WO2013077532A1 - 무염반응을 위한 신규한 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체 - Google Patents

무염반응을 위한 신규한 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체 Download PDF

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WO2013077532A1
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glutamate decarboxylase
variant
gamma
acid
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PCT/KR2012/006711
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강택진
원기훈
호녹안투
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동국대학교 산학협력단
한국보건산업진흥원
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    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01015—Glutamate decarboxylase (4.1.1.15)

Definitions

  • the present invention is the development of a novel glutamate decarboxylase (GAD) developed to be active even at neutral pH and using the enzyme itself or cells containing the enzyme as a catalyst L-glutamate (L-glutamate) It relates to a method for producing gamma-aminobutyric acid (GABA) from.
  • GABA gamma-aminobutyric acid
  • GABA Gamma-aminobutyl acid
  • GABA is a nonproteinaceous amino acid that is an inhibitory neurotransmitter. Its effects are known to stabilize neurons, relieve stress, improve memory, lower blood pressure, reduce depression, prevent stroke and dementia.
  • GABA is a precursor of pyrrolidone, a monomer of polyamide 4, a useful plastic, which has recently highlighted the importance of producing GABA in biomass.
  • GABA production includes synthesis, extraction and bioconversion.
  • the solvent used is mainly toxic, and in the case of the extraction method, a large amount of waste is generated and the manufacturing cost of GABA is high.
  • Bioconversion is a method of producing GABA by decarboxylation of L-glutamate by using an isolated enzyme or a whole cell containing the enzyme as a biocatalyst. From an industrial perspective, producing GABA from environmentally friendly bioconversion processes from inexpensive raw materials such as L-glutamate is a very reasonable and valuable process.
  • the enzyme used for the conversion to GABA is pyridoxal 5-phosphate (PLP) -dependent glutamate decarboxylase (GAD) (EC 4.1.1.15), which is derived from microorganisms such as lactic acid bacteria, Escherichia coli, and Bacillus. Used.
  • the bacterial glutamate decarboxylase has a pH range of 3.5 to 6.0, an optimal pH of 3.8 to 4.6, and rarely occurs when the pH is below 3.5 or above 6.0. This enzyme removes carbon dioxide (CO 2 ) from the carboxy group bound to the ⁇ -carbon of glutamate, which increases the pH (see FIG. 1).
  • the pH increases as GABA is generated by the enzyme catalyst, which causes the reaction to be gradually delayed and eventually stops. Therefore, in the case of a high concentration substrate reaction, conventionally, after adjusting to an optimal pH using a buffer solution or a substrate, as the reaction proceeds, an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, acetic acid, etc. was added as a pH regulator to adjust the pH of the reaction solution.
  • an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, acetic acid, etc. was added as a pH regulator to adjust the pH of the reaction solution.
  • the existing method has a problem in that a large amount of salt is generated by adding an acid in proportion to the amount of GABA generated during the reaction.
  • the present invention enzymatically prepares gamma-aminobutyl acid (GABA) using L-glutamate as a substrate, and expands the active pH range of the enzyme to produce gamma-aminobutyl acid at high concentration without pH adjustment through acid addition. To provide a method.
  • GABA gamma-aminobutyl acid
  • the present invention provides a glutamate decarboxylase variant in which threonine at the carboxy terminus is deleted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or alanine is added at the carboxy terminus.
  • the present invention also provides a gene encoding the glutamate decarboxylase variant.
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising the gene.
  • the present invention also provides a transformant transformed with the recombinant vector.
  • the present invention also provides a method for preparing gamma-aminobutyl acid, comprising contacting the glutamate or glutamate salt substrate with the glutamate decarboxylase variant.
  • the present invention provides a method for producing gamma-aminobutyl acid comprising the step of contacting the transformant with a glutamate substrate.
  • the present invention also provides a method of preparing carbonated water comprising contacting the glutamate decarboxylase variant with a glutamate substrate in water without addition of a pH buffer or acid.
  • the present invention provides a method for preparing carbonated water comprising contacting the transformant with a glutamate substrate in water without adding a pH buffer or an acid.
  • the glutamate decarboxylase variant of the present invention exhibits activity at neutral pH and catalyzes the decarboxylation reaction of glutamate to gamma-aminobutyl acid, and can perform a high concentration conversion reaction without the addition of a pH adjuster. It is possible to produce carbonated water including drinkable gamma-aminobutyl acid and gamma-aminobutyl acid.
  • 1 is a scheme for producing gamma-aminobutyl acid from the decarbonation reaction of glutamate using glutamate decarboxylase as a catalyst.
  • Figure 2 is a diagram showing the pH-dependent structural change of the glutamate decarboxylase carboxy terminal.
  • Figure 3 is a graph showing the activity according to the pH of glutamate decarboxylase variants (Wild type, wild-type glutamate decarboxylase; ⁇ 466, carboxyl-terminated threonine variant; Ala467, alanine added to the carboxy terminus Variants).
  • Figure 4 shows the conversion over time of 1 M glutamate and 0.02 mg glutamate decarboxylase enzyme in water.
  • FIG. 5 shows the conversion over time of 2 M glutamate and 0.02 mg glutamate decarboxylase enzyme in water.
  • the present invention provides a glutamate decarboxylase variant in which the threonine at the carboxy terminus is deleted or the alanine is added at the carboxy terminus in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the carboxy terminal portion of the glutamate decarboxylase forms a loop structure in three dimensions, contributing to the acid-dependence of glutamate decarboxylase.
  • the carboxy terminus of glutamate decarboxylase does not have a structure under acidic conditions but has a well-organized structure under neutral conditions and simultaneously blocks the substrate binding site where the coenzyme pyridoxal 5′-phosphate is present (FIG. 2). Removing the carboxy terminal amino acid moiety of glutamate decarboxylase can inhibit formation of the structure at neutral pH, thereby preventing glutamate decarboxylase from deactivating at neutral pH.
  • the deletion and addition of the carboxy terminal amino acid during the preparation of the glutamate decarboxylase variant may use a site-directed mutagenesis method using a polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • Regioselective mutations are genetic engineering techniques in which only specific amino acids to be altered in a protein are changed exactly as desired, and a technique is used to change a specific amino acid in a protein to another amino acid.
  • the present invention is not limited thereto, and the preparation of the variants may be performed using any method known in the art.
  • the glutamate decarboxylase used in the examples of the present invention is obtained by cloning a gene and purifying the expression in a suitable host cell.
  • the glutamate decarboxylase of the present invention is preferably derived from E. coli but is not limited thereto, and may be derived from various microorganisms.
  • Lactobacillus plantarum Lactobacillus brevis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus sakei , Listeria monocytogenes , Yeast ( Saccharomyces cerevisiae ), Bacteroides fragilis , Dibariomycox han ( Debary mycosis han ) Terium ( Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis ), Aspergillus nidulans , Lactococcus lactis , Candida glabrata , and the like.
