WO2012124965A2 - 다중 타겟 위치의 단일 핵산서열로의 어셈블리 방법 - Google Patents
다중 타겟 위치의 단일 핵산서열로의 어셈블리 방법 Download PDFInfo
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Definitions
- Each of the primer pairs comprises a forward primer and a reverse primer, and the reverse primer of the first primer pair for amplifying a first target position located relatively 5′-direction in the at least two primer pairs comprises: (i) a first primer pair; A second primer for amplifying a target localization nucleotide sequence complementary to a downstream direction region of the target position and (ii) a second target position that is non-complementary to the target nucleic acid molecule and located 3'-direction of the first target position Includes overlapping lapping sequences complementary to the pair of forward primers; The forward primer of the second primer pair for amplifying the second target position located in the 3'-direction of the first target position comprises (i) a target localizing nucleotide sequence complementary to the upstream direction region of the second target position; ) An overlapping sequence that is complementary to the target nucleic acid molecule and complementary
- the method of the present invention further includes the step of reverse transcription of the target nucleic acid molecule obtained from the sample (a-1) to obtain cDNA.
- samples as used while referring to the assembly method and detection method of the present invention includes, but is not limited to, blood, cells, cells, tissues and organs comprising the target nucleic acid molecule of the present invention.
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Abstract
본 발명은 다중 타겟 위치(multiple target loci)를 하나의 어셈블된 핵산서열로의 어셈블리하는 방법 및 이를 이용한 동시 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 두 번의 PCR, 즉 제1차 PCR(polymerase chain reaction) 및 제2차 PCR 반응을 통해 다중 타겟 위치를 하나의 어셈블된 핵산서열로 어셈블리시킨다. 보다 상세하게는, 본 발명에서 이용되는 제1차 증폭용 프라이머쌍(정방향 프라이머 및 역방향 프라이머)은 타겟-특이적 서열(타겟 혼성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5'-플랭킹 어셈블리 스페이서 서열(오버래핑 서열)로 이루어져 있다. 또한, 상기 제1차 증폭용 프라이머쌍을 이용하여 증폭된 제1차 증폭결과물을 제2차 증폭용 프라이머 세트를 통해 간편하고 용이하게 하나의 단축된 핵산서열로 어셈블리시켜 다중 타겟 위치를 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 키트는 시료(바람직하게는, 인간의 혈액)의 DNA 서열 상의 다중 변이성(예컨대, SNPs)을 동시에 검출 및 분석함으로써, 변이 검출을 위한 시퀀싱 비용을 현저하게 감소시킬 수 있을 뿐 아니라 맞춤형 의약의 개념을 실현하기 위한 중요한 접근방법 및 수단을 제공한다.
Description
【명세서】
【발명의 명칭】
다중 타겟 위치의 단일 핵산서열로의 어셈블리 방법 【기술 분야】
본 발명은 다중 타겟 위치 (multiple target loci)를 하나의 어셈블된 핵산서열로 어셈블리하는 방법 및 이를 이용한 다중 타겟 위치의 동시 검출방법에 관한 것이다. 【배경 기술】
게놈 유전자 위치 (genomic locus)의 PCR—기반된 증폭은 타겟된 서열의 정보제공을 위한 가장 간단한 프로토콜을 제공하였다 (1-3). 앰플리콘 (amplicons)을 생산하기 위해 여러 가지 프라이머쌍을 첨가함으로써， 많은 타겟이 되는 게놈 상의 위치들을 증폭할 수 있다 (4， 5). 최근에 개발된 방법들은 원하는 게놈 유전자 위치들을 선택적으로 획득할 수 있게 한다 (6-13). 예를 들어， RainDance 사는 동시에 수천 개의 앰플리콘을 캡쳐할 수 있는 미세 -유체 (micro-fhiidic) 플랫품을 생산하였다 (14). 다른 대규모 타겟-풍부화 (target -enrichment) 방법들은 '분자 역전 프로브 (molecular inversion probes, MIP)' (10-13) 및 하이브리드 캡쳐 접근 방법을 이용한다 (6-9). 상술한 타겟-풍부화 방법들은 타겟 DNA 의 캡쳐에 있어서 복합성 (multiplexity)을 뚜렷하게 증가시켰다 (2), 고속 DNA 시뭔싱 기법과 상기 타겟-풍부화 방법들의 조합을 통해, 연구자들은 시뭔싱 비용을 현저하게 감소시킬 수 있었다.
하지만, 본 발명자들이 아는 한， 단일 시퀀싱 판독 (single sequencing read)를 이용하여 다양한 타겟 시뭔성을 획득할 수 있는 방법은 아직까지 없다. 예를 들어， 종래의 PCR 방법으로는 각각 분리되어 있는 타켓 유전자 위치를 증폭하여 하나의 조합으로 만들 수 없었기 때문에， 타겟 유전자 위치는 분리하여 증폭되고 다양하게 시뭔싱되어야만 한다 (4). 따라서, 단일 시퀀싱 판독에 의해 다양한 타겟 시퀀싱을 획득할 수 있는 방법이 당업계에서 시급히 요구되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 상세한 설명】
본 발명자들은 다중 타겟 위치 (multiple target loci)를 보다 효율적이고 정확하게 검출하는 신규한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 위치의 업스트림 방향 부위 및 다운스트림 방향 부위에 흔성화되고 플탱킹 부위 (flanking region)을 가지는 프라이머쌍을 최소 2 개 이상 포함하는 제 1 차 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 제 1 차 증폭결과물을 제 2 차 증폭용 프라이머 세트를 통해 간편하고 용이하게 하나의 단축된 핵산서열로 어셈블리시켜 다중 타겟 위치를 동시에 검출할 수 있음을 발견함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 다중 타겟 위치 (multiple target loci)의 하나의 단축된 핵산서열로의 어셈블리 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 다증 타겟 위치 (multiple target loci)의 동시 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 다중 타겟 위치 검출용 키트를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci)의 하나의 단축된 핵산서열로의 어셈블리 방법을 제공한다: (a) 최소 2 개의 타켓 위치를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci)를 하나의 하나의 분자 상에서 포함하는 타겟 핵산분자를 얻는 단계; (b) 상기 최소 2 개의 타겟 위치의 업스트림 방향 부위 및 다운스트림 방향 부위에 흔성화 되며 상기 타겟 위치의 플탱킹 부위 (flanking region)를 증폭하기 위한 최소 2 개의 프라이머쌍을
포함하는 제 1 차 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 상기 타겟 핵산분자를 제 1 차 증폭하여 제 1 차 증폭결과물을 얻는 단계로써; 상기 프라이머쌍 각각은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고， 상기 최소 2 개의 프라이머쌍에서 상대적으로 5' —방향쪽에 위치한 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열 (over lapping sequences)을 포함하며; 상기 제 1 타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2 타켓 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 계 2 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며 ; 및 (c) 상기 제 1 차 증폭결과물을 5' to 3' 방향으로 정렬한 경우에 형성되는 5' -말단 부위에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 및 3' -말단 부위에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 제 2 차 증폭용 프라이머 세트 및 상기 제 1 차 증폭결과물을 이용하여 제 2 차 증폭하여 제 2 차 증폭결과물을 얻는 단계로서， 상기 제 2 차 증폭결과물은 상기 최소 2 개의 타겟 위치들이 각각 인접하여 위치된 하나의 핵산서열이며 상기 단계 (a)에서 이용된 타겟 핵산분자보다 연장되어 길어진 길이를 갖는다. 본 발명자들은 다중 타겟 위치를 보다 효율적이고 정확하게 검출하는 신규한 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 타겟 위치의 업스트림 방향 부위 및 다운스트림 방향 부위에 흔성화되고 플탱킹 부위을 가지는 프라이머쌍을 최소 2 개 이상 포함하는 제 1 차 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 제 1 차 증폭결과물을 제 2 차 증폭용 프라이머 세트를 통해 간편하고 용이하게 하나의 단축된 핵산서열로 어셈블리시켜 다중 타겟 위치를 동시에 검출할 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 제 1 차 증폭용 프라이머 세트를 이용한 제 1 차
PCR(polymerase chain react ion)을 실시하고 제 1 차 증폭결과물과 제 2 차
증폭용 프라이머 세트를 이용한 제 2 차 PCR 에 의해 다중 타겟 위치를 포함하는 하나의 단축된 핵산서열을 어셈블리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 최소 2 개의 타겟 위치를 포함하는 타겟 핵산분자에서 PCR 을 실시하여 다중 타켓 위치의 핵산서열을 동시에 검출할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "뉴클레오타이드" 는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며， 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uh 1 man 및 Peyman , Che ica 1 Reviews , 90： 543-584 ( 1990 ) ) .
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 증폭은 PCR 에 의해 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면， 본 발명의 프라이머는 유전자 증폭 반웅 (amplification react ions)에 이용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머" 는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄 (주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건， 즉， 뉴클레오타이드와 DNA 증합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH 의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연 (naturally occurring) dNMP (즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비 -자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한， 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는 중합제 (예컨대， DNA 폴리머라제)의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 층분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소， 예컨대， 온도， 웅용분야 및 프라이머의 소스 (source)에 따라 변화가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 층분히 안정된 흔성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 프라이머는 컴퓨터 프로그램인 Perl-mTAS를 이용하여 제작된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍" 은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치 (apposition)되는 것을 의미하며， 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "흔성화 (hybridization) " 는 2 개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링 (pairing)에 의하여 이합체 구조 (duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 흔성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우 (perfect match) 일어나거나 일부 미스매치 (mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 흔성화에 필요한 상보성의 정도는 흔성화 반웅 조건에 따라 달라질 수 있으며， 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링" 과 "혼성화" 는 차이가 없으며， 본 명세서에서 흔용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명에서 이용되는 프라이머는 PCR 단계 (예컨대， 제 1 차 PCR 및 제 2 차 PCR)에 따라 특이적으로 제작되어 이용된다.
보다 상세하게는， 본 발명의 제 1 차 증폭용 프라이머쌍 (정방향 프라이머 및 역방향 프라이머)은 타겟-특이적 서¾ (타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5' —플탱킹 어셈블리 스페이서 서열 (오버래핑 서열)로 이루어져 있다. 본 명세서의 용어 "타겟ᅳ특이적 서열 (타겟 혼성화 뉴클레오타이드 서열)" 은 증폭하고자 하는 타겟 위치에 상보적인 서열로， 프라이머 내에서 3' -방향쪽에 위치한다, 또한， 본 명세서의 용어 "5' -플탱킹 어셈블리 스페이서 서열 (오버래끰 서열)" 은 증폭하고자 하는 타겟 위치에 비상보적인 서열로， 프라이머 내에서 5' -방향쪽에 위치한다.
