WO2012124738A1 - ブレオマイシン水解酵素産生促進剤 - Google Patents

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利彦 日比野
章子 山田
秀和 福島
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株式会社資生堂
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Definitions

  • the present invention provides a bleomycin hydrolase production promoter, a natural moisturizing factor production promoter or a dry skin improving agent containing the same.
  • the keratin fibers in the granule layer of the epidermis bind to and aggregate with a protein called filaggrin when keratinized to form a specific form called a “keratin pattern”.
  • the keratohyalin granules in the granule cells contain a large amount of profilagrin (10 to 12 filaggrin units arranged vertically), which is a precursor of filaggrin. Aggregates keratin fibers by phosphorylation. Thereafter, it is deiminated by the action of an enzyme called peptidylarginine deiminase (PAD), released from keratin, and then decomposed into amino acids and the like in the upper layer of the horny layer.
  • PAD peptidylarginine deiminase
  • NMF natural moisturizing factors
  • PAD acts on the arginine residue of filaggrin to deiminate and convert it to citrulline residue.
  • deamination of filaggrin weakens the affinity between filaggrin and keratin fibers, and keratin fibers are liberated.
  • filaggrin becomes susceptible to the action of proteases and is finally degraded to NMF. It is considered a thing.
  • calpain-1 as an enzyme that degrades filaggrin deiminated with PAD, and a small peptide fragment as the degradation product is reduced to amino acid units, that is, NMF by bleomycin hydrolase (BH).
  • BH bleomycin hydrolase
  • atopic dermatitis is caused by an abnormality of the profilagrin gene, and about 5-50% of patients with atopic dermatitis have an abnormality of the gene (Smith FJD Et al. Nat Genet 38: 337-42 (2006); Aileen Sandilands1, et al., J. I. Dermatol., 127, 1282-1284 (2007) and Nomura T, et al., J. I. Dermatol ., 128 (6): 1436-41 (2008)).
  • the expression of filaggrin is not necessarily dramatically reduced in the skin of patients with atopic dermatitis.
  • the present inventor has an object to provide a bleomycin hydrolase production promoter.
  • bleomycin hydrolase improves the skin barrier function through the production of NMF.
  • bleomycin hydrolase is thought to work at the final stage of NMF production.
  • filaggrin expression is still seen in many patients with atopic dermatitis, so it is expected to occur due to a cause other than abnormality of filaggrin gene.
  • the present inventor has found that the decrease in the expression of bleomycin hydrolase in human skin is not only due to a decrease in the skin barrier function caused by an abnormality in the NMF production mechanism, but also atopic dermatitis mainly caused by immune abnormalities and dryness caused by the dermatitis. Under the hypothesis that it is also related to the skin, etc., the variation of the expression of the enzyme by the dry skin human test was verified, and the expression control mechanism was analyzed. As a result, the present inventors have found that the decrease in the expression of bleomycin hydrolase is associated with dry skin caused by atopic dermatitis, and the expression of the enzyme is prominent within the 5 ′ flanking region of the gene encoding the enzyme.
  • a bleomycin hydrolase production promoter containing, as an active ingredient, one or more selected from the group consisting of Izayoi rose extract, Toki extract, Oubak extract, Odori extract, rosemary extract, benzenesulfonyl GABA and erythritol.
  • It is a natural moisturizing factor production promoter containing, as an active ingredient, one or more selected from the group consisting of Isaiyoi rose extract, Toki extract, Oat extract, Odori extract, Rosemary extract, benzenesulfonyl GABA and erythritol.
  • Bleomycin hydrolase according to (1) which is a dry skin improving agent containing, as an active ingredient, one or more selected from the group consisting of a tow extract, a buckwheat extract, an apricot extract, a rosemary extract, benzenesulfonyl GABA and erythritol. Production promoter.
  • a method for improving or preventing dry skin comprising applying the bleomycin hydrolase production promoter of any one of (1) to (3) to a subject in need of improvement or prevention of dry skin .
  • the present inventor can provide a novel NMF production promoter and dry skin improving agent.
  • the western blot figure which shows the relationship between the amount of bleomycin enzymes in the human skin extract obtained by tape stripping, and the frequency
  • the western blot figure which shows the relationship between the amount of bleomycin enzymes in a human skin extract, and dry skin.
