WO2012133450A1 - ソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法 - Google Patents

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soft
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檜山　聡
香織 栗林
弘晃 尾上
昌治 竹内
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株式会社 エヌ・ティ・ティ・ドコモ
国立大学法人 東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a microarray of soft material.
  • the present invention relates to a method for producing a microarray of a plurality of types of soft materials on the same substrate.
  • soft material may be derived from living organisms or non-living organisms, and polymers, gels, rubbers, colloids, micelles, liquid crystals, and various types in which small molecules are connected (or assembled) in various forms.
  • biopolymers nucleic acids such as DNA and RNA, proteins, carbohydrates, glycoproteins, etc.
  • Non-Patent Document 1 discloses a technique for forming a single type of soft material on a substrate in a general-purpose and scalable manner, but a technique for arraying different types of soft materials on the same substrate is disclosed. Not disclosed.
  • Non-Patent Document 2 discloses that a micropattern is formed on a polyparaxylylene resin vacuum-deposited on a substrate to form a stencil, and a plurality of types of soft materials are ejected onto the stencil in an ink jet printing manner to produce polyparaxylylene.
  • a technology is disclosed in which a lenic resin is peeled off from a substrate to produce a plurality of types of soft material microarrays on the same substrate.
  • this technique not only requires a high-performance spotter capable of discharging a soft material as an additional dedicated device, but also has a problem that the spot interval depends on the performance of the spotter. That is, depending on the performance of the spotter, in order to avoid contamination (unintentional mixing) between different types of soft materials, there is a problem that the spot interval for arraying different types of soft materials is limited.
  • Non-Patent Document 3 a micropattern is formed on a two-layer polyparaxylylene resin vacuum-deposited on a substrate to form a stencil, and a soft material is injected on the stencil to form a two-layer polyparaxylylene.
  • a technique is disclosed in which a plurality of different types of soft material microarrays are fabricated on the same substrate by peeling the resin one by one from the substrate one after another.
  • this technology has a problem that it cannot exclude the possibility of contamination between different types of soft materials.
  • Non-Patent Document 4 a micropattern is formed on a single layer of polyparaxylylene resin vacuum-deposited on a substrate to form a stencil, and a plurality of microchannels are formed on the stencil,
  • a technique for producing a microarray of a plurality of types of soft materials on the same substrate by injecting different types of soft materials and peeling the polyparaxylylene resin from the substrate.
  • this technology is unlikely to cause contamination, it is a method of connecting a micro flow path to each spot of the microarray, so the spot interval for arraying different types of soft materials cannot be set to a desired size, and is larger. There is a problem that it is difficult to produce an array of areas.
  • the present invention is a method for producing a soft material small-interval microarray using a polyparaxylylene resin lift-off method, which is versatile and scalable without contamination of multiple types of soft materials on the same substrate.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing a microarray of a plurality of types of soft materials.
  • the present inventor has obtained (i) (for example, a polyparaxylylene resin lift-off method).
  • the obtained soft material on the substrate is dehydrated without being denatured (by lyophilization etc.), so that the normal polyparaxylylene resin lift-off method can be applied to the substrate, and (ii) the soft material
  • the present inventors have found that the polyparaxylene resin deposited thereon can be smoothly peeled off from the substrate without impairing the fixing state, structure, and function of the soft material.
  • the present invention is a method for producing a microarray of a plurality of types of soft materials, a first layer of polyparaxylylene resin is vapor-deposited on a substrate, and a first micropattern is formed on the polyparaxylylene resin.
  • a first soft material solution is introduced to form a first microarray on the substrate surface, and the first soft material is lyophilized to form a first soft material microarrayed substrate.
  • the second layer of polyparaxylylene resin is deposited on the microarrayed substrate of the first soft material and laminated, and the first layer and the second layer of polyparaxylylene resin are penetrated.
  • a plurality of types of soft materials can be used on a single substrate for general purpose and scalable, without using a spotter, and with a small interval microarray. Can be produced.
  • the microarray manufacturing procedure according to the present invention not only two types of soft materials but also two or more types of soft materials can be manufactured.
  • the microarray substrate on which the lyophilized soft material is immobilized can be stored and delivered for a long time at room temperature or low temperature, and can be easily used simply by introducing a buffer solution when the user uses the substrate. be able to.
  • FIG. 1 is a diagram conceptually showing a method according to an embodiment of the present invention.
  • a method for producing a microarray of a plurality of types of soft materials according to an embodiment of the present invention uses a so-called conventional polyparaxylylene resin lift-off method, and a polyparaxylylene resin known so far Includes the lift-off method or its various applications.
  • the method according to the embodiment of the present invention is not particularly limited with respect to conditions, materials, apparatuses, reaction conditions, and the like of a normal polyparaxylylene resin lift-off method.
  • a first layer of polyparaxylylene resin is deposited on a substrate, and the first layer of polyparaxylylene resin is subjected to a first process.
  • Such a process is a process of applying a conventional polyparaxylylene resin lift-off method, and the obtained substrate has the first microarray formed (immobilized) thereon.
  • shape etc. There is no restriction
  • the first soft material introduced is usually fixed on the substrate in the form of an aqueous solution or an appropriate solution.
  • the soft material is fixed to the board
  • the substrate surface is not particularly required to be modified to promote the binding with the soft material, but in some cases, a treatment for strengthening the binding with the soft material may be performed.
  • the method according to the embodiment of the present invention includes the step of lyophilizing the obtained first soft material to obtain a microarrayed substrate of the first freeze-dried soft material. .
