CN110283716B - 一种用于无细胞蛋白质连续合成的装置和方法 - Google Patents

一种用于无细胞蛋白质连续合成的装置和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于无细胞蛋白质连续合成的装置及相应的合成方法，该装置包括：液体提供单元、气体提供单元、微型套管膜反应单元、控温单元、和蛋白质纯化单元。液体提供单元、气体提供单元、蛋白质纯化单元分别与微型套管膜反应单元连接，控温单元控制微型套管膜反应单元的反应温度，蛋白质纯化单元纯化微型套管膜反应单元排出的反应产物。本连续合成装置及使用其的方法具有蛋白质合成效率高、表达量灵活可控、氧气浓度可控、气体传质速度快、易与后续蛋白质纯化集成等优点，同时，该方法具有很好的普适性和生物相容性，可用于抗体、疫苗、多肽、酶等多种蛋白质合成。

Description

一种用于无细胞蛋白质连续合成的装置和方法
技术领域
本发明属于生物反应系统技术领域，尤其涉及一种用于无细胞蛋白质连续合成的装置和方法。
背景技术
近年来，无细胞蛋白合成(cell-free protein synthesis，CFPS)作为一种新型的蛋白质合成方法，展现出巨大的潜力和应用前景。该蛋白质合成系统的主要组分包括具有基本转录和翻译功能的粗提取物、DNA模板、能量再生物质、辅因子和无机盐等。特别地，与自然状态下活细胞合成蛋白质不同，无细胞蛋白合成体系发生在一个开放的世界，不受细胞膜的限制，这不仅允许无细胞蛋白体系合成对细胞活性有害的蛋白质，还使基因更容易被编辑和蛋白质合成过程更好监控，极大地增加了蛋白质合成过程的灵活性。因此，无细胞合成体系具有比活细胞合成方法更快的蛋白质表达率、更高的蛋白质产量和可合成更复杂的蛋白质。
目前，已有多种反应器被应用于无细胞蛋白质合成过程。间歇式反应器由于操作简单、规模小，在无细胞合成中得到了广泛的应用。氧气作为三磷酸腺苷(ATP)再生系统中的关键组分，对ATP的再生过程有着重要的影响。氧供应不足降低ATP再生速率，增加脱氧核糖核酸(DNA)转录-翻译时间，从而降低蛋白质产量和合成效率。同时，蛋白质合成过程中产生的二氧化碳也可能抑制代谢过程，影响蛋白质表达。因此，无细胞合成过程中气体的扩散速率影响了蛋白质的产量和合成速率。然而，间歇反应器气液传质性能差，放大困难，将会降低了蛋白质的产量和表达率，同时，该过程操作繁琐，限制了其在无细胞蛋白质合成中的应用。而微反应器作为一种新兴的反应器，以其良好的传质性能和过程连续可控等优点受到研究者的广泛关注，具有传质距离短，合成过程连续，比间歇反应器蛋白质产率高等优点。本专利提出的微型套管膜反应器用于无细胞蛋白质合成过程，除了具有传统微反应器特点外，还可以把气体和反应底物分隔开，避免气体和反应底物的直接接触，气体浓度和反应底物流量可以随时进行改变。该反应器用于无细胞蛋白质合成具有灵活和高效的特点，可实现蛋白质的按需合成。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的是利用微型套管膜反应器的高透气性提高气体传质速度，精准地控制无细胞合成过程中的气体浓度和流量，并结合连续流动合成的方式，实现无细胞蛋白质的灵活、高效和按需合成。同时，通过合成抗体、类病毒颗粒、抗菌肽和疫苗等四种代表性的蛋白质，证明该蛋白质合成方法的普适性。
用于解决技术问题的方法
针对上述问题，本发明提出了一种用于无细胞蛋白连续合成的装置和方法。
根据本发明的一个实施方案，提供一种用于无细胞蛋白质连续合成的装置，其包括：液体提供单元、气体提供单元、微型套管膜反应单元、控温单元、和蛋白质纯化单元。液体提供单元、气体提供单元、蛋白质纯化单元分别与微型套管膜反应单元连接，控温单元控制微型套管膜反应单元的反应温度，蛋白质纯化单元纯化微型套管膜反应单元排出的反应产物。
一种实施方式为，所述液体提供单元采用液体输送泵输送液体，液体输送泵选自注射泵、平流泵、蠕动泵或其他可以精准控制流速的泵。
一种实施方式为，液体提供单元将液体反应原料输送到套管膜反应单元中，套管膜反应单元所用膜为中空纤维膜，液体反应原料在中空膜中反应。
一种实施方式为，套管膜反应单元中中空纤维膜的根数为1根或者多根，中空膜内径为0.1～2mm，膜厚为0.05～0.5mm，膜长度为0.5～10m。
一种实施方式为，套管膜反应单元所用膜材料为聚丙烯、聚四氟乙烯、聚 4-甲基1-戊烯(PMP)、Teflon AF 2400、Teflon AF1600、聚砜或者其他透气疏水膜材料。
一种实施方式为，气体提供单元将气体原料输送到套管膜反应单元中，气体在套管膜反应单元与膜材料之间的空隙中流动，并从套管膜反应单元排出。
根据本发明的一个实施方案，提供一种用于无细胞蛋白质连续合成的方法，其特征在于，使用了如权利要求1-6中任一项所述的装置，包括如下步骤：
