases from the target molecule 60 that binds to the carrier molecule 50 due to chemical equilibrium. That is, the target molecule 60 is unloaded from the carrier molecule 50 in the unloading region 20.
  • the unloading region 20 and the reference region 25 include the immobilized myosin 70, and the carrier molecules 50 after unloading pass through these regions without staying in the unloading region 20. Subsequent carrier molecules 50 can continue to arrive at the unloading region 20.
  • the target molecules 60 are unloaded and concentrated one after another in the unloading region 20 as time passes.
  • the concentration of the target molecule 60 in the unloading region 20 increases, the capacitance component of the impedance of the unloading region 20 increases.
  • the impedance of the reference region 25 does not substantially change. Therefore, the increase in the concentration of the target molecule 60 in the unloading region 20 is caused by a change in the impedance of the unloading region 20 measured by the analysis circuit 45 or a difference in impedance between the unloading region 20 and the reference region 25 by the analysis circuit 47. It can be detected as a change.
  • the unloading region 20 Since the capacitance component of the impedance increases, an increase in the concentration of the target molecule 60 in the unloading region 20 can be detected.
  • 2A, 2B, and 2C illustrate one conveyance path 30, a pair of electrodes 41 and 42 in the unloading region 20, and a pair of electrodes 43 and 44 in the reference region 25.
  • the number of transport paths 30 and the arrangement and shape of electrodes for impedance measurement can be arbitrarily designed.
  • FIG. 3 is a view showing an example of the transport path of the motor protein device according to the embodiment of the present invention.
  • the conveyance path 30 has an overall shape of an annular passage, and the fixed myosin 70 is included in the entire conveyance path 30 which is the annular passage.
  • the carrier molecule 50 that has collected the target molecule 60 in the collection region 10 can return to the collection region 10 again along the path of the transport path 30 after unloading the target molecule 60 in the unloading region 20. . Therefore, the carrier molecule 50 can continue to concentrate the target molecule 60 by repeatedly collecting the target molecule 60, transporting it to the unloading region 20 and unloading it.
  • the motor protein device can be configured as a means for concentrating the target molecule 60 that can operate without power.
  • FIG. 4 is a diagram showing another embodiment of the motor protein device according to one embodiment of the present invention.
  • the unloading region 20 is provided as a common unloading region for the plurality of motor protein devices 11a to 11h.
  • Each of these motor protein devices 11a-h is configured to transport the target molecule 60 toward the unloading region 20 and unload it. Therefore, in the unloading region 20 shown in FIG. 4, each of the motor protein devices 11a to 11h continues to unload the target molecule 60, so that the target molecule 60 is concentrated in a short time.
  • an optical path 26 for connecting a predetermined means for optically detecting the concentration change of the target molecule 60 can be provided.
  • the optical path 26 is made of, for example, a transmissive material that can transmit light in a specific wavelength range.
  • a change in the concentration of the target molecule 60 can be detected as, for example, a change in the absorption rate of the buffer solution in the unloading region 20 at a specific wavelength via the optical path 26.
  • the present invention is not limited to this, and the analysis unit 40 and the electrodes 41 to 44 as the electrical detection means shown in FIGS. 1 to 3 are arbitrarily used. Thus, it is also possible to detect a change in the concentration of the target molecule 60 in the unloading region 20 shown in FIG.
  • FIG. 5 is a diagram showing an example of a cancer sensor array including a motor protein device according to an embodiment of the present invention.
  • the target molecule 50 is a tumor marker.
  • FIG. 5A is a diagram for explaining the structure of a Si semiconductor substrate serving as a cancer sensor array
  • FIG. 5B is a diagram illustrating a cancer sensor array including a motor protein device.
