WO2012147805A1 - 脳移行性機能性核酸及びその利用 - Google Patents

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alzheimer
disease
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oligodeoxynucleotide
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水野　哲也
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Definitions

  • the present invention relates to application of functional nucleic acid to the treatment of Alzheimer's disease. More specifically, the present invention relates to a therapeutic agent for Alzheimer's disease using a functional nucleic acid having a CpG motif and its use.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2011-1000027 filed on April 28, 2011, the entire contents of which are incorporated by reference.
  • a ⁇ neurotoxicity was thought to be in aggregated A ⁇ (fA ⁇ ) deposited in the brain as insoluble amyloid fibrils, but in recent years soluble A ⁇ oligomers (oA ⁇ ) have a stronger neurotoxic effect. It became clear. The neuropathy effect is thought to be due to impaired synaptic plasticity, oxidative stress due to active oxygen, and impaired insulin receptor function in the hippocampus. Thus, the importance of controlling A ⁇ oligomers in Alzheimer's disease treatment strategies is suggested.
  • microglia which are immune cells in the brain, are involved in the pathology of Alzheimer's disease.
  • Microglia gather in senile plaques and treat not only aggregated A ⁇ but also A ⁇ oligomers, while they have aspects of inflammatory cells, and their excessive activation is associated with neurotoxic factors such as inflammatory cytokines, active oxygen, and glutamate.
  • TLR Toll-like receptor
  • TLR9 Toll-like receptor 9
  • CpG-ODN functional nucleic acid CpG oligodeoxynucleotide
  • HO-1 antioxidant enzyme heme oxygenase 1
  • TLR signal in Alzheimer's disease is also being studied by other research groups, and one of the results is the usefulness of administering CpG-ODN from the periphery for several months ( Non-patent document 2).
  • peripheral administration has various problems such as activation of other immune cells to facilitate side reactions and CpG-ODN being easily degraded and difficult to enter the brain.
  • CpG-ODN which is a TLR9 ligand
  • CpG-ODN is expected to be applied and clinically applied as a therapeutic drug for Alzheimer's disease.
  • CpG-ODN reported in the past has no brain migration and cannot be used for actual treatment. Considering the fact that it is attacked by a nucleolytic enzyme when administered to a living body, there is much room for improvement in terms of stability.
  • a therapeutic agent for Alzheimer's disease comprising a structure in which an oligodeoxynucleotide containing a CpG motif and modified with phosphorothioate and an RVG peptide derived from rabies virus glycoprotein are linked, or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the CpG motif is composed of gacgtt.
  • the therapeutic agent for Alzheimer's disease according to [6] wherein the oligodeoxynucleotide is 10 to 20 nucleotides in length.
  • the therapeutic agent for Alzheimer's disease according to [6] wherein the oligodeoxynucleotide comprises the sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Alzheimer's disease drug [14] The therapeutic agent for Alzheimer's disease according to [13], wherein two molecules of the oligodeoxynucleotide and one molecule of the RVG peptide are linked.
  • [16] Use of the structure defined in any one of [1] to [15] for the manufacture of a therapeutic agent for Alzheimer's disease.
  • a method for treating Alzheimer's disease comprising the step of administering a therapeutically effective amount of the therapeutic agent for Alzheimer's disease according to any one of [1] to [15] to an Alzheimer's disease patient.
  • a phosphorothioate-modified oligodeoxynucleotide comprising the sequence of SEQ ID NO: 1 and a rabies virus glycoprotein-derived RVG peptide comprising the sequence of SEQ ID NO: 3 via a disulfide bond at the cysteine residue position in the RVG peptide Structures that are connected together.
  • FIG. 1 Schematic diagram illustrating phosphorothioate modification.
  • the CpG-ODN and RVG peptide are linked via a linear carbon chain (C6) and a disulfide bond.
  • oA ⁇ A ⁇ oligomer The graph which compared the neuroprotective effect of various produced CpG-ODN. The survival rate of neurons when each CpG-ODN was added was compared with the case where no CpG-ODN was added (second from the left). * Indicates that there is a significant difference from the control (no addition).
  • oA ⁇ A ⁇ oligomer Structure of a structure in which CpG-ODN and RVG peptide are linked. CpG-ODN and RVG peptide (RVG-Cys peptide) with cysteine added at the C-terminus are linked.
  • RVG-Cys-127-5 was administered intraperitoneally to Alzheimer's disease model mice (APP / PS1 transgenic mice), and the degree of improvement in cognitive dysfunction was examined.
  • PBS was administered as a control. * Represents a significant difference from the control (PBS).
  • WT A syngeneic wild-type mouse.
  • APP / PS1 APP / PS1 transgenic mouse.
  • oA ⁇ A ⁇ oligomer The graph which shows the neuroprotective effect of RVG-Cys-127-5. The survival rate (right) of neurons when RVG-Cys-127-5 was added was compared with the case without addition (middle). * Indicates that there is a significant difference from the control (cont: RVG-Cys-127-5 not added).
  • the first aspect of the present invention relates to a therapeutic agent for Alzheimer's disease.
  • the term “therapeutic agent” refers to a drug that exhibits a therapeutic or prophylactic effect on Alzheimer's disease, which is a target disease or condition.
  • the therapeutic effects include alleviation of symptoms or associated symptoms characteristic of Alzheimer's disease (mildness), prevention or delay of deterioration of symptoms, and the like. The latter can be regarded as one of the preventive effects in terms of preventing the seriousness.
  • the therapeutic effect and the preventive effect are partially overlapping concepts, so it is difficult to clearly distinguish them from each other, and there is little practical benefit.
  • a typical preventive effect is to prevent or delay the recurrence of symptoms characteristic of Alzheimer's disease.
  • it corresponds to a therapeutic drug for Alzheimer's disease.
  • the active ingredient of the present invention is a structure in which an oligodeoxynucleotide containing a CpG motif and modified with phosphorothioate and an RVG peptide derived from a rabies virus glycoprotein are linked, or a pharmacologically acceptable salt thereof. That is, in the present invention, a molecule having a structure in which a predetermined oligodeoxynucleotide and an RVG peptide are linked is used as an active ingredient.
  • the active ingredient of the present invention exhibits a characteristic action on microglia, that is, an action of enhancing the neuroprotective action of microglia.
  • the active ingredient of the present invention can enhance the ability of microglia to treat A ⁇ oligomers without inducing the production of glutamate, nitric oxide and TNF- ⁇ , which are neurotoxic factors.
  • This action is typically microglia specific.
  • microglia-specific acts on microglia but does not or does not substantially act on other cells (particularly peripheral monocytes, macrophages, B cells, dendritic cells). Even so, it means that the degree is significantly low.
  • the active ingredient of the present invention acts on microglia and can promote the production of the antioxidant enzyme heme oxygenase 1 (HO-1). This action is effective in suppressing the production of active oxygen (ROS) by A ⁇ oligomers.