  • the first soft material fixed to the substrate is freeze-dried.
  • “freeze-drying” is widely used as “from the soft material on the substrate. , Removing moisture and drying so that the structure and function of the soft material are not irreversibly denatured ”. Accordingly, the presence or absence of cooling, the presence or absence of a freezing buffer such as sucrose or trehalose, the presence or absence of a vacuum operation, etc. can be appropriately selected depending on the soft material on the lyophilized substrate.
  • the “freeze drying” can be performed on all or a part of the soft material on the substrate, or on the entire substrate.
  • the second-layer polyparaxylylene resin is again deposited on the substrate. Then, a second micropattern is formed on the second-layer polyparaxylylene resin.
  • the polyparaxylylene resin vapor deposition of the second layer is carried out including the surface of the first soft material fixed on the substrate and freeze-dried. Such vapor deposition is possible under the normal conditions of polyparaxylylene resin vapor deposition, and will be described below. Moreover, no damage such as modification is observed not only on the surface of the first soft material but also inside the vapor deposition. This is considered to be because the first soft material fixed on the substrate is sufficiently dried.
  • the condition of the normal polyparaxylylene resin lift-off method already described above can be applied as it is to form the second micropattern on the second-layer polyparaxylylene resin.
  • the second micropattern formed on the polyparaxylylene resin of the second layer is provided with the first and second soft material microarrays on the same surface of the substrate.
  • the second micropattern is formed on a substrate at a location different from the first micropattern by penetrating the second layer of polyparaxylylene resin.
  • the method according to the embodiment of the present invention further introduces a solution containing the second soft material into the second micropattern of the obtained second-layer polyparaxylylene resin, so that the second on the substrate.
  • the microarray is formed (immobilized). This step may be the same method as the introduction of the solution containing the first soft material above.
  • a polyparaxylylene resin is obtained from the substrate on which the obtained second microarray is formed (immobilized).
  • the microarray of the first and second soft materials can be manufactured on the same surface of the substrate.
  • the first soft material is in a dry state
  • the second soft material is in a solution (wet) state. If necessary, the whole is freeze-dried again to make the first and second soft materials dry, or a buffer solution or the like is injected to make the first and second soft materials wet. be able to. By freeze-drying the whole, it becomes possible to store at room temperature or low temperature.
  • the first polyparaxylylene resin is deposited on the substrate on which the first soft material is fixed and freeze-dried as a target for the second-layer polyparaxylylene resin deposition.
  • the embodiment of the present invention is not limited to this.
  • the first polyparaxylylene layer peeled off is freeze-dried, and the first soft material is introduced and fixed to the substrate.
  • the target is also freeze-dried and then peeled off the first polyparaxylylene layer.
  • a first layer of polyparaxylylene resin is vacuum-deposited on a substrate (FIG. 2A (a)).
  • the substrate may be a material that can fix a soft material and can withstand polyparaxylylene vapor deposition conditions. Examples thereof include glass, silicon, and plastic. When using a microarray, if it is preferable to be light-transmitting for the purpose of measurement or the like, glass that is light-transmitting is preferable.
  • the method for fixing the soft material to the surface of the substrate is not particularly limited. However, if necessary, the substrate surface can be subjected to a treatment for promoting the fixation in order to obtain stronger fixation.
  • the type of polyparaxylylene resin to be deposited is not particularly limited, but here, explanation will be made by taking parylene C (Japan Parylene Godo Kaisha) as an example. Other types of parylene N, parylene D, and parylene HT can also be selected as appropriate. (Both are available at Japan Parylene LLC).
  • the vapor deposition thickness of the polyparaxylylene resin is not particularly limited as long as a pattern having a structure in which a soft material is sufficiently introduced in a later step is formed. Specifically, it is desirable if it is 2 ⁇ m or less. Here, the description will be made by taking the case of vapor deposition with a thickness of 1 ⁇ m as an example.
  • a photoresist is laminated on the deposited polyparaxylylene resin (FIG. 2A (b)).
  • S1818 Silicone Far East Ltd.
  • the lamination method is not particularly limited, and an ordinary method such as spin coating is preferable.
  • photolithography is performed by ultraviolet irradiation through a glass photomask on which the first micropattern is drawn (FIG. 2A (c)), and further development of the photoresist is performed (FIG. 2A (d)).
  • the developer can be selected in combination with the photoresist used. For example, when S1818 is used as the photoresist, NMD-3 (available from Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) can be used as the developer.
  • dry etching with oxygen plasma is performed to draw a first micro pattern on the polyparaxylylene resin (FIG. 2A (e)).
  • photolithography by ultraviolet irradiation and dry etching by oxygen plasma have been described as examples.
  • the present invention is not limited to this, and may be lithography by an electron beam, for example.
  • a flow cell is formed on the micro-patterned first-layer polyparaxylylene resin (FIG. 2A (g)).
  • the flow cell is manufactured by using, for example, a silicon rubber sheet as a spacer and sandwiching it with a cover glass.
  • a solution containing a first soft material for which a microarray is to be produced is injected into the flow cell, and the first microarray is introduced and formed on the exposed glass substrate surface.
  • biotinylated BSA bovine serum albumin
  • 1 mg / mL streptavidin 1 mg / mL streptavidin
  • 5 ⁇ M biotinylated single-stranded DNA 23 base length, fluorescent dye FITC (fluorescein isothiocyanate) modification
  • the solution in the flow cell is replaced with a salt-free solution such as ultrapure water or distilled water.