  • T A: a sample derived from a subject who does not feel dry
  • N a sample derived from a subject who feels slightly dry
  • M a sample derived from a subject who feels dry.
  • the graph which shows the relationship between the amount of bleomycin hydrolase in the stratum corneum extract of a human arm, and the enzyme activity.
  • the number on the horizontal axis represents the identification number of the subject.
  • Statistical analysis of bleomycin hydrolase and skin parameters (A: free amino acid, B: activity, C: TEWL) in human arm stratum corneum extract.
  • BH low bleomycin hydrolase amount ⁇ 10, activity ⁇ 1.5 (nmol / min / ml);
  • BH high bleomycin hydrolase amount ⁇ 10, activity ⁇ 1.5 (nmol / min / ml).
  • Questionnaire flowchart for skin classification The skin parameter measurement result of the stratum corneum of the subject classified according to the flowchart of FIG. Tissue staining diagram showing localization of bleomycin hydrolase and filaggrin in normal skin.
  • Tissue staining diagram showing localization of bleomycin hydrolase and filaggrin in atopic patient skin.
  • the graph which shows the relationship between the differentiation level of keratinocyte using quantitative PCR, and the expression level of bleomycin hydrolase. The value on the vertical axis represents the relative amount when the expression level of 80% confluence is 1.
  • the schematic diagram which shows the 5 'flanking area
  • the graph which shows the result of the luciferase assay of a BH promoter using a human epidermal keratinocyte.
  • the graph which shows the relationship between expression of transcription factor SP1, MZF1, and GATA1 and UV irradiation.
  • the graph which shows the relationship between UV irradiation and the expression of bleomycin hydrolase and protease in normal human epidermal keratinocytes.
  • Primers used to generate consecutive 5'-deletion mutants of the 5'-flanking region of BH by PCR.
  • Primers used to analyze the transcription level of BH and related factors by quantitative real-time RT-PCR.
  • Probe used for electrophoretic mobility shift analysis.
  • A A schematic diagram of the 5'-flanking region of human BH is shown. The putative transcription factor binding site within the 5'-flanking region was revealed by searching with the Genome Net MOTIF program.
  • FIG. 2 shows BH promoter activity in cultured keratinocytes in the presence of IFN- ⁇ .
  • Keratinocytes were transfected with pGL3-216 containing the intact IRF-1 / 2 binding site of the BH promoter region and treated with IFN- ⁇ for 24 hours (upper panel).
  • Keratinocytes were transfected with ⁇ pGL3-616 (IRF-1 / 2 deletion mutant) and treated for 24 hours in the presence or absence of 10 ng / ml IFN- ⁇ or IL-4 (lower panel).
  • C Measurement of IRF-1 and IRF-2 gene expression using small interfering RNA (siRNA) to determine whether IRF-1 / 2 is an essential mediator of IFN- ⁇ -induced downregulation of BH .
  • siRNA small interfering RNA
  • Keratinocytes were transfected with IRF-1 or IRF-2 siRNA (40 nM), cultured for 24 hours, treated with 10 ng / ml IFN- ⁇ , and further cultured for 24 hours before RNA isolation.
  • the right panel shows the silencing effect of IRF-1 and IRF-2.
  • A Expression analysis of BH, calpain I, and putative transcription factors in proliferating or differentiated cells by real-time PCR to investigate the mechanism of transcriptional regulation in the epidermis.
  • B Expression pattern analysis of transcription factors MZF-1, Sp-1, GATA-1, IRF-1 and IRF-2 in cultured keratinocytes.
  • A Effect of IFN- ⁇ on expression of putative transcription factors IRF-1 and IRF-2.
  • Bleomycin hydrolase is a cytoplasmic cysteine peptide hydrolase with a molecular weight of 250-280 kDa (hexamer), and its originally known function is metabolic inactivation of the glycopeptide bleomycin, which is frequently used in cancer combination chemotherapy It is. It contains the characteristic active site residues of the cysteine proteolytic enzyme papain superfamily, and the coding gene is present at locus 17q11.2 in humans (Takeda et al., J Biochem., 119, 29-36, 1996). It exists in all tissues and its presence in the skin was also known (Kamata et al., J. Biochem., 141, 69-76, 2007), but the relationship with filaggrin until the present inventors revealed It was not known at all.