  • HO-1 heme oxygenase 1
  • CpG oligodeoxynucleotide (CpG-ODN)
  • the oligodeoxynucleotide in the present invention contains a CpG motif.
  • the term “motif” here refers to a characteristic common sequence having a specific function.
  • the “CpG motif” is an oligo DNA composed of 6 specific bases (5′-purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine-3 ′). In one embodiment of the present invention, gacgtt is included as the sequence of the CpG motif portion.
  • Oligodeoxynucleotides containing CpG motifs can be classified into three classes, namely A class, B class, and C class, according to their structural characteristics.
  • a class CpG-ODN a phosphodiester bond is used for the CpG motif portion.
  • Class A CpG-ODN strongly induces IFN- ⁇ secretion of plasmacytoid dendritic cells (pDC).
  • pDC plasmacytoid dendritic cells
  • the B class CpG-ODN is linear and has a phosphorothioate backbone. Typically it is fully phosphorothioate modified.
  • B class CpG-ODN generally strongly induces B cell proliferation and plasmacytoid dendritic cell (pDC) maturation, whereas plasmacytoid dendritic cells induce little IFN- ⁇ secretion.
  • the C class has a palindromic structure on the 3 ′ end side and forms a double strand.
  • C class CpG-ODN activates B cells and NK cells and induces IFN- ⁇ .
  • B class CpG-ODN is used in the present invention.
  • the position and degree of phosphorothioate modification are not limited. Since the phosphorothioate-modified site is stabilized and the degradation resistance against nuclease is improved, the degree of phosphorothioate modification is better.
  • B class CpG-ODN is used in which all the nucleotides constituting it are phosphorothioate-modified.
  • the CpG-ODN in the present invention has a structure in which 1 to several nucleotides are linked on both sides of the CpG motif.
  • the CpG motif is not located at the end.
  • the number of nucleotides linked to the 5 ′ side or 3 ′ side of the CpG motif is not particularly limited, but it is better that the molecular weight is not large in consideration of brain migration.
  • the number of nucleotides linked to the 5 ′ side of the CpG motif is preferably 1-8, more preferably 2-6, and even more preferably 2-4. The same applies to the number of oligonucleotides linked to the 3 ′ side of the CpG motif.
  • the total length of CpG-ODN is preferably 10 to 25 nucleotides, more preferably 10 to 20 nucleotides, and even more preferably 10 to 14 nucleotides.
  • Specific examples of CpG-ODN preferable in the present invention are shown below.
  • S represents a phosphorothioate bond (see FIG. 1).
  • CpG-ODN SEQ ID NO: 1
  • the phosphorothioate-modified CpG-ODN may be synthesized by a conventional method such as a method using a solid phase cyanoethyl phosphoramidite method (see, for example, Journal of American Chemical Society 112: 1253, 1990).
  • a conventional method such as a method using a solid phase cyanoethyl phosphoramidite method (see, for example, Journal of American Chemical Society 112: 1253, 1990).
  • reverse phase high performance liquid chromatography may be used.
  • RVG peptide derived from rabies virus glycoprotein The translocation into the brain is strictly controlled by the blood brain barrier.
  • an RVG peptide derived from rabies virus glycoprotein is used to impart brain migration.
  • the sequence of RVG peptide is shown below. In this specification, according to a conventional notation method, peptides are represented such that the left end is the amino terminus (N terminus) and the right end is the carboxy terminus (C terminus).
  • a delivery system using a rabies virus glycoprotein-derived peptide has been reported (see, for example, Nature 448: 39-43, 2007; Nature Biotechnology 29: 341-345, 2011).
  • YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG SEQ ID NO: 3
  • the constituent amino acids of the RVG peptide can be altered or modified.
  • “partially modified” means deletion or substitution of 1 to several amino acids (upper limit is 3, 5, or 7), or 1 to several amino acids (upper limit is 3, for example, 5 And 7) amino acid additions, insertions, or combinations thereof, the amino acid sequence is mutated (changed).
  • “modification” refers to partial stabilization of the basic structure (typically, a peptide consisting of the sequence of SEQ ID NO: 3) or addition of other molecules to improve the stability or add a new function. It means adding.
  • Examples of peptide modifications are those in which the functional group in the constituent amino acid residue is protected by an appropriate protecting group (acyl group, alkyl group, monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide, etc.), or a sugar chain is added.
  • an appropriate protecting group acyl group, alkyl group, monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide, etc.
  • the protecting group is linked by an amide bond, an ester bond, a urethane bond, a urea bond, or the like according to the peptide site to which the protecting group is bound, the kind of the protecting group to be used, or the like.
  • the peptide (RVG peptide or a modified or modified product thereof) in the present invention can be produced using a known peptide synthesis method (for example, a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method).
  • the peptide in this invention can also be prepared by extracting and refine
  • the peptide in the present invention may be prepared by a genetic engineering technique. That is, the peptide of the present invention can also be prepared by introducing a nucleic acid encoding the peptide of the present invention into an appropriate host cell and recovering the peptide expressed in the transformant. The recovered peptide is purified as necessary. The recovered peptide can be subjected to an appropriate substitution reaction and converted into a desired variant.
  • CpG-ODN and RVG peptide are linked.
  • Various methods suitable for linking nucleic acids and peptides can be used for linking.
  • CpG-ODN is linked via a disulfide bond at the cysteine position in the RVG peptide.
  • a method developed by John J. Turner et al. Can be used for such connection (see, for example, Nucleic Acids Research, 33: 27-42, 2005).
  • a thiolation modifier is used, and as a result, the RVG peptide is linked to the 5 ′ terminal side of CpG-ODN by a disulfide bond via a carbon chain (see FIG. 2).
  • the type of carbon chain (straight chain or branched chain, length) can vary depending on the modifier used.
  • the carbon number of the carbon chain is, for example, C3 to C10. However, since it is preferable to reduce the molecular weight of the structure in consideration of brain migration, the length of the carbon chain should be about C3 to C7.
  • cysteine is added to the N-terminus or C-terminus of the RVG peptide.
  • the cysteine is used for linking CoG-ODN. That is, in this embodiment, CpG-ODN is linked at the terminal cysteine position in addition to the cysteine residue position in the RVG peptide. That is, a structure in which two molecules of CpG-ODN and one molecule of RVG peptide are linked is used as an active ingredient. In this case, the two molecules of CpG-ODN need not have the same structure. However, typically, the structure is formed using two molecules of CpG-ODN having the same structure.
  • the sequence of RVG peptide with cysteine added to the C terminus is shown below. YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGC (SEQ ID NO: 4)
  • cysteines may be added to the N-terminal side or C-terminal side.
  • the number of cysteine added in this way is not particularly limited, but is, for example, 1 to 10. Part or all of the added cysteine is subjected to binding with CpG-ODN.
  • a structure in which the ratio of the number of CPG-ODN molecules to the number of RVG peptide molecules is increased (for example, a structure in which one molecule of RVG peptide and 3 to 10 molecules of CPG-ODN are linked) can be formed.
