WO2013072495A2 - Verfahren, photobioreaktor und photosyntheseschichten zur kultur photoautotropher mikroorganismen - Google Patents

Verfahren, photobioreaktor und photosyntheseschichten zur kultur photoautotropher mikroorganismen Download PDF

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Definitions

  • PCC 6803 the green alga Chlamydomonas reinhardtii and other biotechnologically significant phototrophic microorganisms have been decrypted and transgenic strains with the potential for photosynthesis of various biotechnologically relevant organic substances have already been produced.
  • the main carbon source used in photobioreactors is carbon dioxide, which is supplied to the cell suspensions of these microorganisms by introducing air or carbon dioxide / air mixtures.
  • the avoidance of carbon dioxide depletion zones and light deficient areas in photobioreactors with cyanobacteria and microalgae of small size is technically complex at high biomass concentration.
  • alkali hydrogencarbonate in high concentrations is a known way of promoting the initial growth and pH increase in the culture of the spirulina plantenis alkaliphilic large cell organism in exposed basins exchanging carbon dioxide with the atmosphere.
  • a hydrogen carbonate medium may only contain stoichiometrically sufficient supply for high growth rates at high biomass concentrations if it contains the bicarbonate in a concentration greater than 200 mM. It is known that even at much lower concentrations of alkali bicarbonate initially good growth to the death of many cultures comes.
  • the growth of shaken cultures of photoautotrophic microorganisms can be promoted through a membrane bounded carbon dioxide reservoir.
  • the latter consists of a concentrated aqueous buffer solution of bicarbonate and carbonate ions in a bag made of thin polyethylene film.
  • the carbon dioxide is released through the gas permeable membrane to the cell suspension at membrane controlled rate.
  • photosynthetic layers are liquid layers of limited thickness directly in contact with a gas phase, or liquid spaces of limited thickness defined by a translucent solid.
  • the arrangement of the suspensions photoautotrophic microorganisms in layers of limited thickness favors a high rate of photosynthesis, based on the volume of the cell suspension.
  • swirling of the cells is avoided by introducing or passing a carbon dioxide-containing gas.
  • a photosynthetic layer having a mean layer thickness of about 10 mm or less in a photobioreactor is exposed to sunlight or photosynthetically active light radiation from a suitable artificial light source, the photoautotrophic microorganisms in the photosynthetic layer in a photosynthetic mineral medium having a Hydrogen carbonate concentration of preferably more than 10 mM.
  • the proposed method avoids the passage of a gas through the suspension of the photoautotrophic microorganisms or through the photobioreactor and thus allows the use of very thin photosynthetic layers, with the usual method for distributing the cells in the luminous flux and for the distribution of dissolved carbon dioxide by generating turbulence is technically incompatible with the introduction of a gas.
  • the carbon substrate is either contained as a supply in the photosynthetic medium or is diffusively introduced into the photosynthetic layer. Maintaining the bicarbonate concentration in the photosynthetic medium at a level of preferably at least 10 mM during culture prevents or delays the formation of high pH substrate deficient zones.
  • FIG. 1 schematically describes a photobioreactor with the components essential for the method.
  • Maintaining a concentration of the bicarbonate ions in the photosynthetic medium of preferably above 10 mM prevents diffusion-induced substrate depletion zones from forming in a non-agitated or laminar-flow photosynthetic layer. This allows high photosynthetic rates at high cell densities without entangling a carbon dioxide-containing gas in the cell-containing suspension.
  • the generation of a turbulent flow by permanent gas injection is energy consuming and can be associated with a constant shear stress for the cultured microorganisms. In this case, the life of the cells can be shortened. Dead cells cause disruptive foaming, the suppression of which requires additional technical measures and costs.
  • An advantage of a photosynthetic medium with such a high concentration of bicarbonate ions is its high buffering capacity, which retards the metabolic increase in pH. Extremely high pH values, which exceed the tolerance range of the photoautotrophic microorganism, are not reached in it, because previously due to lack of light, photosynthesis is greatly restricted. Undoubtedly, as well as Synechocystis sp.
  • PCC 6803 numerous other microorganisms are directly contacted with a photosynthetic medium, the relatively high concentrations of a soluble bicarbonate such Contains potassium bicarbonate, sodium bicarbonate and magnesium bicarbonate, if the metabolic increase in the pH is avoided to toxic levels. It is advantageous for the process to cultivate alkali-tolerant and osmotolerant photoautotrophic microorganisms in which initial concentrations of the bicarbonate in the photosynthetic medium above 200 mM can be used or hydrogen carbonate concentrations above 50 mM can be maintained with the aid of a carbon storage medium, because this is a prerequisite for the efficient supply represents relatively thick photosynthetic layers with the photosynthetic substrate and prevents strong metabolic pH gradients in the photosynthetic layer.
  • the diffusion distribution of the bicarbonate is also substrate-saturating at high volume-related photosynthesis rates, if by delivering bicarbonate and / or carbon dioxide from a carbon storage medium a bicarbonate concentration of at least 10 mM, preferably at least 20 mM, in particular preferably at least 50 mM is maintained. Therefore, the proposed method and the proposed photobioreactor can also be used with such photoautotrophic microorganisms that are neither osmotolerant nor alkali-tolerant.
  • the proposed method comprises the proven possibility of preventing the metabolic increase of the pH in the cytotoxic region and substrate deficiency in the photosynthetic layer solely by the fact that the photosynthetic medium contains hydrogencarbonate ions in an initial concentration of more than 50 mM, preferably more than 200 mM , contains.
  • the photosynthetic medium contains hydrogencarbonate ions in an initial concentration of more than 50 mM, preferably more than 200 mM , contains.
  • the proposed method alternatively comprises the possibility of using an additional cell-free carbon storage medium, from which bicarbonate and / or carbon dioxide are supplied to the photosynthetic layer by diffusion through a light-permeable membrane.
  • the proposed delivery of bicarbonate and / or carbon dioxide to the photosynthetic medium allows maintaining an average bicarbonate concentration preferably above 10 mM in the photosynthetic medium and prevents or delays the formation of alkaline substrate depletion zones. In one or more embodiments, this increases translucent and cell-free carbon storage medium the amount of carbon stored in the photobioreactor and can be used in addition to the light distribution in the photobioreactor.
  • the oxygen release is stoichiometrically coupled with the consumption of carbon dioxide or hydrogen carbonate ions stored in the cell-free carbon storage medium and / or in the photosynthetic medium.
  • a cell-free carbon storage medium may be diffusion-exchanged with the photosynthetic medium via a hydrophilic porous membrane, for example, a viscose or regenerated cellulose dialysis membrane, or a nylon microfilter membrane. It then contains all components of the photosynthetic medium because of the diffusion of all ions through the hydrophilic porous membrane.
  • the additional volume of the cell-free carbon storage medium increases the buffer capacity and carbon storage capacity of the photobioreactor.
  • a mineral medium with the usual micro- and macronutrients for the preparation of the carbon storage medium is used, the potassium and / or sodium bicarbonate and / or magnesium hydrogen carbonate are added.
  • the initial concentration of said inorganic carbon compounds is preferably at least 200 mM in order to ensure strong buffering and to provide sufficient substrate for the culture of the photoautotrophic microorganisms up to a high biomass concentration.
  • the photosynthetic layer comprises a suspension of a photoautotrophic microorganism such as Synechocystis sp. PCC 6803, which tolerates high concentrations of sodium or potassium bicarbonate and pHs between 9 and 10.5.
  • a hydrophobic, water and water-soluble, gas and light-transmissive membrane is used to provide carbon substrate to the photosynthetic layer.
  • the carbon storage medium used in combination with this membrane is a carbon dioxide-containing gas or a liquid containing carbon dioxide in dissolved or chemically reversibly bound form.
  • Suitable carbon storage medium in conjunction with a gas-permeable hydrophobic membrane are those liquids in which carbon dioxide dissolves in a high concentration, or which have a high absorption coefficient for carbon dioxide, whereby high concentrations of carbon dioxide in dissolved form can be achieved at relatively low carbon dioxide partial pressure.
  • Such liquids are, for example, fluorine solvent from Fluor Daniel (propylene carbonate) or Selexol ® Union Carbide (a mixture of dimethyl ethers and polyethylene glycol).
  • fluorine solvent from Fluor Daniel (propylene carbonate) or Selexol ® Union Carbide (a mixture of dimethyl ethers and polyethylene glycol).
  • suitable organic liquids such as ethylene carbonate or further cyclic alkylene carbonates are known to be used for removing carbon dioxide from gases.
  • the carbon dioxide partial pressure is approximately proportional to the carbon dioxide concentration.
  • the cell-free carbon storage medium may contain carbon dioxide in both dissolved and chemically reversibly bound form when using a hydrophobic gas permeable membrane to deliver carbon dioxide to the photosynthetic layer.
  • Examples of the storage of carbon dioxide by reversible chemical bonding to a solute are the aqueous solutions of bicarbonates and carbonates of inorganic or organic bases, for example the tertiary amines or the potassium and / or sodium ions. Further examples of these are aqueous solutions of the carbamations of primary or secondary amines. These solutions, too, have at high concentration of the carbamates and suitable pH a carbon dioxide partial pressure suitable for delivering carbon dioxide to the photosynthetic medium. As is known, carbon dioxide is reversibly bound to solutions of various alkanal amines during the washing of combustion exhaust gases, inter alia in carbamate form.
  • thin translucent films of polyethylene or polypropylene used to package fruit and vegetables or other moist materials because of their low permeability to water vapor have high permeability to oxygen and carbon dioxide. They are very well available and offer excellent processing possibilities.
  • the proposed method may be carried out using two different cell-free stock media. This can be done on the one hand in such a way that the photosynthetic layer is separated from a first carbon storage medium by a porous hydrophilic membrane which is permeable to water and dissolved ions.
  • the first carbon storage medium used to deliver bicarbonate ions to the photosynthetic layer may be replaced by a hydrophobic, gas-permeable membrane with a second carbon storage medium which provides carbon dioxide to the first carbon storage medium to regenerate the spent bicarbonate ions.
  • the carbon substrate may be provided on one side of the bilateral photosynthetic layer by diffusion of bicarbonate ions from a photosensitive medium-like carbon storage medium through a hydrophilic porous membrane and on the other side of the bilateral photosynthetic layer by diffusion of carbon dioxide from a second carbon storage medium through a hydrophobic, gas permeable membrane are supplied.
  • the described combination of a first cell-free carbon storage medium, which resembles the photosynthetic medium and increases its buffer capacity, and another carbon storage medium, which has a high volume-related substrate storage capacity, is particularly advantageous. It causes a high carbon storage capacity in the photobioreactor and allows the removal of cell-free photosynthesis products by the flow of the first carbon storage medium. Is the suspension of photoautotrophic microorganisms in the photosynthetic layer or one of the Cell suspension with a hydrophilic porous membrane separated carbon storage medium in flow, this allows on the one hand the harvest of biomass and on the other hand, the extraction of diffusive photosynthetic products from at least a portion of the carbon storage medium, separated from the cells.
  • the increase in the pH which occurs because of the consumption of hydrogencarbonate ions and / or of carbon dioxide in the photosynthetic medium and in the carbon storage medium, is limited by adding an acid to the carbon storage medium.
  • This offers the advantage that photoautotrophic microorganisms with low alkali tolerance can be used.
  • Another advantage is the almost complete utilization of the inorganic carbon as the substrate concentration in the photosynthetic storage medium decreases with increasing pH. This is known to be the case with bicarbonate buffers or aqueous solutions of carbamate ions.
  • the design of the gas discharge and the limitation of the carbon dioxide partial pressure in the photobioreactor ensures that the gas volume leaving the photobioreactor is largely determined by the volume of the photosynthetically formed oxygen.
  • This offers, for example, the advantage that the supply of photosynthesis substrate in the photobioreactor lasts longer than with a less stringent limitation of the diffusive carbon dioxide losses.
  • the gas discharge can be designed, for example, so that gases from the photobioreactor predominantly escape due to flow.
  • One way to ensure this, for example, is to form the outer boundary of a largely gas-tight material containing microscopic pores with small pore area and small diameter between the inner gas space and the atmosphere.
  • the upper outer boundary of a transparent Acriyglas- or polycarbonate plate consist, were introduced into the with a laser-assisted drilling process isolated pores in a diameter of 50 ⁇ . A small area fraction of these pores limits the diffusion and prevents complete pressure equalization, whereby there is always a slight overpressure in the photobioreactor and the gas volume formed in the photobioreactor is convectively discharged.
  • a further possibility for this is to guide the outflowing gas through a flow channel, preferably a hose or a pipe, through a liquid in which it rises in the form of bubbles to the surface.
  • the gas be passed through a flow path in a capillary tube or a tube of small width to the outside, the length and width of the flow path are chosen so that according to the first Fick's Law and the law of Hagen-Poiseuille, the flow velocity above the permeability coefficient for the diffusion of carbon dioxide lies on the flow path.
  • the diffusive carbon dioxide release can be almost completely prevented by a gas-tight outer boundary with a convective gas discharge.
  • the concentration ratios in the carbon storage medium so that the carbon dioxide partial pressure in the gas space of the photobioreactor does not exceed 20 kPa. This ensures that the carbon dioxide in the inner gas space of the photobioreactor has a volume fraction lower than that of oxygen. If this is ensured, the molar amount of photosynthetically bound carbon is higher than that which reaches the atmosphere with the gas volume flow.
  • the provision of carbon substrate to the photosynthetic medium from translucent carbon stock media over light and substrate permeable membranes has the advantage that the carbon storage media in the photobioreactor can be arranged to be effective light guides and uniformly illuminate the sunlight or light of an artificial light source onto the surface distribute the photosynthetic layer.
  • the refraction and reflection of the light at the interfaces between the liquids and the membranes, as well as additionally introduced into the receiving space reflectors can be exploited to optimally distribute the light in the depth of the receiving space.
  • the proposed photobioreactor for the cultivation of photoautotrophic microorganisms detects in an exemplary embodiment a closed receiving space with a gas diffusion inhibiting, at least partially transparent outer boundary, which allows the convective discharge of the gas volume formed in the photosynthesis in the manner already described.
  • the receiving space contains at least a first compartment, which serves to form at least one photosynthetic layer of a maximum thickness of typically less than 10 mm on average and contains the suspension of photoautotrophic microorganisms in the photosynthetic medium during operation of the photobioreactor.
  • Each first compartment is of at least a second compartment, which is the Absorption of the cell-free carbon storage medium (4) is used, separated by a light-permeable membrane which is permeable to hydrogen carbonate ions and / or carbon dioxide.
  • the second compartment for receiving the cell-free carbon storage medium may be separated by a flexible, hydrophilic, porous membrane from the first compartment with the suspension of photoautotrophic microorganisms in the photosynthetic medium.
  • a flexible, hydrophilic, porous membrane from the first compartment with the suspension of photoautotrophic microorganisms in the photosynthetic medium.
  • This is, for example, a translucent, hydrophilic dialysis or microfiltration membrane made of nylon ®, regenerated cellulose, a cellulose derivative or the like, which is impermeable to the cells, but permeable to water and dissolved in water low molecular weight substances.
  • Such membranes are used for ultrafiltration or dialysis and are advantageously freely available.
  • This embodiment of the photobioreactor makes possible the already explained embodiment of the method, in which all low molecular weight substances are in exchange between the photosynthetic layer and the photosynthetic medium.