  • glutamate decarboxylase derived from lactic acid bacteria is easy to consume, and when ingested, the balance of intestinal flora is improved through the proliferation of intestinal useful bacteria and inhibition of harmful bacteria, food poisoning, constipation Can be prevented.
  • the glutamate decarboxylase variant has an affinity tag inserted at an amino terminus, and the affinity tag is histidine, His, maltose binding protein (MBP), thioredoxin ( thioredoxin, Trx), N utilization substance A (NusA), or glutathione-S-transferase (GST) tags, but is not limited thereto.
  • affinity tag is histidine, His, maltose binding protein (MBP), thioredoxin ( thioredoxin, Trx), N utilization substance A (NusA), or glutathione-S-transferase (GST) tags, but is not limited thereto.
  • affinity tag refers to a polypeptide fragment that can be attached to a polypeptide or protein to provide purification or detection of the polypeptide or protein or to provide a site for attachment of the polypeptide or protein to a substrate.
  • the variant is preferably a glutamate decarboxylase variant consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the variant consisting of SEQ ID NO: 2 is a glutamate decarboxylase variant which lacks one amino acid threonine at the carboxy terminus and has a histidine tag at the amino terminus.
  • the variant consisting of SEQ ID NO: 4 is a glutamate decarboxylase variant having one extra amino acid alanine added at the carboxy terminus and a histidine tag at the amino terminus.
  • a protein purification method in order to facilitate the purification of glutamate decarboxylase, can be used which introduces a histidine-tag at the amino terminus of the glutamate decarboxylase. have.
  • This uses the affinity chromatography principle and can be purified using histidine-tags having five to six histidines attached thereto. Histidine-tags are expressed by genes in view of their strong affinity with substrates, and are widely used for purification by making a fusion protein in front of the protein to be purified.
  • Histidine-tag has only 6 amino acids, it is small in size and does not affect the original protein structure, so it does not need to be cut separately after making a recombinant protein.
  • GST-tag glutthione-S-transferase tag
  • Histidine-tag is much more specific than histidine-tag, but the size of the tag is so large that when the fusion protein is produced, it is troublesome to cut the tag after purification.
  • histidine-tag is a peptide in which five or six histidines, one of the amino acids, are contiguous and have an amino acid sequence of His-His-His-His-His-His. Since histidine-tags have an affinity with divalent metal ions, purification usually involves Nickel immobilized bead or Cobalt immobilized bead. This method is called IMAC (immobilized metal affinity chromatography).
  • the method of eluting the protein in which the histidine-tag is introduced is, firstly, a method of adding affinity competitors to metal ions and secondly, a method of changing pH.
  • the method of adding affinity competitors to metal ions is a principle that the metal ions have affinity with the imidazole ring of histidine, so if a high concentration of imidazole is flowed, the protein containing the histidine falls from the metal ion.
  • the method of changing the pH is a principle that the histidine-tag falls from the metal since the charge state of the metal ion is changed to have no affinity.
  • it is more preferable to use a method of adding an affinity competitor but is not limited thereto, and protein purification may be performed using any method known in the art.
  • Glutamate decarboxylase variants of the present invention are prepared by depleting threonine at the carboxy terminus of the wild type (SEQ ID NO: 2) or by adding alanine (SEQ ID NO: 4), so that the enzyme activity is in a neutral pH range compared to the wild type. It can be usefully used as a novel glutamate decarboxylase which can be expanded (see FIG. 3) and can carry out a high concentration conversion reaction without addition of a pH adjuster (see FIGS. 4 and 5).
  • the present invention also provides a gene encoding the glutamate decarboxylase variant.
  • the gene is preferably a gene consisting of a nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, but is not limited thereto, and may include a gene consisting of a nucleic acid sequence encoding a glutamate decarboxylase variant according to the present invention. .
  • the present invention also provides a recombinant vector comprising a gene encoding the glutamate decarboxylase variant.
  • Recombinant vector that can be used in the present invention include plasmids (pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, pGEM-T Easy, pQE30, etc.) mainly used in the art, phage ( ⁇ -Charon, etc.) , ⁇ z1, M13, etc.) or viruses (SV40, etc.) may be produced.
  • the vectors of the invention may be fused with an affinity sequence to facilitate purification of the glutamate decarboxylase expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, histidine (His), maltose binding protein (NEB, USA), thioredoxin (TrX), Nutilization substance A (NusA) or glutathione S-transferase (Glutathione-S-transferase). , GST), and the like. Because of the additional sequence for the purification, the protein expressed in the host can be purified quickly and easily through affinity chromatography.
  • Fusion proteins expressed by the vector containing the fusion sequence are purified by affinity chromatography. For example, when glutathione-S-transferase is fused, glutathione, which is a substrate of this enzyme, can be used, and when 6 ⁇ His is used, a desired glutamate decarboxylase is carried out using a Ni-NTA His-binding resin column. Proteins can be obtained quickly and easily.
  • the present invention also provides a transformant transformed with a recombinant vector comprising a gene encoding the glutamate decarboxylase variant.
  • transformants can be prepared by transforming the vector into a suitable host cell.
  • Such transformants may use any host cell known in the art, for example E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E Enteric bacteria, such as strains of the genus Bacillus, such as coli X1776, E. coli W3110, E. coli DH5 ⁇ , E. coli M15, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Salmonella typhimurium, Serratia marsonsons and various Pseudomonas species. And strains.
  • yeast Saccharomyces cerevisiae, etc.
  • insect cells and animal cells CHO cell line ( Chinese hamster ovary ), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines, etc.
  • CHO cell line Chinese hamster ovary
  • W138 BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines, etc.
  • the method of carrying the vector of the present invention into the host cell is performed by the CaCl 2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)) when the host cell is a prokaryotic cell. , Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 ( 1988) and the like.
  • the host cell is a eukaryotic cell
  • a micro-injection method Capecchi, MR, Cell, 22: 479 (1980)
  • calcium phosphate precipitation method Graham, FL et al., Virology, 52: 456 (1973)
  • Electroporation Nectron et al.
  • liposome-mediated transfection Wong, TK et al., Gene, 10:87 (1980)
  • DEAE- Dextran treatment Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)
  • gene balm Yang et al., Proc. Natl. Acad.
  • Vectors injected into host cells can be expressed in host cells, in which case a large amount of glutamate decarboxylase protein is obtained.
  • the expression vector comprises a lac promoter
  • gene expression may be induced by treating IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thio-galactopyranoside) to the host cell.
  • the present invention provides a method for preparing gamma-aminobutyl acid comprising contacting glutamate or glutamate salts with the glutamate decarboxylase variants.
  • the reaction may be carried out at pH 3.5 ⁇ 7.0.
  • the wild type requires acidic conditions to exhibit activity, but the glutamate decarboxylase variants of the present invention have the advantage of being able to exhibit activity over a wide pH range because they are acid-dependent.
  • the glutamate decarboxylase variant may be immobilized on a solid support.