  • cysteine may be added with another amino acid interposed therebetween. When two or more cysteines are additionally added, another amino acid may be interposed between each cysteine residue.
  • Pharmacologically acceptable salts of the above structures may be used as the active ingredient of the therapeutic agent of the present invention.
  • the “pharmacologically acceptable salt” is, for example, an acid addition salt, a metal salt, an ammonium salt, an organic amine addition salt, or an amino acid addition salt.
  • acid addition salts include inorganic acid salts such as trifluoroacetic acid hydrochloride, sulfate, nitrate, phosphate, hydrobromide, acetate, maleate, fumarate, citrate, benzene
  • Organic acid salts such as sulfonate, benzoate, malate, oxalate, methanesulfonate, and tartrate are listed.
  • Examples of the metal salt include alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt and lithium salt, alkaline earth metal salts such as magnesium salt and calcium salt, aluminum salt and zinc salt.
  • Examples of ammonium salts include salts such as ammonium and tetramethylammonium.
  • Examples of organic amine addition salts include morpholine addition salts and piperidine addition salts.
  • Examples of amino acid addition salts include glycine addition salts, phenylalanine addition salts, lysine addition salts, aspartic acid addition salts, and glutamic acid addition salts. These salts can be prepared by conventional means.
  • the preparation of the therapeutic agent of the present invention can be performed according to a conventional method.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients for example, buffer, excipient, disintegrant, emulsifier, suspending agent, soothing agent, stabilizer, preservative, preservative, physiological saline , Carriers and the like.
  • buffer a phosphate buffer, a citrate buffer, or the like can be used.
  • excipient lactose, starch, sorbitol, D-mannitol, sucrose and the like can be used.
  • disintegrant starch, carboxymethylcellulose, calcium carbonate and the like can be used. Phosphate, citrate, acetate, etc. can be used as the buffer.
  • emulsifier gum arabic, sodium alginate, tragacanth and the like can be used.
  • suspending agent glyceryl monostearate, aluminum monostearate, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, sodium lauryl sulfate and the like can be used.
  • soothing agent benzyl alcohol, chlorobutanol, sorbitol and the like can be used.
  • stabilizer propylene glycol, ascorbic acid or the like can be used.
  • preservatives phenol, benzalkonium chloride, benzyl alcohol, chlorobutanol, methylparaben, and the like can be used.
  • preservatives benzalkonium chloride, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol and the like can be used.
  • the dosage form for formulation is not particularly limited. Examples of dosage forms are injections, tablets, powders, fine granules, granules, capsules and syrups.
  • the therapeutic agent of the present invention contains an active ingredient in an amount necessary for obtaining an expected therapeutic effect (or preventive effect) (that is, a therapeutically effective amount).
  • the amount of the active ingredient in the therapeutic agent of the present invention generally varies depending on the dosage form, but the amount of the active ingredient is set, for example, within the range of about 0.001% by weight to about 95% by weight so as to achieve a desired dose.
  • the therapeutic agent of the present invention is administered to the subject by oral administration or parenteral administration (intravenous, intraarterial, subcutaneous, intradermal, intramuscular or intraperitoneal injection, transdermal, nasal, transmucosal, etc.) depending on the dosage form. Applied. These administration routes are not mutually exclusive, and two or more arbitrarily selected can be used in combination (for example, intravenous injection or the like is performed simultaneously with oral administration or after a predetermined time has elapsed).
  • the “subject” here is not particularly limited, and includes humans and non-human mammals (including pet animals, domestic animals, laboratory animals. Specifically, for example, mice, rats, guinea pigs, hamsters, monkeys, cows, pigs, goats. , Sheep, dogs, cats, chickens, quails, etc.). In a preferred embodiment, the therapeutic agent of the present invention is applied to humans.
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention is set so as to obtain the expected therapeutic effect.
  • a therapeutically effective dose the patient's symptoms, age, sex, weight, etc. are generally considered.
  • a person skilled in the art can set an appropriate dose in consideration of these matters.
  • the dose can be set so that the amount of the active ingredient per day is about 10 ⁇ g to about 100 ⁇ g, preferably about 20 ⁇ g to about 50 ⁇ g for an adult (body weight: about 60 kg).
  • the administration schedule for example, once to several times a day, once every two days, or once every three days can be adopted. In preparing the administration schedule, the patient's symptoms and the duration of effect of the active ingredient can be taken into consideration.
  • the structure which is an active ingredient of the present invention enhances the neuroprotective action of microglia, it can be applied to neurodegenerative diseases other than Alzheimer's disease (eg Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease). It is also useful and has high value.
  • the structure is also useful as a seed compound in the development of drugs and drugs for neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease.
  • CpG-ODN which is a ligand for Toll-like receptor 9 (TLR9)
  • TLR9 Toll-like receptor 9
  • CpG-ODN Designing an ODN with a linear structure based on CpG-ODN (CpG subtype B: 5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3 '(SEQ ID NO: 5)) that has shown efficacy against Alzheimer's disease It was to be. In addition, a modification was made to prevent degradation by nucleolytic enzymes.
  • CpG-ODN that activates cultured microglia is selected by MTS assay.
  • the prepared CpG-ODN (1, 10, 100 nM) is administered under the co-culture of neurons and microglia, and then 5 ⁇ M A ⁇ oligomer is added to detect and evaluate neuronal cell death after 24 hours. Select those showing 70% or higher survival rate by immunostaining.
  • 5 ⁇ M A ⁇ oligomer is added, and the A ⁇ oligomer after 24 hours is selected to decrease by 40% or more as determined by ELISA.
  • the results of MTS assay study are shown in FIG.
  • the results of 6 types of CpG-ODN (127-1, 127-2, 127-3, 127-4, 127-5, 2006) were compared.
  • 127-1, 127-2, 127-5 showed high activation ability.
  • 127-5 judged to be particularly effective is entirely phosphorothioate-modified.
  • 127-2 is also partially phosphorothioate-modified.
  • S represents a phosphorothioate bond.
  • Fig. 4 shows the A ⁇ oligomer reduction effect (result of ELISA method) of each CpG-ODN. Further, the effect on neuronal cell death (evaluation of survival rate by immunostaining) is shown in FIG. It can be seen that 127-1, 127-2 and 127-5 effectively reduce A ⁇ oligomers and show neuroprotective action.
  • mice are placed in a test box and given with electrical stimulation alone or electrical stimulation and sound stimulation. The next day, evaluate and quantify the freezing behavior when it is just put in a box and when a sound stimulus is added.
  • freezing behavior decreased, but in the RVG-Cys-127-5 administration group, it was confirmed that freezing behavior increased significantly and cognitive function improved.
  • the examination using cultured cells was also conducted according to the evaluation method described in.
  • the production promoting action of oxidase HO-1 in the presence of A ⁇ oligomer was also examined by the following method.