  • the actin of the carrier molecule 50 transports the collected tumor marker, and the tumor marker is loaded in the unloading area 20. Take it down. In the unloading area 20, the tumor markers are unloaded and concentrated one after another over time. On the other hand, since the tumor marker is not concentrated in the reference region 25, the increase in the concentration of the target molecule 60 in the unloading region 20 is caused as a change in the impedance of the unloading region 20 measured by the analysis circuit 45 included in the analysis unit 40, or This can be detected as a change in impedance difference between the unloading region 20 and the reference region 25 by the analysis circuit 47.
  • the cancer sensor array can have a structure in which a plurality of motor protein devices are loaded, and can detect a plurality of tumor markers simultaneously and with high sensitivity. Become.
  • specimens include blood, serum, plasma, urine, sweat, sputum, prostate fluid, gastric fluid, intestinal fluid, renal fluid, lung fluid, cerebrospinal fluid, spinal fluid, sperm, etc. or brain, esophagus, stomach, lung, small intestine, Samples prepared from tissues such as the large intestine, pancreas, liver, kidney, bladder, spleen, thyroid, testicles, uterus, bone and the like can be included.
  • tumor markers examples include AFP, BCA225, CA15-3, CA19-9, CA72-4, CA125, CEA, CYFRA, DUPAN-2, NMP22, NSE, PA (PSA), PIVKA-II, ProGRP, SCC , SLX, TPA, ⁇ -Sm, anti-p53 antibody, elastase 1 and the like.
  • a Si semiconductor substrate having a surface structure having a track-like flow path exemplified in FIG. 5A was manufactured by a standard CMOS process.
  • the channel width of the unloading region 20 and the reference region 25 is 1.2 ⁇ m
  • the channel width of the arc of the loading region 90 is 10 ⁇ m.
  • a counter electrode and an electrode pad 91 using a metal wiring layer were formed in the flow path of the unloading region 20 and the reference region 25.
  • the obtained Si semiconductor substrate was ultrasonically cleaned with isopropyl alcohol for 1 hour, heated in a dust-free manner at 60 ° C. for 2 hours, and dried. Furthermore, the surface coating agent (manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., KJC7022) was adjusted to 0.001 mg / mL, and the Si semiconductor substrate was coated with a spin coater. This was heated and dried at 60 ° C. for 5 hours in a dust-free manner, and the surface of the Si semiconductor substrate was hydrophobized.
  • the surface coating agent manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., KJC7022
  • the cover glass covering the unloading region 20 and the reference region 25 was subjected to ultrasonic cleaning with a cleaning solution (0.1 M KOH + 70% ethanol) for 1 hour, and further cleaned with pure water. In a dust-free manner, the surface of the cover glass was made hydrophilic by heating and drying at 60 ° C. for 5 hours.
  • a cleaning solution 0.1 M KOH + 70% ethanol
  • An anti-human CEA monoclonal antibody (1.0 mg / mL), which is a tumor marker for early lung cancer, was selected as antibody 80 and printed on the unloading area 20 by an ink jet method.
  • skeletal muscle actin fiber solution 1.0 mg / mL skeletal muscle actin fiber diluted with 25 mM KCl, 2.0 mM ATP, 0.1 mM CaCl 2 , 10 mM sodium creatine phosphate, 10 mg / mL creatine kinase
  • 50-fold amount of 2-mercaptoethanol of SM (PEG) 12 was added to prepare a transport unit protein.
  • a diethylaminoethyl (DEAE) ion exchange membrane was mounted on a Si semiconductor substrate, and the surrounding water was sucked.
  • a cover glass that had been subjected to a surface treatment was attached, and a hydrophilic adhesive was used to press and adhere.