  • a salt-free solution such as ultrapure water or distilled water.
  • the entire substrate including the flow cell is freeze-dried (as it is) using a freeze-drying apparatus (FIG. 2A (h)). Furthermore, after the solution containing the first soft material is completely dried, the flow cell is disassembled (FIG. 2A (h ′)). Here, the whole substrate not including the flow cell may be freeze-dried after the flow cell is disassembled.
  • a second layer of polyparaxylylene resin is vacuum-deposited and laminated to a thickness of, for example, 1 ⁇ m on the freeze-dried substrate under the same conditions and procedures as the first layer (FIG. 2B (i).
  • a photoresist such as S1818 is spin-coated and laminated (FIG. 2B (j)).
  • the baking condition of the photoresist may be a high temperature for a short time (for example, 100 ° C. for 1 minute) or a low temperature in consideration of the properties (for example, heat sensitivity) of the first lyophilized soft material.
  • a long time for example, 3 hours at 35 ° C. or conditions for combining them can be selected.
  • photolithography is performed by ultraviolet irradiation through a glass photomask on which a second micropattern is drawn (FIG. 2B (k)), and photoresist development is performed using NMD-3 (FIG. 2B (l)). .
  • the dry etching conditions for penetrating the first and second polyparaxylylene resins are not particularly limited, depending on the thickness of the first and second polyparaxylylene resins, for example, It can be easily selected by adjusting the etching time.
  • a solution containing the second soft material for which a microarray is to be produced is injected into the flow cell, and the second microarray is formed on the exposed glass substrate surface.
  • the second soft material 4 mg / mL biotinylated BSA, 1 mg / mL streptavidin, 5 ⁇ M biotinylated single-stranded DNA (23 base length, modified with fluorescent dye TMR (tetramethylrhodamine)) is the second soft material.
  • TMR fluorescent dye
  • the polyparaxylylene resin of the first layer and the second layer is peeled off simultaneously (FIG. 2B (p)).
  • the polyparaxylylene resin of the first layer and the second layer is easily peeled off at the same time by peeling off a part thereof with tweezers, for example.
  • FIG. 3 shows an example of the result of observation of the microarray produced by the above procedure with a fluorescence microscope.
  • FIG. (I) First, two different soft materials are fixed on the glass substrate to a sufficient extent for the following various treatments.
  • two different types of soft materials (labeled proteins constructed by combining the functions of a plurality of proteins, respectively) should function without being denatured.
  • two different types of soft materials (labeled proteins constructed by combining the functions of a plurality of proteins, respectively) should function without being denatured.
  • the FITC-modified single-stranded DNA as the first soft material and the TMR-modified single-stranded DNA as the second soft material are microarrayed on the same substrate without contamination. .
  • the arraying is microscale and the spacing between the spots forming the array is sufficiently well separated.
  • FIG. 4 is a fluorescence microscope observation image showing a result of an experiment for verifying whether the microarrayed single-stranded DNA (soft material) according to the embodiment of the present invention has the ability to form double strands. is there.
  • FIG. 4 confirms that the single-stranded DNA microarrayed by the method according to the embodiment of the present invention that has undergone the freeze-drying process retains its ability to form double strands, and is subjected to denaturation and the like. I understand that it is not. That is, the single-stranded DNA of the base sequence A that has undergone the freeze-drying process
  • the complementary strand specifically binds only to the spot where the single-stranded DNA of the base sequence A is immobilized (FIG. 4c), and the ability to form a double-stranded single-stranded DNA after lyophilization. was confirmed to be retained.
  • FIG. 5 is a fluorescence microscope observation image showing a result of a verification experiment on whether the microarrayed protein according to the embodiment of the present invention retains its functionality.
  • kinesin which is a motor protein
  • kinesin which is a motor protein
  • a kinesin microarray was prepared by peeling off the polyparaxylylene resin. The surface of the glass substrate outside the kinesin spot was coated with 5 mg / mL casein to suppress nonspecific adsorption.
  • microtubules labeled with the fluorescent dye TMR were introduced, the microtubules landed specifically only at spots where kinesin was immobilized, and microarrays of microtubules were formed (FIG. 5a).
  • the soft material (kinesin) obtained by performing the freeze-drying process in the manufacturing process according to the embodiment of the present invention retains the ability to bind to microtubules, and also slides the microtubules on a glass substrate. It has the activity to make it.
  • the microarray manufacturing method according to the embodiment of the present invention can be applied to DNA and proteins.
  • the embodiment of the present invention is not limited to DNA and protein, and any soft material such as RNA (ribonucleic acid), lipid, and microbeads can be used.
  • the manufacturing method according to the embodiment of the present invention includes a step of freeze-drying the soft material, this does not exclude application to the soft material in which the embodiment of the present invention is difficult to freeze-dry.
  • Some soft materials such as liposomes and cells that are lipid bilayer capsules, are not suitable for lyophilization, but by chemically modifying these surfaces with single-stranded DNA, biotin, antibodies, etc., It is also possible to produce a microarray. Methods for modifying DNA on liposomes and cell surfaces are disclosed, for example, in References 1 and 2 below, methods for biotinylation modification in Reference 3 and methods for antibody modification in Reference 4, respectively.

