WO2013056510A1

WO2013056510A1 - 脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: WO2013056510A1
Application number: PCT/CN2012/001392
Authority: WO
Inventors: 张始状; 程鑫; 高志芹; 韩明
Original assignee: Zhang Shizhuang
Priority date: 2011-10-17
Filing date: 2012-10-16
Publication date: 2013-04-25
Also published as: PL2769727T3; EP2769727B1; HUE029492T2; EP2769727A1; DK2769727T3; US20140309188A1; CN102499937A; CN102172359A; EP2769727A4; ES2587850T3

Abstract

脱氧核苷与核苷组合在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的脱氧核苷包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷；所述的核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷。本发明的脱氧核苷与核苷组合用于制备治疗胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、生殖系统肿瘤等多种常见恶性肿瘤的药物。

Description

脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用技术领域

本发明涉及脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，具体地说是将一种或两种脱氧核苷与其它核苷中的一种或多种按组合成药用于治疗肿瘤，属于肿瘤药物领域。

背景技术

核苷（nucleoside) 由碱基和五碳糖 (核糖或脱氧核糖)连接而成，即嘌呤的 N-9或嘧啶的 N-1与核糖或脱氧核糖的 C-1通过 β糖苷键连接而成的化合物，包括核糖核苷和脱氧核糖核苷两类，核糖核苷是构成 RNA的核苷，主要有腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷；脱氧核糖核苷（简称脱氧核苷）是构成 DNA的核苷，主要有脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸腺苷。核苷可从水解核酸来制备。用吡啶水溶液、氧化铝或酶促水解核糖核酸 RNA，可得到核糖核苷；用氧化铝或酶水解脱氧核糖核酸 DNA可得到脱氧核糖核苷。核苷也可用化学方法合成。适当保护的核糖或脱氧核糖与碱基衍生物缩合，可得到相应的核糖核苷和脱氧核糖核苷。

核糖核苷，由除胸腺嘧啶外的嘌呤或嘧啶与核糖分子共价结合而成的化合物，主要有腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷。腺嘌呤核苷 (adenosine)简称腺苷，化学名： 9-β-ϋ-呋喃核糖基腺嘌呤， CAS号： 58-61-7，分子式： C₁₍₎H₁₃N₅0₄,分子量: 267.24。鸟嘌呤核苷简称鸟苷，化学名： 9-β-ϋ-呋喃核苷鸟嘌， CAS号： 118-00-3, 分子式： C₁₍₎H₁₃N₅0₅，分子量： 283.24。胞嘧啶核苷简称胞苷，化学名： Ι-β-D-呋喃核糖基胞嘧啶， CAS号： 65-46-3, 分子式： C₉H₁₃N₃0₅，分子量 243.22。尿嘧啶核苷简称尿苷，化学名： Ι-β-D-呋喃核糖基尿嘧啶， CAS号： 58-96-8, 分子式： C₉H₁₂N₂0₆，分子量 244.20。

脱氧核糖核苷（deoxynucleoside), 是嘌吟碱 (腺嘌呤、鸟嘌呤)的 N-9或嘧啶碱 (胞嘧啶、胸腺嘧啶)的 N-1与 2-脱氧 -D-核糖的 C-1通过 β糖苷键相连接而成的化合物，体内主要的脱氧核苷有脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸腺嘧啶脱氧核苷（简称胸苷）。脱氧腺苷（deoxyadenosine) 即 2'-腺嘌呤脱氧核苷，化学名： 9-p-D-2'-脱氧呋喃核苷腺嘌呤，是腺嘌呤的 N-9与 2-脱氧核糖的 C-1 替换页（细则第 26条）通过 β糖苷键相连所形成的化合物， CAS号： 958-09-8, 分子式： C_1QH₁₃N₅0₃，分子量： 251.24。脱氧鸟苷（deoxyguanosine) 即 2'-鸟嘌呤脱氧核苷，化学名： 9-β-2'-呋喃脱氧核苷鸟嘌呤，是鸟嘌呤的 Ν-9与 2-脱氧核糖的 C-1通过 β糖苷键相连接所形成的化合物， CAS号： 961-07-9, 分子式： C₁₍₎H₁₃N₅0₄, 分子量： 267.24。脱氧胞苷（deoxycytidine) 即 2'-脱氧胞嘧啶核苷，化学名： 1-β-2'-呋喃脱氧核苷胞嘧啶，是胞嘧啶的 N-1与 2-脱氧 -D-核糖的 C-1通过 β糖苷键相连接所形成的化合物， CAS 号： 951-77-9, 分子式： C₉H₁₃N₃0₄，分子量： 227.22。胸腺嘧啶脱氧核苷简称胸苷（Thymidine) 即 2'-脱氧胸腺嘧啶核苷，或 β-胸苷，化学名： 9-P-D-呋喃核苷胸腺嘧啶， CAS号： 50-89-5, 分子式： C₁₍₎H₁₄N₂0₅，分子量为 242.023。

