WO2013032174A2 - 단백질 합성 키트，자동추출장비를 이용한 단백질 발현 및 추출 방법 - Google Patents

단백질 합성 키트，자동추출장비를 이용한 단백질 발현 및 추출 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein, and more specifically, to a heating part.
  • the present invention relates to a protein production method characterized by simultaneous expression and extraction of a target protein in a fully automated system using an automatic biological material purification device equipped with a magnetic field.
  • the method of expressing the protein in culture is generally used. This method requires a strain selection process that stably expresses the recombinant protein, and it is difficult to express the protein in the case of a protein that shows toxicity to cells. It takes a few days to several months to get the protein.
  • the time required can be significantly reduced.
  • the reason for the proper temperature and time for the protein to be expressed is that the enzyme is synthesized from the DNA in the tube and from the RNA to the protein in the whole process.
  • the activity must be accompanied by the reaction mentioned above when the temperature of 30 to 40 ° C, which is the activity of many enzymes, is maintained.
  • the expressed protein In order to easily purify the recombinant protein expressed from the sample, the expressed protein must have affinity for a specific substance. Recently, the recombinant protein is expressed mainly with histidine bound and
  • a method of purifying proteins using the affinity of metal ions (nickel ions and cobalt ions) is used, and a variety of related products are sold. Among them, magnetic particles are widely used.
  • the metal has silver on its surface, which can be combined with histidine of the target protein to extract only the target protein from a number of proteins. [5]
  • the above-mentioned techniques are not capable of low yield and high purity purification, and the reproducible production of the same protein has not yet solved the fundamental problem of complex protein expression and inefficient production method according to cell culture.
  • the present invention provides both the expression and extraction of the target protein in a fully automated system using a biological material automatic purification device equipped with a heating part and a magnetic field device.
  • the present invention provides a method for producing a protein by combining a cell-free protein expression method with a protein extraction method using magnetic particles that bind to an affinity tag to simultaneously perform expression and extraction of the target protein.
  • the aim is to provide a protein synthesis kit.
  • the present invention is compatible with cell-free protein expression methods to achieve the above object.
  • the present invention provides a protein production method characterized by simultaneously performing expression and extraction of a target protein in a fully automated system by using a biological material automatic purification device having a heating unit and a magnetic field applying unit including the step.
  • a biological material automatic purification device having a heating unit and a magnetic field applying unit including the step.
  • It provides a first multi-well plate kit 420 comprising a washing solution.
  • the method comprises (a) a solution for diluting the template for acellular protein synthesis; (b) a cell-free protein expression solution for expressing the target protein from the template; a second multiwell plate kit (420 ') comprising; and (c) a magnetic particle for attaching the target protein; (d) the target protein elution solution; (e) a magnetic particle reaction solution and a washing solution for binding the target protein to the magnetic particles; using a first multi-well plate kit 420, the fully automated system
  • the present invention provides a protein production method characterized by simultaneously expressing and extracting a target protein.
  • the template for acellular protein synthesis may be a circular form or a linear form of DNA.
  • the plasmid DNA may be used as the circular DNA.
  • Linear DNA can be used, but is not limited to PCR products.
  • the linear DNA can amplify the target gene and use a primer set designed to have overlapping sequences at the 5 'and 3' ends and a sample premix for PCR. Amplifying the gene to obtain a primary reaction product;
  • Second amplification by using a premix (hereinafter referred to as a 'PCR kit'); and may be prepared.
  • the PCR premix is a mixture of components necessary for amplification reaction, which may include a deoxynucleotide mixture (dNTP mixture) and a complete solution, as well as thermostable DNA such as TaqDNA polymerase. It can also contain polymerases.
  • the complex can also be prepared in liquid or dry form.
  • a PCR kit used in the production of linear DNA includes a premix for PCR, and an affinity tag at both ends 5 'and 3 of the target gene.
  • a cassette set 0.1 to 0.5 ng / ul for encoding the second and second prime and reverse primer angles with overlapping sequences at the 5 'and 3' ends of the casette may include 0.1 to 1.0 pmoles / ul.
  • the term 'cassette' can be artificially linked to DNA fragments.
  • the term 'primer' is a single-stranded nucleic acid sequence having a short free 3 'hydroxyl group that can form a template and base pair of complementary nucleic acids.
  • a short nucleic acid sequence that serves as a starting point for strand copying of a template.
  • the primer initiates DNA synthesis in the presence of reagents for polymerization reactions (i.e., DNA polymerase) and four different dNTPs at the appropriate complete solution and temperature.
  • the PCR kit of the present invention includes primers and cassette sequences specific for the nucleotide sequence of the target gene.
  • a plurality of pipettes (141, 142) are detachably mounted, the pipette block (100) for suctioning and discharging a biological sample containing a target material on the pipettes (141, 142), respectively;
  • a magnetic field applying unit 700 positioned below the specific unit well of the multiwell plate kit 420 ', 420 for heating and applying; heating the specific unit well of the multiwell plate kit 420', 420; Intended to
  • the biological material automatic refining apparatus having the heating unit and the magnetic field applying unit includes a magnet mounting unit equipped with a magnet and a heating unit for heating.
  • the magnetic field is turned on or off and the temperature It is possible to form the magnetic mounting part.
  • the end of the well inlet groove is formed to wrap the lower part of the unit well of the multiwell plate kit, so that the reaction efficiency can be further improved.
  • the magnetic field applying unit 700 is equipped with a magnet 711
  • Magnet mounting portion 710; Lifting portion 760 for raising and lowering the magnetic mounting portion 710; may include, The upper surface of the magnetic mounting portion 710 of the multi-well plate kit (420 ', 420) A unit well inlet groove 713 is formed to allow a specific unit well lower portion to be drawn in, and the base plate 400 has the specific unit well lower portion of the multiwell plate kits 420 'and 420 when the magnetic mounting portion 710 rises. A unit well exposure hole 400-3 is formed to be introduced into the unit well inlet groove 713, and a lower portion of the specific unit well of the multiwell plate kit 420 ′ and 420 is formed in the unit well.
  • a predetermined distance from the unit well lower portion of the multiwell plate kit 420 ′ and 420 adjacent to the retracting groove 713 may be spaced apart, and the magnet 711 may be formed in the unit well.
  • the method for producing a protein according to the present invention comprises injecting a template for cell-free protein synthesis into a unit well of the multiwell plate kit 420 ';
  • reaction step (S120) Reacting with magnetic particles, reaction step (S120);
  • the desired protein-containing solution obtained obtaining a heunhap is water the desired protein-containing solution, except for the desired protein o the magnetic particles of the protein elution solution comprises, separated by applying a magnetic field from the magnetic particles to the common compounds (S200 It is characterized by being produced, including.
  • the injection step (S10) of the present invention is the heating unit and the magnetic field
  • the multi-well plate kit 420 ' is formed by using a plurality of pipettes 141 and 142 mounted on the biological material automatic purification device including the heating unit and the magnetic field applying unit.
  • DEPC distilled water (H) for diluting the template for cell-free protein synthesis injected into the unit wells of the multiwell plate kit (420 ') into the template for cell-free protein synthesis injected into the unit well (L).
  • the second mixing step (S30) is performed after the first mixing step.
  • the second mixing step (S30) is the multiwell using the pipettes (141, 142)
  • the specific unit well of the multiwell plate kit 420 ' in a unit well L into which a template for cell-free protein synthesis is mixed with the DEPC distillation water injected into the unit well of the plate kit 420'.
  • the mixture preparation step (S40) is performed after the second mixing step (S30).
  • the complex preparation step (S40) is for acellular protein synthesis, which is mixed with the DEPC distilled water injected into the unit well of the multiwell plate kit 420 'using the pipettes 141 and 142. To prepare a protein synthesis reaction solution by mixing the cell lysate injected into the cell lysate storage solution 442-1 in the unit well (L) in which the template is injected. The heating step after the preparation of the complex (S40) Perform (S50).
  • the magnetic mounting part 710 is raised in the first heating step so that the bottom of the specific unit well L of the multiwell plate kit 420 ′ is lower than the unit well inlet groove 713.
  • the lower portion of the specific unit well L of the multiwell plate kit 420 ' is heated by using the heating unit 720 to heat the protein synthesis reaction liquid within the specific unit well L.
  • the first protein expression injection step (S60) may be further performed after the heating step (S50).
  • the first protein expression reaction is performed in the protein synthesis reaction solution in the specific unit well (L) using the pipettes (141, 142). Injecting into the unit well (J) of the multi-well plate kit (420 '), the magnetic particle reaction mixture after the first protein expression injection step (S60) A preparation step S70 is performed.
  • the preparation of the magnetic particle reaction mixture (S70) may include the pipettes (141, 142).
  • the magnetic particle reaction solution injected into the unit well (A) of the multiwell plate kit (420) is mixed with the magnetic particles injected into the unit well (F) of the multiwell plate kit (420). After preparing the particle reaction mixture (S70)
  • the injection step (S80), the first magnetic field application step (S90) and the first system removal step (S100) of the magnetic particle mixed reaction solution may be performed sequentially.
  • the injection of the mixed magnetic particle mixed reaction liquid further performed (S80) is a second main mip step, using the pipettes 141 and 142 in the state where the magnetic mounting part 710 is lowered.
  • the mixture mixed with the liquid is injected into a specific unit well which is injected into the specific unit well L of the multiwell plate kit 420 '.
  • the first magnetic field applying step S90 is performed.
  • the magnetic mounting portion 710 is raised to lower the specific unit well L of the multi well plate kit 420 '.
  • the first removing step (S100) is a mixture of the magnetic particles and the reaction mixture
  • the magnetic particles and the adhered particles attached to the magnetic particles are applied to the lower portion of the specific unit well of the multiwell plate kit 420 'by a magnetic field applied to the lower portion of the specific unit well L of the multiwell plate kit 420'.
  • the pipettes (141, 142) to remove the mixture except the magnetic particles and the adhered to the magnetic particles of the mixture mixed with the magnetic particle reaction solution, 1 After the removal step (S100) proceeds to perform the protein expression injection step (S110).
  • the protein expression injection step (S110) is performed by using the pipettes (141, 142) to insert the primary protein expression injected into the unit well (J) of the multiwell plate kit (420 ′). Injecting into the unit well (L) of the plate kit (420 '), and performing the reaction step (S120) after the second protein expression product injection step (S110).
  • the secondary protein expression injected into the unit well (L) of the multiwell plate kit 420 'using the pipettes 141 and 142 may include the multiwell plate kit ( 420 ') to react with the magnetic particles injected into the unit well (L),
  • the second magnetic field applying step S130 may be further performed.
  • the second magnetic field applying step (S130), which is further performed, includes the magnetic mounting portion 710.
  • the removal step (S140) is a second removal step, which is mixed with the secondary protein expression.
  • the magnetic particles to which the protein is attached in the complex are applied by the magnetic field applied under the specific unit well (L) of the multi well plate kit (420 '), thereby specifying the multi well plate kit (420').
  • the second removal step (S140) After the state attached to the inner wall of the lower portion of the unit well (L), by using the pipette (141, 142) to remove the mixture except the magnetic particles and the protein bound to the magnetic particles, the second removal step (S140) after
  • the washing step (S150) is the magnet mounting portion 710 in the lowered state
  • the washing solution injected into the unit wells of the multi well plate kit 420 using the pipettes 141 and 142 to the specific unit well L of the multi well plate kit 420 '.
  • the washing step 150 and then the removal step (S170) is performed.
  • the removal step (S170) is a three-step removal step, increasing the mixture mixed with the washing solution.
  • the magnetic unit to which the target protein is attached is lowered to the specific unit well of the multi well plate kit 420 'by a magnetic field applied to the lower of the specific unit well of the multi well plate kit 420'.
  • the removal step After (S170) the target protein separation step (S180) is performed.
  • a washing step (S150) for washing impurities other than the target protein and a removing step (S170) for removing the mixture except for the magnetic particles to which the target protein is requested may be performed one or more times, After the washing step 150, the third magnetic field applying step S160 may be further performed.