  • FIG. 11 shows the 5'-flanking region of the gene encoding bleomycin hydrolase, particularly the transcriptional regulatory region, and the transcription factor that binds to this region.
  • bleomycin hydrolase only needs to include a region from the coding sequence of the enzyme to at least 216 bp downstream.
  • expression of bleomycin hydrolase is particularly enhanced by enhancing the binding activity of IRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, and GATA-1 contained in this region. It is thought to increase.
  • the expression of bleomycin hydrolase is enhanced by ultraviolet (UV) irradiation (data not shown), and there is a correlation between the increased expression of MZF-1, GATA-1 and the intensity and irradiation time of UV. A relationship is seen (FIG. 13).
  • cytokines For example, interleukin-4 (IL-4), a Th2 cytokine known to be involved in atopic dermatitis, down-regulates bleomycin hydrolase expression. This confirms the low expression of bleomycin hydrolase found in the skin of patients with atopic dermatitis.
  • interferon ⁇ a representative Th1 cytokine having a function of suppressing IgE production in contrast to IL-4, significantly enhances expression of bleomycin hydrolase.
  • tumor cell necrosis factor alpha TNF ⁇
  • TNF ⁇ tumor cell necrosis factor alpha
  • Isaiyoi Rose Extract, Toki Extract, Oubak Extract, Odorikosou Extract and Rosemary Extract are used for topical skin preparations, but all of these extracts have a bleomycin hydrolase production promoting effect, an NMF production promoting effect, and a dry skin improving effect. It is not known to have For example, Isaiyobara extract is only known to have effects such as a ceramide synthesis promoting effect (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-111560) and a collagenase inhibitory effect (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-241148).
  • Benzenesulfonyl GABA benzenesulfonyl- ⁇ -aminobutyric acid
  • erythritol are also used in skin external preparations, but all of them have a bleomycin hydrolase promoting effect, an NMF production promoting effect, and a dry skin improving effect. It is not known to have.
  • the above extract can be obtained by a conventional method.
  • a part or all of the plant that is the source of the extract can be obtained by soaking or heating under reflux with an extraction solvent at room temperature or after being filtered and concentrated.
  • the extraction site Prior to solvent extraction, the extraction site may be dried.
  • the extraction solvent any solvent can be used as long as it is usually used for extraction.
  • organic solvents such as alcohols such as methanol, ethanol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol and glycerin, hydrous alcohols , Chloroform, dichloroethane, carbon tetrachloride, acetone, ethyl acetate, hexane, or an aqueous solvent such as water, physiological saline, phosphate buffer, borate buffer, etc., either alone or in combination. it can.
  • one or more kinds selected from water, methanol, ethanol, and 1,3-butylene glycol are preferably used as the solvent.
  • the extract obtained by extraction with the above solvent can be used as it is or, for example, an extract concentrated by freeze-drying, etc., and if necessary, an adsorption method, for example, an ion exchange resin removed impurities, a porous polymer It is also possible to use those which are adsorbed on a column (for example, Amberlite XAD-2), eluted with a desired solvent, and further concentrated.
  • adsorption method for example, Amberlite XAD-2
  • the compounding amount of the extract such as Isaiyobara extract, Toki extract, Oubak extract, Odori extract and / or rosemary extract in the bleomycin hydrolase production promoter of the present invention is dry in the total amount of the agent.
  • the amount is 0.0001 to 20.0% by mass, preferably 0.0001 to 10.0% by mass, more preferably 0.001 to 1% by mass.
  • the amount of the drug such as benzenesulfonyl GABA and / or erythritol is 0.0001 to 20.0 mmol, preferably 0.0001 to 10.0 mmol, more preferably 0.001 to 1 mmol as a dry product in the total amount of the agent. .
  • the bleomycin hydrolase production promoter according to the present invention can be produced according to a conventional method, and can be prepared as the component constituting the bleomycin hydrolase production promoter by using the above extract or one or more of the drugs alone.
  • Ingredients usually used for skin preparations such as cosmetics and pharmaceuticals including quasi-drugs, such as oils, surfactants, powders, coloring materials, water, alcohols, thickeners, chelating agents, silicones Antioxidants, ultraviolet absorbers, moisturizers, fragrances, various medicinal components, preservatives, pH adjusters, neutralizers, and the like are appropriately blended as necessary.
  • the dosage form of the bleomycin hydrolase production promoter of the present invention is not particularly limited.