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Abstract

【課題】目的の抗体を効率的に搬送して検出することができるモーター蛋白デバイスを提供する。 【解決手段】本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して担体分子から目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域を含む。さらに、該モーター蛋白デバイスは、捕集領域と荷降ろし領域の間に設けられ担体分子が目的分子を搬送可能な搬送路、および荷降ろし領域における目的分子の濃度変化を検出する分析部を含む。荷降ろし領域は、担体分子に修飾された所定抗体よりも高い補足力の所定抗体を含み、目的分子は荷降ろし領域に濃縮される。担体分子は、所定抗体を修飾したアクチンを含み、搬送路は固定化されたミオシンを含む。

Description

モーター蛋白デバイス
　本発明は、所望の分子を目的地まで搬送し、搬送された分子を分離し濃縮することのできるモーター蛋白デバイスに関する。
　従来、目的ＤＮＡ等を高効率に輸送するために、キネシンやミオシンを固定化した基板上に、モーター蛋白と相互作用する微小管やアクチンを滑走させ、これらのモーター蛋白等を用いて目的分子を捕集する方法またはデバイス等が知られている（特許文献１乃至３参照）。
　特許文献１には、キャリア分子に積載用の一本鎖ＤＮＡを結合して荷物分子を積載して滑走運動させ、目的地における二本鎖ヌクレオチドの形成により荷物分子を積み降ろす技術が記載されている。
　特許文献２には、結合機能性核酸を結合した微小管、およびキネシンが塗布された基板を用いて、標的ＲＮＡを回収精製する分子モータシステムが記載されている。
　特許文献３には、プローブＤＮＡコンジュゲート微小管、およびキネシンを塗布した基板を用いて、選択的に目的の標的ＤＮＡを移動させる分子モータシステムが記載されている。
　さらに、目的分子が所定領域に搬送されたことを検出するために、担体分子に蛍光標識等を設けて光学的に検出することが知られている（特許文献４参照）。
特開２００７－１１１００４号公報 特開２００６－２８８３３６号公報 特開２００６－２０４２４１号公報 特表２００５－５３０５１７号公報
　しかしながら、上述のように、特定のＤＮＡ等を搬送する報告はあるものの、特定の抗原を搬送する技術については、今までに報告がない。
　本発明は、目的の抗原を効率的に搬送して濃縮・検出する技術を提供することを主目的とする。
　上述した目的を達成するために鋭意研究したところ、本発明者らは、外部環境の変化に応答して生体から産出される物質を効率的に搬送して濃縮・検出することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
（１）本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して担体分子から目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域を含む。
（２）また、本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を含む複合体を荷降ろしする荷降ろし領域とを含む。
（３）　さらに、捕集領域と荷降ろし領域の間に設けられ担体分子が目的分子を搬送可能な搬送路を含むことを特徴とする請求項（１）または（２）に記載のモーター蛋白デバイス。
（４）　さらに、荷降ろし領域における目的分子の濃度変化を検出する分析部と接続することを特徴とする請求項（１）乃至（３）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（５）　担体分子は、所定抗原と結合可能な所定抗体としての部分構造を含むことを特徴とする請求項（１）乃至（４）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（６）　荷降ろし領域は、担体分子に修飾された所定抗体よりも高い補足力の、目的分子との結合能を有する物質を含むことを特徴とする請求項（１）乃至（５）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（７）　搬送路は、担体分子と相互作用して担体分子を移動させる蛋白が固定化されていることを特徴とする請求項（３）乃至（６）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（８）　担体分子は、所定抗体を修飾した分子を含み、搬送路は表面に固定化されたモーター蛋白を含むことを特徴とする請求項（３）乃至（７）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（９）　