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Abstract

　ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を用いて複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法は：基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第１層目のポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、第１のマイクロアレイが形成された基板を得、続いて第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、凍結乾燥した第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板を得る工程と、係る凍結乾燥した第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板上に第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、第２のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、基板上に第２のマイクロアレイを形成する工程と、前記第１及び第２のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを形成させる工程を有する。

Description

ソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法
　本発明は、ソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法に関する。特に本発明は、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを、同一基板上に作製する方法に関する。
　近年、医療・診断の分野又は分子細胞生物学研究の分野において、タンパク質、DNA（デオキシリボ核酸）又は細胞などの解析、機能評価又はそれらの相互作用解析を、より定量的で再現性よく、かつ迅速に測定・観察する方法・装置が求められてきている。そのひとつの技術として、ガラスなどの基板上に、ソフトマテリアルのアレイを、マイクロメートルからナノメートルスケールで作製する様々な技術が提案されている。ここで「ソフトマテリアル」とは、生物由来又は非生物由来であってもよく、小さな分子が種々の形でつながった（又は集合した）高分子、ゲル、ゴム、コロイド、ミセル、液晶、及び種々の生体高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、タンパク質、糖質、糖タンパク等）を広く意味する。
　係る技術の一つとして、ポリパラキシリレン樹脂（poly(para-xylylene)）をパターニングすることでステンシル（型抜き）とし、ソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する手法が注目を集めている。非特許文献１には、基板上に真空蒸着したポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成して、ステンシルとしてそのステンシル上にソフトマテリアルを注入して、その後ポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がして、基板上にソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する技術が開示されている（いわゆる「ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法」）。しかし非特許文献１には、基板上に１種類のソフトマテリアルを汎用的かつスケーラブルにマイクロアレイ化する技術は開示されているが、異なる複数種類のソフトマテリアルを、同一基板上にアレイ化する技術は開示されていない。
　一方、ポリパラキシリレン樹脂を利用する技術であって、複数種類のソフトマテリアルを基板上にマイクロアレイ化する技術もいくつか知られている。
　例えば、非特許文献２には、基板上に真空蒸着したポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上に複数種類のソフトマテリアルをインクジェットプリント式に吐出してポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がして、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。しかしこの技術では、ソフトマテリアルを吐出可能な高性能スポッターが追加専用機器として必要となるだけでなく、スポット間隔がスポッターの性能に依存するという問題がある。すなわちスポッターの性能に依存して、異なる種類のソフトマテリアル間のコンタミネーション（意図しない混合）を避けるためには異なる種類のソフトマテリアルをアレイ化するスポット間隔が制限されるという問題がある。
　また、非特許文献３には、基板上に真空蒸着した２層のポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上にソフトマテリアルを注入して２層のポリパラキシリレン樹脂を基板から順々に１枚ずつ引き剥がすことで、異なる複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。しかしこの技術では、異なる種類のソフトマテリアル間でコンタミネーションが生じる可能性を排除できないという問題がある。
　さらに、非特許文献４には、基板上に真空蒸着した１層のポリパラキシリレン樹脂にマイクロパターンを形成してステンシルとし、そのステンシル上に複数のマイクロ流路を形成し、流路毎に異なる種類のソフトマテリアルを注入してポリパラキシリレン樹脂を基板から引き剥がすことで、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを同一基板上に作製する技術が開示されている。この技術はコンタミネーションを生じる可能性は少ないが、マイクロアレイの各スポットにマイクロ流路を接続する方法であるため、異なる種類のソフトマテリアルをアレイ化するスポット間隔を望ましい大きさにできず、さらに大面積のアレイを作製することも難しいという問題がある。
B. Ilic, et al., "Topographical Patterning of Chemically Sensitive Biological Materials Using a Polymer-Based Dry Lift Off," Biomedical Microdevices, vol.2, pp.317-322, 2000. C. P. Tan, et al., "Nanoscale Resolution, Multicomponent Biomolecular Arrays Generated by Aligned Printing with Parylene Peel-Off," Nano Letters, vol.10, pp.719-725, 2010. K. Kuribayashi, et al., "Sequential Parylene Lift-Off Process for Selective Patterning of Biological Materials," Proc. IEEE MEMS'07, pp.501-504, 2007. K. Atsuta, et al., "A Parylene Lift-Off Process with Microfluidic Channels for Selective Protein Patterning," Journal of Micromechanics and Microengineering, vol.17, pp.496-500, 2007.