  • it is a solution system, a solubilization system, an emulsification system, a powder dispersion system, a water-oil two-layer system, a water-oil-powder three.
  • Arbitrary dosage forms such as layer systems, ointments, gels, aerosols and the like can be taken.
  • the form of use is not particularly limited, and can take any form such as lotion, milky lotion, cream, essence, jelly, gel, ointment, pack, mask, foundation, and the like.
  • the bleomycin hydrolase production promoter of the present invention can be applied to skin to be used in a cosmetic method for preventing and / or improving dry skin.
  • the usage and dosage of the bleomycin hydrolase production promoter of the present invention in such a cosmetic method is not particularly limited, and is appropriately determined depending on the dosage form and the condition of wrinkles on the skin to be treated.
  • a suitable amount for example, 0.1 to 1 ml per square cm 2 , can be rubbed directly into the skin several times, for example, 1 to 5 times, or the appropriate amount can be soaked in gauze or the like and then applied to the skin.
  • Calpain I was purchased from EMD Bioscience.
  • Bleomycin hydrolase was prepared from human epidermal horny layer according to Non-Patent Document 5.
  • Human IL-4 and IFN- ⁇ were purchased from PEPROTECH EC (London, England).
  • Human IL-13 and IL-17A / F were manufactured by R & D SYSTEM (MINNEAPOLIS, MN).
  • Citrulline 4-methylcoumaryl-7-amide (Cit-MCA) was obtained from Bachem Bioscience (Bubendorf, Switzerland). All other chemicals used were reagent grade.
  • keratinocytes Normal human epidermal keratinocytes derived from neonatal epidermis (Kurabo, Osaka, Japan), EpiLife medium (Cascade Biologics, Portland, OR) containing low concentration (0.03 mM) calcium and HKGS Growth Supplement (Cascade Biologics) ). All cells were incubated at 37 ° C. with 5% CO 2 and used within 4 passages. Keratinocytes were harvested 70% confluent, 100% confluent, 2 days after confluence, and 2 days after confluence in 2 mM calcium.
  • Bleomycin hydrolase is thought to work at the final stage of NMF production. In this case, the expression of the enzyme may be reduced in dry skin. In this experiment, it was examined whether the decrease in the expression and / or activity of bleomycin hydrolase in the skin is associated with dry skin.
  • the skin stratum corneum sample was collected by applying a transparent adhesive tape (Cellotape (registered trademark) (NICHIBAN)) to the skin surface of the arm and then peeling it off.
  • This tape with cutaneous stratum corneum was cut and immersed in an extraction buffer (0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 0.14 M NaCl, 0.1% Tween-20, 1 ml), and sonicated (20 sec).
  • a stratum corneum extract was prepared by applying x4). The extract was subjected to Western blot.
  • the anti-bleomycin hydrolase (BH) antibody used was an antibody produced by Kamata et al. (Journal of Biological Chemistry 2009).
  • the stratum corneum extract was subjected to SDS electrophoresis, transferred to Immobilon-P® (Millipore), and the transferred membrane was washed and reacted with an anti-BH antibody at room temperature for 1 hour. Furthermore, after removing the antibody by washing, an HRP-conjugated secondary antibody was reacted. After washing, the BH protein band emitted by ECL Plus Plus Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare) was baked on an X-ray film, and the expression level was estimated from the density of the band. The results are shown in FIGS.
  • specimen 1 is a skin stratum corneum sample of a person who thinks the person himself has dry skin
  • specimen 2 is a skin stratum corneum sample of a healthy student who thinks that the skin is not dry skin.
  • 2 are derived from a subject who does not feel dry
  • the sample N is derived from a subject who feels somewhat dry
  • the sample M is derived from a subject who feels dry.
  • the expression level of bleomycin hydrolase in the sample 1 is small, while the enzyme expression level in the sample 2 is large. From this result, it can be seen that Samples 1 and 2 are derived from dry skin and moist skin, respectively.
  • specimens T and A are extracts obtained from specimens that do not feel dry
  • specimens N and M are Western blot images of extracts obtained from specimens that are strongly conscious of drying.
  • Experiment 2 In this experiment, individual differences in the amount and activity of bleomycin hydrolase in human skin and the correlation between the enzyme amount and activity were examined.
  • a stratum corneum extract was prepared from the skin of the arms of 40 female students aged 20 to 25 years.