  • the second compartment for receiving the carbon storage medium from the first compartment containing the photosynthetic layer is separated by a hydrophobic membrane permeable to non-volatile water-soluble substances but permeable to carbon dioxide and other gases.
  • Suitable membranes for this purpose are, for example, thin and / or microporous membranes of polyolefins such as polyethylene, polypropylene or similar hydrophobic polymers.
  • This embodiment of the photobioreactor can also be used for photoautotrophic organisms with low tolerance to high salt concentrations and pH values.
  • the thickness or porosity of the gas-permeable membrane or the pH and concentration-dependent carbon dioxide partial pressure in the carbon storage medium can be used to adjust the rate at which carbon dioxide enters the photosynthetic layer.
  • a fluid containing carbon dioxide for example pure carbon dioxide or a gas mixture or a high absorption organic liquid for carbon dioxide enriched or saturated with carbon dioxide, or the aqueous solution of a Carbon dioxide reversible binding substance. Further details of this embodiment can be found in the description of the method.
  • a compartment separated by a hydrophobic gas-permeable membrane for receiving a carbon storage medium is combined with a further compartment for receiving a carbon storage medium, wherein the further compartment is separated from the photosynthesis medium by a hydrophilic porous membrane.
  • the hydrophobic gas-permeable membrane either separates the photosynthetic layer from a compartment intended for receiving a storage medium or separates the two compartments intended for receiving storage media. The latter embodiment makes it possible to compensate for the carbon loss of a cell-free carbon storage medium taken from bicarbonate through the photosynthetic layer by the penetration of carbon dioxide through the hydrophobic gas-permeable membrane.
  • This combination of two compartments for carbon storage media provides high buffer capacity and high storage capacity for inorganic carbon compounds in the photobioreactor through the first carbon dioxide-yielding carbon storage medium.
  • the cell-free second carbon storage medium which is in exchange with the photosynthetic medium over a hydrophilic pore membrane, allows the separation of the soluble photosynthetic products from the cells and improves the substrate distribution in the photosynthetic layer. Further details and advantages of this embodiment of the photobioreactor can be found in the description of the method.
  • membrane boundaries allows the upright placement of one or more photosynthetic layers and one or more layers of the carbon storage medium in various geometric embodiments, for example in the form of parallel or concentric photosynthetic layers between layers of the carbon stock medium or multiple carbon stock media.
  • This is advantageous because light incident through the cell-free carbon storage medium from above or from the side into the photobioreactor can be introduced deeply into the space of the photobioreactor and distributed by scattering, reflection and refraction on the surface of the upright photosynthetic layer (s). In this way - based on the exposed area of the photosynthetic layers and based on the volume of the photobioreactor - high photosynthesis rates can be achieved with little technical effort.
  • the upright photosynthetic layers may be in a cylindrically shaped Bioreactor are in the gaps between a plurality of mutually adjacent upright arranged membrane tubes, which are filled with the / the carbon storage medium.
  • the proportion of photosynthetic layers at the cross section of the photobioreactor is only 25 to 30%.
  • a higher volume fraction of the photosynthetic layers in the photobioreactor can be achieved in embodiments with upright, extensively extended, membrane-bound layers with a parallel, concentric or spiral arrangement, as shown in FIGS. 3 and 6.
  • the flexible light- and substrate-permeable membranes which separate the photosynthetic layer from cell-free layers of the storage medium are used in the form of one or more areal expanded pockets, wherein the thickness of the layers of the cell-free medium and / or the photosynthetic layer is determined by spacers can be set, as shown in Figures 1 B and 3 is shown.
  • Suitable spacers are, for example, solid structures which can limit the expansion of at least one liquid layer between two flexible membranes, e.g. Lattices, braids, profile films and the like.
  • Particularly advantageous spacers are designed in the form of a profile film with elastically compressible folding or wave-like profile. If such a profile film, which is elastically compressed in a surface area, is introduced into a suitable membrane pocket, the membrane stress produced thereby prevents the expansion of the flexible membrane transversely to the surface area and produces parallel vertical or horizontal compartments.
  • a schematic representation of the application of a profile film in a pocket-shaped membrane boundary of the photosynthetic layer is shown in FIG.
  • the profile foil consists of a light-transmitting or light-reflecting material such as acrylic glass or stainless steel, it can contribute to improving the light distribution on the photosynthetic layer or in the photosynthetic layer. In the horizontal position of the folds sedimentation of the cells can be limited.
  • the pleat-like profile can also be used to form parallel horizontal or vertical flow paths in the membrane-bound photosynthetic layer (s) and / or in the layer (s) of the cell-free medium.
  • the thickness of the photosynthetic layer or a layer of the carbon storage medium between two opposite membranes by strip-shaped or punctiform Limited membrane connections is shown schematically in FIGS. 4 and 5.
  • the advantage of this embodiment is, inter alia, that the cost and material costs for the production of a membrane-bound photosynthetic layer is low.
  • the strip-shaped connection between the membrane surfaces can preferably be designed so that there is a single meandering flow path on the membrane surface. If the photosynthetic layer in channels thus produced is located on a membrane surface, this enables the continuous or discontinuous introduction of a dilute suspension into the exposed photosynthetic layer and the removal of biomass from the photosynthetic layer.
  • the supply of the storage medium and the separation of the photosynthetic products from the cells are possible.
  • the sedimentation of the cells is limited.
  • the carbon storage medium can flow continuously along a stationary photosynthetic layer, with permeable photosynthesis products accumulating in it.
  • the suspension of the photoautotrophic cells on a stationary layer of the storage medium can be moved on a flow path between the strip-shaped membrane connections in order to continuously harvest the biomass formed.
  • the photobioreactor only an extensively extended photosynthetic layer and an overlying gas space are enclosed by the outer boundary.
  • the latter is associated with the gas discharge.
  • the outer boundary for example a translucent, largely gas-impermeable plastic film, is adapted in its areal extent to the photosynthetic layer.
  • the advantage of this embodiment is that the photobioreactor can be exposed in a floating manner on a water surface, as shown schematically in FIG.
  • the gas discharge can be designed in this embodiment as a gas discharge pipe, which leads below the water surface, diffusion-inhibiting.
  • a pumping device which prevents the sedimentation of the cells by keeping the suspension in motion by means of oscillating or circulating flow.
  • a plurality of photosynthesis layers arranged upright and parallel to one another are hydraulically connected to one another.
  • the proposed photosynthetic layer is in the first compartment an at least partially open-pore matrix which forms a three-phase system of a transparent solid phase, a finely divided gas phase and an aqueous liquid on the suction of water or aqueous liquid phases.
  • a photosynthetic layer is formed, in which the photoautotrophic microorganisms are surrounded by a finely divided gas phase and a finely divided liquid phase.
  • the light-transmitting and light-scattering three-phase system promotes the diffusion of carbon dioxide through the gas phase and allows the diffusion of hydrogen carbonate ions and other water-soluble substances in the liquid phase. At the same time, the penetration depth of the light into the photosynthetic layer is increased.
  • An exemplary embodiment of the three-phase system is open-pored, elastic and transparent foam, the pores of which are partially saturated with the photosynthetic medium and partially saturated with air.
  • films made of different elastomers such as latex and polyurethane have proven to be particularly suitable.
  • Very suitable for the production of the photosynthetic layer in this embodiment are films of open-pore, translucent and hydrophilic polyurethane foam. The use of such a film in the photosynthetic layer is shown in a horizontal position in FIG. 2 and in an upright position in FIG.
  • a three-phase system with a finely divided gas phase is formed, for example by inclusion of gas and / or by photosynthesis in the open-pore part of the foam.
  • the thickness of the photosynthetic layer is determined by the thickness of the foam film, in the capillary spaces of which the suspension of photoautotrophic microorganisms is absorbed.
  • high biomass concentrations were achieved by photosynthesis using various embodiments of the proposed photobioreactor.
  • the elasticity and mechanical strength of said material allows advantageous methods of removal of biomass and the supply of new medium by using an adapted device for compressing the photosynthetic layer, for example by means of a press, a roller or a slot or by applying pressure to the translucent membrane with Help of carbon storage medium.
  • the photosynthetic layer can also be supplied with oxygen during a dark period without separate ventilation, since the finely divided gas phase stores oxygen during an exposure phase.
  • photosynthetic layers can be used which are of a carbon storage medium serving carbon dioxide-containing gas phase are limited, wherein the carbon dioxide is supplied via a gas-permeable membrane. This increases the supply of oxygen for a dark phase.
  • the photobioreactor contains an elastic foam film in the first compartment and devices for pressing off and discharging the suspension of the photoautotrophic microorganisms.
  • a method of cultivating photoautotrophic microorganisms comprises providing a layer containing a photosynthetic medium and photoautotrophic microorganism-suspended therein in a confined receiving space, the photosynthetic medium containing bicarbonate at a concentration greater than 20 mM; and exposing the photoautotrophic microorganisms in the photosynthetic medium without vortexing or passing a gas through the photosynthetic medium while limiting the diffusive gas exchange of the receiving space with the environment.
  • the delivery of at least one photosynthetic substrate selected from the group comprising carbon dioxide and bicarbonate to the photosynthetic medium from at least one carbon storage medium via a light-transmissive membrane, which is permeable to the photosynthetic substrate is permeable to the photosynthetic substrate.
  • FIG. 1 shows two photobioreactors with the essential components for the process in cross section
  • FIG. 2 shows the cross-section of a photobioreactor with a flexible outer boundary and a flat photosynthetic layer
  • FIG. 3 shows the overview image of a photobioreactor with three membrane-bound photosynthetic layers arranged upright; 4 shows the view of a container formed by bonding two polypropylene membranes and stretched by overpressure container for the carbon storage medium.
  • Figure 5 is a perspective view of a meandering flow path between two welded or bonded membranes
  • FIG. 6 shows the concentric arrangement of a photosynthetic layer and two membrane-limited storage media
  • Figure 7 shows an embodiment of a photobioreactor with several upright
  • FIG. 1 shows essential components of a photobioreactor for carrying out the proposed method using the example of two embodiments.
  • FIG. 1A The photobioreactor has a light-permeable, diffusion-inhibiting outer boundary 1.
  • the photosynthetic layer 2 is arranged horizontally and shown in cross section perpendicular to the base. It can be illuminated from above. Above the photosynthetic layer is a gas phase.
  • Fig. 1B A photobioreactor with an upright photosynthetic layer is shown in a cross-section parallel to the base.
  • the photosynthetic layer is enclosed in a thin pocket of the substrate permeable membrane 3. Its thickness is designed by a spacer 6 in the form of a plastic grid.
  • the bag is located in the liquid carbon storage medium.
  • the outer boundary of the photobioreactor contains microscopic hydrophobic pores which limit the overpressure caused by oxygen formation. Their area fraction is so small that the gas volume flow from the photobioreactor through the outer boundary takes place predominantly as a laminar gas flow.
  • FIG. 2 shows in cross-section a photobioreactor with a photosynthetic layer 2, in which the suspension of the photoautotrophic microorganisms and a finely divided gas phase are located in the capillary spaces of an elastic foam film 7.
  • the gas-tight outer boundary 1 of the photobioreactor is a pocket made of a translucent silicone rubber membrane.
  • a PVC plate In the bag are a PVC plate and a flat expanded film of hydrophilic, partially open-pored polyurethane foam 7.
  • a PVC pipe serves as a convective gas discharge 5, which leads below the water surface.
  • the supply of photosynthetic substrate is in the photosynthetic medium in the form of a high concentration of bicarbonate and carbonate ions.
  • FIG. 3 shows in a plan view A and a perspective side view B a photobioreactor with pocket-shaped substrate-permeable membranes and light-reflecting and translucent profile films which determine the layer thickness of the upright photosynthetic layer 2. Shown is the arrangement of two pocket-shaped membranes separating two cell-free carbon storage media from three photosynthetic layers 2 with the suspension of photoautotrophic microorganisms.
  • One of the carbon storage media 4a has the same composition as the photosynthetic medium in the photosynthetic layer.
  • the adjacent substrate-permeable membrane 3a is made of hydrophilic porous nylon ® with a mesh size of 1 ⁇ .
  • the other cell-free medium 4b is a buffer of potassium bicarbonate and potassium carbonate with a total concentration of 3 M.
  • the adjacent substrate-permeable membrane 3b is made of polypropylene and is 15 ⁇ thick. Both membrane pockets contain as spacers 6 an elastically compressed in the direction of the surface area of the membranes forming profiled sheet of acrylic glass with wavy profile. The light entering obliquely from above is reflected at the profile foil as well as at gas bubbles, which adhere to the membrane surfaces, whereby a good light distribution into the depth of the space of the photobioreactor is guaranteed.
  • the three photosynthetic layers 2 are fluidly connected to each other. Near the base plate is located in the outer wall of the photobioreactor, an elastic membrane (not shown) on which an oscillating vertical flow in the photosynthetic layer can be generated by a vibrator from the outside.
  • FIG. 4 shows a substrate-permeable membrane 3 with punctiform welds.
  • the substrate-permeable membrane is a thin, gas-permeable polypropylene membrane.
  • Such a membrane system can be stretched by the carbon dioxide partial pressure of a liquid carbon storage medium or the pressure of a carbon dioxide-containing gas mixture and used in an upright position in a photobioreactor for limiting the thickness and substrate supply of a photosynthetic layer.
  • FIG. 5 schematically shows a meandering flow channel which is formed by strip-shaped welding of two superimposed substrate-permeable membranes 3.
  • Such membrane-limited channels can be advantageously used for the limitation and laminar flow of a carbon storage medium or a photosynthetic layer.
  • FIG. 6 on the basis of a plan view A and a perspective side view B shows a concentric arrangement of a photosynthetic layer 2 and two different carbon storage media 4a and 4b.
  • the carbon storage media 4a and 4b are located on the inside and on the outside of the photosynthetic layer 2 and are separated from the photosynthetic layer 2 by respective different substrate permeable membranes 3a and 3b.
  • an elastic foam film 7 made of polyurethane is integrated.
  • the central carbon storage medium 4a is a potassium bicarbonate carbonate buffer having an initial total inorganic carbon compound concentration of 3 M and an initial carbon dioxide partial pressure of 3.2 kPa.
  • the peripherally arranged second carbon storage medium 4b exchanges ions with the photosynthetic layer via a hydrophilic porous membrane 3b and corresponds in its composition to the photosynthesis medium.
  • the embodiment shown in Figure 7 A in the plan view and in Figure 7B in a perspective side view shows a photobioreactor with cylindrical gas-tight outer boundary 1 with a plurality of upright Photosynthese Anlagenen 2, which are fluidly interconnected and between membrane hoses, which with a liquid carbon storage media. 4 are filled.
  • the carbon storage medium is a bicarbonate / carbonate buffer having a concentration of 3 M and an initial carbon dioxide partial pressure of 3.2 kPa.
  • the carbon storage medium fills tubes made of a thin, gas-permeable polyethylene or polypropylene membrane, which are sealed gas-tight at the top with a translucent closure made of acrylic glass (not shown).
  • the photobioreactor comprises a gas space arranged above these tubes and photosynthetic layers. The gas space is through a Gas discharge in the form of a capillary tube made of polypropylene connected to the atmosphere.
  • Example 1 the culture of the cyanobacterium Sychenocystis sp. PCC 6803 in a 4 mm thick photosynthetic layer.
  • the essential components of the simple photobioreactor used are shown in FIG. 1A.