　本発明は、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を用いてソフトマテリアルの小間隔のマイクロアレイを作製する方法であって、同一基板上に、複数種類のソフトマテリアルをコンタミネーションさせることなく、汎用的かつスケーラブルに、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法、を提供することを課題とする。
　本発明者は、前記従来技術の問題点のない、複数種類のソフトマテリアルを同一基板上にマイクロアレイ化するための方法を鋭意追求した結果、(i)（例えば、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により得られた）基板上のソフトマテリアルを、（凍結乾燥などにより）変性させることなく脱水することにより、その基板に対して通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法が適用でき、さらに(ii)ソフトマテリアル上に堆積したポリパラキシリレン樹脂が、ソフトマテリアルの固定状態・構造・機能を損なうことなく、スムーズに基板から引き剥がすことができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、基板上に、第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、前記第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がして、前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する又は第２のソフトマテリアルを凍結乾燥することで、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法である。
　さらに、本発明の方法を繰り返すことにより、望ましい種類の異なるソフトマテリアルのマイクロアレイが製造される。
　本発明によれば、ポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により、同一基板上に、複数種類のソフトマテリアルを、コンタミネーションさせることなく、汎用的かつスケーラブルに、スポッターを用いることなく、小さな間隔のマイクロアレイを作製することができる。また、本発明によるマイクロアレイ作製手順を繰り返すことで、２種類のソフトマテリアルに限らず、２種類以上のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製することができる。さらに、凍結乾燥させたソフトマテリアルを固定化したマイクロアレイ基板は、室温または低温で長期保存・配送することができ、使用者が当該基板を使用する際に緩衝溶液を導入するだけで容易に使用することができる。
本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の概念図である。 本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の手順詳細を示した図である。 本発明の一実施形態としてのソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法の手順詳細を示した図である。 異なる塩基配列と蛍光色素を有する一本鎖ＤＮＡのマイクロアレイ作製結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。 凍結乾燥した一本鎖ＤＮＡの二本鎖形成能の検証結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。 凍結乾燥したモータータンパク質キネシンの活性の検証結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
　以下、図面を参照して、本発明の良好な実施の形態を説明するが、本発明はこれらの実施態様に制限されるものではない。
　図１は、本発明の実施の形態に係る方法を概念的に示す図である。本発明の実施の形態に係る、複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法は、いわゆる従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を利用するものであり、これまで知られているポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法又はその種々の応用方法を含む。本発明の実施の形態の方法は、通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法の条件、材料、装置、反応条件等について特に限定されることはない。
　図１に示される通り、本発明の実施の形態に係る方法はまず、基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第１層目のポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、第１のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、第１のマイクロアレイが形成された（固定化された）基板を得る工程を含む。係る工程は、従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法を適用する工程であり、得られる基板は、その上に第１のマイクロアレイが形成された（固定化された）ものである。ここで本発明の実施の形態においては、パターン化された個々のマイクロアレイの形状、個々のソフトマテリアルの大きさ、及び個々のソフトマテリアル間の距離等（以下「形状等」とする）については、特に制限はなく、従来のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法により設計可能な形状等にすることができる。通常、マイクロメータサイズ、又はナノメータサイズに設計することが容易である。
　前記導入された第１のソフトマテリアルは通常、水溶液又は適当な溶液の形で基板上に固定されている。また、導入方法には特に制限はなく、第１のソフトマテリアルの水溶液又は適当な溶媒の溶液を基板の上に一部又は全体に導入して基板表面にソフトマテリアルを固定する。その後、固定されなかった余分のソフトマテリアルの水溶液等を洗い流すことができる。基板表面には特にソフトマテリアルとの結合を促進する修飾は必要ないが、場合により、ソフトマテリアルとの結合を強くする処理がなされていてもよい。
　本発明の実施の形態に係る方法は続いて、前記得られた第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、凍結乾燥した第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板を得る工程を有するものである。本発明の実施の形態においては、基板に固定された第１のソフトマテリアルを凍結乾燥するものであるが、本発明の実施の形態においては「凍結乾燥」には広く「基板上のソフトマテリアルから、当該ソフトマテリアルの構造や機能が非可逆的に変性しないように水分を除去して乾燥する」ことを意味する。従って、冷却の有無、スクロースやトレハロースなどの凍結緩衝剤の有無、真空操作の有無等、凍結乾燥される基板上のソフトマテリアルにより適宜選択することができる。また「凍結乾燥」は、基板上のソフトマテリアルの全部又は一部、又は基板ごと行うことも可能である。