所定抗体は、少なくとも１つの目的分子との結合能を有することを特徴とする請求項（１）乃至（８）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（１０）　分析部は、荷降ろし領域における目的分子の電気的検出手段を含むことを特徴とする請求項（４）乃至（９）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（１１）　分析部は、荷降ろし領域における目的分子の光学的検出手段を含むことを特徴とする請求項（４）乃至（９）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（１２）　前記目的分子が腫瘍マーカーである請求項（１）乃至（１１）のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
（１３）　請求項（１２）に記載のモーター蛋白デバイスを備えることを特徴とするがんセンサアレー。
　これらのように構成することにより、本発明に係るモーター蛋白デバイスにおいて、捕集領域においては抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集し、荷降ろし領域においては化学平衡を利用して担体分子から目的分子を荷降ろしすることができる。荷降ろし領域は、単位表面積において担体分子に修飾された所定抗体よりも高い補足力の所定抗体を含むため、本発明に係るモーター蛋白デバイスは、担体分子が目的分子を次々と搬送して荷降ろし領域に荷降ろしすることにより、荷降ろし領域に目的分子を濃縮することができる。
　本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、目的の分子を効率的に搬送して検出することができる。また、本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、荷降ろし領域において目的分子を濃縮することにより、目的分子を高感度に検出することができる。
本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの基本構成を例示する図。 本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスが目的分子を濃縮することを説明する図。 本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの搬送路の例を示す図。 本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの別の実施形態を示す図。 本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーを例示する図。 本発明の一実施形態にかかるデバイスと従来法の、評価を示す図。
　図１は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの基本構成を例示する図である。
　本発明にかかるモーター蛋白デバイス１は、捕集領域１０、荷降ろし領域２０を含む。これらの領域は、例えば、蛋白を固定化可能な基板上に設けられ、緩衝溶液等で満たされる。また、当該緩衝溶液は、必要に応じ、モーター蛋白を活性化するためのＡＴＰ（アデノシン３リン酸）等を含有することができる。
　捕集領域１０は、抗原抗体反応を利用して担体分子５０が目的分子６０を捕集する領域である。担体分子５０には、所定抗原との結合が可能な抗体を予め修飾することができる。
　一例として、担体分子５０は、所定抗体を修飾したアクチンを含み、捕集領域１０および荷降ろし領域２０は、固定化されたミオシンを含むことができる。
目的分子６０は、抗原抗体反応を利用した濃縮・検出において、濃縮・検出の目的となる分子のことをいう。目的分子６０は、担体分子５０に捕集されるものであれば、特に限定されない。目的分子６０は、目的分子６０を化学修飾した誘導体や、所定抗体との結合が可能な抗原部位６１を修飾したものを含むことができる（図２（ｃ）参照。）。一例として、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類及び核酸等を含む。さらに、抗原、免疫グロブリン、腫瘍マーカー、リガンド、ウイルス、細菌等を含むことができる。
　荷降ろし領域２０は、化学平衡を利用して担体分子５０から目的分子６０を荷降ろしする領域である。荷降ろし領域２０は、単位表面積において担体分子５０に修飾された所定抗体よりも高い補足力または高濃度の、目的分子６０又は所定抗原との結合能を有する物質を含むことができる。一例として、荷降ろし領域２０は、目的分子６０と結合可能な抗体８０を含み、抗体８０が担体分子５０よりも高い補足力を有すること、または高濃度であることにより、化学平衡を利用して、目的分子６０を担体分子５０から荷降ろしさせることができる。
