WO2013058484A2 - 인제난 타입의 디테르펜 화합물 및 이를 포함하는 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 - Google Patents

인제난 타입의 디테르펜 화합물 및 이를 포함하는 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 Download PDF

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    • C07C2603/98—Spiro compounds containing "not free" spiro atoms containing at least one ring with more than six ring members

Definitions

  • the present invention relates to a sensitized-derived ingenan type diterpene compound and a pharmaceutical composition for treating or preventing a viral infection, a health functional food for preventing or ameliorating a viral infection, and a composition for enhancing interferon gamma production. .
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating a viral infection disease, comprising administering the composition to a subject having the onset or potential to develop a viral infection in a therapeutically effective amount.
  • Interferon- ⁇ (IFN- ⁇ ) production in immune cells is an important step in early self defense and tumor control against viral and bacterial infections (Biron, CA et al., Annu. Rev. Immunol. 1999, 17, 189 -220).
  • IFN- ⁇ is generally produced in natural killer (NK) and natural killer T (NKT) cells, which act as effector cells in the regulation of immune responses (Schoenborn, JR et al., Adv. Immunol. 2007, 96, 41 -101).
  • IFN- [gamma] expression is particularly associated with pro-inflammatory states.
  • the biological role of the cytokine IFN- ⁇ in defense systems is well known and implicates both direct viral replication and immunosuppression (Gessani, S. et al., Cytokine & Growth FR 1998, 9, 117-123; Goodbourn , S. et al., J. Gen. Virol. 2000, 81, 2341-2364).
  • Viruses are small particles (less than 0.12um) that are smaller than bacteria and cannot be filtered by a bacterial filter (0.22um). They are nucleic acids (DNA or RNA) and few proteins that are necessary for survival. to be. Anti-viral drugs are drugs that weaken or extinguish the action of viruses that enter the body.
  • tetracycline and chloramphenicol as infectious agents for chlamydia (large virus) such as trachoma and sexually transmitted diseases (STIs), amantadine as a preventive agent against influenza A virus, and IDU (preventive agent against herpetic keratitis).
  • Idoxuridine eye drops have been developed, and as a simple herpes encephalitis (encephalitis) or as an immunosuppressive agent, fidarabine / acycloville is attracting attention, and interferon is the most promising agent for viral infections. It is considered.
  • Euphorbia kansui Liou Geukdae , Euphorbiaceae
  • Dried roots of sensitizers also known as “shuisu”
  • shuisu are edema, ascites (Wang, LY et al., J. Nat. Prod. 2003, 66, 630-633) and cancer (Wang, LY et al. Nat. Prod. 2002, 65, 1246-1251).
  • Previous studies on sensitization have shown a number of Yupane-type triterpenes (Chang, JS et al., Planta Med. 2010, 76, 1544-1549), ingenan-type diterpenes (Pan, Q. et. al., J. Nat.
  • the sample is anticancer (Pan, Q. et al., J. Nat. Prod. 2004, 67, 1548-1551), inhibiting cell division (Chang, JS et al., Planta Med. 2010, 76, 1544- 1549) and anti-allergic effects (Ott, HH et al., Experientia. 1981, 37, 88-91).
  • the present inventors have made intensive efforts to identify substances exhibiting antiviral activity derived from natural products, and as a result, after separating the ingenan-type diterpene compounds from water sensitization, the compounds are interferon gamma (IFN- ⁇ ) of NK92 cells. ) Increased production, and completed the present invention.
  • IFN- ⁇ interferon gamma
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of viral infection diseases comprising a compound represented by the formula (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a health functional food for the prevention or improvement of viral infection diseases comprising a compound represented by the formula (2) or a food acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide an interferon gamma production enhancing composition
  • an interferon gamma production enhancing composition comprising the compound represented by Formula 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a novel diterpene compound of ingenane type isolated from the root region of Euphorbia kansui , wherein the novel diterpene compounds of the sensitized-derived ingenan type comprising the new compound are IFN- in NK cells. Since it exhibits the activity of inducing ⁇ production, there is an effect that can be used for the treatment or prevention of viral infection diseases.
  • FIG. 1 shows the high resolution FABMS results of compound 1.
  • FIG. 3 and 4 show the positive HRFABMS results of compound 1.
  • FIG. 5 shows 1 H-NMR spectroscopic data of Compound 1.
  • FIG. 8 shows the HMBC (H ⁇ C) correlation and COSY (HH) correlation of Compound 1.
  • FIG. 8 shows the HMBC (H ⁇ C) correlation and COSY (HH) correlation of Compound 1.
  • FIG. 10 shows NOESY ( ⁇ ) correlation of compound 1.
  • FIG. 11 is a graph showing the effects of compounds 1-6 and 8 on IFN- ⁇ production in human natural killer cells (NK92).
  • NK92 human natural killer cells
  • PMA Four-ball 12-myristate 13-acetate
  • Each value is the mean ⁇ standard deviation value for three cultures.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound represented by Chemical Formula 1 is represented by Compound 1 , the name of which is 5- O- (2,3-dimethylbutanoyl) -13- O -dodecanoyl-20- O -deoxyphosphate It's play.
  • Compound 1 is a diterpene compound of the ingenane type , which is a novel substance isolated from the root region of Euphorbia kansui by the present inventors.
  • the compound 1 may exhibit an activity of promoting or increasing interferon gamma production of cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of viral infection diseases comprising a compound represented by the following formula (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the interan type diterpene compound represented by Formula 2 may be separated from the root portion of Euphorbia kansui , preferably, water sensitizer .
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include not only the compound represented by Chemical Formula 2, which is isolated from sensitization ( Euphorbia kansui ), but also the compound represented by Chemical Formula 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention includes not only the compound represented by Formula 2 and pharmaceutically acceptable salts thereof, but also all possible solvates, hydrates, or racemates that can be prepared therefrom.
  • prevention means any action that inhibits or delays the development of a viral infection disease by administration of a composition.
  • treatment means any action that improves or advantageously changes the symptoms caused by viral infection by administration of the composition.