상기 오버래핑 서열은 서로 독립적인 타겟 위치 간에 특이적인 어닐링을 가능하게 하는 중첩 부위 (overlapping regions)로서 기능한다. 예를 들어， 2 개의 프라이머쌍을 이용하여 2 개의 다중 타겟 위치를 어셈블리하는 경우， 상기 프라이머쌍에서 상대적으로 5' -방향쪽에 위치한 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1 타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 , 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기
제 1 타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열로 이루어진다. 즉， 상기 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머는 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머와 오버래핑 서열을 통해 어닐링될 수 있다. 따라세 본 발명의 방법은 상기 오버래핑 서열을 이용하여 서로 독립적인 다중 타겟 위치를 하나의 단축된 핵산서열로 어셈블리시킬 수 있으며， 이용된 프라이머쌍에 따라 타겟 위치가 실질적으로 정확한 순서로 어셈블리될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 최소 2 개의 타겟 위치를 포함하는 다증 타겟 위치를 하나의 분자로 단축시킨 핵산서열로, 보다 바람직하게는 최소 3 개의 타겟 위치를 포함하는 다중 타겟 위치를 하나의 분자로 단축시킨 핵산서열로， 보다 더 바람직하게는 최소 4 개의 타켓 위치를 포함하는 다중 타겟 위치를 하나의 분자로 단축시킨 핵산서열로， 보다 더욱 더 바람직하게는 최소 5 개의 타겟 위치를 포함하는 다중 타겟 위치를 하나의 분자로 단축시킨 핵산서열로， 그리고 가장 바람직하게는， 최소 9 개의 타겟 위치를 포함하는 다중 타켓 위치를 하나의 분자로 단축시킨 핵산서열로 어셈블리시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산분자는 최소 2 개의 타겟 위치를 포함하며 상기 단계 (b)에서 이용되는 제 1 차 증폭용 프라이머 세트는 최소 2 개의 프라이머쌍을 포함하며， 상기 최소 2 개의 프라이머쌍에서 상대적으로 가장 ' 5' -방향쪽에 위치한 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1 타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타겟 위치의 3' - 방향쪽에 위치한 제 2 타켓 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 1 타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 2 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타켓 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산분자는 최소 3 개의 타겟 위치를 포함하며 상기 단계 (b)에서 이용되는 제 1 차 증폭용 프라이머 세트는 최소 3 개의 프라이머쌍을 포함하고 상기 최소
3 개의 프라이머쌍에서 상대적으로 가장 5' ᅳ방향쪽에 위치한 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1 타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 게 1 타겟 위치의 3' - 방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 1 타켓 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 2 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 계 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며, 상기 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 2 타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 3 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 2 타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 3 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 3 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 핵산분자는 최소 4 개의 타겟 위치를 포함하며 상기 단계 (b)에서 이용되는 제 1 차 증폭용 프라이머 세트는 최소 4 개의 프라이머쌍을 포함하며 상기 최소
4 개의 프라이머쌍에서 상대적으로 가장 5' -방향쪽에 위치한 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1 타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타겟 위치의 3' -
방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 1 타켓 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 2 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타켓 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며, 상기 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 3 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며 ; 상기 제 2타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 3 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 2 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 · 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며 ; 상기 제 3타겟 위치의 3' ᅳ방향쪽에 위치한 제 4타겟 위치를 증폭하기 위한 제 4 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 4 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 3 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 타켓 핵산분자는 최소 5 개의 타겟 위치를 포함하며 상기 단계 (b)에서 이용되는 제 1 차 증폭용 프라이머 세트는 최소 4 개의 프라이머쌍을 포함하며 상기 최소 4 개의 프라이머쌍에서 상대적으로 가장 5' -방향쪽에 위치한 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1 타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타켓 위치의 3' - 방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 계 1 타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의
정방향 프라이머는 (i) 제 2 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며, 상기 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 3 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며 ; 상기 제 2타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 3 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타켓 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 2 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 3타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 4타겟 위치를 증폭하기 위한 제 4 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 4 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 3 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며 ; 상기 제 4타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 5타겟 위치를 증폭하기 위한 제 5 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 5 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 4 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 4프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함한다ᅳ 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 상기 단계 (b)의 제 1차 증폭결과물은 7으150 bp의 앰플리콘 (amplicons)을 포함한다.
본 명세서에서 언급되는 용어 "상보적 (complementary)" 은 어떤 특정한 흔성화 (hybridization) 또는 어닐링 조건 하에서 상술한 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 흔성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미하며, 실질적으로 상보적 (substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며， 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반웅" 은 타겟 핵산 분자를 증폭하는 반웅을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고 되어 있으며， 이는 중합효소 연쇄반웅 (PCR) (미국 특허 제 4,683,195， 4,683,202, 및 4,800,159 호), 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT— PCR Sambrook 등， Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) , Miller, H. I. (WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법， 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반웅 (Hgase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap— LCRCTO 90/01069), 복구 연쇄 반웅 (repair chain reaction; EP 439,182), 전사 -중재 증폭 (transcript ion- mediated amplification; TMA)(19) (W0 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제 (self sustained sequence repl ication)(20)(W0 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭 (selective amplification of target polynucleotide sequences) (미국 특허 제 6， 410， 276 호)， 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반웅 (consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR) (미국 특허 제 4，437，975 호)， 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반웅 (arbitrari ly primed polymerase chain react ion; AP- PCR) (미국 특허 제 5,413,909 호 및 제 5ᅳ 861,245 호)， 핵산 염기서열 기반 증폭 (nucleic acid sequence based amplification; NASBA) (미국 특허 제 5，130，238호， 제 5,409,818호， 제 5，554，517호， 및 제 6，063，603호) 및 가닥 치환 증폭 (strand dis lacement ampl i f icat ion)(21, 22)을 포함하지만， 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제 5,242,794, 5,494,810, 4,988,617 호 및 미국 특허 제 09/854,317 호에 기술되어 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구현예에서， 증폭 과정은 미국특허 제 4,683,195호, 제 4,683,202호 및 제 4,800,159호에 개시된 PCR에 따라 실시된다.
PCR 은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로， 그의 많은 변형과 웅용들이 개발되어 있다. 예를 들어， PCR 의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운 (touchdown) PCR, 핫 스타트 (hot start) PCR, 네스티드 (nested) PCR 및 부스터 (booster) PCR 이 개발되었다. 또한， 멀티플렉스 PCR, 실시간 (real-time) PCR, 분별
디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PC ) , cDNA 말단의 신속 증폭 (rapid amplification of cDNA ends： RACE), 인버스 중합효소 연쇄반웅 (inverse polymerase chain reaction: IPC ) , 백토레트 (vectorette) PCR 및 TAIL-PCR( thermal asymmetric interlaced PCR)이 특정한 웅용을 위해 개발되었다. PCR 에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J. , 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verl g New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며， 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 발명에서 이용될 수 있는 타겟 핵산분자는 특별하게 제한되지 않으며， 바람직하게는 DNA(gDNA 또는 cDNA) 및 RNA 를 포함하며， 보다 바람직하게는 DNA 를 포함하고 보다 더 바람직하게는 게놈 DNA(genomic DNA)를 포함한다. 또한 타겟 핵산분자는 예컨대， 원핵세포 핵산, 진핵세포 (예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모， 고등 식물， 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산， 바이러스 (예컨대， 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스， 엡스타인―바 바이러스， 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 본 발명의 타겟 핵산분자가 DNA 인 경우， 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 통해 직접적으로 다중 타겟 위치를 동시에 검출할 수 있다. 타겟 핵산분자로써 RNA 를 이용하는 경우， 본 발명의 방법은 (a-l) 시료로부터 얻어진 타겟 핵산분자를 역전사시켜 cDNA 를 얻는 단계를 추가적으로 포함한다. 본 발명의 어셈블리 방법 및 검출방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시료 (samples)" 는 본 발명의 타겟 핵산분자를 포함하는 혈액, 세포， 세포물， 조직 및 기관을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
타겟 핵산분자인 RNA 를 얻기 위하여， 시료에서 총 RNA 를 분리한다. 총 R A 를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Sambrook, J. et al. , Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)； Tesniere, C. et al. , Plant Mol. Biol. Rep. , 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al. , Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol 을 이용하여 용이하게
세포내의 총 RNA 를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA 로부터 cDNA 를 합성하고, 이 d)NA 를 증폭한다. 본 발명의 총 RNA 가 인간의 시료로부터 분리되는 경우에, mRNA 의 말단에는 폴리 -A 테일을 갖고 있으며， 이러한 서열 특성올 이용한 을리고 dT프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988)； Libert F, et al. , Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al . , Molecular Cloning. A Laboratory Manual , 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)) . 이어， 유전자 증폭 반응올 통하여 합성된 cDNA를 증폭한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 흔성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 흔성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor , N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D. , 등， Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며 , E. coli
DNA 중합효소 I 의 "클레나우" 단편， 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는， 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고， 이는 Therwus aQuaticusiTaq) , Thermus thermophi lus{Tt ) , Thermus fili for mis, Therm is flavus, Thermococcus literal is, Pyrococcus
, Thermus antranikiani i , Thermus caldophi lus, Thermus chl iarophi lus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshi ai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus si Ivanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophi lus, Thermo toga mariti a, Thermo toga neapol i tana 및 Thermos ipho africanus DNA 증합효소를 포함한다.
중합 반웅을 실시할 때， 반웅 용기에 반웅에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반웅이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 를 소망하 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 흔합물에 제공하는 것이 소망된다.
증폭 반웅에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반웅 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실， 완충액은 모든 효소들이 최적의 반웅 조건에 근접하도록 한다. 따라서， 본 발명의 증폭 과정은 반웅물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반웅물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열 -의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 이렇게 증폭된 타겟 유전자는 하나의 분자 상에 다중 타켓 위치를 포함하는 타겟 핵산분자이며， 이를 이용하여 동시에 다중 타겟 위치를 분석할 수 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci)의 동시 검출방법을 제공한다: (a) 최소 2 개의 타겟 위치를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci)를 하나의 분자 상에서 포함하는 타겟 핵산분자를 얻는 단계; (b) 상기 최소 2 개의 타겟 위치의 업스트림 방향 부위 및 다운스트림 방향 부위에 흔성화 되며 상기 타겟 위치의 플탱킹 부위 (flanking region)를 증폭하기 위한 최소 2 개의 프라이머쌍을 포함하는 제 1 차 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 상기 타겟 핵산분자를 제 1차 증폭하여 제 1차 증폭결과물을 얻는 단계로서 ; 상기 프라이머쌍 각각은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고， 상기 최소 2 개의 프라이머쌍에서 상대적으로 5' -방향쪽에 위치한 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1 타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 1타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2타켓 위치를 증폭하기 위한 제 2 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 2 타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1 타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1 프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며;
(c) 상기 제 1 차 증폭결과물을 5' to 3' 방향으로 정렬한 경우에 형성되는 5' -말단 부위에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 및 3' -말단 부위에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 제 2차 증폭용 프라이머 세트 및 상기 제 1 차 증폭결과물을 이용하여 제 2 차 증폭하여 제 2 차 증폭결과물을 얻는 단계로서， 상기 제 2 차 증폭결과물은 상기 최소 2 개의 타겟 위치들이 각각 인접하여 위치된 하나의 핵산서열이며 상기 단계 (a)에서 이용된 타겟 핵산분자보다 연장되어 길어진 길이를 가지며; 및 (d) 상기 제 2 차 증폭결과물에서 상기 최소 2 개의 타겟 위치의 존재 유무를 분석하는 단계 .