  • the magnet mounting portion 710 is raised to lower the specific unit well L of the multi well plate kit 420 ′.
  • the magnetic field is applied from the magnet mounting portion 710 to the lower portion of the specific unit well L of the multi well plate kit 420 ′ by being introduced into the recess groove 713.
  • the target protein separation step (S180) performed after the removal step (S170) may be performed.
  • the multi-well plate kit 420 is provided with the target protein elution solution injected into the unit well of the multi-well plate kit 420 using the pipettes 141 and 142 while the magnet mounting unit 710 is lowered. And separating the target protein by injecting the specific unit well (L) into a fourth magnetic field after the target protein separation step (S180).
  • the applying step S190 may be further performed.
  • the magnet mounting unit 710 is raised to lower the specific unit well L of the multi well plate kit 420 ′.
  • the target protein-containing solution acquiring step (S200) is performed by the magnetic particles in the target protein elution solution containing the target protein separated from the magnetic particles in the specific unit well lower portion of the multiwell plate kit 420 '.
  • L) is attached to the inner wall of the bottom of the specific unit well L of the multiwell plate kit 420 'by the magnetic field applied thereto, and then separated from the magnetic particles using the pipettes 141 and 142.
  • a protein can be produced by obtaining a target protein-containing solution, which is a complex of the protein eluate containing the target protein except for the magnetic particles.
  • the obtaining of the target protein-containing solution (S200) is
  • the magnetic particle is a magnetic particle that binds to an affinity tag of a target protein, more specifically, containing a metal ion, and preferably a magnetic particle to which nickel ions are bound. Should be.
  • a protein extraction method using the magnetic particles is acellular.
  • Protein production method according to the present invention is a multi-well plate kit
  • 1 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • the base plate of the automatic purifier is inserted into the casing,
  • FIG. 2 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • 3 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • FIG. 4 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • the perspective view of the casing of the automatic refining device is partially removed.
  • FIG. 5 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • FIG. 6 is a perspective view of a magnet mounting part and a lifting part of a biological material automatic refining apparatus having a heating part and a magnetic field applying part according to the present invention
  • FIG. 7 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • FIG. 8 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • FIG. 9 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • 10 is a biological material having a heating unit and a magnetic field applying unit according to the present invention.
  • a to D Well region in which the magnetic particle reaction solution and washing solution exist to bind the target protein to the magnetic particles
  • E Well region in which the target protein elution solution exists
  • F The magnetic particle to attach the target protein Existing well area
  • casing 310 back and forth support rod
  • UV lamp 360 touch screen
  • pipette rack 440 tube rack for protein storage
  • waste container 442-1 cell lysate storage reservoir
  • height sensor 781 sensing unit
  • the expression vectors for E. coli can be used but are not limited to pBIVT (Bionia, Korea), pIVEX (Roche, Germany), pET (Novagen, Germany), pK7, and pQE.
  • the E. coli expression vector has an affinity tag in the expression vector.
  • an expression vector containing a histidine tag was used, but this is not limiting and other tags may be included. have.
  • CalmL3, RNaseH, DUSP3, CAT, AcGFP, EF-Ts, VF, Poly A polymerase, MMLV RTase, BM3, and genes were used.
  • restriction enzyme treatment for gene synthesis material was & zmHI (Bioneer, Korea) 1 "£, iVotI (Bkmeer, Korea) 1 ⁇ , 10X AccuCutTM buffer (Bioneer, Korea) 2 ⁇ , gene synthesis 10 ⁇ of substance and 6 ⁇ of sterile distilled water were added to each tube, mixed, and placed at a constant temperature for 3 hours at 37 ° C.
  • Restriction enzyme treatment for E-only expression vector was performed by izmHI (Bioneer, Korea) 1 VotI (Bioneer). Co., Ltd.
  • a target gene can be amplified first, and a primer set having overlapping sequences at 5 'and 3' ends is prepared and prepared, and a sample (genomic DNA, T vector, etc.) having the target gene is used as a template.
  • the first PCR reaction was carried out. AccwPc erPCRPremix provided by PCR reaction kit was used, and reaction conditions were denatured at 94 ° C for 5 minutes, and the reaction was performed at 94 ° C for 30 seconds, 58 ° C for 30 seconds, and 1 minute at 72 0 C. The amplification was performed at 30 cycles, and finally, at 72 ° C for 5 minutes.
  • the first PCR reaction product was then subjected to the AccuPrep PCR purification kit (Bioneer, Korea) or AccuPrep Gel Extraction kit (Bioneer, Korea) to prepare and prepare.
  • PCR fragments for protein synthesis were synthesized.
  • PCR reaction was performed by adding the cassette set, primer set and primary PCR reaction product provided in the kit of Table 1 above, and the reaction conditions were denatured at 94 ° C for 5 minutes, and the reaction was performed at 94 ° C for 1 minute, 48 1 cycle at 1 ° C, 1 minute at 72 ° C amplified in 30 cycles (cycle), and finally proceeded to the conditions of polymerization at 72 ° C, 5 minutes.
  • the second PCR reaction product was added to AccuPrep Gel Extraction kit ( Bioneer, Korea) was used for purification.
  • Oligonucleotides encoding portions of the affinity tag to be bound more preferably include a histidine tag.
  • Escherichia coli [BL21 (DE3) (manufactured by Novagen, USA)] was incubated in a 350 I fermentation tank (2 ⁇ YT medium) at a temperature of 37 ° C. Then, by adding 1 mM IPTG at an absorbance (OD 600) of 0.5 , Expresses T7 RNA polymerase and absorbance (OD 600) at 3.0 to 6.0 The cultures were stopped and cells were recovered by centrifugation and stored at -50 ° C.
  • the cell disruption solution was separated by high speed centrifugation (16,000 RPM, 30 minutes, 4 0 C).
  • Mg (OAc) 2 10.4 mM ATP, 200 mM creatine phosphate, 4.4 mM DTT, 0.04 mM amino acids, 26.7 glmi creatine kinase] were added at a rate of 3 m £ per 10 ⁇ of cell lysate.
  • Precultured solutions were made. Then, the precultured solution was put in a dialysis tube (10 kDa, Dialysis Tubing, manufactured by Sigma, USA), and dialyzed in dialysis solution 4 times at 4 ° C for 45 minutes in a 20-fold buffer solution to remove foreign substances after preculture.
  • a protein expression solution for cell-free protein synthesis was prepared.
  • the cell-free protein solution [U 4 mM Hepes-KOH ( pH 8. 2), 2. 4 mM ATP, each 1.7 mM CTP, GTP and UTP, 2 mM DTT, 90 mM K (Glu), 80 mM NH4 (OAc), 12 mM Mg (OAc), 68 g / m £ folinic acid (L-5-formyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolic acid), 1.5 mM 20 amino acids each, 2% PEG 8000, 67 mM creatine phosphate] was prepared. This expression solution was stored at -20 o C until the multi well plate kit was prepared.
  • the magnetic magnetic particles used for protein purification produce magnetic iron (Fe) particles.
  • Magnetic magnetic particles coated with silica and complexed with nickel can be purchased from Sigma, Promega, Qiagen, and the like.
  • the advantage of this magnetic bead is that it is possible to purify the protein more easily by using the magnetic properties, it can be used in various fields.
  • Magnetic particle reaction solution and washing solution were prepared. Specifically, magnetic particle reaction solution and washing solution [50 mM HEPES-KOH (pH7.5), 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 5 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 10% (v / v) glycerol] Prepared. This solution is multi well Plate kits were stored at 4 ° C. until preparation.
  • a protein elution solution [50 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 300 mM NaCl, 1 M Imidazole, 5 mM 2-mercaptoethanol (2-ME), 10% (v / v) glycerol] was prepared This solution was stored at 4 ° C. until the multiwell plate kit was prepared.
  • the cell lysate which is prepared in Example 2, is completely dissolved in ice.
  • the completely dissolved cell lysate was dispensed into 8-strip tubes 200 ⁇ each and stored at -70 ° C.
  • the multiwell plate kit was prepared using the solution prepared in Examples 3 to 5.
  • a crab 2 multiwell plate kit 420 was manufactured. Specifically, after the cell-free protein expression solution prepared in Example 3 was completely dissolved in ice, 350 ⁇ of the protein expression solution was dispensed into column G of the multiwell plate in FIG. 10B, and DEPC distilled water (Bioneer, After dispensing 200 ⁇ each, the top surface of the multiwell plate was sealed with a film and stored at -20 ° C.
  • a first multiwell plate kit 420 was manufactured. Specifically, the magnetic particle reaction solution and the washing solution prepared in Example 4 are each dispensed 1.2 to the columns A to D of the multiwell plate 1 in FIG. 10A, and 250 ⁇ of the protein elution solution to the column ⁇ . And in column F, nickel ions
  • a solution containing magnetic particles (Bioneer, Korea) was dispensed at 500 f each, and the upper surface of the multiwell plate was sealed with a film and stored at 4 ° C.
  • a biological material automatic purification device having a heating part and a magnetic field applied part used in the present invention is a device described in Korean Patent Registration No. 10-1025135, Korean Publication No. 10-2011-0081718 or ExiPmgen TM (manufactured by Bioeer, Korea). Products may be used, but not limited to this. ExiPmgen TM (Bioneer, Korea) was used in this experiment.
  • the method of protein expression / extraction is carried out as shown in the schematic diagram of Fig. 9. Specifically, the tube and the multiwell plate kit, in which the cell lysate prepared in Example 1, 1 was dispensed, are completely taken out of the freezer and completely dissolved at room temperature. Automatic biological material purification device with heating part and magnetic field approved part Ej oge «TM (Bioneer, Drill holes in the 1st and 2nd multiwell plates with 6 Hole Puncher.
  • the cell lysate and the multiwell plate are placed in the appropriate location of ExiProgen TM (manufactured by Bioyer, South Korea). Place the elutiontube and the filter tip into the rack and the location of the rack. Push the set up tray and close the door of the machine. Power on ExiProgen TM (Bioneer, South Korea) and run Protocol 902.
  • the amount of template DNA added at this time depends on the type and size of the template DNA.
  • FIG. 8 shows an automatic biological material purification device having a heating unit and a magnetic field applying unit.
  • a target DNA injection step (S10) is used as a template for cell-free protein synthesis into a specific unit well.
  • DNA is added to the unit well L of the multiwell plate 420 '.
  • 5 and 8 have a first mixing step (S20) of injecting DEPC distilled water into a specific unit well and mixing the same.
  • the DEPC distillation water injected into the unit well H of the plate 420 ' is injected into the specific unit well L. Accordingly, the DEPC distillation water is mixed with the target DNA injected into the specific unit well L.
  • a second mixing step (S30) is performed in which a cell-free protein expression solution is mixed in a specific unit well.
  • the pipettes (141, 142) are mixed in the second mixing step (S30).
  • the cell-free protein expression solution injected into the unit well G of the multiwell plate 420 ' is injected into the specific unit well L.
  • the cell-free protein expression solution is mixed with the target DNA solution in the specific unit well L. do.
  • a mixture preparation step (S40) of injecting and mixing cell lysate into a specific unit well is included.
  • the pipettes (141, 142) may be used.
  • the cell lysate injected into the cell lysate-injected tube (442-1, see Fig. 5) is injected into the specific unit well L. Accordingly, the cell lysate is injected into the specific unit well L.
  • a protein synthesis reaction solution is prepared.
  • the first heating step S50 is performed.
  • the magnet mounting portion 710 (see FIG. 6) is raised so that the lower portion of the specific well in the unit well L is drawn into the unit well inlet groove (713, see FIG. 6). do.
  • a heating unit 720 (see FIG. 6) is operated to heat the lower portion of the unit well L, which is the specific unit well, to promote expression of the protein in the prepared protein synthesis reaction solution.
  • the reaction by the enzyme in the mixture is activated to perform RNA synthesis and protein expression from the target DNA.
  • the lower portion of the unit well L, which is the specific unit well may be heated to 30 ° C for 3 hours by the heating unit.
  • a first protein expression injection step (S60) into a specific unit well is performed.
