WO2013015717A2 - Способ - определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе (варианты), устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе - Google Patents

Способ - определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе (варианты), устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе Download PDF

Info

Publication number
WO2013015717A2
WO2013015717A2 PCT/RU2012/000570 RU2012000570W WO2013015717A2 WO 2013015717 A2 WO2013015717 A2 WO 2013015717A2 RU 2012000570 W RU2012000570 W RU 2012000570W WO 2013015717 A2 WO2013015717 A2 WO 2013015717A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
proteolytic enzyme
spatial
activity
distribution
Prior art date
Application number
PCT/RU2012/000570
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2013015717A3 (ru
WO2013015717A8 (ru
Inventor
Фазоил Иноятович АТАУЛЛАХАНОВ
Наталья Михайловна ДАШКЕВИЧ
Михаил Владимирович ОВАНЕСОВ
Василий Иванович САРБАШ
Михаил Александрович ПАНТЕЛЕЕВ
Сергей Сергеевич КАРАМЗИН
Андрей Юрьевич КОНДРАТОВИЧ
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация"
Priority to EA201400156A priority Critical patent/EA028341B1/ru
Priority to CA2842594A priority patent/CA2842594C/en
Priority to JP2014522787A priority patent/JP2014521952A/ja
Priority to US14/234,909 priority patent/US9938563B2/en
Priority to CN201280045249.3A priority patent/CN103998620A/zh
Priority to EP12818440.5A priority patent/EP2752495B8/en
Publication of WO2013015717A2 publication Critical patent/WO2013015717A2/ru
Publication of WO2013015717A3 publication Critical patent/WO2013015717A3/ru
Publication of WO2013015717A8 publication Critical patent/WO2013015717A8/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6408—Fluorescence; Phosphorescence with measurement of decay time, time resolved fluorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin

Definitions

  • the present invention relates to medicine and biology, and can be used, in particular, for diagnostic and research purposes to determine the characteristics of the blood coagulation system and its components, as well as in biotechnology, pharmacology and basic biological research.
  • the concentration of proteolytic enzymes can be measured if this value is constant over time and is the same at all points of the test sample using a specific fluorogenic substrate or chromogenic substrate.
  • the plasma thrombin generation test described in the fundamental work of Hemker N.C., Wielders S., Kessels H., Beguin S. Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential, is now used. . J Thromb Haemost. 1993, Oct. eighteen ; 70 (4): 617-24. He has demonstrated many advantages over traditional coagulation tests, but is spatially homogeneous, i.e. homogeneous medium is investigated. This does not correspond to the situation in the body described below.
  • FIG. 1 schematically represents the spatial concept of regulation of blood coagulation.
  • Coagulation is activated by cells expressing the transmembrane protein tissue factor, the non-enzymatic cofactor, which is a coagulation factor (left), and spreads deep into the plasma.
  • Thrombin generation is regulated by activated factor X (factor XA, serine proteinase), the limiting component of prothrombinase.
  • factor XA activated factor XA, serine proteinase
  • Coagulation near the activator (initiation phase) is determined solely by the production of factor Xa by an external tenase, a complex of tissue factor and factor Vila serine proteinase. However, factor Xa is rapidly inhibited and cannot diffuse far from the activator.
  • coagulation factor 1Xa The limiting component of internal tenase, coagulation factor 1Xa, is produced by external tenase. Unlike factor XA, it is inhibited slowly and therefore diffuses far. With a further increase in the clot, an additional factor 1Xa is produced by factor X1a, which in turn is produced by thrombin in the positive feedback loop.
  • Clot formation stops due to the action of thrombomodulin a negative feedback loop activates protein C, which stops the spread of thrombin, destroying factors Va and Villa (see Panteleev MA, Ovanesov MV, Kireev DA, Shibeko AM, Sinauridze EI, Ananyeva NM, Butylin AA, Saenko EL, Ataullakhanov FI. Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein C pathways, respectively. Biophys J. 2006 Mar 1; 90 (5): 1489-500.).
  • Thrombin is the main enzyme of the blood coagulation system. It catalyzes the main reaction - the conversion of fibrinogen to fibrin. In addition, it is thrombin that activates coagulation factors V, VIII, VII, XI, XIII, protein C, platelets, a thrombin-activated fibrinolysis inhibitor. Thrombin during coagulation is formed 10 - 100 times more than other proteinases, which facilitates its determination.
  • fibrinogen is converted to fibrin, which polymerizes and thereby gels blood plasma.
  • Blood coagulation studies are of great practical interest, since they not only make it possible to diagnose individual diseases, but also evaluate the activity of drugs that affect blood coagulation parameters.
  • chromogenic and then fluorogenic substrates have accelerated the study of blood coagulation.
  • a synthetic substrate is a molecule that is recognized and cleaved by a proteolytic enzyme.
  • a cut leads to cleavage of a signal molecule, also called a label, from the substrate.
  • the label either changes the optical density of the solution (chromogenic or staining substrate), or is able to fluoresce under illumination (fluorogenic substrate), or is able to spontaneously emit light without external excitation (chemiluminescent label).
  • Substrates for thrombin can be added directly to the plasma and the signal (optical density or light intensity) resulting from clotting can be recorded. The signal increase rate is proportional to the concentration of thrombin.
  • the dependence of thrombin on time is obtained from the experimental dependence of the signal on time by simple differentiation and calculation of the concentration of thrombin from the rate of cleavage of the substrate using a calibration a curve obtained by adding known concentrations of thrombin or another calibrator (for example, a complex of thrombin and alpha2-macroglobulin) to a buffer or plasma under investigation.
  • a calibrator for example, a complex of thrombin and alpha2-macroglobulin
  • the prior art various methods and devices for determining the parameters of blood coagulation in vitro.
  • the known methods and devices are intended to work, as a rule, with homogeneous systems in which a blood or plasma sample is uniformly mixed with an activator, which significantly distinguishes these systems from an in vivo system, which is a complex heterogeneous medium.
  • a clot In existing in vitro model systems, the conditions for the coagulation process are fundamentally different - from those conditions in which a clot forms in a living organism. It is known that in the circulatory system of humans and animals, a clot is formed not in the entire volume of blood plasma, but strictly locally, i.e. in a small area of damage to the blood vessel wall. Coagulation in the body is heterogeneous. The formation of a clot occurs in space. It is triggered by external tenase on the damaged vessel wall, spreads with the participation of prothrombinase on activated platelets in the plasma volume, and is inhibited by reactions involving thrombomodulin on healthy endothelium.
  • coagulation occurs in a cell containing recalcified plasma.
  • an activator a surface with an immobilized coagulation activator, for example, a tissue factor, is used.
  • coagulation begins, which then spreads deep into the plasma and which can be observed by light scattering from the growing clot.
  • the prior art device for studying the characteristics of blood coagulability and its components (patent RU 2395812, class G01N33 / 49, published July 27, 2010), containing a thermostatic chamber, in which is placed a cuvette with the studied plasma sample and coagulation activator, in which quality thromboplastin (tissue coagulation factor) is used, applied to the insert, which is inserted into the cuvette, LEDs to illuminate the contents of the cuvette and - the clot formed at the activator, a digital camera that fixes the growing clot, GUSTs connected to a computer for processing received data.
  • a thermostatic chamber in which is placed a cuvette with the studied plasma sample and coagulation activator, in which quality thromboplastin (tissue coagulation factor) is used, applied to the insert, which is inserted into the cuvette, LEDs to illuminate the contents of the cuvette and - the clot formed at the activator, a digital camera that fixes the growing clot, GUSTs connected to a computer for processing received
  • the specified device allows you to implement a method in which only the process of formation of a fibrin clot, which is the end product of the coagulation system, is recorded.
  • the device includes a cuvette for photometric analysis, an insert and an activator, a thermostat in which the cuvette is located.
  • the coagulation activator is applied to the lower edge of the insert.
  • the coagulation activator is a physiological activator, for example, a tissue factor, or a non-physiological activator, for example, glass.
  • the cuvette is made of light-transmitting polystyrene.
  • the known device allows you to implement a method for monitoring the formation and / or lysis of a fibrin clot in vitro, which contains the following steps:
  • one or more blood plasma samples are placed in a cuvette according to the number of wells,
  • an insert with an activator is introduced into the cuvette and the plasma is in contact with the coagulation activator (when a clot forms);
  • one or more blood plasma samples containing one or more fibrin clots are placed in a cuvette;
  • the principal advantage of this method and device for monitoring the spatial formation of a fibrin clot is the small amount of plasma required. With such a small amount as 20 ⁇ l (instead of 300 to 1500 ⁇ l, i.e. 75 times less than in other similar systems and 5 times less than the minimum amount of plasma required for standard tests, coagulation) can reliable high-resolution results be obtained.
  • the specified device allows you to implement a method in which only the process of formation of a fibrin clot, which is the end product of the coagulation system, is recorded.
  • the disadvantages of the aforementioned device and method include the formation of gas bubbles in the cell in the detection region during heating of the samples under study that distort the light scattering signal from the fibrin clot.
  • the described method and device do not provide the ability to register the process of formation and spatial distribution of individual coagulation factors, such as Na, Xa, Vila, XIa, which regulate the spatial growth process of the fibrin clot.
  • the closest analogue to the claimed method and device can be considered the device and method disclosed in the article by Kondratovich A.Yu., Pokhilko A.V. and Ataullakhanov F.I. “Spatiotemporal dynamics of contact activation factors of blood coagulation. Biochim Biophys Acta. 2002 Jan 15; 1569 (1-3): 86” -104.).
  • platelet-poor plasma is used.
  • the distribution of factor XIa and kallikrein of the studied plasma sample is determined by recording radiation in the blue spectral region of 7-amino-4-methylcoumarin (AMC) resulting from the splitting of fluorogenic substrates specific for these factors.
  • AMC 7-amino-4-methylcoumarin
  • Fig. 2 schematically shows the device used to implement the method.
  • the device contains a container 1 made of polystyrene containing a test sample of blood plasma 2. A substrate was added to plasma 2. The end of 5 glass capillary tubes served as a coagulation activator.
  • the device also contains a light source b, which is a mercury lamp, a thermostat 7, a glass filter 8, a translucent mirror 9, a digital camera 10, a fluorescent plastic sticker 12, the device is connected to a computer 11.
  • AMS fluorescence was recorded as follows. A plasma sample was illuminated by radiation from light source b reflected from a translucent mirror 9. Filters 8 blocked the visible part of the spectrum. AMS fluorescence was recorded by a digital camera 10 mounted behind a translucent mirror. The recorded field of view was 9x6.5 mm. The blue RGB channel of the camera output covered the entire fluorescence range of the AMC. Data, images were continuously transferred to computer 11, and displayed on the monitor, and also saved at specified intervals. A piece of fluorescent plastic 12 was fixed under the thermostat 7 so that its image was always in the field of view of the camera, it was used for calibrations and accounting for fluctuations in lighting.
  • a radial beam was selected with the beginning in the center of the activator.
  • special software determined the spatiotemporal distribution of the concentration of AMS along this beam (Fig. 3), and based on it the spatiotemporal distribution of the concentration of the coagulation factor was restored.
  • the disadvantages of this method include the ability to measure only contact activation factors (namely, factors XIa, Xlla, kallikrein), with a poor ability to distinguish between the contributions of these factors to signal, without the ability to measure the spatial dynamics of the coagulation process, i.e. formation of a fibrin clot.
  • contact activation factors namely, factors XIa, Xlla, kallikrein
  • the disadvantages of the device include: the inconvenience of the capacity used for high-performance research; the use of unstable lighting with a mercury lamp that does not allow accurate measurements, the formation of gas bubbles in the process registration region when heating the samples under study, which distort the fluorescence signal.
  • the known method does not allow to simulate in vitro systems that are close in their physiological properties to in vivo systems, as well as to more accurately diagnose disorders in the blood coagulation system.
  • the method does not allow to fully investigate the spatial dynamics of coagulation factors, primarily thrombin, in the process of growth of a fibrin clot, and does not provide an opportunity to assess the role of coagulation factor in various phases of the blood coagulation process in a heterogeneous system.
  • the objective of the present invention is to study the spatial dynamics of coagulation factors during the growth of a fibrin clot and assess the role of coagulation factors in various phases of the blood coagulation process in a heterogeneous system, which will allow to diagnose individual diseases and evaluate the activity of drugs that affect blood coagulation parameters.
  • the technical result that can be obtained by implementing the proposed solution is to increase the sensitivity of the method to violations of both plasma and platelet coagulation units.
  • the problem is solved by creating a method for determining the spatio-temporal distribution of the activity of a proteolytic enzyme in a heterogeneous system, in which:
  • test medium selected from the group consisting of blood plasma, whole blood, water, lymph, colloidal solution, crystalloid solution or gel, and a proteolytic enzyme or its precursor distributed in the sample,
  • the spatial and temporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme is obtained from the set of spatial distributions of the signal of the fluorescent label for given time instants by solving the inverse problem of the “reaction - diffusion - convection” type taking into account the degree of label binding with the components of the medium under study.
  • the problem can also be solved by creating a second version of the method for determining the spatio-temporal distribution of the activity of a proteolytic enzyme, in which:
  • an in vitro system that contains a sample of the test medium selected from the group consisting of blood plasma, whole blood, water, lymph, colloidal solution, crystalloid solution or gel, and a proteolytic enzyme or its precursor distributed in the sample of the test medium, add a chromogenic substrate to the in vitro system, followed by release of the label upon cleavage of the substrate with a proteolytic enzyme,
  • the problem can also be solved by creating a third version of the method for determining the spatio-temporal distribution of proteolytic enzyme activity, in which:
  • test medium selected from the group consisting of blood plasma, whole blood, water, lymph, colloidal solution, crystalloid solution or gel, and a proteolytic enzyme or its precursor distributed in the sample of the test medium,
  • the spatio-temporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme by solving the inverse problem of the type “reaction - diffusion - convection” taking into account the degree of label binding in the sample of the studied medium with the components of the medium.
  • tissue factor immobilized on the surface an agent selected from the group consisting of tissue factor immobilized on the surface, soluble tissue factor, tissue plasminogen activator, cells enabling expression of tissue factor, tissue samples of the body, glass or plastic is used.
  • a ' also in that it additionally illuminate the sample investigated medium at a predetermined timing and spatial characteristics of the recorded test sample selected from the group consisting of the spatial distribution of scattered light, the spatial distribution of transmittance in the sample or a combination thereof,
  • the substrate is added as a solution to a sample of the test medium.
  • the substrate is applied in a lyophilized form on the walls of the in vitro system until a sample of the test medium is placed in it.
  • whole blood or plasma as a sample, selected from the group consisting of platelet-rich plasma, platelet-free plasma and platelet-poor plasma.
  • the studied proteolytic enzyme can be formed in the studied medium from its predecessor as a result of biochemical processes, and can also gradually be destroyed in the studied medium as a result of biochemical processes in the medium.
  • the spatial distribution of the label and the resulting clot is visualized, preferably at given times.
  • Light scattering from a medium sample is recorded, preferably by the dark field method.
  • Label radiation is recorded, preferably by fluorescence microscopy.
  • the distribution of light scattering and label radiation in a medium sample is also recorded by means of confocal microscopy, which provides refocusing of the optical system and the illumination / irradiation system at given times.
  • the problem is also solved by creating a device for determining the spatio-temporal distribution of the activity of a proteolytic enzyme in a heterogeneous system, containing:
  • an in vitro system which includes a cuvette for placing a sample of the test medium selected from the group consisting of blood plasma, whole blood, water, lymph, colloidal solution, crystalloid solution or gel, distributed in the sample of the test medium of the proteolytic enzyme or its predecessor, and fluorogenic or chromogenic or luminescent substrate,
  • a means of controlling lighting and recording means contains an activating means for placing and introducing a process activator into the cuvette, which initiates changes in the spatio-temporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme.
  • the means of control of the lighting and registration means is configured to control the on / off time, the intensity of the lighting and synchronize the operation of the lighting and registration between them.
  • computing means configured to calculate the spatial distribution of the activity of the proteolytic enzyme over time, or includes said computing means.
  • the problem was also solved by creating a method for diagnosing disorders of the hemostasis system by recording the spatiotemporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme (coagulation factor) in an in vitro heterogeneous system, namely, that use as a test sample blood components selected from the group: whole blood, platelet-free blood plasma, platelet-poor blood plasma, platelet-rich blood plasma, blood with the addition of an anticoagulant, blood plasma with the addition of an anticoagulant, provide conditions for the formation of a proteolytic enzyme in the studied the sample and observing it through at least one operation selected from the group: bringing the test sample into contact with the immobilized Nost activator of blood coagulation; the addition of a substrate cleaved by the studied proteolytic enzyme; the addition of calcium salt; the addition of a coagulation contact activation inhibitor,
  • the studied sample is illuminated and the spatial distribution of light scattering from the formed fibrin clot in the medium is recorded by the dark field method.
  • a proteolytic enzyme selected from the group is studied: thrombin, factor Xa, factor Vila, factor 1Xa, factor Xlla, factor Xlla, factor X1a, plasmin.
  • At least one parameter of the spatiotemporal distribution of thrombin or fibrin is used to assess the condition of the coagulation system in the sample and to make a diagnosis, selected from the group: the spatial velocity of the thrombin wave, the maximum concentration of thrombin in the sample, the maximum concentration thrombin in the moving part of the wave, the rate of increase in the concentration of thrombin, the integral of the concentration of thrombin in space, the integral of the concentration of thrombin in time and space count, speed, spatial distribution of the front fibrin (light scattering), the maximum concentration of fibrin (the quantity of light scattering) in the sample.