  • RVG-Cys-127-5 was administered to cultured microglia in the presence of A ⁇ oligomer, and after 24 hours, cells were disrupted and HO-1 protein was quantified using a HO-1 ELISA kit.
  • Fig. 7 shows the results of the fear conditioning learning test.
  • RVG-Cys-127-5 administration significantly improved cognitive impairment.
  • HO-1 production was promoted (FIG. 10).
  • RVG peptide linkage for conferring brain migration.
  • the application of RVG peptide is well known by Kumar et al. (Nature 448: 39-43,) 2007), in which 9 lysines are added to the RVG peptide and electrically coupled with siRNA.
  • the newly synthesized molecule has a high stability and a low synthesis cost because the peptide and nucleic acid are linked using an S—S bond.
  • the novel RVG-CpG structure which is an active ingredient of the present invention, is excellent in brain migration and stability, and exhibits medicinal effects by enhancing the neuroprotective action of microglia.
  • application to other neurodegenerative diseases for example, Parkinson's disease, amyotrophic lateral sclerosis, Huntington's disease
  • the structure is used as a seed compound for developing a drug or drug for neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease.
  • SEQ ID NO: 1 description of artificial sequence: CpG oligodeoxynucleotide
  • SEQ ID NO: 2 description of artificial sequence: CpG oligodeoxynucleotide
  • SEQ ID NO: 5 description of artificial sequence: CpG oligodeoxynucleotide

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Abstract

　新規アルツハイマー病治療薬及びその用途を提供することを課題とする。脳移行性と安定性を高めたCpGオリゴデオキシヌクレオチド構造体又はその塩を有効成分としたアルツハイマー病治療薬が提供される。

Description

脳移行性機能性核酸及びその利用
　本発明は機能性核酸のアルツハイマー病治療への適用に関する。より詳しくは、CpGモチーフを有する機能性核酸を利用したアルツハイマー病治療薬及びその用途に関する。本出願は、２０１１年４月２８日に出願された日本国特許出願第２０１１－１００２７８号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
　高齢化社会の進展に伴い、アルツハイマー病の患者数は増加しているが、現在、国内で認可されている治療薬はアセチルコリン分解酵素阻害薬のみである。アルツハイマー病の病因蛋白と考えられているAβを標的として、β及びγセクレターゼ阻害剤やAβワクチンなど、Aβ産生抑制又はAβ分解促進に着目した新規治療薬の開発が進められているが、未だ有効な治療法は確立していない。Aβの神経毒性は、不溶性のアミロイド線維として脳内に沈着した凝集Aβ（fAβ）にあると考えられていたが、近年、可溶性のAβオリゴマー(oAβ)に、より強い神経傷害作用があることが明らかとなった。その神経障害作用は、シナプス可塑性の障害、活性酸素による酸化ストレス、海馬におけるインスリン受容体機能の障害などによるものと考えられている。したがって、アルツハイマー病の治療戦略においてAβオリゴマーを制御することの重要性が示唆される。
　脳内の免疫細胞であるミクログリアは、アルツハイマー病の病態に関与することが示されている。ミクログリアは老人斑に集族し、凝集AβのみならずAβオリゴマーも処理する一方、炎症性細胞としての側面をもち、その過剰な活性化は炎症性サイトカイン、活性酸素、グルタミン酸等の神経傷害因子を産生するなど相反する作用を有している。ミクログリアのAβ処理には、自然免疫の活性化に関与する受容体であるトル様受容体（Toll like receptor：TLR)のシグナルが関与している。
　本発明者らの研究グループは、自然免疫の活性化に関与するトル様受容体9（TLR9）に注目して研究を進め、そのリガンドである機能性核酸CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG-ODN）が脳内の免疫細胞であるミクログリアのAβ処理能を増強し、抗酸化酵素ヘムオキシゲナーゼ１（HO-1）を誘導することにより神経細胞・ミクログリア共培養においてオリゴマーAβ神経毒性を抑制し、さらにCpG-ODNの脳室内投与により、アルツハイマー病モデルマウスの認知機能障害およびその病理所見を改善することを見出した（非特許文献１）。アルツハイマー病におけるTLRシグナルの重要性については他の研究グループによっても研究が進められており、その成果の一つとして、CpG-ODNを末梢から数ヶ月投与した際の有用性が報告されている（非特許文献２）。しかしながら、末梢投与では他の免疫細胞を活性化し副反応が生じやすくなることや、CpG-ODNは分解されやすく脳内への移行が困難であることなど、様々な問題がある。
The American Journal of Pathology. 175: 2121-2131, 2009 The Journal of Neuroscience. 29:1846-1854, 2009
　TLR9リガンドである機能性核酸CpG-ODNには、アルツハイマー病治療薬としての適用・臨床応用が期待される。しかしながら、上記の通り、過去に報告されたCpG-ODNは脳移行性がなく、実際の治療には用いることができない。また、生体へ投与した際には核酸分解酵素の攻撃を受けること等を考慮すれば、特に安定性などについて改善の余地は大きい。
　以上の課題に鑑み、臨床応用を最終目標とした上で、機能性核酸CpG-ODNの最適化を試みるとともに、末梢からの投与を可能にするためにCpG-ODNの脳移行性を高めることを試みた。試行錯誤の末、新たにデザインした配列にホスホロチオエート修飾を施すとともに、狂犬病ウイルス糖蛋白由来のRVGペプチドを連結することによって、安定性が高く且つ良好な脳移行性を示す新規分子（RVG-CpGと称する)の合成に成功した。当該分子は、Aβ処理能、抗酸化酵素HO-1誘導能を保持し、神経細胞・ミクログリア共培養におけるオリゴマーAβ神経毒性を抑制することが確認された。さらに、アルツハイマー病モデルマウスの認知機能障害を有意に改善した。このように、当該分子がアルツハイマー病に対して極めて有効であることが裏付けられるとともに、当該分子の合成に際して採用した手法（安定化のためのホスホロチオエート修飾、及び脳移行性付与のためのRVGペプチドの連結）が機能性CpG-ODNの臨床応用のために有効であることが示された。
　以下に示す本発明は主として以上の成果に基づく。