  • the photobioreactor used was a sterile tissue culture bottle of acrylic glass with an internal volume of 500 ml with a base area of 200 cm 2 , into which 50 ml of a suspension of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 in a photosynthetic medium to form a 4 mm thick photosynthetic layer with an initial biomass concentration of 0.3 g dry matter per L.
  • the photosynthetic medium contained the components of a standard mineral medium for the culture of cyanobacteria (BG-1 1 medium according to Schlösser, UG Bot.
  • the photobioreactor described in this way was exposed in a phytochamber to the continuous light of fluorescent tubes with a photon flow rate of 60 ⁇ m "2 s " 1 .
  • 30 ml of the suspension were removed from the photobioreactor and replaced by 30 ml of fresh carbon storage medium.
  • the biomass concentration before daily dilution increased to a value of 0.5 to 0.6 g dry matter per liter. This shows that by using the carbon storage medium used, the cyanobacteria studied maintained a growth rate well above 1 d -1 .
  • Example 2 In this example, a photobioreactor with horizontal photosynthesis layer and gas discharge is described, wherein the photosynthetic layer is formed as a three-phase system with a finely divided gas phase.
  • FIG. 2 shows a cross section through the photobioreactor in the position of the gas discharge.
  • PVC polyvinyl chloride
  • an equally large film made of transparent hydrophilic, elastic and partially open-pored 4 mm thick layer of polyurethane foam was attached with silicone adhesive.
  • a hole of 5 mm diameter is passed through the plate and the foam.
  • a suitable silicone tube was glued into the hole, through which a 2 cm long tube made of PVC with an inner diameter of 2 mm was sealingly and slidably fitted.
  • the PVC pipe served as a gas outlet.
  • the plate with the foam film was introduced into a suitable membrane pocket which was initially open on one side.
  • the bag consists of a translucent, largely gas-tight, flexible membrane made of silicone rubber with a thickness of 0.3 mm.
  • a round hole having a diameter of 4 mm was punched through the silicone rubber sheet.
  • the silicone rubber film was sealed to the PVC plate with the aid of silicone adhesive.
  • the bag containing the contents was sterilized by autoclaving.
  • 30 ml of a suspension of Synechocystis sp. PCC 6803 was filled to a dry matter concentration of 0.1 g L "1.
  • the suspension was spread in the foam film by light pressure on the silicone membrane
  • the photosynthetic medium used had the composition described in Example 1.
  • the open side of the film bag was coated with a With continuous light of a quantum flux density of 80 ⁇ m "2 s " 1 , a growth rate of 0 was still observed in this photobioreactor at a mean biomass concentration of 0.8 g dry matter per liter. 8 d "1 reached.
  • the illustrated photobioreactor was suitable for semi-continuous biomass production. To harvest biomass, the gas discharge was removed and replaced with a suitable plug. After removal of the clip, half of the suspension was squeezed and replaced with fresh carbon storage medium. This type of harvest was at intervals of 2 d repeated. After a few cycles, the biomass concentration at harvest increased to 1 to 2 g dry matter per liter.
  • Example 3 illustrates an embodiment of the proposed fixed-boundary photobioreactor in which a horizontal photosynthetic layer is bounded by a gas-permeable hydrophobic membrane of polyethylene and supplied with carbon dioxide by diffusion of the carbon dioxide from a carbon storage medium through a gas-permeable membrane.
  • Strip-shaped welding of the opposite membrane sides of a foil pocket made of 20 ⁇ m thick polyethylene gave rise to a meandering flow path on the surface of the pocket, as shown in FIG.
  • conical filling nozzles were welded, which can be closed by inserting a conical silicone rubber stopper.
  • the flow path was filled with a suspension of cyanobacteria.
  • the medium already described in Example 1 was used.
  • the resulting membrane-bound photosynthetic layer was placed on a shallow dish containing a cell-free, unphysiological carbon storage medium in the form of a mixture of 3 M potassium bicarbonate and 3 M potassium carbonate (4: 1, v / v).
  • the shell was closed with a perforated glass lid greased on the edge to achieve a largely gas-tight outer boundary.
  • a steel cannula with a diameter of 0.3 mm and a length of 80 mm was glued in as a gas outlet to allow the largely convective gas discharge.
  • the shell was exposed to floating water continuously with fluorescent light of an intensity of 60 ⁇ m "2 s " 1 at 25 ° C. Photosynthesis led to the formation of oxygen bubbles in the photosynthetic layer, which additionally scattered the incident light.
  • the suspension in the photosynthetic layer reached a biomass concentration of about 5 g dry matter per liter after only three to four days.
  • Example 4 The photobioreactor illustrated in this example is shown schematically in FIG. It has a hydraulically connected upright photosynthetic layer, which is above substrate permeable membranes in exchange with two different carbon storage media.
  • One of the carbon storage media contains potassium hydrogen carbonate and potassium carbonate in the toxic concentration of 3 M.
  • the other carbon storage medium is largely identical to the photosynthetic medium, whose composition is described in Example 1.
  • the carbon storage media and photosynthetic layer are concentric with each other as shown in FIG. A shaking culture of the cyanobacterium Synechocystis sp. Growing in this carbon storage medium.
  • PCC 6803 was diluted with the carbon stock medium to produce the inoculum to a biomass concentration of 1 g dry weight per L.
  • a dialysis tube of regenerated cellulose (Union Carbide, Chicago, USA, length 25 mm, swollen diameter 31 mm) was closed at the bottom and swollen in water.
  • a suitable blank of a 6 mm thick film of elastic, transparent open-pore and hydrophilic polyurethane foam was inserted into the dialysis tube.
  • the foam covered the inner side of the dialysis membrane in a single layer up to a height of 17 cm.
  • a bottom sealed film tube from a 50 ⁇ thick polyethylene film (tube film Haaga GmbH, Heringsdorf) was introduced with a diameter of 19 mm and a length of 25 cm in the remaining cavity.
  • the polyethylene tube was filled with a mixture of four parts of a 3 M potassium bicarbonate solution and one part of a 3 M potassium carbonate solution to a filling height of 18 cm and sealed at the end with a translucent acrylic glass stopper.
  • an amount of 80 ml of the suspension of cyanobacteria was placed on the foamed sheet between the polyethylene membrane and the dialysis membrane. This suspension was absorbed by the foam matrix, resulting in a three-phase system with finely divided gas phase in the photosynthetic layer.
  • the dialysis tube with the central carbon storage medium and the external photosynthetic layer was placed in a cylindrical vessel having a diameter of 6 cm and a height of 20 cm.
  • the latter was filled up to a filling height of 19 cm with the above-characterized physiological carbon storage medium.
  • the photosynthetic layer was in communication with the non-toxic carbon storage medium via the dialysis membrane and was also supplied with carbon dioxide through the first carbon storage medium via the polyethylene membrane.
  • the dialysis tube was open at the top and protruded with the opening in a gas space below the lid of the cylindrical vessel. The lid was pressed against the vessel with a clamp and rubber gas-tight seal. Through the lid, a gas discharge in the form of a 200 mm long Kapillarschlauches was passed with 0.2 mm inner diameter.
  • the resulting photobioreactor was exposed on a reflective surface from above with fluorescent lamps for 16 h daily with a quantum flux density of 80 ⁇ m "2 s 1.
  • Example 5 concerns a variant of the proposed photobioreactor with several upright photosynthetic layers. They are located between upright tubes of thin polyethylene film which enclose the carbon storage medium as shown in FIG. The sedimentation of the cells in the photosynthetic layers is prevented by oscillating flow in the photosynthetic layers.
  • the photobioreactor had 7 cylindrical, filled with a mixture of 3 M potassium hydrogen carbonate and 3 M potassium carbonate (4: 1, v / v) and closed bottom tubes of gas and translucent polyethylene film (50 ⁇ membrane thickness, diameter 19 mm, length 20 cm, Tubular film Haaga GmbH, Heringsdorf), which were each closed at the top with translucent plexiglass plugs.
  • the hoses were tightly packed in a matching cylindrical glass jar with a polypropylene grille fixed to the floor at a height of 1 cm.
  • the photobioreactor contained photosynthetic layers formed by a suspension of the green alga Pseudokirchneriella subcapitata in a photosynthetic medium.
  • the photosynthetic medium was a mineral medium after cooling and Lorenzen (Kühl and Lorenzen, in: Prescott, DM (Ed.): Methods in Cell Physiology, pp. 152-87, Academic Press, New York 1964), the sodium bicarbonate at a concentration of 30 mM was added.
  • Under the grille was an externally sealed air-filled bag made of thin, elastic silicone rubber.
  • the membrane tubes were connected to a 10 ml glass syringe whose pistons, by eccentric coupling to a rotor, produced gas pressure fluctuations at a frequency of 10 min -1 , thereby interposing an oscillating vertical flow in the upright photosynthetic layers produced the membrane tubes.
  • the 3 M potassium bicarbonate buffer used as the carbon storage medium in the polyethylene tubes had an initial carbon dioxide partial pressure of 3.2 kPa.
  • the vessel was provided with a tight-fitting lid with gas discharge, as in Example 5, and was exposed uninterrupted in a phytochamber at 20 ° C from above with fluorescent lamps for plant cultivation with an intensity of 120 ⁇ m "2 s " 1 .
  • the suspension had a biomass concentration of 0.5 g dry matter per liter at the beginning of the culture. After four days, the biomass concentration was about 3 g / L. Only then did the growth rate decrease noticeably due to light limitation.
  • a much lower biomass concentration (about 1.2 g dry matter per liter) resulted in the same time with the same exposure.
  • the higher growth rate in the described photobioreactor can be explained by the better light distribution with the help of the upright membrane tube and the much smaller layer thickness.
  • the delivery of scattered light into the photosynthetic layer was promoted by small gas bubbles on the upright polyethylene membrane.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Kultivierung von photoautotrophen Mikroorganismen vorgeschlagen, umfassend: -Bereitstellen einer ein Photosynthesemedium und darin suspendierte photoautotrophe Mikroorganismen enthaltenden Photosyntheseschicht (2) in einem abgeschlossenen Aufnahmeraum mit einer gasdiffusionshemmenden Außenbegrenzung (1 ), wobei die Photosyntheseschicht (2) eine mittlere Dicke von nicht mehr als 10 mm aufweist; - Belichten der Photosyntheseschicht (2) ohne das Verwirbeln oder Durchleiten eines Gases im Photosynthesemedium unter Begrenzung des diffusiven Gasaustausches des Aufnahmeraumes mit der Umgebung, wobei die Versorgung der Mikroorganismen im Photosynthesemedium mit Hydrogencarbonationen durch das Speichern von Hydrogencarbonationen im Photosynthesemedium und/oder das Liefern eines Photosynthesesubstrats in Form von Kohlendioxid und/oder Hydrogencarbonat aus einem zellfreien Kohlenstoffvorratsmedium (4) außerhalb der Photosyntheseschicht aufrechterhalten wird; und - Ableiten eines bei der Photosynthese gebildeten Gases aus dem Aufnahmeraum. Weiterhin wird ein Photobioreaktor zur Kultivierung von photoautotrophen Mikroorganismen vorgeschlagen, der einen abgeschlossenen Aufnahmeraum mit einer Gasdiffusion- hemmenden Außenbegrenzung umfasst, wobei der Aufnahmeraum aufweist: - ein erstes Kompartiment zur Ausbildung einer Photosyntheseschicht (2), die eine mittlere Dicke von nicht mehr als 10 mm aufweist; - und mindestens ein zweites Kompartiment zur Aufnahme eines Kohlenstoffvorratsmediums (4), das vom ersten Kompartiment durch mindestens eine Membran getrennt ist, die durchlässig ist für mindestens ein Photosynthesesubstrat ausgewählt aus der Gruppe umfassend Kohlendioxid und Hydrogencarbonationen.

Description

Verfahren, Photobioreaktor und Photosyntheseschichten zur Kultur photoautotropher
Mikroorganismen
Gegenwärtig wird mit Hilfe der Gentechnologie das Spektrum der von photoautotrophen Mikroorganismen industriell produzierten Stoffe erweitert. Als photoautotrophe Mikroorganismen werden im folgenden Cyanobakterien und eukariontische Mikroalgen verschiedener Abteilungen, vor allem der Rhodophyta, Heterokonta, Euglenophyta und Chlorophyta mit einer Größe der Zellen oder Zellaggregate unter 20 μηη bezeichnet. Die Genome des Cyanobakteriums Sychenocystis sp. PCC 6803, der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii und weiterer biotechnologisch bedeutsamer phototropher Mikroorganismen sind entschlüsselt und es wurden bereits transgene Stämme mit dem Potential zur Photosynthese verschiedener biotechnologisch relevanter organischer Stoffe hergestellt. Als wesentliche Kohlenstoffquelle nutzt man in Photobioreaktoren Kohlendioxid, das den Zellsuspensionen dieser Mikroorganismen durch Einleiten von Luft oder Kohlendioxid-Luftmischungen zugeführt wird. Die Vermeidung von Kohlendioxid -Verarmungszonen und Lichtmangelgebieten in Photobioreaktoren mit Cyanobakterien und Mikroalgen geringer Größe ist bei hoher Biomassekonzentration technisch aufwändig. Der Einsatz von Alkalihydrogencarbonat in hohen Konzentrationen ist eine bekannte Möglichkeit der Förderung des anfänglichen Wachstums und des pH-Anstieges bei der Kultur des alkaliphilen großzelligen Organismus Spirulina plantenis in belichteten Becken, die Kohlendioxid mit der Atmosphäre austauschen. Als einzige Kohlenstoffquelle für die Photosynthese kann ein Hydrogencarbonatmedium aus stöchiometrischen Gründen nur dann genügend Vorrat für hohe Wachstumsraten bei hohen Biomassekonzentrationen enthalten, wenn es das Hydrogencarbonat in einer Konzentration von über 200 mM enthält. Es ist bekannt, dass es bereits bei weit niedrigeren Konzentrationen an Alkalihydrogencarbonat nach anfänglich gutem Wachstum zum Absterben zahlreicher Kulturen kommt.
Das Wachstum geschüttelter Kulturen photoautotropher Mikroorganismen kann durch ein membranbegrenztes Kohlendioxid-Reservoir gefördert werden. Letzteres besteht aus einer konzentrierten wässrigen Pufferlösung aus Hydrogencarbonat- und Carbonationen in einem Beutel aus dünner Polyethylenfolie. Das Kohlendioxid wird durch die gasdurchlässige Membran an die Zellsuspension mit membrankontrollierter Geschwindigkeit abgegeben.