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제 1 차 증폭용 프라이머 세트 및 제 2 차 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci) 검출용 키트를 제공한다ᅳ
본 발명의 방법은 상술한 어셈블리 방법의 과정을 포함하기 때문에， 상술한 본 발명의 어셈블리 방법에서 기재된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 타겟 위치는 뉴클레오타이드 변이 (nucleotide variations) 위치를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면， 본 발명의 뉴클레오타이드 변이는 단일뉴클레오타이드 돌연변이 (point mutation), 삽입 돌연변이 및 결실 돌연변이이며, 보다 바람직하게는 단일뉴클레오타이드 돌연변이이다. 상기 단일 뉴클레오타이드 돌연변이는 단일뉴클레오타이드 다형성 (single nucleotide polymorphisms, SNPs ) , 프레임쉬프트 (frame shift) 돌연변이 미스센스 돌연변이 및 년센스 돌연변이를 포함하며， 가장 바람직하게는 SNPs이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 분석은 시퀀싱 (sequencing)을 통해 실시한다.
본 명세서에서 언급된 용어 "단일뉴클레오타이드 다형성 (single nucleotide polymorphisms, SNPs)" 은 게놈에서 단일염기 T, C 또는 G)가 종의 멤버들 간 또는 한 개체 (individual)의 쌍 염색체 간에 다른 경우에 발생하는 DNA 서열의 다양성을 의미한다. 예를 들어， 서로 다른 개체의 세 개의 DNA 단편들 (참고: 표 1, 본 발명의 노인성황반변성의 SNP
마커인 rsl061147 의 AAGT[A/A]AG, AAGT[A/G]AG, AAGT[G/G]AG)처럼 단일염기에서 차이를 포함하는 경우 두 개의 대립 유전자 (A 또는 G)라고 부르며， 일반적으로 거의 모든 SNPs는 두 개의 대립 유전자를 가진다. 한 집단 (population)내에서, SNPs 는 소수 대립인자 빈도 (minor allele frequency, MAF; 특정 집단에서 발견되는 유전자 위치 (locus)에서 가장 낮은 대립인자 빈도)로 할당될 수 있다, 인간 집단 내에서 변이성 (variations)이 존재하며， 지질학적 또는 민족적 군에서 공통적인 하나의 SNP 대립 유전자는 매우 회귀하다. 단일염기는 폴리뉴클레오타이드 서열에 변화 (대체)， 제거 (결실) 또는 첨가 (삽입)될 수 있다. SNP는 번역 프레임의 변화를 유발할 수 있다.
또한, 단일뉴클레오타이드 다형성은 유전자의 코딩 서열， 유전자의 비 -코딩 부위 또는 유전자 사이의 내부 지역 (intergenic regions)에 포함될 수 있다. 유전자의 코딩 ' 서열 내의 SNP 는 유전암호의 중복성 (degeneracy)으로 인해 반드시 타겟 단백질의 아미노산 서열 상에 변화를 일으키지는 않는다. 동일한 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP 는 동의적 (synonymous)이라 하고 (때때로, 침묵 돌연변이라 불리움), 다른 폴리펩타이드 서열을 형성하는 SNP 의 경우 비—동의적 (non- synonymous)이라고 한다. 비-동의적 SNP 는 미스센스 또는 넌센스일 수 있으며， 미스센스 변화는 다른 아미노산을 발생시키는 반면에 넌센스 변화는 비성숙 종결코돈을 형성한다. 단백질 -코딩 부위가 아닌 곳에 존재하는 SNP 는 유전자 사일런싱 , 전사인자 결합 또는 비 -코딩 RNA 서열을 유발시킬 수 있다.
본 발명에 따르면， 본 발명의 방법 및 키트는 상술한 SNP를 포함하는 뉴클레오타이드 변이를 매우 간편하고 효과적으로 검출할 수 있다. 즉, 병의 발병 및 인간이 어떻게 병원체， 화학물질， 약물， 백신 및 다른 시약에 반웅하는 가에 영향을 미칠 수 있는 인간의 DNA 서열 상의 변이성 (예컨대, SNPs)을 용이하게 검출함으로써， 본 발명의 방법 및 키트는 맞춤형 의약의 개념올 실현하기 위한 중요한 접근방법 및 수단올 제공할 수 있다. 무엇보다도， 최근에 마커로서 활발하게 개발되고 있는 SNPs 는 질병을 가지거나 또는 가지지 않는 군들 간에 게놈 부위를 비교함으로써 질병을 진단하는 생의학적 연구에서 가장 중요하다. SNPs 는 인간 게놈의 가장
많은 변이이며, 1.9 kb 당 하나의 SNP 비율로 존재하는 것으로 추측되고 있다 (Sachidanandam et al., 2001). SNPs는 매우 안정된 유전적 마커이고， 때때로 표현형에 직접적인 영향을 미치며, 자동화된 유전자형 규명 시스템에 매우 적합하다 (Landegren et al. , 1998； Isaksson et al. , 2000). 또한， SNPs 연구는 곡식 및 가축 육성 프로그램에서도 중요하다. 본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 다중 타겟 위치 (multiple target loci)의 하나의 단축된 핵산서열로의 어셈블리 방법 및 이를 이용한 동시 검출방법에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 방법은 두 번의 PCR, 즉 제 1 차 PCR(polymerase chain reaction) 및 제 2 차 PCR 반응을 통해 다중 타겟 위치를 하나의 단축된 핵산서열로 어셈블리시킨다.
(c) 보다 상세하게는， 본 발명에서 이용되는 제 1 차 증폭용 프라이머쌍 (정방향 프라이머 및 역방향 프라이머)은 타겟-특이적 서열 (타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5' -플랭킹 어셈블리 스페이서 서열 (오버래핑 서열)로 이루어져 있다.
(d) 또한, 상기 제 1차 증폭용 프라이머쌍을 이용하여 증폭된 제 1차 증폭결과물을 제 2 차 증폭용 프라이머 세트를 통해 간편하고 용이하게 하나의 단축된 핵산서열로 어셈블리시켜 다증 타겟 위치를 동시에 검출할 수 있다.
■ (e) 따라서， 본 발명의 방법 및 키트는 시료 (바람직하게는, 인간의 혈액)의 DNA 서열 상의 다중 변이성 (예컨대, SNPs)을 동시에 검출 및 분석함으로써, 변이 검출을 위한 시뭔싱 비용을 현저하게 감소시킬 수 있을 뿐 아니라 맞춤형 의약의 개념을 실현하기 위한 중요한 접근방법 및 수단을 제공한다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 본 발명의 mTAS(multiple target loci assembly sequencing) 방법을 도식적으로 나타낸 모식도이다.
도 2 는 본 발명의 mTAS 실험에서 1 차 PCR 산물의 아가로오스 젤 전기영동 사진이다.
도 3 은 79+3(암환자)개의 인간 게놈 유전자 위치에 대한 본 발명의 mTAS 타겟 증폭올 통한 2 차 PCR 산물의 아가로오스 젤 전기영동 사진이다. 빨간색 삼각형은 원하는 타겟 ¾플리콘의 크기를 나타낸다.
도 4 는 20 개의 인간 게놈 유전자 위치에 대한 mTAS 타겟 시뭔싱 데이터를 요약한 도면이다. mTAS 실험은 세 번에 걸쳐서 반복되었다 (각각 녹색, 파란색 및 빨간색 막대로 표시됨). 수평축은 Sanger 시퀀싱 결과에 기반한 타겟 어셈블리 서열로부터 소망하는 타겟 서열의 빈도 (rate)를 나타낸다 (참고： 표 12 내지 표 16).
도 5 는 폐암 환자로부터 3 개의 다른 액손에 존재하는 EGFR 돌연변이들에 대한 mTAS 실험 결과이다. 정상 조직 (A) 및 종양 조직 (B)으로부터 EGFR 돌연변이에 대한 mTAS 타겟 결과를 보여주는 아가로오스 젤 데이터이다ᅳ 빨간색 삼각형은 원하는 타겟 앰플리콘의 크기를 나타낸다. 8 개의 종양 및 정상조직 시료에서, T 는 종양 조직을 나타내고 'N' 은 정상 조직올 나타낸다. 패널 C는 EGFR돌연변이 검출을 위한 mTAS 에 대한 직접적인 Sanger 시퀀싱 결과이다. 환자 1， 2 및 8 은 21 번 액손에 Leu858Arg돌연변이를 가졌다. 환자 3 및 4는 19 번 액손에 결실 돌연변이 (5' -GMTTAAGAGAAGCA-3' )를 가졌다. 환자 5， 6 및 7 는 EGFR이 아닌 형태의 암 돌연변이를 가진 폐암 환자였다. 【실시예】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식올 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험재료 및 실험방법
올리고뉴클레오타이드 서열 디자인
특정 온도에서 어닐링할 수 있는 최적의 길이를 가진 mTASOnultiple target loci assembly sequencing) 을리고뉴클레오타이드를 제작하기 위해， 본 발명자들은 컴퓨터 프로그램인 Perl-mTAS 를 이용하였다. 을리고뉴클레오타이드 프로브는 타겟-특이적 서열 (타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열) 및 5' -플랭킹 어셈블리 스페이서 서열 (오버래핑 서열)로부터 제작되었다. 모든 프로브들은 거의 25 bp였으며 Tm 60°C에서 어닐링하였다. 각 타켓 게놈 유전자 위치 (genomic locus)를 위해， SNP 위치를 포함하는 7 bp의 갭 (gap)이 존재하도록 (즉， SNP위치의 좌측, 3 bp; SNP 위치, 1 bp; 및 SNP 위치의 우측， 3 bp) 디자인되었다, 디자인의 용이성을 더하기 위하여 갭의 간격은 0-3bp로 조절되었다. 비록 어셈블리 스페이서 서열이 임의적으로 제조될 지라도， 어셈블리 서열 상에 존재하는 어닐링 부위는 을리고뉴클레오타이드 간의 중첩 부위 (overlapping regions)에 대한 은도값 (temperature value)을 계산하기 위해 가장 가까운 인접 방법 (nearest neighbor methods； 19)에 기반하여 결정되었다. 인간 혈액으로부터 정제된 게놈 DNA를 이용한 mTAS 타켓 시퀀싱
본 발명자들은 건강한 지원자들로부터 얻은 혈액 시료에서 AccuPrep™ Genomic DNA Extraction Kit(Bioneer, Korea)를 이용하여 게놈 DNA 를 추출하였다. 모든 올리고뉴클레오타이드는 co隱 ercial vendors (Marcrogen, Korea; Bioneer, Korea)로부터 구매하였다, 상기 을리고뉴클레오타이드 서열은 표 1 내지 표 9에 기재되어 있다ᅳ 표 1. mTAS 를 위해 이용된 타겟 유전자 위치 및 을리고뉴클레오타이드의 리스트 (SNP검출용).