  • the amount of bleomycin hydrolase and the enzyme activity in the extract were measured according to the method of Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009).
  • the expression level was evaluated by Western blot, and the enzyme activity was evaluated by measuring the degradation amount of Cit- ⁇ -NA, which is a fluorescent substrate, for the aminopeptidase activity of the enzyme.
  • the results are shown in FIG. 3 and the correlation diagram is shown in FIG. As is clear from the results in FIG. 4, there is a correlation between the amount of bleomycin hydrolase and its activity.
  • the horny layer extract was subjected to statistical analysis on bleomycin hydrolase and various skin parameters.
  • 40 stratum corneum extracts were classified into the following two types.
  • the amount of bleomycin hydrolase clarified from the results of Western blotting with a densitometer, when 1 is displayed as an arbitrary unit, the amount of bleomycin hydrolase is less than 10 and the activity of the enzyme is 1 Extraction solution of less than 5 nmol / min / ml: low bleomycin hydrolase protein content and low activity (BH low); other: high protein content and high activity (BH high) .
  • Free amino acids were measured according to the method of Kamata et al (J. Biol. Chem, Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009). Specifically, the filaggrin peptide decomposed with calpain I and each extract were reacted, and the amount of free amino acid was measured by quantifying the amino group using fluorescamine. The measurement result of free amino acids is shown in FIG. 5A.
  • the unit of the vertical axis in FIG. 5A represents the total amount of free amino acids (nmol) in 3 ml of the measurement sample.
  • the activity of bleomycin hydrolase was evaluated by measuring the amount of degradation of Cit- ⁇ -NA, which is a fluorescent substrate, for the aminopeptidase activity of the enzyme.
  • the measurement result of bleomycin hydrolase activity is shown in FIG. 5B.
  • the unit of the vertical axis in FIG. 5B represents the degradation amount of Cit- ⁇ -NA (nmol / min / ml)).
  • the TEWL of the student's skin was measured using Vapometer (Delfin Technologies, Ltd, Finland) and displayed as g / m2 / h.
  • the measurement result of TEWL is shown in FIG. 5C.
  • FIG. 7 shows the correlation between the questionnaire results and the skin parameter results measured in Experiment 2 above.
  • FIG. 7 shows that the bleomycin hydrolase activity of students classified as oily dry skin is significantly high.
  • Immunohistochemical staining was performed by the method described in Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009).
  • the materials used were 5 ⁇ m thick human skin frozen sections and anti-rat BH IgG.
  • human skin specimens were obtained from patients suffering from atopic dermatitis at Tokyo Medical University on informed consent. This study was approved by the Tokyo Medical University Institutional Review Board and Shiseido Special Committee on Ethics.
  • FIG. 8 shows the tissue staining results of normal skin
  • FIG. 9 shows the comparison results of skin from normal subjects (normal skin) and skin from atopic dermatitis patients (atopic rash).
  • bleomycin hydrolase was highly expressed in the upper epidermis and showed the same localization as filaggrin.
  • the expression of bleomycin hydrolase and filaggrin was lower in the atopic rash area than in normal skin (FIG. 9).
  • Quantitative PCR The expression level of bleomycin hydrolase in keratinocytes was measured by quantitative PCR using Light Cycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) by the following method.
  • the reagent used was Light Cycler FastStart DNA Master CYBR Green I.
  • PCR was performed. The obtained result was corrected in comparison with the result of G3PDH which is a housekeeping gene.
  • bleomycin hydrolase was highly expressed in keratinocytes that reached confluence, ie, differentiated keratinocytes, compared to 80% confluent keratinocytes, ie, undifferentiated keratinocytes. In other words, it can be seen from the results of this experiment that the enzyme is not expressed much in basal cells before differentiation. This quantitative PCR result confirms the result of the tissue staining.
  • BH promoter luciferase assay using human epidermal keratinocytes Lysis buffer (200 ⁇ l) is added to keratinocytes in the growth phase (approximately 80% confluence) or after differentiation (after confluence, air exposure, addition of 2 mM calcium, and continuous cultivation for 2 days). The measurement was performed using the Bright-Glo Luciferase assay system (Promega Co., Madison, Wis., USA) 20 ⁇ l of the sample was transferred to a predetermined tube, and Auto Lumat Plus (LB953) Berthhold GmbH & Co. KG (Bad Wildbad Germany). From the results shown in FIG. 12, it is understood that the transcription regulatory region only needs to have a region from the coding sequence of the enzyme to at least 216 bp downstream in order for bleomycin hydrolase to be expressed.