  • the pipettes (141, 142) are used for the multi-well playful complex in which the protein is expressed from the unit well L, which is a specific unit well, after the first heating step (S50). It is injected into the unit well J of the site 420 '.
  • the magnetic particle semi-aqueous solution injected into the unit well A of the multi well plate 420 using the pipettes 141 and 142 is transferred to the unit well F of the multi well plate 420. Injecting and mixing with the magnetic particles. Accordingly, the surface of the magnetic particles is equilibrated with the magnetic particle reaction solution.
  • magnetic particles are injected into a specific unit well, that is, magnetic particles.
  • An injection step j (S80) for injecting a mixture mixed with the reaction solution into a specific unit well has a second injection step.
  • the mixture is mixed with the magnetic particle reaction solution of the specific unit well F using the pipette (141, 142) in the state that the magnet mounting portion 710 is lowered unit that is the specific unit well Inject into well L.
  • a first magnetic field applying step S90 is performed.
  • the magnet mounting portion 710 is raised to allow the lower portion of the unit well L, which is the body unit well, to be introduced into the unit well inlet groove. Accordingly, the magnetic field is applied from the magnet (711 (see Fig. 6)) mounted on the magnet mounting portion to the lower portion of the unit well L, which is the specific unit well.
  • a first removal step S100 is performed.
  • the first removing step S100 is performed in a state in which a magnetic field is applied to a lower portion of the unit well L that is the specific unit well by the first magnetic field applying step S90. More specifically, the magnetic particles of the magnetic particle semicoagulant in the mixture mixed with the magnetic particle semicoagulant during the first removal step S100 are attached to the lower inner wall of the unit well L which is the specific unit well by a magnetic field. Maintain the state.
  • the pipettes (141, 142) are used.
  • the mixture mixed with the magnetic particle semi-agitator is to remove the semi-agitator except for the magnetic particles.
  • the reaction solution removed in the first removal step S100 may be discharged to the waste liquid container 450 (see FIG. 5). As the first removal step (S100) is performed
  • Magnetic particles remain in the unit well L, which is the specific unit well.
  • step (S80) the first step of injecting a semi-agitated solution mixed with magnetic particles into a specific unit well
  • the magnetic field applying step S90 and the first removing step S100 may be repeated once. This In this case, in the step S80 of injecting the reaction mixture containing the magnetic particles into a specific unit well, the magnetic particle reaction solution injected into the unit well A of the multiwell plate 420 is injected into the specific unit well L.
  • the first magnetic field applying step S90 and the first removing step S100 are performed in the same manner.
  • a second protein expression injection step (S110) into a specific unit well is used.
  • the pipettes (141, 142) are used.
  • the protein expression of the specific unit well J is then injected into the specific unit well L.
  • the second protein expression and the magnetic particles injected into the specific unit well L are mixed using the pipettes (141, 142). Protein expression is bound to the surface.
  • the second magnetic field applying step (S130) is performed.
  • the magnetic mounting part 710 is raised to lower the lower portion of the specific unit well L. To be introduced into the unit well inlet groove.
  • a magnetic field is applied from the magnet mounted on the magnet mounting portion 710 to the bottom of the specific unit well L.
  • the second removal step S140 is performed.
  • the removing step S140 is performed while the magnetic field is applied to the lower portion of the specific unit well L by the second magnetic field applying step S130.
  • the magnetic particle protein expression is performed during the second removing step S130.
  • the magnetic particles in water and the proteins bound to the magnetic particles remain attached to the lower inner wall of the specific unit well L by the magnetic field.
  • the pipettes 141 and 142 are used to remove a mixture except for the protein bound to the magnetic particles and the magnetic particles from the magnetic particle protein expression.
  • the complex removed in the second removal step S140 may be discharged to the unit well K of the multiwell plate 420 '.
  • the protein bound to the magnetic particles and the magnetic particles is carried out. Silver remains in the specific unit well L.
  • the magnetic mounting part 710 is lowered using the pipettes (141, 142) in the state in which the magnetic mounting part (710) is lowered from the magnetic particles.
  • the washing solution injected into unit well B of 420 is mixed with the specific unit well L, and impurities are separated from the magnetic particles except for the target protein.
  • the third magnetic field applying step (S160) is performed.
  • the magnetic mounting part 710 is raised to lower the lower portion of the specific unit well L. To be introduced into the unit well inlet groove. The magnetic field is applied to the lower portion of the specific unit well L from the magnet 711 mounted on the magnet mounting portion 710.
  • a third removal step S170 is performed.
  • the removing step S170 is performed in a state in which a magnetic field is applied to the lower portion of the specific unit well L by the third magnetic field applying step S160. Therefore, the magnetic particles to which the target protein is attached in the mixture mixed with the washing solution during the third removal step S170 are maintained attached to the lower inner wall of the specific unit well L by a magnetic field. do.
  • the pipettes 141 and 142 may be used.
  • the mixture except for the magnetic particles to which the target protein is attached is removed.
  • the complex removed in the third removal step S170 may be discharged to the unit well I of the multi well plate 420 ′.
  • the magnetic particles to which the target protein is attached remain in the specific unit well L.
  • Separation step (S150), the third magnetic field applying step (S160) and the third removal step (S170) for separating impurities other than the protein may be carried out repeatedly several times in sequence, in the third step (S170)
  • the mixture to be removed is discharged to the waste liquid container 450.
  • a target protein separation step (S180) of injecting a protein elution solution into a specific unit well and extracting a target protein is performed.
  • the elution solution is mixed with the specific unit well L, and the target protein is separated from the magnetic particles.
  • the application step (S190) is performed after a predetermined time elapses after the target protein separation step (S180) of extracting a target protein by injecting a protein well elution solution into a specific unit well.
  • the magnet mounting part 710 is raised to allow the lower portion of the specific unit well L to be drawn into the unit well inlet groove. Accordingly, the magnetic field is applied to the lower portion of the specific unit well L from the magnet mounted on the magnet mounting portion 710.
  • the target protein-containing solution obtaining step (S200) is performed in a state in which a magnetic field is applied to the lower portion of the specific unit well L by the fourth magnetic field applying step (S190).
  • Protein elution the magnetic particles in the solution containing the protein separated from the magnetic particles is kept i the state attached to the inner wall of the lower unit of a particular well welin unit L by magnetic field.
  • the protein-containing solution which is a complex excluding the magnetic particles, from the protein elution solution containing the protein separated from the magnetic particles by using the pipettes (141, 142). remind

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Abstract

본 발명은 단백질의 생산방법에 관한 것으로，상기 본 발명에 따른 단백질 생산방법은 본 발명의 멀티 웰 플레이트 키트 및 히팅부와 자기장 인가부를 구비한 생물학적 물질 자동정제 장치를 이용함으로써 기존의 종래의 세포배양을 통한 단백질 발현 / 추출 방법을 사용하여 목적 단백질을 얻는 경우에 비해 다수의 단백질을 신속하고 간편하게 획득할 수 있으며，반응 웰 사이의 편차가 없어 동일 단백질에 대해서 재현성 있는 합성 효율을 얻을 수 있다는 장점이 있다.

Description

명세서
발명의명칭:단백질합성키트，자동추출장비를이용한단백질 발현및추출방법
기술분야
[1] 본발명은단백질의생산방법에관한것으로，보다상세하게는히팅부와
자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제장치를이용하여전자동화된 시스템에서목적단백질의발현및추출을동시에수행함을특징으로하는 단백질생산방법에관한것이다.
배경기술
[2] 재조합된단백질을발현하는방법으로주로대장균이나효모와같은세포를 이용하며，세포내로재조합단백질발현백터를형질전환하고세포를
배양하면서단백질을발현시키는방법이일반적으로사용되고있다.이방법은 재조합단백질을안정하게발현시키는균주선별과정을필요로하며，세포에 독성을나타내는단백질인경우에는단백질을발현시키는것이어렵다는 단점이있어하나의단백질을얻기까지최소수일〜수개월의시간이소요된다.
[3] 최근에는세포를이용하지않고시험관류브내에서단백질을합성하는무세포 단백질발현방법이주목을받으며이와관련한제품들이다양하게개발되고 있다.이방법은류브에단백질을발현할수있는주형 DNA (예) expression vector, PCR product),세포파쇄액，발현용액그리고 DEPC증류수를첨가한후, 적정온도 (30내지 40°C)에서적정시간 (1내지 3시간)동안반응을시켜주면， 단백질이발현되는시스템으로세포내에서독성을가지는단백질도발현을 시킬수있다는장점이 있고，위에서언급한세포를사용하여단백질을
발현시키는방법에비해서소요시간을획기적으로줄일수있다.단백질이 발현되기위해서적정온도와시간이필요한이유는튜브내에서 DNA로부터 RNA가합성되고，이 RNA로부터단백질이합성되기까지의모든과정에서 효소의활성이수반되어야하는데,다수의효소의활성이나타나는온도인 30 내지 40°C를유지시켜줄때，위에서언급한반웅이진행될수있기때문이다.
[4] 재조합단백질이발현된시료에는다수의단백질이흔재되어 있으므로,이
시료로부터발현시킨재조합단백질을손쉽게정제하기위해서는발현된 단백질이특정물질에대한친화력을가지고있어야한다.최근에는주로재조합 단백질에히스티딘을결합시킨상태로발현시키고이히스티딘과
금속이온 (니켈이온，코발트이온둥)의친화력을이용하여단백질을정제하는 방법을사용하고있으며이와관련된다양한제품들이판매되고있다.그 중에서도자성입자를이용하는방법이널리사용되고있는데，이방법은자성 입자의표면에금속이은을가지고있어목적단백질의히스티딘과결합하여 다수의단백질로부터목적단백질만을추출할수있는방법이다. [5] 그러나상기종래기술들은낮은수득률과고순도정제가불가능할뿐아니라 세포배양에따른복잡한단백질발현의조절과비효율적인생산방법으로동일 단백질에대한재현성 있는생산이란근본적인문제는아직까지해결하지 못하고있다.
[6] 이에，낮은수득률과고순도정제가불가능하며수득률을높일수있는기술뿐 아니라동일단백질에대해서재현성있는합성효율적인단백질의생산방법이 요구되고있다.
발명의상세한설명
기술적과제
[7] 이에，본발명자들은상기와같은문제점을해결하기위하여단백질의발현에 대한조절이효율적이고간편한발현시스템과이를사용한단백질의생합성 방법에관한지속적인연구중，목적단백질의발현과추출을동시에수행할수 있어종래보다더욱효율적이고도용이한단백질생산방법을발견하고，본 발명을완성하였다.
[8] 본발명은히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제장치를 이용하여전자동화된시스템에서목적단백질의발현및추출올동시에
수행함을특징으로하는단백질생산방법올제공하는것을목적으로한다.
[9] 또한,본발명은상기단백질생산방법에 있어,무세포단백질발현방법과친화 태그 (affinity tag)와결합하는자성입자를이용하는단백질추출방법을결합시켜 목적단백질의발현및추출을동시에수행할수있는단백질합성키트를 제공하는것을목적으로한다. ᅳ 과제해결수단
[10] 본발명은상기목적을달성하기위해，무세포단백질발현방법과친화
태그 (affinity tag)와결합하는자성입자를이용하는단백질추출방법을결합시켜 당사의히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제장비에 적용함으로써，6시간이내에최대 16종의목적단백질을합성하여생산할수 있는단백질생산방법을제공한다.
[11] 이하,본발명을상세히설명한다.
[12] 본발명은
[13] (1)무세포단백질합성을위한주형을제조하고;
[14] (2)상기주형을무세포단백질발현용반웅액에가하여단백질을발현시키고;
[15] (3)상기발현단백질의친화태그 (affinity tag)와결합하는자성입자를가하여 목적단백질을부착시키고;
[16] (4)상기부착된목적단백질을자성입자로부터분리시키는;
[17] 단계를포함하는히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제 장치를이용하여，전자동화된시스템에서목적단백질의발현및추출을동시에 수행함을특징으로하는단백질생산방법을제공한다. ' [18] 또한，본발명 '은
[19] (a)무세포단백질합성을위한주형을희석시키기위한용액;
[20] (b)상기주형으로부터목적단백질을발현시키기위한무세포단백질
발현용액;이포함되는제 2멀티웰플레이트키트 (420')및
[21] (c)상기목적단백질을부착시키기위한자성입자;
[22] (d)상기목적단백질용출용액;
[23] (e)상기자성입자에목적단백질을결합시키기위한자성입자반웅액및
세척용액;이포함되는제 1멀티웰플레이트키트 (420)를제공한다.