　［１］CpGモチーフを含み且つホスホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドと、狂犬病ウイルス糖蛋白由来RVGペプチドと、が連結した構造体又はその薬理学的に許容可能な塩を含む、アルツハイマー病治療薬。
　［２］前記構造体は、ミクログリアの神経保護作用を増強する作用を示す、［１］に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［３］前記作用はミクログリア特異的である、［１］に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［４］前記オリゴデオキシヌクレオチドがCpG Bクラスである、［１］～［３］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［５］前記CpGモチーフがgacgttからなる、［１］～［４］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［６］前記オリゴデオキシヌクレオチドは、CpGモチーフの両側にそれぞれ１ないし数個のヌクレオチドが連結した構造を備える、［１］～［５］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［７］前記オリゴデオキシヌクレオチドが10～20ヌクレオチド長である、［６］に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［８］前記オリゴデオキシヌクレオチドが10～14ヌクレオチド長である、［６］に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［９］前記オリゴデオキシヌクレオチドが配列番号１の配列からなる、［６］に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［１０］前記オリゴヌクレオチドは、それを構成する全てのヌクレオチドがホスホロチオエート修飾されている、［１］～［９］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［１１］前記オリゴデオキシヌクレオチドと前記RVGペプチドは、前記RVGペプチド中のシステイン残基位置においてジスルフィド結合を介して連結している、［１］～［１０］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［１２］前記オリゴデオキシヌクレオチドの5'末端に前記RVGペプチドが連結している、［１］～［１１］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［１３］前記RVGペプチドのN末端又はC末端にはシステインが付加されており、該システイン位置にも前記オリゴデオキシヌクレオチドが連結している、［１］～［１２］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［１４］２分子の前記オリゴデオキシヌクレオチドと１分子の前記RVGペプチドが連結している、［１３］に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［１５］前記RVGペプチドが配列番号３の配列からなる、［１］～［１４］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
　［１６］アルツハイマー病治療薬の製造のための、［１］～［１５］のいずれか一項に定義される構造体の使用。
　［１７］［１］～［１５］のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬の治療上有効量をアルツハイマー病患者に投与するステップを含む、アルツハイマー病の治療法。
　［１８］配列番号１の配列からなりホスホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドと、配列番号３の配列からなる狂犬病ウイルス糖蛋白由来RVGペプチドとが、該RVGペプチド中のシステイン残基位置でジスルフィド結合を介して連結してなる構造体。
　［１９］前記RVGペプチドのN末端又はC末端にはシステインが付加されており、該システイン位置にも前記オリゴデオキシヌクレオチドが連結している、［１８］に記載の構造体。
　［２０］前記オリゴヌクレオチドは、それを構成する全てのヌクレオチドがホスホロチオエート修飾されている、［１８］又は［１９］に記載の構造体。
ホスホロチオエート修飾を説明する模式図。 CpG-ODNと狂犬病ウイルス糖蛋白由来のRVGペプチドとの連結態様。この例では、直鎖状炭素鎖（C6）とジスルフィド結合を介してCpG-ODNとRVGペプチドが連結される。 作製した各種CpG-ODNのミクログリア活性化作用を比較したグラフ（MTSアッセイの結果）。＊はコントロール（－：非添加）との間で有意差があることを表す。 作製した各種CpG-ODNのAβオリゴマー減少効果を比較したグラフ。oAβ：Aβオリゴマー 作製した各種CpG-ODNの神経保護作用を比較したグラフ。各CpG-ODNを添加した際の神経細胞の生存率を非添加の場合（左から２番目）と比較した。＊はコントロール（非添加）との間で有意差があることを表す。oAβ：Aβオリゴマー CpG-ODNとRVGペプチドが連結した構造体の構造。CpG-ODNと、C末端にシステインを付加したRVGペプチド（RVG-Cysペプチド）が連結している。連結部位は、RVG-Cysペプチドの中央部のシステイン位置とC末端に付加したシステイン位置の２箇所であり、２分子のCpG-ODNと１分子のRVG-Cysペプチドが連結した構造体（RVG-CpG）となる。CpG-ODNについては連結部（5'末端）のみを示し、その他を省略した。 アルツハイマー病モデルマウスを用いた恐怖条件付け学習試験の結果。RVG-Cys-127-5をアルツハイマー病モデルマウス（APP/PS1トランスジェニックマウス）に腹腔内投与し、認知機能障害の改善の程度を調べた。コントロールにはPBSを投与した。＊はコントロール（PBS）との間で有意差があることを表す。WT：同系の野生型マウス。APP/PS1：APP/PS1トランスジェニックマウス。 RVG-Cys-127-5のAβオリゴマー減少効果を示すグラフ。＊はコントロール（oAβ：RVG-Cys-127-5非添加）との間で有意差があることを表す。oAβ：Aβオリゴマー RVG-Cys-127-5の神経保護作用を示すグラフ。RVG-Cys-127-5を添加した際の神経細胞の生存率（右）を非添加の場合（中央）と比較した。＊はコントロール（cont：RVG-Cys-127-5非添加）との間で有意差があることを表す。cont：コントロール、oAβ：Aβオリゴマー RVG-Cys-127-5の抗酸化酵素HO-1産生効果を示すグラフ。＊はコントロール（oAβ：RVG-Cys-127-5非添加）との間で有意差があることを表す。oAβ：Aβオリゴマー
　本発明の第１の局面はアルツハイマー病治療薬に関する。本明細書において用語「治療薬」とは、標的の疾病ないし病態であるアルツハイマー病に対する治療的又は予防的効果を示す医薬のことをいう。治療的効果には、アルツハイマー病に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であることから、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、アルツハイマー病に特徴的な症状の再発を阻止ないし遅延することである。尚、アルツハイマーに対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、アルツハイマー病治療薬に該当する。
　本発明の有効成分は、CpGモチーフを含み且つホスホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドと狂犬病ウイルス糖蛋白由来RVGペプチドが連結した構造体又はその薬理学的に許容可能な塩である。即ち、本発明では所定のオリゴデオキシヌクレオチドとRVGペプチドが連結した構造の分子を有効成分とする。本発明の有効成分はミクログリアに対する特徴的な作用、即ち、ミクログリアの神経保護作用を増強する作用を示す。より具体的には、本発明の有効成分は神経傷害因子であるグルタミン酸、一酸化窒素及びTNF-αの産生を誘導することなくミクログリアのAβオリゴマー処理能を高め得る。当該作用は典型的にはミクログリア特異的である。ここでの用語「ミクログリア特異的」とは、ミクログリアに作用する一方で、他の細胞（特に末梢における単球、マクロファージ、B細胞、樹状細胞）に対しては実質的に作用しないか或いは作用するとしてもその程度が有意に低いことを意味する。