  • influenza virus influenza virus
  • influenza A virus Influenza A virus subtype H1N1
  • avian influenza virus avian influenza virus
  • rhinovirus rhinovirus
  • adenovirus adenovirus
  • corona Virus parainfluenza virus
  • HSV herpesvirus
  • HSV human immunodeficiency virus
  • rotavirus It may be a disease infected by one or more viruses selected from the group consisting of hepatitis virus, but is not limited thereto.
  • the viral infection disease is selected from the group consisting of rotavirus infection, adenovirus infection, flu, cold, sore throat, bronchitis, pneumonia, bird flu, conjunctivitis, encephalitis, acquired immune deficiency syndrome, hepatitis and acute respiratory syndrome (SARS) It may be one or more viral infection diseases, but is not limited thereto.
  • the compound represented by Chemical Formula 2 of the present invention may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and as the salt, an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid is useful.
  • Acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, nitric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, nitrous acid or phosphorous acid and aliphatic mono and dicarboxylates, phenyl-substituted alkanoates, hydroxy alkanoates and alkanes. Obtained from non-toxic organic acids such as dioates, aromatic acids, aliphatic and aromatic sulfonic acids.
  • Such pharmaceutically toxic salts include sulfate, pyrosulfate, bisulfate, sulfite, bisulfite, nitrate, phosphate, monohydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, metaphosphate, pyrophosphate chloride, bromide and iodide Id, fluoride, acetate, propionate, decanoate, caprylate, acrylate, formate, isobutyrate, caprate, heptanoate, propiolate, oxalate, malonate, succinate, suverate , Sebacate, fumarate, maleate, butyne-1,4-dioate, hexane-1,6-dioate, benzoate, chlorobenzoate, methylbenzoate, dinitro benzoate, hydroxybenzoate, meth Oxybenzoate, phthalate, terephthalate, benzenesulfonate, toluenesulfon
  • the acid addition salts according to the invention are dissolved in conventional methods, for example, by dissolving the compound of the formula (2) in an excess of an aqueous solution of an acid, which salt is subjected to a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Can be prepared by precipitation.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and evaporating and drying the filtrate. At this time, it is pharmaceutically suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt as the metal salt.
  • Corresponding silver salts are also obtained by reacting alkali or alkaline earth metal salts with a suitable negative salt (eg, silver nitrate).
  • the composition of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin.
  • lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a viral infection disease comprising administering to the subject of the occurrence or potential of the viral infection in a therapeutically effective amount of the composition of the present invention.
  • the term "individual” means all animals including humans already infected with or capable of being infected with the virus, and by administering the composition of the present invention to an individual, the disease can be effectively prevented and treated.
  • composition of the present invention can be administered in parallel with a therapeutic agent for an existing viral infection disease.
  • the route of administration of the composition may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • the composition of the present invention may be administered as desired, but is not limited to intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, intranasal administration, pulmonary administration, rectal administration.
  • the composition may also be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount.
  • therapeutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, with an effective dose level of the individual type and severity, age, sex, type of virus infected, drug Activity, sensitivity to drug, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, hormonal therapy, drug therapy and biological response modifiers for the prevention and treatment of viral infections.
  • the compound represented by the following formula (2), the compound represented by the following formula (3), the compound represented by the following formula (4), and the compound represented by the following formula (5) were separately identified from the water.
  • R One Silver CO-CH (CH 3 ) -CH (CH 3 ) 2 And R 2 Is H and R 3 Is OCO- (CH 2 ) 10 -CH 3 And R 4 Is Compound if H 2 R, R One Is H and R 2 Is OCO- (CH 2 ) 8 -CH 3 Is R 3 Is H and R 4 Is Compound if H 3 With R One Is CO (CH CH)-(CH 2 ) 4 -CH 3 And R 2 Is OAc and R 3 Is H and R 4 Is Compound if H 4 R, R One Silver CO-CH (CH 3 ) -CH (CH 3 ) 2 And R 2 Is OCO- (CH 2 ) 14 -CH 3 I
  • the present invention provides a health functional food for the prevention or improvement of a viral infection disease comprising a compound represented by the formula (2) or a food acceptable salt thereof as an active ingredient. That is, the compound of Formula 2 or a food acceptable salt thereof may be added to food for the purpose of preventing or ameliorating a viral infection disease.
  • prevention means any action that suppresses or delays the onset of symptoms caused by a viral infection disease by ingestion of a health functional food
  • improvement means a viral infection disease by ingesting a health functional food. It means all actions that improve or beneficially change symptoms.
  • the health functional food of the present invention corresponds to all types of health functional foods, nutritional supplements, nutritional supplements, pharmafood, health foods, nutraceutical, designer foods, food additives, feed additives and the like.
  • the compound of Formula 2 or a food acceptable salt thereof When used as an additive for a health functional food, the compound or a food acceptable salt thereof may be added as it is, or may be used together with other food or food ingredients. It may be appropriately used depending on the method.
  • the mixed amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (preventive or improved treatment).
  • the health functional food of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, Alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the health functional food of the present invention may contain fruit flesh for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage.
  • the viral infection disease is as described above.
  • the present invention provides a composition for enhancing interferon gamma production comprising a compound represented by the formula (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • composition for enhancing interferon gamma production may further include a pharmaceutically acceptable carrier, and the pharmaceutically acceptable carrier is as described above.
  • the compound represented by the formula (2) or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be usefully used for the prevention and treatment of viral infectious diseases by increasing IFN- ⁇ production of cells, preferably NK cells.
  • the roots of sensitizer ( Euphorbia kansui ) are imported from China and purchased from the domestic herbal medicine company Chilsung, and the standard product (PB-3755) is stored in the extract bank of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.
  • NK92 cells human NK lymphoma
  • NK92 cells were obtained from the American Type Culture Collection. NK92 cells were maintained in ⁇ -MEM (Invitrogen, USA) containing 20% fetal bovine serum (Invitrogen), 2 mM L-glutamate, 100 m g / mL penicillin and 100 m g / mL streptomycin (Invitrogen) Supplemented with 100 U / mL IL-2 (Peprotech, USA). NK92 cell culture was performed in a 37 ° C. incubator with a 5% CO 2 humidity atmosphere. The amount of human IFN- ⁇ was analyzed using an assay kit (Endogen, Woburn, USA) according to the supplier's protocol.