　さらに、モーター蛋白デバイス１は、荷降ろし領域２０における目的分子６０の濃度変化を検出する分析部４０と接続し、目的分子６０が荷降ろし領域２０に荷降ろしされたことを検出することができる。分析部４０は、例えば、電気的検出手段の一部としての電極４１、４２を備え、これらの電極４１、４２を介して荷降ろし領域２０のインピーダンスまたは当該インピーダンスの変化を検出することができる。すなわち、モーター蛋白デバイス１において、荷降ろし領域２０のインピーダンスまたは当該インピーダンスの変化として、荷降ろし領域２０における目的分子６０の濃度変化を検出することができる。
　一例として、上記所定抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリンとの結合能を有することができる。
　これらのように構成することにより、モーター蛋白デバイス１の担体分子５０は、捕集領域１０において、抗原抗体反応を利用して、目的分子６０としての免疫グロブリンを捕集した後、荷降ろし領域２０まで移動できる。荷降ろし領域２０においては、単位表面積において担体分子５０に修飾された抗体よりも高い補足力または高濃度の抗体が含まれているため、目的分子６０としての免疫グロブリンは、化学平衡により、荷降ろし領域２０にある抗体に結合する。すなわち、担体分子５０は、目的分子６０を荷降ろし領域２０に荷降ろしすることができる。時間の経過により、担体分子５０が次々に荷降ろし領域２０において免疫グロブリンを荷降ろしし続けることにより、荷降ろし領域２０には免疫グロブリンが濃縮される。この免疫グロブリンの濃縮は、分析部４０により、荷降ろし領域２０のインピーダンスの変化として検出することができる。
　図２は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスが目的分子を濃縮することを説明する図である。図２（ａ）は、担体分子５０の荷降ろし領域２０への移動を説明する図であり、図２（ｂ）及び図２（ｃ）は、担体分子５０が荷降ろし領域２０において目的分子６０を荷降ろしすることを説明する図である。
　図２（ａ）において、担体分子５０は、捕集した目的分子６０を搬送路３０に沿って搬送する。搬送路３０は、例えば、前述の捕集領域１０と荷降ろし領域２０との間に設けられる通路であり、捕集領域１０と同様に固定化されたミオシン７０等を含むことができる。なお、搬送路３０は、捕集領域１０から独立した通路でもよく、捕集領域１０または荷降ろし領域２０の一部であってもよい。搬送路３０は、荷降ろし領域２０に到達する複数の通路からなっていてもよい。
　図２（ａ）に例示する分析部４０は、電気的検出手段としての分析回路４５、４６、４７を含む。分析回路４５は、電極４１、４２を介して、荷降ろし領域２０のインピーダンスを測定するために用いられる。分析回路４６は、電極４３、４４を介して、参照領域２５のインピーダンスを測定するために用いられる。参照領域２５は、前述の抗体８０を含まないこと以外は、荷降ろし領域２０と同等に設けられる。分析回路４７は、分析回路４５が測定した荷降ろし領域２０のインピーダンスと、分析回路４６が測定した参照領域２５のインピーダンスとの、差分を測定するために用いられる。
　図２（ｂ）において、荷降ろし領域２０には、担体分子５０よりも高い補足力を有する、または高濃度の抗体８０が固定化されている。したがって、荷降ろし領域２０に担体分子５０が到達すると、化学平衡により、担体分子５０に結合する目的分子６０よりも抗体８０に結合する目的分子６０が増加する。すなわち、目的分子６０は、荷降ろし領域２０において担体分子５０から荷降ろしされる。荷降ろし領域２０および参照領域２５には、固定化されたミオシン７０が含まれ、荷降ろし後の担体分子５０は、荷降ろし領域２０に滞留することなく、これらの領域を通過する。後続の担体分子５０は、引き続き、荷降ろし領域２０に到着することができる。
　このようにして、荷降ろし領域２０には、目的分子６０が時間の経過とともに次々に荷降ろしされ、濃縮される。荷降ろし領域２０における目的分子６０の濃度上昇にしたがい、荷降ろし領域２０のインピーダンスの容量成分が増加する。一方、参照領域２５には目的分子６０が濃縮されないため、参照領域２５のインピーダンスは実質的に変化しない。したがって、荷降ろし領域２０における目的分子６０の濃度上昇は、分析回路４５が測定する荷降ろし領域２０のインピーダンスの変化として、あるいは分析回路４７による荷降ろし領域２０と参照領域２５とのインピーダンスの差分の変化として、検出することができる。