  • Enzyme immobilization is the immobilization of an enzyme to an insoluble carrier by chemical or physical methods to limit its mobility.
  • Immobilized glutamate decarboxylase enzymes offer significant advantages in the bioconversion process compared to free enzymes. Fixing enzymes can be reused, saving money and eliminating the need for separation after use.
  • the immobilized enzyme since the immobilized enzyme is insoluble, it can be used in a continuous reactor and has an advantage of reducing the sensitivity of the enzyme to changes in external conditions.
  • Immobilization of proteins, especially enzymes, to solid supports can be carried out through various methods known in the art (Weetall, HH, Preparation of immobilized proteins covalently coupled through silane coupling agents to inorganic supports.Appl. Biochem. Biotech. 41 : 157-188 (1993); Weetall, HH, Methods in Enzymology. 44: 134-148 (1976).
  • Solid supports to which the glutamate decarboxylase of the present invention is immobilized include, but are not limited to, porous silica, silica, porous glass beads, controlled-pore glass, porous ceramics, porous alumina, and porous titania. no.
  • the glutamate decarboxylase variant and glutamate are contacted in water without addition of a pH buffer or acid, but are not limited thereto.
  • a method of preparing gamma-aminobutyl acid in pure water without addition of a buffer solution or a pH adjuster may be performed through a reaction system using glutamate as a substrate and a buffer.
  • the resulting salt-free gamma-aminobutyl acid is drinkable.
  • Gamma-aminobutyl acid is an inhibitory neurotransmitter that acts on the central nervous system of mammals and is, in principle, included in amino acids but not in proteins.
  • Gamma-aminobutyric acid is known to be involved in the regulation of many physiological mechanisms to promote blood flow to the brain and increase the oxygen supply in animals to promote the metabolism of brain cells, and to regulate the secretion of prolactin and growth hormone. It is also known to be effective in lowering blood pressure and pain relief, etc., and therefore has a very high pharmacological interest.
  • Intravenous drugs are used to improve brain blood flow and brain metabolism in stroke and cerebral artery sequelae, and are also sold as oral prescription drugs.
  • gamma-aminobutyl acid is known to play an important role in the prevention of high blood pressure, pain relief, etc. Recently, interest in gamma-aminobutyl acid as a functional food material, as well as the use as a medicament is increasing.
  • a typical food product is GABARON-TEA, which is developed in Japan, and a product with increased gamma-aminobutyl acid content in green tea is sold.
  • GABARON-TEA GABARON-TEA
  • a product with increased gamma-aminobutyl acid content in green tea is sold.
  • research has been conducted using various plant materials which have increased the gamma-aminobutyl acid content by anaerobic treatment of green tea leaves.
  • Glutamate is known as anxiety and excitatory neurons, and there is a risk of harm to the human body if consumed in large quantities.
  • the present invention provides a method for producing gamma-aminobutyl acid, which comprises contacting a glutamate or glutamate salt substrate with the transformant.
  • the method may be a method for producing gamma-aminobutyl acid, which is carried out by culturing the transformant in a medium containing a glutamate or glutamate salt substrate.
  • This preparation method is different from the above-described method using an enzyme in terms of producing gamma-aminobutyl acid by directly contacting the reactive material with cells expressing glutamate decarboxylase variants.
  • the method of directly using the cells for gamma-aminobutyl acid production can be divided into two types.
  • the first method is a culture method
  • the second method is to use immobilized cells.
  • the method for preparing gamma-aminobutyl acid is carried out by culturing a transformant transformed with a recombinant vector expressing a truncated glutamate decarboxylase variant in a medium containing glutamate or a salt thereof.
  • any medium known in the art may be selected according to the type of host cell.
  • Luria-Bertani (LB) medium, deMan Rogosa Sharpe (MRS) broth medium, All Purpose with Tween (APT) medium, or Brain Heart Infusion (BHI) medium may be used.
  • the carbon source used may be various carbohydrates, and may be sucrose, glucose, fructose, galactose, arabinose and lactose.
  • the nitrogen source used in the medium of the method of the present invention is an organic nitrogen source, and may be yeast extract, proteose peptone No. 3 and peptone.
  • Gamma-aminobutyl acid is produced by culturing host cells expressing truncated glutamate decarboxylase variants in the medium and in the presence of glutamate or glutamate salt substrates.
  • the transformant is preferably immobilized on a solid support, but is not limited thereto.
  • transformants expressing glutamate decarboxylase variants are immobilized on a solid support for cell immobilization.
  • the transformant of the present invention can be immobilized on a solid support because the activity of the glutamate decarboxylase variant is expressed over a wide range such as pH 3.5-7.0.
  • Solid supports used for cell immobilization include alginate, polyacrylamide, agarose and chitosan, and typically alginate can be used.
  • Cell immobilization can be carried out through various methods known in the art (Fukui, S. And A. Tanaka, Immobilized microbial cells.Annu. Rev. Microbiol., 36: 145-172 (1982) Kierstan, M. and Bucke, C. The immobilization of microbial cells, subcellular organelles, and enzymes in calcium alginate gels, Biotechnol. Bioeng., 19: 387-397 (1977); Kierstan, M. and Coughlan, P., Immobilization of cells and enzymes by gelentrappment.In Immobilized Cells and Enzymes, ed. J. Woodward, pp. 39-48. IRL Press, Oxford. (1985)).
  • the transformant and the glutamate substrate are contacted in water without addition of a pH buffer or acid, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method of preparing carbonated water comprising contacting the glutamate decarboxylase variant, or the transformant, with a glutamate substrate in water without addition of a pH buffer or acid.
  • the glutamate decarboxylase variant may be immobilized on a solid support.
  • the transformant may be immobilized on a solid support.
  • the carbonated water helps to alleviate various diseases by promoting excellent warmth and promoting blood circulation, it has been used in baths using hot springs since ancient times. This action of the carbonated water is considered to be because the containing carbon dioxide has a peripheral vasodilating action to improve the body environment. Specifically, it has been disclosed that an increase and expansion of capillaries occurs due to the transdermal entry of carbon dioxide gas, which improves blood circulation of the skin, and is effective in treating degenerative lesions and peripheral circulation disorders.
  • the carboxy terminus of glutamate decarboxylase is a structure in which the substrate binding site is capable of binding to the substrate under acidic conditions but has a well-organized structure under neutral conditions and at the same time blocks the substrate binding site where the coenzyme pyridoxal 5'-phosphate is present. It is known to be (Fig. 2). Therefore, the carboxy terminus of E. coli DH5 ⁇ -derived glutamate decarboxylase (SEQ ID NO: 1) was modified to control pH dependence. Variant construction used a conventional site-directed mutagenesis method using polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR polymerase chain reaction
  • PET-28 primer was used in the ⁇ 465_F (5'-ACAGAACAGCTTTAAACATTAACTCGAGCACCACCACCACCACCA-3 ', SEQ ID NO: 6)
  • ⁇ 465_R (5'- GGTATTGCCCAACAGAACAGCTTTAAA-3', SEQ ID NO: 7) primerb to prepare a variant without the threonine amino acid at the carboxy terminus. Both cloned glutamate decarboxylase and vector sequences were mutated amplified by PCR.