一磷酸脱氧核糖核苷是构成脱氧核糖核酸 DNA的结构片段，脱氧核苷及其衍生物具有良好的生理活性，是基因药物和基因工程研究的重要原料。如 2-氯脱氧腺苷用于治疗白血病，从复合虫草素中提取的 2'脱氧腺苷和 3'脱氧腺苷及 2 脱氧腺苷和 3 脱氧腺苷对肿瘤有明显的抑制作用，脱氧无环鸟苷（地昔洛伟）有显著的抗病毒作用， 2脱氧胞苷（扎西胞苷）是临床上常用的治疗艾滋病的药物。因此脱氧核苷类似物是许多抗病毒、抗肿瘤、抗艾滋病药物的良好中间体。但是将脱氧核苷或 /与其它核苷按组合，用于抗肿瘤领域，尚未见相关报道。发明内容

本发明的目的在于，提供了脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，将四种脱氧核苷包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种或两种与其它核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷的一种或多种组合作为治疗肿瘤的药物成分使用，较单独应用能够达到明显提高抗肿瘤效果，减少毒副作用和延缓耐药性发生的目的。

本发明的技术方案为：

脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，所述的脱氧核苷包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷；所述的核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷。

其中，所述的脱氧核苷为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种替换页（细则第 26条) 或两种；所述的核苷为腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种或多种。

优选地，所述的脱氧核苷为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种；所述的核苷为腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种或两种，且选择的脱氧核苷与核苷不同。

优选地，所述的脱氧核苷为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的两种；所述的核苷为腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种或两种，且选择的脱氧核苷与核苷不同。

进一步地，所述的脱氧核苷为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的两种，所述的核苷为腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种。

优选地，所述的脱氧核苷为脱氧腺苷和脱氧鸟苷，所述的核苷为一种核糖核苷。

进一步地，上述各成分的摩尔数相同。

所述的肿瘤包括胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、生殖系统肿瘤等多种常见恶性肿瘤。

经研究发现：不同的核苷组合用药比单一用药血液中的单一药物浓度降低，因而毒副作用下降。同时多药用药可延缓肿瘤耐药性的发生。通过组合用药，能够降低各成分单一用药时的用药量，而每种具体核苷的绝对浓度明显下降，药物毒副作用就下降；同时，二种或多种化疗药物组合用药可大大降低耐药性的发生。相比脱氧核苷与另一种核苷用药，脱氧核苷与另两种核苷的组合，其耐药性大大降低；相比脱氧核苷与另四种核苷组合用药，脱氧核苷与另两种核苷的组合，在降低了耐药性的同时，使用起来也方便，容易配制。

将脱氧核苷与其它核苷组合后，用在制备治疗上述肿瘤的药物中，直接制成注射剂，进行注射使用；注射剂可以是常规注射剂，也可是各种类型的缓释注射剂。

不同肿瘤有不同的核苷代谢与组成特点，对不同肿瘤细胞每种核苷有不同的抑制强度。经研究发现，嘌呤核苷的抗肿瘤作用强于嘧啶核苷，且嘌呤核苷替换页（细则第 26条）的代谢产物次黄嘌吟核苷（即肌苷）也有一定的抗肿瘤作用；同一碱基的核苷脱氧核苷抗肿瘤作用强于非脱氧核苷。脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷与其对应的非脱氧核苷（即腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷）分子中差一个氧原子，分子量小 16D，在浓度 0.03mmol/L以上表现出抗肿瘤活性，在浓度 0.4mmol/L体外抑瘤率达 80%以上。脱氧核苷抗肿瘤作用明显，单一脱氧腺苷治疗肿瘤瘤体大小的 15°/。完全缓解，有效率为 91.0%以上，且使用剂量低，为 4.0〜35.0 mmol /Kg/ 天，持续缓慢静脉点滴。