(1)利用微型套管膜反应单元进行无细胞蛋白质连续流动合成，通过液体提供单元将反应底物连续注入膜反应单元内的中空纤维膜管中进行蛋白质表达，通过气体提供单元向微型套管膜反应单元中提供气体，反应温度通过温度控制单元控制；
(2)反应底物在套管膜反应单元中表达一定时间后，得到的产物直接流入蛋白质纯化单元进行蛋白质纯化，得到纯化好的蛋白质；
一种实施方式为，所述步骤(1)中控制温度为0-60℃。
一种实施方式为，所述步骤(1)中停留时间为0.1-24h。
一种实施方式为，所述步骤(1)中膜反应单元壳层气体中氧气体积分数为 0-100％，其余气体组分为氮气。
本发明的有益效果
在本发明提供的一种用于无细胞蛋白质连续合成的装置和方法中，蛋白质合成效率高且合成速度快；套管膜反应单元中蛋白质表达时间比微型离心管少了1-6h，但表达量比微型离心管中高了0-5mg/mL；气体传质速度快，由于管表面上高透气性致密膜，氧气快速地进入反应底物，从而可以精准的控制氧气在蛋白质合成过程中的浓度，同时，可以迅速将反应底物中的二氧化碳脱除；易于集成蛋白质纯化等多个步骤，实现蛋白质连续高效合成；具有很好的普适性和生物相容性，可以快速高效合成抗体、疫苗、类病毒颗粒和抗菌肽等四种代表性的蛋白质。
从以下示例性实施方案的描述中，本发明的进一步特征将变得显而易见。
附图说明
图1是本发明实施例中微型套管膜反应单元内连续合成蛋白质的流程图；
图2是本发明实施例中微型套管膜反应单元内合成抗体、类病毒颗粒、疫苗和抗菌肽等四种代表性蛋白质的电泳图。
具体实施方式
以下对本公开的一个实施方式具体地说明，但本公开并非限定于此。
本发明提供一种无细胞蛋白质快速高效合成的装置和方法。该装置包括液体提供单元、气体提供单元、微型套管膜反应单元、控温单元、和蛋白质纯化单元。液体提供单元、气体提供单元、蛋白质纯化单元分别与微型套管膜反应单元连接，控温单元控制微型套管膜反应单元的反应温度，蛋白质纯化单元纯化微型套管膜反应单元排出的反应产物。该使用该装置制备蛋白质的方法，基于微型套管膜反应单元中中空纤维膜对气体的高透气性，氧气可以迅速透过膜进入液体管路中连续流动的反应底物，参与底物的蛋白质表达过程，同时代谢产生的二氧化碳可以通过膜快速地从流动底物中去除，表达温度由恒温水浴槽控制，氧气流量和浓度由气体质量流量计控制。
液体提供单元将液体反应原料输送到套管膜反应单元中，液体提供单元采用液体输送泵输送液体，液体输送泵选自注射泵、平流泵、蠕动泵或其他可以精准控制流速的泵。
套管膜反应单元所用膜为中空纤维膜，液体反应原料在中空膜中反应。套管膜反应单元中中空纤维膜的根数为1根或者多根，中空膜内径为0.1～2mm，膜厚为0.05～0.5mm，膜长度为0.5～10m。套管膜反应单元所用膜材料为聚丙烯、聚四氟乙烯、聚4-甲基1-戊烯(PMP)、Teflon AF 2400、Teflon AF1600、聚砜或者其他透气疏水膜材料。
气体提供单元将气体原料输送到套管膜反应单元中，气体在套管膜反应单元与膜材料之间的空隙中流动，并从套管膜反应单元排出，气体在本申请中采用氧气，采用气体质量流量计控制气体流量。相应的，可以设置气体收集单元。
温度控制单元可以采用常规的温度控制装置，可以使用例如恒温水浴等。在反应底物在套管膜反应单元中表达的同时，在同一温度条件下(例如在同一水浴锅内)，将0-50μL反应物加入到微型离心管中进行蛋白质表达，作为对照组实验，分析微型套管膜反应单元中蛋白质合成效率。
实施例1:
通过注射泵将合成荧光蛋白质的反应底物连续注入套管膜反应单元的液体管路管中，改变反应底物的流速0-500μL/min,使反应底物在反应器内中的停留时间为0-6h,在反应器壳层中以40mL/min充入氧气体积分数为21％气体混合物，反应温度维持在30℃。
在表达一定时间后，生成的产物进入蛋白质纯化柱中。经纯化后，得到纯化好的蛋白质产品。
在纯化柱出口，取20μL蛋白质样品；同时，从恒温水浴槽中取出微型离心管中的样品，都放入-80℃冷冻冰箱，淬灭反应。
将得到的样品解冻，进行电泳实验，分析并得到不同停留时间下蛋白质的表达量，如表1。
实施例2:
通过平流泵将合成荧光蛋白质的反应底物连续注入套管膜反应单元的液体管路中，改变反应底物的流速100μL/min,使反应底物在反应器中的停留时间为6h,在反应器壳层中以40mL/min充入氧气体积分数为0％、21％和100％的气体混合物，反应温度维持在30℃。
生成的产物从套管膜反应单元的内管出口直接流入蛋白质纯化柱中进行纯化。经纯化后，得到纯化好的蛋白质产品。
在纯化柱出口，取20μL蛋白质样品放入-80℃冷冻冰箱储存。
将得到的样品解冻，进行电泳实验，分析得到在氧气浓度为0％、21％和100％气体混合物下蛋白质的表达量依次为0mg/mL、10.9mg/L和5.7mg/mL。
实施例3:
通过蠕动泵将合成荧光蛋白质的反应底物连续注入套管膜反应单元的液体管路中，改变反应底物的流速100μL/min,使反应底物在反应器内中的停留时间为6h,在反应器壳层中以40mL/min充入氧体积分数为21％的气体混合物，反应温度维持在20℃、30℃和37℃。