  • A466_F (5'-ACAGAACAGCTTTAAACATACCGCTTAACTCGAGCACCACCACCACCACCACCA-3 ', SEQ ID NO: 8) and ⁇ 465_R (5'- GGTATTGCCCAACAGAACAGCTTTAAA-3', SEQ ID NO: 7) were used for preparation of the mutant introduced with alanine following the amino acid threonine at the carboxy terminus.
  • PCR reaction solution Engineics , Korea
  • Dpn I Takara, Japan
  • All genes were identified by nucleic acid sequencing, and the wild type and the clones into which the desired mutations were introduced were expressed in E. coli BL21 (DE3) and isolated in nearly pure form using Ni-NTA agarose (Merck, USA).
  • ultrafiltration was performed to remove imidazole (Sigma, USA) from the enzyme.
  • the citrate-phosphate buffer system was used to confirm the initial reaction rate according to the pH of the variants prepared in Example 1.
  • the buffer solution was mixed with 0.1 M citrate and 0.2 M disodium phosphate in an appropriate ratio to prepare various pH buffers.
  • 100 mM L-monosodium glutamate (MSG, Sigma, USA), 1 mM PLP (pyridoxal-5'-phosphate, Sigma, USA), 0.1 mM DTT (dithiothreitol, Sigma, USA), 0.01 mg purified enzyme in each buffer solution was added and reacted at 37 ° C. for 10 minutes.
  • 0.01 mL of the reaction solution was taken, mixed with 0.09 mL of 100 mM Tris-HCl (pH 8.5), and heated at 95 ° C for 10 minutes to stop the reaction. This was quantified using Gabase (Sigma, USA).
  • the mutants showed higher inactivation in acidity compared to enzymes without carboxy-terminus removal.
  • the wild-type showed no activity at all above pH6, but still showed high activity in the variants (FIG. 3).
  • both wild-type and variant showed 100% conversion under the reaction conditions using glutamate as a buffer.
  • the carboxy terminal variant exhibited a full conversion of about 50% faster, and was expected to be more industrially useful (FIG. 4).
  • the conversion rate was almost 100% after 18 hours in both wild-type and variant.
  • the conversion rate of the carboxy terminal variant, in particular ⁇ 466 variant is higher industrially than the wild type (Fig. 5).

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Abstract

본 발명은 중성 pH에서도 활성을 띠는 신규 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase, GAD)의 개발과 이 효소 자체나 효소를 함유한 세포를 촉매로 사용하여 고농도 L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 신규 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 야생형의 글루타메이트 디카르복실라아제의 아미노 말단에 분리를 위한 히스티딘-택을 추가하고, 카르복시 말단의 트레오닌을 제거하거나 잉여의 잔기인 알라닌을 추가함으로써 제조함으로써, 활성 pH 범위가 야생형에 비해 중성으로 넓어졌으며 감마-아미노부틸산 합성 효율도 야생형에 비해 향상되어 거의 100% 전환률을 나타내므로, 활성 pH 범위의 확장과 글루타메이트를 기질인 동시에 완충제로 사용하는 반응계를 개발하여 인체에 무해한 무염의 감마-아미노부틸산을 제조하고 이를 섭취할 수 있다.

Description

무염반응을 위한 신규한 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체
본 발명은 중성 pH에서도 활성을 띠도록 개발된 신규 글루타메이트 디카르복실라아제(glutamate decarboxylase, GAD)의 개발과 이 효소 자체나 효소를 함유한 세포를 촉매로 사용하여 L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
감마-아미노부틸산(GABA)은 비단백질성 아미노산으로 억제성 신경전달물질이다. 그 효능으로서 신경안정 작용, 스트레스 해소, 기억력 증진, 혈압강하작용, 우울증 완화, 중풍과 치매 예방 등이 알려져 있다. 또한, GABA는 유용한 플라스틱인 폴리아미드 4의 단량체인 피롤리돈의 전구체로 최근 바이오매스에서 GABA를 생산하는 방법의 중요성이 강조되고 있다.
GABA 생산을 위한 공업적 방법은 합성법, 추출법, 생물전환법 등이 있다. 합성법의 경우 사용하는 용매가 주로 유독하고, 추출법의 경우는 폐기물의 발생량이 많고, GABA의 제조 단가가 높은 단점이 있다. 생물전환법은 바이오촉매(biocatalyst)인 분리 효소(isolated enzyme)나 효소를 함유한 전세포(whole cell)를 촉매로 사용하여 L-글루타메이트의 탈카르복시화 반응으로 GABA를 생산하는 방법이다. 산업적인 측면에서 볼때 L-글루타메이트와 같은 값싼 원료로부터 환경친화적인 생물전환공정을 통해 GABA를 생산하는 것은 매우 합리적이고 가치 있는 공정이다.
GABA로의 전환 반응에 사용되는 효소는 피리독살 5-포스페이트(PLP)-의존형 글루타메이트 디카르복실라아제(GAD)(EC 4.1.1.15)이며, 이 효소는 유산균, 대장균, 바실러스 등 미생물 유래의 것이 많이 사용된다. 박테리아 글루타메이트 디카르복실라아제가 작용하는 pH 범위는 3.5~6.0이고, 최적 pH는 3.8~4.6에 존재하며, pH가 3.5 이하 이거나 6.0 이상이 되면 반응은 거의 일어나지 않는다. 이 효소는 글루타메이트의 α-탄소에 결합되어 있는 카르복시기로부터 이산화탄소(CO2)를 제거하는데, 이 과정에서 pH가 증가하게 된다(도 1 참조).
생물전환법의 경우, 효소촉매에 의해 GABA가 생성됨에 따라 pH가 증가하게 되고, 이로 인해 반응은 점점 늦어지다가 결국 반응이 멈추게 된다. 따라서 고농도 기질 반응의 경우 종래에는 완충용액이나 기질을 사용하여 최적 pH로 맞춘 후, 반응이 진행함에 따라 염산, 황산, 질산, 초산 등과 같은 산을 pH 조절제로 투입하여 반응액의 pH를 맞추었다. 그러나, 기존 방법은 반응 중 생성되는 GABA의 양에 비례하여 산을 첨가함으로써 염(salt)이 다량으로 생성되는 문제점이 있다. 생성된 염을 제거하기 위해서는 이온교환수지 공정, 재결정과 같은 정제공정이 필요하게 되고, 반응액 중의 다량의 염은 수율 저하, 폐수 발생 등과 같은 문제를 수반하게 됨으로써, 염 발생은 GABA의 생산 단가를 높이는 중요한 원인이 되어 왔다. 또한, 고농도의 염은 생산된 GABA의 직접적인 섭취에 장애가 되고 있다. 따라서, 중성 pH, 더 나아가 염기성 pH에서도 활성을 띠는 글루타메이트 디카르복실라아제를 개발할 경우 pH 완충제나 산을 전혀 첨가하지 않은 순수한 물에서 반응시켜 무염의 GABA를 생산할 수 있을 것으로 예상된다.