  • the proposed method allows you to simulate in vitro systems that are close in their physiological properties to in vivo systems, as well as more accurate diagnosis of disorders in the blood coagulation system.
  • the resulting spatio-temporal data array i.e. spatio-temporal distribution of proteolytic enzyme activity, is used to calculate at each point the rate of change of proteolytic enzyme activity in space and in time, according to which
  • the proposed method allows you to reliably diagnose hypercoagulant conditions in the early stages, when all other tests do not feel them. For the first time in medical practice, this makes it possible to identify with a high degree of accuracy the tendency of patients to a wide range of pathologies, including hypercoagulable syndrome of various etiologies, hemorrhages, thromboses, heart attacks and strokes, to study the pathogenesis of diseases, to monitor classical drugs and new generation drugs, including shunting antihemophilic drugs .
  • the proposed device allows to implement the claimed method and to provide a more accurate determination of the spatio-temporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme in a heterogeneous system.
  • FIG. 1 schematically shows a spatial concept for the regulation of blood coagulation
  • FIG. 2 is a diagram of a prior art device for determining the spatial dynamics of coagulation factors
  • FIG. Figure 3 shows typical dependences of the AMS concentration on distance and on time obtained by studying the spatiotemporal distribution of coagulation factor X1a; coagulation activator is located at the origin; in FIG. 4 shows a diagram of a device for determining the spatio-temporal distribution of activity a proteolytic enzyme in a heterogeneous system according to the invention;
  • FIG. 5a-b show a visualization of the spatial dynamics of formation of a fibrin clot (a) and fluorophore (b), according to the invention
  • FIG. ba-b shows an example of the spatiotemporal dynamics of the formation of a fibrin clot (a) and the concentration of the proteolytic enzyme (thrombin) (b) in an in vitro system obtained using the device according to the invention; the coagulation activator is located at the origin.
  • a method for determining the spatio-temporal distribution of the activity of a proteolytic enzyme in a heterogeneous system which is carried out as follows.
  • test medium selected from the group consisting of blood plasma, whole blood, water, lymph,. a colloidal solution, crystalloid solution or gel, and a proteolytic enzyme or its precursor distributed in a sample of the test medium.
  • the fluorogenic substrate is immersed in an in vitro system.
  • the substrate is cleaved with the separation of the fluorophore label from it.
  • the sample of the medium under study is illuminated with exciting radiation at specified times to excite the label fluorescence signal, and at the given times, the spatial distribution of the label fluorescence signal in the sample is recorded.
  • the spatiotemporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme is obtained by solving the inverse problem of the reaction – diffusion – convection type, taking into account the degree of label binding to the components of the medium under study.
  • the lighting wavelength is selected in accordance with the excitation spectrum of the label (fluorophore).
  • the illumination wavelength is selected so as to provide the maximum signal to noise ratio, in particular, in the study of the signal-clotting system of fibrin clot light scattering, noise, light scattering of plasma and other elements of the in vitro system.
  • an activating agent can be added to the in vitro system, which will cause a change in the spatiotemporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme.
  • an agent selected from the group consisting of tissue factor immobilized on a carrier surface, a soluble tissue factor, tissue plasminogen activator, cells enabling the expression of tissue factor, tissue samples of the body, glass or plastic is used.
  • a possible embodiment of the invention is when the studied proteolytic enzyme is formed directly in the test medium from its predecessor as a result of biochemical processes.
  • a variant is also possible in which the proteolytic enzyme under study is gradually destroyed in the test medium as a result of biochemical processes occurring in the medium. 2Q
  • the spatial distribution of light scattering and label radiation in the sample can be recorded by means of confocal microscopy, which provides refocusing of the optical system and the lighting / irradiation system at specified times or by fluorescence microscopy.
  • Light scattering from a medium sample is recorded by the dark field method.
  • the second embodiment differs from the first embodiment in that a chromogenic substrate is used as a substrate.
  • the substrate When the proteolytic enzyme interacts with a chromogenic substrate, the substrate is cleaved with the separation of the label — the chromophore.
  • the system is illuminated with light with the wavelength at which it occurs - significant absorption of radiation by the chromophore.
  • a change in the spatial distribution of the color of the medium under study is recorded.
  • the spatial distribution of the color in the sample determines the spatial distribution of the chromophore in the sample.
  • the spatiotemporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme is obtained by solving the inverse problem of the type “reaction - diffusion - convection” taking into account the binding of the chromophore in the medium with the components of the medium.
  • a sample of the medium under study is illuminated and the optical characteristics of the sample under study selected from the group consisting of the spatial distribution of light scattering, the spatial distribution of light transmission in the sample, or a combination thereof are recorded with a camera.
  • the third variant of the method differs from the first embodiment in that a substrate is used as a substrate, which when reacted with a proteolytic enzyme breaks down to form a product having chemiluminescence. At given times, the spatial distribution of the luminescence intensity in the sample is recorded. From this distribution, the spatiotemporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme is obtained by solving the inverse problem of the type “reaction - convection diffusion” taking into account the binding of the phosphor in the medium.
  • a sample of the medium under study is illuminated and the optical characteristics of the sample under study selected from the group consisting of the spatial distribution of light scattering, the spatial distribution of light transmission in the sample, or a combination thereof are recorded with a camera.
  • the same temperature is maintained throughout the volume of the in vitro system, preferably 37 ° C, for which the system is thermostatic.
  • the pressure in the system is maintained in vitro, preferably increased relative to atmospheric pressure.
  • a stable pH of the test sample preferably with a range of 7.2 - 7.4.
  • the substrate is added to the sample of the test medium in the form of a solution or to apply the substrate in a lyophilized form on the walls of the in vitro system before placing the sample of the test medium.
  • Lighting and registration of changes in the label signal is carried out with a frequency of from 1 to 1800 times per minute. Moreover, lighting is carried out after establishing a stable temperature in the sample.
  • a mixture is prepared consisting of a test sample, contact phase inhibitor, calcium chloride, substrate specific for the coagulation factor under study.
  • the sample used is whole blood or plasma selected from the group consisting of platelet-rich plasma, platelet-free plasma and platelet-poor plasma.
  • thrombin is determined as a coagulation factor.
  • the invention also provides a method for diagnosing disorders of the hemostasis system by recording the spatiotemporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme (coagulation factor) in an in vitro heterogeneous system, which consists in using blood components selected from the group: whole blood free from platelets as a sample blood plasma, platelet-poor plasma, platelet-rich blood plasma, blood with the addition of an anticoagulant, blood plasma with the addition of an anticoagulant.
  • coagulation factor coagulation factor
  • the spatial distribution of the signal of the label to be detached from the substrate in the sample is recorded at predetermined points in time.
  • Labels are obtained from the set of spatial distributions of the signal for given instants of time spatially the temporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme (coagulation factor) by solving the inverse problem of the type “reaction - diffusion - convection” taking into account the degree of label binding with the components of the medium under study, based on it I calculate the spatio-temporal distribution of the concentration of coagulation factor over time.
  • test sample is illuminated, and the spatial distribution of light scattering from the resulting fibrin clot in the medium sample is recorded to visualize the resulting fibrin clot.
  • a proteolytic enzyme selected from the group is studied: thrombin, factor Xa, factor Vila, factor 1Xa, factor Xlla, factor X1a, plasmin.
  • At least one parameter of the spatiotemporal distribution of thrombin or fibrin is used to assess the state of the coagulation system in the sample and to make a diagnosis, selected from the group: the spatial velocity of the thrombin wave, the maximum concentration of thrombin in the sample, the maximum concentration of thrombin in the moving part of the wave, the rate of increase in thrombin concentration, the integral of thrombin concentration in space, the integral of thrombin concentration in time and space, the velocity of the spatial distribution of the fibrin front (light scattering), the maximum concentration of fibrin (light scattering value) in the sample.
  • a device that contains an in vitro system that includes a cell 20 (Fig. 4) for placing sample 21 of the test medium selected from the group consisting of blood plasma, whole blood, water, lymph, colloidal solution, crystalloid solution or gel, and a proteolytic enzyme or its precursor distributed in the sample of the test medium.
  • the cell 20 has certain geometric dimensions and shape, which is based on a rectangle.
  • the cuvette is made of plastic.
  • the thickness of the sample layer should be minimal. To increase the signal level - maximum.
  • the optimum thickness is in the range of 0.1-1.5 mm.
  • the device also contains means 22, intended for placement and insertion into the cuvette of the process activator 23, which initiates changes in the spatiotemporal distribution of the activity of the proteolytic enzyme.
  • the device is also equipped with means 24 for ensuring the same temperature in the in vitro system.
  • the device allows you to provide various types of temperature control, including water temperature control and air temperature control, and gel can also be used for temperature control, but it should be borne in mind that the medium must be transparent to radiation.
  • thermostating is water. During thermostating, the temperature is maintained within the range of 25 - 45 ° ⁇ with an accuracy of 1 ° ⁇ .
  • the device is also equipped with a means (not shown) for maintaining pressure in the in vitro system, the specified tool is designed to maintain constant air pressure in the space surrounding the sample medium (together with means 24 to maintain the same temperature, they form thermostatic and pressure unit 25).
  • the specified tool supports excess atmospheric pressure from 0.2 to 0.5 atmospheres, which prevents the formation of gas bubbles in the test sample.
  • Education bubbles is associated with a decrease in the solubility of the dissolved gases contained in the sample. Usually this phenomenon is associated with the heating of the sample. Bubbles lead to local distortions both from the point of view of increasing the non-physiological nature of the environment, i.e. avoiding simulated conditions, and in terms of calculating the distribution of enzymes.
  • the device comprises means 26 for illuminating the sample 21 of the test medium at specified times with exciting radiation to excite the fluorescence label when a fluorogenic substrate is added to the sample or by light with a wavelength of significant label absorption if a chromogenic substrate is added to the sample.
  • the means 26 provides a radiation supply perpendicular to the wall of the cell 20 through the window in the thermostat 24.
  • sources of UV radiation for example, LEDs of the UV spectrum, are used.
  • the device also includes a means 27 for illuminating a sample of the test medium with visible radiation, which provides radiation at an angle to the wall of the cell 20 and a mirror 28, directing the radiation to the recording unit 32, as well as an excitation filter 29 and an emission filter 30, which provide the label fluorescence signal , while the radiation of the lighting means should not cause local heating of the sample.
  • a means 27 for illuminating a sample of the test medium with visible radiation which provides radiation at an angle to the wall of the cell 20 and a mirror 28, directing the radiation to the recording unit 32, as well as an excitation filter 29 and an emission filter 30, which provide the label fluorescence signal , while the radiation of the lighting means should not cause local heating of the sample.
  • the combination of means from 26 to 30 forms a lighting unit 31.
  • the device also includes a unit 32 for recording the spatial distribution of the fluorescence signal of the label / light scattering (or absorption by the tag-chromophore) in the sample of the studied medium and at specified times.
  • the registration unit 32 contains means for acquiring images from different depths of the sample, containing an optical system 33 for focusing the optics and aperture (not shown). The intensity of the glow depends on the concentration of the label, in turn, determined by the activity of the studied proteolytic enzyme. Radiation from the label passes perpendicular to the wall of the cell 20 through the mirror 28, transparent for this emission spectrum, and through the optical system 33 enters the registration means 34, which may be a digital camera.
  • the device comprises means for controlling irradiation / lighting means, made in the form of a processor (not shown), providing control of the on / off time, intensity and duration of irradiation / lighting, and synchronization of the functioning of irradiation / lighting means and recording means (not shown).
  • a computing tool (not shown) provides a calculation of the spatial distribution of proteolytic enzyme activity over time.
  • the means of visualization of the forming / decaying clot by the dark field method and the means of visualizing the spatial image of the formation / destruction of the substrate label are also connected to the control means
  • phosphatidylserine and phosphatidylcholine 7-amino-4-methylcoumarin (AMS); ⁇ -Gli-Gli-Arg-AMS; an Xlla factor inhibitor, for example, CTI, or any other suitable inhibitor; glycoprotein antagonist Ilb-IIIa.
  • Normal plasma samples were obtained from freshly collected human blood from healthy donors. Blood was collected in 3.8% sodium citrate (pH 5.5) in a 9: 1 ratio by volume. Blood was centrifuged for 15 min at 1600 g, and then the supernatant was further centrifuged for 5 min at 10 000 g to obtain plasma without platelets, the supernatant was then frozen and stored at a temperature of -70 ° C. Before each test, the samples were thawed in a water bath.
  • the blood was centrifuged at 100 g for 8 minutes.
  • the platelet concentration was adjusted to 250,000 cells / ⁇ l by plasma dilution without platelets.
  • 28 m Hepes pH 7.4 was added to the plasma.
  • coagulation was activated using an activator in the form of a monolayer of tissue factor (TF) immobilized on a plastic surface.
  • Activators were stored at temperatures from +4 to + 8 ° C.
  • the plasma prepared as indicated above was supplemented with an inhibitor, for example, a trypsin inhibitor from maize (0.2 mg / ml), 10 ⁇ M lipid vesicles (phosphatidylserine / phosphatidylcholine, in a molar ratio of 20/80).
  • Z-Gly-Gli-Arg-AMS substrate 800 ⁇ M was added to monitor thrombin formation.
  • the prepared sample was incubated for 10 min at 37 ° C, and then supplemented with a Ca salt, in particular CaCl1 (20 mM).
  • the test sample was placed in an experimental cuvette and clot formation was initiated by an activator with a surface covered with tissue factor by bringing it into contact with a prepared plasma sample.
  • Tests were carried out using a specially developed video microscopy system, which allowed observing spatial distribution or growth of a fibrin clot and proteolytic enzyme, in particular, thrombin, simultaneously.
  • the temperature in the chamber was maintained at 37 ° C and illumination was carried out using red (625 nm) and ultraviolet (365 nm) LEDs. Clot growth was detected by light scattering of the sample under illumination.
  • red light (Fig. 5, a)
  • the AMS fluorescence signal (Fig. 5, b) was excited by ultraviolet LEDs.
  • a multi-band emission filter was used to separate red light scattering, AMS radiation, and excitation radiation.
  • the fluorescence and scattering of red light passing through the optical system were detected by a digital CCD camera. Images in red and blue light were obtained sequentially, usually from one to four times per minute. To eliminate AMS burnout, the LEDs were synchronized with the camera and they were turned on only for the duration of the exposure, i.e. about 0.5 sec.
  • Sample preparation was performed as described above, except that instead of platelet-free plasma, platelet-rich plasma was used. After recalcification, the plasma was preheated to 42 ° C for 2 min. An agarose solution was added and the mixture was incubated in an experimental cuvette for 3 min to form a gel. Then the test was carried out as described above.
  • the clot growth rate was calculated from the motion of the half-maximum intensity point on the light scattering profiles.
  • the initial growth rate was determined as the slope of the linearized section of the diagram of the dependence of the clot size on time in the first 10 min of clot growth. Stationary. the speed is calculated in the same way, after 40 minutes of clot growth, when the clot boundary is so far from the activator that its effect on the clot growth becomes insignificant.
  • AMS fluorescence intensity profiles are converted to its concentration profiles by calibration.
  • the intensity calibration profile was calculated in the framework of a uniform distribution with a known concentration of AMS in the same plasma.
  • AMC concentration at each point (C ⁇ ) was calculated as follows:
  • Ii is the fluorescence intensity
  • I ca i ' is the fluorescence intensity with a known concentration of AMS, all at the same point in the frame
  • C ca i is the calibration concentration of AMS.
  • the thrombin concentration (Fig. B, b) was calculated by the one-dimensional distribution of AMS by solving the inverse problem for the following reaction-diffusion equation.
  • the AMS diffusion coefficient was measured experimentally by fitting the measured diffusion profiles to theoretical ones.
  • Distortion of the AMS signal occurs due to the excitation of light scattering on a fibrin clot.
  • the fluorescence intensity increases inside the clot. This increase is proportional to the AMS concentration and density of the clot. To overcome this and calculate the actual concentration of AMS, the following formula was used.
  • AMSrb AMS g + (k ⁇ + k 2 - LMS ea1 -—