  • UV irradiation on NHEK Irradiate 30 mJ or 60 mJ UVB (Torex Fl20S-E-30 / DMR, 20W, Toshiba Medical Supply), collect RNA for 3 hours, 24 hours, and 48 hours later using the specified method for quantification MRNA expression of bleomycin hydrolase and calpain was measured by PCR. As a result of the measurement, the bleomycin hydrolase mRNA was most expressed in the sample collected 48 hours after irradiation with 30 mJ (FIG. 13).
  • a continuous 5'-deletion mutant of the 5'-flanking region of BH was generated by PCR using the primers listed in FIG. After amplification, all PCR products were cloned into the pGEM-T simplified vector (Promega, Madison, Wis.) And sequenced using an ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Calif.).
  • PCR was performed under the following conditions: first denaturation 94 ° C. for 4 minutes, 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 1 minute, 72 ° C.
  • Keratinocytes are cultured in 12-well tissue culture plates at a density of 5 ⁇ 10 4 cells / well and using FuGene HD Transfection reagent (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland). And transfection with 1 ⁇ g of each construct. To correct for transfection efficiency, all cells were co-transfected with pGL4.74 [hRluc-TK] vector Promega containing the Renilla luciferase gene under the control of the HSV-TK promoter. Unless otherwise noted, cells were harvested 24 hours after transfection and lysed using 250 ⁇ l Passive lysis buffer (Promega) per well.
  • Luciferase activity was analyzed using the Dual Luciferase Reporter Assay System (Promega) and Autorumat plus luminometer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany). Firefly luciferase activity was normalized for Renilla luciferase activity. For each construct, three transfections were performed independently and the results were expressed as mean values.
  • siRNA-based inhibition of IRF-1 and -2 Cultured keratinocytes were cultured with Lipofectamine with 40 nM siIRF-1, siIRF-2, and siControl A (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) according to the manufacturer's instructions. RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA) was used for transfection. The cells were cultured in antibiotic-free medium for 24 hours, after which total RNA was extracted and analyzed by real-time RT-PCR as described above.
  • Electrophoretic mobility shift analysis Double stranded oligonucleotide probes were prepared by annealing single stranded biotinylated oligonucleotides and single stranded unlabeled oligonucleotides (FIG. 17). Nuclear extraction and EMSA were performed using the Nuclear Extraction kit and EMSA gel shift kit (Panomics, Santa Clara, CA). Nuclear extract (4 ⁇ g) is biotinylated probe corresponding to 1 ⁇ binding buffer and 1 ⁇ g poly d (IC), and MZF-1, Sp-1, IRF-1 / 2, and GATA-1 binding sites (50 pmol) and incubated at 15 ° C. for 30 minutes.
  • the relative luciferase activity of the deletion plasmid remained high until the deletion proceeded to pGL3-216.
  • the plasmid containing fragment -444 / + 1 (designated pGL3-444) showed significantly lower activity in cultured keratinocytes, suggesting the presence of upstream suppressor activity in the -616 / -444 region. Since these results demonstrated that the -216 / -1 region contains a minimal promoter for BH gene transcription, its nucleotide sequence is shown in Figure 18C. This sequence did not contain a TATA- or CCAAT-box, suggesting the housekeeping nature of this gene. On the other hand, several transcription factor binding sites, such as MZF-1, Sp-1, IRF-1 / 2, and GATA-1 / 2, were present in this core promoter region.
  • FIG. 20A showed that in proliferating keratinocytes, the Th1 cytokine IFN- ⁇ down-regulated BH mRNA expression in a dose-dependent manner. On the other hand, Th2 and Th17 cytokines did not show any significant effect on BH expression. Similar results were obtained with differentiated keratinocytes (data not shown). In order to elucidate the role of IFN- ⁇ in regulating BH gene expression, promoter assays were performed to identify cytokine response elements. As shown in FIG.
  • IFN- ⁇ exhibits BH promoter activity in cultured keratinocytes transfected with pGL3-BH-616 containing an IRF-1 / 2 binding sequence between ⁇ 131 and ⁇ 120. Down controlled. After deletion of this sequence, IFN- ⁇ no longer repressed promoter activity (FIG. 20B).