본 발명은 L-글루타메이트를 기질로 하여 감마-아미노부틸산(GABA)을 효소적으로 제조함에 있어서, 효소의 활성 pH 범위를 확대하여 산 첨가를 통한 pH 조절 없이 고농도로 감마-아미노부틸산 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 카르복시 말단의 트레오닌이 결손되거나, 카르복시 말단에 알라닌이 첨가된 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형질전환체에 글루타메이트 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 pH 완충제 또는 산을 첨가하지 않은 물에서 글루타메이트 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 탄산수 제조방법을 제공한다.
아울러 본 발명은 상기 형질전환체를 pH 완충제 또는 산을 첨가하지 않은 물에서 글루타메이트 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 탄산수 제조방법을 제공한다.
본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 중성 pH에서 활성을 나타내어 글루타메이트의 감마-아미노부틸산으로의 탈카르복시화 반응을 촉매하며, pH 조절제의 첨가없이 고농도 전환 반응을 실시할 수 있어 경제적이고 친환경적이며, 음용 가능한 감마-아미노부틸산 및 감마-아미노부틸산을 포함한 탄산수의 제조가 가능하다.
도 1은 글루타메이트 디카르복실라아제를 촉매로 사용하여 글루타메이트의 탈탄산 반응으로부터 감마-아미노부틸산을 생산하는 반응식이다.
도 2는 글루타메이트 디카르복실라아제 카르복시 말단의 pH 의존적 구조변화를 나타낸 도면이다.
도 3은 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체의 pH에 따른 활성도를 나타낸 그래프이다(Wild type, 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제; Δ466, 카르복시 말단의 트레오닌이 결손된 변이체; Ala467, 카르복시 말단에 알라닌이 첨가된 변이체).
도 4는 1 M의 글루타메이트와 0.02 ㎎의 글루타메이트 디카르복실라아제 효소의 물에서의 시간에 따른 전환율을 보여주는 도면이다.
도 5는 2 M의 글루타메이트와 0.02 ㎎의 글루타메이트 디카르복실라아제 효소의 물에서의 시간에 따른 전환율을 보여주는 도면이다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 카르복시 말단의 트레오닌이 결손되거나, 카르복시 말단에 알라닌이 첨가된 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 제공한다.
상기 글루타메이트 디카르복실라아제의 카르복시 말단 부위는 3차원적으로 루프 구조를 형성하여 글루타메이트 디카르복실라아제의 산성-의존성에 기여한다. 글루타메이트 디카르복실라아제의 카르복시 말단은 산성 조건에서 구조를 지니지 못하지만 중성 조건에서는 잘 정돈된 구조를 가지며 동시에 조효소인 피리독살 5'-포스페이트가 존재하는 기질 결합 부위를 막는다(도 2). 글루타메이트 디카르복실라아제의 카르복시 말단 아미노산 부위를 제거하면 중성 pH에서 구조를 형성하는 것을 억제시켜 글루타메이트 디카르복실라아제가 중성 pH에서 활성이 떨어지는 것을 방지할 수 있다.
하지만 카르복시 말단의 15개 아미노산을 제거할 경우 효소의 비활성이 떨어지는 단점이 있다. 카르복시 말단의 15개 아미노산이 활성을 저해하는 메커니즘은 (1) 안정한 구조가 기질 결합 부위를 막고 (2) 465번 히스티딘이 276번 리신, 피리독살 5'-포스페이트와 화학결합하여 기질 결합 부위가 막힌 구조를 안정화하는 것으로 이해된다. 따라서 카르복시 최말단의 트레오닌을 결손시키거나 혹은 알라닌을 첨가하는 것은 465번 히스티딘이 276번 리신, 피리독살 5'-포스페이트와 화학결합을 하기 위해 필요한 구조적 요소를 파괴하여 상대적으로 좀 더 높은 pH에서도 활성을 나타내면서도 효소의 비활성은 떨어지지 않는다는 것을 알아냈다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체 제작 과정 중 카르복시 말단 아미노산의 결손 및 첨가는 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하는 위치선택적 돌연변이(Site-directed mutagenesis) 방법을 사용할 수 있다. 위치선택적 돌연변이란, 단백질에서 변경시키고자 하는 특정 아미노산만을 정확히 원하는 대로 변경시키는 유전자 조작기술로써 유전자의 특정 서열을 변화시켜 단백질 내의 원하는 아미노산을 다른 아미노산으로 변경시키는 기술이다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 변이체 제작이 가능하다.
본 발명의 실시예에서 이용된 글루타메이트 디카르복실라아제는 유전자를 클로닝하여 적합한 숙주세포에서 발현된 것을 정제하여 얻은 것이다. 본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제는 대장균에서 유래된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 다양한 미생물에서 유래될 수 있다. 예를 들면, 락토바실러스(Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus sakei), 리스테리아(Listeria monocytogenes), 이스트(Saccharomyces cerevisiae), 박테로이드(Bacteroides fragilis), 디바리오마이시스(Debaryomyces hansenii), 마이코박테리움(Mycobacteriumbovis, Mycobacterium tuberculosis), 아스퍼질러스(Aspergillus nidulans), 락토코코스(Lactococcuslactis), 캔디다(Candida glabrata) 등이 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 유산균에서 유래된 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용할 경우 섭취가 용이하며 섭취할 경우 장내 유용균의 증식 및 유해균의 억제를 통하여 장내 균총의 균형을 개선하고, 식중독, 변비를 방지할 수 있다.
상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 아미노 말단에 친화성 태그가 삽입된 것이 바람직하고, 상기 친화성 태그는 히스티딘(Histidine, His), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP), 티오레독신(thioredoxin, Trx), NusA(N utilization substance A) 또는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST) 태그일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "친화성 태그"란 폴리펩티드 또는 단백질의 정제나 검출을 제공하거나 기질에 대한 폴리펩티드 또는 단백질의 부착을 위한 부위를 제공하기 위하여 폴리펩티드 또는 단백질에 부착할 수 있는 폴리펩티드 단편을 의미한다.