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к медицине и биологии, и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей для определения характеристик системы свертывания крови и ее компонентов. Задачей настоящего изобретения является исследование пространственной динамики факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка и оценка роли факторов свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе, что позволяет диагностировать отдельные заболевания и оценивать активность препаратов, влияющих на параметры свертывания крови. Поставленная задача решена путем создания способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, в котором обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце протеолитический фермент или его предшественник, добавляют в систему in vitro флуорогенный. субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени для возбуждения сигнала флуоресценции метки, регистрируют одновременно с освещением в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце, получают из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресцентной метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды. В качестве субстрата может быть добавлен хромогенный или люминесцентный субстраты. Предложено также устройство для реализации указанного способа.

Description

СПОСОБ - ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОГО
РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА В ГЕТЕРОГЕННОЙ СИСТЕМЕ (ВАРИАНТЫ) , УСТРОЙСТВО ДЛЯ РЕАЛИЗАЦИИ УКАЗАННОГО СПОСОБА И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА ПО ИЗМЕНЕНИЮ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОГО
РАСПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА В ГЕТЕРОГЕННОЙ СИСТЕМЕ
Область техники
Настоящее изобретение относится к медицине и биологии, и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей для определения характеристик системы свертывания крови и ее компонентов, а также в биотехнологии, фармакологии и в фундаментальных биологических исследованиях.
Предшествующий уровень техники
В настоящее время существует большая проблема исследования динамики сложных биологических систем и происходящих в них процессов, где есть пространственная неоднородность. К таким процессам относятся, в частности, процессы свертывания крови, комплемент, апоптоз, пищеварение, фибринолиз, где ключевую роль играют протеолитические ферменты (протеиназы) .
Можно измерить концентрацию таки протеолитических ферментов, если эта величина неизменна во времени и одинакова во всех точках исследуемого образца, с помощью специфического флуорогенного субстрата или хромогенного субстрата. В настоящее время появились способы измерения изменения концентрации во времени, которые используются как для фундаментальных исследований, так и для диагностики нарушений, в функционировании соответствующих биологических систем. Для определения нарушения свертывания крови сейчас используется тест генерации тромбина в плазме, раскрытый в основополагающей работе Hemker Н.С, Wielders S., Kessels H., Beguin S. Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential. J Thromb Haemost. 1993, Oct. 18 ; 70 ( 4 ) : 617-24. Он продемонстрировал много преимуществ по сравнению с традиционными тестами свертывания, но является пространственно однородным, т.е. исследуется гомогенная среда. Это не соответствует ситуации в организме, описанной ниже .
На фиг. 1 схематически представлена пространственная концепция регуляции свертывания крови. Свертывание активируется клетками, экспрессирующими трансмембранный белок тканевый фактор, неферментный кофактор, являющийся фактором свертывания (слева) , и распространяется вглубь плазмы. Генерация тромбина регулируется активированным фактором X (фактором Ха, сериновой протеиназой) - лимитирующим компонентом протромбиназы. Свертывание около активатора (фаза инициации) определяется исключительно производством фактора Ха внешней теназой - комплексом тканевого фактора и сериновой протеиназы фактора Vila. Однако фактор Ха быстро ингибируется и не может диффундировать далеко от активатора. Поэтому в фазе распространения сгустка он образуется внутренней теназой. Лимитирующий компонент внутренней теназы, фактор свертывания 1Ха, производится внешней теназой. В отличие от фактора Ха, он ингибируется медленно и поэтому диффундирует далеко. При дальнейшем увеличении сгустка дополнительный фактор 1Ха производится фактором Х1а, который в свою очередь производится тромбином в петле положительной обратной связи. Формирование сгустка останавливается вследствие действия тромбомодулина : петля отрицательной обратной связи активирует протеин С, который останавливает распространение тромбина, разрушая факторы Va и Villa (см. Panteleev MA, Ovanesov MV, Kireev DA, Shibeko AM, Sinauridze EI, Ananyeva NM, Butylin AA, Saenko EL, Ataullakhanov FI . Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein С pathways, respectively. Biophys J. 2006 Mar 1;90(5) : 1489-500.) . Несмотря на то, что отдельные детали этой концепции могут уточняться, ключевая роль процессов диффузии и пространственной неоднородности в свертывании не вызывает сомнений (Hoffman M, Monroe DM 3rd. A cell-based model of hemostasis. Thromb Haemost. 2001 Jun; 85 ( 6) : 958-65 ) .
Тромбин - главный фермент системы свертывания крови. Он катализирует основную реакцию - превращение фибриногена в фибрин. Кроме того, именно тромбин активирует факторы свертывания V, VIII, VII, XI, XIII, протеин С, тромбоциты, тромбин-активируемый ингибитор фибринолиза . Тромбина при свертывании образуется в 10 - 100 раз больше, чем остальных протеиназ, что облегчает его определение.
В реакции, катализируемой тромбином, фибриноген превращается в фибрин, который полимеризуется и тем самым желирует плазму крови.
Исследования свертывания крови представляют большой практический интерес, поскольку не только позволяют диагностировать отдельные заболевания, но и оценивать активность препаратов, влияющих на параметры свертывания крови.
Появление хромогенных, а затем и флуорогенных субстратов позволило ускорить изучение свертывания крови. Такой синтетический субстрат представляет собой молекулу, которая распознается и разрезается протеолитическим ферментом. Разрез ведет к отщеплению от субстрата сигнальной молекулы, также называемой меткой. Метка либо меняет оптическую плотность раствора (хромогенный или окрашивающий субстрат) , либо способна флуоресцировать при освещении ( флуорогенный субстрат), либо способна спонтанно испускать свет без внешнего возбуждения (хемилюминесцирующая метка) . Субстраты для тромбина можно добавлять непосредственно в плазму и записывать сигнал (оптическую плотность или интенсивность света), получающийся при свертывании. Скорость увеличения сигнала -пропорциональна концентрации тромбина. Зависимость тромбина от времени получается из экспериментальной зависимости сигнала от времени путем простого дифференцирования и вычисления концентрации тромбина из скорости расщепления субстрата с помощью калибровочной кривой, полученной путем добавления в буфер или исследуемую плазму известных концентраций тромбина или иного калибратора (например, комплекса тромбина и альфа2-макроглобулина ) .
Из уровня техники известны различные способы и устройства для определения параметров свертывания крови in vitro. Однако известные способы и устройства предназначены для работы, как правило, с гомогенными системами, в которых образец крови или плазмы равномерно перемешан с активатором, что существенно отличает данные системы от системы in vivo, являющейся сложной гетерогенной средой.
В существующих модельных системах in vitro условия протекания процесса свертывания принципиально отличаются - от тех условий, в которых сгусток образуется в живом организме. Известно, что в кровеносной системе человека и животных сгусток образуется не во всем объеме плазмы крови, а строго локально, т.е. в небольшой области повреждения стенки кровеносного сосуда. Свертывание в организме протекает неоднородно. Формирование сгустка происходит в пространстве. Оно запускается внешней теназой на поврежденной стенке сосуда, распространяется с участием протромбиназы на активированных тромбоцитах в объеме плазмы и тормозится реакциями с участием тромбомодулина на здоровом эндотелии. При этом факторы свертывания закономерным образом распределяются в небольшом объеме плазмы, и в нем образуется тромб. Это отражает основные защитные механизмы' системы гемостаза - поддержание целостности кровеносного русла за счет образования тромба в месте повреждения. Адекватно изучить эти процессы с помощью способов, проводимых в гомогенной среде, невозможно.
Таким образом, в настоящее время существует проблема экспериментального моделирования свертывания крови in vitro, в которой желательно наиболее полно смоделировать ту пространственную ситуацию, в которой кровь свертывается непосредственно в кровеносном сосуде. Она существует как для фундаментальных исследований тромбоза и гемостаза, так и для прикладных диагностических и фармакологических задач.
Задача определения изменения концентрации протеолитических ферментов во времени и пространстве, т.е. в различных точках в объеме исследуемого образца, до сих пор не решена .
В последнее время стали использоваться приборы, позволяющие учитывать пространственную неоднородность свертывания. В этих приборах свертывание происходит в кювете, содержащей рекальцифицированную плазму. В качестве активатора используется поверхность с иммобилизованным активатором свертывания, например, тканевым фактором. При контакте с плазмой начинается свертывание, которое затем распространяется вглубь плазмы и которое можно наблюдать по светорассеянию от растущего сгустка.
Из уровня техники известно устройство для исследования характеристик свертываемости крови и ее компонентов (патент RU 2395812, кл . G01N33/49, опубл. 27.07.2010), содержащее термостатируемую камеру, в которую помещена кювета с исследуемым образцом плазмы и активатором свертывания, в качестве которого используется тромбопластин (тканевый фактор свертывания) , нанесенный на вставку, которую вставляют в кювету, светодиоды для освещения содержимого кюветы и - образующегося у активатора сгустка, цифровую камеру, фиксирующую растущий сгусток, при этом устройство соединено с компьютером для обработки полученных данных.
Указанное устройство позволяет реализовать способ, в котором регистрируется только процесс образования фибринового сгустка, являющегося конечным продуктом работы системы свертывания .
Известны также способ и устройство для мониторинга пространственного образования фибринового сгустка
(международная заявка РСТ/СН2007/000543, кл . G01N33/49, опубл. 07.05.2009, номер публикации WO 2009/055940). Устройство включает кювету, предназначенную для фотометрического анализа, вставку и активатор, термостат, в котором размещается указанная кювета. Активатор свертывания нанесен на нижнюю грань вставки. Активатор свертывания является физиологическим активатором, например, тканевым фактором, или нефизиологическим активатором, например, стеклом. Кювета выполнена из пропускающего свет полистирола.
Известное устройство позволяет осуществлять способ мониторинга образования и/или лизирования фибринового сгустка in vitro, который содержит следующие шаги:
помещают в кювету один или более образцов плазмы крови в соответствии с количеством лунок,
вводят в кювету вставку с активатором и обеспечивают соприкосновение плазмы с активатором свертывания (при образовании сгустка) ; и
регистрируют рост фибринового сгустка как функцию времени и расстояния, или
помещают в кювету один или более образцов плазмы крови, содержащих один или более фибриновых сгустков;
обеспечивают соприкосновение плазмы с активатором фибринолиза (при лизировании сгустка) ; и
регистрируют лизис фибринового сгустка как функцию времени и расстояния.
Принципиальное преимущество указанного способа и устройства для мониторинга пространственного образования фибринового сгустка состоит в малом объеме требуемой плазмы. С таким небольшим количеством, как 20 мкл (вместо от 300 до 1500 мкл, т.е. в 75 раз меньше, чем в других похожих системах и в 5 раз меньше, чем минимальное количество плазмы, требуемой для стандартных тестов, свертывания) , могут быть получены достоверные результаты высокого разрешения. Указанное устройство позволяет реализовать способ, в котором регистрируется только процесс образования фибринового сгустка, являющегося конечным продуктом работы системы свертывания. Недостатками названных выше устройства и способа можно назвать образование при нагреве исследуемых образцов пузырьков газа в кювете в области регистрации, которые искажают сигнал светорассеяния от фибринового сгустка.
А наличие источников освещения только одной длины волны, например, красного света, не позволяет исследовать пространственно-временное распределение флуоресцентных веществ .
Кроме того, описанные способ и устройство не обеспечивают возможность регистрации процесса образования и пространственного распределения отдельных факторов свертывания, таких как На, Ха, Vila, XIa, которые регулируют процесс пространственного роста фибринового сгустка.
Наиболее близким аналогом к заявленному способу и устройству можно рассматривать устройство и способ, раскрытые в статье Кондратовича А.Ю., Похилко А. В. и Атауллаханова Ф.И. «Пространственно-временная динамика факторов контактной активации свертывания крови», 2002 год (Kondratovich AY, Pokhilko AV, Ataullakhanov FI . Spatiotemporal dynamics of contact activation factors of blood coagulation. Biochim Biophys Acta. 2002 Jan 15 ; 1569 ( 1-3 ) : 86-104. ) .
Для реализации упомянутого способа используют бедную тромбоцитами плазму. Определение распределения фактора XIa и калликреина исследуемого образца плазмы осуществляют, регистрируя излучение в синей области спектра 7-амино-4- метилкумарина (АМС) , образующегося в результате расщепления флуорогенных субстратов, специфичных для данных факторов.
Предварительно к каждому исследуемому образцу плазмы добавлялся субстрат и образец перемешивался при 37 °С, рН среды поддерживался равным 7,4 при указанной температуре.
На фиг .2 схематично показано устройство, используемое для реализации способа. Устройство содержит емкость 1, изготовленную из полистирола, содержащую исследуемый образец плазмы крови 2. К плазме 2 добавляли субстрат. Конец 5 стеклянной капиллярной трубки служил активатором свертывания. Устройство содержит также источник освещения б, представляющий собой ртутную лампу, термостат 7, стеклянный фильтр 8, полупрозрачное зеркало 9, цифровую камеру 10, флуоресцентную пластиковую наклейку 12, устройство подключали к компьютеру 11.
Активация факторов свертывания изучалось в двумерной (плоской) среде, т.е. в тонком слое неперемешанной плазмы. Емкость 1 помещали в термостат 7 при температуре 37 °С, и быстро опускали в нее активатор, чтобы конец 5 трубки погрузился в плазму.
Фактор свертывания, активируемый контактом со стеклом, расщеплял субстрат, что приводило к образованию АМС . Флуоресценцию АМС записывали следующим образом. Образец плазмы освещали излучением источника освещения б, отраженным от полупрозрачного зеркала 9. Фильтры 8 блокировали видимую часть спектра. Флуоресценция АМС записывалась цифровой камерой 10, установленной позади полупрозрачного зеркала. Записанное поле обзора составило 9x6,5 мм. Синий канал RGB выходного сигнала камеры охватывал весь диапазон флуоресценции АМС. Данные, изображения непрерывно передавались в компьютер 11, и отображались на мониторе, а также сохранялись с заданными интервалами. Кусочек флуоресцирующего пластика 12 был закреплен под термостатом 7, чтобы его изображение было всегда в поле зрения камеры, оно использовалось для калибровок и учета колебаний в освещении.