  • Example 1 The MeOH extract of Example 1 (1 kg) was suspended in H 2 O and partitioned successively with CHCl 3 , EtOAc, and n- BuOH to 230.0 g of CHCl 3 -soluble extract, 4.5 g of EtOAc-soluble extract, and 41.0 g of n- BuOH-soluble extract were obtained.
  • the CHCl 3 -soluble fraction was found to be the most active for IFN- ⁇ production.
  • the CHCl 3 -soluble fraction (100 g) was subjected to silica gel column chromatography using a stepwise gradient mixture of n -hexane: EtOAC (50: 1 to 1: 1 v / v), followed by CHCl 3 : MeOH Silica gel column chromatography was performed again using a gradient gradient mixture of (5: 1 to 1: 1 v / v) to obtain 22 fractions (KC16-1-KC16-22). The material in fraction KC16-7 was then crystallized to give compound 9 (10 g).
  • Fraction KC16-12 (5.7 g) was purified by RP C-18 (3.5 ⁇ 40 cm) with a medium pressure liquid chromatography system (MPLC) eluting with MeOH: H 2 O (4: 1 to 4.5: 1, then 100% MeOH). Chromatography on a 40C 18 -PREP) column yielded 20 fractions (KC16-12-1-KC16-12-20). Fraction KC16-12-18 (485 mg) was fractionated using Sephadex LH-20 column chromatography (2.5 ⁇ 170 cm) eluting with 90% MeOH in H 2 O to yield three fractions (KC16-12-18-1). KC16-12-18-3) was obtained.
  • MPLC medium pressure liquid chromatography system
  • Fraction KC16-12-18-2 (198 mg) was purified by preparative HPLC (YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 ⁇ m, 100% MeOH, 10 mL / min) using a reversed phase column. 1 (10.0 mg, t R 13.2 min) and 2 (60.0 mg, t R 17.1 min) were obtained.
  • Fraction KC16-12-20 (777 mg) was chromatographed on a silica gel MPLC column eluting with n -hexane: EtOAC (5: 1 to 1: 1 v / v) to give eight fractions (KC16-12-20-1 KC16-12-20-8).
  • Fraction KC16-12-20-1 (366 mg) was fractionated through Sephadex LH-20 column chromatography (2.5 ⁇ 170 cm) eluting with 90% MeOH in H 2 O to give four fractions (KC16-12-20- 1-1-KC16-12-20-1-4).
  • fraction KC16-12-20-1-2 (100 mg) to preparative HPLC using a reverse phase column (YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 m m, 100% MeOH, 10 mL / min) Purification gave compound 7 (4 mg, t R 62.1 min).
  • Fraction KC16-14-12 (295 mg) was fractionated using Sephadex LH-20 column chromatography (2.5 ⁇ 170 cm) eluting with 80% MeOH in H 2 O to give five fractions (KC16-14-12-1 KC16-14-12-5) was obtained.
  • Fraction KC16-14-12-2 (150 mg) to preparative HPLC using a reverse phase column (YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 m m, 83% MeOH in H 2 O, 10 mL / min) Purification through afforded Compound 3 (40 mg, t R 31.3 min).
  • Fraction KC16-14-15 (144 mg) was fractionated using Sephadex LH-20 column chromatography (2.5 ⁇ 170 cm) eluting with 80% MeOH in H 2 O to yield 6 fractions (KC16-14-15-1). KC16-14-15-6) was obtained.
  • Fraction KC16-14-15-6 (55 mg) to preparative HPLC using a reverse phase column (YMC 250 x 20 mm, 4 m m, 70% MeCN in H 2 O, 10 mL / min) to give compound 8 with ( 25 mg, t R 15.4 min) was obtained.
  • Fraction KC16-21 (1.2 g) was chromatographed on silica gel via MPLC column chromatography eluting with n -hexane: EtOAC (5: 1 to 1: 1 v / v, 3.5 ⁇ 40 cm) to obtain 18 fractions ( KC16-21-1-KC16-21-18).
  • Fraction KC16-21-8 (242 mg) was eluted with n -hexane-dimethyl chloride-MeOH (10: 10: 1 v / v, 2.5 ⁇ 170 cm) Sephadex LH-20 column chromatography (2.5 ⁇ 170 cm) Fractions were used to obtain six fractions (KC16-21-8-1-KC16-21-8-6).
  • the lower fraction KC16-21-8-3 (130 mg) was fractionated using Sephadex LH-20 column chromatography (2.5 ⁇ 170 cm) eluting with 90% MeOH in H 2 O to yield 8 fractions (KC16-21- 8-3-1-KC16-21-8-3-8).
  • Fraction KC16-21-8-3-8 (40 mg) in a reverse phase column to take advantage preliminary HPLC (YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 m m, 100% MeOH, 10 mL / min) to Purification via afforded compound 6 (4.5 mg, t R 12.6 min).
  • S- MTPA derivatives were prepared using the same procedure as above except that they were replaced with other stereoisomers.
  • Compound 1 was obtained as a colorless gum. Its IR spectrum showed absorption bands due to the presence of hydroxyl functional groups (3446 cm ⁇ 1 ) and carbonyl functional groups (1732 cm ⁇ 1 ) (FIG. 1). High resolution FABMS of compound 1 showed [M + Na] + peak at m / z 651.4271, corresponding to molecular formula C 38 H 60 O 7 (FIG. 2). In addition, HRFABMS (positive) of Compound 1 is m / z 513 [M + H-116] + and 429 [M + H, indicating loss of 2,3-dimethylbutanoate and dodecanoate units from the parent molecule, respectively. -200] two characteristic ion fragment peaks at + (FIG.
  • a Mosher derivative (1 R and 1 S ) was prepared as in Example 3. As shown in FIG. 9, a difference ( ⁇ SR ) was observed, where the positive values of H-1 and H-19 and the negative values of H-5, H-7, and H-20 differ from the absolute arrangement in C-3. Clearly proved to be S.
  • the structure of compound 1 is (3 S) -5- O - ( 2,3- dimethyl butanoyl) -13- O - was identified to be a play in Spain oxy-dodecanoyl -20- O.