　一方、本発明の有効成分はミクログリアに作用し、抗酸化酵素ヘムオキシゲナーゼ１（HO-1）の産生を促し得る。この作用は、Aβオリゴマーによる活性酸素（ROS）の産生抑制に有効である。
（１）CpGオリゴデオキシヌクレオチド（CpG-ODN）
　本発明におけるオリゴデオキシヌクレオチドはCpGモチーフを含む。ここでの用語「モチーフ」とは特定の機能を有する特徴的な共通配列のことをいう。「CpGモチーフ」は、特定の6塩基（5'-プリン－プリン－CG－ピリミジン－ピリミジン-3'）で構成されるオリゴDNAである。本発明の一態様ではCpGモチーフ部分の配列としてgacgttが含まれることになる。
　CpGモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチドはその構造上の特徴によって３クラス、即ちAクラス、Bクラス及びCクラスに分類できる。AクラスのCpG-ODNではCpGモチーフ部分にはホスホジエステル結合が用いられる。AクラスのCpG-ODNは、形質細胞様樹状細胞（pDC）のIFN-α分泌を強く誘導する。その一方で形質細胞様樹状細胞の成熟化作用はそれほど強くなく、また、B細胞への作用は低い。BクラスのCpG-ODNは直線状であり、ホスホロチオエート骨格を有する。典型的には完全にホスホロチオエート修飾されている。BクラスのCpG-ODNは一般に、B細胞の増殖及び形質細胞様樹状細胞（pDC）の成熟化を強く誘導する一方、形質細胞様樹状細胞のIFN-α分泌は殆ど誘導しない。Cクラスは3'末端側にパリンドローム構造を有し、２本鎖を形成する。CクラスのCpG-ODNはB細胞及びNK細胞を活性化し、IFN-γを誘導する。
　好ましくは、特に強い神経保護作用を示したという事実（後述の実施例及びThe American Journal of Pathology. 175: 2121-2131, 2009を参照）、本発明ではBクラスのCpG-ODNを用いる。ホスホロチオエート修飾の位置及び程度（即ち、ホスホロチオエート結合の導入位置及び導入数）は限定されない。ホスホロチオエート修飾された部位は安定化し、ヌクレアーゼに対する分解抵抗性が向上することから、ホスホロチオエート修飾の程度は大きいほどよい。特に好ましくは、それを構成する全てのヌクレオチドがホスホロチオエート修飾されているBクラスのCpG-ODNを用いる。
　好ましくは、本発明におけるCpG-ODNはCpGモチーフの両側にそれぞれ１ないし数個のヌクレオチドが連結した構造を備える。換言すれば、CpGモチーフが末端に位置しない。CpGモチーフの5'側又は3'側に連結されるヌクレオチドの数は特に限定されないが、脳移行性を考慮すれば分子量は大きくない方がよい。CpGモチーフの5'側に連結されるヌクレオチドの数は好ましくは１～８個、更に好ましくは２～６個、一層好ましくは２～４個である。CpGモチーフの3'側に連結されるオリゴヌクレオチドの数についても同様である。
　上述の通り、脳移行性を考慮すればCpG-ODNの分子量は大きくない方がよい。そこで、CpG-ODNの全体の長さを好ましくは10～25ヌクレオチド長、更に好ましくは10～20ヌクレオチド長、より一層好ましくは10～14ヌクレオチド長とする。本発明において好ましいCpG-ODNの具体例を以下に示す。尚、配列中のSはホスホロチオエート結合（図１を参照）を表す。
　c S a S t S g S a S c S g S t S t S c S c S t（配列番号１）
　tc S gtc S gttttgtc S gttttgtc S gtt（配列番号２）
　前者のCpG-ODN（配列番号１）については、培養細胞を用いた実験に加え、アルツハイマー病モデル動物を用いた実験においてもその有効性が確認されており、特に好ましいCpG-ODNといえる。
　ホスホロチオエート修飾されたCpG-ODNは、固相シアノエチルホスホアミダイト法を利用した方法など、常法で合成すればよい（例えばJournal of the American ChemicalSociety 112:1253, 1990を参照）。合成したCpG-ODNの分離・精製には、例えば、逆相高速液体クロマトグラフィーを利用すればよい。
（２）狂犬病ウイルス糖蛋白由来RVGペプチド
　脳内への移行は血液脳関門により厳密に制御されている。本発明では脳移行性の付与のために狂犬病ウイルス糖蛋白由来のRVGペプチドを用いる。RVGペプチドの配列を以下に示す。本明細書では慣例の標記法に従い左端がアミノ末端（N末端）、右端がカルボキシ末端（C末端）となるようにペプチドを表記する。尚、狂犬病ウイルス糖蛋白由来ペプチドを利用したデリバリーシステムが報告されている（例えば、Nature 448:39-43, 2007； Nature Biotechnology 29:341-345, 2011を参照）。
　YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG（配列番号３）
　本発明において要求される特性（即ち、脳移行性の付与）を損なわない限りにおいて、RVGペプチドの構成アミノ酸の一部の改変や修飾が許容される。ここでの「一部の改変」とは、１～数個（上限は例えば３個、５個、７個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１～数個（上限は例えば３個、５個、７個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列に変異（変化）が生じていることをいう。また、「修飾」とは、基本構造（典型的には、配列番号３の配列からなるペプチド）の部分的な置換や他の分子の付加などによって、安定化を向上させたり、新たな機能を付加したりすることをいう。当業者であれば、周知ないし慣用の手段を用いて置換体などの修飾体をデザインすることができる。また、かかるデザインに基づき、周知ないし慣用の手段を用いて目的の修飾体を調製し、その性質や作用を調べることも当業者には容易である。
　ペプチド修飾体の例として、構成アミノ酸残基内の官能基が適当な保護基（アシル基、アルキル基、単糖、オリゴ糖、多糖など）によって保護されているもの、糖鎖が付加されているもの、N末端又はC末端が他の原子等で置換されることによってアルキルアミン、アルキルアミド、スルフィニル、スルフォニルアミド、ハライド、アミド、アミノアルコール、エステル、アミノアルデヒド等に分類される各種ペプチド誘導体、標識化ペプチド（例えばN末端がビオチン標識やFITC標識されたペプチド、蛍光色素で標識化されたペプチドなど）を挙げることができる。尚、保護基は、保護基を結合させるペプチド部位や使用する保護基の種類などに応じてアミド結合、エステル結合、ウレタン結合、尿素結合等によって連結される。
　本発明におけるペプチド（RVGペプチド又はその改変体や修飾体）は、公知のペプチド合成法（例えば固相合成法、液相合成法）を利用して製造することができる。尚、生体材料から抽出・精製することによって、本発明におけるペプチドを調製することもできる。
　本発明におけるペプチドを遺伝子工学的手法で調製してもよい。即ち、本発明におけるペプチドをコードする核酸を適当な宿主細胞に導入し、形質転換体内で発現されたペプチドを回収することによって、本発明におけるペプチドを調製することもできる。回収したペプチドは必要に応じて精製される。回収したペプチドを適当な置換反応に供し、所望の改変体に変換することもできる。
　本発明の有効成分である構造体ではCpG-ODNとRVGペプチドが連結している。連結には、核酸とペプチドの連結に適した各種手法を利用できる。一態様では、RVGペプチド中のシステイン位置において、ジスルフィド結合を介して、CpG-ODNを連結させる。このような連結にはJohn J. Turnerらが開発した方法を利用できる（例えば、Nucleic Acids Research, 33:27-42, 2005を参照）。当該方法では例えばチオール化修飾剤が使用され、その結果、炭素鎖を介したジスルフィド結合によって、CpG-ODNの5'末端側とRVGペプチドが連結されることになる（図２を参照）。使用する修飾剤によって炭素鎖の種類（直鎖又は分岐鎖、長さ）は変化し得る。炭素鎖の炭素数は例えばC3～C10である。但し、脳移行性を考慮すれば構造体を低分子化することが好ましいため、炭素鎖の長さをC3～C7程度にするとよい。