При анализе изображений выбирали радиальный луч с началом в центре активатора. При помощи . специального программного обеспечения определялось пространственно- временное распределение концентрации АМС вдоль этого луча (фиг. 3), а на его основе восстанавливалось пространственно- временное распределение концентрации фактора свертывания.
К недостаткам указанного способа можно отнести возможность измерения только факторов контактной активации (а именно, факторов XIa, Xlla, калликреина) , с плохой возможностью различения между вкладами этих факторов в сигнал, без возможности измерения пространственной динамики процесса свертывания, т.е. образования фибринового сгустка.
К недостаткам устройства можно отнести: неудобство используемой емкости для высокопроизводительных исследований; использование нестабильного освещения с помощью ртутной лампы, не позволяющего производить точные измерения, образование пузырьков газа в области регистрации процесса при нагреве исследуемых образцов, которые искажают сигнал флуоресценции .
Известный способ не позволяет моделировать системы in vitro, приближенные по своим физиологическим свойствам к системам in vivo, а также проводить более точную диагностику нарушений в системе свертывания крови.
Кроме того, способ не позволяет полноценно исследовать пространственную динамику факторов свертывания, в первую очередь, тромбина, в процессе роста фибринового сгустка, и не обеспечивает возможность оценки роли фактора свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе .
Таким образом, для более качественного определения характеристик свертывания крови и ее компонентов имеется потребность в усовершенствовании имеющихся способов и приборов .
Краткое изложение существа изобретения
Задачей настоящего изобретения является исследование пространственной динамики факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка и оценка роли факторов свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе, что позволит диагностировать отдельные заболевания и оценить активность препаратов, влияющих на параметры свертывания крови.
Технический результат, который может быть получен при реализации заявляемого решения, заключается в повышении чувствительности способа к нарушениям как плазменного, так и тромбоцитарного звеньев свертывания крови. Поставленная задача решена путем создания способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, в котором:
обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце протеолитический фермент или его предшественник,
добавляют в систему in vitro флуорогенный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом,
освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени для возбуждения сигнала флуоресценции метки,
регистрируют одновременно с освещением в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце,
получают из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресцентной метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды.
Поставленная задача может быть также решена путем создания второго варианта способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента, в котором:
обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник, добавляют в систему in vitro хромогенный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом,
освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени светом с длиной волны его значительного поглощения меткой,
регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение поглощения света меткой в образце,
получают (определяют или рассчитывают) из совокупности пространственных распределений поглощения света меткой для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки в образце исследуемой среды с компонентами среды.
Поставленная задача может быть также решена путем, создания третьего варианта способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента, в котором:
обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник,
добавляют в систему in vitro люминисцентный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом,
регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала люминесценции метки в образце,
получают (определяют или рассчитывают) из совокупности пространственных распределений сигналов люминисценции метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки в образце исследуемой среды с компонентами среды.
Ά также тем, что в систему in vitro дополнительно помещают активирующий агент, который вызывает изменение в пространственно-временном распределении активности протеолитического фермента.
А также тем, что в качестве активирующего агента используют агент, выбранный из группы, состоящей из иммобилизованного на поверхности тканевого фактора, растворимого тканевого фактора, тканевого активатора плазминогена, клеток, обеспечивающих возможность экспрессии тканевого фактора, образцов тканей организма, стекла или пластика .
А ' также тем, что дополнительно освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени и регистрируют пространственные характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации,
А также тем, что субстрат добавляют в виде раствора в образец исследуемой среды.
А также тем, что субстрат наносят в лиофилизированной форме на стенки системы in vitro до размещения в ней образца исследуемой среды.
А также тем, что освещение и регистрацию изменения сигнала метки осуществляют с частотой от 1 до 1800 раз в минуту .
А также тем, что используют в качестве образца цельную кровь или плазму, выбранную из группы, состоящей из богатой тромбоцитами плазмы, свободной от тромбоцитов плазмы и бедной тромбоцитами плазмы.
А также тем, что обеспечивают стабильную температуру по всему объему исследуемого образца, предпочтительно 37 °С. А также тем, что обеспечивают стабильное давление по всему объему исследуемого образца, предпочтительно повышенное по отношению к атмосферному.
А также тем, что обеспечивают стабильный рН исследуемого образца, предпочтительно с диапазоном 7,2 - 7,4.
Исследуемый протеолитический фермент может образовываться в исследуемой , среде из своего предшественника в результате протекания биохимических процессов, а также может постепенно разрушаться в исследуемой среде в результате протекающих в среде биохимических процессов.
Визуализируют пространственное распределение метки и образовавшегося сгустка предпочтительно в заданные моменты времени .
Регистрируют светорассеяние от образца среды предпочтительно по методу темного поля.
Регистрируют излучение метки предпочтительно методом флуоресцентной микроскопии.
Регистрацию распределения светорассеяния и излучения метки в образце среды, в том числе, осуществляют посредством конфокальной микроскопии, обеспечивающей перефокусировку оптической системы и системы освещения/облучения в заданные моменты времени .
Поставленная задача решена также путем создания устройства определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, содержащего:
систему in vitro, которая включает кювету для размещения образца исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, распределенного в образце исследуемой среды протеолитического фермента или его предшественника, и флуорогенного, или хромогенного, или люминесцентного субстрата,
средство для освещения образца исследуемой среды в заданные моменты времени, средство регистрации пространственного распределения сигнала метки, образовавшейся при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, в заданные моменты времени,
средство управления средствами освещения и регистрации. А также тем, что оно содержит активирующее средство для размещения и ввода в кювету активатора процесса, обеспечивающего инициирование изменения пространственно- временного распределения активности протеолитического фермента .
А также тем, что оно содержит средство для обеспечения стабильной температуры в образце исследуемой среды, предпочтительно 3 °С.
А также тем, что оно содержит средство обеспечения стабильного давления по всему объему исследуемого образца, предпочтительно повышенного по отношению к атмосферному.
А также тем, что оно содержит средство для освещения образца исследуемой среды излучением видимого спектра по методу темного поля.
А также тем, что средство управления средствами освещения и регистрации выполнено с возможностью регулирования времени включения/выключения, интенсивности освещения и синхронизации работы средств освещения и регистрации между собой.
А также тем, что оно соединено с вычислительным средством, выполненным с возможностью осуществления расчета пространственного распределения активности протеолитического фермента во времени, или включает указанное вычислительное средство .
Поставленная задача решена также путем создания способа диагностики нарушений системы гемостаза посредством регистрации пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента (фактора свертывания) в гетерогенной системе in vitro, заключающегося в том, что используют в качестве исследуемого образца компоненты крови, выбранные из группы: цельная кровь, свободная от тромбоцитов плазма крови, бедная тромбоцитами плазма крови, богатая тромбоцитами плазма крови, кровь с добавлением антикоагулянта, плазма крови с добавлением антикоагулянта, обеспечивают условия для формирования протеолитического фермента в исследуемом образце и наблюдения за ним посредством совершения, по меньшей мере, одной операции, выбранной из группы: приведение исследуемого образца в контакт с иммобилизованным на поверхности активатором свертывания крови; добавление субстрата, расщепляемого исследуемым протеолитическим ферментом; добавление соли кальция; добавление ингибитора контактной активации свертывания,
регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала отщепляемой от субстрата метки в образце,
получают из совокупности пространственных распределений сигнала метки для заданных моментов времени пространственно- временное распределение активности протеолитического фермента (фактора свертывания) путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды,
оценивают состояние системы гемостаза по отклонению пространственно-временного распределения протеолитического фермента от нормального.
А также тем, что дополнительно в заданные моменты времени освещают исследуемый образец и регистрируют пространственное распределение светорассеяния от образовавшегося фибринового сгустка в образце среды методом темного поля.
А также тем, что в качестве фактора свертывания исследуют ' протеолитический фермент, выбранный из группы: тромбин, фактор Ха, фактор Vila, фактор 1Ха, фактор Xlla, фактор Х1а, плазмин. А также тем, что используют, по меньшей мере, один параметр пространственно-временного распределения тромбина или фибрина, для оценки состояния системы свертывания в образце и постановки диагноза, выбранный из группы: скорость пространственного распространения волны тромбина, максимальная концентрация тромбина в образце, максимальная концентрация тромбина в движущейся части волны, скорость увеличения концентрации тромбина, интеграл от концентрации тромбина по пространству, интеграл от концентрации тромбина по времени и по пространству, скорость пространственного распространения фронта фибрина (светорассеяния), максимальная концентрация фибрина (величина светорассеяния) в образце.
Предложенный способ позволяет моделировать системы in vitro, приближенные по своим физиологическим свойствам к системам in vivo, а также проводить более точную диагностику нарушений в системе свертывания крови.
Полученный в результате исследования пространственно- временной массив данных, т.е. пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента, используется для расчета в каждой точке скорости изменения активности протеолитического фермента в пространстве и во времени, по которому
судят о статусе состояния системы свертывания крови в образце ,
делают вывод о состоянии системы свертывания у пациента посредством сравнения со здоровыми донорами,
оценивают эффективность терапии,
подбирают оптимальную индивидуальную дозу лекарственного препарата,
определяют механизм действия лекарственного препарата, осуществляют скрининг " химических веществ в процессе разработки лекарственных препаратов,
получают информацию о механизме работы системы свертывания,
изучают патогенез и этиологию заболеваний системы крови, исследуют пространственную динамику факторов свертывания в процессе роста фибринового сгустка,
обеспечивают возможность оценки роли фактора свертывания в различных фазах процесса свертывания крови в гетерогенной системе .
Предложенный способ позволяет надежно диагностировать гиперкоагулянтные состояния на ранних стадиях, когда все прочие тесты их не чувствуют. Впервые в медицинской практике это дает возможность с высокой степенью точности выявлять склонность пациентов к широкому кругу патологий, включая гиперкоагуляционный синдром различной этиологии, геморрагии, тромбозы, инфаркты и инсульты, изучать патогенез заболеваний, осуществлять мониторинг классических препаратов и лекарств нового поколения, включая шунтирующие антигемофилические средства.
Предложенное устройство позволяет реализовать заявленный способ и обеспечить более точное определение пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе.
Краткое описание чертежей
В дальнейшем изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов воплощения со ссылками на сопровождающие чертежи, где:
на Фиг. 1 схематически представлена пространственная концепция регуляции свертывания крови;
на Фиг. 2 представлена схема известного из уровня техники устройства для определения пространственной динамики факторов свертывания;
на Фиг. 3 представлены типичные зависимости концентрации АМС от расстояния и от времени, получаемые при исследовании пространственно-временного распределения фактора свертывания Х1а; активатор свертывания расположен в начале координат; на Фиг. 4 представлена схема устройства для определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, согласно изобретению;
на Фиг. 5а-Ь представлена визуализация пространственной динамики образования фибринового сгустка (а) и флуорофора (Ь) , согласно изобретению;
на Фиг. ба-b представлен пример пространственно- временной динамики образования фибринового сгустка (а) и концентрации протеолитического фермента (тромбина) (Ь) в системе in vitro, полученный при помощи устройства, согласно изобретению; активатор свертывания расположен в начале координат .
Описание вариантов воплощения изобретения
Первый вариант выполнения способа.'
Согласно изобретению, предложен способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, который осуществляется следующим образом.
Используют систему in vitro, в которую помещают образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, . коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник. _^
Погружают в систему in vitro флуорогенный субстрат.
При взаимодействии протеолитического фермента с флуорогенным субстратом происходит расщепление субстрата с отделением от него метки - флуорофора.
Освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени возбуждающим излучением для возбуждения сигнала флуоресценции метки, в заданные моменты времени одновременно с освещением регистрируют пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце .
В дополнение к регистрации пространственного распределения сигнала метки в образце возможно в заданные моменты времени освещать образец исследуемой среды и регистрировать оптические характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации. Тем самым регистрировать пространственное распределение фибрина.