  • small interfering RNA siRNA was used to determine whether IRF-1 / 2 is an essential mediator of IFN- ⁇ -induced downregulation of BH, using the IRF-1 and IRF-2 genes Expression was suppressed. IFN- ⁇ activity was significantly suppressed in cultured keratinocytes transfected with either IRF-1 or ⁇ 2 siRNA (40 nM) (FIG. 20C).
  • FIG. 22A shows that IFN- ⁇ strongly upregulated IRF-1 mRNA expression in a dose-dependent manner.
  • IRF-2 expression was upregulated in the presence of IFN- ⁇ .
  • IRF-1 and IRF-2 expression was significantly enhanced in the presence of IL-4 only at 100 ng / ml (FIG. 22B).
  • both MZF-1 and Sp-1 were most effectively down-regulated in the presence of 10 ng / ml IL-4 (FIG. 22C).
  • BH is down-regulated in atopic dermatitis skin
  • Loss-of-function mutations in FLG are associated with AD pathogenesis, but not only gene defects but also disruption of the degradation pathway may be associated with AD pathology There is. Therefore, the localization of BH and filaggrin and the BH activity in the lesioned and non-lesional skin of AD patients were next examined.
  • double staining with anti-BH and anti-filaggrin antibodies showed co-localization of BH and filaggrin in the upper epidermis, particularly in the granular layer, as previously reported (FIG. 23A).
  • MZF-1 is a transcription factor belonging to the Krupple family of zinc finger proteins and is expressed in totipotent hematopoietic cells as well as bone marrow progenitor cells. However, the function of MZF-1 in transcriptional regulation in the mammalian epidermis has not been reported.
  • an IRF-1 / 2 transcription factor may also be required for minimal promoter activity of the BH gene under basic conditions.
  • the IRF family is a group of transcription factors, and so far, nine IRF members (IRF-1 to -9) have been identified in various cell types and tissues. These IRF molecules play a role in antiviral defense, immune response / regulation, and cell growth regulation under stimulation by IFN- ⁇ , ⁇ , and ⁇ . IRF-1 and -2 have been shown to function as agonist-antagonist pairs involved in the regulation of many IFN- ⁇ inducible genes. Interestingly, IFN- ⁇ significantly suppressed BH mRNA expression (FIGS. 20A and B).
  • endogenous AD is immunologically characterized by low expression of IL-4, IL-5, and IL-13, and high expression of IFN- ⁇ .
  • IL-4, IL-5, and IL-13 high expression of IFN- ⁇ .
  • Th1 to Th2 occurs during the acute to chronic phase in AD skin.
  • IFN- ⁇ may play a more important role in AD than was thought.
  • RT-PCR Total RNA 500 ng isolated from human keratinocytes cultured as described above was reverse transcribed using random hexamers and Superscript II RNase H-reverse transcriptase (Gibco-BRL, Getersberg, MD) Thereafter, PCR amplification was performed using Taq DNA polymerase (Takara, Kyoto, Japan) and the following primers. 40 amplification cycles of 94 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 1 minute, and 72 ° C. for 1 minute were performed.
  • the primers used for PCR are as follows.
  • Forward primer 5'-TGTGGTTTGGCTGTGATGTT-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • Reverse primer 5'-GCACCATCCTGATCATCCTT-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • GAPDH was PCR amplified as an internal control, and the primers used were as follows.