本发明的优点在于：

1、脱氧核苷与其它核苷组合用于制备治疗胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、生殖系统肿瘤等多种常见恶性肿瘤的药物，抗肿瘤效果明显，具有高效、广谱、低毒的特点；对正常细胞无细胞毒作用是该发明的最大优点。

2、脱氧核苷与其它核苷组合用药比单一用药血液中的单一药物浓度降低，从而毒副作用降低；

3、脱氧核苷与其它核苷组合用药可延缓肿瘤耐药性的发生。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例 1

脱氧核苷与其它核苷的抑瘤实验

一、试验方法

将人肝癌 Bel-7402肿瘤细胞和人肺癌细胞 PG (中国科学院上海细胞所提供），用含 10%新生牛血清的 RPMI 1640培养基培养，取对数生长期的细胞，用 0.25%胰蛋白酶消化后以 3χ10³个 /孔接种于 96孔板，置于 37°C、 5%C0₂培养箱中培养 24小时，每组设 8个复孔，试验组分别加入总浓度为 lO.Ommol/L的核苷溶液 60iiL,补充培养液至每孔 200μί，对照组的 5-FU试验组的脱氧腺苷的用量（mmol L) 相同，用无血清培养基稀释， 0.22μπι的无菌微孔滤膜过滤。在拟定的测量时间 48小时，倒置显微镜观察细胞形态并拍照，然后每孔加入 5mg/mL 的 MTT溶液 20μί, 置于 37°C、 5%C0₂培养箱中继续培养 4小时，终止培养，替换页（细则第 26条) 吸弃孔内培养的上清液，每孔加入 15(^L DMSO，震荡 10分钟，使结晶物充分溶解后，以自动酶标仪（Thermo, 型号 MULTISKAN MK3 )测量 570mn处吸光度。每一板每组设 8个复孔，每个实验重复 3次，表 1 中数据为三次实验的平均均数。在以后的实施例中，数据的计算完全与本实施例相同。

肿瘤细胞生长抑制率计算公式如下：

肿瘤细胞存活率(％)=加药孔的实际 OD值 /阴性对照孔的 OD值；

肿瘤细胞生长抑制率 (％)=100%—细胞存活率。

表 1.各种核苷对 7402、 PG肿瘤细胞 48小时抑制率（％)

(表中： A、 G、 C、 U分别代表腺苷、鸟苷、胞苷和尿苷， dA、 dG、 dC、 T分别代表脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和胸苷）

二、结果与分析

从上表 1中可以看出：

1、脱氧核苷与非脱氧核苷均有抗肿瘤作用；

2、嘌呤核苷抗肿瘤作用强于嘧啶核苷；

3、脱氧核苷抗肿瘤作用强于非脱氧核苷。

实施例 2

一种脱氧核苷与一种核苷组合及该种脱氧核苷、核苷单独用药的抑瘤试验一、试验方法

分别设置各种脱氧核苷与核糖核苷的组合及对照组（5-FU) 实验，见表 2。用药于人结肠癌细胞株 ΗΤ-29肿瘤细胞（中国科学院基础医学研究所所提供)，方法和条件同实施例 1。核苷的总浓度、单一核苷浓度及 5-FU浓度的相同，并与实施例 1相同。替换页（细则第 26条) 表 2. 脱氧核苷与核苷组合对 HT-29细胞的抑制率（％)