rs547154 정 방향 CAATGTTTTCCGACGAACGGnCCCGC CCGCCAGAGGCC
역 방향 CACCGGGCACAGTTACTGGCACTGTGT CCAGGTTCC
rs3750847 정 방향 CAGTAACTGTGCCCGGTGTAGGACA
TGACAAGCTGTCATTCAAGACC
역 방향 GGTGGTCTCGAGAGCCCCAGGCAGCC 알파 -1 2 Bgll l rs 17580 정 방향 GGTGGTAGATCTGATGATATCGTGGG 항트립신 IXhol TGAGTTCA
결핍증 역 방향 TCAnGTCTGACTGGCTGACGAGGGG (AATD) AAACTACAGCACC
r s28929474 정 방향 GTCAGCCAGTCAGACAATGACTCGCC
CAGCAGCTTCAGTCCCTT
역 방향 GGTGGTCTCGAGAAGGCTGTGCTGAC CATC
BRAC 암 3 Bgll l 185de lAG 정 방향 GGTGGTGGTGGTAGATCTTTGTGCTG 돌연변이 IXhol ACTTACCAGATGG
역 방향 ATCGATTCAGATGCTTTCACAACATG TCATTAATGCTATGCAGAAAATOT
5382 i nsC 정방향 GTTGTGAAAGCATCTGAATCGATGGA
GCnTACCTTTCTGTCCTG 역방향 GTCTCAATCGTCCGAAATCTTAAAAG GTCCAAAGCGAGCAAG
6174de lT 정방향 TTAAGATTTCGGACGATTGAGACCTT
GTGGGATmTAGCACAGC 역 방향 GGTGGTGGTGGTCTCGAGCATCTGAT ACCTGGACAGATTTTC
클로파도 5 Bgll l rs4244285 정방향 GGTGGTAGATCTGCAATMmTCCC
그텔 (Pla iXhol ACTATCATTGATTAT T
vix) 역 방향 CTGGGATCGATTAAGTAAGTTGAACGCA 효능 AGGT TTAAGTAATTTGTTATGGGT
rs4986893 정방향 GTTCAACTTACTTAATCGATCCCAGATC
AGGATTGTAAGCACCCC
역 방향 CTACGACCGATCGCAATCAGCAAAAAAC HGGCCTTACCTG
rs28399504 정 방향 TGAHGCGATCGGTCGTAGAGGTAGGTCT
TAACAAGAGGAGAAGGCT
역 방향 CCTGGCCCTTCAGAGGTATCGCACMGGA CCACAAAAGGAT
rs41291556 정 방향 GATACCTCTGAAGGGCCAGGATCAGGGAA
TCGTTTTCAGCAATGGAAAG
역 방향 CGAGCTGATCTGGTGGCAGAAACGCCGGA TCTCCT
rs 12248560 정 방향 GCCACCAGATCAGCTCGATCAGACGnCA
AATTTGTGTCTTCTGTTCTCA
역방향 GGTGGTCTCGAGGGCGCATTATCTCTTAC ATCAGA 표 . mTAS 를 위해 이용된 타겟 유전자 위치 및 올리고뉴클레오타이드의 리스트 (SNP 검출용) .
CGCTCTCCATAGCAA
GGTGGTCTCGAGGTGGCAACATGAAAAGAG
역방향
TCC
혈 소 2 Bglll rs 1800562 정방향 GGTGGTAGATCTCCTGGGGAAGAGCAGAGA 침착증 IXhol TATA
역방향 CTACGGATCACTCACTTGTAACTTAGCCTG GGTGCTCCACC
rs 1799945 정방향 TAAGTTACAAGTGAGTGATCCGTAGGACCA
GCTGTTCGTGTTCTAT
역방향 GTTTTGCTTCGCACAAAAAGTGTCCACACG GCGACTCT
파킨슨 1 rs34637584 정방향 CACTTTTTGTGCGAAGCAAAACGATCCATC 병 ATTGCAMGATTGCTGAC
역방향 GGT iTCTCGAGCATTCTACAGCAGTACTG AGCAA
건선 3 Bglll rs 10484554 정방향 GGTGGTAGATCTAGGTCCCCTTCCTCCTAT
IXhol CT
역방향 CTGGGATCGATTAAGTAAGTTGAACGGCAG GCTGAGACGTC
rs3212227 정방향 GnCAACTTACTTAATCGATCCCAGCTGAT
TGTrTCAATGAGCATTTAGC 역방향 CTACGACCGATCGCAATCAGCAAAATCACA ATGATATCTTTGCTGTAITTGTATA
rs 11209026 정방향 TGATTGCGATCGGTCGTAGAGGTAGnCTT
TGATTGGGATAriTMCAGATCAT 역방향 GGTGGTCTCGAGGAAATTCTGCAAAAACC TACCCA
전립선암 5 EccRl rs 1447295 정방향 GGTGGTGMTTCTGCCATTGGGGAGGTAT
/Notl GTA
역 방향 CAATGTAGAMGCCAGGGTCTAGGTTCCT
GT GCTTTTTTTCCATAG
rs6983267 정 방향 TAGACCCTGGCmCTACATTGCAACCTT TGAGCTCAGCAGATGA
역 방향 TGACGGGCACTTAGTCCTCGCACATAAAA ATTCTTTGTACTTTTCTCA
rs 10505483 정 방향 GAGGACTAAGTGCCCGTCACTGACGCATA
GGGCCCTGGGCTTA
역방향 CCGAGATTAGTTCTGGAACGTCTCTGTTC TAAGGCTCATGGC
r s 1859962 정 방향 GACGTTCCAGAACTAATCTCGGAATACTT rrCCAAATCCCTGCCC
역 방향 GCGTCAGTGTGCAGATCAAAATOTGGGA CCTTTAAAGTGTTC
rs4430796 정 방향 TGATCTGCACACTGACGCCACGCGGAGAG
AGGCAGCACAGACT "
역방향 GGTGGTGCGGCCGCTGCCCAATTTAAGCT TTATGCAG 표 3 . mTAS 를 위해 이용된 타겟 유전자 위치 및 을리고뉴클레오타이드의 리스트 (SNP 검출용) .
역방향 CCCATACCGCTGCTCGCTTCnGGCTGGA GGGC
rs2476601 정 방향 CGAGCAGCGGTATGGGCCGCTTCACCCAC
AATAAATGATTCAGGTGTCC
역방향 GGTGGTCTCGAGCCCCCTCCACTTCCTGTA 류마티스 3 EcdRl r s3890745 정 방향 GGTGGTGAAnCCTGAGGGAGGGCCCAA 관절염 iXhol 역 방향 CGTCCATGCCACTGCGGGGGAAAnGHAC 단편 2 AAATCCAGAC
rs2327832 정 방향 CGCAGTGGCATGGACGAAGATACCGGCACT
TCAATAMAMAMTTCTTMATGMAM
역 방향 GGTAGGCACCTGGCATGACATCTTCAGTTG AGGTGTCCITT
rs3761847 정 방향 TCATGCCAGGTGCCTACCnGTGCAGTCCC TTCTCTCCCCTCC
역 방향 GGTGGTCTCGAGAGAGAGGGTGGTAHGAG GC
류마티스 6 EccRl rs6457617 정 방향 GGTGGTGAATTCCCATATGCACAGATCITT 관절염 IXhol GTTAGTCA
긴 역 방향 TGCGTCCAGAGAGMCGTATTGTTGAGTCC 어셈블리 ATGAGCAGAT
단편 rs ll203366 정방향 TACGTTCTCTCTGGACGCATGTTTAGGTCG
TGGATATTGCCCAC
역 방향 CCCATACCGCTGCTCGCTTCTTGGCTGGAG GGC
r s2476601 정 방향 CGAGCAGCGGTATGGGCCGOTCACCCACA
ATAAATGATTCAGGTGTCC
역 방향 CTGGGATCGATTAAGTAAGnGAACCCCCC TCCAOTCCTGTA
r s3890745 정 방향 GTTCAACTTAOTAATCGATCCCAGCTGAG
GGAGGGCCCAA
역 방향 CGTCCATGCCACTGCGGGGGAAATTGTTAC
AAATCCAGAC
r s2327832 | 정 방향 CGCAGTGGCATGGACGAAGATACCGGCACT
TCAATAAAAAAAAATTOTAAATGAAAM
역방향 GGTAGGCACCTGGCATGACATCTTCAGTTG AGGTGTCCTTT
rs3761847 | 정방향 TCATGCCAGGTGCCTACCTTGTGCAGTCCC
TTCTCTCCCCTCC
역 방향 GGTGGTCTCGAGAGAGAGGGTGGTATTGAG
GC
표 4. mTAS 를 위해 이용된 타겟 유전자 위치 및 을리고뉴클레오타이드의 리스트 (SNP 검출용) .
rs3741208 정방향 GCAGAATGACCCTTCATAACTTCATCGGTTG
TTGCCTCTCCC
역방향 GGTGGTCTCGAGTGGACAGGAGACTGAGGAG
10 제 1형 4 EccRl rsl893217 정방향 GGTGGTGAATTCCACTTGTCACCAnCCTAG -2 당뇨병 IXhol GG
단편 2 역방향 CCGATGCGCTGGACTATTAGATACACTCTTC
TTCCTCTACCT
rs2476601 정방향 AATAGTCCAGCGCATCGGAATGCGTCCACAA
TAAATGATTCAGGTGTCC
역방향 TTTGCCTAAOTGCGCATTTCCCCCTCCACT TCCTGTA
rs3184504 정방향 AAATGCGCAAGnAGGCAAACGCTAGCATCC AGGAGGTCCGG
역방향 CGTACTCAAATCTTACCACGG1TCAAGCCGT GTGCACC
rs725613 정방향 ACCGTGGTAAGATTTGAGTACGTTCGCTGCC
TATCAGTGTTTAGCAC
역방향 GGTGGTCTCGAGATCMGACGCCAGGCAC 표 5. mTAS 를 위해 이용된 타겟 유전자 위치 및 을리고뉴클레오타이드의 리스트 (SNP 검출용).