　また、図２（ｃ）に例示するとおり、目的分子６０に担体分子５０の一部が結合する、あるいは抗原部位６１を修飾した目的分子６０を含む複合体であっても、荷降ろし領域２０のインピーダンスの容量成分は増加するため、荷降ろし領域２０における目的分子６０の濃度上昇を検出することができる。
　図２（ａ）（ｂ）及び（ｃ）には、一つの搬送路３０、荷降ろし領域２０における一対の電極４１、４２、および参照領域２５における一対の電極４３、４４を例示したが、これらに限定されず、搬送路３０の数およびインピーダンス測定のための電極の配置・形状等の態様は、任意に設計できる。
　図３は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの搬送路の例を示す図である。
　図３において、搬送路３０は、全体的に環状の通路の形状を有しており、この環状の通路である搬送路３０には固定化されたミオシン７０が全面に含まれている。捕集領域１０において目的分子６０を捕集した担体分子５０は、荷降ろし領域２０において目的分子６０を荷降ろしした後、搬送路３０の経路に沿って、再び捕集領域１０に戻ることができる。したがって、担体分子５０は、目的分子６０を捕集して荷降ろし領域２０に搬送して荷降ろしすることを繰り返し、目的分子６０を濃縮し続けることができる。
　このような担体分子５０の移動は、緩衝溶液を流動させるための機構を設ける必要なく、緩衝溶液中に存在するＡＴＰ等の化学エネルギー源により可能である。したがって、本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、無動力で動作可能な目的分子６０の濃縮手段として構成することが可能である。
　図４は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの別の実施形態を示す図である。
　図４において、荷降ろし領域２０は、複数のモーター蛋白デバイス１１ａ～ｈについての共通の荷降ろしのための領域として設けられる。これらのモーター蛋白デバイス１１ａ～ｈのそれぞれは、荷降ろし領域２０に向かって目的分子６０を搬送し、荷降ろしするよう構成される。したがって、図４に示す荷降ろし領域２０には、モーター蛋白デバイス１１ａ～ｈのそれぞれが目的分子６０を荷降ろしし続けることにより、短時間で目的分子６０が濃縮される。
　図４に示す荷降ろし領域２０には、目的分子６０の濃度変化を光学的に検出する所定手段を接続するための、光路２６を設けることができる。光路２６は、例えば、特定の波長範囲の光を通過することのできる透過材料等で構成される。目的分子６０の濃度変化は、例えば、光路２６を介した特定波長における荷降ろし領域２０の緩衝液の吸収率変化として、検出することができる。
　図４には、光学的検出手段のための光路２６を例示したが、これに限定されず、図１乃至３に示した電気的検出手段としての分析部４０および電極４１乃至４４を任意に用いて、図４に示す荷降ろし領域２０における目的分子６０の濃度変化を検出することも可能である。
図５は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーの例を示す図である。該がんセンサアレーでは、目的分子５０は腫瘍マーカーである。図５（ａ）は、がんセンサアレーとなるＳｉ半導体基板の構造を説明する図であり、図５（ｂ）は、モーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーを例示する図である。
がんセンサアレーの荷積み領域９０に、目的分子６０が含まれると思われる検体をのせると、担体分子５０のアクチンは捕集した腫瘍マーカーを搬送し、荷降ろし領域２０において腫瘍マーカーを荷降ろしする。荷降ろし領域２０には、腫瘍マーカーが時間の経過とともに次々に荷降ろしされ、濃縮される。一方、参照領域２５には腫瘍マーカーが濃縮されないため、荷降ろし領域２０における目的分子６０の濃度上昇は、分析部４０に含まれる分析回路４５が測定する荷降ろし領域２０のインピーダンスの変化として、あるいは分析回路４７による荷降ろし領域２０と参照領域２５とのインピーダンスの差分の変化として、検出することができる。
そして、図５（ｂ）に例示するように、該がんセンサアレーは、モーター蛋白デバイスを複数積載した構造をとることができ、複数の腫瘍マーカーを同時にかつ高感度に検出することが可能となる。