[24] 또한,본발명은
[25] (1)무세포단백질합성을위한주형을제조하고;
[26] (2)상기주형을무세포단백질발현용반웅액에가하여단백질을발현시키고;
[27] (3)상기발현단백질의친화태그 (affinity tag)와결합하는자성입자를가하여 목적단백질을부착시키고;
[28] (4)상기부착된목적단백질을자성입자로부터분리시키는;
[29] 단계를포함하는히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제 장치를이용한단백질생산방법에있어서,
[30] 상기방법은 (a)무세포단백질합성을위한주형을회석시키기위한용액; (b) 상기주형으로부터목적단백질을발현시키기위한무세포단백질발현용액;이 포함되는제 2멀티웰플레이트키트 (420')및 (c)상기목적단백질을부착시키기 위한자성입자; (d)상기목적단백질용출용액； (e)상기자성입자에목적 단백질을결합시키기위한자성입자반웅액및세척용액;이포함되는제 1멀티 웰플레이트키트 (420)를이용하여 ,전자동화된시스템에서목적단백질의발현 및추출을동시에수행함을특징으로하는단백질생산방법을제공한다.
[31] 본발명에 있어서,상기무세포단백질합성을위한주형은원형형태 (circular form)또는선형형태 (linear form)의 DNA를사용할수있다.바람직하게는상기 원형형태의 DNA로는플라스미드 DNA를사용할수있고,선형형태의 DNA는 PCR단편 (product)를사용할수있으나,이에한정되는것은아니다.
[32] 보다상게하게는상기선형형태의 DNA는타겟유전자를증폭할수있으며 5'과 3'말단에 overlapping서열을갖도록제작된프라이머세트와 PCR용사전 흔합물 (premix)을이용하여，시료내타겟유전자를증폭시켜 1차반웅물을 수득하는단계；및
[33] 상기수득된 1차반웅물에하기조성물 A를포함하는 PCR용
사전흔합물 (premix)을이용 (이하, 'PCR용키트'라칭한다)하여 2차증폭하는 단계;를포함하여제조될수있다.
[34] [조성물 A]
[35] (a)타겟유전자의 5'과 3，말단의양끝에위치하는 upstream casette set와
downstream casette set
[36] (b)상기 cassette의 5'과 3'말단에 overlapping서열을가지는 2차프라이머세트 [37] 상기 PCR용사전흔합물 (premix)은증폭반웅에필요한성분들이혼합된 흔합물로서디옥시뉴클레오티드흔합물 (dNTP mixture)및완층용액을포함할수 있으며，아울러， TaqDNA중합효소와같은열안정성 DNA중합효소를포함할수 있다ᅳ또한이흔합물은액상또는건조된형태로제조될수있다.
[38] 본발명에있어서，선형형태의 DNA의제조시사용되는 PCR용키트는 PCR용 사전흔합물 (premix)을포함하고,타겟유전자의 5'및 3，양말단에친화 태그 (affinity tag)를코드화하기위한 cassette set 0.1내지 0.5 ng/ul,상기 casette의 5'과 3'말단에 overlapping서열을가지는 2차 forward및 reverse프라이머각 0.1 내지 1.0pmoles/ul를포함할수있다.
[39] 본발명에서용어 , '카세트 (cassette)'는 DNA단편에인위적으로연결될수
있도록짧게합성된이중가닥의올리고뉴클레오티드를포괄적으로이르는 용어이다ᅳ카세트의 5'말단에는인산기가없기때문에이중가닥으로구성된 카세트중단일가닥만게놈 DNA에연결될수있다.
[40] 본발명에서용어， '프라이머 '는짧은자유 3말단수산화기 (free 3' hydroxyl group)를가지는단일가닥핵산서열로상보적인핵산의주형 (template)과 염기쌍 (base pair)을형성할수있고핵산주형의가닥복사를위한시작지점으로 기능하는짧은핵산서열을의미한다.프라이머는적절한완층용액및온도에서 중합반웅 (즉， DNA중합효소)을위한시약및상이한 4가지 dNTP의존재하에서 DNA합성을개시할수있다.본발명의 PCR용키트에는타겟유전자의 뉴클레오티드서열에특이적인프라이머및카세트서열에특이적인
프라이머가포함된다.
[41] 본발명에있어서,상기히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치는다수의피펫 (141, 142)이분리가능하도록장착되며,상기 장착된다수의피펫 (141， 142)에각각타켓물질을포함하는생물학적시료를 흡입및토출시키기위한피펫블럭 (100);상기피펫블럭 (100)을지지하는 고정몸체 (200);상기고정몸체 (200)에설치되어상기피펫블력 (100)올
상하방향으로이동시키는피펫블럭상하이동수단;상기고정몸체 (200)를 전후방향으로이동시킴으로써상기피펫블럭 (100)을전후방향으로이동시키는 피펫블럭전후이동수단；상기고정몸체 (200)하부에위치하며인접한 2열의 웰로이루어지는다수개의단위웰을구비하는멀티웰플레이트키트 (420'， 420)가탑재되는베이스플레이트 (400);상기멀티웰플레이트키트 (420', 420)의 특정단위웰에자기장을인가및해제하기위하여상기멀티웰플레이트 키트 (420'， 420)의상기특정단위웰하부에위치하는자기장인가부 (700);상기 멀티웰플레이트키트 (420'，420)의상기특정단위웰을가열하기위한
히팅부 (810);를포함하는것을특징으로한다.
[42] 또한，본발명에 있어서상기히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질 자동정제장치는자석이장착된자석장착부및가열을위한히팅부를
상하방향으로이동시킴으로써자기장을인가또는해제함과동시에온도조절이 가능하며，상기자석장착부에형성된다수개의단인웰인입홈이멀티웰 플레이트키트의단위웰의하부를감쌀수있도록형성되어반웅효율을더욱 높일수있는것을특징으로한다.
[43] 보다상세하게는상기자기장인가부 (700)는,자석 (711)이장착되는
자석장착부 (710);상기자석장착부 (710)를상승및하강시키는승강부 (760);를 포함할수있는데,상기자석장착부 (710)의상면에는상기멀티웰플레이트 키트 (420'， 420)의상기특정단위웰하부가인입되도록단위웰인입홈 (713)이 형성되고,상기베이스플레이트 (400)에는상기자석장착부 (710)상승시상기 멀티웰플레이트키트 (420'， 420)의상기특정단위웰하부가상기단위웰 인입홈 (713)에인입되도록단위 웰노출공 (400-3)이형성되며,상기멀티웰 플레이트키트 (420'，420)의상기특정단위웰의하부는상기단위웰
인입홈 (713)에인입되도록이웃한상기멀티웰플레이트키트 (420'， 420)의단위 웰하부와소정거리이격될수있고,상기자석 (711)은상기단위웰
인입홈 (713)의주변부에삽착될수있다.
[44] 본발명에따른단백질생산방법은상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위 웰에무세포단백질합성을위한주형올주입하는，주입단계 (S10);
[45] 상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰에주형을희석시키기위해주입된 용액을상기주입된주형에흔합하는，제 1혼합단계 (S20);
[46] 무세포단백질발현용액을상기제 1혼합단계의혼합물과흔합하는,제 2 혼합단계 (S30);
[47] 제 2흔합단계의흔합물과세포파쇄액을흔합하여단백질합성반웅액을 제조하는，흔합물제조단계 (S40);
[48] 히팅부 (720)를이용하여상기흔합물이들어있는상기멀티웰플레이트
키트 (420')의상기특정단위웰하부를가열하여상기특정단위웰내단백질 합성반응액에열을가하는，가열단계 (S50);
[49] 자성입자반응흔합물을준비하는단계 (S70)
[50] 상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰에주입된단백질발현물을상기 준비한자성입자흔합물에주입하는단백질발현물주입단계 (S110);
[51] 상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰에주입된단백질발현물을
자성입자와반웅시키는，반웅단계 (S120);
[52] 상기단백질발현물과혼합된흔합물에자기장을인가시켜상기자성입자와 자성입자에결합된단백질을제외한흔합물을제거하는，제거단계 (S140);
[53] 상기멀티웰플레이트키트 (420)의단위웰에주입된세척용액을주입하여 상기자성입자로부터목적단백질을제외한불순물을세척하는,
세척단계 (S150);
[54] 상기세척용액과흔합된흔합물에자기장을인가시켜상기세척용액과흔합된 흔합물증상기목적단백질이부착된상기자성입자를제외한흔합물을 제거하는,제거단계 (S 170); [55] 상기멀티웰플레이트키트 (420)의단위웰에주입된목적단백질용출용액을 상기제거단계를거친흔합물에주입하여상기목적단백질을분리시키는，목적 단백질분리단계 (S180);
[56] 상기흔합물에자기장을인가시켜상기자성입자로부터분리된목적단백질 o' 포함된단백질용출용액중상기자성입자를제외한흔합물인목적단백질 함유용액을획득하는，목적단백질함유용액획득단계 (S200);를포함하여 생산되는것을특징으로한다.
[57] 보다상세하게는본발명의상기주입단계 (S10)는상기히팅부와자기장
인가부를구비한생물학적물질자동정제장치에장착되어 있는다수의 피펫 (141, 142)을이용하여상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰 (L)에 무세포단백질합성을위한주형을주입하는것으로,상기주입단계후제 1 혼합단계 (S20)를수행한다.
[58] 상기제 1흔합단계 (S20)는상기히팅부와자기장인가부를구비한생물학적 물질자동정제장치에장착되어있는다수의피펫 (141， 142)을이용하여상기 멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰에주입된무세포단백질합성을위한 주형을회석시키기위한 DEPC증류수 (H)를상기멀티웰플레이트키트 (420')의 단위웰 (L)에주입된상기무세포단백질합성을위한주형에흔합하는것으로， 상기제 1흔합단계후제 2흔합단계 (S30)를수행한다.
[59] 상기제 2흔합단계 (S30)는상기피펫 (141， 142)을이용하여상기멀티웰
플레이트키트 (420')의단위웰에주입된상기 DEPC증류수와흔합된상기 무세포단백질합성을위한주형이주입된단위웰 (L)에상기멀티웰플레이트 키트 (420')의상기특정단위웰 (G)에주입된무세포단백질발현용액을 흔합하는것으로,상기제 2흔합단계 (S30)후혼합물제조단계 (S40)를수행한다.
[6이 상기흔합물제조단계 (S40)는상기피펫 (141， 142)을이용하여상기멀티웰 플레이트키트 (420')의단위웰에주입된상기 DEPC증류수와흔합된상기 무세포단백질합성을위한주형이주입된단위웰 (L)에상기세포파쇄액 보관용류브 (442-1)에주입된세포파쇄액을흔합하여단백질합성반응액을 제조하는것으로.상기흔합물제조단계 (S40)후가열단계 (S50)를수행한다.
[61] 상기가열단계 (S50)는제 1가열단계로상기자석장착부 (710)를상승시켜상기 멀티웰플레이트키트 (420')의상기특정단위웰 (L)하부가상기단위웰 인입홈 (713)에인입된상태에서,상기히팅부 (720)를이용하여상기멀티웰 플레이트키트 (420')의상기특정단위웰 (L)하부를가열하여상기특정단위 웰 (L)내단백질합성반웅액에열을가하는것으로，상기가열단계 (S50)후제 1 단백질발현물주입단계 (S60)더수행할수있다.
[62] 상기더수행되는제 1단백질발현물주입단계 (S60)는상기피펫 (141， 142)을 이용하여상기특정단위웰 (L)내단백질합성반응액에서반웅이진행된 1차 단백질발현물을상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰 (J)로주입하는 것으로，상기제 1단백질발현물주입단계 (S60)후자성입자반웅흔합물을 준비하는단계 (S70)가진행된다.