  • NK92 cells / mL were seeded in 48-well culture plates and 12 with each of the isolated compounds in ⁇ -MEM medium containing 20% FBS and IL-2 Incubated for hours. IFN- ⁇ secreted in the culture supernatant was analyzed by ELISA method. Absorbance was measured on a microplate reader and all compound treatment assays were performed in two replicates. Cytotoxicity of compound-treated NK92 cells was assessed by MTT assay.

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Abstract

본 발명은 감수 유래 인제난 타입의 디테르펜 화합물 및 이를 포함하는, 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 및 인터페론 감마 생산 증강용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 치료 유효량으로 바이러스 감염질환의 발병 또는 발병가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

인제난 타입의 디테르펜 화합물 및 이를 포함하는 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물
본 발명은 감수 유래 인제난 타입의 디테르펜 화합물 및 이를 포함하는, 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물, 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 및 인터페론 감마 생산 증강용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 치료 유효량으로 바이러스 감염질환의 발병 또는 발병가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
면역 세포에서의 인터페론-γ(IFN-γ) 생산은 바이러스 및 박테리아 감염에 대한 초기 자체 방어 및 종양 제어에 있어 중요한 단계이다(Biron, C. A. et al., Annu. Rev. Immunol. 1999, 17, 189-220). IFN-γ는 일반적으로 면역 반응의 조절시 효과 세포로서 작용하는, 자연 살해(NK) 및 자연 살해 T(NKT) 세포에서 생산된다(Schoenborn, J. R. et al., Adv. Immunol. 2007, 96, 41-101). IFN-γ 발현은 전-염증 상태와 특히 관련이 있다. 방어 시스템의 사이토카인 IFN-γ의 생물학적 역할은 잘 알려져 있으며 바이러스 복제 및 면역자극의 직접적인 억제 모두에 관련이 있다(Gessani, S. et al., Cytokine & Growth F. R. 1998, 9, 117-123; Goodbourn, S. et al., J. Gen. Virol. 2000, 81, 2341-2364).
소득수준 향상, 인구의 고령화, 만성질환 관련 의약품에 대한 수요증가, 수명증가 등으로 인하여 전 세계적으로 의약품 시장이 성장하고 있는 가운데, 바이오 의약품의 연구 개발이 국내외 제약 산업에서 증대되고 있다. 그 가운데 전 인류의 숙제인 에이즈 치료제 개발 및 간질환 인플루엔자 질환 치료제 개발의 기초가 되는 항바이러스 치료제 관련 연구 및 이를 활용한 치료제 개발, 의료기술 및 삶의 질 향상 기술개발에 대한 요구가 증대되고 있다.
바이러스란 세균보다 작아서 세균여과기(0.22um)로도 걸러질 수 없는 작은 입자(평균 0.1um 이하)로, 생존에 필요한 물질로 핵산(DNA 또는 RNA)과 소수의 단백질만을 가지고 있어 숙주에 의존하여 살아가는 생명체이다. 바이러스로 인해 야기되는 질환에 대한 치료제로, 체내에 침입한 바이러스의 작용을 약하게 하거나 소멸하게 하는 약을 항바이러스 치료제라 한다.
현재 바이러스 감염증에 대한 치료법은 백신에 의한 면역요법이 주축을 이루고 있다. 구체적으로, 트라코마, 제4성병(성병)등 클라미디아(대형 바이러스)에 의한 감염증 치료제로 테트라시클린, 클로람페니콜이 있고, 인플루엔자A형 바이러스에 대한 예방제로 아만타딘이 있으며, 헤르페스 각막염에 대한 예방제로 IDU(이독스우리딘) 점안제가 개발되었으며, 단순 헤르페스 뇌염(뇌염)이나 면역억제제로서 피다라빈이/아시클로빌이 주목받고 있으며, 특히 인터페론은 바이러스 감염증에 대해 가장 유망시되는 약제로, 현재 그 유용성이 검토되고 있다.
최근에 건강문제를 다루거나 예방하는데 있어, 천연물질을 선호하는 인구가 전 세계적으로 증가하고 있다. 이러한 추세는 제약회사로 하여금 식물에서 추출한 새로운 항미생물제 생산에 영향을 미치고 있다. 이에 따라 세계적으로 수 천여종의 식물자원으로부터 새로운 항바이러스 소재를 탐색하기 위한 연구가 꾸준히 이루어지고 있으며, 또한 항바이러스 활성을 가진 플라보노이드, 테르페노이드, 리그난, 설파이드, 폴리페놀류, 쿠마린, 사포닌, 알카로이드, 폴리인, 티오펜, 단백질과 펩타이드 등 매우 다양한 피토케미칼들이 동정되어 왔다. 일반적인 용도의 식용허브, 향신료 및 허브차의 몇몇 휘발성 정유들 또한 높은 수준의 항바이러스 활성을 나타내고 있다. 그러나 위에 언급한 약간의 화합물군을 제외하고는 대부분의 항바이러스 활성을 지닌 약용식물 활성물질의 연구는 시작단계에 불과한 실정이다.
감수(Euphorbia kansui Liou)(대극과, Euphorbiaceae)는 중국 및 한국 본토에 널리 분포되어 있다. "간수이"로도 알려져 있는, 감수의 건조된 뿌리는 부종, 복수(Wang, L. Y. et al., J. Nat. Prod. 2003, 66, 630-633) 및 암(Wang, L. Y. et al., J. Nat. Prod. 2002, 65, 1246-1251)을 위한 약초 치료제로서 사용되어 왔다. 감수에 대한 이전 연구들을 통해 이의 추출물 중에 다수의 이우판-타입 트리테르펜(Chang, J. S. et al., Planta Med. 2010, 76, 1544-1549), 인제난-타입 디테르펜(Pan, Q. et al., J. Nat. Prod. 2004, 67, 1548-1551) 및 자트로판-타입 디테르펜(Zheng, W. F. et al., Planta Med. 1998, 64, 754-756)이 존재하는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 시료는 항암(Pan, Q. et al., J. Nat. Prod. 2004, 67, 1548-1551), 세포 분열 억제(Chang, J. S. et al., Planta Med. 2010, 76, 1544-1549) 및 항알러지 효과(Ott, H. H. et al., Experientia. 1981, 37, 88-91)를 나타내는 것으로 확인되었다.