세 질환 유전자 클로닝을 유전자 프라이머 (5' ->3' )
ΐ:느 위치 위한 위치
# 표현형 (개수) 제한효소 (loci)
이름
10 제 1형 8 EccRl rs3129934 정방향 GGTGGTGAATTCTCACTCTCGTTAnCTA 당뇨병 IXhol GGATACATTATATT
긴 역방향 CGCTAGCTTTACCGCTOTCCTTAGTGAA 어셈블리 GTGGCCGG
단편 rs3087243 ᄋ AAGAGCGGTAAAGCTAGCGGACTGCTGAT
TTCTTCACCACTATTTGGGATAT
ᄋ TCAACCTCATATGGTAATCGGGAGGACTG CTATGTCTGTGTTAAC
rs 1990760 정방향 CCCGATTACCATATGAGGnGATCGTCGG CACACTTCT TGCA
역방향 GMGTTATGAAGGGTCATTCTGCAGGGAA CT TACATTGTAAGAGAAAAC
rs3741208 정방향 GCAGAATGACCCTTCATAACTTCATCGGT
TGTTGCCTCTCCC
역방향 CTGGGATCGATTMGTAAGTTGMCTGGA CAGGAGACTGAGGAG
rs 1893217 정방향 GTTCAACTTACTTAATCGATCCCAGTGTC
ACCAHCCTAGGGACA
역방향 CCGATGCGCTGGACTATTAGATACACTCT TCTTCCTCTACCT
rs2476601 정방향 AATAGTCCAGCGCATCGGAATGCGTCCAC
AATAAATGATTCAGGTGTCC
역방향 TTTGCCTAACTTGCGCAITTCCCCCTCCA CTTCCTGTA
rs3184504 정방향 AMTGCGCAAGTTAGGCAAACGCTAGCAT
CCAGGAGGTCCGG
역방향 CGTACTCA TCTTACCACGGTTCAAGCC GTGTGCACC
rs725613 정방향 ACCGTGGTAAGAT TGAGTACGnCGCTG CCTATCAGTG1TTAGCAC 역방향 GGTGGTCTCGAGATCMGACGCCAGGCAC 제 2형 5 EccRl rs7903146 정방향 GGTGGTGAATTCCAATTAGAGAGCTAAGC 당뇨병 iXhol ACTTTTTAGATA
단편 1 역방향 TCACCTAGGATTAACCATCCCTGTGCCTC
ATACGGCAATTAAATTATATA
rsl801282 정 방향 AGGGATGGTTAATCCTAGGTGACMCTCT
GGGAGATTCTCCTATTGAC
역 방향 GCTCTGGAACTAAATCTGGACATCAGTGA AGGAATCGCTTTCTG
r s5219 정 방향 IGTCCAGATTTAGnCCAGAGCGGAGCAC GGTACCTGGGCT
역방향 ACGCTGGCCACCAATAnGGCAGAGGACC CTGCC
r s4402960 정방향 AATATTGGTGGCCAGCGTTCAAATTAGTA
AGGTAGGATGGACAGTAGATT
역 방향 ACGGATGCAAAGTTGACGAATGmGCAA ACACAATCAGTATCTT
rsllll875 정방향 nCGTCAACTTTGCATCCGnCATAGAGT GCAGGTTCAGACGTC
역 방향 GGTGGTCTCGAGCGTACCATCAAGTCATT TCCTCT 표 6 . mTAS 를 위 해 이용된 타겟 유전자 위치 및 올리고뉴클레오타이드의 리스트 (SNP 검출용) .
r sl0012946 GAACAAGCAGTAAACTAAAACACCTTGGCT 정 방향
CAAGTGCTCACTCA
CCGATAAGGAGGCTCGAATGGCAGAATACC
역 방향
CTCTGGTTTATOA
r s2383208 정방향 CATTCGAGCCTCCTTATCGGAGAAACTGTG
ACAGGAAGGAAGTCC 역 방향 GGTGGTCTCGAGTTGAAACTAGTAGATGCT CAATTCATG
제 2 형 9 Ec Rl r s7903146 GGT^TGAATTCCAA TAGAGAGCTMGCA 정 방향
당뇨병 lXho\ CTTTrTAGATA
긴 역 방향 TCACCTAGGAnAACCATCCCTGTGCCTCA
TACGGCAATTAAATTATATA
어 셈블리
단편 r s 1801282 AGGGATGGTTAATCCTAGGTGACAACTCTG 정 방향
GGAGATTCTCCTATTGAC
GCTCTGGAACTAMTCTGGACATCAGTGAA
역 방향
GGAATCGCTTTCTG
rs5219 TGTCCAGA TTAGTTCCAGAGCGGAGCACG 정 방향
GTACCTGGGCT
ACGCTGGCCACCAATATTGGCAGAGGACCC
역 방향
TGCC
r s4402960 정 방향 AATATTGGTGGCCAGCGTTCAAATTAGTAA
GGTAGGATGGACAGTAGATT 역방향 ACGGATGCAMGTTGACGAATG TTGCAAA CACAATCAGTATCn rsllll875 정방향 nCGTCAACTTTGCATCCGTTCATAGAGTG CAGGTTCAGACGTC
역방향 CTGGGATCGATTAAGTAAGnGAACCGTAC CATCAAGTCATTTCCTCT
rs4712523 정방향 GTTCAAOTACTTAATCGATCCCAGTTCTC
CTTCTGTTGCACCC
TGCACGGGATATCATCACGTGTAAATCTTT
역 방향
ACAITTGGGTATAAAGGAT rs 13266634 CGTGATGATATCCCGTGCACTGATGCTTTA 정방향
TCAACAGCAGCCAGC 역 방향 AGGTGTTTTAGTrTACTGCTTGTTCGAACC ACTTGGCTGTCCC rs 10012946 GAACAAGCAGTAAACTAAAACACCTTGGCT 정 방향
CAAGTGCTCACTCA
CCGATAAGGAGGCTCGAATGGCAGAATACC
역 방향
CTCTGGTTTATTCA
rs2383208 CATTCGAGCCTCCTTATCGGAGAAACTGTG 정 방향
ACAGGAAGGAAGTCC
GGTGGTCTCGAGTTGAAACTAGTAGATGCT
역 방향
CAATTGATG 표 7. mTAS 를 위 해 이용된 타겟 유전자 위치 및 올리고뉴클레오타이드의 리스트 (SNP 검출용) .
DDDVD10I31VI3VLL9V3D333030I0DIDD
13LL1X0VVIVX93I0I
W333DV3VDDV0VIDD3WDWIVD03I3VI I6I½08S J I
idovmoiodD
LL33I3I3IV1DVD33IVJJ,3113D3VI0I33
I3D3113LLV1LXXDV
DVD3IDV313DV3VID1L L0D31133IV10D Z99S08SS J
WD 3IV
3DD9IV33DD3VXV3DVV9D3WWDVI3I0D
VOVOILDVLLUVIO
3D3V3DVD3JID3V30V3VDDDI9I3DX0DVI 8^9612is z
01
3I3391VDDDV333V133V33V3V3331013D I
o o o
V3VD0D1WV3I3I3DV9I30LLVV0I30IDD 쒜 I Π
VD33I3LL
IVVD1DDV0IWW1333D33DD30I0DI0D
niwwovivooovDV
3D1133X03DIV3I3110VI33VDVDI9I03
IDD13DD9
I3I0DV0D0D3V3V3I3X00VI9WDV01VD
VWDDVOWWDOIV
3I33DV3V3DV1D13DDX3VIV3VDV0IV3D C86S6 sJ
D13VDI01LLDVI911L3LL
VWWIV3V3DiV3I3I9IVI9V303V9V13
9W \J°NI
V9IV0V3DVD133V0X1L33I1W0ID0I90 Z9CS869S £ ετ
33V1L33IVD
IW1WVI0V1WW9X33DV3313I9DID9
3LL033IVD33LLD
808ΐ00/Ζΐ0ΖΗΜ/Χ3<Ι S96쒜 OAV
15 루푸스 4 BglW rs9888739 정방향 GGTGGTAGATCTAGTATGCAGAACTCACTATG (전신 iXhol TTGTAA .
홍반성 역 방향 GGCACGGTGATGTGGCAGTCAAAGAGGTTCTA 루푸스) TATTTITATCATTACAG
rs7574865 정방향 GCCACATCACCGTGCCCGCGGATaAAGTATG AAAAGTTGGTGACCAAAA
역방향 GACAGTAGCCATCTTCCAGGGAMnCCACTG AAATAAGATMCCACT
r s2187668 정방향 CCTGGAAGATGGCTACTGTCTCGTGAACAATC
ATTTTACCACATGGTCC
역방향 GATTTCCCTCAGTTGTGTAGACACACATATGA GGCAGCTGAGAG
rs 10488631 정방향 TGTCTACACAACTGAGGGAAATCAAGGCTGCT
TCCATAGCTAGTCT
역 방향 GGTGGTCTCGAGGCCTTGTAGCTCGGAAATGG 표 8 mTAS 를 위 해 이 용된 타겟 유전자 위 치 및 올리고뉴클레오타이 드의 리스트 (SNP 검출용 ) .
