WO2013058388A1 - 抗ｇａｐ４３抗体 - Google Patents

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WO2013058388A1
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gap43
antibody
phosphorylated
residue
threonine residue
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恒成 武内
道弘 五十嵐
素広 野住
麻実 河嵜
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国立大学法人新潟大学
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/14—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material phosphorylation

Definitions

  • the present invention relates to an antibody capable of specifically detecting a growth cone and use thereof.
  • a step (1) in which a nerve cell is generated or regenerated and a step (2) in which the generated or regenerated nerve cell correctly extends an axon to correctly form a synapse are necessary.
  • a step (2) in which the generated or regenerated nerve cell correctly extends an axon to correctly form a synapse are necessary.
  • a growth cone At the tip of the axon of the generated and regenerated nerve cell, there is a fan-like structure with high mobility called a growth cone.
  • This growth cone has a central region and a peripheral region including a leaf-like and a thread-like temporary foot. The growth cone properly guides the axon for the formation of synapses, while extending or retracting the filopodia.
  • GAP43 Growth associated protein 43
  • Neuromodulin is abundant in the growth cone, and plays an important role in the extension of the filamentous temporary foot and the branching of neurites.
  • GAP43 is phosphorylated by protein kinase C while dephosphorylated by calcineurin.
  • Non-phosphorylated GAP43 functions as an actin cap protein and reduces the elongation of the filamentous temporary foot.
  • phosphorylation of the 41st serine residue (S41) of mouse GAP43 is considered to be important for the stabilization of actin for the extension of the filamentous pseudopodia (for example, Denny, JB., Curr Neuropharmacol., Vol. 4 (12): pp. 293-304 (2006)).
  • An object of the present invention is to provide an antibody capable of specifically detecting a growth cone and an immunological analysis method using the antibody.
  • the present inventors analyzed the growth cone phosphorylation proteomics by analyzing the 89th threonine residue (T89), 96th serine residue (S96), and 172nd threonine residue of mouse GAP43 ( It was newly found that while T172) is significantly phosphorylated, S41 is hardly phosphorylated. This finding indicates that phosphorylation of T89, S96 and T172 is important in axonal elongation. According to the present invention, it is possible to quantitatively evaluate the generation and / or regeneration of nerves by specifically detecting GAP43 phosphorylated on T89, S96 or T172.
  • the present invention can distinguish the non-phosphorylated 89th threonine residue (T89) of mouse GAP43 shown in SEQ ID NO: 13 from the phosphorylated 89th threonine residue (pT89).
  • An anti-GAP43 antibody capable of specifically detecting cones is provided.
  • the present invention can distinguish between the 96th serine residue (S96) that is not phosphorylated in mouse GAP43 shown in SEQ ID NO: 13 and the 96th serine residue (pS96) that is phosphorylated.
  • An anti-GAP43 antibody capable of specifically detecting cones is provided.
  • the present invention can distinguish the unphosphorylated 172nd threonine residue (T172) and the phosphorylated 172nd threonine residue (pT172) of mouse GAP43 shown in SEQ ID NO: 13, An anti-GAP43 antibody capable of specifically detecting cones is provided.
  • the present invention comprises (1) preparing at least one anti-GAP43 antibody selected from the group consisting of the above-described three antibodies of the present invention and a test sample, and (2) the anti-GAP43 antibody, There is provided a method for immunological analysis of GAP43, comprising contacting the test sample, and (3) detecting or quantifying the anti-GAP43 antibody bound to the test sample.
  • the immunological analysis method of the present invention may be used to evaluate nerve development and / or regeneration.
  • the detection or quantification of the anti-GAP43 antibody bound to the test sample is a group consisting of ELISA, Western blot, surface plasmon resonance, latex agglutination, and immunohistochemistry In some cases, at least one method selected from the above may be used.
  • Each of the three anti-GAP43 antibodies of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the present invention provides a hybridoma that produces any one of the above-described three monoclonal antibodies of the present invention.
  • the present invention provides a kit for carrying out the immunological analysis method of the present invention.
  • the kit may contain at least one anti-GAP43 antibody selected from the group consisting of the above-mentioned three kinds of antibodies of the present invention and a reagent for detecting or quantifying the anti-GAP43 antibody.
  • the present invention provides a reagent for detecting a growth cone comprising at least one anti-GAP43 antibody selected from the group consisting of the above-mentioned three antibodies of the present invention.
  • the present invention provides the use of at least one anti-GAP43 antibody selected from the group consisting of the above three antibodies of the present invention in a method for detecting growth cones.
  • the term “process” means not only an independent process but also the term “process” as long as the intended effect of this process is achieved even when it cannot be clearly distinguished from other processes.
  • a numerical range indicated by using “to” indicates a range including the numerical values described before and after “to” as the minimum value and the maximum value, respectively.
  • the amount of each component in the composition is such that when there are a plurality of substances corresponding to each component in the composition, the plurality of substances present in the composition unless otherwise specified. It means the total amount.
  • an amino acid is represented by a compound name such as serine or threonine, a conventional three-letter code such as Ser or Thr, or a conventional single-character code such as S or T.
  • non-phosphorylated polypeptide refers to a polypeptide that includes only non-phosphorylated amino acid residues
  • phosphorylated polypeptide refers to an amino acid residue that is phosphorylated.
  • a polypeptide comprising at least one group is meant.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 1 is CEGDGSATDADAPA.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 2 is CDAAPATSPKAEE.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 3 is CVTDAAAATTPAAED.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 4 is CTDAAAATTPAAED.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 5 is CKATTDNSPSSKA.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 6 is CTTDNSPSSKAEDG.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 7 is CVTDAAAATTPAAED.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 8 is CKKEGDGSATTDA.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 9 is CTDAAPATSPKAE.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 10 is CPKAEEPSKAGDA.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 11 is CSEEKAGGSAETES.
  • the amino acid sequence of the polypeptide of SEQ ID NO: 12 is CTETAESSQAEEE.
  • the amino acid sequence of GAP43 of SEQ ID NO: 13 is that of GenBank Accession No. AAH28288.
  • the western blot photograph which shows the result of the cross-reaction experiment of the anti- GAP43 antibody with respect to a rat growth cone fraction (GCP).
  • the western blot photograph which shows the result of the expression detection experiment of the fusion protein of mouse
  • the western blot photograph which shows the result of the cross-reaction experiment (1) of the anti- GAP43 antibody with respect to various samples.
  • the western blot photograph which shows the result of the cross-reaction experiment (2) of the anti- GAP43 antibody with respect to various samples.
  • Fluorescence micrographs of rat cerebral cortical neurons stained immunocytochemically with various anti-GAP43 antibodies Fluorescence micrograph of rat cerebral cortical neurons stained immunocytochemically with anti-GAP43 monoclonal antibody and anti-GAP43 pS96 antibody. Fluorescence micrograph of rat spinal dorsal root ganglion cells immunocytochemically stained with anti-GAP43 pS96 antibody. Fluorescence micrograph of spinal dorsal root ganglion injury site immunohistochemically stained with anti-GAP43 pS96 antibody and anti-neurofilament monoclonal antibody. Fluorescence micrograph of spinal cord injury site immunohistochemically stained with anti-GAP43 pS96 antibody and anti-GAP43 monoclonal antibody.
  • Photomicrograph of spinal cord injury site 7 days after spinal cord injury stained with anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 pS41 antibody and anti-GAP43 monoclonal antibody Developmental fetal brain immunohistochemically stained with anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 pS41 antibody and anti-GAP43 monoclonal antibody: thalamic cerebral cortex tract on embryonic day 15; B: embryonic stage 12 Photomicrograph of the day's olfactory nerve. The western blot photograph which shows the result of the cross-reaction experiment of the anti- GAP43 antibody with respect to the rhesus monkey.
  • the antibodies of the present invention are as follows: The 89th threonine residue (T89) which is not phosphorylated in mouse GAP43 shown in SEQ ID NO: 13 can be distinguished from the 89th threonine residue (pT89) which is phosphorylated.
  • An anti-GAP43 antibody detectable to The 96th serine residue (S96) that is not phosphorylated in mouse GAP43 shown in SEQ ID NO: 13 can be distinguished from the 96th serine residue (pS96) that is phosphorylated, and the growth cone is specific.
  • the immunological analysis method of the present invention comprises (1) preparing at least one anti-GAP43 antibody selected from the group consisting of the above-described three antibodies of the present invention, and a test sample; 2) An immunological analysis method for GAP43, comprising contacting the anti-GAP43 antibody with the test sample; and (3) detecting or quantifying the anti-GAP43 antibody bound to the test sample.
  • the kit of the present invention is for carrying out the immunological analysis method, or contains at least one anti-GAP43 antibody selected from the group consisting of the above-mentioned three antibodies of the present invention, A reagent for detecting or quantifying the anti-GAP43 antibody may be included.
  • the reagent for detecting a growth cone of the present invention comprises at least one anti-GAP43 antibody selected from the group consisting of the above-mentioned three antibodies of the present invention.
  • these three types of anti-GAP43 antibodies are T86, S96.
  • nerve generation and / or regeneration can be evaluated based on the binding state of the anti-GAP43 antibody of the present invention. The present invention will be described below.
  • the polypeptide herein may be a polypeptide produced by a biological procedure.
  • the biological procedure comprises preparing a polynucleotide comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the polypeptide by expressing it using an inanimate expression system or an expression system using a host organism and an expression vector.
  • the host organisms include prokaryotes such as E. coli and Bacillus subtilis and eukaryotes such as yeast, fungi, plants and animals.
  • the expression system using the host organism and the expression vector may be part of an organism such as a cell or tissue, or the entire individual of the organism.
  • the polypeptide herein may be a synthetic polypeptide made by a chemical procedure using the Fmoc method, the Boc method, or the like.
  • the polypeptide is preferably used in a purified state.
  • the amino acid sequence of the polypeptide may include a part of the amino acid sequence of mouse GAP43.
  • a specific serine residue or threonine residue may be phosphorylated.
  • the polypeptide may be used as a complex bound to a carrier polymer to produce the antibody of the present invention and / or to carry out the immunological analysis method of the present invention.
  • carrier polymer refers to any polymer that can impart immunogenicity to a hapten, and may be a biopolymer such as a protein or polysaccharide, or a synthetic polymer such as polylysine. Absent. Proteins used in the carrier polymer of the complex include, but are not limited to, bovine serum albumin, chicken ovalbumin, and mussel hemocyanin.
  • a complex of the carrier polymer and a polypeptide containing any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 12 and phosphorylated on a specific serine residue or threonine residue is any functional group of amino acid and carrier It may be bonded with a polymer.
  • the amino group or carboxyl group of an amino acid may be covalently bonded to any side chain of the carrier polymer via an appropriate crosslinking agent.
  • the cross-linking agents include m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), glutaraldehyde (GA), N-hydroxysuccinimide (NHS) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride Including (EDC), but not limited to.
  • MBS m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester
  • GA glutaraldehyde
  • NHS N-hydroxysuccinimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride Including
  • a complex of the carrier polymer and a polypeptide containing any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 14 and having a specific serine residue or threonine residue phosphorylated is a phosphorylated specific serine
  • Various protections, modifications, and the like may be
  • Each of the anti-GAP43 antibodies of the present invention may be selected from the group consisting of a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, an antigen-binding fragment of the antibody, and a recombinant antibody or a chimeric antibody containing the antigen-binding fragment.
  • the anti-GAP43 antibody and hybridoma of the present invention may be prepared by various methods known to those skilled in the art. See, for example, Current Protocols in Immunology (edited by John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.).
  • the polypeptide or the complex is any animal of mammals (eg, mouse, rat, rabbit, sheep or goat) or birds (eg, chicken) in order to collect antiserum containing the anti-GAP43 antibody of the present invention.
  • the host is injected as an immunogen.
  • the immunogen may elicit an excellent immune response when linked to the carrier polymer.
  • the immunogen is preferably injected into the animal host according to a predetermined schedule incorporating one or more booster immunizations.
  • the immunogen may be injected into the animal host in a mixture with complete or incomplete Freund's adjuvant or other immunopotentiators.
  • the anti-GAP43 antibody of the present invention may be purified from antisera by affinity chromatography using the polypeptide bound to a suitable solid support.