이러한 배경하에서, 본 발명자는 천연물 유래의 항바이러스 활성을 나타내는 물질을 동정하기 위하여 예의 노력한 결과, 감수로부터 인제난-타입의 디테르펜 화합물을 분리한 후 상기 화합물이 NK92 세포의 인터페론 감마(IFN-γ) 생산을 증가시킴을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인터페론 감마 생산 증강용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 감수(Euphorbia kansui)의 뿌리 부위로부터 분리한 인제난 타입의 신규한 디테르펜 화합물을 제공하고, 상기 신규 화합물을 포함하는 감수 유래 인제난 타입의 신규한 디테르펜 화합물들은 NK 세포에서 IFN-γ 생산을 유도하는 활성을 나타내므로 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방을 위하여 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 화합물 1의 IR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 화합물 1의 고해상도 FABMS 결과를 나타낸다.
도 3 및 도 4는 화합물 1의 포지티브 HRFABMS 결과를 나타낸다.
도 5는 화합물 1의 1H-NMR 분광학적 데이터를 나타낸다.
도 6은 화합물 1의 13C-NMR 분광학적 데이터를 나타낸다.
도 7은 화합물 1의 HMQC 분광학적 데이터를 나타낸다.
도 8은 화합물 1의 HMBC (H→C) 상관관계 및 COSY (H-H) 상관관계를 나타낸다.
도 9는 화합물 1의 절대 배열을 나타낸다. 이때 2개 MPTA 에스테르 1a 및 1b에 대한 Δδ 값(δS-δR)을 헤르츠 단위로 나타내었다.
도 10은 화합물 1의 NOESY (↔) 상관관계를 나타낸다.
도 11은 인간 자연 살해세포(NK92)에서의 IFN-γ 생산에 대한 화합물 1-6 및 8의 영향을 나타내는 그래프이다. 이때 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA)를 양성 대조군으로 사용하였다. 각각의 값은 3회 배양에 대한 평균 ± 표준편차값이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2012007897-appb-I000001
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 화합물 1로 나타내었으며, 이의 명칭은 5-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀이다.
상기 화합물 1은 인제난 타입의 디테르펜 화합물로서, 본 발명자들이 감수(Euphorbia kansui)의 뿌리 부위로부터 분리한 신규 물질이다. 상기 화합물 1은 세포의 인터페론 감마 생산을 촉진 또는 증가시키는 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2012007897-appb-I000002
상기 식에서,
R1은 H이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이거나,
R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나,
R1은 H이고, R2는 OCO-(CH2)8-CH3이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
R1은 CO(CH=CH)-(CH2)4-CH3이고, R2는 OAc이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OCO-(CH2)14-CH3이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나, 또는
R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OH이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이다.
본 발명에서, 상기 화학식 2로 표시되는 인제난 타입의 디테르펜 화합물은 감수(Euphorbia kansui), 바람직하게는 감수의 뿌리 부위로부터 분리될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 감수(Euphorbia kansui)로부터 분리된 상기 화학식 2로 표시되는 화합물뿐만 아니라, 화학적 방법으로 합성한 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 이로부터 제조될 수 있는 가능한 용매화물, 수화물 또는 라세미체를 모두 포함한다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 바이러스 감염 질환은 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종 인플루엔자A 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV), 로타바이러스(rotavirus) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 바이러스 감염 질환은 로타바이러스감염증, 아데노바이러스감염증, 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴, 조류독감, 결막염, 뇌염, 후천성면역결핍증, 간염 및 중증급성호흡기증후군(SARS)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 감염 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태일 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화학식 2의 화합물을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속 염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명은 본 발명의 조성물을 치료학적 유효량으로 바이러스 감염질환의 발병 또는 발병가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "개체"란 바이러스에 이미 감염되었거나 감염될 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물을 기존의 바이러스 감염 질환의 치료제와 병행하여 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "치료학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 바이러스 감염의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 감수로부터 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 하기 화학식 4로 표시되는 화합물 및 하기 화학식 5로 표시되는 화합물을 분리 동정하였다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2012007897-appb-I000003
[화학식 3]
Figure PCTKR2012007897-appb-I000004
[화학식 4]
Figure PCTKR2012007897-appb-I000005
[화학식 5]
Figure PCTKR2012007897-appb-I000006
상기 식에서,
R1은 H이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이거나,
R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나,
R1은 H이고, R2는 OCO-(CH2)8-CH3이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
R1은 CO(CH=CH)-(CH2)4-CH3이고, R2는 OAc이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OCO-(CH2)14-CH3이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나, 또는
R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OH이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이다.
본 발명에서는 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 중 R1은 H이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2인 경우 화합물 1로, R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H인 경우 화합물 2로, R1은 H이고, R2는 OCO-(CH2)8-CH3이며, R3는 H이고, R4는 H인 경우 화합물 3으로, R1은 CO(CH=CH)-(CH2)4-CH3이고, R2는 OAc이며, R3는 H이고, R4는 H인 경우 화합물 4로, R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OCO-(CH2)14-CH3이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H인 경우 화합물 5로, R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OH이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H인 경우 화합물 6으로 나타내었으며, 화학식 3로 표시되는 화합물은 화합물 7로, 화학식 4로 표시되는 화합물은 화합물 8로, 화학식 5로 표시되는 화합물은 화합물 9로 나타내었다.
상기 화합물 1의 명칭은 5-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀, 화합물 2의 명칭은 3-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀, 화합물 3의 명칭은 20-O-데카노일인제놀, 화합물 4의 명칭은 20-O-아세틸인제놀-3-O-(2'E,4'Z) 데카디엔에이트, 화합물 5의 명칭은 간수이포린 A, 화합물 6의 명칭은 3-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일인제놀, 화합물 7의 명칭은 간수이닌 F, 화합물 8의 명칭은 (20R,23E)-이우파-8,23-디엔-3b,25-디올, 화합물 9의 명칭은 이우폴이다.