Из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресценции метки для заданных моментов времени получают пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды.
Длина волны освещения подбирается в соответствии со спектром возбуждения метки (флуорофора) . Длина волны освещения подбирается так, чтобы обеспечить максимальное отношение сигнал/шум, в частности, при исследовании системы свертывания сигнал - светорассеяние фибринового сгустка, шум светорассеяние плазмы и остальных элементов системы in vitro .
При проведении тестов в систему in vitro можно добавить активирующий агент, который вызовет изменение в пространственно-временном распределении активности протеолитического фермента. В качестве активирующего агента используют агент, выбранный из группы, состоящей из иммобилизованного на поверхности носителя тканевого фактора, растворимого тканевого фактора, тканевого активатора плазминогена, клеток, обеспечивающих возможность экспрессии тканевого фактора, образцов тканей организма, стекла или пластика.
Возможен вариант выполнения изобретения, когда исследуемый протеолитический фермент образуется непосредственно в исследуемой среде из своего предшественника в результате протекания биохимических процессов. Возможен также вариант, в котором исследуемый протеолитический фермент постепенно разрушается в исследуемой среде в результате протекающих в среде биохимических процессов. 2Q
Регистрацию пространственного распределения светорассеяния и излучения метки в образце возможно осуществлять посредством конфокальной микроскопии, обеспечивающей перефокусировку оптической системы и системы освещения/облучения в заданные моменты времени либо методом флуоресцентной микроскопии.
Далее визуализируют пространственное распределение метки и образовавшегося сгустка в заданные моменты времени.
Светорассеяние от образца среды регистрируют по методу темного поля.
Второй вариант выполнения способа
Второй вариант выполнения отличается от первого варианта тем, что в качестве субстрата используют хромогенный субстрат.
При взаимодействии протеолитического фермента с хромогенным субстратом происходит расщепление субстрата с отделением от него метки - хромофора. Система освещается светом с длиной волны, на которой происходит - значительное поглощение излучения хромофором. В заданные моменты времени регистрируют изменение пространственного распределения цвета исследуемой среды. По изменению пространственного распределения цвета в образце определяют пространственное распределение хромофора в образце . Из этого распределения хромофора получают пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом связывания хромофора в среде с компонентами среды.
В заданные моменты времени освещают образец исследуемой среды и регистрируют фотокамерой оптические характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации .
Третий вариант осуществления способа Третий вариант выполнения способа отличается от первого варианта тем, что в качестве субстрата используют субстрат, который при взаимодействии с протеолитическим ферментом расщепляется с образованием продукта, обладающего хемилюминесценцией . В заданные моменты времени регистрируют пространственное распределение интенсивности люминесценции в образце . Из этого распределения получают пространственно- временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия конвекция» с учетом связывания люминофора в среде.
В заданные моменты времени освещают образец исследуемой среды и регистрируют фотокамерой оптические характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в образце или их комбинации .
В каждом из вариантов осуществления способа обеспечивают одинаковую температуру по всему объему системы in vitro, предпочтительно 37 °С, для чего систему термостатирую . Для избежания появления пузырьков воздуха, выделяющихся из образца среды, поддерживают давление в системе in vitro, предпочтительно повышенное по отношению к атмосферному. Обеспечивают стабильный рН исследуемого образца, предпочтительно с диапазоном 7,2 - 7,4.
Возможно добавлять субстрат в образец исследуемой среды в виде раствора или наносить субстрат в лиофилизированной форме на стенки системы in vitro до размещения образца исследуемой среды.
Освещение и регистрацию изменения сигнала метки осуществляют с частотой от 1 до 1800 раз в минуту. Причем, освещение осуществляют после установления стабильной температуры в образце.
Для осуществления любого из вариантов указанного способа приготавливают смесь, состоящую из исследуемого образца, ингибитора контактной фазы, хлорида кальция, субстрата, специфичного к исследуемому фактору свертывания.
В качестве образца используют, в частности, цельную кровь либо плазму, выбранную из группы, состоящей из богатой тромбоцитами плазмы, свободной от тромбоцитов плазмы и бедной тромбоцитами плазмы.
В качестве фактора свертывания определяют, в частности, тромбин .
Согласно изобретению предложен также способ диагностики нарушений системы гемостаза посредством регистрации пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента (фактора свертывания) в гетерогенной системе in vitro, заключающийся в том, что в качестве образца используют компоненты крови, выбранные из группы: цельная кровь, свободная от тромбоцитов плазма крови, бедная тромбоцитами плазма крови, богатая тромбоцитами плазма крови, кровь с добавлением антикоагулянта, плазма крови с добавлением антикоагулянта.
Обеспечивают условия для формирования протеолитического фермента в исследуемом образце и наблюдения за ним посредством совершения, по меньшей мере, одной операции, выбранной из группы: приведение исследуемого образца в контакт с иммобилизованным на поверхности активатором свертывания крови; добавление субстрата, расщепляемого исследуемым протеолитическим ферментом; добавление соли кальция; добавление ингибитора контактной активации свертывания.
Регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала отщепляемой от субстрата метки в образце .
Поддерживают стабильную температуру образца с точностью до 1 градуса . в диапазоне температур 25-45°С. Стабилизируют рН образца до. диапазона 7,2 - 7,4.
Получают из совокупности пространственных распределений сигнала метки для заданных моментов времени пространственно- временное распределение активности протеолитического фермента (фактора свертывания) путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды, на его основе рассчитываю пространственно-временное распределение концентрации фактора свертывания во времени.
Оценивают состояние системы, гемостаза по отклонению пространственно-временного распределения протеолитического фермента от нормального.
Дополнительно в заданные моменты времени освещают исследуемый образец, и регистрируют пространственное распределение светорассеяния от образовавшегося фибринового сгустка в образце среды · для визуализации образовавшегося фибринового сгустка,.
В качестве фактора свертывания исследуется протеолитический фермент, выбранный из группы: тромбин, фактор Ха, фактор Vila, фактор 1Ха, фактор Xlla, фактор Х1а, плазмин .
Используют, по меньшей мере, один параметр пространственно-временного распределения тромбина или фибрина для оценки состояния системы свертывания в образце и постановки диагноза, выбранный из группы: скорость пространственного распространения волны тромбина, максимальная концентрация тромбина в образце, максимальная концентрация тромбина в движущейся части волны, скорость увеличения концентрации тромбина, интеграл от концентрации тромбина по пространству, интеграл от концентрации тромбина по времени и по пространству, скорость пространственного распространения фронта фибрина (светорассеяния), максимальная концентрация фибрина (величина светорассеяния) в образце.
Для реализации указанного способа (его вариантов выполнения) определения пространственно-временного распределения активности - протеолитического фермента в гетерогенной системе предлагается устройство, содержащее систему in vitro, которая включает кювету 20 (фиг. 4) для размещения образца 21 исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенного в образце исследуемой среды протеолитического фермента или его предшественника. Кювета 20 имеет определенные геометрические размеры и форму, в основе которой лежит прямоугольник. Кювета выполнена из пластика.
Для снижения конвективных потоков (чем тоньше слой, тем быстрее затухает движение жидкости) и обеспечения быстрого прогрева, толщина слоя образца должна быть минимальной. Для повышения уровня сигнала - максимальной. Оптимальная толщина лежит в пределах 0,1 -1,5 мм.
Устройство содержит также средство 22, предназначенное для размещения и ввода в кювету активатора 23 процесса, обеспечивающего инициирование изменения пространственно- временного распределения активности протеолитического фермента .
Устройство снабжено также средством 24 для обеспечения одинаковой температуры в системе in vitro. Устройство позволяет обеспечить различные виды термостатирования, включая водяное термостатирование и воздушное термостатирование , а также для термостатирования может использоваться гель, но при этом следует учитывать, что среда должна быть прозрачна для излучения. В описываемом варианте термостатирование - водяное. При термостатировании поддерживается температура в пределах 25 - 45°С с точностью в 1°С. Устройство снабжено также средством (не показано) поддержания давления в системе in vitro, указанное средство предназначено для поддержания постоянного воздушного давления в пространстве, окружающем исследуемый образец среды (совместно со средством 24 для поддержания одинаковой температуры они образуют блок 25 термостатирования и давления) . Указанное средство поддерживает избыточное атмосферное давление от 0,2 до 0,5 атм., что предотвращает образование пузырей газа в исследуемом образце. Образование пузырей связано с уменьшением растворимости содержащихся в образце растворенных газов. Обычно это явление связано с нагревом образца. Пузыри приводят к локальным искажениям как с точки зрения повышения нефизиологичности окружения, т.е. ухода от моделируемых условий, так и с точки зрения расчета распределения ферментов.
Устройство содержит средство 26 для освещения образца 21 исследуемой среды в заданные моменты времени возбуждающим излучением для возбуждения сигнала флуоресценции метки в случае добавления к образцу флуорогенного субстрата или светом с длиной волны его значительного поглощения меткой в случае добавления к образцу хромогенного субстрата. Средство 26 обеспечивает подачу излучения перпендикулярно стенке кюветы 20 через окно в термостате 24. В качестве средства 26 для освещения используют источники УФ излучения, например, светодиоды УФ спектра. Устройство также содержит средство 27 для освещения образца исследуемой среды излучением видимого спектра, которое обеспечивает подачу излучения под углом к стенке кюветы 20 и зеркало 28, направляющее излучение в блок регистрации 32, а также фильтр 29 возбуждения и фильтр 30 эмиссии, обеспечивающие выделение сигнала флуоресценции метки, при этом излучение средств освещения не должно вызывать локального нагрева образца. Совокупность средств с 26 по 30 образует блок 31 освещения.
' Устройство включает также блок 32 регистрации пространственного распределения сигнала флуоресценции метки/светорассеяния (или поглощения меткой-хромофором) в образце исследуемой среды и в заданные моменты времени. Блок 32 регистрации содержит средства получения изображения с различной глубины образца, содержащие оптическую систему 33 для фокусировки оптики и диафрагмы (не показаны) . Интенсивность свечения зависит от концентрации метки, в свою очередь, определяющейся активностью исследуемого протеолитического фермента. Излучение от метки проходит перпендикулярно стенке кюветы 20 через зеркало 28, прозрачное для этого спектра излучения, и через оптическую систему 33 попадает в средство регистрации 34, которое может представлять собой цифровую фотокамеру.
Устройство содержит средство управления средствами облучения/освещения, выполненное в виде процессора (не показан) , обеспечивающего управление временем включения/выключения, интенсивностью и длительностью облучения/освещения, и синхронизацией функционирования средств облучения/освещения и средств регистрации (не показано) .
Вычислительное средство (не показано) обеспечивает расчет пространственного распределения активности протеолитического фермента во времени.
К средству управления подключено также средство визуализации формирующегося/распадающегося сгустка методом темного поля и средство визуализации пространственного изображения образования/разрушения метки субстрата
(флуорофора/хромофора) (не показаны) .
Работа устройства и осуществление способа определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента - в гетерогенной системе рассматривается далее на неисчерпывающем примере осуществления .
Материалы
Для проведения исследования использовались следующие реагенты: фосфатидилсерин и фосфатидилхолин; 7-амино-4- метилкумарин (АМС) ; Ζ-Гли-Гли-Арг-АМС ; ингибитор фактора Xlla, например, КТИ, или любой другой подходящий ингибитор; антагонист гликопротеина Ilb-IIIa.
Сбор крови и приготовление плазмы
Образцы нормальной плазмы были получены из свежесобранной человеческой крови здоровых доноров. Кровь собирали в 3,8% цитрата натрия (рН 5,5) в соотношении 9:1 по объему. Кровь центрифугировали в течение 15 мин при 1600 g, а затем супернатант дополнительно центрифугировали в течение 5 мин при 10 ООО g для получения плазмы без тромбоцитов, супернатант затем был заморожен и хранился при температуре - 70 °С. Перед каждым тестом образцы оттаивали на водяной бане.
Для приготовления обогащенной тромбоцитами плазмы, кровь центрифугировалась при 100 g в течение 8 мин. Концентрация тромбоцитов доводилась до 250 000 кл/мкл разбавлением плазмой без тромбоцитов. Для стабилизации рН в плазму добавили 28 м Hepes (рН 7.4) .
Коммерчески доступные плазмы, дефицитные по - отдельным факторам свертывания, размораживали и далее обрабатывали с использованием Hepes для стабилизации рН, аналогично плазме, обогащенной тромбоцитами.
Подготовка активатора
Как указывалось ранее, свертывание активировалось с использованием активатора в виде монослоя тканевого фактора (TF) , иммобилизованного на пластиковой поверхности. Активаторы хранились при температуре от +4 до +8°С.
Проведение теста
Рассмотрим пространственный рост сгустка в различных образцах исследуемой среды.
А) Пространственный рост сгустка в свободной от тромбоцитов плазме
Приготовленная как указано выше плазма была дополнена ингибитором, например, ингибитором трипсина из кукурузы (0,2 мг/мл) , 10 мкМ липидных везикул (фосфатидилсерин/ фосфатидилхолин, в молярном соотношении 20/80) . Субстрат Z- Гли-Гли-Арг-АМС (800 мкМ) был добавлен для мониторинга формирования тромбина . Приготовленный образец инкубировали в течение 10 мин при 37 °С, а затем дополняли солью Са, в частности, СаС1г (20 мМ) . Исследуемый образец помещали в экспериментальную кювету и инициировали образование сгустка активатором с поверхностью, покрытой тканевым фактором, путем приведения ее в контакт с подготовленным образцом плазмы.