  • the hybridoma producing the anti-GAP43 antibody of the present invention is prepared by fusion of spleen cells prepared from an immunized mouse with, for example, myeloma cells derived from the same or different animals as the mouse.
  • the spleen cells and myeloma cells are mixed with a nonionic surfactant for several minutes and then seeded at a low concentration in a selective medium that supports hybridoma growth but does not support myeloma cell growth.
  • the selection technique preferably uses HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) selection. Hybridoma colonies are usually observed after about 1 to 2 weeks. A single colony is selected and its culture supernatant is tested for binding activity against the polypeptide.
  • a hybridoma clone that stably produces a large amount of highly reactive and specific antibody is selected.
  • Monoclonal antibodies may be isolated from the supernatants of colonies of cell lines derived from selected growing hybridoma clones.
  • various techniques may be used to improve yield, such as injecting the hybridoma into the peritoneal cavity of a suitable vertebrate host such as a mouse.
  • the monoclonal antibody may be purified by affinity chromatography using the polypeptide bound to a suitable solid support.
  • antigen-binding fragment of an antibody refers to a portion of an antibody that participates in antigen binding.
  • the antigen binding site is formed by amino acid residues in the variable (V) region at the N-terminus of the heavy (H) chain and light (L) chain.
  • the antigen-binding fragment includes, in addition to an Fab fragment or F (ab ′) 2 fragment obtained by degrading an intact polyclonal antibody or a monoclonal antibody with the proteolytic enzyme papain or pepsin, respectively, and the antigen recognition ability and binding ability of a natural antibody molecule Fv fragments containing non-covalent V H and V L region heterodimers containing antigen binding sites that retain most of the.
  • the recombinant antibody may be prepared by expression cloning of antibody genes including transformation into a suitable bacterial host or transfection into a suitable mammalian cell host.
  • the chimeric antibody comprises a specific serine residue and threonine residue that are not phosphorylated in GAP43 and a specific serine that is phosphorylated in the anti-GAP43 antibody of the present invention.
  • the fusion protein is supported by the constant domain of a homologous or heterologous antibody so that the residue and threonine residue can be distinguished.
  • the specific serine residue and threonine residue are the 86th serine residue (S86), 89th threonine residue (T89), 95th threonine residue (T95), 96th mouse GAP43.
  • the chimeric antibody includes a single chain variable region antibody (scFv) comprising an antibody heavy chain variable region (V H ) operably linked to an antibody light chain variable region (V L ), a camelid family (Camelidae, camel, dromedary, including animals including llamas) is a camel heavy chain antibodies (HCAb) or a heavy chain variable domain (V H D) are a class of IgG no light chain produced.
  • scFv single chain variable region antibody
  • V H antibody heavy chain variable region
  • V L antibody light chain variable region
  • HCAb camel heavy chain antibodies
  • V H D heavy chain variable domain
  • the recombinant antibody can be prepared in large quantities using prokaryotic and eukaryotic gene expression systems.
  • the step of “preparing the anti-GAP43 antibody of the present invention” in the immunological analysis method of the present invention includes obtaining the anti-GAP43 antibody of the present invention or preparing the anti-GAP43 antibody of the present invention.
  • Examples of the method for obtaining the anti-GAP43 antibody of the present invention include obtaining the anti-GAP43 antibody of the present invention that has already been prepared from a specific supplier free of charge or for a fee.
  • the method of preparing the anti-GAP43 antibody of the present invention may be performed by various methods known to those skilled in the art described above.
  • the step of “preparing a test sample” in the immunological analysis method of the present invention is applicable to obtaining a test sample applicable to the immunological analysis method of the present invention, or applicable to the immunological analysis method of the present invention.
  • Preparing a test sample examples include obtaining a test sample that has already been prepared from a specific source at no charge or for a fee.
  • a method for preparing a test sample may be performed by collection from a living body, cell culture, or the like.
  • the test sample includes, but is not limited to, collected cells, tissues and organs, cultured cells, cell lysates, and synthetic polypeptides.
  • the test sample generally contains GAP43, a variant or polypeptide thereof, or a fusion protein containing at least a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the fusion protein may be a fusion protein of GAP43, a variant or polypeptide thereof containing at least a portion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and a tag protein or tag peptide.
  • the tag proteins include, but are not limited to, green fluorescent protein (EGFP), yellow fluorescent protein (EYFP), and cyan fluorescent protein (ECFP).
  • the tag peptide includes, but is not limited to, His tag, Myc tag, HA tag, and FLAG tag.
  • GAP43 a variant or polypeptide thereof containing at least a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and the fusion protein may be phosphorylated.
  • the biological species of the test sample can be identified by the anti-GAP43 antibody of the present invention from a specific serine residue or threonine residue that is not phosphorylated and a specific serine residue or threonine residue that is phosphorylated. Conditions include, but are not limited to, humans, monkeys, mice and rats.
  • the specific serine residue and threonine residue are the 86th serine residue (S86), 89th threonine residue (T89), 95th threonine residue (T95), 96th mouse GAP43.
  • the step of “contacting the anti-GAP43 antibody and the test sample” in the immunological analysis method of the present invention may be performed using a solid support on which the test sample is fixed.
  • the solid support is not particularly limited as long as it can be fixed without losing the immunogenicity of the test sample, and solids of various materials or shapes can be used.
  • the solid support may be fabricated from materials including but not limited to polymeric materials, glass, ceramics, gels, membranes, natural fibers, silicones, metals and composites thereof.
  • the solid support includes a solid support having a shape suitable for handling by an automated analysis system, such as a multi-well plate, a microtiter plate, a multi-array chip, a sensor chip or a latex agglomeration microparticle.
  • a plurality of anti-GAP43 antibodies may be used in combination.
  • the immunological analysis method of the present invention may include a step of bringing the test sample into contact with another antibody other than the anti-GAP43 antibody of the present invention.
  • Such other antibodies include, but are not limited to, commercially available anti- ⁇ -actin antibodies and anti-neurofilament antibodies.
  • the step of “detecting or quantifying the anti-GAP43 antibody bound to the test sample” in the immunological analysis method of the present invention is detected or quantified by a label such as an anti-GAP43 antibody or a secondary antibody bound to the test sample.
  • the anti-GAP43 antibody may be labeled with a low molecular ligand such as biotin, an enzyme, a radioisotope, a dye, a fluorescent dye, or the like.
  • a low molecular ligand such as biotin, an enzyme, a radioisotope, a dye, a fluorescent dye, or the like.
  • a secondary antibody against the anti-GAP43 antibody or a biopolymer such as avidin that specifically binds to a low molecular ligand such as biotin is labeled with an enzyme, radioisotope, dye, fluorescent dye, etc.
  • the enzyme is peroxidase (POD), beta-galactosidase ( ⁇ -Gal), alkaline phosphatase (ALP) or the like.
  • the enzyme is generally used in combination with an appropriate substrate.
  • the detecting step may include a step of exposing to an imaging plate, a step of photographing with a CCD camera, or a step of observing with a microscope.
  • the step of quantifying includes a step of preparing a calibration curve in which the amount of anti-GAP43 antibody bound to a test sample having a known concentration or amount is plotted, and a test sample having an unknown concentration or amount using the calibration curve. And calculating the concentration or amount of the test sample from the amount of the anti-GAP43 antibody bound to.
  • the step of detecting or quantifying may include a step of removing the anti-GAP43 antibody and other antibodies that have not bound to the test sample by washing.
  • the reference value can be calculated by statistical processing well known to those skilled in the art.
  • the reference value may be determined as an average value of the amount of anti-GAP43 antibody bound to a test sample prepared from a particular population.
  • the population used in this case may be a normal test animal or a test animal in which nerves have been regenerated. It is preferable that the test animal of the said population and the test animal to be evaluated have the same species, age and sex.
  • the step of “detecting or quantifying the anti-GAP43 antibody bound to the test sample” in the immunological analysis method of the present invention may be carried out by various techniques known to those skilled in the art.
  • the method includes, but is not limited to, an ELISA method, a Western blot method, a surface plasmon resonance method, a latex agglutination method, an immunohistochemistry method, or a combination of two or more thereof.
  • the surface plasmon resonance (SPR) method uses an optical phenomenon to fine-tune a specific interaction on a solid support between a molecule immobilized on the solid support and a molecule that is an interaction partner. A method of measuring as a mass change.
  • a system for carrying out the SPR method for example, a BIAcore system (BIAcore, GE Healthcare Japan Co., Ltd.) can be used.
  • the latex agglutination method uses a spectrophotometer to measure the degree of agglomeration reaction of fine particles according to the amount of antibody bound to fine particles or nanoparticles such as latex as a solid support as the change in turbidity. The technique to do.
  • the kit for carrying out the immunological analysis method of the present invention may contain a control sample having a known concentration or amount for preparing a calibration curve in addition to the anti-GAP43 antibody of the present invention.
  • the control sample may be GAP43, a mutant or polypeptide thereof, or a fusion protein containing at least a part of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 and phosphorylating a specific serine residue or threonine residue.
  • the specific serine residue and threonine residue are the 86th serine residue (S86), 89th threonine residue (T89), 95th threonine residue (T95), 96th mouse GAP43.
  • the kit for carrying out the immunological analysis method of the present invention may further contain a reagent for detecting or quantifying the anti-GAP43 antibody of the present invention.
  • the reagent examples include a reagent appropriately selected according to the method for detecting or quantifying the anti-GAP43 antibody, and examples thereof include a buffer solution such as a phosphate buffer as a diluent, and a color former. .
  • the present invention provides an immunological analyzer for GAP43, which is configured to execute the immunological analysis method.
  • the apparatus includes a detection unit such as an optical microscope, a fluorescence microscope, an electron microscope, a CCD camera, a measurement unit such as a spectrophotometer, a fluorescence spectrophotometer, a surface plasmon resonance measuring instrument, a reagent, a cleaning liquid and / or a sample injection and A dispenser unit for removal, a multi-well plate for ELISA, a robot arm unit for handling a sensor chip for surface plasmon resonance, a control unit for controlling them, and the like are included.
  • a detection unit such as an optical microscope, a fluorescence microscope, an electron microscope, a CCD camera
  • a measurement unit such as a spectrophotometer, a fluorescence spectrophotometer, a surface plasmon resonance measuring instrument, a reagent, a cleaning liquid and / or a sample injection
  • a dispenser unit for removal for removal,
  • the phosphorylated polypeptide No. 3 contains the amino acid sequence of 14 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 3, and the ninth threonine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pT172”). Met.
  • the phosphorylated polypeptide No. 4 includes the amino acid sequence of 13 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 4, and a polypeptide in which the eighth threonine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pT172 (# 2)”). ").
  • the phosphorylated polypeptide No. 5 includes the amino acid sequence of 13 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 5, and the eighth serine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pS142”). Met.
  • the phosphorylated polypeptide No. 6 includes the amino acid sequence of 14 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 6, and the ninth serine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pS145”). Met.
  • the phosphorylated polypeptide No. 7 includes the amino acid sequence of 14 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 7, and the eighth threonine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pT171”). Met.
  • the phosphorylated polypeptide No. 8 includes the amino acid sequence of 13 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 8, and the eighth serine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pS86”). Met.
  • the phosphorylated polypeptide No. 9 includes the amino acid sequence of 13 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 9, and the eighth threonine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pT95”). Met.
  • the phosphorylated polypeptide No. 10 includes the amino acid sequence of 13 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 10, and the eighth serine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pS103”). Met.
  • the phosphorylated polypeptide No. 11 includes the amino acid sequence of 13 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 11, and the eighth serine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pS128”). Met.
  • the phosphorylated polypeptide No. 12 includes the amino acid sequence of 13 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 12, and the eighth serine residue is phosphorylated (hereinafter referred to as “GAP43 pS192”). Met.
  • the antiserum was affinity purified by methods well known to those skilled in the art. Briefly, the antiserum was desalted with a PD-10 column (catalog number 54805, Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) and mixed with a carrier (Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) on which the phosphorylated polypeptide was immobilized. It was mixed with TOYOPEARL AF-Tresyl-6504B carrier (catalog number 14471, Tosoh Corporation) on which the phosphorylated polypeptide was immobilized. After mixing, the precipitated carrier was washed with phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PBS”).