상기 변이체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 서열번호 2로 이루어진 변이체는 카르복시 말단의 1개의 아미노산 트레오닌이 결손되고 아미노 말단에 히스티딘 태그를 가지는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체이다. 상기 서열번호 4로 이루어진 변이체는 카르복시 말단에 1개의 잉여 아미노산 알라닌이 첨가되고 아미노 말단에 히스티딘 태그를 가지는 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 글루타메이트 디카르복실라아제의 정제를 용이하게 하기 위하여, 글루타메이트 디카르복실라아제의 아미노 말단에 히스티딘-태그(His-tag)를 도입하는 단백질 정제 방법을 사용할 수 있다. 이것은 친화 크로마토그래피 원리를 이용하는 것으로 히스티딘이 5개 내지 6개가 붙어있는 히스티딘-태그를 이용하여 정제할 수 있다. 히스티딘-태그는 기질과 강한 친화력을 가진다는 것에 착안해서 유전자에 의해서 발현되어 자신이 정제하고자 하는 단백질 앞에 융합 단백질을 만들어 정제를 하는 용도에 많이 사용된다. 히스티딘-태그를 사용하는 이유는 히스티딘-태그의 경우 아미노산이 6개 밖에 되지 않기 때문에 크기도 작고 원래의 단백질 구조에 영향을 주지 않으므로 재조합 단백질을 만든 후에 따로 잘라주지 않아도 된다는 편의성을 가지기 때문이다. GST-tag(글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그)의 경우 히스티딘-태그에 비해 특이성이 훨씬 높지만 태그의 크기 자체가 워낙 커서 융합 단백질을 만들었을 때 정제 후 태그를 잘라줘야 하는 번거로움이 있다. 이런 태그는 벡터의 종류에 따라 표적 단백질의 아미노 말단, 카르복시 말단 어느 쪽에도 만들 수 있다. 또한 히스티딘-태그를 포함하는 벡터를 이용하면, 발현하는 단백질이 불용성일지라도 His-Bind Resin을 이용하여 변성조건하에서 정제할 수 있으므로 편리하다. 히스티딘-태그는 아미노산 중의 하나인 히스티딘이 5개 내지는 6개가 연속으로 오는 펩티드로 His-His-His-His-His-His의 아미노산 서열을 가진다. 히스티딘-태그는 2가의 금속이온과 친화력을 가지기 때문에 정제시에는 주로 Nickel immobilized bead, Cobalt immobilized bead 등을 사용하게 되는데, 이 방법을 약자로 IMAC(immobilized Metal Affinity Chromatography)라고 한다. 히스티딘-태그가 도입된 단백질을 용출하는 방법은 첫째로, 금속 이온에 대한 친화성 경쟁자를 넣어주는 방법과 둘째로, pH의 변화를 주는 방법 등이 있다. 금속 이온에 대한 친화성 경쟁자를 넣어주는 방법은 금속 이온이 히스티딘의 이미다졸 링과 친화성을 가지고 있으므로 이미다졸을 고농도로 흘려 보내주면 히스티딘이 붙어 있는 단백질이 금속 이온으로부터 떨어지는 원리이다. pH의 변화를 주는 방법은 금속 이온의 전하 상태가 달라지면 친화력을 가지지 못하게 되어 히스티딘-태그가 금속으로부터 떨어지는 원리이다. 하지만 이 경우에는 단백질의 구조에도 영향을 줄 수 있기 때문에 친화성 경쟁자의 첨가 방법을 사용하는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 단백질 정제를 할 수 있다.
본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 야생형의 카르복시 말단의 트레오닌을 결손시키거나(서열번호 2), 또는 알라닌을 추가(서열번호 4)함으로써 제조되어, 효소 활성이 야생형에 비해 중성 pH 범위로 확대되고(도 3 참조), pH 조절제 첨가 없이도 고농도 전환 반응을 실시(도 4 및 도 5 참조)할 수 있는 신규한 글루타메이트 디카르복실라아제로서 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 코딩하는 핵산서열로 이루어진 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에 이용될 수 있는 싱기 재조합 벡터로는 당업계에서 주로 사용되는 플라스미드(pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pGEM-T Easy, pQE30 등), 파지(λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체가 친화성 태그를 포함하지 않는 경우, 본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 글루타메이트 디카르복실라아제의 정제를 용이하게 하기 위하여, 친화성 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 히스티딘(Histidine, His), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), 티오레독신(thioredoxin, TrX), NusA(Nutilization substance A) 또는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST) 등 일 수 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고 용이하게 정제될 수 있다. 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6× His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 이용하여 원하는 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.
글루타메이트 디카르복실라아제 유전자를 포함하는 벡터가 제작되면, 벡터를 적합한 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조할 수 있다. 이러한 형질전환체는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X1776, E. coli W3110, E. coli DH5α, E. coli M15, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환 시키는 경우에는 숙주세포로서, 이스트(Saccharomyces cerevisiae 등), 곤충 세포 및 동물 세포(CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc.Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵세포인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다. 숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 글루타메이트 디카르복실라아제 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주세포에 IPTG(isopropyl-β-D-thio-galactopyranoside)를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 반응은 pH 3.5~7.0에서 실시될 수 있다. 야생형은 활성을 나타내기 위해서 산성 조건을 요구하지만, 본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 산성-의존성이 없어 넓은 pH범위에 걸쳐 활성을 나타낼 수 있는 이점을 갖게 된다.
상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 고체 지지체에 고정화된 것일 수 있다. 효소 고정화는 효소를 화학적 또는 물리적 방법에 의하여 불용성 담체(matrix)에 고정하여 이동성을 제한하는 것이다. 고정화된 글루타메이트 디카르복실라아제 효소는 유리 효소(free enzyme)와 비교하여 생물전환공정에서 상당한 장점을 발휘한다. 효소를 고정하면 재사용이 가능하기 때문에 비용이 절감되고 사용 후 분리할 필요가 없다. 또한 고정화 효소는 불용성이기 때문에 연속 반응기에서도 이용이 가능하며 외부 조건 변화에 대한 효소의 민감성을 감소시킬 수 있다는 장점이 있다.
그러나 산성 pH 범위에서 활성을 나타내는 야생형 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하는 경우에는 세포고정화를 할 수 없다. 세포 고정화에 이용되는 지지체(알기네이트 등)가 산성범위에서 안정성이 확보되기 어렵고 이에 세포의 고정화 담체에서 유출되는 현상이 야기되거나 불안정성으로 인해 고정화 세포의 재사용측면에서 경제성이 떨어지기 때문이다. 본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체 고정화를 통하여 감마-아미노부틸산의 생산이 가능한 것은, 변이체의 활성이 pH 3.5~7.0과 같이 넓은 범위에 걸쳐 나타나기 때문이다.
단백질, 특히 효소를 고체 지지체에 고정화하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다 (Weetall, H.H., Preparation of immobilized proteins covalently coupled through silane coupling agents to inorganic supports. Appl. Biochem. Biotech. 41:157-188(1993); Weetall, H. H., Methods in Enzymology. 44:134-148(1976)). 본 발명의 글루타메이트 디카르복실라아제가 고정화 되는 고체 지지체는 다공성 실리카, 실리카, 다공성 유리 비드, 조절-동공 유리(controlled-pore glass), 다공성 세라믹, 다공성 알루미나 및 다공성 티타니아를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체와 글루타메이트를 pH 완충제 또는 산을 첨가하지 않은 물에서 접촉시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 글루타메이트를 기질인 동시에 완충제로 사용하는 반응계를 통해 완충용액 또는 pH 조절제를 첨가하지 않은 순수한 물에서 감마-아미노부틸산의 제조방법이 실시될 수 있다. 생성된 무염의 감마-아미노부틸산은 음용 가능하다. 감마-아미노부틸산은 포유류의 중추신경계에 작용하는 억제성 신경전달물질로, 원칙적으로 아미노산에 포함되나 단백질에 포함되지는 않는다.