　本発明の一態様では、RVGペプチドのN末端又はC末端にシステインが付加されている。当該システインはCoG-ODNの連結に利用される。即ち、当該態様においてはRVGペプチド中のシステイン残基位置に加えて、末端システイン位置においてもCpG-ODNが連結される。即ち、２分子のCpG-ODNと１分子のRVGペプチドが連結した構造体が有効成分として用いられることになる。この場合において２分子のCpG-ODNは構造が同一である必要はない。但し、典型的には、同一構造のCpG-ODNを２分子用いて当該構造体を形成する。尚、C末端にシステインを付加したRVGペプチドの配列を以下に示す
　YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGC（配列番号４）
　N末端側又はC末端側に更に１～数個のシステインを付加することにしてもよい。このように追加で付加するシステインの数は特に限定されないが、例えば１～１０個である。付加されたシステインの一部又は全部はCpG-ODNとの結合に供される。これによって、RVGペプチドの分子数に対するCPG-ODNの分子数の比率が増大した構造体（例えば１分子のRVGペプチドと３～１０分子のCPG-ODNが連結した構造体）を形成できる。尚、RVGペプチドのN末端側又はC末端側に直接システインを付加するのではなく、他のアミノ酸を間に介在させた状態でシステインを付加することにしてもよい。二以上のシステインを追加で付加する場合にも各システイン残基の間に他のアミノ酸を介在させることにしてもよい。
　本発明の治療薬の有効成分として上記構造体の薬理学的に許容される塩を用いても良い。「薬理学的に許容される塩」とは例えば、酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、又はアミノ酸付加塩である。酸付加塩の例としてはトリフルオロ酢酸塩塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩などの無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩が挙げられる。金属塩の例としてはナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩が挙げられる。アンモニウム塩の例としてはアンモニウム、テトラメチルアンモニウムなどの塩が挙げられる。有機アミン付加塩の例としてはモルホリン付加塩、ピペリジン付加塩が挙げられる。アミノ酸付加塩の例としてはグリシン付加塩、フェニルアラニン付加塩、リジン付加塩、アスパラギン酸付加塩、グルタミン酸付加塩が挙げられる。これらの塩の調製は慣用手段によって行なうことができる。
　本発明の治療薬の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、緩衝剤、賦形剤、崩壊剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水、担体など）を含有させることができる。緩衝剤としてはリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などを用いることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。
　製剤化する場合の剤型も特に限定されない。剤型の例は注射剤、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤及びシロップ剤である。
　本発明の治療薬には、期待される治療効果（又は予防効果）を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。本発明の治療薬中の有効成分量は一般に剤型によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約０．００１重量％～約９５重量％の範囲内で設定する。
　本発明の治療薬はその剤型に応じて経口投与又は非経口投与（静脈内、動脈内、皮下、皮内、筋肉内又は腹腔内注射、経皮、経鼻、経粘膜など）によって対象に適用される。これらの投与経路は互いに排他的なものではなく、任意に選択される二つ以上を併用することもできる（例えば、経口投与と同時に又は所定時間経過後に静脈注射等を行う等）。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい一態様では本発明の治療薬はヒトに対して適用される。
　本発明の治療薬の投与量は、期待される治療効果が得られるように設定される。治療上有効な投与量の設定においては一般に患者の症状、年齢、性別、及び体重などが考慮される。尚、当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。例えば、成人（体重約60kg）を対象として一日当たりの有効成分量が約10μg～約100μg、好ましくは約20μg～約50μgとなるよう投与量を設定することができる。投与スケジュールとしては例えば１日１回～数回、２日に１回、或いは３日に１回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、患者の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。
　本発明の有効成分である構造体はミクログリアの神経保護作用を増強することから、アルツハイマー病以外の神経変性疾患（例えばパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病）への適用の可能性も秘め、それ自体が有用且つ高い価値を有する。また、当該構造体は、アルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患に対する医薬・薬剤の開発にけるシーズ化合物としても有用である。
　トル様受容体9（TLR9）のリガンドであるCpG-ODNの有用性に注目し、新規アルツハイマー病治療法の開発を目指した。
１．CpG-ODNの最適化
　アルツハイマー病に対して有効性を示したCpG-ODN（CpGサブタイプB：5’-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3’（配列番号５））を基に、直線構造を有するODNをデザインすることにした。また、核酸分解酵素による分解を阻止するため修飾を施すことにした。
２．作製したCpG-ODNの有効性の検討
　作製したCpG-ODNについて、次の方法で有効性を評価した。まず、MTSアッセイにより、培養ミクログリアを活性化するCpG-ODNを選択する。一方、ニューロン、ミクログリア共培養下、作製したCpG-ODN (1, 10 , 100 nM)を投与した後、5μMのAβオリゴマーを添加し、24時間後の神経細胞死を検出・評価する。免疫染色にて70%以上の生存率を示すものを選択する。次に、培養ミクログリアに対して、選択したCpG-ODNを添加後、5μMのAβオリゴマーを加え、24時間後のAβオリゴマーがELISA法による定量にて40%以上減少するものを選択する。
　MTSアッセイ検討の結果を図３に示す。６種のCpG-ODN（127-1、127-2、127-3、127-4、127-5、2006）の結果を比較した。127-1、127-2、127-5が高い活性化能を示した。特に有効性が高いと判断された127-5は全体にホスホロチオエート修飾されている。127-2についても一部にホスホロチオエート修飾が施されている。これら二つのCpG-ODNの配列を以下に示す。尚、配列中のSはホスホロチオエート結合を表す。
　127-5：c S a S t S g S a S c S g S t S t S c S c S t（配列番号１）
　127-2：tc S gtc S gttttgtc S gttttgtc S gtt（配列番号２）
　各CpG-ODNのAβオリゴマー減少効果（ELISA法の結果）を図４に示す。また、神経細胞死に対する効果（免疫染色による生存率の評価）を図５に示す。127-1、127-2及び127-5がAβオリゴマーを効果的に減少させ、神経保護作用を示すことがわかる。
３．脳移行性CpG-ODNの作成（脳移行性ペプチドの付加）
　有効性を認めたCpG-ODN（127-1、127-2、127-4、127-5）に狂犬病ウイルス糖蛋白由来のRVGペプチド（YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNG（配列番号３））を付加することで脳移行性を付与することにした。まず、RVGペプチドのC末端にシステイン（Cys）を付加した脳移行性RVG-Cysペプチド（YTIWMPENPRPGTPCDIFTNSRGKRASNGC（配列番号４））を用意した。次にRVG-Cysペプチドのシステイン残基をピリジル化した後、適切な濃度条件下で5'チオール化CpG-ODNと混合し置換反応を行った。得られた反応物について逆相HPCL法にて精製を行った。