  • PBS phosphate buffered saline
  • the antibody was eluted with 0.1 M glycine hydrochloride buffer (pH 2.5) and neutralized with 1 M Tris hydrochloride buffer (pH 8.0).
  • the antibody was prepared in PBS / 50% glycerol / 15 ppm procrine solution and stored at ⁇ 20 ° C.
  • GAP43 pT89, GAP43 pS96, GAP43 pT172, GAP43 pT172 (# 2), GAP43 pS142, GAP43 pS145, GAP43 pT171, GAP43 pS86, GAP43 pT95, GAP43 pS103, GAP43 pS43, GAP43 pS43, GAP43 pS43 Anti-GAP43 pT89 antibody, anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody, anti-GAP43 pS142 antibody, anti-GAP43 pS145 antibody, anti-GAP43 pT171 antibody, anti-GAP43 pS86 antibody, anti-GAP43 pT95 antibody, anti-GAP43 pS103 antibody, anti-GAP43 pS128 antibody, and anti-G That P43 pS192 antibody.
  • Anti-GAP43 pS86 antibody (0.7 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pT89 antibody (0.35 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pT95 antibody (0.09 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pS96 antibody (0.5 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pS103 antibody (0.6 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pS128 antibody (1.26 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pS142 antibody (1.37 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pS145 antibody (0.75 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pT171 antibody (0.78 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pT172 antibody (0.26 ⁇ g / mL), anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody (0.37 ⁇ g / mL), and anti-GAP43 pS192
  • Anti-GAP43 pT89 antibody, anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody, anti-GAP43 pS142 antibody, anti-GAP43 pS145 Antibody, anti-GAP43 pT171 antibody, anti-GAP43 pS86 antibody, anti-GAP43 pT95 antibody, anti-GAP43 pS103 antibody, anti-GAP43 pS128 antibody and anti-GAP43 pS192 antibody are respectively GAP43 pT89, GAP43 pS96, GAP43 pT172P, GAP43 pT172P 2), GAP43 pS142, GAP43 pS145, GAP43 pT171, GAP43 pS86, GAP43 pT95, GAP43 pS103, GAP43 p 128, and, while having a
  • FIG. 1 is a western blot photograph showing the results of an anti-GAP43 antibody cross-reaction experiment with a sample derived from rat growth cone particles (GCP).
  • GCP rat growth cone particles
  • Anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 pT89 antibody, anti-GAP43 pS145 antibody, anti-GAP43 pT171 antibody, anti-GAP43 pS142 antibody, and anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody are specific crosslinks for GCP. Has reactivity.
  • the anti-GAP43 pS96 antibody, the anti-GAP43 pT172 antibody, and the anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody had particularly strong cross-reactivity.
  • the anti-GAP43 pS86 antibody, anti-GAP43 pT95 antibody, anti-GAP43 pS103 antibody, anti-GAP43 pS128 antibody, and anti-GAP43 pS192 antibody did not have specific cross-reactivity with GCP (data not shown) .)
  • anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 pT89 antibody, anti-GAP43 pS145 antibody, anti-GAP43 pT171 antibody, anti-GAP43 pS142 antibody, and anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody, respectively. was shown to have specific cross-reactivity to GCP. Therefore, it was suggested that the antibody can discriminate between GAP43 in which a specific serine residue or threonine residue is not phosphorylated and GAP43 in which a specific serine residue or threonine residue is phosphorylated.
  • a fusion protein (hereinafter referred to as “EGFP-GAP43 S96A”) with a variant in which the alanine residue (A) is substituted from the group (S), or (3) the 96th amino acid residue of EGFP and GAP43 Either a fusion protein with a mutant in which a serine residue (S) is replaced with an aspartic acid residue (D) (hereinafter referred to as “EGFP-GAP43 S96D”), or (4) EGFP and the 172nd amino acid of GAP43 A fusion protein (hereinafter referred to as “EGFP-GAP”) in which a residue is substituted from a threonine residue (T) to an alanine residue (A) 3 T172A ”) or (5) a fusion protein of EGFP and a mutant in which the 172nd amino acid residue of GAP43 is substituted from a threonine residue (T) to an aspartic acid residue (D) (hereinafter referred to as“ 3T
  • FLAG-GAP43 S96A FLAG and the 96th amino acid of GAP43 A fusion protein in which a residue is substituted from a serine residue (S) to an alanine residue (A), or (8) FLAG and the 96th position of GAP43 A fusion protein (hereinafter referred to as “FLAG”) with a mutant in which the amino acid residue of is substituted with a serine residue (S) aspartic acid residue (D) -GAP43 S96D ") or (9) a fusion protein of FLAG and a mutant in which the 172nd amino acid residue of GAP43 is replaced with an alanine residue (A) from a threonine residue (T) (hereinafter referred to as" GAP43 S96D "
  • FLAG-GAP43 T172A (“FLAG-GAP43 T172A”)) or (10) Fusion protein of FLAG and a mutant in which the 172nd amino acid residue of GAP43 is substituted from a threonine residue (T) to an aspartic acid residue (D) (Hereinafter referred to as “FLAG-GAP43 T172D”).
  • a cell lysate containing either maxGFP or the fusion protein was prepared from COS-7 cells transfected with the expression vector.
  • a cell lysate prepared from PC12D cells (hereinafter referred to as “PC12D”) prepared from GCP and PC12D cells which are undifferentiated neurons, and a cell lysate prepared from PC12D cells stimulated with nerve growth factor (NGF).
  • PC12D PC12D cells
  • NGF nerve growth factor
  • PC12D / NGF (+) PC12D / NGF (+)
  • COS-7 cell lysate prepared from untransfected COS-7 cells
  • a commercially available anti-GAP43 monoclonal antibody (catalog number G9264, Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.)
  • the anti-GAP43 antibody prepared in Example 1 was used as the primary antibody.
  • a peroxidase-labeled sheep anti-mouse IgG antibody (catalog number NA931, GE Healthcare Japan, Inc.) was used.
  • FIG. 2 is a western blot photograph showing the results of mouse GAP43 fusion protein expression detection experiments. Expression of EGFP-GAP43 S96A, EGFP-GAP43 S96D, EGFP-GAP43 T172A, and EGFP-GAP43 T172D in COS-7 cells was confirmed.
  • FIG. 3 is a Western blot photograph showing the results of the cross-reaction experiment (1) of anti-GAP43 antibody against various samples.
  • the anti-GAP43 monoclonal antibody was cross-reactive with GCP, EGFP-GAP43 S96A, EGFP-GAP43 S96D, EGFP-GAP43 T172A, and EGFP-GAP43 T172D, while PC12D, COS-7, and maxGFP. There was no cross-reactivity.
  • FIG. 4 is a western blot photograph showing the results of an anti-GAP43 antibody cross-reaction experiment (2) for various samples.
  • the anti-GAP43 monoclonal antibody was cross-reactive with GCP, EGFP-GAP43, and EGFP-GAP43 S96A.
  • the anti-GAP43 pS96 antibody had cross-reactivity with GCP and EGFP-GAP43, but did not have cross-reactivity with EGFP-GAP43 S96A.
  • the anti-GAP43 monoclonal antibody and the anti-GAP43 pS96 antibody had cross-reactivity with PC12D / NGF (+) (data not shown).
  • FIG. 5 is a western blot photograph showing the results of cross-reaction experiments of anti-GAP43 pT172 antibody on various samples.
  • the anti-GAP43 pT172 antibody has cross-reactivity with FLAG-GAP43, FLAG-GAP43 S96A and FLAG-GAP43 S96D, while it has cross-reactivity with FLAG-GAP43 T172A and FLAG-GAP43 T172D. There wasn't.
  • the anti-GAP43 monoclonal antibody was found to have GAP43 in which the 96th serine residue or 172nd threonine residue is not phosphorylated and the 96th serine residue or 172nd It was shown that threonine residues cannot be distinguished from phosphorylated GAP43. In contrast, it was shown that the anti-GAP43 pS96 antibody can discriminate between GAP43 in which the 96th serine residue is not phosphorylated and GAP43 in which the 96th serine residue is phosphorylated.
  • the anti-GAP43 pT172 antibody can discriminate between GAP43 in which the 172nd threonine residue is not phosphorylated and GAP43 in which the 172nd threonine residue is phosphorylated.
  • each of the anti-GAP43 pT89 antibody, anti-GAP43 pS145 antibody, anti-GAP43 pT171 antibody, anti-GAP43 pS142 antibody, and anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody has GCP-specific cross-reactivity, the 89th The threonine residue, the 145th serine residue, the 171st threonine residue, the 142nd serine residue, or the 172nd threonine residue which is not phosphorylated, and the 89th It is suggested that the threonine residue, the 145th serine residue, the 171st threonine residue, the 142nd serine residue, or the 172nd threonine residue can be distinguished from phosphorylated GAP43. It was done.
  • the cover glass was placed in a culture dish (catalog number 353002, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.), and the cells were B27 supplement (catalog number 0050129SA, Invitrogen, Life Technologies Japan Co., Ltd.), glutamine-penicillin-streptomycin mixed solution (Neurobasal Medium, Catalog No. 21103-049, Invitrogen, Life Technologies Japan, Inc.) containing (Catalog No. G6784, Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) at 37 ° C., 5% CO 2 and saturated steam atmosphere Incubated for 3 days.
  • DRG rat dorsal root ganglion
  • the cover glass was placed in a culture dish (catalog number 353002, Nippon Becton Dickinson Co., Ltd.), and the cells were B27 supplement (catalog number 0050129SA, Invitrogen, Life Technologies Japan Co., Ltd.), glutamine-penicillin-streptomycin mixed solution (Neurobasal Medium, Catalog No. 21103-049, Invitrogen, Life Technologies Japan, Inc.) containing (Catalog No. G6784, Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) at 37 ° C., 5% CO 2 and saturated steam atmosphere Incubated for 3 days.
  • Example 2 For staining, 12 types of anti-GAP43 antibodies prepared in Example 1, as a primary antibody, a commercially available anti-phosphorylated GAP43pS41 polyclonal antibody (catalog number G8043, Sigma-Aldrich Japan), anti-GAP43 monoclonal antibody, and anti- ⁇ -Tubulin monoclonal antibody (Cat. No. T9026, Sigma Aldrich Japan Co., Ltd.) was used at a dilution of 100 to 500 times. As secondary antibodies, Alexa488 fluorescently labeled goat anti-rabbit IgG antibody (Catalog No. A11034, Invitrogen, Life Technologies Japan) and Alexa568 fluorescently labeled goat anti-mouse antibody (Catalog No.
  • the upper left is an anti-GAP43S41 antibody
  • the middle is an anti-microtubule antibody that recognizes the entire growth cone and axon (microtubulin antibody (catalog number MAB3408, Chemicon))
  • the right shows its merged image
  • the lower The left shows an anti-GAP43pT171 antibody
  • the center shows an anti-microtubule antibody
  • the right shows its merged image.
  • Merge means superposition of double-stained images of a phosphorylated antibody and another antibody, respectively.
  • the upper part of FIG. 8 shows the results using the anti-GAP43pS96 antibody
  • the lower part shows the results using the anti-GAP43pS171 antibody
  • the left side is a phase contrast microscopic image
  • the right side is a fluorescent microscopic image.
  • FIG. 6 is a fluorescence micrograph of rat cerebral cortical neurons stained immunocytochemically with various anti-GAP43 antibodies.
  • the anti-GAP43pS41 polyclonal antibody and the anti-GAP43 pT171 antibody reacted with the whole nerve cells (see the lower part of FIG. 6).
  • the anti-GAP43 pS96 antibody, the anti-GAP43 pT172 antibody, and the anti-GAP43 pT89 antibody reacted specifically in the growth cone located at the tip of the nerve cell, particularly in the central region.
  • FIG. 7 is a fluorescence micrograph of rat cerebral cortical neurons stained immunocytochemically with anti-GAP43 monoclonal antibody and anti-GAP43 pS96 antibody. The anti-GAP43 monoclonal antibody reacted with the whole nerve cells including dendrites.