Um mit geringem Aufwand die Kohlenstoffernährung der photoautotrophen Mikroorganismen in belichteten Photosyntheseschichten begrenzter Dicke zu verbessern und eine gute Substratverteilung mit einer optimalen Lichtverteilung bei der Produktion von Sauerstoff, Biomasse oder organischer Stoffe durch photoautotrophe Mikroorganismen zu verbinden, werden Verfahren, Photobioreaktoren und Photosyntheseschichten in verschiedenen Ausführungsformen entsprechend den Ansprüchen 1 bis 22 vorgeschlagen. Durch den Einsatz der Zellsuspensionen photoautotropher Mikroorganismen in Photosyntheseschichten begrenzter Dicke wird erreicht, dass die Photosynthese durch Lichtmangel erst bei hohen Zelldichten limitiert wird. Photosyntheseschichten im hier gebrauchten Sinne sind mit einer Gasphase direkt in Kontakt stehende Flüssigkeitsschichten oder Flüssigkeitsräume begrenzter Dicke, die durch einen lichtdurchlässigen Feststoff festgelegt wird. Die Anordnung der Suspensionen photoautotrophen Mikroorganismen in Schichten mit begrenzter Dicke begünstigt eine hohe Photosyntheserate, bezogen auf das Volumen der Zellsuspension. In dünnen Photosyntheseschichten, die eine effiziente Lichtverteilung ermöglichen, wird ein Verwirbeln der Zellen durch Ein- oder Durchleiten eines Kohlendioxid enthaltenden Gases vermieden. Bei dem vorgeschlagenen Verfahren wird eine Photosyntheseschicht mit einer mittleren Schichtdicke von ca. 10 mm oder weniger in einem Photobioreaktor dem Sonnenlicht oder der photosynthetisch aktiven Lichtstrahlung einer geeigneten Kunstlichtquelle ausgesetzt, wobei die photoautotrophen Mikroorganismen in der Photosynthese-Schicht in einem mineralischen Photosynthese-Medium mit einer Hydrogencarbonatkonzentration von vorzugsweise über 10 mM gehalten werden. Das vorgeschlagene Verfahren vermeidet das Durchleiten eines Gases durch die Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen bzw. durch den Photobioreaktor und ermöglicht so den Einsatz von sehr dünnen Photosyntheseschichten, der mit dem üblichen Verfahren zur Verteilung der Zellen im Lichtstrom und zur Verteilung des gelösten Kohlendioxids durch Erzeugung von Turbulenzen beim Einleiten eines Gases technisch nicht vereinbar ist. Das Kohlenstoff-Substrat ist entweder als Vorrat im Photosynthesemedium enthalten oder wird diffusiv in die Photosyntheseschicht eingeleitet. Die Aufrechterhaltung der Hydrogencarbonatkonzentration im Photosynthesemedium in einer Höhe von vorzugsweise mindestens 10 mM während der Kultur verhindert oder verzögert die Ausbildung von Substratmangelzonen mit hohem pH- Wert. Sie wird entweder durch eine hohe Anfangskonzentration der Hydrogencarbonationen im Kulturmedium oder durch die Verwendung eines Kohlenstoffvorratsmediums gewährleistet. Das Kohlenstoffvorratsmedium ist ein Fluid, das Hydrogencarbonationen und/oder Kohlendioxid an das Photosynthesemedium auf dem Weg der Permeation durch eine substratdurchlässige und lichtdurchlässige Membran abgibt. Figur 1 beschreibt schematisch einen Photobioreaktor mit den für das Verfahren wesentlichen Komponenten.
Das Aufrechterhalten einer Konzentration der Hydrogencarbonat-Ionen im Photosynthesemedium von vorzugsweise über 10 mM verhindert, dass diffusionsbedingte Substratverarmungszonen in einer nicht bewegten oder laminar strömenden Photosyntheseschicht entstehen. Das ermöglicht hohe Photosyntheseraten bei hohen Zelldichten ohne das Verwirbeln eines Kohlendioxid-haltigen Gases in der zellhaltigen Suspension. Das Erzeugen einer turbulenten Strömung durch permanente Gaseinblasung ist energieaufwendig und kann mit einer ständigen Scherbelastung für die kultivierten Mikroorganismen verbunden sein. Dabei kann die Lebensdauer der Zellen verkürzt werden. Abgestorbene Zellen verursachen eine störende Schaumbildung deren Unterdrückung zusätzliche technische Maßnahmen und Kosten erfordert.
Bisher wurde auf den Einsatz von Hydrogencarbonat als einzige Kohlenstoffquelle in abgeschlossenen Photobiorekatoren verzichtet, weil Medien mit hierfür ausreichenden Konzentrationen von Kalium- oder Natriumhydrogencarbonat in der Regel toxisch wirken. Unveröffentlichte Ergebnisse der Erfinder haben aber gezeigt, dass das Absterben eines biotechnologisch wichtigen phototrophen Mikroorganismus, des Süßwasser- Cyanobakteriums Syncechocystis sp. PCC 6803, in Nährlösungen mit 30 bis 50 mM Natrium- oder Kaliumhydrogencarbonat nicht auf der Toxizität der Bicarbonat- und Carbonationen beruht. Der Verbrauch des Hydrogencarbonats bei der Photosynthese führte bei den genannten Konzentrationen nach Erreichen einer kritischen Zelldichte zu einer schnellen und starken Zunahme des pH-Wertes bis auf toxisch wirkende Werte von etwa 1 1. Überraschenderweise zeigte der oben genannte Organismus in semikontinuierlicher Kultur stabile Wachstumsraten von etwa 1 pro Tag bei Biomassekonzentrationen zwischen 0,5 und 1 g Trockenmasse pro Liter, wenn er dem vorgeschlagenen Verfahren entsprechend, in einem Medium mit 200 mM oder 300 mM Kalium- oder Natriumhydrogencarbonat belichtet wurde. Ein Vorteil eines Photosynthesemediums mit einer so hohen Konzentration der Hydrogencarbonationen besteht in seiner hohen Pufferkapazität, die den stoffwechselbedingten Anstieg des pH Wertes verzögert. Extrem hohe pH-Werte, die den Toleranzbereich des photoautotrophen Mikroorganismus überschreiten, werden in ihm nicht erreicht, weil zuvor auf Grund von Lichtmangel die Photosynthese stark eingeschränkt wird. Ohne Zweifel können ebenso wie Synechocystis sp. PCC 6803 zahlreiche weitere Mikroorganismen direkt mit einem Photosynthesemedium in Kontakt gebracht werden, das relativ hohe Konzentrationen eines löslichen Hydrogencarbonates wie Kaliumhydrogencarbonat, Natriumhydrogencarbonat und Magnesiumhydrogencarbonat enthält, wenn der stoffwechselbedingte Anstieg des pH-Wertes auf toxische Werte vermieden wird. Für das Verfahren ist es vorteilhaft, wenn alkalitolerante und osmotolerante photoautotrophe Mikroorganismen kultiviert werden, bei denen Anfangskonzentrationen des Hydrogencarbonates im Photosynthesemedium über 200 mM eingesetzt werden können oder mit Hilfe eines Kohlenstoffvorratsmediums Hydrogencarbonatkonzentrationen über 50 mM aufrechterhalten werden können, weil dies eine Voraussetzung für die effiziente Versorgung relativ dicker Photosyntheseschichten mit dem Photosynthesesubstrat darstellt und starke stoffwechselbedingte pH-Gradienten in der Photosyntheseschicht verhindert. Bei Photosyntheseschichten mit einer Dicke von unter 2 mm ist die diffusive Verteilung des Hydrogencarbonats aber bei hohen volumenbezogenen Photosyntheseraten auch dann substratsättigend, wenn durch das Liefern von Hydrogencarbonat und/oder Kohlendioxid aus einem Kohlenstoffvorratsmedium eine Hydrogencarbonatkonzentration von mindestens 10 mM, bevorzugt mindestens 20 mM, insbesondere bevorzugt mindestens 50 mM aufrechterhalten wird. Daher sind das vorgeschlagene Verfahren und der vorgeschlagene Photobioreaktor auch mit solchen photoautotrophen Mikroorganismen einsetzbar, die weder osmotolerant noch alkalitolerant sind.
Das vorgeschlagene Verfahren umfasst die nachgewiesene Möglichkeit, den stoffwechselbedingten Anstieg des pH-Wertes in den zelltoxischen Bereich und Substratmangel in der Photosyntheseschicht allein dadurch zu verhindern, dass das Photosynthese-Medium Hydrogencarbonat-Ionen in einer Anfangskonzentration von über 50 mM, vorzugsweise von über 200 mM, enthält. So kann verhindert werden, dass die mittlere Konzentration der Hydrogencarbonationen in der Photosyntheseschicht in der Wachstumsphase unter einen Wert von 10 mM abfällt und sich Substratmangelzonen in der Photosyntheseschicht bilden.
Das vorgeschlagene Verfahren umfasst alternativ die Möglichkeit, ein zusätzliches zellfreies Kohlenstoffvorratsmedium einzusetzen, aus dem Hydrogencarbonat und/oder Kohlendioxid auf dem Wege der Diffusion durch eine lichtdurchlässige Membran an die Photosyntheseschicht geliefert werden. Das vorgeschlagene Liefern von Hydrogencarbonat und/oder Kohlendioxid an das Photosynthesemedium ermöglicht die Aufrechterhaltung einer mittleren Hydrogencarbonatkonzentration vorzugsweise über 10 mM im Photosynthesemedium und verhindert oder verzögert die Bildung von alkalischen Substratverarmungszonen. Gemäß einer oder mehrerer Ausführungsformen vergrößert das lichtdurchlässige und zellfreie Kohlenstoffvorratsmedium die Menge des im Photobioreaktor gespeicherten Kohlenstoffs und kann zusätzlich zur Lichtverteilung im Photobioreaktor genutzt werden. Bei dem vorgeschlagenen Verfahren ist die Sauerstoff-Freisetzung stöchiometrisch mit dem Verbrauch von Kohlendioxid oder Hydrogencarbonationen gekoppelt, die im zellfreien Kohlenstoffvorratsmedium und/oder im Photosynthesemedium gespeichert sind.
Ein zellfreies Kohlenstoffvorratsmedium kann über eine hydrophile poröse Membran, beispielsweise eine Dialysemembran aus Viskose oder regenerierter Zellulose oder eine Mikrofiltermembran aus Nylon, in Diffusionsaustausch mit dem Photosynthesemedium gebracht werden. Es enthält dann wegen der Diffusion aller Ionen durch die hydrophile poröse Membran alle Komponenten des Photosynthesemediums. Durch das zusätzliche Volumen des zellfreien Kohlenstoffvorratsmediums werden die Pufferkapazität und die Kohlenstoff-Speicherkapazität des Photobioreaktors erhöht. Vorzugsweise wird bei dieser Ausführungsform des Verfahrens ein Mineralmedium mit den üblichen Mikro- und Makronährstoffen zur Herstellung des Kohlenstoffvorratsmediums eingesetzt, dem Kalium- und/oder Natriumhydrogencarbonat und/oder Magnesiumhydrogencarbonat hinzugefügt sind. Die Anfangs-Konzentration der genannten anorganischen Kohlenstoffverbindungen beträgt vorzugsweise mindestens 200 mM, um eine starke Pufferung zu gewährleisten und ausreichend Substrat für die Kultur der photoautotrophen Mikroorganismen bis zu einer hohen Biomassekonzentration zur Verfügung zu stellen. Vorzugsweise umfasst bei dieser Ausführungsform des Verfahrens die Photosyntheseschicht eine Suspension eines photoautotrophen Mikroorganismus wie Synechocystis sp. PCC 6803, der hohe Konzentrationen von Natrium- oder Kaliumhydrogencarbonat sowie pH-Werte zwischen 9 und 10,5 toleriert. Eine Toleranz gegen sehr hohe Konzentrationen von Kalium- oder Natriumhydrogencarbonat ist bei marinen photoautotrophen Mikroorganismen oder bei solchen, die aus Soda- bzw. Natron-Seen isoliert wurden, generell zu erwarten, kann aber, wie eigene Ergebnisse zeigen, auch bei euryhalinen Süßwasser-Cyanobakterien oder - Mikroalgen festgestellt werden. Die Anwendung möglichst hoher Konzentrationen von Hydrogencarbonationen hat neben einer hohen volumenbezogenen Speicherkapazität für anorganischen Kohlenstoff den Vorteil, dass das Wachstum der photoautotrophen Mikroorganismen in einem selektiven Medium mit hohem osmotischem Druck, hoher lonenstärke und gegebenenfalls hohem pH-Wert erfolgt, wodurch die Möglichkeit der Kontamination mit den Luftkeimen von Fremdorganismen stark herabgesetzt wird. Bei einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird zum Liefern von Kohlenstoffsubstrat an die Photosyntheseschicht eine hydrophobe, für Wasser und wasserlösliche Stoffe undurchlässige, für Gase und Licht durchlässige Membran verwendet. Das in Kombination mit dieser Membran eingesetzte Kohlenstoff-Vorratsmedium ist in diesem Fall ein Kohlendioxid enthaltendes Gas oder eine Flüssigkeit, die Kohlendioxid in gelöster oder chemisch reversibel gebundener Form enthält. Als Kohlenstoffvorratsmedium in Verbindung mit einer gasdurchlässigen hydrophoben Membran sind solche Flüssigkeiten geeignet, in denen sich Kohlendioxid in einer hohen Konzentration löst, bzw. die einen hohen Absorptionskoeffizienten für Kohlendioxid aufweisen, wodurch hohe Konzentrationen von Kohlendioxid in gelöster Form bei relativ geringem Kohlendioxidpartialdruck erreichbar sind. Solche Flüssigkeiten sind beispielsweise Fluor Solvent der Firma Fluor Daniel (Propylencarbonat) oder Selexol ® der Firma Union Carbide (eine Mischung aus Dimethyläthern und Polyethylenglycol). Die genannten und weitere geeignete organische Flüssigkeiten wie Ethylencarbonat oder weitere zyklische Alkylencarbonate werden bekanntlich zum Entfernen von Kohlendioxid aus Gasen eingesetzt. In ihnen ist der Kohlendioxidpartialdruck der Kohlendioxidkonzentration annähernd proportional. Das zellfreie Kohlenstoffvorratsmedium kann bei Verwendung einer hydrophoben gasdurchlässigen Membran zur Lieferung von Kohlendioxid an die Photosyntheseschicht Kohlendioxid sowohl in gelöster als auch in chemisch reversibel gebundener Form enthalten. Beispiele für die Speicherung von Kohlendioxid durch reversible chemische Bindung an einen gelösten Stoff sind die wässrigen Lösungen der Hydrogencarbonate und Carbonate anorganischer oder organischer Basen, beispielsweise der tertiären Amine oder der Kalium- und/oder Natriumionen. Weitere Beispiele hierfür sind wässrige Lösungen der Carbamationen primärer oder sekundärer Amine. Auch diese Lösungen haben bei hoher Konzentration der Carbamate und geeignetem pH-Wert einen für das Liefern von Kohlendioxid an das Photosynthesemedium geeigneten Kohlendioxidpartialdruck. Bekanntlich wird Kohlendioxid beim Waschen von Verbrennungsabgasen u.a. in Carbamatform an Lösungen verschiedener Alkanaloamine reversibel gebunden. Werden hydrophobe gasdurchlässige Membranen zum Liefern von Kohlendioxid an die Zellsuspension in der Photosyntheseschicht verwendet, stehen die Zellen des photoautotrophen Mikroorganismus nicht direkt mit dem Kohlenstoffvorratsmedium in Kontakt. Daher können hoch konzentrierte Lösungen und toxisch wirkende Flüssigkeiten mit hoher Kohlenstoffspeicherkapazität eingesetzt werden, wobei die Nährionen des Photosynthesemediums nicht mit dem Kohlenstoffvorratsmedium austauschen und daher diesem auch nicht zugesetzt werden. Durch die Wahl einer Membran mit bestimmter Gas- Permeabilität oder die Wahl des Kohlendioxidpartialdruckes des flüssigen Kohlenstoffvorratsmediums können die Kohlendioxid-Flussraten in das Photosynthesemedium an die Photosynthese-Rate angepasst werden. Es besteht ein breiter Spielraum für die Einstellung der Gaspermeabilität durch die Dicke der Membran. Bekanntlich besitzen dünne, lichtdurchlässige Folien aus Polyethylen oder Polypropylen, die zur Verpackung von Obst und Gemüse oder andere feuchte Materialien wegen ihrer geringen Permeabilität für Wasserdampf eingesetzt werden, eine hohe Permeabilität für Sauerstoff und Kohlendioxid. Sie sind sehr gut verfügbar und bieten hervorragende Verarbeitungsmöglichkeiten. Gemäß einer oder mehrerer Ausführungsformen kann es bei stärkeren Polyolefinmembranen vorteilhaft sein, ein Kohlenstoffvorratsmedium einzusetzen, das unter Überdruck steht.