본 발명의 실시예에서는 NK92 세포에서의 IFN-γ 발현에 대한 상기 화합물들(1-9)의 영향을 ELISA 분석을 이용하여 조사하여 화합물 1-6 및 8이 NK92 세포에서 IFN-γ 생산을 유도할 수 있음을 확인하였다(도 10). 이러한 결과는 본 발명에서 동정한 화합물 1-6이 세포의 IFN-γ 생산을 촉진 또는 증가시킴으로써 유용한 항바이러스제로 사용될 수 있음을 나타낸다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 즉, 상기 화학식 2의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품에 첨가할 수 있다.
본 발명에서, "예방"이란 건강기능식품의 섭취에 의해 바이러스 감염 질환에 의한 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "개선"이란 건강기능식품의 섭취에 의해 바이러스 감염 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 보든 행위를 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강 식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제, 사료첨가제 등의 모든 형태에 해당한다.
상기 화학식 2의 화합물 또는 이의 식품적으로 허용가능한 염을 건강기능식품의 첨가물로 사용할 경우, 상기 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방 또는 개선적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으며, 예를 들면 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
그밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
상기 바이러스 감염 질환은 상기에서 설명한 바와 같다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인터페론 감마 생산 증강용 조성물을 제공한다.
상기 인터페론 감마 생산 증강용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 실시예에서는 상기 화학식 2로 표시되는 화합물을 NK92 세포에 처리한 결과, 상기 NK92 세포에서의 IFN-γ 발현이 증가하였음을 확인하였다(도 10). 따라서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 세포, 바람직하게는 NK 세포의 IFN-γ 생산을 증가시킴으로써, 궁극적으로 바이러스 감염 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 효과를 보다 더 구체적으로 설명하고자 하나, 이들 실시예는 본 발명의 예시적인 기재일뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 재료 및 방법
일반적인 실험 과정
용융점은 코플러 마이크로-호스테이지(Kofler micro-hostage) 상에서 측정되었다. 광학적 회전은 Jasco P-1020 편광계로 측정하였다. UV 데이터는 UV-VIS 분광기 2400 상에서 얻었으며, FT-IR 스펙트럼은 Jasco FT/IR-4200을 이용하여 얻었다. NMR 스펙트럼은 내부 표준물질로서 테트라메틸실란을 사용하여 Varian UNITY 400 및 Brucker DMX-800 MHz FT-NMR 분광기 상에서 기록하였다. HRESIMS 및 HRFABMS는 Waters Q-Tof Premier 분광기 및 JEOL JMS-HX110 분광기 상에서 각각 수행하였다. HPLC 분리는 UV/VIS-155 검출기를 사용하여 Gilson pump 305 상에서 수행하였다.
식물 재료
감수(Euphorbia kansui)의 뿌리는 중국 수입산으로 국내 생약 판매회사인 칠성사로부터 구입하였으며 표준품(PB-3755)는 한국생명공학연구원의 추출물은행에 보관하고 있다.
세포 배양
NK92 세포(인간 NK 림프종)를 American Type Culture Collection으로부터 입수하였다. NK92 세포를 20% 우태아 혈청(Invitrogen), 2 mM L-글루타메이트, 100 mg/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 α-MEM (Invitrogen, 미국) 중에서 유지시킨 다음, 100 U/mL IL-2 (Peprotech, 미국)로 보충하였다. NK92 세포 배양을 5% CO2 습도 대기로 37 ℃ 배양기 내에서 수행하였다. 인간 IFN-γ의 양을 분석 키트(Endogen, Woburn, 미국)를 이용하여 공급자의 프로토콜에 따라 분석하였다.
실시예 2: 추출 및 분리
상기 실시예 1의 MeOH 추출물(1 kg)을 H2O 중에 현탁시키고 CHCl3, EtOAc, 및 n-BuOH로 연속적으로 분배시켜 230.0 g의 CHCl3-가용성 추출물, 4.5 g의 EtOAc-가용성 추출물, 및 41.0 g의 n-BuOH-가용성 추출물을 얻었다. CHCl3-가용성 분획이 IFN-γ 생산에 가장 활성이 높은 것으로 확인되었다. 상기 CHCl3-가용성 분획(100 g)을 n-헥산:EtOAC (50:1 내지 1:1 v/v)의 단계적인 농도구배 혼합물을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시한 다음, CHCl3:MeOH (5:1 내지 1:1 v/v)의 단계적인 농도구배 혼합물을 사용하여 다시 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 22개 분획물(KC16-1 - KC16-22)을 얻었다. 그 다음 분획 KC16-7 내 물질을 결정화하여 화합물 9 (10 g)를 얻었다. 분획 KC16-12 (5.7 g)를 MeOH:H2O (4:1 내지 4.5:1, 그 다음 100% MeOH)로 용리되는 중압액체 크로마토그래피 시스템(MPLC)으로 RP C-18 (3.5 × 40 cm, 40C18-PREP) 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 20개의 분획(KC16-12-1 - KC16-12-20)을 얻었다. 분획 KC16-12-18 (485 mg)을 H2O 중의 90% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 3개의 분획(KC16-12-18-1 - KC16-12-18-3)을 얻었다. 분획 KC16-12-18-2 (198 mg)를 역상 컬럼을 이용한 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 ㎛, 100% MeOH, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 1 (10.0 mg, t R 13.2 min) 및 2 (60.0 mg, t R 17.1 min)를 얻었다. 분획 KC16-12-20 (777 mg)을 n-헥산:EtOAC (5:1 내지 1:1 v/v)로 용리되는 실리카 겔 MPLC 컬럼 상에서 크로마토그래피하여 8개의 분획(KC16-12-20-1 - KC16-12-20-8)을 얻었다. 분획 KC16-12-20-1 (366 mg)을 H2O 중의 90% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 통해 분획하여 4개의 분획(KC16-12-20-1-1 - KC16-12-20-1-4)을 얻었다. 분획 KC16-12-20-1-2 (100 mg)를 역상 컬럼을 이용한 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 mm, 100% MeOH, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 7 (4 mg, t R 62.1 min)을 얻었다. 활성 분획 KC16-14 (2.8 g)를 MeOH:H2O (1:1 내지 4.5:1, 그 다음 100% MeOH)로 용리되는 RP C-18 컬럼 (3.5 × 40 cm, 40C18-PREP) 상에서 MPLC를 통해 크로마토그래피하여 18개의 분획(KC16-14-1 - KC16-14-18)을 얻었다. 분획 KC16-14-10 (153 mg)을 n-헥산:EtOAC로 용리되는 MPLC 컬럼 크로마토그래피(3:1 v/v, 3.5 ×40 cm)를 통해 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 4개의 분획(KC16-14-10-1 - KC16-14-10-4)을 얻었다. 분획 KC16-14-10-1 (36 mg)을 역상 컬럼을 이용하는 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 mm, 88% MeOH in H2O, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 4 (9 mg, t R 23.5 min) 및 5 (4 mg, t R 32.6 min)를 얻었다.