  • FIG. 8 is a fluorescence micrograph of rat spinal dorsal root ganglion cells immunocytochemically stained with anti-GAP43 pS96 antibody. The anti-GAP43 pS96 antibody reacted specifically in the central region of the ganglion cell growth cone.
  • the 41st is a serine residue
  • the 89th is a threonine residue
  • the 96th is a serine residue
  • the 171st is a threonine residue
  • the 172nd is a threonine residue. It is a group.
  • the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 to 12 are conserved in rat GAP43.
  • the phosphorylated GAP43-specific antibody of this example was predicted to react not only with mouse GAP43 but also with rat GAP43. This prediction was confirmed from the experimental results of this example.
  • the anti-GAP43 pS96 antibody, the anti-GAP43 pT172 antibody, and the anti-GAP43 pT89 antibody can specifically detect the growth cone as compared with the anti-GAP43 monoclonal antibody.
  • GAP43 phosphorylated at the 89th threonine residue, the 96th serine residue, or the 172nd threonine residue is localized in the growth cone of the nerve cell.
  • GAP43 in which the 172nd threonine residue was phosphorylated was localized in the growth cone, and GAP43 in which the 171st threonine residue was phosphorylated was present in all neurons.
  • the phosphorylation of GAP43 is strictly controlled so that nerve cells correctly extend axons and correctly form synapses. Particularly in the growth cone, phosphorylation of the 89th threonine residue, the 96th serine residue, and the 172nd threonine residue of GAP43 is the phosphorylation of the 41st serine residue of GAP43. It was suggested that it is more important. It was also suggested that the anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody that recognizes the same phosphorylated threonine as the anti-GAP43 pT172 antibody can also specifically detect the growth cone.
  • peripheral nerve regeneration model mice peripheral nerve regeneration model mice
  • Generation of a peripheral nerve regeneration model mouse was performed by a method well known to those skilled in the art. Briefly, a mouse (C57BL6J, male, 8 weeks old, Nippon Charles River Co., Ltd.) was incised at the ankle joint portion under anesthesia, and bypass grafting was performed for the myofascial nerve to the ulnar nerve. Immunohistochemical staining analysis was performed 7 days after treatment.
  • mice Pregnant mice (Slc: ICR, female, 15 and 12 days of gestation, SLC Japan, Inc.) were incised under anesthesia, and the fetus was removed.
  • Frozen tissue sections were prepared by methods well known to those skilled in the art. Briefly, after spinal cord injury treatment and dorsal root ganglion injury treatment, or after the fetus was removed, the mice were fixed by perfusion with 4% paraformaldehyde / PBS (PFA solution). The spinal cord injury site and the dorsal root ganglion injury site were removed and fixed with PFA solution. The fixed site was replaced with a sucrose solution and embedded with a frozen tissue embedding agent (Tissue-tek OCT compound, catalog number 4583, Sakura Finetech Japan Co., Ltd.). A section having a thickness of 10 ⁇ m was prepared by a frozen section preparation apparatus (Cryostat, Leica Microsystems), and placed on a glass slide coated with gelatin.
  • Immunohistochemical staining was performed according to the method described in Example 3.
  • Anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 monoclonal antibody and anti-GAP43 pS41 antibody were used as primary antibodies.
  • Alexa 488 fluorescence-labeled goat anti-rabbit IgG antibody catalog number A11034, Invitrogen, Life Technologies Japan Co., Ltd.
  • Alexa568 fluorescence-labeled goat anti-mouse antibody catalog number A11031, Invitrogen, Life Technologies Japan Co., Ltd.
  • anti-GAP43 pS96 antibody In experiments on the developing fetal brain, anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 monoclonal antibody and anti-GAP43 pS41 antibody were used as primary antibodies.
  • Biotin-labeled horse anti-mouse antibody catalog number BA-2001, VECTOR Laboratories
  • biotin-labeled sheep anti-rabbit antibody catalog number BA-1000, VECTOR Laboratories
  • FIG. 9 shows immunohistochemistry analysis of the musculoskeletal nerve bypass-transplanted to the ulnar nerve and regeneration from the transplanted nerve within the ulna nerve one week after transplantation. It is a photograph. When stained with an anti-NF (neurofilament (intermediate fiber)) antibody, all nerves are recognized. Some nerves contain regenerative nerves from the myocutaneous nerves, but anti-NF antibodies recognize all nerve fibers and cannot catch only regenerative nerves. Of these, anti-GAP43 pS96 antibody correctly recognized only the regenerated nerve and reacted. The enlarged photograph also responded to the regenerating nerve from the myocutaneous nerve in the shape of elongation.
  • NF neuroofilament (intermediate fiber)
  • FIG. 10 is a fluorescence micrograph of the spinal cord injury site on the 21st day after injury stained with anti-GAP43 pS96 antibody and anti-GAP43 monoclonal antibody. .
  • the anti-GAP43 monoclonal antibody reacted to nerve cells at the non-injured site and the damaged site.
  • the anti-GAP43 pS96 antibody did not react with nerve cells at the uninjured site, but reacted with nerve cells at the injured site.
  • FIG. 11 is a photomicrograph of the spinal cord injury site 7 days after spinal cord injury immunohistochemically stained with anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 pS41 antibody and anti-GAP43 monoclonal antibody.
  • Anti-GAP43 pS41 antibody does not react to the nerve cells at the site of injury.
  • Anti-GAP43 pS96 antibody and anti-GAP43 pT172 antibody reacted to the nerve cells at the injury site.
  • FIG. 12 shows developmental fetal brain A: embryonic stage 15 immunohistochemically stained with anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, anti-GAP43 pS41 antibody and anti-GAP43 monoclonal antibody.
  • Thalamic cerebral cortex of day, B photomicrograph of olfactory nerve on embryonic day 12.
  • the anti-GAP43 pS41 antibody does not react to the A and B neural circuits.
  • Anti-GAP43 pS96 antibody and anti-GAP43 pT172 antibody reacted vigorously with the A and B neural circuits.
  • FIG. 13 is a Western blot photograph showing the results of a cross-reaction experiment of anti-GAP43 antibodies against rhesus monkeys.
  • Anti-GAP43 pT172 antibody had strong cross-reactivity to the rhesus monkey visual cortex.
  • the anti-GAP43 pT96 antibody did not have specific cross-reactivity with rhesus monkeys.
  • the experimental results of this example showed that neurons in the regeneration process of the central nerve and peripheral nerve can be selectively detected by the anti-GAP43 pS96 antibody, but not selectively by the anti-GAP43 monoclonal antibody.
  • the anti-GAP43 pT89 antibody and anti-GAP43 pT172 antibody that specifically react with the growth cone and the anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody that recognizes the same phosphorylated threonine as the anti-GAP43 pT172 antibody are the anti-GAP43 pS96. Similar to antibodies, it was suggested that neurons in the development and regeneration processes can be selectively detected.
  • the anti-GAP43 pS96 antibody and the anti-GAP43 pT172 antibody were found to have GAP43 in which the 96th serine residue or the 172nd threonine residue is not phosphorylated and the 96th serine. It was shown that the residue or the 172nd threonine residue can be distinguished from phosphorylated GAP43.
  • anti-GAP43 pT89 antibody, anti-GAP43 pS142 antibody, anti-GAP43 pS145 antibody, anti-GAP43 pT171 antibody, and anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody each have specific cross-reactivity with GCP, GAP43 in which the 89th threonine residue, the 142nd serine residue, the 145th serine residue, the 171st threonine residue, or the 172nd threonine residue is not phosphorylated, Distinguishes from 89th threonine residue, 142nd serine residue, 145th serine residue, 171st threonine residue, or GAP43 phosphorylated at 172nd threonine residue it can.
  • anti-GAP43 pT89 antibody, anti-GAP43 pS96 antibody, and anti-GAP43 pT172 antibody react specifically with the growth cone as compared with anti-GAP43 monoclonal antibody.
  • anti-GAP43 pT89 antibody, anti-GAP43 pS96 antibody, anti-GAP43 pT172 antibody, and anti-GAP43 pT172 (# 2) antibody can detect neurons in the process of development and regeneration of the central nerve and peripheral nerve. Therefore, the anti-GAP43 antibody of the present invention and the immunological analysis method using the antibody are useful for quantitatively evaluating nerve development and / or regeneration.

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Abstract

　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；前記マウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；前記マウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；これらの抗ＧＡＰ４３抗体を利用する免疫学的分析方法。

Description

抗ＧＡＰ４３抗体
　本発明は、成長円錐を特異的に検出可能な抗体及びその利用に関する。
　神経の発生及び再生では、神経細胞が発生又は再生する段階（１）と、発生又は再生した神経細胞が軸索を正しく伸長し、シナプスを正しく形成する段階（２）とが必要である。発生及び再生した神経細胞の軸索先端部には、成長円錐と呼ばれる運動性の高い扇状の構造体が存在する。この成長円錐は、中央領域（ｃｅｎｔｒａｌ　ｄｏｍａｉｎ）と、葉状仮足及び糸状仮足を含む辺縁領域（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｄｏｍａｉｎ）とを有する。成長円錐は、シナプス形成のために、糸状仮足の伸長又は退縮をしながら軸索を適切に誘導する。