AATAGGTGAGCTGTC
역방향 GGTGGTCTCGAGGAGCCTCTCCCTGCCA
궤양성 4 BglW rs2395185 정방향 GGTGGTAGATCTACTACTACACTACATGAAGC
대장암 /Xhol CAAAAA
역방향 CTGGGATCGATTAAGTAAGHGAACACAGCAG
AATTCTCCAGGGA
rs9858542 정방향 G CAACTTACTTAATCGATCCCAGCGAGCAA
GCTGGCAAACT
역방향 CTACGACCGATCGCAATCAGCAAAATGCAGGC
AGTGCATACC
rs 10883365 정방향 TGATTGCGATCGGTCGTAGAGGTAGTTCGTTC
TCAGACGGTTTGAA
역방향 CCTGGCCCTTCAGAGGTATCGCACAGGGGTCA
CGTTGGCAC
rsll209026 정방향 GATACCTCTGAAGGGCCAGGATCAG CTTTG
ATTGGGATA1TTAACAGATCAT
역방향 GGTGGTCTCGAGGAAATTCTGCAAAAACCTAC
CCA
알코을 1 Bglll rs671 정방향 GGTGGTAGATCTCGGGCTGCAGGCATAC
/Xhol 역방향 CTGTTITGCGCTCGCGGTCCCACACTCACAGT
TTTCA
쓰入 1 rs713598 정방향 CGCGAGCGCAAAACAGCGOTGGACGCACACA
인지 ATCACTGTTGCTCA
역방향 CCAATGGAAAAGCTGCAGGAG TTTTTGGGA
TGTAGTGAAGAGG
귀지 1 rsl7822931 정방향 TCCTGCAGCTTTTCCAnGGCTAGCACCAAGT
유형 CTGCCACTTACTG
역방향 GGTGGTCTCGAGGCTTCTGCATTGCCAGTGTA ¬ᄀ 1 Bglll rs 12913832 정방향 GGTGGTAGATCTGGCCAGTTTCAnTGAGCAT
lXho\ TAA
역방향 AGAGGTAATTCCTTGTGTGCATTAGCGTGCAG AACTTGACA
유당불 1 rs4988235 정방향 AATGCACACAAGGAAHACCTCnCGnCCn 내증 TGAGGCCAGGG
역 방향 CGCCGGACAAAAGTACTCTGCTGGCAATACAG ATAAGATAATGTAG
말라리아 1 rs2814778 정 방향 AGAGTACTTTTGTCCGGCGGCGTCACCCTCAT 저항성 TAGTCCTTGGCTCTTA
(더피 역 방향 TGCCTAACCTCCnAATCGGATGCGCCTGTGC 항원 ) TTCCAAG
근수행 력 1 rs 1815739 정 방향 ATCCGATTAAGGAGGTTAGGCAGGCACTGCCC
GAGGCTGAC
역 방향 GGTGGTaCGAGGATGGCACCTCGCTCTC
20 노로바이 1 BglU rs601338 정방향 GGTGGTAGATCTCCGGCTACCCCTGCT 러스 IXhol 역 방향 GCCCATATTCCAGGGCCCGCGGAGGTGGTGGT 저 ¾성 AGAAG
하지블안 1 rs3923809 정 방향 GGGCCCTGGAATATGGGCMCATGCAGTGAAA 즈 ᄒ구 ATAMATGATAGCTTTCTCTCT
역 방향 GGTGGTCTCGAGGTCCTACTGAATTGCAGATG GAT 표 9. mTAS 를 위해 이용된 타겟 유전자 위 치 및 을리고뉴클레오타이드의 리스트 (SNP 검출용) .
TGATTGCGATCGGTCGTAGAGGTAGAGGTAAMGTTMMTTC
19번 액손 정방향
CCGTCGCTATC
(결실
CTG^ATCGMTAAGTMGTTGAACCCTTGTrGGCTTTCGGAG 돌연변이) 역방향
A
GTTCAACTTACTTAATCGATCCCAGGCATGTCAAGATCACAGA
정방향
21번 액손 TTTTGG
(Leu858Arg) CCTGGCCCTTCAGAGGTATCTGCATGGTATOTTTCTCnCCG 역방향
CA 정방향 GATACCTCTGAAGGGCCAGGCATCTGCCTCACCTCCACC
21번 엑손
(Leu858Arg) GCACGATGCCGGTGAACGCGGCCGCCACCAGTTGAGCAGGTAC 역방향
TG
* EGFR 돌연변이 검출을 위한 프라이머 서열 (5' —> 3' )： 정방향 프라이머, ATCTCGATCCCGCGAAATTMTACG; 및 역방향 프라이머， GCACGATGCCGGTGAAC
다양한 엄플리콘을 생산하기 위해, 본 발명자들은 상기 프로브들로 어셈블리 PCR 를 실시하였고， 이후 소망하는 긴 DNA 서열을 제작하기 위해 2차 (second-round) 어셈블리 과정에서 중첩하는 스페이서 서열 (over lapping spacer sequences)을 이용하였다. 첫 번째 어셈블리 PCR 단계에서， 본 발명자들은 mTAS 올리고뉴클레오타이드, 게놈 DNA, 물 및 h-Taq premix™ DNA 폴리머라제 (Solgent, Korea)를 이용하여 타겟 DNA 서열을 증폭하였다. PCR 반웅은 다음과 같이 실시하였다: (a) 전변성 단계, 95°C에서 3 분; (b) 95°C에서 30 초， 60°C에서 60 초 및 72°C에서 30 초로 이루어진 40 사이클의 PCR 단계 ; 및 (c) 최종 연장 단계， 72°C에서 10분. PCR 반응 후, 최종 산물을 4°C에서 보관하였다. 본 발명자들은 외측 플탱킹 프라이머， 5 ^의 첫 번째 PCR 산물， 10 ^의 h-Taq premix™ DNA 폴리머라제 및 5
^의 물을 이용하여 1 차 PCR 반웅에 이용된 동일한 PCR 조건 하에서 2 차 PCR 반웅을 실시하였다. PCR 반웅 용량은 20 ^였다. PCR 반웅의 상세 조건은 표 10 및 표 11에 기재되어 있다. 표 10. mTAS를 위한 어셈블리 첫 번째 (First-step) PCR프로토콜.
15세트 10 2 1.2 8 325
16세트 10 4 1.2 6 228
17세트 10 2 1.2 8 297
18 세트 10 4 1.2 6 218
19 세트 10 2 1.2 8 250
20세트 10 6 1.2 4 149 표 11. mTAS를 위한 어셈블리 두 번째 (Second-step) PCR 프로토콜.
2 차 PCR 후, 본 발명자들은 \ 아가로오스 젤 전기영동을 통해 DNA 를 분석하고 젤로부터 예상된 크기의 산물들을 절단하였다。 명확한 산물 밴드를 얻을 수 없는 경우에， 본 발명자들은 변형된 갭 길이를 인풋으로 이용한 Perl-mTAS 프로그램을 다시 실시하였는데， 이는 보다 개선된 mTAS 을리고뉴클레오타이드 세트를 제공하였다. 상기 재디자인된 세트는 9ᅳ 1， 9-2， 9 긴 세트， 10-2, 10 긴 세트， 11-1， 11-2, 11 긴 세트, 12， 13 및 19 세트를 포함하였다 (표 10).
본 발명자들은 AccuPrep™ 젤 정제 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 증폭된 산물을 정제하여 제한효소 (Fermentas)를 이용하여 백터 (pTWINl; New England Biolab)로 클로닝한 후, E. ^//(competent eel Is)에 형질 전환시켰다. 제한효소 위치는 표 1 내지 표 9에 요약되어 있다. 증폭된 산물들의 올바른 삽입을 확인하기 위해, 하룻밤 동안 성장시킨 후 임의적으로 선택된 콜로니에 대한 콜로니 PCR 을 통해 스크리닝하였다. 적합한 콜로니를 카르베니실린 (Sigma-Aldrich)을 포함하는 LB 브로스 (BD Science)로 옮겨서 배양하고 AccuPrep™ 플라스미드 추출 키트 (Bioneer,
Korea)를 이용하여 플라스미드 추출 후 프라이머 (5' - GAAGAAGGTAAACTGACAAATCC-3' )를 이용하여 시뭔싱하였다. 결과적인 시퀀싱 데이터는 Laser gene (DNAs tar, Madison, WI)을 이용하여 분석하였다. 폐암 조직으로부터 정제된 게놈 DNA를 이용한 mTAS 타겟 시퀀싱
본 발명자들은 AccuPrep™ 게놈 DNA 추출 키트 (Bioneer, Korea)를 이용하여 폐암 종양 조직 및 정상 조직으로부터 게놈 DNA 를 추출하였다. mTAS 조건은 상술한 바와 동일하였다. 2 차 PCR 후， 본 발명자들은 아가로오스 (Bioneer) 젤 전기영동하고 소망하는 산물을 절단하였다. 본 발명자들은 젤-정제된 DNA 시료를 Sanger 시퀀싱으로 시퀀싱한 후, Lasergene(DNAstar, Madison, WI)을 이용하여 시퀀싱 데이터를 분석하였다. 실험결과 및 추가논의사항
mTAS 방법은 거대한 DNA 스트레치 (stretches)를 구축하는 방법인 폴리머라제 사이클링 어셈블리 (polymerase cycling assembly, PCA; 17)의 장점을 가진다. 전형적으로, PCA 방법은 PCR 을 통해 어셈블리하도록 디자인된 많은 중첩 을리고뉴클레오타이드들을 이용한다. mTAS 타겟 시뭔싱을 위해, 본 발명자들은 많은 PCA 프로브를 디자인하였는데， 각각의 PCA 프로브들은 3' -말단에 타겟-특이적 서열 및 5' -말단에 어셈블리 스페이서 서열을 가진다 (도 1). 우선， 상기 프로브들은 많은 짧은 앰플리콘들을 발생시키고 어셈블리 과정의 2 차 라운드에서 중첩하는 스페이서 서열들은 짧은 앰플리콘들이 소망하는 DNA 서열로 어셈블리하도록 이용된다.
타겟된 시뭔싱을 위한 mTAS 의 유용성을 테스트하기 위해， 본 발명자들은 상업적으로 유용한 유전 테스팅 서비스 웹 사이트 (ht t ps： //www .23andme . com/ )에 나열된 다양한 세트의 질환- 및 특이적 표현형-관계된 인간 SNP 들 (18)을 어셈블리하였다. 선택된 SNP 서열들은 표 1 내지 표 9 에 기재되어 있다. mTAS 실험들을 위한 올리고뉴클레오타이드의 디자인을 용이하게 하기 위해， 본 발명자들은 Perl 프로그램인 PerHnTAS 를 개발하였다. 간략하게는, Perl-mTAS 프로그램은 타겟 유전자 위치의 길이인 SNP ID 및 올리고 어셈블리 온도를 포함하는
특정 인풋 변수들에 최적화된 중첩하는 을리고뉴클레오타이드들을 디자인한다. 인접한 올리고뉴클레오타이드와 중첩하는 부위에 대한 어셈블리 온도를 계산하기 위해， 본 발명자들은 가장 가까운 인접 방법 (nearest neighbor methods; 19)을 이용하였다。 PerHnTAS 프로그램으로부터 디자인된 올리고뉴클레오타이드 서열들은 표 1 내지 표 9에 나열되어 있다.