二、结果与分析

从表 2 中可以看出，脱氧核苷与核苷的组合抗肿瘤作用比单一核苷抑瘤率均有所提高；因单一核苷的浓度降低 50%，从而其副作用也有不同程度降低。实施例 3

一种脱氧核苷与二种核糖核苷组合、以及相同的单独一种脱氧核苷、单独核糖核苷和对照组（5-FU) 的对人肝癌 Bd-7402抑瘤试验

一、试验方法：分别设置各种脱氧核苷与核糖核苷的组合及对照组（5-FU) 实验，见表 3。用药于人肝癌 Bd-7402肿瘤细胞（中国科学院上海细胞所提供），方法和条件同实施例 1。核苷的总浓度、单一核苷浓度及 5-FU浓度的相同，并与实施例 1相同。

表 3、脱氧核苷及不同组合对 7402抑制率（％)

二、结果与分析

从上表 3中可以看出：一种脱氧核苷与二种核糖核苷组合对 BGC823有明替换页（细则第 26条) 显抑瘤率，较单独的单独一种脱氧核苷或单独的二种核糖核苷组合的肿瘤抑制率均高，且临床发现其毒副作用低。

实施例 4

一种脱氧核苷与二种核苷（一种脱氧、一种非脱氧）组合、以及相同的单独一种脱氧核苷、单独二种核糖核苷和对照组（5-FU) 的对人胃癌细胞株 BGC823抑瘤试验

一、试验方法

分别设置各种脱氧核苷与其它核苷的组合及对照组（5-FU)实验，见表 4。用药于人胃癌细胞株 BGC823肿瘤细胞（中国科学院基础医学研究所所提供)，方法和条件同实施例 1。核苷组合的总浓度、单一核苷浓度及 5-FU浓度的相同，并与实施例 1相同。

表 4、脱氧核苷及不同组合对 BGC823抑制率（％)

二、结果与分析

从上表 4中可以看出：

1、一种脱氧核苷、一种脱氧与一种非脱氧核苷组合、二种脱氧核苷与一种非脱氧核苷组合，其对肿瘤的抑制作用依次提高，其中， dA+dG+C因为有 2种脱氧嘌呤核苷参与，对胃癌细胞株 BGC823抑制最明显；

2、核苷组合后不但没有降低肿瘤抑制作用，而是提高了对肿瘤的抑制作用。实施例 5

二种脱氧核苷与一种核糖核苷组合、以及单独二种脱氧核苷、单独一种核糖核苷和对照组（5-FU) 对人乳腺癌细胞株 Bcap-37的抑瘤试验

一、试验方法

分别设置二种脱氧核苷与一种核糖核苷组合、以及单独二种脱氧核苷、单独一种核糖核苷、和对照组（5-FU) 的抑瘤试验，见表 5。用药于人乳腺癌细胞替换页（细则第 26条）株 Bcap-37肿瘤细胞（中国科学院基础医学研究所所提供），方法和条件同实施例 1。核苷组合的总浓度、单一核苷浓度及 5-FU浓度的相同，并与实施例 1相同。

表 5、二种脱氧核苷与一种核糖核苷组合对 Bcap-37抑制率（％)

二、结果与分析

从上表 5中可以看出：

1、一种核糖核苷、两种脱氧核苷组合、二种脱氧核苷与一种非脱氧核苷组合，其对肿瘤的抑制作用依次提高，其中，二种脱氧核苷与一种核糖核苷组合对 Bcap-37抑制率最高；

2、核苷组合与其它抑瘤率的变化与核苷抑瘤特点相关。

实施例 6

二种脱氧核苷与二种非脱氧核糖核苷组合、以及单独二种脱氧核苷、单独二种核糖核苷和对照组（5-FU) 人宫颈癌细胞株（Hela)

的抑瘤试验

一、试验方法

分别设置二种脱氧核苷与二种非脱氧核糖核苷组合、以及单独二种脱氧核苷、单独二种核糖核苷和对照组（5-FU)抑瘤试验，见表 6。用药于人宫颈癌细胞株 Hda肿瘤细胞（中国科学院基础医学研究所提供），方法和条件同实施例 1。核苷组合的总浓度、单一核苷浓度及 5-FU浓度的相同，并与实施例 1相同。表 6、二种脱氧核苷与二种非脱氧核糖核苷组合对 Hda的抑瘤率（％)