Gemäß verschiedenen Ausführungsformen kann das vorgeschlagene Verfahren so durchgeführt werden, dass zwei verschiedene zellfreie Vorratsmedien eingesetzt werden. Dies kann einerseits in der Weise erfolgen, dass die Photosyntheseschicht von einem ersten Kohlenstoffvorratsmedium durch eine poröse hydrophile Membran getrennt ist, die für Wasser und gelöste Ionen durchlässig ist. Das erste Kohlenstoffvorratsmedium, das zum Liefern von Hydrogencarbonationen an die Photosyntheseschicht eingesetzt wird, kann über eine hydrophobe, gasdurchlässige Membran mit einem zweiten Kohlenstoffvorratsmedium im Austausch stehen, welches zur Regeneration der verbrauchten Hydrogencarbonationen Kohlendioxid an das erste Kohlenstoffvorratsmedium liefert. Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann das Kohlenstoffsubstrat auf einer Seite der zweiseitigen Photosyntheseschicht durch Diffusion von Hydrogencarbonationen aus einem dem Photosynthesemedium ähnlichen Kohlenstoffvorratsmedium durch eine hydrophile poröse Membran bereitgestellt werden und auf der anderen Seite der zweiseitigen Photosyntheseschicht durch Diffusion von Kohlendioxid aus einem zweiten Kohlenstoffvorratsmedium durch eine hydrophobe, gasdurchlässige Membran geliefert werden.
Die beschriebene Kombination eines ersten zellfreien Kohlenstoffvorratsmediums, das dem Photosynthesemedium ähnelt und seine Pufferkapazität vergrößert, und eines weiteren Kohlenstoffvorratsmediums, das eine hohe volumenbezogene Substratspeicherkapazität besitzt, ist besonders vorteilhaft. Sie bewirkt eine hohe Kohlenstoffspeicherkapazität im Photobioreaktor und ermöglicht die Entnahme von zellfreien Photosyntheseprodukten, indem das erste Kohlenstoffvorratsmedium in Strömung versetzt wird. Wird die Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen in der Photosyntheseschicht oder ein von der Zellsuspension mit einer hydrophilen porösen Membran getrenntes Kohlenstoffvorratsmedium in Strömung versetzt, ermöglicht dies einerseits die Ernte von Biomasse und andererseits die Gewinnung diffusibler Photosyntheseprodukte aus zumindest einem Teil des Kohlenstoffvorratsmediums, getrennt von den Zellen. Gemäß einer oder mehrerer Ausführungsformen des vorgeschlagenen Verfahrens wird der Anstieg des pH-Wertes, der wegen des Verbrauches von Hydrogencarbonat-Ionen und/oder von Kohlendioxid im Photosynthesemedium und im Kohlenstoffvorratsmedium eintritt, durch Zugabe einer Säure zum Kohlenstoffvorratsmedium begrenzt. Das bietet den Vorteil, dass photoautotrophe Mikroorganismen mit geringer Alkalitoleranz eingesetzt werden können. Ein weiterer Vorteil besteht in der fast vollständigen Ausnutzung des anorganischen Kohlenstoffs, wenn die Substratkonzentration im Photosynthesevorratsmedium mit zunehmendem pH-Wert sinkt. Dies ist bekanntlich bei Hydrogencarbonat-Puffern oder wässrigen Lösungen von Carbamationen der Fall.
Gemäß einer oder mehreren weiteren Ausführungsformen des Verfahrens wird durch die Gestaltung der Gasableitung und die Begrenzung des Kohlendioxidpartialdruckes im Photobioreaktor gesichert, dass das aus dem Photobioreaktor austretende Gasvolumen weitgehend durch das Volumen des photosynthetisch gebildeten Sauerstoffs bestimmt wird. Das bietet beispielsweise den Vorteil, dass der Vorrat an Photosynthesesubstrat im Photobioreaktor länger vorhält, als bei einer weniger strikten Begrenzung der diffusiven Kohlendioxidverluste. Um die Diffusion des Kohlendioxids aus dem Photobioreaktor zu begrenzen, kann die Gasableitung beispielsweise so gestaltet werden, dass Gase aus dem Photobioreaktor überwiegend strömungsbedingt austreten. Eine Möglichkeit, dies zu gewährleisten, besteht beispielsweise darin, die Außenbegrenzung aus einem weitgehend gasdichten Material zu bilden, welches zwischen dem inneren Gasraum und der Atmosphäre mikroskopische Poren mit geringer Porenfläche und geringem Durchmesser enthält. Hierzu kann beispielsweise die obere Außenbegrenzung aus einer transparenten Acriyglas- oder Polycarbonatplatte bestehen, in die im mit Hilfe eines Laser-gestützten Bohrverfahrens vereinzelte Poren im mit einem Durchmesser von 50 μηη eingebracht wurden. Ein geringer Flächenanteil dieser Poren begrenzt die Diffusion und verhindert den vollständigen Druckausgleich, wodurch im Photobioreaktor stets ein geringfügiger Überdruck herrscht und das im Photobioreaktor gebildete Gasvolumen konvektiv abgeleitet wird.
Eine weitere Möglichkeit hierzu besteht darin, das ausströmende Gas mit Hilfe eines Strömungskanals, vorzugsweise eines Schlauches oder eines Rohres, durch eine Flüssigkeit zu leiten, in welcher es in Blasenform an die Oberfläche steigt. Alternativ kann das Gas durch eine Strömungsbahn in einem Kapillarrohr oder einem Schlauch geringer Weite nach außen geleitet werden, wobei die Länge und Weite der Strömungsbahn so gewählt werden, dass entsprechend dem ersten Fick'schen Gesetz und dem Gesetz von Hagen-Poiseuille die Strömungsgeschwindigkeit über dem Permeabilitätskoeffizienten für die Diffusion des Kohlendioxids auf der Strömungsbahn liegt. Die diffusive Kohlendioxidabgabe kann fast vollständig durch eine gasdichte Außenbegrenzung mit einer konvektiven Gasableitung verhindert werden.
Für die Reduktion strömungsbedingter Kohlendioxidverluste ist es vorteilhaft, die Konzentrationsverhältnisse im Kohlenstoffvorratsmedium so einzustellen, dass der Kohlendioxid-Partialdruck im Gasraum des Photobioreaktors 20 kPa nicht übersteigt. So wird gewährleistet, dass das Kohlendioxid in dem inneren Gasraum des Photobioreaktors einen Volumenanteil unter demjenigen des Sauerstoffs besitzt. Ist dies gewährleistet, liegt die molare Menge des photosynthetisch gebundenen Kohlenstoffs über derjenigen, die mit dem Gas-Volumenfluss in die Atmosphäre gelangt. Das Liefern von Kohlenstoffsubstrat an das Photosynthesemedium aus lichtdurchlässigen Kohlenstoff-Vorratsmedien über licht- und substratdurchlässige Membranen hat den Vorteil, dass die Kohlenstoffvorratsmedien im Photobioreaktor so angeordnet werden können, dass sie effektive Lichtleiter darstellen und das Sonnenlicht oder das Licht einer künstlichen Lichtquelle gleichmäßig auf die Fläche der Photosyntheseschicht verteilen. Hierbei kann die Brechung und Reflexion des Lichtes an den Grenzflächen zwischen den Flüssigkeiten und den Membranen, sowie an zusätzlich in den Aufnahmeraum eingebrachten Reflektoren ausgenutzt werden, um das Licht in der Tiefe des Aufnahmeraumes optimal zu verteilen.
Der vorgeschlagene Photobioreaktor zur Kultivierung von photoautotrophen Mikroorganismen erfasst in einer beispielhaften Ausführungsform einen abgeschlossenen Aufnahmeraum mit einer die Gasdiffusion hemmenden, mindestens teilweise lichtdurchlässigen Außenbegrenzung, welche die konvektive Ableitung des bei der Photosynthese gebildeten Gasvolumens in der bereits beschriebenen Weise ermöglicht. Der Aufnahmeraum enthält mindestens ein erstes Kompartiment, welches der Ausbildung mindestens einer Photosyntheseschicht einer maximalen Dicke von typischerweise durchschnittlich weniger als 10 mm dient und beim Betrieb des Photobioreaktors die Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen im Photosynthesemedium enthält. Jedes erste Kompartiment ist von mindestens einem zweiten Kompartiment, das der Aufnahme des zellfreien Kohlenstoffvorratsmediums (4) dient, durch eine lichtdurchlässige Membran getrennt, die für Hydrogencarbonationen und/oder Kohlendioxid permeabel ist.
Das zweite Kompartiment zur Aufnahme des zellfreien Kohlenstoffvorratsmediums kann durch eine flexible, hydrophile, poröse Membran vom ersten Kompartiment mit der Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen im Photosynthesemedium getrennt sein. Dabei handelt es sich beispielsweise um eine lichtdurchlässige, hydrophile Dialyse- oder Mikrofiltrationsmembran aus Nylon ®, regenerierter Zellulose, einem Zellulosederivat oder dergleichen, die für die Zellen undurchlässig, für Wasser und in Wasser gelöste niedermolekulare Stoffe jedoch durchlässig ist. Derartige Membranen werden zur Ultrafiltration oder Dialyse eingesetzt und sind vorteilhafterweise frei verfügbar. Diese Ausführungsform des Photobioreaktors ermöglicht die bereits erläuterte Ausführungsform des Verfahrens, bei dem alle niedermolekularen Stoffe zwischen der Photosyntheseschicht und dem Photosynthesemedium im Austausch stehen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform ist das zweite Kompartiment zur Aufnahme des Kohlenstoffvorratsmediums vom ersten Kompartiment, das die Photosyntheseschicht enthält, durch eine hydrophobe, für nichtflüchtige wasserlösliche Stoffe undurchlässige, für Kohlendioxid und andere Gase jedoch durchlässige Membran getrennt. Hierfür geeignete Membranen sind beispielsweise dünne und/oder mikroporöse Membranen aus Polyolefinen wie Polyäthylen, Polypropylen oder ähnlichen hydrophoben Polymeren. Der Vorteil dieser Ausführungsform des vorgeschlagenen Photobioreaktors besteht darin, dass das Kohlenstoffvorratsmedium nur über die Gasphase mit dem Photosynthesemedium austauscht. Es können daher anderenfalls toxisch wirkenden Flüssigkeiten mit sehr hoher Substrat-Speicherkapazität als Kohlenstoffvorratsmedium eingesetzt werden, beispielsweise ein 3 M Kaliumhydrogencarbonat-Puffer. Diese Ausführungsform des Photobioreaktors ist auch für photoautotrophe Organismen mit geringer Toleranz gegen hohe Salzkonzentrationen und pH-Werte einsetzbar. Durch die Dicke oder die Porosität der gasdurchlässigen Membran oder den pH-und konzentrationsabhängigen Kohlendioxid- Partialdruck im Kohlenstoffvorratsmedium kann die Rate eingestellt werden, mit der Kohlendioxid in die Photosyntheseschicht eintritt. In das zweite Kompartiment kann bei dieser Ausführungsform des Photobioreaktors ein Fluid gefüllt werden, in dem Kohlendioxid enthalten ist, beispielsweise reines Kohlendioxid oder ein Gasgemisch oder eine organische Flüssigkeit mit hohem Absorptionskoeffizienten für Kohlendioxid, die mit Kohlendioxid angereichert oder gesättigt ist, oder die wässrige Lösung eines Kohlendioxid in reversibel bindenden Stoffes. Weitere Einzelheiten zu dieser Ausführungsform sind der Beschreibung des Verfahrens zu entnehmen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein durch eine hydrophobe gasdurchlässige Membran abgetrenntes Kompartiment zur Aufnahme eines Kohlenstoffvorratsmedium mit einem weiteren Kompartiment zur Aufnahme eines Kohlenstoffvorratsmedium kombiniert, wobei das weitere Kompartiment durch eine hydrophile poröse Membran vom Photosynthesemedium separiert ist. Verschiedene Möglichkeiten dieser Kombination sind in Figur 3 und Figur 6 dargestellt. Die hydrophobe gasdurchlässige Membran trennt entweder die Photosyntheseschicht von einem zur Aufnahme eines Vorratsmedien bestimmten Kompartiment oder trennt die beiden zur Aufnahme von Vorratsmedien bestimmten Kompartimente. Die letztgenannte Ausführungsform ermöglicht es, den Kohlenstoffverlust eines zellfreien Kohlenstoffvorratsmediums, dem Hydrogencarbonat durch die Photosyntheseschicht entnommen wurde, durch Eindringen von Kohlendioxid über die hydrophobe gasdurchlässige Membran zu kompensieren. Diese Kombination zweier Kompartimente für Kohlenstoffvorratsmedien ermöglicht durch das erste Kohlendioxid liefernde Kohlenstoffspeichermedium eine hohe Pufferkapazität und große Speicherkapazität für anorganische Kohlenstoffverbindungen im Photobioreaktor. Das zellfreie zweite Kohlenstoffvorratsmedium, welches mit dem Photosynthesemedium über eine hydrophile Porenmembran im Austausch steht, ermöglicht die Abtrennung der löslichen Photosyntheseprodukte von den Zellen und verbessert die Substratverteilung in der Photosyntheseschicht. Weitere Einzelheiten und Vorteile dieser Ausführungsform des Photobioreaktors sind der Beschreibung des Verfahrens zu entnehmen.
Die Verwendung von Membranbegrenzungen ermöglichen die aufrechte Anordnung einer oder mehrerer Photosyntheseschichten und einer oder mehrerer Schichten des Kohlenstoffvorratsmediums in verschiedenen geometrischen Ausführungsformen, beispielsweise in Form paralleler oder konzentrischer Photosyntheseschichten zwischen Schichten des Kohlenstoff-Vorratsmediums oder mehrerer Kohlenstoff -Vorratsmedien. Dies ist vorteilhaft, weil durch das zellfreie Kohlenstoffvorratsmedium von oben oder von der Seite in den Photobioreaktor einfallende Licht tief in den Raum des Photobioreaktors eingeleitet und durch Streuung, Reflexion und Brechung auf der Fläche der aufrechten Photosyntheseschicht(en) verteilt werden kann. Hierdurch können - bezogen auf die belichtete Fläche der Photosyntheseschichten und bezogen auf das Volumen des Photobioreaktors - mit geringem technischem Aufwand hohe Photosyntheseraten erreicht werden. Die aufrechten Photosyntheseschichten können sich in einem zylindrisch geformten Bioreaktor in den Lücken zwischen mehreren zueinander benachbart aufrecht angeordnete Membranschläuchen befinden, die mit dem/den Kohlenstoffvorratsmedium gefüllt sind. Aus geometrischen Gründen beträgt bei dieser Ausführungsform der Anteil der Photosyntheseschichten am Querschnitt des Photobioreaktors nur 25 bis 30 %. Ein höherer Volumenanteil der Photosyntheseschichten im Photobioreaktor lässt sich in Ausführungsformen mit aufrechten, flächig ausgedehnten, membranbegrenzten Schichten mit paralleler, konzentrischer oder spiraliger Anordnung erreichen, wie den Abbildungen 3 und 6 zu entnehmen ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Photobioreaktors werden die flexiblen licht- und substratdurchlässigen Membranen, welche die Photosyntheseschicht von zellfreien Schichten des Vorratsmediums trennen, in Form einer oder mehrerer flächig ausgedehnter Taschen eingesetzt, wobei die Stärke der Schichten des zellfreien Mediums und/oder der Photosyntheseschicht durch Abstandshalter festgelegt werden kann, wie in den Figuren 1 B und 3 dargestellt ist. Als Abstandshalter eignen sich beispielsweise feste Strukturen, welche die Ausdehnung mindestens einer Flüssigkeitsschicht zwischen zwei flexiblen Membranen begrenzen können, z.B. Gitter, Geflechte, Profilfolien und dergleichen.