[63] 상기자성입자반웅흔합물을준비하는단계 (S70)는상기피펫 (141， 142)을
이용하여상기멀티웰플레이트키트 (420)의단위웰 (A)에주입된자성입자 반응액을상기멀티웰플레이트키트 (420)의단위웰 (F)에주입된자성입자와 흔합하는것으로，상기자성입자반웅흔합물을준비하는단계 (S70)후
순차적으로자성입자흔합된반응액의주입단계 (S80),제 1자기장인가단계 (S90) 및계 1제거단계 (S100)를더수행할수있다.
[64] 상기더수행되는자성입자흔합된반웅액의주입단계 (S80)는제 2주밉단계로， 상기자석장착부 (710)가하강된상태에서상기피펫 (141， 142)을이용하여상기 자성입자반웅액과흔합된흔합물을상기멀티웰플레이트키트 (420')의상기 특정단위웰 (L)에주입하는특정단위웰로주입하는것으로，상기 2
주입단계 (S80)후제 1자기장인가단계 (S90)를수행한다.
[65] 상기제 1자기장인가단계 (S90)는상기자석장착부 (710)를상승시켜상기멀티 웰플레이트키트 (420')의상기특정단위웰 (L)하부가상기단위웰
인입홈 (713)에인입되도록하여상기자석장착부 (710)로부터상기멀티웰 폴레이트키트 (420')의상기특정단위웰하부로자기장을인가하는것으로, 상기제 1자기장인가단계 (S90)후제 1제거단계 (S100)를수행한다.
[66] 상기제 1제거단계 (S100)는상기자성입자반웅액과혼합된흔합물중상기
자성입자및자성입자에부착된부착물이상기멀티웰플레이트키트 (420')의 상기특정단위웰 (L)하부에인가된자기장에의하여，상기멀티웰플레이트 키트 (420')의상기특정단위웰하부의내벽에부착된상태에서,상기피펫 (141， 142)을이용하여상기자성입자반웅액과흔합된흔합물중상기자성입자및 상기자성입자에부착된부착물을제외한흔합물을제거하는것으로，상기제 1 제거단계 (S100)를진행한후단백질발현물주입단계 (S110)를수행한다.
[67] 상기단백질발현물주입단계 (S110)는상기피펫 (141， 142)을이용하여상기 멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰 (J)에주입된 1차단백질발현물을상기 멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰 (L)에주입하는것으로，상기제 2단백질 발현물주입단계 (S110)후반웅단계 (S120)를수행한다.
[68] 상기반웅단계 (S120)는상기피펫 (141, 142)을이용하여상기멀티웰플레이트 키트 (420')의단위웰 (L)에주입된 2차단백질발현물을상기멀티웰플레이트 키트 (420')의단위웰 (L)에주입된자성입자와반응시키는것으로，상기
반웅단계 (S120)후제 2자기장인가단계 (S130)를더수행할수있다.
[69] 상기더수행되는제 2자기장인가단계 (S130)는상기자석장착부 (710)를
상승시켜상기멀티웰플레이트키트 (420')의상기특정단위웰 (L)하부가상기 단위웰인입홈 (713)에인입되도록하여상기자석장착부 (710)로부터상기멀티 웰플레이트키트 (420')의상기특정단위웰 (L)하부로자기장을인가하는 것으로，상기제 2자기장인가단계 (S130)후제거단계 (S140)를수행한다.
[70] 상기제거단계 (S140)는제 2제거단계로,상기 2차단백질발현물과흔합된 흔합물 중 상기 단백질이 부착된 상기 자성 입자가 상기 멀티 웰 플레 이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 (L) 하부에 인가된 자기장에 의하여 상기 멀티 웰 플레 이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 (L) 하부의 내벽 에 부착된 상태에서， 상기 피 펫 (141， 142)을 이용하여 상기 자성 입자와 자성 입자에 결합된 단백질을 제외 한 흔합물을 제거하는 것으로，상기 제 2 제거단계 (S140) 후
세 척 단계 (S150)를 수행한다.
[71] 상기 세척단계 (S150)는 상기 자석장착부 (710)가 하강된 상태에서 상기
피 펫 (141, 142)을 이용하여 상기 멀티 웰 플레이트 키트 (420)의 단위 웰에 주입된 세척용액을 상기 멀티 웰 플레이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 (L)에
주입하여 상기 자성 입자로부터 목적 단백질을 제외 한 불순물을 분리하는 것으로，상기 세척 단계 (150) 후 제거단계 (S170)를 수행한다.
[72] 상기 제거단계 (S170)는 계 3 제거단계로，상기 세척용액과 흔합된 흔합물 증
상기 목적 단백질이 부착된 상기 자성 입자가 상기 멀티 웰 플레 이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 하부에 인가된 자기장에 의 하여 상기 멀티 웰 플레 이 트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 하부의 내벽에 부착된 상태에서 , 상기 피 펫 (141， 142)을 이용하여 상기 세척용액과 흔합된 흔합물 중 상기 목적 단백질이 부착된 상기 자성 입자를 제외 한 흔합물을 제거하는 것으로，상기 제거단계 (S170) 후 목적 단백질 분리 단계 (S180)를 수행한다.
[73] 상기 목적 단백질을 제외 한 불순물을 세척 하는 세척단계 (S150)와 상기 목적 단백질이 부탁된 자성 입자를 제외 한 혼합물을 제거하는 제거단계 (S170)를 순차적으로 1회 이상 수행할 수 있으며，상기 세척 단계 (150) 후 제 3 자기장 인가단계 (S160)를 더 수행할 수 있다.
[74] 상기 더 수행되는 상기 제 3 자기 장 인가단계 (S160)는 상기 자석장착부 (710)를 상승시켜 상기 멀티 웰 플레 이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 (L) 하부가 상기 단위 웰 인입홈 (713)에 인입 되도록 하여 상기 자석장착부 (710)로부터 상기 멀티 웰 플레이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 (L) 하부로 자기장을 인가하는 것 이다.
[75] 상기 제거단계 (S170) 후 수행하는 목적 단백질 분리 단계 (S180)는 상기
자석장착부 (710)가 하강된 상태에서 상기 피 펫 (141， 142)을 이용하여 상기 멀티 웰 플레 이트 키트 (420)의 단위 웰에 주입 된 목적 단백질 용출용액을 상기 멀티 웰 플레 이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 (L)에 주입 하여 상기 목적 단백질을 분리시 키는 것으로, 상기 목적 단백질 분리 단계 (S180) 후 제 4 자기장
인가단계 (S190)를 더 수행할 수 있다.
[76] 상기 더 수행되는 상기 제 4 자기장 인가단계 (S190)는 상기 자석장착부 (710)를 상승시 켜 상기 멀티 웰 플레이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 (L) 하부가 상기 단위 웰 인입홈 (713)에 인입되 도록 하여 상기 자석장착부 (710)로부터 상기 멀티 . 웰 플레 이트 키트 (420')의 상기 특정 단위 웰 하부로 자기장을 인가하는 것으로, 상기 제 4 자기장 인가단계 (S190)후 목적 단백질 함유용액 획득 단계 (S200)를 수행한다.
[77] 상기목적단백질함유용액획득단계 (S200)는상기자성입자로부터분리된 목적단백질이포함된목적단백질용출용액중상기자성입자가상기멀티웰 플레이트키트 (420')의상기특정단위웰하부 (L)에인가된자기장에의하여 상기멀티웰플레이트키트 (420')의상기특정단위웰 (L)하부의내벽에부착된 상태에서，상기피펫 (141, 142)을이용하여상기자성입자로부터분라된목적 단백질이포함된단백질용출용액중상기자성입자를제외한흔합물인목적 단백질함유용액을획득하여목적단백질을생산할수있다.
[78] 본발명에 있어서,상기목적단백질함유용액획득단계 (S200)는상기
피펫 (141， 142)을이용하여상기목적단백질함유용액을상기베이스 플레이트 (400)에탑재된단백질보관용튜브 (442-3)에주입하는것을포함하는 것을특징으로한다.
[79] 본발명에 있어서상기자성입자는목적단백질의친화태그 (affinity tag)와 결합하는자성입자로서보다상세하게는금속이온을포함하는것이며， 바람직하게는니켈이온이결합된자성입자인것을특징으로한다.
[80] 본발명에 있어서，상기자성입자를이용하는단백질추출방법을무세포
단백질발현방법과결합시키고,이를당사의히탕부와자기장인가부를구비한 생물학적물질자동정제장비에적용함으로써， 6시간이내에최대 16종의목적 단백질을합성하여생산할수있는장점이있다.
발명의효과
[81] 본발명에따른단백질생산방법은본발명의멀티웰플레이트키트및
히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제장치를
이용함으로써기존의종래의세포배양을통한단백질발현 /추출방법을 사용하여목적단백질을얻는경우에비해다수의단백질을신속하고간편하게 획득할수있으며,반웅웰사이의편차가없어동일단백질에대해서재현성 있는합성효율을얻을수있다는장점이있다.
도면의간단한설명
[82] 도 1은본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치의베이스플레이트가케이싱에인입되는상태도이고，
[83] 도 2는본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치의피펫블록의개략도를보여주는것이며，
[84] 도 3은본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치의피펫블럭의주요부의단면도이고,
[85] 도 4는본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치의케이싱이일부제거된사시도이며,
[86] 도 5는본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치의베이스플레이트의사용상태도이고， [87] 도 6은본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질 자동정제장치의자석장착부및승강부의사시도이며,
[88] 도 7은본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치를이용한단백질생산하기위한주형 PCR product제조모식도를 보여주는것이고，
[89] 도 8은본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치를이용한단백질생산방법의모식도이며，
[90] 도 9는본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치를이용한실험모식도이고，
[91] 도 10은본발명에따른히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질
자동정제장치를이용시안착되는제 1멀티웰플레이트키트 (A)및제 2멀티웰 플레이트키트 (B)를보여주는것이며，
[92] (G열:무세포단백질발현용액이존재하는웰영역 , H열: DEPC증류수가
존재하는웰영역， L열:무세포단백질합성을위한주형이존재하는웰영역，
A~D:상기자성입자에목적단백질을결합시키기위한자성입자반응액및 세척용액이존재하는웰영역， E:목적단백질용출용액이존재하는웰영역， F: 목적단백질을부착시키기위한자성입자가존재하는웰영역)
[93] 도 11은본발명에따른단백질생산방법을이용하여생산된목적
단백질 (GFP)의 SDS-PAGE젤확인결과이고,
[94] (M:바이오니아의 Accw iii er™ Protein Size Marker(Low), E:발현된 GFP시료，
P:추출된 GFP시료, 1~16:각각의단위웰내반웅된 GFP합성단백질)
[95] 도 12는본발명에따른단백질생산방법을이용하여다양한주형 DNA별
생산된목적단백질의 SDS-PAGE젤확인결과이다.
[96] [부호의설명]
[97] 100피펫블릭 110:시린지핀홀더
[98] 112안내가이드 120:시린지핀 120:시린지핀
[99] 130시린지핀안내블록 131:시린지핀안내공
[100] 133피펫장착부 133-1:연통공
[101] 133-2:밀착링 134:피펫장착부
[102] 134-1:연통공 134-2:밀착링
[103] 141피펫 142:피펫
[104] 150시린지핀안내블록지지판 152:상하이동너트
[105] 160안내봉 171:시린지핀조절모터지지판
[106] 172시린지핀조절모터 173:시린지핀조절스크류
[107] 181상부탈착판 182:탈착판
[108] 183연결봉 184:돌출봉
[109] 185스프링 200:고정몸체
[110] 231상하이동모터 232:상하이동벨트 111] 233:상하이동스크류 241:전후이동슬라이더
112] 300:케이싱 310:전후이동지지봉
113] 311:전후가이더 350:문짝
114] 320:전후이동모터 330:전후이동벨트
115] 340:자외선램프 360:터치스크린
116] 400:베이스플레이트 401：손잡이
117] 420':멀티웰플레이트 420:멀티웰플레이트
118] 430:피펫랙 440:단백질보관용튜브랙
119] 450:폐액통 442-1:세포파쇄액보관용류브
120] 442-3:단백질보관용튜브 700:자기장인가부
121] 710자석장착부 711:자석
122] 713단위웰인입홈 720:자석장착부지지대
123] 730가이드봉 740:가이드블록
124] 750인장스프링 760:승강부
125] 761승강모터 762:제 1승강축
126] 763승강캠 764:제 2승강축
127] 780높이감지센서 781:센싱부
128] 782센싱타겟부 810:히팅부
129] 812히팅부고정판
발명의실시를위한형태
[130] 이하실시예에의거하여본발명을더욱상세히설명하겠는바,다음실시예는 오로지본발명을보다구체적으로설명하기위한것으로서，본발명이다음 실시예에의해한정되지않는다는것은본발명이속하는기술분야에서통상의 지식을가진자에게있어서자명할것이다.본발명의실시예에서사용된재료 및방법등을설명하면다음과같다.