Тесты проводили с помощью специально разработанной системы видеомикроскопии, что позволяло наблюдать пространственное распространение или рост фибринового сгустка и протеолитического фермента, в частности, тромбина, одновременно. Поддерживали температуру в камере на уровне 37 °С и освещение осуществляли посредством красного (625 нм) и ультрафиолетового (365 нм) светодиодов. Рост сгустка детектировали по светорассеянию образца при освещении . красным светом (фиг. 5, а), а сигнал флуоресценции АМС (фиг. 5, Ь) возбуждали ультрафиолетовыми светодиодами . Многополосный эмиссионный фильтр использовали для разделения рассеяния красного света, излучения АМС и излучения для возбуждения. Флуоресценцию и рассеяние красного света, проходящего через оптическую систему, детектировали цифровой ПЗС камерой. Изображения в красном и синем свете получали последовательно, обычно от одного до четырех раз в минуту. Чтобы устранить выгорание АМС, светодиоды синхронизировали с камерой и они включались только на время экспозиции, т.е. около 0,5 сек.
В) Пространственный рост сгустка в обогащенной тромбоцитами плазме
Чтобы предотвратить ретракцию сгустка использовали 25 мкг/мл антагониста гликопротеина Ilb/IIIa. Также были проведены тесты на 0,5% низкотемпературном агарозном геле, так как в некоторых случаях даже большая концентрация антагониста полностью не ингибирует ретракцию.
Подготовку образцов выполняли, как описано выше, за исключением того, что вместо свободной от тромбоцитов плазмы использовали обогащенную тромбоцитами плазму. После рекальцификации плазма предварительно нагревалась до 42°С в течение 2 мин. Агарозный раствор добавляли и смесь инкубировали в экспериментальной кювете в течение 3 мин для образования геля. Затем тест проводили, как описано выше.
Обработка данных
Обработка изображения
Изображения в красном и УФ-свете были первично обработаны одинаковым образом. Для получения профилей светорассеяния (фиг. 6, а) или флуоресценции АМС, для каждого кадра была измерена интенсивность света в соответствующем диапазоне вдоль линии, перпендикулярной к поверхности активатора. Значения были усреднены для 150-300 линий.
Скорость роста сгустка рассчитывалась по движению точки полумаксимальной интенсивности на профилях светорассеяния. Начальная скорость роста определялась как тангенс угла наклона линеаризованного участка диаграммы зависимости размера сгустка от времени в первые 10 мин роста сгустка. Стационарная . скорость рассчитывается таким же образом, через 40 мин роста сгустка, когда граница сгустка оказывается так далеко от активатора, что его влияние на рост сгустка становится незначительным.
Профили интенсивности флуоресценции АМС переводятся в профили его концентрации посредством калибровки. Профиль калибровки интенсивности рассчитан в рамках равномерного распределения с известной концентрацией АМС в той же плазме. АМС концентрация в каждой точке (С±) была рассчитана следующим образом:
Figure imgf000031_0001
(Ля/ ^bgr ) где: Ii - интенсивность флуоресценции, Ibgr ~~ интенсивность фона, Icai ' - интенсивность флуоресценции с известной концентрацией АМС, все в одной и той же точке кадра, Ccai - калибровочная концентрация АМС.
Расчет концентрации тромбина
Концентрация тромбина (фиг. б, Ь) рассчитывалась по одномерному распределению АМС путем решения обратной задачи для следующего уравнения реакция - диффузия. дАМС На х S
АМС + к '.cat
dt дх2 К... + S
Km + S ( дАМС(х, t) д2АМС(х, t) )
IIa(x, t) =
S χ к,. dt шс дх2
где: АМС, S и На являются концентрациями АМС, флуорогенного субстрата и тромбина, соответственно, DAMC - коэффициент диффузии АМС; Km, kcat являются константами реакции расщепления субстрата тромбином, следующей кинетике Михаэлиса .
Коэффициент диффузии АМС был измерен экспериментально путем фиттинга измеренных профилей диффузии к теоретическим.
Обратная задача для распределения концентрации тромбина является некорректной, поэтому экспериментальный шум и даже небольшие искажения профилей АМС приводят к отсутствию ее решения. Для преодоления этого были использованы численные алгоритмы для снижения шума и уровня искажения сигнала АМС.
Искажения АМС сигнала происходят из-за возбуждения рассеяния света на фибриновом сгустке . Интенсивность флуоресценции увеличивается внутри сгустка. Это увеличение пропорционально АМС концентрации и плотности сгустка. Чтобы преодолеть это и рассчитать реальную концентрацию АМС, была использована следующая формула.
Clot
АМСгыъь = АМСг + (к± + к2 - ЛМСеа1 -—
к
где: AMCviSibie . ~ концентрация АМС, полученная путем калибрования, AMCreai - реальная концентрация АМС, Clot интенсивность рассеянного фибрином света, коэффициенты ki, k2, кз были измерены экспериментально.
Для снижения шума были использованы следующие алгоритмы вычисления производны : д[АМС] _ 1 ^ [AMC](x,t + j * At) - [AMC](x, t)
dt ~J j j * At
д2 [АМС] _ 1 ^ [AMC]{x +/* As,Q - 2 · [AMC](x, t) + [AMC](x - i* Ax, t)
дх2 ~/ {i * Ax)2 где: At -время между кадрами, обычно 1 мин.; Δχ - размер пикселя (4,3 мкм) ; значения I и J выбраны оптимальными для максимального снижения шума при минимальном искажении сигнала. Обычно выбирались J = 3 и I = 40, при этом суммирование могло начинаться со значений i и j, больших единицы.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, заключающийся в том, что
обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник,
добавляют в систему in vitro флуорогенный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом,
освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени для возбуждения сигнала флуоресценции метки,
регистрируют одновременно с освещением в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала флуоресценции метки в образце,
получают из совокупности пространственных распределений сигнала флуоресценции метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды.
2. Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, заключающийся в том, что
обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник, добавляют в систему in vitro хромогенный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом,
освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени светом с длиной волны его значительного поглощения меткой,
регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение поглощения света меткой в образце,
получают (определяют или рассчитывают) из совокупности пространственных распределений поглощения света меткой для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки в образце исследуемой среды с компонентами среды.
3. Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в 'гетерогенной системе, заключающийся в том, что
обеспечивают систему in vitro, которая содержит образец исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, и распределенный в образце исследуемой среды протеолитический фермент или его предшественник,
добавляют в систему in vitro люминисцентный субстрат, с последующим высвобождением метки при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом,
регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала люминесценции метки в образце,
получают (определяют или рассчитывают) из совокупности пространственных распределений сигналов люминисценции метки для заданных моментов времени пространственно-временное распределение активности протеолитического фермента путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция» с учетом степени связывания метки в образце исследуемой среды с компонентами среды.
4. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором дополнительно в систему in vitro помещают активирующий агент, который вызывает изменение в пространственно-временном распределении активности протеолитического фермента .
5. Способ по п. 4, в котором в качестве активирующего агента используют агент, выбранный из группы, состоящей из иммобилизованного на поверхности подложки тканевого фактора, растворимого тканевого фактора, тканевого активатора плазминогена , клеток, обеспечивающих возможность экспрессии тканевого фактора, образцов тканей организма, стекла или пластика .
6. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором дополнительно освещают образец исследуемой среды в заданные моменты времени и регистрируют пространственные характеристики исследуемого образца, выбранные из группы, состоящей из пространственного распределения светорассеяния, пространственного распределения светопропускания в исследуемом образце или их комбинации.
7. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором субстрат добавляют в виде раствора в образец исследуемой среды.
8. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором наносят субстрат в лиофилизированной форме на стенки системы in vitro до размещения в ней образца исследуемой среды.
9. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором в качестве исследуемой среды используют плазму крови, выбранную из группы, состоящей из богатой тромбоцитами плазмы, свободной от тромбоцитов плазмы и бедной тромбоцитами плазмы.
10. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором освещение и регистрацию изменения сигнала метки осуществляют с частотой от 1 до 1800 раз в минуту.
11. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором обеспечивают стабильную температуру по всему объему исследуемого образца, предпочтительно 37 °С.
12. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором обеспечивают стабильное давление по всему объему исследуемого образца, предпочтительно повышенное по отношению к атмосферному.
13. Способ по любому из п. п. 1-3, в котором обеспечивают стабильный рН исследуемого образца, предпочтительно с диапазоном 7,2 - 7,4.
14. Устройство определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, содержащее
систему in vitro, которая включает кювету для размещения образца исследуемой среды, выбранной из группы, состоящей из плазмы крови, цельной крови, воды, лимфы, коллоидного раствора, кристаллоидного раствора или геля, распределенного в образце исследуемой среды протеолитического фермента или его предшественника, и флуорогенного, или хромогенного, или люминесцентного субстрата,
средство для освещения образца исследуемой среды в заданные моменты времени,
средство регистрации пространственного распределения сигнала метки, образовавшейся при расщеплении указанного субстрата протеолитическим ферментом, в заданные моменты времени,
средство управления, средствами освещения и регистрации.
15. Устройство по п.14, которое содержит активирующее средство для размещения и ввода в кювету1 активатора процесса, обеспечивающего инициирование изменения пространственно- временного распределения активности протеолитического фермента,
16. Устройство по п.14, которое содержит средство для обеспечения стабильной температуры в образце исследуемой среды, предпочтительно 37°С.
17. Устройство по п.14, которое содержит средство обеспечения стабильного давления по всему объему исследуемого образца, предпочтительно повышенного, по отношению к атмосферному.
18. Устройство по п.14, которое содержит средство для освещения образца исследуемой среды излучением видимого спектра по методу темного поля.
19. Устройство по п.14, в котором средство управления средствами освещения и регистрации выполнено с возможностью регулирования времени включения/выключения, интенсивности освещения и синхронизации работы средств освещения и регистрации между собой.
20. Устройство по п.14, которое соединено с вычислительным средством, выполненным с возможностью осуществления расчета пространственного распределения активности протеолитического фермента во времени, или включает указанное вычислительное средство.
21. Способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе in vitro, заключающийся в том, что
используют в качестве исследуемого образца компоненты крови, выбранные из группы: цельная кровь, свободная от тромбоцитов плазма крови, бедная тромбоцитами плазма крови, богатая тромбоцитами плазма крови, кровь с добавлением антикоагулянта, плазма крови с добавлением антикоагулянта,
обеспечивают условия для формирования протеолитического фермента в исследуемом образце и наблюдения за ним посредством совершения, по меньшей мере, одной операции, выбранной из группы: приведение исследуемого образца в контакт с иммобилизованным на поверхности активатором свертывания крови; добавление субстрата, расщепляемого исследуемым протеолитическим ферментом; добавление соли . кальция; добавление ингибитора контактной активации свертывания,
регистрируют в заданные моменты времени пространственное распределение сигнала отщепляемой от субстрата метки в образце, получают из совокупности пространственных распределений сигнала метки для заданных моментов времени пространственно- временное распределение активности протеолитического фермента (фактора свертывания) путем решения обратной задачи типа «реакция - диффузия - конвекция»- с учетом степени связывания метки с компонентами исследуемой среды,
оценивают состояние системы гемостаза по отклонению пространственно-временного . распределения протеолитического фермента от нормального.
22. Способ по п. 21, в котором дополнительно в заданные моменты времени освещают исследуемый образец и регистрируют пространственное распределение светорассеяния от образовавшегося фибринового сгустка в образце среды методом темного поля.
23. Способ по п.21, в котором в качестве фактора свертывания исследуют протеолитический фермент, выбранный из группы: тромбин, фактор Ха, фактор Vila, фактор 1Ха, фактор Xlla, фактор Х1а, плазмин.
24. Способ по п. 21, в котором используют, по меньшей мере, один параметр пространственно-временного распределения тромбина или фибрина, для оценки состояния системы свертывания в образце и постановки диагноза, выбранный из группы: скорость пространственного распространения . волны тромбина, максимальная концентрация тромбина в образце, максимальная концентрация тромбина в движущейся части волны, скорость увеличения концентрации тромбина, интеграл от концентрации тромбина по пространству, интеграл от концентрации тромбина по времени и по пространству, скорость пространственного распространения фронта фибрина (светорассеяния), максимальная концентрация фибрина (величина светорассеяния) в образце.
PCT/RU2012/000570 2011-07-26 2012-07-16 Способ - определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе (варианты), устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе WO2013015717A2 (ru)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201400156A EA028341B1 (ru) 2011-07-26 2012-07-16 Способ определения активности протеолитического фермента (варианты), устройство для его реализации и способ диагностики
CA2842594A CA2842594C (en) 2011-07-26 2012-07-16 Method for determining the spatial and temporal distribution of the activity of a proteolytic enzyme in a heterogeneous system (variations), device for realizing same and method for diagnosing defects in the hemostatic system on the basis of a change in the spatial and temporal distribution of the activity of a proteolytic enzyme in a heterogeneous system
JP2014522787A JP2014521952A (ja) 2011-07-26 2012-07-16 不均一系（ばらつき）におけるタンパク質分解酵素活性の空間分布および時間分布を求めるための方法、これを実現するための装置、不均一系におけるタンパク質分解酵素活性の空間分布および時間分布の変化をもとに、止血系の欠陥を診断するための方法
US14/234,909 US9938563B2 (en) 2011-07-26 2012-07-16 Method for determining the spatiotemporal distribution of activity of a proteolytic enzyme in a heterogeneous system (variations), a device for realizing same and a method for diagnosing the defects in the hemostatic system on the basis of a change in the spatiotemporal distribution of activity of a proteolytic enzyme in a heterogeneous system
CN201280045249.3A CN103998620A (zh) 2011-07-26 2012-07-16 用于确定蛋白水解酶活性的方法(变体)、用于实现该方法的装置以及诊断方法
EP12818440.5A EP2752495B8 (en) 2011-07-26 2012-07-16 Method for determining the activity of a proteolytic enzyme (variants), device for the implementation of same and diagnostic method