Besonders vorteilhafte Abstandshalter sind in Form einer Profilfolie mit elastisch komprimierbarem falten- oder wellenartigem Profil gestaltet. Wird eine solche, in einer Flächenausdehnung elastisch komprimierte, Profilfolie in eine passende Membrantasche eingeführt, verhindert die hierdurch erzeugte Membranspannung die Ausdehnung der flexiblen Membran quer zu Flächenausdehnung und erzeugt parallele vertikale oder horizontale Kompartimente. Eine schematische Darstellung der Anwendung einer Profilfolie in einer taschenförmigen Membranbegrenzung der Photosyntheseschicht ist der Figur 3 zu entnehmen. Besteht die Profilfolie aus einem lichtdurchlässigen oder Licht reflektierenden Material wie Acrylglas bzw. Edelstahl, kann sie zur Verbesserung der Lichtverteilung auf die Photosyntheseschicht bzw. in der Photosyntheseschicht beitragen. Bei horizontaler Position der Falten kann die Sedimentation der Zellen begrenzt werden. Das faltenartige Profil kann außerdem zur Gestaltung von parallelen horizontalen oder vertikalen Fließbahnen in der/den membranbegrenzten Photosyntheseschicht/en und/oder in der/den Schichten des zellfreien Mediums genutzt werden.
Gemäß einer vorteilhafterweise materialsparenden Ausführungsform wird die Dicke der Photosyntheseschicht oder einer Schicht des Kohlenstoffvorratsmediums zwischen zwei einander gegenüberliegenden Membranen durch streifenförmige oder punktförmige Membranverbindungen begrenzt. Dies ist schematisch in den Figuren 4 und 5 dargestellt. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht u.a. darin, dass der Kosten- und Materialaufwand für die Herstellung einer membranbegrenzten Photosyntheseschicht gering ist. Die streifenförmige Verbindung zwischen den Membranflächen kann dabei vorzugsweise so gestaltet werden, dass eine einzige mäandrierende Fließbahn auf der Membranfläche vorliegt. Befindet sich die Photosyntheseschicht in so hergestellten Kanälen auf einer Membranfläche, so ermöglicht dies die kontinuierliche oder diskontinuierliche Einführung einer verdünnten Suspension in die belichtete Photosyntheseschicht und die Entnahme von Biomasse aus der Photosyntheseschicht. Ebenso sind die Zuführung des Vorratsmediums und die Trennung der Photosyntheseprodukte von den Zellen möglich. Bei horizontaler Position der Kanäle wird bei dieser Ausführungsform die Sedimentation der Zellen begrenzt. In ihnen kann ferner das Kohlenstoffvorratsmedium kontinuierlich an einer stationären Photosyntheseschicht entlang strömen, wobei sich permeable Photosyntheseprodukte in ihm anreichern. Die Suspension der photoautotrophen Zellen an einer stationären Schicht des Vorratsmediums kann auf einer Fließbahn zwischen den streifenförmigen Membranverbindungen bewegt werden, um die gebildete Biomasse kontinuierlich zu ernten.
Gemäß einer weiteren, vorteilhafterweise einfach und robust ausführbaren Ausführungsform des Photobioreaktors werden durch die Außenbegrenzung nur eine flächig ausgedehnte Photosyntheseschicht und ein darüber liegender Gasraum eingeschlossen. Letzterer steht mit der Gasableitung in Verbindung. Die Außenbegrenzung, beispielsweise eine lichtdurchlässige, weitgehend gasundurchlässige Kunststoff-Folie, ist in ihrer Flächenausdehnung der Photosyntheseschicht angepasst. Der Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass der Photobioreaktor auf einer Wasseroberfläche schwimmend belichtet werden kann, wie in Figur 2 schematisch gezeigt. Die Gasableitung kann bei dieser Ausführungsform als Gasableitungsrohr, das unter die Wasseroberfläche führt, diffusionshemmend gestaltet werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Photobioreaktors mit aufrechten Photosyntheseschichten ist eine Pumpvorrichtung vorgesehen, welche die Sedimentation der Zellen dadurch verhindert, dass die Suspension durch oszillierende oder zirkulierende Strömung in Bewegung gehalten wird. Vorzugsweise werden hierbei mehrere aufrecht und parallel zueinander angeordnete Photosyntheseschichten hydraulisch miteinander verbunden. Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorgeschlagenen Photosyntheseschicht befindet sich im ersten Kompartiment eine mindestens teilweise offenporige Matrix, die beim Einsaugen von Wasser oder wässriger Flüssigphasen ein Dreiphasensystem aus einer lichtdurchlässigen Festphase, einer fein verteilten Gasphase und einer wässrigen Flüssigkeit ausbildet. Wird die Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen in diese Matrix eingesaugt, bildet sich eine Photosyntheseschicht aus, in der die photoautotrophen Mikroorganismen von einer feinverteilten Gasphase und einer feinverteilten Flüssigphase umgeben sind. Das lichtdurchlässige und lichtstreuende Dreiphasensystem begünstigt die Diffusion von Kohlendioxid über die Gasphase und ermöglicht die Diffusion von Hydrogencarbonationen und anderen wasserlöslichen Stoffen in der Flüssigphase. Gleichzeitig wird die Eindringtiefe des Lichtes in die Photosyntheseschicht erhöht.
Eine beispielhafte Ausführungsform des Dreiphasensystems besteht in offenporigem, elastischem und transparentem Schaumstoff, dessen Poren teilweise mit dem Photosynthesemedium und teilweise mit Luft gesättigt sind. Hierfür haben sich Folien aus unterschiedlichen Elastomeren wie Latex und Polyurethan als besonders geeignet erwiesen. Sehr gut geeignet für Herstellung der Photosyntheseschicht in dieser Ausführungsform sind Folien aus offenporigem, lichtdurchlässigem und hydrophilem Polyurethanschaum. Der Einsatz einer solchen Folie in der Photosyntheseschicht ist in horizontaler Lage in Figur 2 und in aufrechter Position in Figur 6 dargestellt. Wird in diese Folien die Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen eingesaugt, entsteht, beispielsweise durch Einschluss von Gas und/oder durch Photosynthese im offenporigen Teil des Schaumstoffs, ein Dreiphasensystem mit einer fein verteilten Gasphase. Die Stärke der Photosyntheseschicht wird durch die Dicke der Schaumstoff-Folie vorgegeben, in deren Kapillarräumen die Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen absorbiert ist. In einer Photosyntheseschicht aus diesem Material wurden unter Verwendung verschiedener Ausführungsformen des vorgeschlagenen Photobioreaktors hohe Biomassekonzentrationen durch Photosynthese erreicht. Die Elastizität und mechanische Belastbarkeit des genannten Materials ermöglicht vorteilhafte Verfahren der Entnahme von Biomasse und der Zuführung neuen Mediums durch Nutzung einer angepassten Vorrichtung zur Druckbelastung der Photosyntheseschicht, z.B. mit Hilfe einer Presse, einer Walze oder eines Schlitzes oder durch die Druckausübung auf die lichtdurchlässige Membran mit Hilfe des Kohlenstoff- Vorratsmediums. Die Photosyntheseschicht kann auch während einer Dunkelzeit ohne eine gesonderte Belüftung mit Sauerstoff versorgt werden, da die fein verteilte Gasphase während einer Belichtungsphase Sauerstoff speichert. In dieser Ausführungsform können Photosyntheseschichten eingesetzt werden, die von einer als Kohlenstoffvorratsmedium dienenden Kohlendioxid-enthaltenden Gasphase begrenzt sind, wobei das Kohlendioxid über eine gasdurchlässige Membran geliefert wird. Hierdurch wird der Vorrat an Sauerstoff für eine Dunkelphase vergrößert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält der Photobioreaktor eine elastische Schaumstoff-Folie im ersten Kompartiment und Vorrichtungen zum Abpressen und Ableiten der Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Kultivierung von photoautotrophen Mikroorganismen bereitgestellt. Das Verfahren umfasst das Bereitstellen einer ein Photosynthesemedium und darin suspendierte photoautotrophe Mikroorganismen enthaltenden Schicht in einem abgeschlossenen Aufnahmeraum, wobei das Photosynthesemedium Hydrogencarbonat in einer Konzentration größer als 20 mM enthält; und das Belichten der photoautotrophen Mikroorganismen im Photosynthesemedium ohne das Verwirbeln oder Durchleiten eines Gases im Photosynthesemedium unter Begrenzung des diffusiven Gasaustausches des Aufnahmeraumes mit der Umgebung. Gemäß einer Ausführungsform erfolgt weiterhin das Liefern von mindestens einem Photosynthesesubstrat ausgewählt aus der Gruppe umfassend Kohlendioxid und Hydrogencarbonat an das Photosynthesemedium aus mindestens einem Kohlenstoffvorratsmedium über eine lichtdurchlässige Membran, die für das Photosynthesesubstrat durchlässig ist. Im Folgenden werden einzelne vorteilhafte Ausführungsformen beschrieben und in Figuren dargestellt.
Es zeigen:
Figur 1 zwei Photobioreaktoren mit den für das Verfahren wesentlichen Komponenten im Querschnitt; Figur 2 den Querschnitt eines Photobioreaktors mit flexibler Außenbegrenzung und flach liegender Photosyntheseschicht;
Figur 3 das Übersichtsbild eines Photobioreaktors mit drei aufrecht angeordneten membranbegrenzten Photosyntheseschichten; Figur 4 die Ansicht eines durch Verklebung zweier Polypropylenmembranen gebildeten und durch Überdruck gespannten Behälters für das Kohlenstoffvorratsmedium;
Figur 5 die perspektivische Ansicht einer mäandrierenden Fließ-Bahn zwischen zwei verschweißten oder verklebten Membranen;
Figur 6 die konzentrische Anordnung einer Photosyntheseschicht und zweier membranbegrenzter Vorratsmedien; und
Figur 7 eine Ausführungsform eines Photobioreaktors mit mehreren aufrechten
Photosyntheseschichten zwischen membranbegrenzten Kohlenstoff-
Vorratsmedien.
Figur 1 zeigt wesentliche Komponenten eines Photobioreaktors zur Durchführung des vorgeschlagenen Verfahrens am Beispiel von zwei Ausführungsformen. Fig. 1A: Der Photobioreaktor weist eine lichtdurchlässige diffusionshemmende Außenbegrenzung 1 auf. Die Photosyntheseschicht 2 ist horizontal angeordnet und im Querschnitt senkrecht zur Grundfläche dargestellt. Sie kann von oben belichtet werden. Über der Photosyntheseschicht befindet sich eine Gasphase. Fig. 1 B: Ein Photobioreaktor mit einer aufrechten Photosyntheseschicht ist in einem Querschnitt parallel zur Grundfläche dargestellt. Die Photosyntheseschicht ist in eine dünne Tasche der substratdurchlässigen Membran 3 eingeschlossen. Ihre Dicke wird durch einen Abstandshalter 6 in Form eines Kunststoff- Gitters gestaltet. Die Tasche befindet sich im flüssigen Kohlenstoff-Vorratsmedium. Im oberen Teil des Photobioreaktors befindet sich über den Photosyntheseschichten ein Gasraum (nicht dargestellt). In beiden Varianten enthält die Außenbegrenzung des Photobioreaktors mikroskopische hydrophobe Poren, welche den durch Sauerstoffbildung verursachten Überdruck begrenzen. Ihr Flächenanteil ist so gering, dass der Gasvolumenfluss aus dem Photobioreaktor durch die Außenbegrenzung überwiegend als laminare Gasströmung erfolgt.
Figur 2 zeigt im Querschnitt einen Photobioreaktor mit einer Photosyntheseschicht 2, bei der die Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen und eine fein verteilte Gasphase sich in den Kapillarräumen einer elastischen Schaumstoff-Folie 7 befinden. Die gasdichte Außenbegrenzung 1 des Photobioreaktors ist eine Tasche aus einer lichtdurchlässigen Silikongummi-Membran. In der Tasche befinden sich eine PVC-Platte und eine flächig ausgebreitete Folie aus hydrophilem, teilweise offenporigem Polyurethan-Schaumstoff 7. In den Kapillarräumen dieser Folie befinden sich die Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen oder eingeschlossenes Gas mit etwa gleichen Volumenanteilen. Ein PVC- Rohr dient als konvektive Gasableitung 5, die unter die Wasseroberfläche führt. Der Vorrat an Photosynthesesubstrat befindet sich im Photosynthesemedium in Form einer hohen Konzentration an Hydrogencarbonat- und Carbonationen.
Figur 3 zeigt in einer Aufsicht A und einer perspektivischen Seitenansicht B einen Photobioreaktor mit taschenförmigen substratdurchlässigen Membranen und lichtreflektierenden sowie lichtdurchlässigen Profilfolien, welche die Schichtdicke der aufrechten Photosyntheseschicht 2 bestimmen. Gezeigt ist die Anordnung zweier taschenförmiger Membranen, die zwei zellfreie Kohlenstoff-Vorratsmedien von drei Photosyntheseschichten 2 mit der Suspension der photoautotrophen Mikroorganismen trennen. Eines der Kohlenstoff-Vorratsmedien 4a besitzt die gleiche Zusammensetzung wie das Photosynthesemedium in der Photosyntheseschicht. Die angrenzende substratdurchlässige Membran 3a besteht aus hydrophilem porösem Nylon ® mit einer Maschenweite von 1 μηη. Das andere zellfreien Medium 4b ist ein Puffer aus Kaliumhydrogencarbonat und Kaliumcarbonat mit einer Gesamtkonzentration von 3 M. Die angrenzende substratdurchlässige Membran 3b besteht aus Polypropylen und ist 15 μηη stark. Beide Membrantaschen enthalten als Abstandshalter 6 eine elastisch in Richtung der Flächenausdehnung der Membranen komprimierte formgebende Profilfolie aus Acrylglas mit wellenförmigem Profil. Das schräg von oben eintretende Licht wird an der Profilfolie sowie an Gasbläschen, die an den Membranoberflächen haften, reflektiert, wodurch eine gute Lichtverteilung in die Tiefe des Raumes des Photobioreaktors gewährleistet wird. Die drei Photosyntheseschichten 2 sind fluidisch miteinander verbunden. Nahe der Grundplatte befindet sich in der äußeren Wand des Photobioreaktors eine elastische Membran (nicht dargestellt), an der durch einen Vibrator von außen eine oszillierende vertikale Strömung in der Photosyntheseschicht erzeugt werden kann.