検体の一例として、血液、血清、血漿、尿、汗、痰、前立腺液、胃液、腸液、腎液、肺液、脳脊髄液、髄液、精子等あるいは脳、食道、胃、肺、小腸、大腸、すい臓、肝臓、腎臓、膀胱、脾臓、甲状腺、睾丸、子宮、骨等の組織から調製された試料を含むことができる。また、腫瘍マーカーの一例として、ＡＦＰ、ＢＣＡ２２５、ＣＡ１５－３、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡ１２５、ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ、ＤＵＰＡＮ－２、ＮＭＰ２２、ＮＳＥ、ＰＡ（ＰＳＡ）、ＰＩＶＫＡ－ＩＩ、ＰｒｏＧＲＰ、ＳＣＣ、ＳＬＸ、ＴＰＡ、γ―Ｓｍ、抗ｐ５３抗体、エラスターゼ１等を含むことができる。
（Ｓｉ半導体基板の作成）
本発明にかかる、がんセンサアレーについて、図５（ａ）を用いて説明する。まず、図５（ａ）に例示する、トラック状の流路を有する表面構造をもつＳｉ半導体基板を、標準ＣＭＯＳプロセスにより製作した。ここで、荷降ろし領域２０と参照領域２５の流路幅は１．２μｍ、荷積み領域９０の円弧の流路幅は１０μｍとした。荷降ろし領域２０と参照領域２５の流路には、メタル配線層を利用した対向電極及び電極パッド９１を形成した。
（Ｓｉ半導体基板の表面処理）
得られたＳｉ半導体基板を、イソプロピルアルコールで1時間超音波洗浄し、無塵中で、６０℃２時間加熱し、乾燥させた。さらに、表面コート剤（信越化学工業製、ＫＪＣ７０２２）を０．００１ｍｇ／ｍＬに調整し、Ｓｉ半導体基板にスピンコーターでコーティングした。これを無塵中で、６０℃５時間加熱して乾燥させ、Ｓｉ半導体基板の表面の疎水化処理を行った。
（カバーガラスの表面処理）
荷降ろし領域２０と参照領域２５を覆うカバーガラスを、洗浄液（０．１Ｍ　ＫＯＨ＋７０％エタノール）で1時間超音波洗浄後、さらに純水で洗浄した。無塵中で、６０℃５時間加熱して乾燥させ、カバーガラスの表面を親水化した。
（モーター蛋白の印刷）
２６μｇ／ｍＬの骨格筋ミオシンを、２５ｍＭ　ＫＣｌ、３．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５．０ｍＭ　ｐＨ緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）で希釈して得たｐＨ＝８．０のモーター蛋白溶液に、カバー蛋白質２０μｇ／ｍＬを加えた溶液を作製し、インクジェット方式でＳｉ半導体基板のトラック全面に印刷した。
（荷降ろし領域２０への抗体８０の印刷）
初期肺がんの腫瘍マーカーである、抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体（１．０ｍｇ／ｍＬ）を抗体８０として選択し、荷降ろし領域２０にインクジェット方式で印刷した。
（輸送ユニット蛋白の調整）
Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５を用い、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体０．５ｍＬを、５０ｍＭリン酸緩衝液にて調整した。これに２０００倍量の架橋剤であるＳＭ（ＰＥＧ）１２（ＴＨＥＲＭＯ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を加え、２５℃で３時間反応させた。さらに、ＳＭ（ＰＥＧ）１２の５０倍量のＴｒｉｓ－ＨＣｌを加えた後、５０ｍＭリン酸緩衝液にて調整した。これに、骨格筋アクチン繊維溶液（１．０ｍｇ／ｍＬの骨格筋アクチン繊維を、２５ｍＭ　ＫＣｌ、２．０ｍＭ　ＡＴＰ、０．１ｍＭ　ＣａＣｌ２、１０ｍＭクレアチンリン酸ナトリウム、１０ｍｇ／ｍＬクレアチンキナーゼにて希釈）を０．５ｍＬ加え、２５℃で３時間処理後、ＳＭ（ＰＥＧ）１２の５０倍量の２－メルカプトエタノールを加え、輸送ユニット蛋白を調整した。
（担体分子５０の作成とＳｉ半導体基板への注入）
輸送ユニット蛋白と、骨格筋アクチン繊維を１:１００００の割合で、溶媒（２５ｍＭ　ＫＣｌ、２５ｍＭ　ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、２．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭクレアチンリン酸、１００Ｕ／ｍＬクレアチンキナーゼ）中にて混合し、担体分子５０となるナノ輸送繊維を得た。これを、Ｓｉ半導体基板上に１５μＬ滴下した。さらに、２．０μＬを滴下し、表面の溶液２．０μＬを吸引洗浄した。Ｓｉ半導体基板上に、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）イオン交換膜を装着、周囲の水分を吸引した。表面処理を行ったカバーガラスを装着し、親水性接着剤を用い、加圧して接着した。
（インピーダンス計測と従来法との比較）