감마-아미노부틸산은 많은 생리적인 메커니즘의 조절에 관여하여 동물의 경우 뇌에 혈류를 활발하게 하고 산소 공급량을 증가시켜 뇌세포의 대사기능을 항진시키는 것으로 알려져 있으며, 프로락틴의 분비와 성장호르몬의 분비 조절에도 관여하며 혈압강하 및 통증완화 등에도 효과가 있는 것으로 알려져 있어 약리적으로 매우 관심이 높은 물질이다. 의약품으로는 정맥 주사제로 뇌졸중, 뇌동맥 후유증에 있어 뇌 혈류 개선 및 뇌 대사 증진 작용에 사용하고 있으며, 경구 처방약으로도 판매되고 있다.
또한 감마-아미노부틸산이 고혈압의 예방, 통증의 완화 등의 중요한 역할을 하는 것으로 알려지면서 의약품으로서의 용도뿐만 아니라 최근에는 기능성 식품소재로서의 감마-아미노부틸산에 대한 관심이 고조되고 있다.
최근에는 더욱 쉽게 식품으로 이용하기 위해서 많은 연구가 이루어지고 있는데 대표적인 식품으로는 일본에서 개발 된 가바론 티(GABARON-TEA)라 하여 녹차에서 감마-아미노부틸산 함량을 증가시킨 상품이 판매되고 있고, 국내에서도 녹차 잎을 혐기처리 하여 감마-아미노부틸산 함량을 높인 다양한 식물소재를 이용하여 연구가 이루어지고 있다.
하지만 상기와 같은 차 종류는 감마-아미노부틸산 함량이 매우 적기 때문에, 일정량을 섭취하기 위해서는 차를 다량을 섭취해야 하는 문제가 있다.
한편, 글루타메이트를 이용하여 감마-아미노부틸산를 합성하는 경우 모든 첨가물이 감마-아미노부틸산으로 전환 되는 것이 아니고, 글루타메이트가 잔존하는 문제가 있다. 글루타메이트는 불안감 및 흥분성 신경물질로 알려져 있는데, 이것이 다량 섭취가 되는 경우 인체에 해가 될 수 있는 위험이 있다.
그러나 본 발명의 구체적인 실시예에서는 글루타메이트를 완충제로 사용하는 반응조건에서 100%의 전환율을 보였고(도 4 및 도 5 참조), 염 생성이 없으므로, 본 발명의 제조방법에 의하여 생성된 감마-아미노부틸산은 섭취하여도 인체에 해롭지 않다.
본 발명은 상기 형질전환체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서 상기 방법은 상기 형질전환체를 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 포함하는 배지에서 배양하여 실시하는 것인 감마-아미노부틸산의 제조방법일 수 있다. 이 제조방법은 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 세포에 반응기질을 직접 접촉시켜 감마-아미노부틸산을 생산한다는 측면에서 효소를 이용하는 상기한 방법과 차이가 있다.
이와 같이 세포를 직접 감마-아미노부틸산 생산에 이용하는 방법은 크게 두 가지로 나눌 수 있다. 첫 번째 방법은 배양방법이고, 두 번째 방법은 고정화된 세포를 이용하는 방법이다.
배양방법에 따르면, 감마-아미노부틸산의 제조방법은 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 글루타메이트 또는 이의 염을 포함하는 배지에서 배양하여 실시한다.
배양에 이용되는 배지로는 숙주세포의 종류에 따라 당업계에 공지된 어떠한 배지도 선택할 수 있다. 예를 들어, LB(Luria-Bertani) 배지, MRS (deMan Rogosa Sharpe) 브로스 배지, APT (All Purpose with Tween) 배지 또는 BHI(Brain Heart Infusion) 배지를 이용할 수 있다. 본 발명의 방법의 배지에 있어서, 이용되는 탄소원은 다양한 탄수화물이 이용될 수 있으며, 수크로스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스일 수 있다. 본 발명의 방법이 배지에 이용되는 질소원은 유기 질소원이 이용되며, 이스트 추출물, 프로테오스 펩톤 No.3 및 펩톤일 수 있다. 상기 배지 내에서 그리고 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질의 존재 하에서 절단형 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 숙주세포를 배양하여 감마-아미노부틸산을 생산한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 형질전환체는 고체 지지체에 고정화된 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 세포고정화 방법에 따르면, 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 발현하는 형질전환체는 세포고정화용 고체 지지체에 고정화된다. 상기 설명과 같이 본 발명의 형질전환체가 고체 지지체에 고정화할 수 있는 것은 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체의 활성이 pH 3.5~7.0과 같이 넓은 범위에 걸쳐 나타나기 때문이다.
세포고정화에 이용되는 고체 지지체는 알기네이트(alginate), 폴리아크릴아마이드, 아가로스 및 키토산을 포함하고, 통상적으로 알기네이트를 이용할 수 있다. 세포고정화는 당업계에 공지된 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다(Fukui, S. And A. Tanaka, Immobilized microbial cells. Annu. Rev. Microbiol., 36:145-172(1982); Kierstan, M. and Bucke, C. The immobilization of microbial cells, subcellular organelles, and enzymes in calcium alginate gels, Biotechnol. Bioeng., 19:387-397(1977); Kierstan, M. and Coughlan, P., Immobilization of cells and enzymes by gelentrappment. In Immobilized Cells and Enzymes, ed. J. Woodward, pp. 39-48. IRL Press, Oxford.(1985)).
상기 형질전환체와 글루타메이트 기질을 pH 완충제 또는 산을 첨가하지 않은 물에서 접촉시키는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체, 또는 상기 형질전환체를 pH 완충제 또는 산을 첨가하지 않은 물에서 글루타메이트 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 탄산수 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 고체 지지체에 고정화된 것일 수 있다.
상기 형질전환체는 고체 지지체에 고정화된 것일 수 있다.
상기 탄산수는 우수한 보온 작용과 혈액순환 촉진으로 여러 질병 완화에 도움을 주기 때문에 예부터 온천을 사용하는 목욕탕 등에서 사용되고 있다. 탄산수의 이러한 작용은 함유 탄산 가스가 말초 혈관 확장 작용을 하여 신체 환경이 개선되기 때문이라고 여겨진다. 자세하게는, 탄산 가스의 경피 진입에 의해 모세혈관 상의 증가 및 확장이 발생되고, 피부의 혈행을 개선하여, 퇴행성 병변 및 말초 순환 장해의 치료에 효과가 있다고 개시되어 있다.