분획 KC16-14-12 (295 mg)를 H2O 중의 80% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 5개의 분획(KC16-14-12-1 - KC16-14-12-5)을 얻었다. 분획 KC16-14-12-2 (150 mg)를 역상 컬럼을 이용하는 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 mm, 83% MeOH in H2O, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 3 (40 mg, t R 31.3 min)을 얻었다.
분획 KC16-14-15 (144 mg)를 H2O 중의 80% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 6개의 분획(KC16-14-15-1 - KC16-14-15-6)을 얻었다. 분획 KC16-14-15-6 (55 mg)을 역상 컬럼을 이용하는 예비 HPLC(YMC 250 x 20 mm, 4 mm, 70% MeCN in H2O, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 8 (25 mg, t R 15.4 min)을 얻었다.
분획 KC16-21 (1.2 g)을 n-헥산:EtOAC (5:1 내지 1:1 v/v, 3.5 × 40 cm)로 용리되는 MPLC 컬럼 크로마토그래피를 통해 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여 18개의 분획(KC16-21-1 - KC16-21-18)을 얻었다. 분획 KC16-21-8 (242 mg)을 n-헥산-디메틸 클로라이드-MeOH (10:10:1 v/v, 2.5 × 170 cm)로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 6개의 분획(KC16-21-8-1 - KC16-21-8-6)을 얻었다. 하위 분획 KC16-21-8-3 (130 mg)을 H2O 중의 90% MeOH로 용리되는 Sephadex LH-20 컬럼 크로마토그래피(2.5 × 170 cm)를 이용하여 분획하여 8개의 분획(KC16-21-8-3-1 - KC16-21-8-3-8)을 얻었다. 분획 KC16-21-8-3-8 (40 mg)을 역상 컬럼을 이용하년 예비 HPLC(YMC J'sphere ODS-H80, 250 x 20 mm, 4 mm, 100% MeOH, 10 mL/min)를 통해 정제하여 화합물 6 (4.5 mg, t R 12.6 min)을 얻었다.
실시예 3: 화합물 1의 R - 및 S -MTPA 에스테르 유도체의 제조
화합물 1 (2.0 mg)을 2 mL 무수 CH2Cl2 중에 용해시켰다. (S)-(+)-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)페닐아세틸 클로라이드(3 mL) 및 N,N-디메틸-4-아미노피리딘을 상기 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 24 시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응이 완결된 후, 상기 잔사물에 대해 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피[1 × 7 cm, n-헥산:EtOAc (15:1)]를 수행하여 R-MTPA 유도체를 얻었다.
S-MTPA 유도체는 다른 입체이성질체로 대체한 것을 제외하고는 상기와 동일한 과정을 이용하여 제조하였다.
실시예 4: 화합물 동정
화합물 1은 무색의 검(colorless gum)으로서 얻어졌다. 이의 IR 스펙트럼은 히드록실 작용기(3446 cm-1) 및 카보닐 작용기(1732 cm-1)의 존재로 인한 흡수 밴드를 나타내었다(도 1). 화합물 1의 고해상도 FABMS는 분자식 C38H60O7에 해당하는, m/z 651.4271에서의 [M+Na]+ 피크를 나타내었다(도 2). 또한, 화합물 1의 HRFABMS(포지티브)는 모분자로부터 각각 2,3-디메틸부타노에이트 및 도데카노에이트 단위의 손실을 나타내는, m/z 513 [M+H-116]+ 및 429 [M+H-200]+에서의 2개의 특징적인 이온 단편 피크를 나타내었다(도 3 및 도 4). 화합물 1의 1H-NMR 분광학적 데이터(도 5)는 δH 2.38 (1H, m), 2.0 (1H, m), 1.14 (3H, d, J = 7.2 Hz), 0.98 (3H, d, J = 4.8 Hz), 및 0.94 (3H, d, J = 6.5 Hz) ppm에서 2,3-디메틸부타노에이트기에 속하는 프로톤 시그널을 나타내었다. 도데카노에이트 스펙트럼은 δH 2.19 (2H, t, J = 7.6 Hz), 1.57 (2H, m), 1.25 [오버랩 시그널, 16H], 및 0.88 (3H, t, J = 6.8 Hz)에서 시그널을 나타내었다. δH 1.83, 1.64, 1.24, 1.07, 및 0.99에서의 5개의 메틸기, δH 2.76 및 2.15에서의 하나의 메틸렌기, δH 5.88, 5.85, 4.18, 2.52, 및 1.25에서의 7개의 메틴기(2개의 올레핀 포함), 및 δH 5.24 및 3.81에서의 2개의 산소화된 메틴기로 이루어지는 나머지 프로톤 시그널들은 인제놀-타입 구조 부분인 것으로 분석되었다. 이러한 분석은 13C-NMR(도 6) 및 HMQC(도 7) 분광학적 데이터의 해석을 통해 추가로 뒷받침되었다. 수집된 데이터에 기초하여, 화합물 1은 3-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀(2)과 일부 유사성이 있음을 알 수 있었다. 상기 두 화합물의 주요 차이점은 2,3-디메틸부탄산 부분의 위치인 것으로 나타났다. 화합물 1의 2,3-디메틸부타노일기의 위치는 H-5 (δH 5.24) 및 C-1' (δC 176.1) 사이의 HMBC 상관관계에 의해 C-5에 존재하는 것으로 확인되었다(도 8).