　以上の操作によって、RVG-Cysペプチド中の２箇所のシステイン位置において、CpG-ODNが炭素鎖及びジスルフィド結合を介して連結した構造体（RVG-CpG）を得た（図６）。
４．脳移行性CpG-ODN（RVG-CpG）の有効性の検証（アルツハイマー病モデルマウスによる検討）
　２．の検討によって有効性が最も高いと判断された127-5を用いて作製した脳移行性CpG-ODN（RVG-Cys-127-5）の治療効果を検討した。検討にはアルツハイマー病モデルマウス（APP/PS1トランスジェニックマウス（ジャクソンラボラトリー））を用いた恐怖条件付け学習試験（連合学習）を採用した。試験方法を簡単に説明すると、アルツハイマー病モデルマウスに対してRVG-Cys-127-5を１回あたり1μgの投与量で隔日、腹腔内投与した（合計３回）。全投与終了2日目にマウスを試験箱に入れ、電気刺激のみ又は電気刺激と音刺激を与え、条件付けを行う。翌日、箱に入れただけの場合と、さらに音刺激を加えた場合のすくみ行動を評価し定量化する。アルツハイマー病モデルマウスでは、すくみ行動が減少するが、RVG-Cys-127-5投与群では有意にすくみ行動が増加し認知機能が改善したことが確かめられた。一方、２．での評価法に準じ、培養細胞を用いた検討も行った。また、以下の方法によって、Aβオリゴマー存在下における酸化酵素HO-1の産生促進作用も調べた。Aβオリゴマー存在下で培養ミクログリアにRVG-Cys-127-5を投与し、24時間後、細胞を破砕し、HO-1 ELISAキットを用いてHO-1蛋白を定量した。
　恐怖条件付け学習試験の結果を図７に示す。RVG-Cys-127-5の投与によって認知機能障害が有意に改善された。培養細胞を用いた実験では、RVG-Cys-127-5はAβオリゴマー量を有意に減少させ（図８）、神経細胞の生存率を有意に高め（図９）、更には神経保護に作用するHO-1の産生を促した（図１０）。以上の結果は、アルツハイマー病に対してRVG-Cys-127-5が有効であることを示す。
５．まとめ
　脳移行性及び安定性に優れた新規分子、即ち機能性核酸（RVG-CpG）の合成に成功した。当該分子は神経保護作用を示し、末梢投与でアルツハイマー病モデル動物の認知能を有意に改善させた。この事実は当該分子がアルツハイマー病に有効であることを示す。また、他の神経変性疾患への適用の可能性を強く示唆する。当該分子を基に、更なる薬効の向上を目指した新規薬剤の開発も期待される。
　一方、以上の実験結果は、新規分子の合成に際して採用した手法（安定化のためのホスホロチオエート修飾、及び脳移行性付与のためのRVGペプチドの連結）の有効性も裏付ける。RVGペプチドの応用としては、RVGペプチドに9個のリジンを付加し、siRNAと電気的に結合させて投与するという、Kumarらの例（Nature 448:39-43, 2007）が有名である。対照的に、今回合成に成功した新規分子ではペプチドと核酸をS-S結合を利用して連結しており、安定性が高く、合成コストは低い。実用化する上でこれらの特徴も重要である。
　本発明の有効成分である新規RVG-CpG構造体は脳移行性及び安定性に優れ、ミクログリアの神経保護作用を増強することで薬効を発揮する。アルツハイマー病への適用に限らず、その他の神経変性疾患（例えばパーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病）への適用も大いに期待される。アルツハイマー病をはじめとする神経変性疾患に対する医薬・薬剤を開発するためのシーズ化合物として当該構造体を利用することも想定される。
　この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
　配列番号１：人工配列の説明：CpGオリゴデオキシヌクレオチド
　配列番号２：人工配列の説明：CpGオリゴデオキシヌクレオチド
　配列番号５：人工配列の説明：CpGオリゴデオキシヌクレオチド

Claims (20)

  1. 　CpGモチーフを含み且つホスホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドと、狂犬病ウイルス糖蛋白由来RVGペプチドと、が連結した構造体又はその薬理学的に許容可能な塩を含む、アルツハイマー病治療薬。
  2. 　前記構造体は、ミクログリアの神経保護作用を増強する作用を示す、請求項１に記載のアルツハイマー病治療薬。
  3. 　前記作用はミクログリア特異的である、請求項２に記載のアルツハイマー病治療薬。
  4. 　前記オリゴデオキシヌクレオチドがCpG Bクラスである、請求項１～３のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
  5. 　前記CpGモチーフがgacgttからなる、請求項１～４のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
  6. 　前記オリゴデオキシヌクレオチドは、CpGモチーフの両側にそれぞれ１ないし数個のヌクレオチドが連結した構造を備える、請求項１～５のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
  7. 　前記オリゴデオキシヌクレオチドが10～20ヌクレオチド長である、請求項６に記載のアルツハイマー病治療薬。
  8. 　前記オリゴデオキシヌクレオチドが10～14ヌクレオチド長である、請求項６に記載のアルツハイマー病治療薬。
  9. 　前記オリゴデオキシヌクレオチドが配列番号１の配列からなる、請求項６に記載のアルツハイマー病治療薬。
  10. 　前記オリゴヌクレオチドは、それを構成する全てのヌクレオチドがホスホロチオエート修飾されている、請求項１～９のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
  11. 　前記オリゴデオキシヌクレオチドと前記RVGペプチドは、前記RVGペプチド中のシステイン残基位置においてジスルフィド結合を介して連結している、請求項１～１０のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
  12. 　前記オリゴデオキシヌクレオチドの5'末端に前記RVGペプチドが連結している、請求項１～１１のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
  13. 　前記RVGペプチドのN末端又はC末端にはシステインが付加されており、該システイン位置にも前記オリゴデオキシヌクレオチドが連結している、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
  14. 　２分子の前記オリゴデオキシヌクレオチドと１分子の前記RVGペプチドが連結している、請求項１３に記載のアルツハイマー病治療薬。
  15. 　前記RVGペプチドが配列番号３の配列からなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬。
  16. 　アルツハイマー病治療薬の製造のための、請求項１～１５のいずれか一項に定義される構造体の使用。
  17. 　請求項１～１５のいずれか一項に記載のアルツハイマー病治療薬の治療上有効量をアルツハイマー病患者に投与するステップを含む、アルツハイマー病の治療法。
  18. 　配列番号１の配列からなりホスホロチオエート修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドと、配列番号３の配列からなる狂犬病ウイルス糖蛋白由来RVGペプチドとが、該RVGペプチド中のシステイン残基位置でジスルフィド結合を介して連結してなる構造体。
  19. 　前記RVGペプチドのN末端又はC末端にはシステインが付加されており、該システイン位置にも前記オリゴデオキシヌクレオチドが連結している、請求項１８に記載の構造体。
  20. 　前記オリゴヌクレオチドは、それを構成する全てのヌクレオチドがホスホロチオエート修飾されている、請求項１８又は１９に記載の構造体。
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