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2011131293 2011-07-26
RU2011131293/10A RU2518247C2 (ru) 2011-07-26 2011-07-26 Способ определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе, устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2013015717A2 true WO2013015717A2 (ru) 2013-01-31
WO2013015717A3 WO2013015717A3 (ru) 2013-04-11
WO2013015717A8 WO2013015717A8 (ru) 2014-02-20

Family

ID=47601696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2012/000570 WO2013015717A2 (ru) 2011-07-26 2012-07-16 Способ - определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе (варианты), устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9938563B2 (ru)
EP (1) EP2752495B8 (ru)
JP (1) JP2014521952A (ru)
CN (1) CN103998620A (ru)
CA (1) CA2842594C (ru)
EA (1) EA028341B1 (ru)
RU (1) RU2518247C2 (ru)
WO (1) WO2013015717A2 (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105738378A (zh) * 2016-02-23 2016-07-06 上海航天动力科技工程有限公司 一种多功能自显像着色渗透剂及其应用
US11237178B2 (en) * 2016-11-30 2022-02-01 Obschestvo S Ogranichennoy Otvetstvennostyu <<Hemacore Labs>> Device for monitoring the spatial and temporal dynamics of thrombin
RU2657294C1 (ru) * 2016-12-15 2018-06-13 Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Московской области "Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского" (ГБУЗ МО МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского) Устройство для количественной оценки флюоресценции и оптических свойств тканей in vivo
JP7273631B2 (ja) * 2019-06-26 2023-05-15 株式会社日立製作所 検体性状識別装置、検体性状識別方法及び検体搬送システム
EP4270010A1 (en) * 2020-12-28 2023-11-01 Fujimori Kogyo Co., Ltd. Method for evaluating blood coagulation performance, and method for inspecting risk of thrombosis
CN114465969B (zh) * 2021-12-23 2023-07-04 珠海格力电器股份有限公司 通讯消息组的管理方法、装置、设备和存储介质

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009055940A1 (en) 2007-11-02 2009-05-07 Verano Financial Ltd. Method and apparatus for monitoring spatial fibrin clot formation
RU2395812C2 (ru) 2008-11-14 2010-07-27 Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские инновации" Устройство для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3516579A1 (de) * 1984-11-19 1986-05-22 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Gerinnungstest auf teststreifen
WO1993010261A1 (en) * 1991-11-13 1993-05-27 Dahlbaeck Bjoern Method for the diagnosis of blood coagulation disorders
US5339830A (en) 1992-01-21 1994-08-23 Blake Joseph W Iii Blood coagulation test system
DK1159448T3 (da) * 1999-03-04 2004-08-09 Synapse Bv Bestemmelse af biologisk aktive former af proteolytiske enzymer
EP2405019A1 (en) * 2001-09-10 2012-01-11 Meso Scale Technologies LLC Methods, reagents, kits and apparatus for protein function analysis
ES2291661T3 (es) * 2002-05-01 2008-03-01 Synapse B.V. Prueba de diagnostico para la determinacion de la concentracion de actividad proteolitica transitoria en medios biologicos compuestos.
EP1717588A1 (en) * 2005-04-29 2006-11-02 Synapse B.V. Measuring thrombin activity in whole blood
WO2007073597A1 (en) * 2005-12-27 2007-07-05 Mcmaster University Enzyme measurement assay using a modified substrate comprising a substrate attached to a macromolecule via a spacer
JP5461175B2 (ja) * 2006-06-06 2014-04-02 トロームビノスコープ ベスローテン フェンノートシャップ 生体媒質中で酵素活性を決定する方法
ATE516504T1 (de) * 2008-02-07 2011-07-15 Synapse Bv Um den einfluss von störfaktoren korrigierte messung des zeitlichen verlaufs einer enzymatischen aktivität bei der reaktion eines enzyms mit einem substrat

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009055940A1 (en) 2007-11-02 2009-05-07 Verano Financial Ltd. Method and apparatus for monitoring spatial fibrin clot formation
RU2395812C2 (ru) 2008-11-14 2010-07-27 Общество с ограниченной ответственностью "Медицинские инновации" Устройство для исследования пространственного свертывания крови и ее компонентов

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEMKER HC; WIELDERS S.; KESSELS H.; BEGUIN S.: "Continuous registration of thrombin generation in plasma, its use for the determination of the thrombin potential", J THROMB HAEMOST., vol. 70, no. 4, 18 October 1993 (1993-10-18), pages 617 - 24, XP000567560
HOFFMAN M.; MONROE DM 3RD: "A cell based model of hemostasis", THROMB HAEMOST., vol. 85, no. 6, June 2001 (2001-06-01), pages 958 - 65
KONDRATOVICH A.Y.; POHILKO A.V.; ATAULLAHANOV F.I.: "Spatiotemporal Dynamics of Contact Activation Factors of Blood Coagulation", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1569, no. 1-3, 15 January 2002 (2002-01-15), pages 86 - 104, XP004341305, DOI: doi:10.1016/S0304-4165(01)00247-1
PANTELEEV M.A.; OVANESOV M.V.; KIREEV D.A.; SHIBEKO A.M; SINAURIDZE E.I.; ANANYEVA N.M.; BUTYLIN A.A.; SAENKO E. L.; ATAULLAKHANOV: "Spatial Propagation and Localization of Blood Coagulation Are Regulated by Intrinsic and Protein C Pathways, Respectively", BIOPHYS J., vol. 90, no. 5, 1 March 2006 (2006-03-01), pages 1489 - 500
See also references of EP2752495A4

Also Published As

Publication number Publication date
RU2518247C2 (ru) 2014-06-10
CA2842594A1 (en) 2013-01-31
EA028341B1 (ru) 2017-11-30
WO2013015717A3 (ru) 2013-04-11
EA201400156A1 (ru) 2014-08-29
EP2752495B1 (en) 2020-03-25
EP2752495B8 (en) 2020-04-29
CN103998620A (zh) 2014-08-20
US9938563B2 (en) 2018-04-10
RU2011131293A (ru) 2013-02-10
WO2013015717A8 (ru) 2014-02-20
JP2014521952A (ja) 2014-08-28
EP2752495A4 (en) 2015-04-15
US20140227726A1 (en) 2014-08-14
CA2842594C (en) 2020-01-07
EP2752495A2 (en) 2014-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2013015717A2 (ru) Способ - определения пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе (варианты), устройство для реализации указанного способа и способ диагностики нарушений системы гемостаза по изменению пространственно-временного распределения активности протеолитического фермента в гетерогенной системе
CA2879601C (en) Device for monitoring spatial coagulation of blood and of components thereof
CA2704287C (en) Method and apparatus for monitoring spatial fibrin clot formation
ES2725426T3 (es) Medios y procedimientos para calibración universal de pruebas anti-factor Xa
BR112014031509B1 (pt) Para a determinação simultânea in vitro em tempo real do curso da atividade da enzima proteolítica e da resistência do coágulo de fibrina, reômetro rotativo e uso de um reômetro rotativo
US20060051828A1 (en) Diagnostic test for determining the concentration of transient proteolytic activity in composite biological media
Koltsova et al. Determination of fibrin clot growth and spatial thrombin propagation in the presence of different types of phospholipid surfaces
RU123166U1 (ru) Устройство мониторинга постранственного свертывания крови и ее компонентов
RU2660706C1 (ru) Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК)
EA026282B1 (ru) Способ определения функционального состояния системы гемостаза
ES2857686T3 (es) Dispositivo para monitorizar la dinámica espacial y temporal de trombina
Roshal et al. Thrombin Generation Assays
RU177920U1 (ru) Устройство мониторинга пространственно-временной динамики тромбина
Paul et al. Reactive oxygen species in endothelial signaling in COVID-19: Protective role of the novel peptide PIP-2
Novikov et al. Correlation between erythrocyte sedimentation rate (ESR) dynamics and blood luminescence studied using of opto-electronic devices
Jain Examination of a system for the mechanistic study of tumor cell-platelet interactions under well-defined flow conditions
UA30962U (ru) Способ определения тканевой фибринолитической активности у молодых и старых крыс

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12818440

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2842594

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014522787

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201400156

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2012818440

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14234909

Country of ref document: US