mTAS 를 위한 어셈블리 과정은 2 단계로 진행된다. 본 발명자들은 인간 혈액으로부터 정제된 게놈 DNA 를 이용하였다. 첫 번째 어셈블리 단계는 약 100 bp 의 앰플리콘 흔합물을 생산하였다 (도 2). 이후, 본 발명자들은 첫 번째 증폭 산물들의 분취액을 추가적인 정제 없이 두 번째 어셈블리 과정을 시작하기 위해 층분한 양의 플탱킹 프라이머 올리고뉴클레오타이드 쌍과 흔합하였다. 어셈블리 과정에 최적화된 프로토콜을 이용하여 (참고: 실험방법)， 본 발명자들은 26 개의 mTAS 실험 세트로부터 25 개의 앰플리콘을 어셈블리할 수 있었다 (도 3). 본 발명자들은 첫 번째 및 두 번째 어셈블리 단계를 위해 이용된 올리고뉴클레오타이드의 농도가 주요 산물로서 소망하는 앰플리콘을 얻는 데 중요하다는 것을 발견하였다 (실험방법， 표 10 및 표 11). 또한， 본 발명자들은 대부분의 실험에서 2 개 내지 5 개의 SNP 들의 어셈블리가 고효율로 일어난다는 것을 발견하였다 (도 1). 본 발명자들은 표현형에 기반된 2 개 내지 5 개의 SNP 들을 그룹화하였다. 예를 들어， 본 발명자들은 하나의 세트로서 웹 사이트 (htt ps： //www .23andme . com/ )에 AMD(Age-r elated Macular Degeneration)를 위해 나열된 모든 SNP 유전자 위치들을 이용하였다. 하나의 SNP 만을 포함하는 표현형의 경우， 본 발명자들은 하나의 mTAS 실험을 실시하기 위해 몇몇 SNP 들을 합쳐서 이용하였다. 놀랍게도， 류마티스 관절염 (6 개의 SNPs), 제 1 형 당뇨병 (8 개의 SNPs) 및 제 2 형 당뇨병 (9 개의 SNPs)에서 확인된 바와 같이 본 발명자들은 6 개 내지 9 개의 유전자 위치들의 mTAS 타겟 시뭔싱을 획득하였다 (도 3). 하지만， 본 발명자들은 SNP 의 수가 6 개 이상인 경우 증폭 정도가 덜 효과적이라는 것을 확인하였다. 이에 따라 본 발명자들은 SNP 의 수가 5 개 이상인 경우에는 mTAS 실험을 2 개의 세트로 나누어 실시하는 것이 더 효율적일 수 있다고 생각한다.
보다 상세하게 mTAS 방법을 분석하기 위해， 본 발명자들은 앰플리콘들을 클로닝하고 Sanger 시퀀싱을 이용하여 캡쳐된 타겟 유전자 위치의 서열을 확인하였다. 본 발명자들은 어셈블리 앰플리콘들로부터 몇몇 타겟 유전자 위치의 소실을 초래하는 아주 경미한 예외들이 있지만 대부분의 타겟 서열들이 완벽하게 어셈블리되는 것을 확인하였다 (표 12 내지 표 16). mTAS로부터 얻어진 Sanger 시뭔싱 결과.
서열결과 CT,CT,CT,CT Τ,Τ,Τ,Τ A, A, A, A
실험
2nd
서열결과 CT,CT,CT;CT Τ,Τ,Τ'Τ A, A, A, A
실험
3rd
서열결과 CT,CT,CT,CT Τ,Τ,Τ,Τ A, A, A, A
실험
SNP 위치 rs4244285 rs4986893 rs28399504 rs41291556 rs 12248560 원 염기 G G A T C
1st
서열결과 G,G G,G A, A TJ C,C 실험
4 세트
2nd
서열결과 G,G,G G, G/A A, A, A Τ,Τ,Τ C,C,C 실험
3rd
서열결과 G,G,G A, A/G Α,Α,Α Τ,Τ,Τ C.C.C 실험
SNP 위치 rs2187668 rs6822844
원 염기 C G
1st
서열결과 cccc G,G,G,G
5 세트
2nd
서열결과 C,C,C G,G,G
실험
3rd
서열결과 C,C,C G,G,G
실험
- 본 발명자들은 각 세트에서 3 개의 반복 실험들 (1st, 2nd 및 3rd 세트로 나타냄)을 실시하였다. 또한, 본 발명자들은 각 결과로부터 다수의 콜로니들을 시뭔성 (첫번째 실험은 4 개의 콜로니를 이용하고， 두 번째 및 세 번째 실험은 3 개의 콜로니를 이용하여 시퀀성)하였으며, 각 시뭔싱 데이터들을 콤마로서 나열하였다.
표 13. mTAS로부터 얻어진 Sanger 시퀀싱 결과.
원 염기 C G A
1st
서열결과 T, T/C A, A/G G,G,G
9-1 실험
세트 2nd
서열결과 C, C/T A, A, A G,G,G
실험
3rd
서열결과 T, T/C A, A/G G,G,G
실험
SNP 위치 rs3890745 rs2327832 rs3761847
원 염기 T A G
1st
서열결과 C, C/T A, A, A A, A/G
9-2 실험
세트 2nd
서열결과 C, C/T A, A, A G, G/A
실험
3rd
서열결과 C,C'C A, A, A A, A/G
실험
- 본 발명자들은 각 세트에서 3 개의 반복 실험들 (1st, 2nd 및 3rd 세트로 나타냄)을 실시하였다. 또한， 본 발명자들은 각 결과로부터 다수의 콜로니들올 시뭔싱 (첫번째 실험은 4 개의 콜로니를 이용하고, 두 번째 및 세 번째 실험은 3 개의 콜로니를 이용하여 시뭔싱)하였으며， 각 시뭔싱 데이터들을 콤마로서 나열하였다. 표 14. mTAS로부터 얻어진 Sanger 시퀀싱 결과.
2nd
서열결과 CCC G,G,G c,c,c G,G,G G.G/A G,G,G ccc G.G/T 실험
3rd G,
서열결과 ccc G,G,G ccc A, A, A G,G,G ccc G,G,G 실험 G/A
rs521 rs440
SNP 위치
9 2960
원 염기 c c T G A
1st
11-1 서열결과 c,c,c ccc T,T,C G,G,G Τ,Τ,Τ
실험
세트
2nd
서열결과 c'c c,c C,C G,G C,T
실험
3rd c,
서열결과 ccc C,T,T G,G,G C/x,x
실험 C/x
발명자들은 각 세트에서 3 개의 반복 실험들 (1 세트로 나타냄)을 실시하였다. 또한， 본 발명자들은 각 결과로부터 다수의 콜로니들을 시퀀싱 (첫번째 실험은 4 개의 콜로니를 이용하고, 두 번째 및 세 번째 실험은 3 개의 콜로니를 이용하여 시퀀싱)하였으며， 각 시¾성 데이터들을 콤마로서 나열하였다. 표 15. mTAS로부터 얻어진 Sanger 시퀀싱 결과.
서열결과 G,G,G C,C,C C,C,C A, A, A
실험
3rd
서열결과 G,G'G Τ,Τ/C ccc Α'Α,Α
실험
cs790 rsl80 rs521 rs440 rslll rs471 rsl32 rslOO
SNP 위치
3146 1282 9 2960 1875 2523 66634 12946 원 염기 C C T G C A C T A
11 Ist
서열결과 ccc ccc C,C/T G,G/T Τ,Τ'Τ G,G,G C,C/T C,C,C A, A, A 긴
세트 2nd
서열결과 c,c,c C,C,C TJ/C G,G/T C.C/T G,G/A TJ/C CCC A,A/C 실험
3rd
서열결과 c,c,c C,C,C T'T/C G,G,G T.T/C G,G,G C,C/T C,C,C A, A, A 실험
rs602 rs494
SNP 위치
5 8418
원 염기 T C
Ist
12 서열결과 C,C,C ccc
실험
세트
2nd
서열결과 C,C C,C
실험
3rd
서열결과 ccc ccc
실험
13 rs698 rs493
SNP 위치
세트 3267 9827
원 염기 G T
Is'
서열결과 T,T C,C
실험
2nd 서염 ¾과 x,x x,x
- 본 발명자들은 각 세트에서 3 개의 반복 실험들 (1st, 2nd 및 3rd 세트로 나타냄)을 실시하였다. 또한， 본 발명자들은 각 결과로부터 다수의 콜로니들을 시뭔싱 (첫번째 실험은 4 개의 콜로니를 이용하고， 두 번째 및 세 번째 실험은 3 개의 콜로니를 이용하여 시퀀싱)하였으며, 각 시퀀싱 데이터들을 콤마로서 나열하였다ᅳ 표 16. mTAS로부터 얻어진 Sanger 시퀀싱 결과.
1st
서열결과 A G T C 실험
2nd
서열결과 A, A, A G,G,G Τ,Τ,Τ C,C,C
실험
3rd
서열결과 A, A, A G,G,G Τ,Τ,Τ C,C,C
실험
SNP위치 rs601338 rs3923809
원 염기 G A
1st
서열결과 G.G.G G,G,G
실험
20세트
2nd
서열결과 G,G,G G,G,G
실험
3rd
서열결과 G,G,G G'G,G
실험
- 본 발명자들은 각 세트에서 3 개의 반복 실험들 (1st, 2nd 및 3rd 세트로 나타냄)을 실시하였다. 또한， 본 발명자들은 각 결과로부터 다수의 콜로니들을 시뭔싱 (첫번째 실험은 4 개의 콜로니를 이용하고， 두 번째 및 세 번째 실험은 3 개의 콜로니를 이용하여 시뭔싱)하였으며， 각 시뭔싱 데이터들을 콤마로서 나열하였다. 본 발명자들은 20 개의 앰플리콘들의 어셈블리를 3 번 이상 반복하였으며， 어셈블리 효율이 우수하다는 것을 확인하였다 (도 4 및 표 12 내지 표 16). 상술한 실험들에서， 본 발명자들은 mTAS 를 간략하게 평가하기 위해 클로닝 과정을 이용하였다. 하기에 논의된 바와 같이， mTAS로부터 얻어진 PCR산물들은 아가로오스 젤 정제 후 직접 시뭔싱될 수 있다.
표피성장인자 수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR)에서의 돌연변이들은 비-소세포 폐암 (non-small cell lung cancer , NSCLC)의 주요 원인이다 (16). 약 90% 이상의 EGFR 돌연변이들이 19 번
액손 (5 개의 아미노산 결실 돌연변이) 및 21 번 엑손 (단일뉴클레오타이드 변화에 따른 Leu858Arg 돌연변이)에 존재한다. 보다 중요하게는， EGFR 돌연변이들을 타켓팅하는 타이로신 키나제 억제제 약물 [제피티닙 (gefitinib) 및 엘로티닙 (erlotinib)]은 주로 20 번 액손 돌연변이 (Thr790Met)로부터 야기되는 약물 저항성 암을 발병시킨다. 현재까지 상술한 EGFR 돌연변이들의 동정이 맞춤 치료법올 위해 환자들을 스크리닝하는 데 매우 중요하기 때문에， 폐암 환자의 종양 조직 시료들이 상술한 유전자 위치들의 PCR 평가로 빈번하게 조사되어 많은 Sanger 시¾싱을 실시하고 있다.