　本発明の実施の形態に係る方法は続いて、前記得られた、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化された基板を用いて、再び当該基板上に第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、第２層目のポリパラキシリレン樹脂に第２のマイクロパターンを形成する。ここで第２層目のポリパラキシリレン樹脂蒸着は、基板上に固定され凍結乾燥された、第１のソフトマテリアルの表面も含めて蒸着させる。係る蒸着は、ポリパラキシリレン樹脂蒸着の通常の条件で可能であり、以下説明するが、しかも蒸着によっても第１のソフトマテリアルの表面のみならず内部についても変性等の損傷が見られない。これは基板上に固定された第１のソフトマテリアルが十分乾燥されていることによると考えられる。さらに、第２層目のポリパラキシリレン樹脂に第２のマイクロパターンを形成することも既に上で説明した通常のポリパラキシリレン樹脂リフトオフ法の条件がそのまま適用することができる。ここで第２層目のポリパラキシリレン樹脂に形成する第２のマイクロパターンは、基板の同一面に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイを設けるものであるから、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所の基板上に形成される。
　本発明の実施の形態に係る方法はさらに、得られた第２層目のポリパラキシリレン樹脂の第２のマイクロパターンに第２のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、基板上に第２のマイクロアレイを形成する（固定化する）。この工程は上の第１のソフトマテリアルを含む溶液の導入と同じ方法でよい。
　ここで、第１及び第２の２種類の異なるソフトマテリアルによるマイクロアレイの製造を意図する場合、前記得られた第２のマイクロアレイが形成された（固定化された）基板から、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がすことにより、基板の同一面上に、第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイが製造できる。ここで、第１のソフトマテリアルは乾燥した状態であり、第２のソフトマテリアルは溶液（濡れた）の状態である。
　必要に応じて、全体を再度凍結乾燥して第１及び第２のソフトマテリアルを乾燥した状態にするか、又は緩衝溶液等を注入して第１及び第２のソフトマテリアルを濡れた状態とすることができる。全体を凍結乾燥させることで、室温または低温で保存を行うことが可能となる。
　図１には連続した矢印で示されているが、本発明の実施の形態では、上で説明した第１及び第２のソフトマテリアルによるマイクロアレイだけでなく、必要ならば、さらにこれを繰り返すこととで、３種類以上の異なるソフトマテリアルが同一基板表面に設けられたマイクロアレイが製造可能である。
　また上で、第２層目のポリパラキシリレン樹脂蒸着の対象となるものとして、第１のソフトマテリアルが固定され凍結乾燥された基板で第１のポリパラキシリレン層を保持するものであると説明したが、本発明の実施の形態においてはこれに限定されない。
　第１のソフトマテリアルを導入して基板に固定した後、第１のポリパラキシリレン層を引き剥がしたものを凍結乾燥したもの、及び第１のソフトマテリアルを導入して基板に固定した後、凍結乾燥し、その後第１のポリパラキシリレン層を引き剥がしたものも対象となる。
　以下本発明の実施の形態を実施例に基づきさらに詳しく説明する。
 [マイクロアレイの作製方法]
　図２Ａ、２Ｂは実施例で行った作製方法の手順を詳細に示したものである。図２Ａ、２Ｂを参照しながら説明する。
　まず、基板上に第１層目のポリパラキシリレン樹脂を真空蒸着する（図２Ａ（ａ））。
　ここで、基板はソフトマテリアルを固定可能とし、かつポリパラキシリレン蒸着条件に耐える材質であればよい。例えばガラス、シリコンやプラスチックなどが挙げられる。マイクロアレイを使用する際、測定等の目的で光透過性であることが好ましい場合、光透過性であるガラスが好ましい。また、基板の表面にソフトマテリアルを固定する方法は特に制限されないが、必要な場合、より強い固定を得るため、基板表面に、固定化を促進する処理を施すことも可能である。
　また、蒸着するポリパラキシリレン樹脂の種類も特に限定されるものではないが、ここではパリレンＣ（日本パリレン合同会社）を例として説明を進める。他の種類のパリレンＮやパリレンＤ、パリレンＨＴも又は必要に応じて適宜選択することができる。（いずれも日本パリレン合同会社にて入手可能）。ポリパラキシリレン樹脂の蒸着厚さは特に限定されず、後の工程でソフトマテリアルが十分導入される構造を有するパターンが形成される厚さであればよい。具体的には、２μm以下であれば望ましい。ここでは、１μｍの厚さで蒸着することを例にして説明を進める。
　次に、蒸着したポリパラキシリレン樹脂上に、フォトレジストを積層する（図２Ａ（ｂ））。フォトレジストとして、ここではＳ１８１８（Shipley Far East Ltd.）を例として説明を進めるが、特にこれに限定されない。また積層方法についても特に限定はなく通常の例えばスピンコートによる方法が好ましい。
　続いて、第１のマイクロパターンを描画したガラスフォトマスクを介して紫外線照射によるフォトリソグラフィを行い（図２Ａ（ｃ））、さらにフォトレジストの現像を行う（図２Ａ（ｄ））。現像液は、使用したフォトレジストとの組み合わせで選択することができ、例えばＳ１８１８をフォトレジストとした場合は、ＮＭＤ－３（東京応化工業株式会社から入手可能）を現像液として利用できる。
　その後、酸素プラズマによるドライエッチングを行い、ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを描画する（図２Ａ（ｅ））。ここでは、紫外線照射によるフォトリソグラフィや酸素プラズマによるドライエッチングを例として説明したが、これに限定されず、例えば電子線ビームによるリソグラフィであっても良い。
　続いて、アセトンとイソプロピルアルコールを使って残存するフォトレジストを洗い流してガラス基板上に第１のマイクロパターンを形成させる（図２Ａ（ｆ））。
　続いて、第１のソフトマテリアルを導入するために、マイクロパターン化された第１層目のポリパラキシリレン樹脂上にフローセルを作製する（図２Ａ（ｇ））。ここではフローセルは、例えばシリコンゴムシートをスペーサとして用い、カバーガラスで挟んで作製する。マイクロアレイを作製したい第１のソフトマテリアルを含む溶液をフローセル内に注入し、露出させたガラス基板表面上に第１のマイクロアレイを導入・形成する。ここでは、例として、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）修飾）を第１のソフトマテリアルとして順に積層するものとする。
　第１のソフトマテリアル導入後、フローセル内の溶液を塩を含まない溶液、例えば超純水や蒸留水に置換する。これによりフローセルに残存する、又は基板上に固定されない遊離の第１のソフトマテリアルが完全に洗い流される。
　その後、フローセルを含む基板を丸ごと（そのまま）凍結乾燥装置を用いて凍結乾燥を行う（図２Ａ（ｈ））。さらに、第１のソフトマテリアルを含む溶液を完全に乾燥させた後、フローセルを解体する（図２Ａ（ｈ'））。ここで、フローセルを解体してからフローセルを含まない基板丸ごと凍結乾燥を行っても良い。
　続いて、凍結乾燥を行った基板上に、第２層目のポリパラキシリレン樹脂を第１層と同様の条件・手順で、例えば１μmの厚さで真空蒸着、積層し（図２Ｂ（ｉ））、次いでＳ１８１８などのフォトレジストをスピンコートして積層する（図２Ｂ（ｊ））。
　ここで、フォトレジストのベイク条件は、凍結乾燥した第１のソフトマテリアルの性質（例えば熱感受性等）を考慮して、高温で短時間（例えば１００℃で１分間）としても良いし、低温で長時間（例えば３５℃で３時間）又はそれらを組み合わせる条件を選択できる。
　その後、第２のマイクロパターンを描画したガラスフォトマスクを介して紫外線照射によるフォトリソグラフィを行い（図２Ｂ（ｋ））、ＮＭＤ－３を使ってフォトレジストの現像を行う（図２Ｂ（ｌ））。
　その後、酸素プラズマによるドライエッチングを行い、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に描画する（図２Ｂ（ｍ））。第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させるドライエッチング条件は特に限定はなく、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂の厚さに応じて、例えばエッチング時間を調節することで容易に選択することができる。