　ｇｒｏｗｔｈ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４３（ｎｅｕｒｏｍｏｄｕｌｉｎ）（以下、「ＧＡＰ４３」という。）は、成長円錐に豊富に存在し、糸状仮足の伸長や神経突起の枝分れで重要な役割を果たす。ＧＡＰ４３はタンパク質キナーゼＣによってリン酸化される一方、カルシニューリンによって脱リン酸化される。非リン酸化ＧＡＰ４３はアクチンキャップタンパク質として機能し、糸状仮足の伸長を低下させる。また、マウスＧＡＰ４３の第４１番目のセリン残基（Ｓ４１）のリン酸化が、糸状仮足の伸長のためのアクチンの安定化に重要であると考えられている（例えば、Denny,JB.、Curr Neuropharmacol.,Vol.4(12):pp.293-304 (2006)参照）。
　従来、前記段階（２）を評価するために、リン酸化Ｓ４１を認識する抗ＧＡＰ４３抗体が用いられている。
　しかし、前記抗ＧＡＰ４３抗体は、神経細胞全体でＧＡＰ４３に反応し、成長円錐のみを特異的に検出できない。したがって、前記抗ＧＡＰ４３抗体は、神経の発生又は再生を定量的に評価することができない。このように、発生及び再生過程において、成長円錐を特異的に検出できる抗体はほとんどなかった。
　本発明の課題は、成長円錐を特異的に検出できる抗体と、該抗体を利用する免疫学的分析方法とを提供することである。
　本発明者らは、成長円錐のリン酸化プロテオミクス解析によって、マウスＧＡＰ４３の第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）、第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）、及び、第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）が顕著にリン酸化される一方、前記Ｓ４１は、ほとんどリン酸化されないことを新たに見出した。この発見は、軸索伸長では、前記Ｔ８９、Ｓ９６及びＴ１７２のリン酸化が重要であることを示す。本発明によれば、前記Ｔ８９、Ｓ９６又はＴ１７２がリン酸化されたＧＡＰ４３を特異的に検出することによって、神経の発生及び／又は再生を定量的に評価することを可能となった。
　本発明は、配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体を提供する。
　本発明は、配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体を提供する。
　本発明は、配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体を提供する。
　本発明は、（１）本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１種の抗ＧＡＰ４３抗体と、被験試料とを準備することと、（２）前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させることと、（３）前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量することとを含む、ＧＡＰ４３の免疫学的分析方法を提供する。
　本発明の免疫学的分析方法は、神経の発生及び／又は再生を評価するために用いられる場合がある。
　本発明の免疫学的分析方法において、前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体の検出又は定量は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、及び免疫組織化学法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を利用する場合がある。
　本発明の３種の抗ＧＡＰ４３抗体はそれぞれ、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の場合がある。
　本発明は、本発明の前述した３種のモノクローナル抗体のいずれかを産生するハイブリドーマを提供する。
　本発明は、本発明の免疫学的分析方法を実行するためのキットを提供する。
　前記キットは、本発明の前述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬と、を含む場合がある。
　本発明は、本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体を含む成長円錐を検出するための試薬を提供する。
　本発明は、本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体の、成長円錐の検出方法における使用を提供する。
　本明細書において「工程（process）」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
　また、本明細書において「～」を用いて示された数値範囲は、「～」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
　また、本発明において、組成物中の各成分の量は、組成物中に各成分に該当する物質が複数存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
　本明細書でアミノ酸を表す場合、セリン、スレオニン等の化合物名で表す場合と、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ等の慣用の３文字表記で表す場合と、Ｓ、Ｔ等の慣用の１文字表記で表す場合とがある。
　本明細書において、用語「非リン酸化ポリペプチド」とは、リン酸化されていないアミノ酸残基のみを含むポリペプチドを意味し、用語「リン酸化ポリペプチド」とは、リン酸化されているアミノ酸残基を少なくとも１つ含むポリペプチドを意味する。
　配列番号１のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＥＧＤＧＳＡＴＴＤＡＡＰＡである。配列番号２のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＤＡＡＰＡＴＳＰＫＡＥＥである。配列番号３のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＶＴＤＡＡＡＴＴＰＡＡＥＤである。配列番号４のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＴＤＡＡＡＴＴＰＡＡＥＤである。配列番号５のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＫＡＴＴＤＮＳＰＳＳＫＡである。配列番号６のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＴＴＤＮＳＰＳＳＫＡＥＤＧである。配列番号７のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＶＴＤＡＡＡＴＴＰＡＡＥＤである。配列番号８のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＫＫＥＧＤＧＳＡＴＴＤＡである。配列番号９のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＴＤＡＡＰＡＴＳＰＫＡＥである。配列番号１０のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＰＫＡＥＥＰＳＫＡＧＤＡである。配列番号１１のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＳＥＥＫＡＧＳＡＥＴＥＳである。配列番号１２のポリペプチドのアミノ酸配列は、ＣＴＥＴＡＥＳＳＱＡＥＥＥである。配列番号１３のＧＡＰ４３のアミノ酸配列は、GenBank アクセッション番号ＡＡＨ２８２８８の配列である。
ラット成長円錐画分（ＧＣＰ）に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真。 マウスＧＡＰ４３の融合タンパク質の発現検出実験の結果を示すウエスタンブロット写真。 さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験（１）の結果を示すウエスタンブロット写真。 さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験（２）の結果を示すウエスタンブロット写真。 さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真。 さまざまな抗ＧＡＰ４３抗体で免疫細胞化学染色されたラット大脳皮質神経細胞の蛍光顕微鏡写真。 抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体で免疫細胞化学染色されたラット大脳皮質神経細胞の蛍光顕微鏡写真。 抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体で免疫細胞化学染色されたラット脊髄後根神経節細胞の蛍光顕微鏡写真。 抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体及び抗ニューロフィラメント　モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された脊髄後根神経節損傷部位の蛍光顕微鏡写真。 抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された脊髄損傷部位の蛍光顕微鏡写真。 抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、　抗ＧＡＰ４３　ｐＳ４１抗体および抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された脊髄損傷後７日目の脊髄損傷部位の顕微鏡写真。 抗ＧＡＰ４３　ｐS９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、　抗ＧＡＰ４３　ｐＳ４１抗体および抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された発生過程の胎児脳のＡ：胎生期１５日目の視床大脳皮質路、Ｂ：胎生期１２日目の嗅覚神経の顕微鏡写真。 アカゲザルに対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真。
　本発明の抗体は、以下のものである：
　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体と、
　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体と、
　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な、抗ＧＡＰ４３抗体。
　また、本発明の免疫学的分析方法は、（１）本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１種の抗ＧＡＰ４３抗体と、被験試料とを準備することと、（２）前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させることと、（３）前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量することとを含む、ＧＡＰ４３の免疫学的分析方法である。本発明のキットは、前記免疫学的分析方法を実行するためのものであり、あるいは、本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１種の抗ＧＡＰ４３抗体を含み、更に当該抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬を含む場合がある。本発明の成長円錐を検出するための試薬は、本発明の上述した３種の抗体からなる群より選択された少なくとも１種の抗ＧＡＰ４３抗体を含むものである。
　本発明では、上述したこれらの３種の抗ＧＡＰ４３抗体（以下、特に断らない限り、これらの３種を総称して「本発明の抗ＧＡＰ４３抗体」と表記することがある）は、Ｔ８６、Ｓ９６又はＴ１７２がリン酸化されたＧＡＰ４３を特異的に認識することができるので、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体の結合状態に基づいて神経の発生及び／又は再生を評価することができる。
　以下、本発明について説明する。
　本明細書におけるポリペプチドは、生物学的手順で作製されたポリペプチドの場合がある。前記生物学的手順は、前記ポリペプチドのアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かを用いて発現させて調製することを含むが、これらに限定されない。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。前記宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞又は組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。代替的には、本明細書におけるポリペプチドは、Ｆｍｏｃ法、Ｂｏｃ法等を用いる化学的手順で作製された合成ポリペプチドの場合がある。前記ポリペプチドは、精製された状態で使用されることが好ましい。前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、マウスＧＡＰ４３のアミノ酸配列の一部分を含む場合がある。前記ポリペプチドは、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化される場合がある。
　前記ポリペプチドは、キャリア高分子と結合した複合体として、本発明の抗体の作製、及び／又は、本発明の免疫学的分析方法の実施に用いられる場合がある。本明細書における「キャリア高分子」とは、ハプテンに免疫原性を付与することのできるいずれかの高分子をいい、タンパク質、多糖類等の生体高分子でも、ポリリジン等の合成高分子でもかまわない。前記複合体のキャリア高分子に用いられるタンパク質は、ウシ血清アルブミン、ニワトリオボアルブミン及びスカシ貝ヘモシアニンを含むがこれらに限定されない。前記キャリア高分子と、配列番号１ないし１２のいずれかのアミノ酸配列が含まれ、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチドとの複合体は、アミノ酸のいかなる官能基とキャリア高分子との間で結合されてもかまわない。例えば、アミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基とキャリア高分子のいずれかの側鎖とが適当な架橋剤を介して共有結合される場合がある。前記架橋剤は、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を含むがこれらに限定されない。前記キャリア高分子と、配列番号１ないし１４のいずれかのアミノ酸配列が含まれ、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチドとの複合体は、リン酸化された特定のセリン残基及びスレオニン残基の免疫原性を高めるためにさまざまな保護、修飾等が行われる場合がある。
　本発明の抗ＧＡＰ４３抗体それぞれは、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体と、該抗体の抗原結合断片と、該抗原結合断片を含む組換え抗体又はキメラ抗体とからなるグループから選択される場合がある。
　本発明の抗ＧＡＰ４３抗体及びハイブリドーマは、当業者に知られたさまざまな方法によって調製される場合がある。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ　Ｅ．　Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，　Ｉｎｃ．）を参照せよ。
　前記ポリペプチド又は前記複合体は、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を含む抗血清を採取するために、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ又はヤギ）又は鳥類（例えばニワトリ）のいずれかの動物宿主に免疫原として注射される。前記免疫原は、前記キャリア高分子と連結される場合に優れた免疫応答が誘発される場合がある。前記免疫原は、１回又は２回以上のブースター免疫を取り込んだ予め定められたスケジュールに従って、前記動物宿主に注射されることが好ましい。前記免疫原は、完全又は不完全フロイントアジュバントその他の免疫増強剤に混合して前記動物宿主に注射される場合がある。本発明の抗ＧＡＰ４３抗体は、適当な固体支持体に結合された前記ポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって抗血清から精製される場合がある。
　本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を産生するハイブリドーマは、免疫されたマウスから調製された脾臓細胞が、例えば、前記マウスと同種又は異種の動物由来のミエローマ細胞との融合によって調製される。前記脾臓細胞とミエローマ細胞とは非イオン性界面活性剤と数分間混合され、その後、ハイブリドーマの増殖は支持するが、ミエローマ細胞の増殖は支持しない選択培地に低濃度で播種される。選択技術はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を用いることが好ましい。通常約１ないし２週間後、ハイブリドーマのコロニーが観察される。シングルコロニーが選択され、その培養上清が前記ポリペプチドに対する結合活性についてテストされる。限界希釈法によるクローニングを繰り返すことにより、反応性及び特異的が高い抗体を安定的に大量に産生するハイブリドーマのクローンが選択される。モノクローナル抗体は増殖中の選択されたハイブリドーマクローン由来の細胞株のコロニーの上清から単離される場合がある。さらに、マウスのような適当な脊椎動物宿主の腹腔内に前記ハイブリドーマを注射するような、収率を向上させるためのさまざまな技術が用いられる場合がある。前記モノクローナル抗体は、適当な固体支持体に結合された前記ポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製される場合がある。
　本明細書における「抗体の抗原結合断片」とは、抗原結合に参加する抗体の部分をいう。前記抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＮ末端の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。前記抗原結合断片は、インタクトなポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体をそれぞれタンパク質分解酵素パパイン又はペプシンで分解して得られるＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の他、天然抗体分子の抗原認識能及び結合能の多くを保持する抗原結合部位を含む非共有結合的なＶＨ及びＶＬ領域のヘテロ２量体を含むＦｖ断片を含む。
　本発明の抗ＧＡＰ４３抗体において、組換え抗体は、適当な細菌宿主への形質転換か、適当な哺乳類細胞宿主へのトランスフェクションかを含む抗体遺伝子の発現クローニングによって調製される場合がある。本発明の抗ＧＡＰ４３抗体において、キメラ抗体は、前記本発明の抗ＧＡＰ４３抗体の抗原結合部位が、ＧＡＰ４３のリン酸化されていない特定のセリン残基及びスレオニン残基と、リン酸化された特定のセリン残基及びスレオニン残基とを識別できるように同種又は異種の抗体の定常ドメインによって支持された融合タンパク質の場合がある。前記特定のセリン残基及びスレオニン残基は、マウスＧＡＰ４３の第８６番目のセリン残基（Ｓ８６）、第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）、第９５番目のスレオニン残基（Ｔ９５）、第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）、第１０３番目のセリン残基（Ｓ１０３）、第１２８番目のセリン残基（Ｓ１２８）、第１４２番目のセリン残基（Ｓ１４２）、第１４５番目のセリン残基（Ｓ１４５）、第１７１番目のスレオニン残基（Ｔ１７１）、第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）、又は、第１９２番目のセリン残基（Ｓ１９２）の場合がある。前記キメラ抗体には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）に操作可能に連結された抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単鎖可変部抗体（ｓｃＦｖ）と、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマを含む）の動物が産生する軽鎖がないＩｇＧのクラスであるラクダ重鎖抗体（ＨＣＡｂ）又はその重鎖可変部ドメイン（ＶＨＤ）とを含む。前記組換え抗体は原核生物及び真核生物由来の遺伝子発現システムを用いて大量に調製することができる。