在表达一定时间后，生成的产物进入蛋白质纯化柱中。经纯化后，得到纯化好的蛋白质产品。
在纯化柱出口，取20μL蛋白质样品，放入-80℃冷冻冰箱。
将得到的样品解冻，进行电泳实验，得到反应温度在20℃、30℃和37℃下，蛋白质的表达量依次为0.9mg/mL、10.3mg/mL和6.9mg/mL。
实施例4:
通过注射泵将反应底物连续注入套管膜反应单元的液体管路中，改变反应底物的流速100μL/min,使在反应器内中的停留时间为6h,在反应器气体壳层中以40mL/min充入氧体积分数为21％的气体混合物，反应温度维持在30℃。
在表达一定时间后，生成的产物进入蛋白质纯化柱中。经纯化后，得到纯化好的蛋白质产品。改变反应底物的组成，合成NbVimentin抗体、CCMV类病毒颗粒、DT5疫苗和CP抗菌肽等四种代表性的蛋白质。
在纯化柱出口，取20μL蛋白质样品，放入-80℃冷冻冰箱。
将得到的样品解冻，进行电泳实验，分析不同种类的蛋白质在套管膜反应单元内的表达情况，见图2。
Figure BDA0002101668030000061
Figure BDA0002101668030000071
表1
此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种用于无细胞蛋白质连续合成的方法，其使用了用于无细胞蛋白质连续合成的装置，该装置包括：液体提供单元、气体提供单元、微型套管膜反应单元、控温单元和蛋白质纯化单元，液体提供单元、气体提供单元、蛋白质纯化单元分别与微型套管膜反应单元连接，控温单元控制微型套管膜反应单元的反应温度，蛋白质纯化单元纯化微型套管膜反应单元排出的反应产物，微型套管膜反应单元所用膜为疏水透气致密性中空纤维膜，该膜使得氧气快速地进入反应底物，中空纤维膜内径为0.1～2mm，膜厚为0.05～0.5mm，其中，所述液体提供单元采用液体输送泵输送液体，液体提供单元将液体反应原料输送到微型套管膜反应单元中，气体提供单元将气体原料输送到微型套管膜反应单元中，其中，微型套管膜反应单元所用膜材料选自聚丙烯、聚四氟乙烯、聚4-甲基1-戊烯(PMP)、Teflon AF 2400、TeflonAF1600；
该方法包括如下步骤：
(1)利用微型套管膜反应单元进行无细胞蛋白质连续流动合成，通过液体提供单元将反应底物连续注入微型套管膜反应单元内的中空纤维膜中进行蛋白质表达，通过气体提供单元向微型套管膜反应单元中提供气体，反应温度通过控温单元控制；
(2)反应底物在微型套管膜反应单元中停留一定时间后，得到的产物直接流入蛋白质纯化单元进行蛋白质纯化，得到纯化好的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，液体输送泵选自注射泵、平流泵、蠕动泵或其他可以精准控制流速的泵。
3.根据权利要求1-2中之一所述的方法，其中，液体反应原料在中空纤维膜中反应。
4.根据权利要求1-2中之一所述的方法，其中，微型套管膜反应单元中中空纤维膜的根数为1根或者多根，膜长度为0.5～10m。
5.根据权利要求1-2中之一所述的方法，其中，气体在微型套管膜反应单元与膜材料之间的空隙中流动，并从微型套管膜反应单元排出。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中控制温度为0-60℃。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中停留时间为0.1-24h。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中微型套管膜反应单元壳层气体中氧气体积分数为0-100％，其余气体组分为氮气。
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Automated in Situ Measurement of Gas Solubility in Liquids with a Simple Tube-in-Tube Reactor;Zhang J, et al.;《Anal Chem.》;20170815;第89卷(第16期);全文，特别是摘要，第8526页左栏第2段，图1，图2 *
Synthesis of preparative amounts of biologically active interleukin-6 using a continuous-flow cell-free translation system.;Volyanik EV, et al.;《Anal Biochem.》;19931031;第214卷(第1期);第290页右栏第3段，图1及其图注 *

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