[131] <실시예 1>주형 DNA제조
[132] (I) Plasmid DNA제조
[133] 단백질합성을실시하기위해，주형 DNA - plasmid DNA를제조하였다.각각의 유전자를유전자합성방법 (NBiochem. Biophys. Res. Commun.1998, 248,
200-203)을통해합성하고，제한효소처리를한후, E.coli전용발현백터에 클로닝하였다.
[134] 상기 E.coli전용발현백터로는 pBIVT (바이오니아，한국)， pIVEX(Roche,독일)， pET (Novagen,독일)， pK7, pQE둥이사용될수있으며 ,이에한정되는것은 아니다.
[135] 또한상기 E.coli전용발현백터는발현백터내에친화태그 (affinity tag)가
포함되어 있어야한다.본실시예에서는히스티딘태그 (histidinetag)가포함된 발현백터를사용하였으나，이에한정되는것은아니며다른 tag가포함될수 있다.
[136] 본 실시 예에서는 CalmL3, RNaseH, DUSP3, CAT, AcGFP, EF-Ts, VF, Poly A polymerase, MMLV RTase, BM3, 유전자를 사용하였다.
[137] 구체적으로 유전자 합성물질에 대한 제한효소 처 리는 &zmHI(Bioneer사제 , 한국) 1 " £, iVotI(Bkmeer사제, 한국) 1 βΐ, 10X AccuCutTM buffer(Bioneer사제 , 한국) 2 βί, 유전자 합성물질 10 μί, 멸균증류수 6 μί를 각각의 튜브에 넣어 흔합한 다음 37°C에서 3시간 정온 배치하였다 . E 전용 발현백터에 대 한 제한효소 처 리는 izmHI(Bioneer사제，한국) 1 VotI(Bioneer사제，한국) 1 μί, 10X AccuCutTM buffer(Bioneer사제, 한국) 2 μϋ, E.coli 전용 발현백터 10 μί, 멸균증류수 6 를 류브에 넣어 흔합한 다음 37 C에서 3시간 정은 배치 하였다. 각 제한효소 처 리 반웅물로부터 Accuprep Gel Extraction kit(Bioneer사제，한국)를 사용하여 DNA를 추출하였다.
[138] 2x rapid 라이 게 이션 버퍼 (Promega사제, 미국) 5 μΐ, Τ4 DNA 라이 게이즈 1 /^(Promega사제, 미국), 제한효소 처 리 유전자 합성물질 3 μί, 제한효소 처 리 백터 1 를 류브에 넣어 흔합한 다음 16°C에서 1시간 정온 배치 하였다. 그 후, E. coli 만능세포 (competent cell) 100 ^에 상기 의 정온 배치 한 반웅액 10 ^을 넣고 얼음 상에 30분간 놓아둔 뒤 42°C에서 90초 배양하고, 다시 얼음 상에 5분 놓아두었다. 카나마이신 (kanamycin)이 포함된 LB 플레 이트에 상기 반응액을 접종한 후 37°C에서 16시간 배양하였다.
[139] 흰색 콜로니를 취하여 LB 액체 배지 10 에서 16시간 정도 배양한 후 원심 분리하여 상층액은 버 리고 AccuPrep plasmid DNA prep kit(Bioneer사제, 한국)를 사용하여 펠릿으로 부터 플라스미드 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 염 기서 열 분석을 하여 , 각 유전자 합성방법에 의해 합성된 유전자가 맞는지 확인하였고, 단백질 합성에 사용할 DNA는 해당 콜로니를 배양하여 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 확보하였다. 플라스미드 DNA는 UV
분광계 (Shimazu사제，일본)로 농도와 순도를 측정하여 순도가 1.8ᅳ 2.0 사이 인 것을 확인하였다.
[140] (2) PCR product 제조
[141] 단백질 합성을 실시하기 위해, 주형 DNA - PCR product를 제조하였다. PCR product 제작을 위해서 Two-step PCR의 원리를 적용한 'PCR용 키트'를
개발하였으며， PCR 단편 (product)을 제작하는 방법 (도 7 참조)과 키트 구성품은 하기 표 1과 같다. [142] [표 1] PCR용 키트
AccuPower PCR Premix
N terminus upstream cassette
N terminus downstream cassette
C terminus upstream cassette C terminus downstream cassette
2n Forward primer 2nd Reverse primer
[143] 구체적으로먼저타겟유전자를증폭할수있으며， 5'과 3'말단에 overlapping 서열을가지고있는프라이머세트를제작하여준비하고,타겟유전자를가지고 있는시료 (genomic DNA, T vector등)를주형으로하여 1차 PCR반응을하였다. PCR반웅시키트에서제공하는 AccwPc erPCRPremix를사용하고，반웅 조건은 94°C에서 5분간변성시킨후반응은 94°C에서 30초， 58°C에서 30초， 720C에서 1분을한주기로 30사이클 (cycle)로증폭하고,최종적으로 72°C, 5분간 증합시키는조건으로진행하였다.이후 1차 PCR반웅물을 AccuPrep PCR purification kit(Bioneer사제，한국)또는 AccuPrep Gel Extraction kit(Bioneer사제， 한국)를이용하여정제하여준비하였다.
[144] 상기 1차 PCR반웅물을주형으로하여 2차 overlapping PCR을진행하여
최종적으로단백질합성을위한 PCR단편을합성하였다. PCR반웅은상기표 1의키트에서제공하는카세트세트와프라이머세트및 1차 PCR반웅물을 첨가하여수행하였고，반응조건은 94°C에서 5분간변성시킨후반응은 94°C에서 1분， 48°C에서 1분， 72°C에서 1분을한주기로 30사이클 (cycle)로증폭하고, 최종적으로 72°C, 5분간중합시키는조건으로진행하였다.2차 PCR반웅물을 AccuPrep Gel Extraction kit(Bioneer사제,한국)를이용하여정제하여준비하였다.
[145] 상기제공되는 upstream cassette와 downstream cassette는목적단백질에
결합되는친화태그 (affinity tag)부분을코드화하는올리고뉴클레오티드로,보다 바람직하게는히스티딘태그 (histidine tag)를포함한다.
[146] <실시예 2>단백질발현용세포파쇄액제조
[147] α)세포배양
[148] 먼저대장균 [BL21(DE3)(Novagen사제，미국)]을 350 I발효조 (2x YT배지)에서 37°C의온도로배양하였다.그리고흡광도 (OD 600) 0.5에서 1 mM IPTG를 첨가하여， T7 RNA증합효소를발현시키고,흡광도 (OD 600) 3.0 ~ 6.0에서 배양을 중단하고 원심분리를 통해 세포를 회수하였고， -50°C에서 보관하였다.
[149] 2)세포 파쇄 액 제조
[150] 회수된 대장균 100 g을 500 m 의 세척용액 [10 mM Tris(oAc) pH 8.2, 14 mM
Mg(oAc)2, 60 mM K(OAc), 1 mM DTT(dithiothreitol), 0.05%(v/v)
2-mercaptoethanol(2-ME)]를 넣고，잘 씻어주고 (washing), 다시 원심분리 (3,000 RPM, 30분)하는 절차를 3회 반복하였다. 세척 이 끝난 후，대장균의 무게를 측정 한 후, 무게의 1.1배의 부피에 해당하는 완충용액 [상기 세척용액에서
2-ME만 제게을 넣고 대장균을 균일하게 잘 풀어준 후, 세포 패쇄기 (Pressure Cell Homogeniser, Stansted Fluid Power)를 이용하여 일정 한 압력 (160 ~ 280 MPa)하에 세포를 파쇄하였다.
[151] 상기 의 세포 파쇄 액을 고속 원심분리 (16,000 RPM, 30분， 40C)로 분리 하여
상둥액을 회수하고，이에 전배양용액 [293.3 mM Tris(OAc) pH 8.2, 2 mM
Mg(OAc)2, 10.4 mM ATP, 200 mM creatine phosphate, 4.4 mM DTT, 0.04 mM amino acids, 26.7 glmi creatine kinase]을 세포 파쇄 액 10 ^당 3 m£씩 첨가하여 3TC, 90분 배 양을 통하여 전배양된 용액을 만들었다. 그리고，상기 전배양된 용액을 투석 튜브 (10 kDa, Dialysis Tubing, Sigma사제，미국)에 넣고 20배의 완충용액에서 45분 동안 4°C에서 4번 투석올 시 켜 , 전배양 후의 이물질을 제거 한 후，투석 류브안의 용액은 원심분리 (1 1 ,000RPM, 20분, 4°C)를 거 친 후，비로소 단백질 합성을 위 한 세포 파쇄 액을 제조하였다. 이 세포 파쇄 액은 멀티 웰 플레 이트 키트를 제조하기 전까지 -70oC에 보관하였다.
[152] <실시 예 3> 무세포 단백질 발현용액 제조
[153] 무세포 단백질 합성 에 필요한 단백질 발현용액을 제조하였다.
[154] 구체적으로 무세포 단백질 발현용액 [U4 mM Hepes-KOH(pH 8.2), 2.4 mM ATP, 각 1.7 mM CTP, GTP 및 UTP, 2 mM DTT, 90 mM K(Glu), 80 mM NH4(OAc), 12 mM Mg(OAc), 68 g/m£ folinic acid(L-5-formyl-5, 6, 7, 8-tetrahydrofolic acid), 각 1.5 mM 20 amino acids, 2% PEG 8000, 67 mM creatine phosphate]을 제조하였다. 이 발현용액은 멀티 웰 플레 이트 키트를 제조하기 전까지 -20oC에 보관하였다.
[155] <실시 예 4> 자성 입자 반웅액 및 세척용액 제조
[156] 단백질 정제에 사용되는 마그네틱 자성 입자는 자성을 띠는 철 (Fe)입자를
실리카 (Silica)로 코팅 하고 말단을 니 켈 (Ni)로 컴플렉스 (complex)화한 마그네틱 자성 입자이다. 이 러 한 자성 입자는 시그마 (Sigma)사, 프로메가 (Promega)사, 퀴 아젠 (Qiagen)사 등으로부터 구입가능하다. 이 자성 비드의 장점은 자성을 띠는 특성을 이용하여 보다 손쉬운 단백질 정제가 가능하고，이를 이용하여 다양한 분야에 웅용이 가능하다.
[157] 목적 단백질의 추출에 필요한 자성 입자에 목적 단백질을 결합시키 기 위 한
자성 입자 반응액 및 세척용액을 제조하였다. 구체적으로 자성 입자 반응액 및 세척용액 [50 mM HEPES-KOH(pH7.5), 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 5 mM 2-mercaptoethanol(2-ME), 10%(v/v) glycerol]을 제조하였다. 이 용액은 멀티 웰 플레이트키트를제조하기전까지 4°C에보관하였다.
[158] <실시예 5>단백질용출용액제조
[159] 목적단백질추출에필요한단백질용출용액을제조하였다.