　アセトンとイソプロピルアルコールを使って残存するフォトレジストを洗い流すことで、ガラス基板表面に第２のマイクロパターンが形成される（図２Ｂ（ｎ））。
　次に第１層目と同様の条件で、マイクロパターン化された第２層目のポリパラキシリレン樹脂上にフローセルを作製する（図２Ｂ（ｏ））。
　そして、マイクロアレイを作製したい第２のソフトマテリアルを含む溶液をフローセル内に注入し、露出させたガラス基板表面上に第２のマイクロアレイを形成する。ここでは、例として、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＴＭＲ（テトラメチルローダミン）修飾）を第２のソフトマテリアルとして順に積層するものとする。ここで、第１のソフトマテリアルのパターニングを行った場所は、第２層目のポリパラキシリレン樹脂によって覆われているため、第１のソフトマテリアルと第２のソフトマテリアルとのコンタミネーションは完全に阻止される。その後、フローセルを解体する（図２Ｂ（ｏ'））。
　さらに、第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がす（図２Ｂ（ｐ））。第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂は、例えばピンセット等で一部分を引き剥がすことで同時に容易に引き剥がされる。
　最後に基板上にフローセルを作製し（図２Ｂ（ｑ））、緩衝溶液を注入することで凍結乾燥された第１のソフトマテリアルが再溶解し、同一基板上に第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイが作製される。
[作製したマイクロアレイの評価]
　図３は、上記手順にて作製されたマイクロアレイの蛍光顕微鏡観察結果の例を示す。図３から次のことが明らかである。（ｉ）まず、ガラス基板上に2種類の異なるソフトマテリアルが、以下の種々の処理に対しても十分な程度に固定されていること。(ii)さらに、2種類の異なるソフトマテリアル（それぞれ複数のタンパク質の機能を組み合わせて構築された標識化タンパク質）が変性を受けずに機能を発揮すること。（ｉｉｉ）2種類の異なるソフトマテリアルのコンタミネーションがないこと。すなわち、第１のソフトマテリアルとしてのＦＩＴＣ修飾一本鎖ＤＮＡと、第２のソフトマテリアルとしてのＴＭＲ修飾一本鎖ＤＮＡとが、コンタミネーションすることなく同一基板上にマイクロアレイ化されていることが分かる。（ｉｖ）アレイ化がマイクロスケールであり、かつアレイを形成するスポット間の間隔が十分明確に分離されている。
　ただし今回の図３の例では、マイクロメートルスケールでのアレイ化の条件・装置を用いてマイクロメートルスケールでのアレイ化を目的としたものを示したが、必要ならば通常のナノメートルスケールでのアレイ化を目的とする条件・装置、例えば電子線ビームによるリソグラフィなどを行えば、ナノメートルスケールでのアレイ化も可能である。
　図４は、本発明の実施の形態によるマイクロアレイ化された一本鎖ＤＮＡ（ソフトマテリアル）が、二本鎖形成能を保持しているかを検証する実験を行った結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
　この実験では、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ修飾、塩基配列Ａ）を第１のソフトマテリアルとして順に積層しており、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、５μＭのビオチン化一本鎖ＤＮＡ（２３塩基長、蛍光色素ＦＩＴＣ修飾、塩基配列Ｂ）を第２のソフトマテリアルとして順に積層している。そのマイクロアレイ作製結果はＦＩＴＣの蛍光フィルタを通じて観察され（図４ａ）、ＴＭＲの蛍光フィルタを通じては観察されないことを確認した（図４ｂ）。
　図４から、凍結乾燥の過程を経る本発明の実施の形態に係る方法によるマイクロアレイ化された一本鎖ＤＮＡは、その二本鎖形成能が保持されていることを確認され、変性等を受けていないことが分かる。すなわち、凍結乾燥の過程を経た塩基配列Ａの一本鎖ＤＮＡの
外１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
を注入すると、塩基配列Ａの一本鎖ＤＮＡが固定化されているスポットにのみ特異的に相補鎖が結合し（図４ｃ）、凍結乾燥の過程を経た一本鎖ＤＮＡの二本鎖形成能が保持されていることを確認した。
　図５は、本発明の実施の形態によるマイクロアレイ化されたタンパク質が、その機能性を保持しているか検証実験を行った結果を示す蛍光顕微鏡観察像である。
　ここでは、機能性タンパク質の例として、モータータンパク質であるキネシンを用いた。すなわち、４ｍｇ／ｍＬのビオチン化ＢＳＡ、５ｍｇ／ｍＬのカゼイン、蛍光色素ＴＭＲを標識した１ｍｇ／ｍＬのストレプトアビジン、１００μｇ/ｍＬのビオチン化キネシンを第１および第２のソフトマテリアルとして順に積層し、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がすことでキネシンのマイクロアレイを作製した。そして、キネシンのスポット外のガラス基板表面は、５ｍｇ／ｍＬのカゼインでコーティングを行い、非特異的な吸着を抑制した。ここで、蛍光色素ＴＭＲを標識した微小管を投入すると、キネシンが固定化されているスポットにおいてのみ特異的に微小管が着地し、微小管のマイクロアレイが形成された（図５ａ）。
　続いて、ＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を含む緩衝溶液を注入すると、キネシン上に着地した微小管の滑走運動が開始され、微小管がスポット外まで滑走すると、キネシンとの結合が無くなり、溶液中に浮遊して顕微鏡の焦点から外れて観察されなくなる現象が確認された（図５ｂ）。
　図５から、本発明の実施の形態に係る製造工程で凍結乾燥処理を行って得られるソフトマテリアル（キネシン）は、微小管と結合する能力を保持し、しかもガラス基板上で微小管を滑走運動させる活性を有することを示している。
　以上説明したように、本発明の実施の形態に係るマイクロアレイ作製方法は、ＤＮＡやタンパク質に適用可能であることが分かる。ただし、本発明の実施の形態はＤＮＡやタンパク質に限定されず、ＲＮＡ（リボ核酸）や脂質、マイクロビーズなど、マイクロアレイ化が可能であれば、どんなソフトマテリアルであっても良い。
　さらに、本発明の実施の形態に係る製造方法では、ソフトマテリアルを凍結乾燥する工程を有するが、これは本発明の実施の形態が凍結乾燥されにくいソフトマテリアルへの適用を除外するものではない。例えば脂質二分子膜カプセルであるリポソームや細胞など、ソフトマテリアルの中には、凍結乾燥に適さないものもあるが、これらの表面を一本鎖ＤＮＡやビオチン、抗体などで化学修飾することで、マイクロアレイを作製することも可能である。リポソームや細胞表面をＤＮＡ修飾する方法は例えば以下参考文献１、２に、ビオチン化修飾する方法は参考文献３に、抗体修飾する方法は参考文献４に各々開示されている。つまり、本発明の実施の形態に係るマイクロアレイ作製方法にて、一本鎖ＤＮＡやタンパク質のマイクロアレイを予め形成しておけば、ＤＮＡの二本鎖形成反応、ビオチン－アビジン結合、抗原抗体結合などを利用して、ポリパラキシリレン樹脂を引き剥がした後でもリポソームや細胞を特異的にマイクロアレイ化することができる。
参考文献：
１　S. Hiyama, et al., "Biomolecular-motor-based autonomous delivery of lipid vesicles as nano- or microscale reactors on a chip," Lab on a Chip, vol.10, pp.2741-2748, 2010.
２　S. C. Hsiao, et al., "Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns," Langmuir, vol.25, pp.6985-6991, 2009.
３　D. Stamou, et al., "Self-assembled microarrays of attoliter molecular vessels," Angewandte Chemie International Edition, vol.42, pp.5580-5583, 2003.