　本発明の免疫学的分析方法における「本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を準備する」工程は、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を入手すること、又は本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を調製することを含む。本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を入手する方法としては、既に作製された本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を、特定の供給元から無償又は有償で入手することが挙げられる。本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を調製する方法は、前述の当業者に知られたさまざまな方法によって実施される場合がある。
　本発明の免疫学的分析方法における「被験試料を準備する」工程は、本発明の免疫学的分析方法に適用可能な被験試料を入手すること、又は本発明の免疫学的分析方法に適用可能な被験試料を調製することを含む。被験試料を入手する方法としては、既に調製された被験試料を、特定の供給源から無償又は有償で入手することが挙げられる。被験試料を調製する方法は、生体からの採取、細胞培養等によって実施される場合がある。前記被験試料は、採取した細胞、組織及び器官と、培養細胞と、細胞溶解物と、合成ポリペプチドとを含むがこれらに限定されない。前記被験試料は、配列番号１３のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む、ＧＡＰ４３、その変異体又はポリペプチドか、あるいは融合タンパク質を含むことが一般的である。前記融合タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含むＧＡＰ４３、その変異体又はポリペプチドと、タグタンパク質又はタグペプチドとの融合タンパク質の場合がある。前記タグタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）及びシアン色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含むがこれらに限定されない。前記タグペプチドは、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ及びＦＬＡＧタグを含むがこれらに限定されない。配列番号１３のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む、ＧＡＰ４３、その変異体又はポリペプチドと、融合タンパク質とは、リン酸化される場合がある。前記被験試料の生物種は、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体によって、リン酸化されていない特定のセリン残基又はスレオニン残基と、リン酸化された特定のセリン残基又はスレオニン残基とを識別できることを条件として、ヒト、サル、マウス及びラットを含むがこれらに限定されない。前記特定のセリン残基及びスレオニン残基は、マウスＧＡＰ４３の第８６番目のセリン残基（Ｓ８６）、第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）、第９５番目のスレオニン残基（Ｔ９５）、第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）、第１０３番目のセリン残基（Ｓ１０３）、第１２８番目のセリン残基（Ｓ１２８）、第１４２番目のセリン残基（Ｓ１４２）、第１４５番目のセリン残基（Ｓ１４５）、第１７１番目のスレオニン残基（Ｔ１７１）、第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）、又は、第１９２番目のセリン残基（Ｓ１９２）の場合がある。
　本発明の免疫学的分析方法における「前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させる」工程は、前記被験試料が固定された固体支持体を用いて実施される場合がある。前記固体支持体は、前記被験試料の免疫原性を失うことなく固定できるものであればよく、さまざまな材料又は形状の固体を利用することができる。前記固体支持体は、ポリマー材料、ガラス、セラミック、ゲル、膜、天然繊維、シリコーン、金属及びそれらの複合材料を含むがこれらに限定されない材料から加工される場合がある。前記固体支持体は、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、マルチアレイチップ、センサーチップ又はラテックス凝集法用微粒子のような、自動分析システムによって取り扱うのに適する形状を有する固体支持体が含まれる。前記接触させる工程では、複数の抗ＧＡＰ４３抗体が組み合わせて用いられる場合がある。本発明の免疫学的分析方法は、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体以外の他の抗体と、前記被験試料とを接触させる工程を含む場合がある。前記他の抗体は、商業的に入手可能な抗β－アクチン抗体及び抗ニューロフィラメント抗体を含むがこれらに限定されない。
　本発明の免疫学的分析方法における「被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量する」工程は、被験試料に結合した抗ＧＡＰ４３抗体又は二次抗体等の標識により検出又は定量される場合がある。前記抗ＧＡＰ４３抗体は、ビオチンのような低分子リガンド、酵素、放射性同位元素、色素、蛍光色素等で標識される場合がある。前記抗ＧＡＰ４３抗体に対する二次抗体か、前記ビオチンのような低分子リガンドに特異的に結合するアビジンのような生体高分子かは、酵素、放射性同位元素、色素、蛍光色素等で標識される場合がある。前記酵素は、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ベータ－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等である。前記酵素は、適切な基質と組み合わせて用いられることが一般的である。検出する工程は、イメージングプレートに感光する工程か、ＣＣＤカメラで撮影する工程か、顕微鏡で観察する工程かを含む場合がある。定量する工程は、既知の濃度又は量の被験試料に結合した抗ＧＡＰ４３抗体の量を数値化してプロットした検量線を作成する工程と、前記検量線を用いて、未知の濃度又は量の被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体の量から該被験試料の濃度又は量を算出する工程とを含む場合がある。検量線を作成するために、濃度又は量が知られた被験試料が少なくとも２種類あればよいが、定量精度を確保するために３種類又は４種類以上あることが好ましい。検出又は定量する工程は、被験試料に結合しなかった抗ＧＡＰ４３抗体及び他の抗体を洗浄により除去する工程を含む場合がある。
　本発明の免疫学的分析方法において、神経の発生及び／又は再生を評価するとき、被験試料に結合した抗ＧＡＰ４３抗体の量が、基準値よりも高い値を示す場合に、神経の発生及び／又は再生は良好であると判断される場合がある。前記基準値は、当業者に周知な統計処理によって算出することができる。前記基準値は、特定の母集団から調製された被験試料に結合した抗ＧＡＰ４３抗体の量の平均値として決定される場合がある。この場合に用いられる母集団は、正常な被験動物か、神経が再生された被験動物かの場合がある。前記母集団の被験動物と、評価される被験動物とは、生物種、年齢及び性別が同じであることが好ましい。
　本発明の免疫学的分析方法における「被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量する」工程は、当業者に知られたさまざまな手法によって実施される場合がある。例えば、前記手法は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、免疫組織化学法、又はこれらの２種以上の組み合わせを含むが、これらに限定されない。前記表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法とは、光学現象を利用して、固体支持体上に固定化された分子と、相互作用の相手となる分子との固体支持体上における特異的相互作用を微細な質量変化として測定する手法をいう。ＳＰＲ法を実施するためのシステムとしては、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（ＢＩＡｃｏｒｅ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が利用できる。前記ラテックス凝集法とは、分光光度計を利用して、固体支持体であるラテックス等の微粒子又はナノ微粒子に結合した抗体の量に応じた微粒子の凝集反応の程度を比濁度の変化として測定する手法をいう。
　本発明の免疫学的分析方法を実行するためのキットは、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体の他、検量線を作成するための既知の濃度又は量の対照試料を含む場合がある。前記対照試料は、配列番号１３のアミノ酸配列の少なくとも一部分が含まれ、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化された、ＧＡＰ４３、その変異体又はポリペプチドか、融合タンパク質かの場合がある。前記特定のセリン残基及びスレオニン残基は、マウスＧＡＰ４３の第８６番目のセリン残基（Ｓ８６）、第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）、第９５番目のスレオニン残基（Ｔ９５）、第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）、第１０３番目のセリン残基（Ｓ１０３）、第１２８番目のセリン残基（Ｓ１２８）、第１４２番目のセリン残基（Ｓ１４２）、第１４５番目のセリン残基（Ｓ１４５）、第１７１番目のスレオニン残基（Ｔ１７１）、第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）、又は、第１９２番目のセリン残基（Ｓ１９２）の場合がある。本発明の免疫学的分析方法を実行するためのキットは、更に、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬を含む場合がある。前記試薬としては、前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための手法に応じて適宜選択された試薬を含み、例えば、希釈液としてのリン酸緩衝液等の緩衝液、発色剤を挙げることができる。
　本発明は、前記免疫学的分析方法を実行できるように構成される、ＧＡＰ４３の免疫学的分析装置を提供する。前記装置には、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡、ＣＣＤカメラ等の検出ユニット、分光光度計、蛍光分光光度計、表面プラズモン共鳴測定器等の測定ユニット、試薬、洗浄液及び／又は試料の注入及び／又は除去のためのディスペンサーユニット、ＥＬＩＳＡ用マルチウェルプレートや表面プラズモン共鳴用センサーチップのハンドリングのためのロボットアームユニット、それらの制御のための制御ユニット等が含まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
　以下の実験は、新潟大学動物実験倫理委員会によって承認された後に実施された（承認番号：新大研第４４号、承認日：２００６年９月２７日）。
　抗ＧＡＰ４３抗体の作製
　１　材料及び方法
　１．１　ポリペプチドの入手
　非リン酸化ポリペプチド１２種類と、リン酸化ポリペプチド１２種類とがシグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社から購入された。前記非リン酸化ポリペプチド１２種類のアミノ酸配列は、配列番号１ないし１２に列挙される。リン酸化ポリペプチド１２種類それぞれについては以下に説明される。
　リン酸化ポリペプチド第１番は、配列番号１に示されるアミノ酸残基１４個のアミノ酸配列を含み、第９番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＴ８９」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第２番は、配列番号２に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＳ９６」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第３番は、配列番号３に示されるアミノ酸残基１４個のアミノ酸配列を含み、第９番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第４番は、配列番号４に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第５番は、配列番号５に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第６番は、配列番号６に示されるアミノ酸残基１４個のアミノ酸配列を含み、第９番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第７番は、配列番号７に示されるアミノ酸残基１４個のアミノ酸配列を含み、第８番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第８番は、配列番号８に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＳ８６」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第９番は、配列番号９に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のスレオニン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＴ９５」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第１０番は、配列番号１０に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＳ１０３」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第１１番は、配列番号１１に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＳ１２８」という。）であった。リン酸化ポリペプチド第１２番は、配列番号１２に示されるアミノ酸残基１３個のアミノ酸配列を含み、第８番目のセリン残基がリン酸化されたポリペプチド（以下、「ＧＡＰ４３　ｐＳ１９２」という。）であった。
　１．２　抗原の作製
　１２種類のペプチド抗原が、当業者に周知の方法に従って作製された。簡潔には、１２種類のポリペプチド抗原は、それぞれ、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシサクシンイミドエステル（ＭＢＳ）（カタログ番号Ｍ２７８６、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）を用いてスカシ貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）（カタログ番号Ｈ７０１７、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）と結合された。
　１．３　抗血清の調製
　初回免疫では、前記ペプチド抗原２００μｇがフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）（カタログ番号Ｆ５８８１、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）と混合され、ウサギに投与された。初回免疫後、ＧＡＰ４３　ｐＴ８９、ＧＡＰ４３　ｐＳ９６、ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１、及び、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２についてのペプチド抗原１００μｇが、フロイント不完全アジュバント（以下、「ＦＩＡ」という。）（カタログ番号Ｆ５５０６、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）と混合され、７日毎に投与された。採血が初回免疫から４９日後に行われ、抗血清が得られた。初回免疫後、ＧＡＰ４３　ｐＳ８６、ＧＡＰ４３　ｐＴ９５、ＧＡＰ４３　ｐＳ１０３、ＧＡＰ４３　ｐＳ１２８、ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）、及び、ＧＡＰ４３　ｐＳ１９２についてのペプチド抗原１００μｇがＦＩＡと混合され、１４日毎に投与された。採血が初回免疫から８４日後に行われ、抗血清が得られた。
　１．４　抗ＧＡＰ４３抗体の精製
　前記抗血清は、当業者に周知な方法でアフィニティー精製された。簡潔には、前記抗血清はＰＤ－１０カラム（カタログ番号５４８０５、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）で脱塩され、前記リン酸化ポリペプチドを固定化した担体（シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）と混合された。前記リン酸化ポリペプチドを固定化したＴＯＹＯＰＥＡＲＬ　ＡＦ－Ｔｒｅｓｙｌ－６５０４Ｂ担体（カタログ番号１４４７１、東ソー株式会社）と混合された。混合後、沈降した担体はリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という。）で洗浄された。抗体は０．１Ｍ　グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ　２．５）で溶出され、１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　８．０）で中和された。前記抗体はＰＢＳ／５０％グリセロール／１５ｐｐｍプロクリン溶液で調製され、－２０℃で保存された。以下、ＧＡＰ４３　ｐＴ８９、ＧＡＰ４３　ｐＳ９６、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）、ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２、ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１、ＧＡＰ４３　ｐＳ８６、ＧＡＰ４３　ｐＴ９５、ＧＡＰ４３　ｐＳ１０３、ＧＡＰ４３　ｐＳ１２８、及び、ＧＡＰ４３　ｐＳ１９２についてのペプチド抗原に対する抗ＧＡＰ４３抗体それぞれを、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ８６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ９５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１０３抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１２８抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１９２抗体という。
　１．５　ＥＬＩＳＡ法を用いた抗ＧＡＰ４３抗体の特異性の評価
　抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応性がＥＬＩＳＡ法で調べられた。簡潔には、前記非リン酸化ポリペプチド１２種類と、前記リン酸化ポリペプチド１２種類とが、それぞれ、マルチウェルプレートに添加され、前記プレート上に固定化された。ブロッキング後、前記抗ＧＡＰ４３抗体が、それぞれ、一次抗体として前記プレートに添加された。その後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体が二次抗体として添加された。基質溶液の添加後、吸光度（４０５ｎｍ）がマイクロプレートリーダーによって測定された。
　１．６　ウエスタンブロット法を用いた抗ＧＡＰ４３抗体の特異性の評価