替换页（细则第 26条) dA+dG dA+dG c+u dG+dC dG+dC A+G dC+T+ 5-FU

+C+U +A+G G C

48H 87 93 60 SO 85 80 78 92

72H 92 97 67 84 90 87 82 96 二、结果与分析

从上表 6中可以看出：

1、 4种组合与 3种组合相比优势不明显；

2、在 Hda细胞上显示出脱氧核苷抗肿瘤作用优于非脱氧核苷。

实施例 7

二种脱氧核苷与另外二种脱氧核苷组合、以及分别单独的二种脱氧核苷和对照组（5-FU)对人胶质瘤细胞株 SHG-44的抑瘤试验

一、试验方法

分别设置 4种脱氧核苷组合与 2种脱氧核苷组合和对照组（5-FU) 抑瘤试验，见表 7。用药于人胶质瘤 SHG-44肿瘤细胞（中国科学院基础医学研究所提供），方法和条件同实施例 1。核苷组合的总浓度、单一核苷浓度及 5-FU浓度的相同，并与实施例 1相同。

表 7、 4种脱氧核苷组合与 2种脱氧核苷组合对 SHG-44抑瘤率

二、结果与分析

从上表 7中可以看出： 4种脱氧核苷组合与 2种脱氧核苷组合相比，两种脱氧嘌呤核苷的抗肿瘤作用最强，其次是 4种脱氧核苷组合，嘧啶核苷的作用最小。

替换页（细则第 26条）实施例 8

二种脱氧核苷与一种非脱氧核糖核苷组合，在不同的用量比试验对人胰腺癌细胞株 PANC-1抑制实验。

一、试验方法

设置 2种脱氧核苷（dA+dG) 与 1种脱氧核苷（C) 组合和对照组（5-FU) 抑瘤试验，见表 8。用药于人胰腺癌细胞株 PANC-1肿瘤细胞（中国科学院基础医学研究所提供），方法和条件同实施例 1，核苷组合的总浓度相同，并与对照组的浓度相同。

其中， A1用药比例 1 :1:1， A2用药比例 2:2:1 , A3用药比例 1 :1 :2， A4用药比例 2:1 :2, A5用药比例 3: 3： 1， A6用药比例 1 :1 :3， A7用药比例 3:1:3。

表 8、不同用量比 2种脱氧（dA+dG)、 1种非脱氧核苷（C)对 PANC-1抑瘤率 (%)

二、结果与分析

从上表 8 中可以看出：二种脱氧核苷与一种非脱氧核糖核苷组合在用药比例为 A5 (用药比例 dA: dG: C 为 3: 3: 1 ) 时抑瘤作用最佳。同时在临床治疗肿瘤药物制备时，要考虑到临床用药的可行性和安全性。

通过上述实施例人肿瘤细胞抑瘤的观察发现，脱氧核苷与核苷组合与单一用药相比，无细胞毒作用发生。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

替换页（细则第 26条)

Claims

权利要求书

1、脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，所述的脱氧核苷包括脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷；所述的核苷包括腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷。

2、根据权利要求 1所述的脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的脱氧核苷为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种或两种；所述的核苷为腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种或多种。

3、根据权利要求 1所述的脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的脱氧核苷为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种；所述的核苷为腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种或两种。

4、根据权利要求 1所述的脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的脱氧核苷为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞昔、胸苷中的两种；所述的核苷为腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种或两种。

5、根据权利要求 1所述的脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的脱氧核苷为脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的两种，所述的核苷为腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷中的一种。

6、根据权利要求 5所述的脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的脱氧核苷为脱氧腺苷和脱氧鸟苷，所述的核苷为一种核糖核苷。

⁷、根据权利要求 1-6中任意一项所述的脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的每种脱氧核苷与核苷的摩尔数相同。

8、根据权利要求 7中任意一项所述的脱氧核苷与核苷组合在制备肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤包括胃癌、肺癌、肝癌、结 ¾癌、乳腺癌、白血病、生殖系统肿瘤。