본 발명자들은 임상적으로 매우 중요한 EGFR 타겟 서열에 대해 mTAS 시퀀싱을 적용함으로써 EGFR에 대해 디자인된 niTAS 프라이머 쌍들의 이용을 통해 DNA 시퀀싱 비용을 현저하게 감소시킬 것으로 기대하였다. 본 발명자들은 인간 폐암 조직으로부터 추출된 게놈 DNA 를 이용하여 3 개의 유전자 위치들 (19 번， 20 번 및 21 번 액손)에 대한 mTAS 타겟 증폭을 실시하였다 (도 5). 이후, 본 발명자들은 타겟 서열을 확인하기 위해 상술한 앰플리콘들의 Sanger 시퀀싱을 바로 실시하였다. 본 발명자들은 폐암과 관계된 EGFR돌연변이들 (도 5의 화살표)을 성공적으로 검출하였으며， 본 발명자들의 결과는 종래의 EGFR DNA 시퀀싱 제공자들로부터 얻어진 시퀀싱 결과들에 비해 우수하였다.
요약하면, 본 발명자들은 타겟 게놈 유전자 위치들에 어닐링할 수 있는 다양한 PCR 프라이머 쌍들을 이용하여 단일 DNA 시뭔성 실행 (runs)으로부터 상기 유전자 위치들의 정보를 수집할 수 있었다。 더 나아가， mTAS 타켓 시¾싱은 많은 타겟 유전자 위치들 (약 10 개의 유전자 위치)에 대한 동질적 풍부화 (homogeneous enrichment)를 제공하며， 타겟 유전자 위치들에 대한 특이적이고 균일한 평가를 제공한다ᅳ 그 결과， 본 발명의 mTAS 타겟 시퀀싱 과정은 일반적으로 Sanger 시퀀싱 실행에 의해 조사되는 임상 시료들의 비용ᅳ절감적 분석들에 대한 우수한 해법을 제공한다. 현재까지， 대부분의 임상 유전 테스트들은 Sanger 시뭔싱을 이용하여 실시되고 있다. 따라서， 본 발명자들은 상술한 많은 임상 유전 테스트용 타겟 유전자 위치들의 증폭에 의한 단일 서열 판독으로 Sanger 시뭔싱 비용을 매우 많이 감소시킬 수 있다. 비록 본 발명자들이 mTAS 를
평가하기 위해 본 연구에서 Sanger 시퀀싱을 이용했을 지라도, 본 발명의 방법은 실험처리량 (throughput)을 증가시키기 위해 추가적으로 고속 시퀀싱 기법과 조합 (conjugation)되어 이용될 수 있다. 예를 들어， 약 500 bp 의 판독 길이를 가지는 Rocheᅳ 454 시뭔싱 플랫품은 대부분의 서열 데이터를 유지한 채 게놈 전반에 걸쳐 퍼져있는 SNKsingle-nucleotide polymorph isms)를 검출하기 위해 mTAS와 함께 이용될 수 있다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 참고문헌
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t
o
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Claims
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci)의 하나의 단축된 핵산서열로의 어셈블리 방법 :
(a) 최소 2개의 타겟 위치를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci)를 하나의 분자 상에서 포함하는 타켓 핵산분자를 얻는 단계;
(b) 상기 최소 2개의 타겟 위치의 업스트림 방향 부위 및 다운스트림 방향 부위에 흔성화 되며 상기 타겟 위치의 플랭킹 부위 (flanking region)를 증폭하기 위한 최소 2개의 프라이머쌍을 포함하는 제 1차 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 상기 타겟 핵산분자를 제 1차 증폭하여 제 1차 증폭결과물을 얻는 단계로서; 상기 프라이머쌍 각각은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고， 상기 최소 2개의 프라이머쌍에서 상대적으로 5' -방향쪽에 위치한 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 게 1프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 게 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열 (over lapping sequences)을 포함하며; 상기 제 1타겟 위치의 3' ᅳ 방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며 ; 및
(c) 상기 제 1차 증폭결과물을 5' to 3' 방향으로 정렬한 경우에 형성되는 5' -말단 부위에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 및 3' -말단 부위에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 제 2차 증폭용 프라이머 세트 및 상기 제 1차 증폭결과물을 이용하여 제 2차 증폭하여 제 2차 증폭결과물을 얻는 단계로서， 상기 제 2차 증폭결과물은 상기 최소 2개의 타겟 위치들이 각각 인접하여 위치된 하나의 핵산서열이며 상기 단계 (a)에서 이용된 타겟 핵산분자보다 연장되어 길어진 길이를 갖는다.
【청구항 2】
다음의 단계를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci)의 동시 검출방법 :
(a) 최소 2개의 타겟 위치를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci)를 하나의 분자 상에서 포함하는 타겟 핵산분자를 얻는 단계;
(b) 상기 최소 2개의 타겟 위치의 업스트림 방향 부위 및 다운스트림 방향 부위에 흔성화 되며 상기 타겟 위치의 플랭킹 부위 (flanking region)를 증폭하기 위한 최소 2개의 프라이머쌍을 포함하는 제 1차 증폭용 프라이머 세트를 이용하여 상기 타겟 핵산분자를 제 1차 증폭하여 제 1차 증폭결과물을 얻는 단계로서; 상기 프라이머쌍 각각은 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함하고, 상기 최소 2개의 프라이머쌍에서 상대적으로 5' ᅳ방향쪽에 위치한 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 게 2프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 1타겟 위치의 3' ᅳ방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며；
(c) 상기 제 1차 증폭결과물올 5' to 3' 방향으로 정렬한 경우에 형성되는 5' -말단 부위에 상보적인 서열을 갖는 프라이머 및 3' ᅳ말단 부위에 상보적인 서열을 갖는 프라이머를 포함하는 제 2차 증폭용 프라이머 세트 및 상기 게 1차 증폭결과물을 이용하여 제 2차 증폭하여 제 2차 증폭결과물을 얻는 단계로서, 상기 제 2차 증폭결과물은 상기 최소 2개의 타겟 위치들이 각각 인접하여 위치된 하나의 핵산서열이며 상기 단계 (a)에서 이용된 타겟 핵산분자보다 연장되어 길어진 길이를 가지며; 및
(d) 상기 게 2차 증폭결과물에서 상기 최소 2개의 타겟 위치의 존재 유무를 분석하는 단계 .
【청구항 3】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 타겟 핵산분자는 최소 3개의 타겟 위치를 포함하며 상기 단계 (b)에서 이용되는 게 1차 증폭용 프라이머 세트는 최소 3개의 프라이머쌍을 포함하며 상기 최소 3개의 프라이머쌍에서 상대적으로 가장 5' -방향쪽에 위치한 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 게 1타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 게 1타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며， 상기 게 2프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 2타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 게 3타겟 위치를 증폭하기 위한 거 13프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 2타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 3타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열올 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 4】
제 3 항에 있어세 상기 타겟 핵산분자는 최소 4개의 타겟 위치를 포함하며 상기 단계 (b)에서 이용되는 제 1차 증폭용 프라이머 세트는 최소 4개의 프라이머쌍을 포함하며 상기 최소 4개의 프라이머쌍에서 상대적으로 가장 5' ᅳ방향쪽에 위치한 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의
역방향 프라이머는 (i) 제 1타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타켓 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 1타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 게 2타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 게 1프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며, 상기 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 2타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 3타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 게 3타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 4타켓 위치를 증폭하기 위한 게 4프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 게 4타켓 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타켓 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 게 3프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 5]
제 4 항에 있어서， 상기 타겟 핵산분자는 최소 5개의 타켓 위치를 포함하며 상기 단계 (b)에서 이용되는 제 1차 증폭용 프라이머 세트는 최소 4개의 프라이머쌍올 포함하며 상기 최소 4개의 프라이머쌍에서 상대적으로 가장 5' -방향쪽에 위치한 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 1타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인
타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타켓 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 1타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 게 2타켓 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 ( ) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 1타겟 위치를 증폭하기 위한 제 1프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며， 상기 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머는 (i) 제 2타겟 위치의 다운스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 2타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 3타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 2타겟 위치를 증폭하기 위한 제 2프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 3타겟 위치의 3' ᅳ방향쪽에 위치한 제 4타겟 위치를 증폭하기 위한 거 프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 4타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 3타겟 위치를 증폭하기 위한 제 3프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하며; 상기 제 4타겟 위치의 3' -방향쪽에 위치한 제 5타겟 위치를 증폭하기 위한 제 5프라이머쌍의 정방향 프라이머는 (i) 제 5타겟 위치의 업스트림 방향 부위에 상보적인 타겟 흔성화 뉴클레오타이드 서열 및 (Π) 상기 타겟 핵산분자에 비상보적이며 상기 제 4타겟 위치를 증폭하기 위한 제 4프라이머쌍의 역방향 프라이머에 상보적인 오버래핑 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. ,
【청구항 6】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 타겟 핵산분자는 DNA 또는
RNA인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 7】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 타겟 위치는 뉴클레오타이드 변이 (nucleotide variations) 위치인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8】
제 7 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이는 단일뉴클레오타이드 돌연변이 (point mutation), 삽입 돌연변이 또는 결실 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법 .
[청구항 9】
제 8 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이는 단일뉴클레오타이드 돌연변이인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 10】
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서， 상기 단계 (b)의 제 1차 증폭결과물은 70-150 bp의 앰플리콘 (amplicons)인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 11】
제 2 항에 있어서 , 상기 단계 (d)의 분석은 시뭔성 (sequencing)을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 12】
제 1 항 또는 제 2 항의 제 1차 증폭용 프라이머 세트 및 제 2차 증폭용 프라이머 세트를 포함하는 다중 타겟 위치 (multiple target loci) 검출용 키트.
【청구항 13】
제 12 항에 있어서， 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 14】
제 12 항에 있어서, 상기 타겟 위치는 최소 2개 이상인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 15】
제 12 항에 있어서， 상기 타겟 위치는 뉴클레오타이드 변이 (nucleotide variations) 위치인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 16]
제 15 항에 있어서， 상기 뉴클레오타이드 변이는 단일뉴클레오타이드 돌연변이， 삽입 돌연변이 또는 결실 돌연변이인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 17]
제 16 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 변이는 단일뉴클레오타이드 돌연변이인 것을 특징으로 하는 키트.
【청구항 18】
제 12 항에 있어서, 상기 검출은 시퀀싱을 통해 실시하는 것을 특징으로 하는 키트.
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