　ＧＡＰ４３に対する抗ＧＡＰ４３抗体それぞれの交叉反応性がウエスタンブロット法で調べられた。前記ウエスタンブロット法は、当業者に周知の標準的な方法に従って実施された。簡潔には、ラット新生仔の前脳の成長円錐画分（２μｇ／ｍＬ、５０μＬ）（以下、「ＧＣＰ」という。）が用いられた。一次抗体の抗ＧＡＰ４３ウサギ抗体のそれぞれの最終濃度は以下のとおりであった。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ８６抗体（０．７μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体（０．３５μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ９５抗体（０．０９μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体（０．５μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１０３抗体（０．６μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１２８抗体（１．２６μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２抗体（１．３７μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５抗体（０．７５μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１抗体（０．７８μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体（０．２６μｇ／ｍＬ）、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（＃２）抗体（０．３７μｇ／ｍＬ）、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１９２抗体（０．０８μｇ／ｍＬ）。０．１５６μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号ＮＡ９３４、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が二次抗体として用いられた。検出は、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（カタログ番号ＲＰＮ２１０８、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いて実施された。
　２　結果
　２．１　ＥＬＩＳＡ法を用いた抗ＧＡＰ４３抗体の特異性の評価
　抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ８６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ９５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１０３抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１２８抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１９２抗体は、それぞれ、ＧＡＰ４３　ｐＴ８９、ＧＡＰ４３　ｐＳ９６、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）、ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２、ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５、ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１、ＧＡＰ４３　ｐＳ８６、ＧＡＰ４３　ｐＴ９５、ＧＡＰ４３　ｐＳ１０３、ＧＡＰ４３　ｐＳ１２８、及び、ＧＡＰ４３　ｐＳ１９２に対して交叉反応性を有する一方、非リン酸化ポリペプチドに対して交叉反応性を有さなかった（データは示されない。）。したがって、前記抗体全ては、非リン酸化ポリペプチドと、リン酸化ポリペプチドとを明確に識別できることが示された。
　２．２　ウエスタンブロット法を用いた抗ＧＡＰ４３抗体の特異性の評価
　図１は、ラット成長円錐粒子由来の試料（ＧＣＰ）に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体は、ＧＣＰに対して特異的な交叉反応性を有した。また、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体は、特に強い交叉反応性を有した。なお、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ８６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ９５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１０３抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１２８抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１９２抗体は、ＧＣＰに対して特異的な交叉反応性を有さなかった（データは示されない。）。
　本実施例の実験結果から、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体それぞれは、ＧＣＰに対して特異的な交叉反応性を有することが示された。したがって、前記抗体は、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、特定のセリン残基又はスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示唆された。
　抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体の性状解析
　１　材料及び方法
　抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体の性状が、実施例１に記載のウエスタンブロット法で解析された。緑色蛍光タンパク質（ｍａｘＧＦＰ）か、マウスＧＡＰ４３の融合タンパク質かをエンコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターがＣＯＳ－７細胞にトランスフェクションされた。前記融合タンパク質は、（１）緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）及びＧＡＰ４３の融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３」という。）か、（２）ＥＧＦＰと、ＧＡＰ４３の第９６番目のアミノ酸残基をセリン残基（Ｓ）からアラニン残基（Ａ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａ」という。）か、（３）ＥＧＦＰと、ＧＡＰ４３の第９６番目のアミノ酸残基をセリン残基（Ｓ）からアスパラギン酸残基（Ｄ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ｄ」という。）か、（４）ＥＧＦＰと、ＧＡＰ４３の第１７２番目のアミノ酸残基をスレオニン残基（Ｔ）からアラニン残基（Ａ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ａ」という。）か、（５）ＥＧＦＰと、ＧＡＰ４３の第１７２番目のアミノ酸残基をスレオニン残基（Ｔ）からアスパラギン酸残基（Ｄ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ｄ」という。）か、（６）フラッグタグ（ＦＬＡＧ）及びＧＡＰ４３の融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３」という。）か、（７）ＦＬＡＧと、ＧＡＰ４３の第９６番目のアミノ酸残基をセリン残基（Ｓ）からアラニン残基（Ａ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａ」という。）か、（８）ＦＬＡＧと、ＧＡＰ４３の第９６番目のアミノ酸残基をセリン残基（Ｓ）からアスパラギン酸残基（Ｄ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ｄ」という。）か、（９）ＦＬＡＧと、ＧＡＰ４３の第１７２番目のアミノ酸残基をスレオニン残基（Ｔ）からアラニン残基（Ａ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ａ」という。）か、（１０）ＦＬＡＧと、ＧＡＰ４３の第１７２番目のアミノ酸残基をスレオニン残基（Ｔ）からアスパラギン酸残基（Ｄ）に置換した変異体との融合タンパク質（以下、「ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ｄ」という。）かであった。前記ｍａｘＧＦＰか、前記融合タンパク質かを含む細胞溶解液が、前記発現ベクターをトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞から調製された。なお、ＧＣＰと、未分化神経細胞であるＰＣ１２Ｄ細胞から調製された細胞溶解液（以下、「ＰＣ１２Ｄ」という。）と、神経成長因子（ＮＧＦ）で刺激されたＰＣ１２Ｄ細胞から調製された細胞溶解液（以下、「ＰＣ１２Ｄ／ＮＧＦ（＋）」という。）と、トランスフェクションされていないＣＯＳ－７細胞から調製された細胞溶解液（以下、「ＣＯＳ－７」という。）とが対照として用いられた。ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ｄ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ｄの発現を検出するために、最終濃度１μｇ／ｍＬの抗ＥＧＦＰモノクローナル抗体（カタログ番号Ｍ０４８－３、株式会社医学生物学研究所）が一次抗体として用いられ、最終濃度０．１５６μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号ＮＡ９３１、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が二次抗体として用いられた。ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ｄ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ｄに対する交叉反応性を比較するために、市販の抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体（カタログ番号Ｇ９２６４、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）と、実施例１で調製された抗ＧＡＰ４３抗体とが一次抗体として用いられた。前記抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体に対する二次抗体は、ペルオキシダーゼ標識ヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体（カタログ番号ＮＡ９３１、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）が用いられた。
　２　結果
　２．１　融合タンパク質の発現
　図２は、マウスＧＡＰ４３の融合タンパク質の発現検出実験の結果を示すウエスタンブロット写真である。ＣＯＳ－７細胞におけるＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ｄ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ｄの発現が確認された。
　２．２　抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体の性状解析
　図３は、さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験（１）の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、ＧＣＰ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ｄ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ｄに対して交叉反応性を有した一方、ＰＣ１２Ｄ、ＣＯＳ－７、及び、ｍａｘＧＦＰに対して交叉反応性を有さなかった。また、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体は、ＧＣＰ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ａ、及び、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ｄに対して交叉反応性を有した一方、ＰＣ１２Ｄ、ＣＯＳ－７、ｍａｘＧＦＰ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａ、及び、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ｄに対して交叉反応性を有さなかった。図４は、さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験（２）の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、ＧＣＰ、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３、及び、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａに対して交叉反応性を有した。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体は、ＧＣＰ及びＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３に対して交叉反応性を有した一方、ＥＧＦＰ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａに対して交叉反応性を有さなかった。なお、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体は、ＰＣ１２Ｄ／ＮＧＦ（＋）に対して交叉反応性を有した（データは示されない。）。
　２．４　抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体の性状解析
　図５は、さまざまな試料に対する抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体は、ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３、ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ａ及びＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３　Ｓ９６Ｄに対して交叉反応性を有した一方、ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ａ、及び、ＦＬＡＧ－ＧＡＰ４３　Ｔ１７２Ｄに対して交叉反応性を有さなかった。
　本実施例の実験結果から、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、第９６番目のセリン残基又は第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第９６番目のセリン残基又は第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できないことが示された。
　これに対して、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体は、第９６番目のセリン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第９６番目のセリン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示された。また、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示された。さらに、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体それぞれは、ＧＣＰに特異的な交叉反応性を有するため、第８９番目のスレオニン残基、第１４５番目のセリン残基、第１７１番目のスレオニン残基、第１４２番目のセリン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第８９番目のスレオニン残基、第１４５番目のセリン残基、第１７１番目のスレオニン残基、第１４２番目のセリン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示唆された。
　抗ＧＡＰ４３抗体の免疫細胞化学染色解析
　１　材料及び方法
　１．１　ラット大脳皮質神経細胞の初代培養
　大脳皮質神経細胞は、ラット（ＳＤラット、雌、日本エスエルシー株式会社）の新生仔の脳から調製された。簡潔には、大脳皮質神経細胞が、細胞分散用試薬（Ａｃｃｕｍａｘ（登録商標）、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，　Ｉｎｃ．、フナコシ株式会社）で処理され、０．０５％ポリエチレンイミン（カタログ番号Ｐ３１４３、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）でコーティングしたカバーガラス上に播種された。前記カバーガラスは培養ディッシュ（カタログ番号３５３００２、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に載置され、前記細胞は、Ｂ２７サプリメント（カタログ番号００５０１２９ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（カタログ番号Ｇ６７８４、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）を含む市販培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号２１１０３－０４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で３日間培養された。
　１．２　ラット脊髄後根神経節（ＤＲＧ）細胞の初代培養
　脊髄後根神経節細胞は、ラット（ＳＤラット、雌及び雄、生後１日齢、日本エスエルシー株式会社）から調製された。簡潔には、頸椎から腰椎までが摘出され、脊髄後根神経節細胞が採取された。前記脊髄後根神経節細胞は、ポリＬ－リジン（カタログ番号Ｐ４８３２、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）でコーティングしたカバーガラス上に播種された。前記カバーガラスは培養ディッシュ（カタログ番号３５３００２、日本ベクトン・ディッキンソン株式会社）に載置され、前記細胞は、Ｂ２７サプリメント（カタログ番号００５０１２９ＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、グルタミン－ペニシリン－ストレプトマイシン混合溶液（カタログ番号Ｇ６７８４、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）を含む市販培地（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ、カタログ番号２１１０３－０４９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、３７℃、５％ＣＯ２及び飽和水蒸気雰囲気下で３日間培養された。
　１．３　免疫細胞化学染色
　培養後、前記細胞はブアン固定液（飽和ピクリン酸水溶液：ホルマリン溶液＝３：１＜体積比＞）で１０分間固定された。ＰＢＳで洗浄後、前記細胞は、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００／ＰＢＳで１０分間透過処理された。その後、免疫細胞化学染色が実施された。
　染色には、一次抗体として、実施例１で作製された抗ＧＡＰ４３抗体１２種類と、市販の抗リン酸化ＧＡＰ４３ｐＳ４１ポリクローナル抗体（カタログ番号Ｇ８０４３、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体と、抗α－チューブリンモノクローナル抗体（カタログ番号Ｔ９０２６、シグマ　アルドリッチ　ジャパン株式会社）とが、１００～５００倍希釈で用いられた。また、二次抗体として、Ａｌｅｘａ４８８蛍光標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ１１０３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と、Ａｌｅｘａ５６８蛍光標識ヤギ抗マウス抗体（カタログ番号Ａ１１０３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）とが、それぞれ１０００倍希釈で用いられた。その後、ＰｒｏＬｏｎｇ　Ｇｏｌｄ退色防止試薬（カタログ番号Ｐ３６９３０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）で包埋され、倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２００、カールツァイス株式会社）で観察された。