Figur 4 zeigt eine substratdurchlässige Membran 3 mit punktförmigen Verschweißungen. Als substratdurchlässige Membran dient eine dünne, gasdurchlässige Polypropylenmembran. Ein derartiges Membransystem kann durch den Kohlendioxidpartialdruck eines flüssigen Kohlenstoffvorratsmedium oder den Druck eines Kohlendioxid enthaltenden Gasgemisches gespannt werden und in aufrechter Position in einem Photobioreaktor zur Dickenbegrenzung und Substratversorgung einer Photosyntheseschicht eingesetzt werden. Figur 5 zeigt schematisch einen mäanderförmigen Fließkanal, der durch streifenförmiges Verschweißen zweier aufeinander gelegter substratdurchlässiger Membranen 3 gebildet ist. Derartige membranbegrenzte Kanäle können vorteilhaft für die Begrenzung und die laminare Strömung eines Kohlenstoffvorratsmediums oder einer Photosyntheseschicht eingesetzt werden.
Die in Figur 6 an Hand einer Aufsicht A und einer perspektivischen Seitenansicht B dargestellte Ausführungsform zeigt eine konzentrische Anordnung einer Photosyntheseschicht 2 und zweier unterschiedlicher Kohlenstoffvorratsmedien 4a und 4b. Die Kohlenstoffvorratsmedien 4a und 4b liegen an der Innenseite und an der Außenseite der Photosyntheseschicht 2 und sind durch jeweils unterschiedliche substratdurchlässige Membranen 3a und 3b von der Photosyntheseschicht 2 getrennt. In die Photosyntheseschicht 2 ist eine elastische Schaumstoff-Folie 7 aus Polyurethan integriert. Das im Zentrum befindliche Kohlenstoffvorratsmedium 4a ist ein Kaliumhydrogencarbonat Carbonatpuffer mit einer anfänglichen Gesamtkonzentration der anorganischen Kohlenstoffverbindungen von 3 M und einem anfänglichen Kohlendioxidpartialdruck von 3.2 kPa. Es füllt einen Schlauch, der aus einer dünnen, gasdurchlässigen Polypropylen- oder Polyethylenmembran gebildet ist und oben mit einem lichtdurchlässigen Stopfen hermetisch abgeschlossen ist. Hierdurch entsteht ein leichter Überdruck in dem Schlauch, der dessen zylindrische Form stabilisiert. Das peripher angeordnete zweite Kohlenstoffvorratsmedium 4b tauscht über eine hydrophile poröse Membran 3b Ionen mit der Photosyntheseschicht aus und entspricht in seiner Zusammensetzung dem Photosynthesemedium.
Die in Figur 7 A in der Aufsicht und in Figur 7B in einer perspektivischen Seitenansicht dargestellte Ausführungsform zeigt einen Photobioreaktor mit zylindrischer gasdichter Außenbegrenzung 1 mit mehreren aufrechten Photosyntheseschichten 2, die fluidisch miteinander verbunden sind und sich zwischen Membranschläuchen, die mit einem flüssigen Kohlenstoff-Vorratsmedien 4 gefüllt sind, befinden. Das Kohlenstoffvorratsmedium ist ein Hydrogencarbonat-/Carbonatpuffer mit einer Konzentration von 3 M und einem anfänglichen Kohlendioxidpartialdruck von 3,2 kPa. Das Kohlenstoffvorratsmedium füllt Schläuche aus einer dünnen, gasdurchlässigen Polyethylen- oder Polypropylenmembran aus, die oben mit einem lichtdurchlässigen Verschluss aus Acrylglas (nicht dargestellt) gasdicht verschlossen sind. Der Photobioreaktor umfasst einen über diesen Schläuchen und Photosyntheseschichten angeordneten einen Gasraum. Der Gasraum ist durch eine Gasableitung in Form eines Kapillarschlauches aus Polypropylen mit der Atmosphäre verbunden.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1 In diesem Beispiel wird die Kultur des Cyanobakteriums Sychenocystis sp. PCC 6803 in einer 4 mm dicken Photosyntheseschicht beschrieben. Die wesentlichen Komponenten des verwendeten einfachen Photobioreaktors sind der Figur 1A zu entnehmen.
Als Photobioreaktor diente eine sterile Gewebekulturflasche aus Acrylglas mit einem Innenvolumen von 500 ml mit einer Grundfläche von 200 cm2, in die 50 ml einer Suspension des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 in einem Photosynthesemedium eingefüllt wurden, so dass eine 4 mm starke Photosyntheseschicht mit einer anfänglichen Biomassekonzentration von 0,3 g Trockenmasse pro L entstand. Das Photosynthesemedium enthielt die Komponenten eines mineralischen Standardmediums für die Kultur von Cyanobakterien (BG-1 1 -Medium nach Schlösser, U. G. Bot. Acta 107, 178 pp, 1994) und zusätzlich zur Vermeidung von Phosphormangel Dinatnumhydrogenphosphat in einer Konzentration von 1 mM sowie zur Gewährleistung der Photosynthese während der Betriebszeit Kaliumhydrogencarbonat in einer Konzentration von 200 mM. Die schräg nach oben führende Einfüllöffnung des Gefäßes wurde nach Entfernen des gasdurchlässigen Original-Schraubverschlusses mit einem durchbohrten Silikongummistopfen verschlossen. Durch den Silikongummistopfen wurde ein elastischer Silikongummischlauch mit einem Durchmesser von 1 mm hindurchgeführt. Der Schlauch führte durch eine Diffusionssperre in Form einer wassergefüllten Blasensäule. Der Silikongummistopfen mit der gesamten Gasableitung sowie die Diffusionssperre wurden vor dem Verschluss der Öffnung der Gewebekulturflasche autoklaviert. Der so beschriebene Photobioreaktor wurde in einer Phytokammer dem Dauerlicht von Leuchtstoffröhren mit einer Photonenflussrate von 60 μηηοΙ m"2s"1 ausgesetzt. In Abständen von 24 h wurden dem Photobioreaktor 30 ml der Suspension entnommen und durch 30 ml des frischen Kohlenstoff-Vorratsmediums ersetzt. Im Laufe einer Woche kam es zu einer Zunahme der Biomassekonzentration vor der täglichen Verdünnung auf einen Wert von 0,5 bis 0,6 g Trockenmasse pro Liter. Dies zeigt, dass durch Nutzung des verwendeten Kohlenstoffvorratsmediums die untersuchten Cyanobakterien eine Wachstumsrate weit über 1 d"1 aufrechterhielten. Beispiel 2 In diesem Beispiel wird ein Photobioreaktor mit horizontal ausgebreiteter Photosyntheseschicht und Gasableitung beschrieben, wobei die Photosyntheseschicht als Dreiphasensystem mit einer feinverteilten Gasphase ausgebildet ist. Figur 2 zeigt einen Querschnitt durch den Photobioreaktor in der Position der Gasableitung. An eine 8 mm starke, 50 mm breite und 200 mm lange Platte aus Polyvinylchlorid (PVC) wurde mit Silikonklebstoff eine ebenso große Folie aus transparentem hydrophilen, elastischen und teilweise offenporigen 4 mm dicken Schicht aus Polyurethan-Schaumstoff befestigt. In der Mitte der Platte wird durch die Platte und den Schaumstoff eine Bohrung von 5 mm Durchmesser geführt. In die Bohrung wurde ein passender Silikonschlauch eingeklebt, durch den ein 2 cm langes Rohr aus PVC mit einem Innendurchmesser von 2 mm dichtend und verschiebbar eingepasst wurde. Das PVC-Rohr diente als Gasableitung. Zur Herstellung des Photobioreaktors wurde die Platte mit der Schaumstoff-Folie in eine passende, zunächst an einer Seite offene, Membrantasche eingebracht. Die Tasche besteht aus einer lichtdurchlässigen, weitgehend gasdichten, flexiblen Membran aus Silikongummi mit einer Stärke von 0,3 mm. An der Position der Bohrung durch die PVC-Platte wurde durch die Silikongummi-Folie eine runde Öffnung mit einem Durchmesser von 4 mm ausgestanzt. An der Stelle der Öffnung wurde die Silikongummifolie mit Hilfe von Silikonkleber dichtend mit der PVC-Platte verbunden. Durch die Öffnung wurde die bereits beschriebene Gasableitung so hineingeschoben, dass das obere Ende mit der seitlichen Öffnung 5 mm über der Schaumstoff-Folie lag. Die Tasche mit dem Inhalt wurde durch Autoklavieren keimfrei gemacht. In die Tasche mit der Schaumstoff-Folie wurden 30 ml einer Suspension von Synechocystis sp. PCC 6803 mit einer Trockenmassekonzentration von 0,1 g L"1 eingefüllt. Die Suspension wurde in der Schaumstoff-Folie durch leichten Druck auf die Silikonmembran verteilt. Das verwendete Photosynthesemedium hatte die in Beispiel 1 beschriebene Zusammensetzung. Die offene Seite der Folientasche wurde mit einer Klammer verschlossen. Der so gebildete Photobioreaktor wurde zur Wärmeableitung auf eine Wasseroberfläche aufgelegt. Bei Dauerlicht einer Quantenflussdichte von 80 μηηοΙ m"2 s" 1 wurde in diesem Photobioreaktor bei einer mittleren Biomassekonzentration von 0,8 g Trockenmasse pro Liter noch eine Wachstumsrate von 0,8 d"1 erreicht. Der dargestellte Photobioreaktor eignete sich zur semikontinuierlichen Biomasseproduktion. Zur Ernte von Biomasse wurde die Gasableitung herausgenommen und durch einen passenden Stopfen ersetzt. Nach Entfernen der Klammer wurde die Hälfte der Suspension abgepresst und durch frisches Kohlenstoffvorratsmedium ersetzt. Diese Art der Ernte wurde in Abständen von 2 d wiederholt. Nach einigen Zyklen war die Biomassekonzentration bei der Ernte auf 1 bis 2 g Trockenmasse pro Liter angestiegen.
Beispiel 3 Das Beispiel erläutert eine Ausführungsform des vorgeschlagenen Photobioreaktors mit fester Außenbegrenzung, bei dem eine horizontale Photosyntheseschicht durch eine gasdurchlässige hydrophobe Membran aus Polyethylen begrenzt und durch Diffusion des Kohlendioxid aus einem Kohlenstoffvorratsmedium durch eine gasdurchlässige Membran mit Kohlendioxid versorgt wird. Durch streifenförmiges Verschweißen der gegenüberliegenden Membranseiten einer Folientasche aus 20 μηη dickem Polyethylen entstand eine mäandrierende Fließbahn auf der Fläche der Tasche, wie in Figur 5 gezeigt. In die beiden Enden der Fließbahn wurden konische Befüllstutzen eingeschweißt, die durch Einstecken eines konischen Silikongummistopfens verschlossen werden können. Die Fließbahn wurde mit einer Suspension von Cyanobakterien gefüllt. Es wurde das bereits in Beispiel 1 beschriebene Medium verwendet. Die so entstandene membranbegrenzte Photosyntheseschicht wurde auf eine flache Schale gelegt, in der sich ein zellfreies unphysiologisches Kohlenstoffvorratsmedium in Form einer Mischung aus 3 M Kaliumhydrogencarbonat und 3 M Kaliumcarbonat (4:1 , v/v) befand. Die Schale wurde mit einem durchbohrten, am Rand gefetteten Glasdeckel verschlossen, um eine weitgehend gasdichte Außenbegrenzung zu erreichen. In die Bohrung wurde eine Stahlkanüle mit einem Durchmesser von 0,3 mm und einer Länge von 80 mm als Gasableitung eingeklebt, um die weitgehend konvektive Gasableitung zu ermöglichen. Die Schale wurde auf Wasser schwimmend ununterbrochen mit Fluoreszenzlicht einer Intensität von 60 μηηοΙ m"2 s"1 bei 25°C belichtet. Auf Grund der Photosynthese kam es in der Photosyntheseschicht zur Bildung von Sauerstoffblasen, an denen das einfallende Licht zusätzlich gestreut wurde. Die Suspension in der Photosyntheseschicht erreichte bereits nach drei bis vier Tagen eine Biomassekonzentration von ca. 5 g Trockenmasse pro Liter.
Beispiel 4 Der in diesem Beispiel erläuterte Photobioreaktor ist schematisch in Figur 6 abgebildet. Er besitzt eine hydraulisch verbundene aufrechte Photosyntheseschicht, die über substratdurchlässige Membranen im Austausch mit zwei verschiedenen Kohlenstoffvorratsmedien steht. Eines der Kohlenstoffvorratsmedien enthält Kaliumhydrogencarbonat und Kaliumcarbonat in der toxisch wirkenden Konzentration von 3 M. Das andere Kohlenstoffvorratsmedium ist weitgehend identisch mit dem Photosynthesemedium, dessen Zusammensetzung in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Kohlenstoffvorratsmedien und die Photosyntheseschicht sind, wie in Figur 6 gezeigt, konzentrisch zueinander angeordnet. Eine in diesem Kohlenstoffvorratsmedium wachsende Schüttelkultur des Cyanobakteriums Synechocystis sp. PCC 6803 wurde für die Herstellung des Inokulums auf eine Biomassekonzentration von 1 g Trockenmasse pro L mit dem Kohlenstoffvorratsmedium verdünnt. Ein Dialyseschlauch aus regenerierter Zellulose (Union Carbide, Chicago, USA, Länge 25 mm, Durchmesser im gequollenen Zustand 31 mm) wurde unten verschlossen und in Wasser gequollen. In den Dialyseschlauch wurde ein passender Zuschnitt einer 6 mm dicken Folie aus elastischem, transparentem offenporigem und hydrophilem Polyurethan- Schaumstoff hineingeschoben. Der Schaumstoff bedeckte einschichtig die Innenseite der Dialysemembran bis zu einer Höhe von 17 cm. Mit Hilfe eines Glasstabes wurde in den verbleibenden Hohlraum ein unten verschlossener Folienschlauch aus einer 50 μηι dicken Polyethylenfolie (Schlauchfolie Haaga GmbH, Heringsdorf) mit einem Durchmesser von 19 mm und einer Länge von 25 cm eingeführt. Der Polyethylenschlauch wurde mit einer Mischung aus vier Teilen einer 3 M Kaliumhydrogencarbonatlösung und einem Teil einer 3 M Kaliumcarbonatlösung bis zu einer Füllhöhe von 18 cm gefüllt und am Ende mit einem lichtdurchlässigen Acrylglasstopfen dicht verschlossen. Nun wurde eine Menge von 80 ml der Suspension der Cyanobakterien auf die Schaumstofffolie zwischen der Polyethylenmembran und der Dialysemembran gegeben. Diese Suspension wurde von der Schaumstoffmatrix absorbiert, wobei ein Dreiphasensystem mit feinverteilter Gasphase in der Photosyntheseschicht entstand. Der Dialyseschlauch mit dem zentralen Kohlenstoffvorratsmedium und der außen liegenden Photosyntheseschicht wurde in ein zylindrisches Gefäß mit einem Durchmesser von 6 cm und einer Höhe von 20 cm gestellt. Letzteres wurde bis zu einer Füllhöhe von 19 cm mit dem oben charakterisierten physiologischen Kohlenstoffvorratsmedium gefüllt. Die Photosyntheseschicht stand über die Dialysemembran im Austausch mit dem nicht toxischen Kohlenstoffvorratsmedium und wurde außerdem über die Polyethylenmembran mit Kohlendioxid durch das erste Kohlenstoffvorratsmedium versorgt. Der Dialyseschlauch war oben offen und ragte mit der Öffnung in einen Gasraum unterhalb des Deckels des zylindrischen Gefäßes. Der Deckel wurde mit einer Klemme und Gummidichtung gasdicht an das Gefäß angedrückt. Durch den Deckel wurde eine Gasableitung in Form eines 200 mm langen Kapillarschlauches mit 0,2 mm Innendurchmesser hindurchgeführt. Der so entstandene Photobioreaktor wurde auf einer reflektierenden Unterlage von oben mit Fluoreszenzlampen 16 h lang täglich mit einer Quantenflussdichte von 80 μηιοΙ m"2 s1 belichtet. Bereits nach einem Tag ließ sich visuell eine starke Zunahme der Pigmentkonzentration feststellen. Die Sauerstoffkonzentration im physiologischen Kohlenstoffvorratsmedium stieg auf über 300 % des Luftsättigungswertes. Der hohe Gehalt an feinen Gasblasen in der Photosyntheseschicht und die hohe Konzentration der Hydrogencarbonationen bewirkte einen schnellen Austausch von Kohlendioxid und Sauerstoff zwischen den Vorratsmedien und dieser Schicht. Die Speicherung der genannten Gase in den Vorratsmedien verhinderte selbst bei einer hohen Biomassekonzentration in der Photosyntheseschicht Anaerobiose in der Nacht und Kohlendioxid-Limitation am Tage. Die nach 12 Tagen aus der Photosyntheseschicht abgepresste Zellsuspension hatte eine Biomassekonzentration von 10 bis 12 g Trockenmasse/L. Die Photosyntheseschicht blieb im Verlauf von vier Wochen vital und bildete während der Lichtperioden mit hoher Intensität Sauerstoff, was sich in einem schnellen Anstieg der Sauerstoffkonzentration zu Beginn der Belichtungszeit äußerte.