[160] 구체적으로단백질용출용액 [50 mM HEPES-KOH(pH7.5), 300 mM NaCl, 1 M Imidazole, 5 mM 2-mercaptoethanol(2-ME), 10%(v/v) glycerol]을제조하였다.이 용액은멀티웰플레이트키트를제조하기전까지 4°C에보관하였다.
[161] <실시예 6>멀티웰플레이트키트의제조
[162] m세포파쇄액분주및보과
[163] 상기실시예 2에서제조하여보관증인세포파쇄액을얼음에서완전히녹인다. 완전히녹은세포파쇄액을 8-strip튜브에각 200 ^씩분주한후， -70°C에 보관하였다.
[164] (2)멈티웸폴레이트키트제조
[165] 상기실시예 3~5에서제조한용액을사용하여멀티웰플레이트키트를
제조하였다.
[166] 먼저도 10의 B를참고하면，게 2멀티웰플레이트키트 (420')를제조하였다. 구체적으로는실시예 3에서제조한무세포단백질발현용액을얼음에서완전히 녹인후，도 10의 B에서멀티웰플레이트의 G열에단백질발현용액을각 350 μί를분주하고， Η열에는 DEPC증류수 (Bioneer사제，한국)를각 200 μί를분주한 후，상기의멀티웰플레이트의윗면을필름으로실링하여 -20°C에보관하였다.
[167] 그후도 10의 A를참고하면,제 1멀티웰플레이트키트 (420)를제조하였다. 구체적으로는실시예 4에서제조한자성입자반응액및세척용액을도 10의 A에서멀티웰플레이트 1의 A~D열에각 1.2 씩분주하고 ,Ε열에는단백질 용출용액을각 250^를분주한다.그리고 F열에는니켈이온이결합된
자성입자 (Bioneer사제，한국)를포함하는용액을각 500 f 씩분주하고,상기의 멀티웰플레이트의윗면을필름으로실링하여 4°C에보관하였다.
[168] <실시예 7>히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제장치를 이용한단백질발현 /추출방법
[169] (1)다백질합성음위하주비과정
[170] 본발명에사용되는히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제 장치는한국등록특허 10-1025135，한국공개특허 10-2011-0081718등에언급된 장치또는 ExiPmgen™ (Bioneer사제，한국)제품이사용될수있으며 ,이에 한정되는것은아니다.본실험에서는 ExiPmgen™ (Bioneer사제 ,한국)제품을 사용하였다.
[171] 히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제장치를이용한
단백질발현 /추출하는방법은도 9의모식도와같이진행된다.구체적으로는 먼저실시예 6의 1번에서준비한세포파쇄액이분주된튜브와멀티웰플레이트 키트를냉동고에서꺼내서상온에서완전히녹인다.그후히팅부와자기장 인가부를구비한생물학적물질자동정제장치 Ej oge«™ (Bioneer사제, 한국)의제공품 6 Hole Puncher로 1,2번멀티웰플레이트에구멍을뚫는다.
[172] 상기실시예 1에서준비한주형 DNA를제 2멀티웰플레이트 (420') L열에
첨가한다.그후，세포파쇄액과멀티웰플레이트를 ExiProgen™ (Bioneer사제， 한국)의해당위치에장착한다.단백질추출용액이담길 elutiontube와필터팁을 해당랙에꽂고해당랙의위치에장착한후， set up tray를밀어넣고장비의 도어를닫는다. ExiProgen™ (Bioneer사제，한국)의전원을켜고프로토콜 902를 실행한다.
[173] 이때첨가되는상기주형 DNA의양은주형 DNA의종류및크기에따라
차이가있으며,바람직하게는 plasmidDNA의경우 1내지 10 ug, PCR product의 경우 500 ng내지 2 ug을첨가한다.
[174] (2)히팅부와자기장이가부름구비하생물학적물짐자듀정체장치름이 ^하 단백짐발현 /추출과정
[175] 도 8은히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질자동정제장치를
이용하여목적단백질의발현및추출을동시에수행함을특징으로하는단백질 생산방법의흐름도를나타낸것이다.
[176] 도 5및도 8을참조하면특정단위웰로의무세포단백질합성을위한주형으로 목적 DNA주입단계 (S10)를가진다.도 10의 B를참조하면목적 DNA
주입단계 (S10)에서는 DNA를멀티웰플레이트 (420')의단위웰 L에 첨가한다.
[177] 도 5및도 8을참조하면특정단위웰에 DEPC증류수를주입하여흔합하는 제 1흔합단계 (S20)를가진다.특정단위웰로의 DEPC증류수주입및
혼합단계 (S20)에서는피펫 (141, 142도 3참조)을이용하여멀티웰
플레이트 (420')의단위웰 H에주입된 DEPC증류수를상기특정단위웰 L에 주입하게된다.이에따라 DEPC증류수가상기특정단위웰 L에주입된목적 DNA와흔합된다.
[178] 도 5및도 8을참조하면특정단위웰에무세포단백질발현용액주밉하여 흔합하는제 2흔합단계 (S30)를가진다.상기제 2흔합단계 (S30)에서는상기 피펫 (141, 142)을이용하여멀티웰플레이트 (420')의단위웰 G에주입된무세포 단백질발현용액을상기특정단위웰 L에주입하게된다.이에따라무세포 단백질발현용액은특정단위웰 L에서목적 DNA용액과혼합된다.
[179] 도 5및도 8을참조하면특정단위웰에세포파쇄액을주입하여혼합하는 흔합물제조단계 (S40)를가진다.상기흔합물제조단계 (S40)에서는상기 피펫 (141, 142)을이용하여세포파쇄액이주입된튜브 (442-1，도 5참조)에 주입된세포파쇄액을상기특정단위웰 L에주입하게된다.이에따라세포 파쇄액은특정단위웰 L에서목적 DNA와무세포단백질발현용액흔합물과 흔합되어，단백질합성반웅액이제조된다.
[180] 도 5및도 8을참조하면제 1가열단계 (S50)를가진다.상기
가열단계 (S50)에서는자석장착부 (710,도 6참조)를상승시켜상기특정단위 웰인단위웰 L의하부가단위웰인입홈 (713，도 6참조)에인입된상태가되도록 한다. 이어서 , 히 팅부 (720, 도 6 참조)를 작동시켜 상기 특정 단위 웰인 단위 웰 L의 하부를 가열하여 상기 제조된 단백질 합성 반응액에서 단백질의 발현을 촉진시 킨다. 가열단계 (S50)에서 흔합물 내의 효소에 의한 반응이 활성화되어 목적 DNA로부터 RNA 합성 및 단백질 발현이 이루어 진다. 상기 특정 단위 웰인 단위 웰 L의 하부는 상기 히팅부에 의 하여 섭씨 30°C로 3시간 동안 가열될 수 있다.
[181] 도 5 및 도 8을 참조하면 특정단위 웰로의 제 1 단백질 발현물 주입단계 (S60)를 가진다. 제 1 단백질 발현물 주입단계 (S60)에서는 상기 피 펫 (141， 142)올 이용하여 상기 제 1 가열단계 (S50) 후 특정 단위 웰인 단위 웰 L로부터 단백질의 발현이 이루어 진 흔합물을 멀티 웰 플레 이트 (420')의 단위 웰 J로 주입 된다.
[182] 도 5 및 도 8을 참조하면 자성 입자 반웅액과 자성 입자를 흔합하는 제 3
흔합단계 (S70)를 가진다. 상기 제 3 흔합단계 (S70)에서는 상기 피펫 (141， 142)을 이용하여 멀티 웰 플레 이트 (420)의 단위 웰 A에 주입 된 자성 입자 반웅액을 멀티 웰 플레 이트 (420)의 단위 웰 F에 주입하여 자성 입자와 흔합하게 된다. 이 에 따라 자성입자의 표면이 자성 입자 반응액으로 평 형화가 이루어 진다.
[183] 도 5 및 도 8을 참조하면 특정 단위 웰로의 자성 입자를 주입 즉，자성 입자
반응액과 흔합된 흔합물을 특정 단위 웰에 주입하는 주입단겨 j(S80)로 제 2 주입단계를 가진다. 상기 주입단계 (S80)에서는 상기 자석장착부 (710)가 하강된 상태에서 상기 피 펫 (141, 142)을 이용하여 상기 특정 단위 웰 F의 상기 자성 입자 반응액과 혼합된 혼합물을 상기 특정 단위 웰인 단위 웰 L에 주입하게 된다.
[184] 도 5 및 도 8을 참조하면 제 1 자기장 인가단계 (S90)를 가진다. 제 1 자기 장
인가단계 (S90)에서 는 상기 자석 장착부 (710)를 상승시 켜 상기 특장 단위 웰인 단위 웰 L의 하부가 상기 단위 웰 인입홈에 인입되도록 한다. 이에 따라, 상기 자석 장착부에 장착된 자석 (711，도 6 참조)으로부터 상기 특정 단위 웰인 단위 웰 L의 하부로 자기장이 인가된다.
[185] 도 5 및 도 8을 참조하면 제 1 제거단계 (S100)를 가진다. 제 1 제거단계 (S100)는 제 1 자기장 인가단계 (S90)에 의하여 상기 특정 단위 웰인 단위 웰 L의 하부로 자기장이 인가된 상태에서 수행된다. 보다 상세하게는 제 1 제거단계 (S100)가 수행되는 동안 상기 자성 입자 반웅액과 혼합된 흔합물 중 상기 자성 입자 반웅액의 자성 입자는 자기장에 의하여 상기 특정 단위 웰인 단위 웰 L의 하부 내벽에 부착된 상태를 유지 한다.
[186] 또한，제 1 제거단계 (S100)에서는 상기 피펫 (141， 142)을 이용하여 상기
자성 입자 반웅액과 흔합된 흔합물 증 상기 자성 입자를 제외 한 반웅액을 제거 하게 된다. 제 1 제거단계 (S100)에서 제거 되는 반응액은 폐 액통 (450，도 5 참조)으로 배출될 수 있다. 제 1 제거단계 (S100)가 수행됨에 따라 상기
자성 입자는 상기 특정 단위 웰인 단위 웰 L에 잔류하게 된다.
[18기 또한，특정 단위 웰로의 자성 입자가 흔합된 반웅액의 주입 단계 (S80), 제 1
자기장 인가단계 (S90) 및 제 1 제거단계 (S100)는 1회 반복하여 수행될 수 있다. 이 경우특정단위웰로의자성입자가흔합된반웅액의주입단계 (S80)는멀티웰 플레이트 (420)의단위웰 A에주입된자성입자반웅액을상기특정단위웰 L에 주입하게된다.그후제 1자기장인가단계 (S90)와제 1제거단계 (S100)는동일한 방식으로수행된다.
[188] 도 5및도 8올참조하면특정단위웰로의제 2단백질발현물주입단계 (S110)를 가진다.상기제 2단백질발현물주입단계 (S110)에서는상기피펫 (141， 142)을 이용하여상기특정단위웰 J의단백질발현물을상기특정단위웰 L로 주입된다.
[189] 도 5및도 8을참조하면자성입자와제 2단백질발현물과혼합후
반웅단계 (S120)를가진다.상기반웅단계 (S120)에서는상기피펫 (141, 142)을 이용하여상기특정단위웰 L에주입된제 2단백질발현물과자성입자가 흔합하게된다.이에따라자성입자의표면에단백질발현물이결합하게된다.
[190] 도 5및도 8을참조하면제 2자기장인가단계 (S130)를가진다.상기제 2자기장 인가단계 (S130)에서는상기자석장착부 (710)를상승시켜상기특정단위웰 L의 하부가상기단위웰인입홈에인입되도록한다.이에따라，상기
자석장착부 (710)에장착된자석으로부터상기특정단위웰 L의하부로 자기장이인가된다.
[191] 도 5및도 8을참조하면제 2제거단계 (S140)를가진다.상기제 2
제거단계 (S140)는제 2자기장인가단계 (S130)에의하여상기특정단위웰 L의 하부로자기장이인가된상태에서수행된다.따라서,제 2제거단계 (S130)가 수행되는동안상기자성입자단백질발현물중자성입자와자성입자에결합된 단백질은자기장에의하여상기특정단위웰 L의하부내벽에부착된상태를 유지한다.