がんセンサアレーに、腫瘍マーカーＣＥＡを０．１０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬ含む人工血清を２．０μＬ滴下した。センサユニットの半導体回路を使い、インピーダンス計測を行った。測定は並列四端子法で行われ、流路の下に設けられた分析回路４７で、荷降ろし領域２０と参照領域２５のインピーダンス変化を差動検出し、その出力値を電圧に変換した。また比較例として、化学発光免疫測定法を使い腫瘍マーカーＣＥＡを検出した。両者の結果を図６に示す。この結果から、本発明による初期ガン検出能力は従来法と同等であり、電気的に測定できるため、安価で高速に行えることが判明した。
　以上、実施形態を用いて本発明を説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施形態に記載の範囲には限定されないことは言うまでもない。上記実施形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。またその様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
　　１、１１　モーター蛋白デバイス
　　１０　捕集領域
　　２０　荷降ろし領域
　　２５　参照領域
　　２６　光路
　　３０　搬送路
　　４０　分析部
　　４１、４２、４３、４４　電極
　　４５、４６、４７　分析回路
　　５０　担体分子
　　６０　目的分子
　　６１　抗原部位
　　７０　固定化ミオシン
　　８０　抗体
　　９０　荷積み領域
　　９１　電極パッド

Claims (13)

  1. 　抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、
    化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、
    を含むことを特徴とするモーター蛋白デバイス。
  2. 　抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、
    化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を含む複合体を荷降ろしする荷降ろし領域と、
    を含むことを特徴とするモーター蛋白デバイス。
  3. 　さらに、前記捕集領域と前記荷降ろし領域の間に設けられ前記担体分子が前記目的分子を搬送可能な搬送路を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のモーター蛋白デバイス。
  4. 　さらに、前記荷降ろし領域における前記目的分子の濃度変化を検出する分析部と接続することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  5. 　前記担体分子は、所定抗原と結合可能な所定抗体としての部分構造を含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  6. 　前記荷降ろし領域は、前記担体分子に修飾された前記所定抗体よりも高い補足力の、目的分子との結合能を有する物質を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  7. 　前記搬送路は、前記担体分子と相互作用して前記担体分子を移動させる蛋白が固定化されていることを特徴とする請求項３乃至６のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  8. 　前記担体分子は、所定抗体を修飾した分子を含み、前記搬送路は表面に固定化されたモーター蛋白を含むことを特徴とする請求項３乃至７のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  9. 　前記所定抗体は、少なくとも１つの目的分子との結合能を有することを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  10. 　前記分析部は、前記荷降ろし領域における前記目的分子の電気的検出手段を含むことを特徴とする請求項４乃至９のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  11. 　前記分析部は、前記荷降ろし領域における前記目的分子の光学的検出手段を含むことを特徴とする請求項４乃至９のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  12. 　前記目的分子が腫瘍マーカーである請求項１乃至１１のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  13. 　請求項１２に記載のモーター蛋白デバイスを備えることを特徴とするがんセンサアレー。
    　 
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