４　A. Ito, et al., "Magnetite nanoparticle-loaded anti-HER2 immuno-liposomes for combination of antibody therapy with hyperthermia," Cancer Letters, vol.212, pp.167-175, 2004.
　本国際出願は２０１１年３月２８日に出願した日本国特許出願２０１１－０７０９３４号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願２０１１－０７０９３４号の全内容を本国際出願に援用する。

Claims (5)

  1. 　複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
    　基板上に、
    　第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
    　前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
    　第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
    　前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
    　前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
    　第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
    　前記第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を貫通させて第２のマイクロパターンを第１のマイクロパターンとは異なる場所に形成し、
    　第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
    　第１層目と第２層目のポリパラキシリレン樹脂を同時に引き剥がして、
    　前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
    　前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
  2. 　複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
    　基板上に、
    　第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
    　前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
    　第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
    　前記第１のマイクロアレイを形成した基板から、前記第１層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がし、
    　第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
    　前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
    　第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
    　前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂に、第１のマイクロパターンとは異なる場所に第２のマイクロパターンを形成し、
    　第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
    　前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、
    　前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
    　前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
  3. 　複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイを作製する方法であり、
    　基板上に、
    　第１層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着し、
    　前記ポリパラキシリレン樹脂に第１のマイクロパターンを形成し、
    　第１のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第１のマイクロアレイを形成し、
    　前記第１のソフトマテリアルを凍結乾燥して、第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
    　前記第１のマイクロアレイを形成した基板から、前記第１層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がし、
    　前記第１のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板上に、
    　第２層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して積層し、
    　前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂に、第１のマイクロパターンとは異なる場所に第２のマイクロパターンを形成し、
    　第２のソフトマテリアル溶液を導入して、前記基板表面上に第２のマイクロアレイを形成し、
    　前記第２層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、
    　前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、
    　前記第１及び前記第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝溶液を導入して前記第１のソフトマテリアルを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
  4. 　請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法であってさらに、
    　前記第１と第２のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に、第３層目のポリパラキシリレン樹脂を蒸着して、第３のマイクロパターンを形成し、第３のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、前記第３層目のポリパラキシリレン樹脂を引き剥がして、同一基板上に第１、第２及び第３のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板とし、前記第１、第２及び第３のソフトマテリアルのマイクロアレイ化基板に緩衝液を導入して前記第１及第２のソフトマテリアを溶解する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
  5. 　請求項１乃至４のいずれか一項に記載の複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法であって、最後のソフトマテリアルを含む溶液を導入して、前記基板表面上に最後のマイクロアレイを形成した後、使用まで室温又は低温で保存するために、全てのマイクロアレイを形成した基板ごと凍結乾燥する、ことを特徴とする複数種類のソフトマテリアルのマイクロアレイ作製方法。
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