[192] 또한,상기제 2제거단계 (S140)에서는상기피펫 (141， 142)을이용하여상기 자성입자단백질발현물중상기자성입자와자성입자에결합된단백질을 제외한흔합물을제거하게된다.제 2제거단계 (S140)에서제거되는흔합물은 멀티웰플레이트 (420')의단위웰 K로배출될수있다.제 2제거단계 (S140)가 수행됨에따라상기자성입자와자성입자에결합된단백질은상기특정단위웰 L에잔류하게된다.
[193] 도 5및도 8을참조하면특정단위웰로의세척용액주입하여세척하는
자성입자로부터목적단백질을제외한불순물을분리하는분리단계 (S150)를 가진다.상기분리단계 (S150)에서는상기자석장착부 (710)가하강된상태에서 상기피펫 (141， 142)을이용하여멀티웰플레이트 (420)의단위웰 B에주입된 세척용액을상기특정단위웰 L에주입하여흔합하며，상기자성입자로부터 목적단백질을제외한불순물을분리하게된다.
[194] 도 5및도 8을참조하면제 3자기장인가단계 (S160)를가진다.상기제 3자기장 인가단계 (S160)에서는상기자석장착부 (710)를상승시켜상기특정단위웰 L의 하부가상기단위웰인입홈에인입되도록한다.이에따라，상기 자석장착부 (710)에 장착된 자석 (711)으로부터 상기 특정 단위 웰 L의 하부로 자기장이 인가된다.
[195] 도 5 및 도 8을 참조하면 제 3 제거 단계 (S170)를 가진다. 상기 제 3
제거 단계 (S170)는 상기 제 3 자기장 인가단계 (S160)에 의하여 상기 특정 단위 웰 L의 하부로 자기장이 인가된 상태에서 수행된다. 따라서，제 3 제거 단계 (S170)가 수행되는 동안 상기 세 척용액과 흔합된 흔합물 중 상기 목적 단백질이 부착된 자성 입자는 자기 장에 의하여 상기 특정 단위 웰 L의 하부 내벽 에 부착된 상태를 유지 한다.
[196] 또한，상기 제 3 제거 단계 (S170)에서는 상기 피 펫 (141, 142)을 이용하여 상기
세척용액과 흔합된 흔합물 중 목적 단백질이 부착된 자성 입자를 제외 한 흔합물을 제거하게 된다. 상기 제 3 제거 단계 (S170)에서 제거 되는 흔합물은 멀티 웰 플레 이트 (420')의 단위 웰 I로 배출될 수 있다. 제 3 제거 단계 (S170)가 수행됨 에 따라 상기 목적 단백질이 부착된 상기 자성 입자는 상기 특정 단위 웰 L에 잔류하게 된다.
[197] 상기 특정 단위 웰로의 세척용액 주입 하여 세척하는 자성 입자로부터 목적
단백질을 제외 한 불순물을 분리하는 분리 단계 (S150), 제 3 자기장 인가단계 (S160) 및 제 3 제거단계 (S170)는 순차적으로 여 러 번 반복하여 수행될 수 있으며，제 3 단계 (S170)에서 제거되는 흔합물을 상기 폐 액통 (450)으로 배출하게 된다.
[198] 도 5 및 도 8을 참조하면 특정 단위 웰로의 단백질 용출용액을 주입하여 목적 단백질 추출하는 목적 단백질 분리 단계 (S180)를 가진다. 상기 목적 단백질 분리 단계 (S180)에서는 상기 자석장착부 (710)가 하강된 상태에서 상기 피 펫 (141， 142)을 이용하여 멀티 웰 플레 이트 (420)의 단위 웰 E에 주입 된 단백 질
용출용액을 상기 특정 단위 웰 L에 주입하여 흔합하며，상기 자성 입자로부터 목적 단백질을 분리시 키 게 된다.
[199] 도 5 및 도 8을 참조하면 제 4 자기장 인가단계 (S190)를 가진다. 제 4 자기 장
인가단계 (S190)는 특정 단위 웰로의 단백잘 용출용액을 주입하여 목적 단백질을 추출하는 목적 단백질 분리 단계 (S180)의 수행 후 소정 시간이 경과한 다음에 수행된다. 제 4 자기장 인가단계 (S190)에서는 상기 자석 장착부 (710)를 상승시 켜 상기 특정 단위 웰 L의 하부가 상기 단위 웰 인입홈에 인입 되도록 한다. 이 에 따라，상기 자석장착부 (710)에 장착된 자석으로부터 상기 특정 단위 웰 L의 하부로 자기장이 인가된다.
[200] 도 5 및 도 8을 참조하면 목적 단백질 함유용액 획득 단계 (S200)를 가진다. 상기 목적 단백질 함유용액 획득 단계 (S200)는 상기 제 4 자기장 인가단계 (S190)에 의하여 상기 특정 단위 웰 L의 하부로 자기 장이 인가된 상태에서 수행된다.
따라서，목적 단백질 함유용액 획득 단계 (S200)가 수행되는 동안 상기
자성 입자로부터 분리 된 단백질이 포함된 단백질 용출용액 중 상기 자성 입자는 자기 장에 의하여 상기 특정 단위 웰인 단위 웰 L의 하부 내벽에 부착된 상태를 유지ᅵ한다. [201] 상기목적단백질함유용액획득단계 (S200)에서는상기피펫 (141, 142)을 이용하여상기자성입자로부터분리된단백질이포함된단백질용출용액중 상기자성입자를제외한흔합물인목적단백질함유용액을상기
베이스플레이트 (400)에탑재된단백질보관용튜브 (442-3)에주입보관하게 된다.
[202] G)다백짐합성키트를이용하심 과
[203] 상기실시예 7의방법으로본키트와 ExiProgen™ (Bioneer사제，한국)를 이용하여 16개의반웅웰에서동시에 GFP를합성한결과도 11과같은결과를 얻을수있다.구체적으로는 10 ~ 12% SDS-PAGE젤에서확인한결과를 나타내며,반응웰사이의편차가없어동일단백질에대해서재현성 있는합성 효율을얻을수있음을확인할수있었다.
[204] 또한각기다른형태로제작된주형을사용하여각기다른단백질을합성한 결과역시도 12와같은결과를얻을수있었다.

Claims

청구범위
[청구항 1] (1)무세포단백질합성을위한주형을제조하고;
(2)상기주형을무세포단백질발현용반웅액에가하여단백질을 발현시키고;
(3)상기발현단백질에친화태그 (affinity tag)와결합하는 자성입자를가하여목적단백질을부착시키고;
(4)상기부착된목적단백질을자성입자로부터분리시키는; 단계를포함하는히팅부와자기장인가부를구비한생물학적물질 자동정제장치를이용하여，전자동화된시스템에서목적단백질의 발현및추출을동시에수행함을특징으로하는단백질생산방법.
[청구항 2] 제 1항에있어서，
상기방법은
(a)무세포단백질합성을위한주형을희석시키기위한용액;
(b)상기주형으로부터목적단백질을발현시키기위한무세포 단백질발현용액;이포함되는제 2멀티웰플레이트키트 (420')및
(c)상기목적단백질올부착시키기위한자성입자용액;
(d)상기목적단백질용출용액;
(e)상기자성입자에목적단백질을결합시키기위한자성입자 반웅액및세척용액;이포함되는제 1멀티웰플레이트
키트 (420)로구성되는，멀티웰플레이트키트 (420', 420)를
. 이용하는것을특징으로하는단백질생산방법.
[청구항 3] 제 1항에있어서,
상기무세포단백질합성을위한주형은원형형태 (circular form) 또는선형형태 (linear form)의 DNA인것을특징으로하는단백질 생산방법.
[청구항 4] 제 3항에 있어서，
상기선형형태의 DNA는
타겟유전자를증폭할수있으며 5'과 3'말단에 overlapping서열을 갖도록제작된프라이머세트를이용하여，시료내타겟유전자를 증폭시켜 1차반웅물을수득하는단계;및
상기수득된 1차반응물에하기조성물 A를포함하는 PCR용 사전흔합물 (premix)을이용하여 2차증폭하는단계;를포함하여 제조되는것을특징으로하는단백질생산방법 ·
[조성물 A]
(a)타겟유전자의 5'과 3'양말단에위치하는 upstream casette set와 downstream casette set
(b)상기 cassette의 5'과 3'말단에 overlapping서열을가지는 2차 프라이머세트
[청구항 5] 제 4항에있어서,
상기조성물 A는
타겟유전자의 5，및 3'양말단에친화태그 (affinity tag)를코드화 하기위한 cassette set 0.1내지 0.5 ng/ul,상기 casette의 5'과
3'말단에 overlapping서열을가지는 2차 forward및 reverse 프라이머각 0.1내지 1.0 pmoles/ul를포함하는것을특징으로하는 단백질생산방법.
[청구항 6] 제 4항에있어서,
상기친화태그 (affinity tag)는히스티딘인것을특징으로하는 단백질생산방법.
[청구항 7] 제 1항에있어서,
상기자성입자는금속이온을포함하는것을특징으로하는단백질 생산방법.
[청구항 8] 제 7항에 있어서,
상기금속이온은니켈이온인것을특징으로하는단백질 생산방법.
[청구항 9] 제 1항내지제 8항에서선택되는어느한항에있어서,
상기단백질생산방법은상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위 웰에무세포단백질합성을위한주형을주입하는，주입단계 (S10); 상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰에주형을희석시키기 위해주입된 DEPC증류수를상기주입된주형에흔합하는,제 1 흔합단계 (S20);
무세포단백질발현용액을상기제 1흔합단계의흔합물과 흔합하는，제 2흔합단계 (S30);
제 2흔합단계의흔합물과세포파쇄액을흔합하여단백질합성 반웅액을제조하는，흔합물제조단계 (S40);
히팅부 (720)를이용하여상기흔합물이들어있는상기멀티웰 플레이트키트 (420')의상기특정단위웰하부를가열하여상기 특정단위웰내단백질합성반웅액에열을가하는,
가열단계 (S50);
자성입자반웅흔합물을준비하는단계 (S70) 상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰에주입된단백질 발현물을상기준비한자성입자흔합물에주입하는단백질발현물 주입단계 (S 110);
상기멀티웰플레이트키트 (420')의단위웰에주입된단백질 발현물을자성입자와반웅시키는,반웅단계 (S120);
상기단백질발현물과흔합된흔합물에자기장을인가시켜상기 자성입자와자성입자에결합된단백질을제외한흔합물을
제거하는제거단계 (S 140);
상기멀티웰플레이트키트 (420)의단위웰에주입된세척용액을 주입하여상기자성입자로부터목적단백질을제외한불순물을 세척하는세척단계 (S 150);
상기세척용액과흔합된흔합물에자기장올인가시켜상기 세척용액과흔합된흔합물중상기목적단백질이부착된상기 자성입자를제외한혼합물을제거하는，제거단계 (S 170);
상기멀티웰플레이트키트 (420)의단위웰에주입된목적단백질 용출용액을상기제거단계를거친혼합물에주입하여상기목적 단백질을분리시키는,목적단백질분리단계 (S180);
상기흔합물에자기장을인가시켜상기자성입자로부터분리된 목적단백질이포함된단백질용출용액중상기자성입자를 제외한흔합물인목적단백질함유용액을획득하는，목적단백질 함유용액획득단계 (S200);
단계를포함하는것을특징으로하는단백질생산방법.
제 9항에 있어서，
상기목적단백질을제외한불순물을세척하는세척단계 (S150)와 상기목적단백질이부탁된자성압자를제외한혼합물을제거하는 제거단계 (S170)를순차적으로 1회이상수행하는것을특징으로 하는단백질생산방법.
제 9항에 있어서，
상기목적단백질함유용액획득단계 (S200)는상기목적단백질 함유용액을단백질보관용튜브 (442-3)에주입하는것을포함하는 것을특징으로하는단백질생산방법.
Figure imgf000025_0001
제 9항에있어서，
상기자성입자는니켈이온이결합된자성입자인것을특징으로 하는단백질생산방법 .
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