Beispiel 5 Das Beispiel betrifft eine Variante des vorgeschlagenen Photobioreaktors mit mehreren aufrechten Photosyntheseschichten. Sie befinden sich zwischen aufrecht angeordneten Schläuchen aus einer dünnen Polyethylenfolie, die das Kohlenstoffvorratsmedium einschließen, wie in Figur 7 gezeigt ist. Die Sedimentation der Zellen in den Photosyntheseschichten wird durch oszillierende Strömung in den Photosyntheseschichten verhindert. Der Photobioreaktor besaß 7 zylindrische, mit einer Mischung aus 3 M Kaliumhydrogencarbonat und 3 M Kaliumcarbonat (4:1 , v/v) gefüllte und unten verschlossene Schläuche aus gas- und lichtdurchlässiger Polyethylenfolie (50 μηη Membranstärke, Durchmesser 19 mm, Länge 20 cm, Schlauchfolie Haaga GmbH, Heringsdorf), die oben jeweils mit lichtdurchlässigen Plexiglas-Stopfen verschlossen waren. Die Schläuche standen in dichter Packung in einem passenden zylindrischen Glasgefäß, über dessen Boden in 1 cm Höhe ein Gitter aus Polypropylen befestigt war. Zwischen den Schläuchen enthielt der Photobioreaktor Photosyntheseschichten, die durch eine Suspension der Grünalge Pseudokirchneriella subcapitata in einem Photosynthesemedium gebildet wurden. Das Photosynthesemedium war ein Mineralmedium nach Kühl und Lorenzen (Kühl und Lorenzen, in: Prescott, D M (Ed.): Methods in Cell Physiology, pp. 152- 87, Academic Press, New York 1964), dem Natriumhydrogencarbonat in einer Konzentration von 30 mM hinzugesetzt wurde. Unter dem Gitter befand sich eine nach außen abgeschlossene luftgefüllte Tasche aus dünnem, elastischem Silikongummi. Sie war mit einem Silikonschlauch verbunden, der durch eine Bohrung in der Glaswand nach außen führte und in der Bohrung gedichtet war. Der Schlauch war mit einer 10 ml-Glasspritze verbunden, deren Kolben durch exzentrische Kopplung an einen Rotor Gasdruckschwankungen mit einer Frequenz von 10 min"1 erzeugt wurden. Hierdurch wurde eine oszillierende vertikale Strömung in den aufrechten Photosyntheseschichten zwischen den Membranschläuchen erzeugt. Der als Kohlenstoffvorratsmedium in den Polyethylenschläuchen eingesetzte 3 M Kaliumhydrogencarbonat-Puffer besaß einen anfänglichen Kohlendioxid Partialdruck von 3,2 kPa. Das Gefäß war mit einem dicht schließenden Deckel mit Gasableitung, wie in Beispiel 5, versehen und wurde in einer Phytokammer bei 20°C von oben mit Fluoreszenzlampen für die Pflanzenanzucht mit einer Intensität von 120 μηιοΙ m"2 s"1 ununterbrochen belichtet. Die Suspension besaß zu Beginn der Kultur eine Biomassekonzentration von 0,5 g Trockenmasse pro Liter. Nach vier Tagen betrug die Biomassekonzentration etwa 3 g/L. Erst danach nahm die Wachstumsrate auf Grund der Lichtlimitation merklich ab. In Kontrollversuchen mit geschüttelten Kulturen, bei denen der Kohlenstoffmangel durch ein membranbegrenztes Kohledioxidreservoir nach DE 102008029169 A1 verhindert wurde, ergab sich in der gleichen Zeit bei gleicher Belichtung eine weit geringere Biomassekonzentration (etwa 1 ,2 g Trockenmasse pro Liter). Die höhere Wachstumsrate im beschriebenen Photobioreaktor erklärt sich aus der besseren Lichtverteilung mit Hilfe des aufrechten Membranschlauches und die wesentlich geringere Schichtdicke. Die Abgabe von Streulicht in die Photosyntheseschicht wurde dadurch gefördert, dass sich an der aufrechten Polyethylenmembran kleine Gasblasen befanden.
Bezugszeichen
1 diffusionshemmende Außenbegrenzung des abgeschlossenen Aufnahmeraumes
2 Photosyntheseschicht
3 substratdurchlässige Membran
4 Kohlenstoff-Vorratsmedium
5 konvektive Gasableitung
6 Abstandshalter
7 Polyurethan-Schaumstoff-Folie
Referenzliste:
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DE 102008029169 A1

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Kultivierung von photoautotrophen Mikroorganismen, umfassend:
Bereitstellen einer ein Photosynthesemedium und darin suspendierte photoautotrophe Mikroorganismen enthaltenden Photosyntheseschicht (2) in einem abgeschlossenen Aufnahmeraum mit einer gasdiffusionshemmenden Außenbegrenzung (1 ), wobei die Photosyntheseschicht (2) eine mittlere Dicke von nicht mehr als 10 mm aufweist und wobei in dem Photosynthesemedium zur Aufrechterhaltung einer hohen Photosyntheserate der photoautotrophen Mikroorganismen eine Hydrogencarbonatkonzentration von mindestens 10 mM aufrechterhalten wird;
Belichten der Photosyntheseschicht (2) ohne das Verwirbeln oder Durchleiten eines Gases im Photosynthesemedium unter Begrenzung des diffusiven Gasaustausches des Aufnahmeraumes mit der Umgebung, wobei die Versorgung der Mikroorganismen im Photosynthesemedium mit Hydrogencarbonationen durch
Speichern von Hydrogencarbonationen im Photosynthesemedium und/oder
Liefern eines Photosynthesesubstrats in Form von Kohlendioxid und/oder Hydrogencarbonat aus einem zellfreien Kohlenstoffvorratsmedium (4) außerhalb der
Photosyntheseschicht aufrechterhalten wird; und
Ableiten eines bei der Photosynthese gebildeten Gases aus dem Aufnahmeraum.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , bei dem in dem Photosynthesemedium zur Aufrechterhaltung einer hohen Photosyntheserate der photoautotrophen Mikroorganismen eine Hydrogencarbonatkonzentration von mindestens 20 mM, und insbesondere bevorzugt mindestens 50 mM, aufrechterhalten wird. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das Photosynthesesubstrat an das Photosynthesemedium über eine lichtdurchlässige und für das Photosynthesesubstrat permeable Membran (3) geliefert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das zellfreie Kohlenstoffvorratsmedium (4) Hydrogencarbonationen in einer Anfangskonzentration über 50 mM, vorzugsweise über 200 mM, und permeable anorganisch ionische Bestandteile des Photosynthesemediums enthält, wobei die Photosynthesesubstrat- und lichtdurchlässige Membran (3) eine hydrophile Membran (3) ist, und wobei das Photosynthesesubstrat durch Austausch von Hydrogencarbonationen gegen Carbonationen über die hydrophile Membran (3) aus dem zellfreien Kohlenstoffvorratsmedium (4) an das Photosynthesemedium geliefert wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das zellfreie Kohlenstoffvorratsmedium (4) Kohlendioxid als Bestandteil eines Gases oder als physikalisch gelösten oder als chemisch reversibel gebundenen Bestandteil eines Feststoffes oder einer wässrigen Lösung oder einer organischen Flüssigkeit enthält und die lichtdurchlässige und für das Photosynthesesubstrat permeable Membran (3) eine gasdurchlässige hydrophobe und für Wasser und nichtflüchtige Stoffe undurchlässige Membran (3) ist, wobei das Liefern des Photosynthesesubstrats an das Photosynthesemedium ausschließlich auf dem Wege der Diffusion von Kohlendioxid durch die gasdurchlässige hydrophobe Membran (3) aus dem Kohlenstoffvorratsmedium (4) erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Kohlenstoffvorratsmedium (4) eine wässrige Lösung von Hydrogencarbonaten anorganischer oder organischer Basen oder eine wässrige Lösung von Carbamaten primärer oder sekundärer Amine, vorzugsweise primärer oder sekundärer Alkanolamine mit einer molaren Konzentration des reversibel gebundenen Kohlendioxids von mindestens 1 M ist, oder welches ein organisches Lösungsmittel mit hohem Absorptionskoeffizienten für Kohlendioxid wie Ethylencarbonat, Propylencarbonat, ein zyklische Alkylencarbonat ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei Kohlendioxid aus einem Kohlenstoff- Vorratsmedium nach Anspruch 5 oder Anspruch 6 über eine gasdurchlässige hydrophobe und für Wasser und nichtflüchtige Stoffe undurchlässige Membran (3) an ein Kohlenstoff-Vorratsmedium nach Anspruch 4 geliefert wird, und Hydrogencarbonationen an die Photosyntheseschicht (2) über eine lichtdurchlässige und für das Photosynthesesubstrat permeable Membran (3) geliefert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, wobei das Kohlenstoffvorratsmedium (4) eine Substanz enthält, die ausgewählt ist unter: organischen oder anorganischen Carbonaten, organischen oder anorganischen Hydrogencarbonaten, Carbamaten, Carbamaten primärer oder sekundärer Alkanolamine, Alkylammoniumcarbamaten, Alkylencarbonaten, zyklischen Alkylencarbonaten, Ethylencarbonat, Propylencarbonat.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend das Zusetzen einer Säure zum Kohlenstoffvorratsmedium (4).
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Ableiten des bei der Photosynthese gebildeten Gases aus der Photosyntheseschicht und dem Aufnahmeraum mittels einer Gasableitungsvorrichtung (5) erfolgt.
1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend: diskontinuierliches oder kontinuierliches Entnehmen zumindest eines Teils des die photoautotrophen Mikroorganismen enthaltenden Photosynthesemediums und/oder eines Kohlenstoffvorratsmediums zur Gewinnung von Biomasse oder anderer darin enthaltener Photosyntheseprodukte.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, weiterhin umfassend: in-Strömung-Versetzen des Photosynthesemediums und/oder des Kohlenstoffvorratsmediums (4) ohne dafür ein Gas oder Gasgemisch in eines dieser Medien einzuleiten oder durch eines dieser Medien durchzuleiten.
13. Photobioreaktor zur Kultivierung von photoautotrophen Mikroorganismen, der einen abgeschlossenen Aufnahmeraum mit einer Gasdiffusion-hemmenden Außenbegrenzung umfasst, wobei der Aufnahmeraum aufweist: ein erstes Kompartiment zur Ausbildung einer Photosyntheseschicht (2), die eine mittlere Dicke von nicht mehr als 10 mm aufweist; und mindestens ein zweites Kompartiment zur Aufnahme eines Kohlenstoffvorratsmediums (4), das vom ersten Kompartiment durch mindestens eine Membran getrennt ist, die durchlässig ist für mindestens ein Photosynthesesubstrat ausgewählt aus der Gruppe umfassend Kohlendioxid und Hydrogencarbonationen.
14. Photobioreaktor gemäß Anspruch 13, wobei das erste Kompartiment eine Außenbegrenzung (1 ) aufweist, die fest und/oder flexibel und/oder lichtdurchlässig ist.
15. Photobioreaktor gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei das erste Kompartiment eine integrierte Gasableitungsvorrichtung (5) für das konvektive Ableiten von photosynthetisch gebildetem Gas aufweist.
16. Photobioreaktor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das erste Kompartiment ein Photosynthesemedium mit einer Hydrogencarbonatkonzentration von mindestens 30 mM und darin suspendierte photoautotrophe Mikroorganismen zur Ausbildung der Photosyntheseschicht enthält.
17. Photobioreaktor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, wobei das erste und/oder das zweite Kompartiment durch eine oder mehrere Taschen aus einer lichtdurchlässigen Membran gebildet ist/werden, wobei der Abstand zwischen einander gegenüberliegenden Membranflächen der Taschen oder zwischen benachbarten Taschen durch einen oder mehrere Abstandshalter (6) festgelegt wird.
18. Photobioreaktor gemäß Anspruch 17, wobei der Abstandshalter (6) lichtdurchlässig und/oder lichtreflektierend ist, aus einem elastischen Kunststoff wie Acrylglas, Polycarbonat oder Edelstahlblech besteht, und ein falten- oder wellenförmiges Profil hat.
19. Photobioreaktor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 18, wobei das erste Kompartiment einen zumindest teilweise raumfüllenden, offenporigen und lichtdurchlässigen Feststoff enthält, der beim kapillaren Einsaugen einer überwiegend aus Wasser bestehenden Flüssigkeit ein Dreiphasensystem mit einer stabilen feinverteilten Gasphase bildet.
20. Photobioreaktor gemäß Anspruch 19, bei dem der raumfüllende offenporige lichtdurchlässige Feststoff eine Schaumstoff-Folie aus einem Elastomer wie Polyurethan oder Kautschuk ist.
21 . Photobioreaktor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 20, wobei der Photobioreaktor zur Entnahme zumindest eines Teiles des die photoautotrophen Mikroorganismen enthaltenden Photosynthesemediums aus dem lichtdurchlässigen Feststoff mittels einer Press- oder Saugvorrichtung angepasst ist. 22. Photobioreaktor gemäß einem der Ansprüche 13 bis 21 , wobei das zweite Kompartiment und/oder darin enthaltenes Kohlenstoffvorratsmedium als Lichtleiter zur Belichtung der Photosyntheseschicht gestaltet ist.
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