본 발명에 따르면, 갈증해소 및 청량감을 주는 탄산음료의 제조에 자연효소를 이용함으로써 인체의 신진대사를 활성화시키는 효과가 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 글루타메이트 디카르복실라아제의 변이체 제작
글루타메이트 디카르복실라아제의 카르복시 말단은 산성 조건에서 기질 결합 자리가 기질과 결합이 가능한 구조이지만 중성 조건에서는 잘 정돈된 구조를 가지며 동시에 조효소인 피리독살 5'-포스페이트가 존재하는 기질 결합 부위를 막는 것으로 알려져 있다(도 2). 따라서, 대장균 DH5α 유래 글루타메이트 디카르복실라아제(서열번호 1)의 카르복시 말단을 변형하여 pH 의존도를 조절하고자 하였다. 변이체 제작은 PCR(polymerase chain reaction)을 이용하는 통상적인 위치선택적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법을 사용하였다. 카르복시말단의 아미노산인 트레오닌이 제거된 변이체를 제작하기 위해 Δ465_F (5'-ACAGAACAGCTTTAAACATTAACTCGAGCACCACCACCACCA-3', 서열번호 6) Δ465_R (5'- GGTATTGCCCAACAGAACAGCTTTAAA-3', 서열번호 7) 프라이머를 이용하여 pET-28b에 클로닝된 글루타메이트 디카르복실라아제 및 벡터 서열을 모두 PCR로 변이 증폭하였다. 카르복시말단의 아미노산 트레오닌 다음에 알라닌이 도입된 변이체 제작을 위해서는 A466_F (5'-ACAGAACAGCTTTAAACATACCGCTTAACTCGAGCACCACCACCACCA-3', 서열번호 8)와 Δ465_R (5'- GGTATTGCCCAACAGAACAGCTTTAAA-3', 서열번호 7)프라이머를 이용하였다. 원래의 서열을 모두 제거하기 위해 PCR 반응액(엔지노믹스, 한국)을 제한효소 DpnⅠ(다카라, 일본)으로 처리하고 이를 대장균 JM109에 형질전환하였다. 모든 유전자는 핵산서열 분석을 통해 확인하였고, 야생형과 원하는 변이가 도입된 클론을 대장균 BL21(DE3)에서 발현하고, Ni-NTA 아가로즈(머크, 미국)를 이용하여 거의 순수한 형태로 분리하였다. 실험에는 효소로부터 이미다졸(시그마, 미국)을 제거하기 위해 초미세여과(ultrafiltration)를 실시하였다.
그 결과, 글루타메이트 디카르복실라아제의 카르복시말단의 트레오닌이 제거된 변이체와 카르복시말단의 아미노산 트레오닌 다음에 알라닌이 도입된 변이체를 각각 제조하였다(서열번호 2 및 서열번호 4).
<실시예 2> 대장균 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체의 활성 분석
상기 실시예 1에서 제조한 변이체들의 pH에 따른 반응 초기 속도 확인을 위하여 시트레이트-포스페이트(citrate-phosphate) 완충 시스템을 이용하였다. 완충 용액은 0.1 M의 시트레이트에 0.2 M의 디소듐 포스페이트(disodium phosphate)를 적정한 비율로 섞어 여러 pH 완충액을 제조하였다. 각 완충 용액에 100 mM L-monosodium glutamate(MSG, 시그마, 미국), 1 mM PLP(pyridoxal-5'-phosphate, 시그마, 미국), 0.1 mM DTT(dithiothreitol, 시그마, 미국), 0.01 ㎎의 정제 효소를 넣고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 반응 용액 0.01 ㎖를 취하여 100 mM Tris-HCl(pH 8.5) 0.09 ㎖와 혼합하고 95℃에서 10분간 가열하여 반응을 중지시켰다. 이를 Gabase(시그마, 미국)를 이용하여 정량하였다.
카르복시 말단의 아미노산이 결손되거나 잉여의 알라닌이 첨가된 변이체의 pH에 따른 초기 반응을 확인한 결과, 변이체들은 카르복시 말단이 제거되지 않은 효소에 비해 산성에서 높은 비활성도를 나타내었으며, 그 활성 범위도 중성으로 증가하여 pH6 이상에서 야생형이 전혀 활성을 나타내지 않는 것에 비하여 변이체들에서는 여전히 높은 활성을 나타내었다(도 3).
<실시예 3> 고농도 감마-아미노부틸산의 무염 합성
글루타메이트 디카르복실라아제 야생형과 변이체들의 고농도 반응을 위하여 1 M의 글루타메이트와 0.02 ㎎의 효소의 물에서 시간에 따른 전환율을 확인하였다.
그 결과, 야생형 및 변이체 모두 글루타메이트를 완충제로 사용하는 반응조건에서 100%의 전환율을 나타내었다. 단, 야생형에 비해 카르복시 말단 변이체가 50% 정도 빠른 완전 전환을 나타내어 산업적으로 더욱 유용할 것으로 예상되었다(도 4). 또한, 2 M의 글루타메이트와 0.02 ㎎의 효소의 물에서 시간에 따른 전환율을 확인한 결과, 야생형 및 변이체 모두에서 18시간 이후 거의 100%의 전환율을 나타내었다. 단, 야생형에 비해 카르복시 말단 변이체, 특히 Δ466 변이체의 전환율이 더욱 높아 산업적으로 유용할 것으로 예상되었다(도 5).

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열에서 카르복시 말단의 트레오닌이 결손되거나, 카르복시 말단에 알라닌이 첨가된 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 변이체는 아미노 말단에 친화성 태그가 삽입된 것인 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 친화성 태그는 히스티딘(Histidine, His), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP), 티오레독신(thioredoxin, Trx), NusA(N utilization substance A) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 변이체는 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체를 코딩하는 유전자.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 핵산서열로 이루어진 유전자.
  7. 청구항 5의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  8. 청구항 7의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  9. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체, 또는 청구항 8의 형질전환체에 글루타메이트 또는 글루타메이트 염 기질을 접촉시키는 단계를 포함하는 감마-아미노부틸산의 제조방법.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 고체 지지체에 고정화된 것인 감마-아미노부틸산의 제조방법.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 형질전환체는 고체 지지체에 고정화된 것인 감마-아미노부틸산의 제조방법.
  12. 청구항 9에 있어서,
    상기 방법은 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체 또는 형질전환체와 글루타메이트 기질을 pH 완충제 또는 산을 첨가하지 않은 물에서 접촉시키는 것인 감마-아미노부틸산의 제조방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항의 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체, 또는 청구항 8의 형질전환체를 pH 완충제 또는 산을 첨가하지 않은 물에서 글루타메이트 기질과 접촉시키는 단계를 포함하는 탄산수 제조방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 글루타메이트 디카르복실라아제 변이체는 고체 지지체에 고정화된 것인 탄산수 제조방법.
  15. 청구항 13에 있어서,
    상기 형질전환체는 고체 지지체에 고정화된 것인 탄산수 제조방법.
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