또한, 화합물 1의 구조에서 C-3의 절대 배열을 결정하기 위하여 상기 실시예 3과 같이 모셔(Mosher) 유도체(1R 및 1S)를 제조하였다. 도 9에서 보여주듯이, 차이(ΔδS-R)가 관찰되었으며, H-1 및 H-19의 포지티브 값과 H-5, H-7, 및 H-20의 네거티브 값이 C-3에서의 절대 배열이 S인 것으로 명백하게 입증하였다. 따라서, 화합물 1의 구조는 (3S)-5-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀인 것으로 확인되었다.
화합물 1의 절대 입체화학을 확인하기 위한 추가적인 실험을 NOESY를 이용하여 수행하였다. NOE 스펙트럼은 H-5, H-20, H-8, H-17, 및 H-11 사이의 상관관계를 보였으며, 이는 H-5가 β-배향인 것을 나타낸다. 따라서, 5-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀(1)은 (3S, 5R, 16R, 17S, 18R, 19S, 20R)인 것으로 확인되었다(도 10).
동일한 클로로포름 추출물로부터 분리된 8개의 추가 화합물들은 이들의 공개된 분광학적 데이터와의 비교에 근거하여, 각각 3-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일-20-O-데옥시인제놀(2), 20-O-데카노일인제놀(3), 20-O-아세틸인제놀-3-O-(2'E,4'Z) 데카디에노에이트(4), 간수이포린 A (5), 3-O-(2,3-디메틸부타노일)-13-O-도데카노일인제놀(6), 간수이닌 F(7), (20R,23E)-이우파-8,23-디엔-3b,25-디올(8), 및 이우폴(9)인 것으로 확인되었다.
화합물 1의 물리화학적 특징 및 분광학적 데이터를 하기에 나타내었다: 무색 검 (CHCl3); [α]26 D-30°(c 0.1, CHCl3); UV (EtOH) λmax nm (log ε) 210 (3.91), 282 (3.08); IR (박막) cm-1: 3346, 1732. FABMS m/z 651 [M+Na]+, 629 [M+H]+, 513 [M+H-116]+, 429 [M+H-200]+, HRFABMS m/z 651.4271 [M+Na] (calcd for C38H60O7Na, 651.4237).
아울러, 1H-NMR (CDCl3) 및 13C-NMR (CDCl3) 데이터를 하기 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure PCTKR2012007897-appb-I000007
실시예 5: 본 발명 화합물들의 IFN-γ 생산 능력 및 세포 독성 조사
IFN-γ의 검출을 위하여, 2 × 105 NK92 세포/mL를 48-웰 배양 플레이트에 접종하고, 20% FBS 및 IL-2를 함유하는 α-MEM 배지 중에서 상기 각각의 분리된 화합물과 함께 12 시간 동안 배양시켰다. 배양 상등액 중에 분비된 IFN-γ를 ELISA 방법으로 분석하였다. 흡광도를 마이크로플레이트 리더 상에서 측정하고 모든 화합물 처리 분석은 2회 반복으로 수행하였다. 화합물-처리된 NK92 세포의 세포 독성은 MTT 분석을 통해 평가하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 보여주듯이, 화합물 1-6 및 8만이 NK92 세포에서 IFN-γ 생산을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, IFN-γ 생산에 대한 각 화합물의 유효 투여량은 매우 다양하였다. 10 nM의 화합물 4 및 6이 동일한 투여량의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)와 유사하게 IFN-γ 생산에 대한 유의적인 효과를 가지는 것으로 나타났다. 화합물 3 (100 nM), 1 (1.25 μM), 5 및 8 (각각 5 μM) 역시 NK92 세포 상에 처리되었을 때 IFN-γ 생산활성을 나타내었다. 이러한 결과를 통해 본 발명에서 감수(Euphorbia kansui)의 뿌리로부터 분리한 인제난 타입의 디테르펜 화합물들이 IFN-γ 유도제로써 유용하게 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2012007897-appb-I000008
  2. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2012007897-appb-I000009
    상기 식에서,
    R1은 H이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이거나,
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나,
    R1은 H이고, R2는 OCO-(CH2)8-CH3이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
    R1은 CO(CH=CH)-(CH2)4-CH3이고, R2는 OAc이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OCO-(CH2)14-CH3이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나, 또는
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OH이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 세포의 인터페론 감마 생산 증강활성을 갖는 것인 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 바이러스 감염 질환은 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종 인플루엔자A 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV), 로타바이러스(rotavirus) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것인 조성물.
  5. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 바이러스 감염 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2012007897-appb-I000010
    상기 식에서,
    R1은 H이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이거나,
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나,
    R1은 H이고, R2는 OCO-(CH2)8-CH3이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
    R1은 CO(CH=CH)-(CH2)4-CH3이고, R2는 OAc이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OCO-(CH2)14-CH3이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나, 또는
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OH이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이다.
  6. 제5항에 있어서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 인터페론 감마 생산 증강활성을 갖는 것인 건강기능식품.
  7. 제5항에 있어서, 상기 바이러스 감염 질환은 인플루엔자바이러스(influenza virus), 신종 인플루엔자A 바이러스(Influenza A virus subtype H1N1), 조류인플루엔자바이러스(avian influenza virus), 리노바이러스(rhinovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 코로나바이러스(coronavirus), 파라인플루엔자바이러스(parainfluenza virus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 포진 바이러스(Herpesvirus, HSV), 후천성 면역결핍 증후군 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV), 로타바이러스(rotavirus) 및 간염바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 바이러스에 의해 감염되는 질환인 것인 건강기능식품.
  8. 하기 화학식 2로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 인터페론 감마 생산 증강용 조성물:
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2012007897-appb-I000011
    상기 식에서,
    R1은 H이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이거나,
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 H이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나,
    R1은 H이고, R2는 OCO-(CH2)8-CH3이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
    R1은 CO(CH=CH)-(CH2)4-CH3이고, R2는 OAc이며, R3는 H이고, R4는 H이거나,
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OCO-(CH2)14-CH3이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이거나, 또는
    R1은 CO-CH(CH3)-CH(CH3)2이고, R2는 OH이며, R3는 OCO-(CH2)10-CH3이고, R4는 H이다.
  9. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 자연살해세포(Natural killer cell)의 인터페론 감마 생산을 증가시키는 것인 조성물.
  10. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 치료 유효량으로 바이러스 감염질환의 발병 또는 발병가능성이 있는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료방법.
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