　結果を図６～図７に示す。図６において上段の左は抗ＧＡＰ４３Ｓ４１抗体、中央は成長円錐と軸索全体を認識する抗微小管抗体（マイクロチュブリン抗体（カタログ番号ＭＡＢ３４０８，ケミコン株式会社））、右はそのマージ像を示し、下段の左は抗ＧＡＰ４３ｐＴ１７１抗体、中央は抗微小管抗体、右はそのマージ像を示す。マージとは、それぞれリン酸化抗体と他の抗体との２重染色像の重ね合わせを意味する。図８の上段は、抗ＧＡＰ４３ｐＳ９６抗体を用いた結果であり、下段は、抗ＧＡＰ４３ｐＳ１７１抗体を用いた結果であり、それぞれ、左側は位相差顕微鏡像であり、右側は蛍光顕微鏡写真像である。
　２　結果
　２．１　ラット大脳皮質神経細胞の免疫細胞化学染色
　図６は、さまざまな抗ＧＡＰ４３抗体で免疫細胞化学染色されたラット大脳皮質神経細胞の蛍光顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３ｐＳ４１ポリクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１抗体は、神経細胞全体に反応した（図６下段参照）。一方、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体は、神経細胞の先端に位置する成長円錐、特に中央域で特異的に反応した。
　図７は、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体で免疫細胞化学染色されたラット大脳皮質神経細胞の蛍光顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、樹状突起を含む神経細胞全体で反応した。
　２．２　ラット脊髄後根神経節細胞の免疫細胞化学染色
　図８は、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体で免疫細胞化学染色されたラット脊髄後根神経節細胞の蛍光顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体は、神経節細胞の成長円錐の中央域で特異的に反応した。
　ラットＧＡＰ４３及びマウスＧＡＰ４３のアミノ酸配列は、ともに、第４１番目がセリン残基、第８９番目がスレオニン残基、第９６番目がセリン残基、第１７１番目がスレオニン残基、第１７２番目がスレオニン残基である。また、ラットＧＡＰ４３には、配列番号１ないし１２のアミノ酸配列が保存される。そこで、本実施例のリン酸化ＧＡＰ４３特異的抗体は、マウスＧＡＰ４３だけでなく、ラットＧＡＰ４３にも反応すると予測された。本実施例の実験結果からこの予測が確認された。さらに、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体は、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体と比較して成長円錐を特異的に検出できることが示された。また、第８９番目のスレオニン残基、第９６番目のセリン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３は、神経細胞の成長円錐に局在することが示された。さらに、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３は成長円錐に局在し、第１７１番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３は神経細胞全体で存在した。したがって、ＧＡＰ４３のリン酸化は、神経細胞が軸索を正しく伸長し、シナプスを正しく形成するために厳密に制御されていることが示唆された。特に成長円錐では、ＧＡＰ４３の第８９番目のスレオニン残基と、第９６番目のセリン残基と、第１７２番目のスレオニン残基とのリン酸化が、ＧＡＰ４３の第４１番目のセリン残基のリン酸化よりも重要であることが示唆された。なお、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体と同一のリン酸化スレオニンを認識する抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体も成長円錐を特異的に検出できることが示唆された。
　抗ＧＡＰ４３抗体の免疫組織化学染色解析
　１　材料及び方法
　１．１　脊髄損傷モデルマウスの作製（中枢神経損傷再生モデル）
　脊髄損傷処置が当業者に周知な方法で実施された。簡潔には、マウス（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ、雄、８週齢、日本チャールス・リバー株式会社）は麻酔下で背部を切開され、脊椎が露出された。第８－１１番胸椎（Ｔ８－１１）の椎弓が電気ドリルで切除された。その後、市販の装置（ＩＨ　Ｉｍｐａｃｔｏｒ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、錘（２．５ｇ）が２ｃｍ垂直上方から前記胸椎に３回落下され、脊髄が損傷された。免疫組織化学染色解析が、処置後２１日目に実施された。脊髄損傷処置が施されていないマウスが、対照として用いられた。
　１．２　末梢神経再生モデルマウスの作製（末梢神経再生モデル）
　末梢神経再生モデルマウス作成が当業者に周知な方法で実施された。簡潔には、マウス（Ｃ５７ＢＬ６Ｊ、雄、８週齢、日本チャールス・リバー株式会社）は麻酔下で足関節部を切開され、筋皮神経を尺骨神経にバイパス移植が行われた。免疫組織化学染色解析が、処置後７日目に実施された。
１．３　発生過程の胎児脳
　妊娠マウス（Slc:ICR、雌、妊娠１５日齢及び１２日齢、日本エスエルシー株式会社）は麻酔下で切開され、胎児が摘出された。
　１．４　凍結組織切片の作製
　凍結組織切片が当業者に周知な方法で作製された。簡潔には、脊髄損傷処置及び脊髄後根神経節損傷処置後、または胎仔が摘出された後、前記マウスは４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（ＰＦＡ液）で灌流固定された。脊髄損傷部位及び脊髄後根神経節損傷部位が摘出され、さらにＰＦＡ液で固定された。固定された前記部位はスクロース溶液で置換され、凍結組織包埋剤（Ｔｉｓｓｕｅ－ｔｅｋ　ＯＣＴ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ、カタログ番号４５８３、サクラファインテックジャパン株式会社）で包埋された。厚さ１０μｍの切片が凍結切片作製装置（クリオスタット、ライカ　マイクロシステムズ株式会社）によって作製され、ゼラチンでコーティングしたスライドガラスに載置された。
　１．５　免疫組織化学染色
　脊髄損傷モデルマウス実験では、免疫組織化学染色が実施例３に記載の方法に従って実施された。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体と抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＳ４１抗体が一次抗体として用いられた。また、Ａｌｅｘａ４８８蛍光標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（カタログ番号Ａ１１０３４、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）と、Ａｌｅｘａ５６８蛍光標識ヤギ抗マウス抗体（カタログ番号Ａ１１０３１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社）とが二次抗体として用いられた。
　発生過程の胎児脳に関する実験では、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体と抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＳ４１抗体が一次抗体として用いられた。また、ビオチン標識ウマ抗マウス抗体（カタログ番号ＢＡ-２００１、ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）と、ビオチン標識ヒツジ抗ウサギ抗体（カタログ番号ＢＡ－１０００、ＶＥＣＴＯＲ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）とが二次抗体として用いられた。
　末梢神経再生モデルマウス実験では、免疫組織化学染色が市販のキット（Ｖｅｃｔｏｒｓｔａｉｎ　Ｅｌｉｔｅ　ＡＢＣ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｋｉｔ、カタログ番号ＰＫ６１００、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｉｎｃ．、フナコシ株式会社）を用いて製造者の指示書に従って実施された。前記染色では、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体と、抗ニューロフィラメント（ＮＦ）抗体（カタログ番号ａｂ７７７４５、アブカム株式会社）とが一次抗体として用いられた。また、ビオチン標識ヒツジ抗マウス抗体（カタログ番号ＲＰＮ１００１、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）と、ビオチン標識ロバ抗ウサギ抗体（カタログ番号ＲＰＮ１００４、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）とが二次抗体として用いられた。
　２　結果　（末梢神経・中枢神経双方の再生神経の認識）
　２．１　末梢神経再生モデルマウス実験の解析
　図９は、尺骨神経にバイパス移植された筋皮神経が尺骨神経内に新しく移植神経からの再生する様子を移植後１週間にて免疫組織化学で解析した写真である。抗ＮＦ（ニューロフィラメント（中間径線維））抗体で染色をするとすべての神経を認識している。　一部の神経は筋皮神経からの再生神経を含んでいるが、抗ＮＦ抗体はすべての神経線維を認識するため再生神経のみをとらえることはできない。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体ではこのうち再生神経のみを正しく認識し反応した。拡大写真からも伸長過程にある形状の筋皮神経からの再生神経に対して反応した。
　２．２　脊髄損傷モデルマウス（中枢神経再生モデル）の解析
　図１０は、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された損傷後２１日目の脊髄損傷部位の蛍光顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体は、非損傷部位及び損傷部位の神経細胞に反応した。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体は、非損傷部位の神経細胞に反応しない一方、損傷部位の神経細胞に反応した。
　図１１は、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、　抗ＧＡＰ４３　ｐＳ４１抗体および抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された脊髄損傷後７日目の脊髄損傷部位の顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ４１抗体は、損傷部位の神経細胞に反応しない。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体は、損傷部位の神経細胞に反応した。
　２．３　発生過程の胎児脳に関する解析
　図１２は抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、　抗ＧＡＰ４３　ｐＳ４１抗体および抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体で免疫組織化学染色された発生過程の胎児脳のＡ：胎生期１５日目の視床大脳皮質路、Ｂ：胎生期１２日目の嗅覚神経の顕微鏡写真である。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ４１抗体は、Ａ，Ｂの神経回路に反応しない。抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体は、Ａ，Ｂの神経回路に激しく反応した。
　２．４　ウエスタンブロット法を用いた哺乳動物間での抗ＧＡＰ４３抗体の交差性の評価
　図１３は、アカゲザルに対する抗ＧＡＰ４３抗体の交叉反応実験の結果を示すウエスタンブロット写真である。抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体は、アカゲザルの視覚野に対し強い交叉反応性を有した。なお、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ９６抗体は、アカゲザルに対して特異的な交叉反応性を有さなかった。
　本実施例の実験結果から、中枢神経及び末梢神経の再生過程の神経細胞は、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体によって選択的に検出できる一方、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体では選択的に検出できないことが示された。また、成長円錐に特異的に反応した抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体と、該抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体と同一のリン酸化スレオニンを認識する抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体とは、前記抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体と同様に、発生及び再生過程の神経細胞を選択的に検出できることが示唆された。
　結論
　これらの実施例の実験結果から、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体及び抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体は、第９６番目のセリン残基又は第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第９６番目のセリン残基又は第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できることが示された。また、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４２抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ１４５抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７１抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体は、それぞれ、ＧＣＰに対して特異的な交叉反応性を有するため、第８９番目のスレオニン残基、第１４２番目のセリン残基、第１４５番目のセリン残基、第１７１番目のスレオニン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されていないＧＡＰ４３と、第８９番目のスレオニン残基、第１４２番目のセリン残基、第１４５番目のセリン残基、第１７１番目のスレオニン残基、又は、第１７２番目のスレオニン残基がリン酸化されたＧＡＰ４３とを識別できる。また、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体は、抗ＧＡＰ４３モノクローナル抗体と比較して、成長円錐に特異的に反応することが示された。さらに、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ８９抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＳ９６抗体、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２抗体、及び、抗ＧＡＰ４３　ｐＴ１７２（♯２）抗体は、中枢神経及び末梢神経の発生・再生過程の神経細胞を検出できることが示唆された。したがって、本発明の抗ＧＡＰ４３抗体と、該抗体を利用する免疫学的分析方法とは、神経の発生及び／又は再生を定量的に評価するのに有用である。
　２０１１年１０月２０日に出願された日本国特許出願第２０１１－２３０５７７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
　本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。

Claims (12)

  1. 　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
  2. 　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
  3. 　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
  4. 　ポリクローナル抗体である請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の抗ＧＡＰ４３抗体。
  5. 　モノクローナル抗体である請求項１～請求項３のいずれか１項に記載の抗ＧＡＰ４３抗体。
  6. 　（１）以下の抗体（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、被験試料とを準備することと、
    　　（Ａ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
    　　（Ｂ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
    　　（Ｃ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体； 
    　（２）前記抗ＧＡＰ４３抗体と、前記被験試料とを接触させることと、
    　（３）前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量することと、
    を含む、ＧＡＰ４３の免疫学的分析方法。
  7. 　神経の発生及び／又は再生を評価するために用いられる、請求項６に記載の免疫学的分析方法。
  8. 　前記被験試料に結合した前記抗ＧＡＰ４３抗体の検出又は定量は、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、表面プラズモン共鳴法、ラテックス凝集法、及び免疫組織化学法からなる群より選択される少なくとも１種の方法を利用することを含む請求項６又は請求項７に記載の免疫学的分析方法。
  9. 　請求項５に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
  10. 　請求項６～請求項９のいずれか１項に記載の免疫学的分析方法を実行するためのキット。
  11. 　以下の抗体（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体と、
    　　（Ａ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
    　　（Ｂ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
    　　（Ｃ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体； 
    　前記抗ＧＡＰ４３抗体を検出又は定量するための試薬と、
    を含む請求項１０に記載のキット。
  12. 　以下の抗体（Ａ）～（Ｃ）からなる群より選択された少なくとも１つの抗ＧＡＰ４３抗体を含む、成長円錐を検出するための試薬：
    　　（Ａ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第８９番目のスレオニン残基（Ｔ８９）と、リン酸化された第８９番目のスレオニン残基（ｐＴ８９）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；
    　　（Ｂ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第９６番目のセリン残基（Ｓ９６）と、リン酸化された第９６番目のセリン残基（ｐＳ９６）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体；及び、
    　　（Ｃ）　配列番号１３に示されるマウスＧＡＰ４３のリン酸化されていない第１７２番目のスレオニン残基（Ｔ１７２）と、リン酸化された第１７２番目のスレオニン残基（ｐＴ１７２）とを識別でき、成長円錐を特異的に検出可能な抗ＧＡＰ４３抗体。
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