  • Reverse primer TATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTGAGG (SEQ ID NO: 16)

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Abstract

　新規のブレオマイシン水解酵素産生促進剤の提供。　イザヨイバラエキス、トウキエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス、ローズマリーエキス、ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ及びエリスリトールからなる群から選ばれる１又は複数を活性成分として含有する、ブレオマイシン水解酵素産生促進剤、天然保湿因子産生促進剤、乾燥肌改善剤を提供する。

Description

ブレオマイシン水解酵素産生促進剤
　本発明は、ブレオマイシン水解酵素産生促進剤、それを含有する天然保湿因子産生促進剤又は乾燥肌改善剤を提供する。
　表皮の顆粒層のケラチン線維は、角化する際にフィラグリンと呼ばれるタンパク質に結合して凝集し、“ケラチンパターン”と称される特異的な形態をつくる。顆粒細胞内のケラトヒアリン顆粒にはフィラグリンの前駆物質であるプロフィラグリン（フィラグリン単位が10乃至12個縦に並んだもの）が多量に存在するが、角化の際、フィラグリンモノマーが生成されるとともに脱リン酸化によりケラチン線維を凝集させる。その後、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）という酵素の作用によって脱イミノ化され、ケラチンと遊離した後、角層上層でアミノ酸などに分解される。これらのアミノ酸は天然保湿因子（natural moisturizing factor ； ＮＭＦ）と呼ばれ、角層水分量の保持に重要な役割を担い、また紫外線吸収能をもつことで知られる(Blank I.H. J.I. Dermatol., 18, 433 (1952); Blank I.H. J.I. Dermatol., 21, 259 (1953))。
　ＮＭＦの主成分であるアミノ酸がフィグラリンに由来することが明らかになって以来、乾燥肌を呈する病態とフィグラリンの関連性についての研究が進められている。近年、老人性乾皮症、アトピー性疾患などの乾燥肌において角層中のアミノ酸が減少していることが明らかになっている（Horii I. et al., Br. J. Dermatol., 121, 587-592(1989); Tanaka M. et al., Br. J. Dermatol., 139, 618-621(1989))。
　ＰＡＤはフィラグリンのアルギニン残基に作用して脱イミノ化させ、シトルリン残基に変換させる。このようにフィラグリンが脱イミノ化されることでフィラグリンとケラチン繊維との親和性が弱まり、ケラチン繊維が遊離し、その結果フィラグリンはプロテアーゼの作用を受け易くなり、最終的にＮＭＦにまで分解されるものと考えられる。
　本発明者は、ＰＡＤで脱イミノ化したフィラグリンを分解する酵素として、カルパイン－１を特定しており、その分解産物としての小さいペプチド断片がブレオマイシン水解酵素（ＢＨ）によってアミノ酸単位、即ちＮＭＦにまで分解されることを明らかにしている（Journal of Investigative Dermatology (2008), Volume 128, ABSTRACTS, S90, 539, 第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会　合同大会　講演要旨集、第５８３頁、JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284, NO. 19, pp. 12829-12836, 2009、３Ｐ－０２５１、及び特願２００８－１３５９４４号（以下第９４４号出願と称する））。
　最近の研究で、アトピー性皮膚炎の一部は、プロフィラグリン遺伝子の異常により生じることが知られており、アトピー性皮膚炎患者の5-50％程度で当該遺伝子の異常が見られる（Smith FJD, et al. Nat Genet 38:337-42 (2006); Aileen Sandilands1, et al., J. I. Dermatol., 127, 1282-1284 (2007) 及びNomura T, et al., J. I. Dermatol., 128(6):1436-41 (2008)）。しかしながら、アトピー性皮膚炎患者の皮膚では、必ずしもフィラグリンの発現が劇的に低下しているわけではない。
Blank I.H. J.I. Dermatol., 18, 433 (1952) Blank I.H. J.I. Dermatol., 21, 259 (1953) Horii I. et al., Br. J. Dermatol., 121, 587-592(1989) Tanaka M. et al., Br. J. Dermatol., 139, 618-621(1989) Kamata et al., J. Biochem., 141, 69-76, 2007 Journal of Investigative Dermatology (2008), Volume 128, ABSTRACTS, S90, 539 第３０回日本分子生物学会年会・第８０回日本生化学会大会　合同大会　講演要旨集、第５８３頁、３Ｐ－０２５１ JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 284, NO. 19, pp. 12829-12836, 2009 Smith FJD, et al. Nat Genet 38:337-42 (2006) Aileen Sandilands1, et al., J. I. Dermatol., 127, 1282-1284
　本発明者は、ブレオマイシン水解酵素産生促進剤の提供を課題とする。
　上記第９４４号出願において、本発明者は、ブレオマイシン水解酵素の活性亢進がＮＭＦの産生を介して皮膚バリアー機能を改善することを明らかにした。このように、ブレオマイシン水解酵素はＮＭＦ産生の最終段階で働いていると考えられる。しかし、興味深いことに、アトピー性皮膚炎により生じる乾燥肌に関しては、多くのアトピー性皮膚炎患者で依然としてフィラグリンの発現が見られることから、フィラグリン遺伝子の異常とは別の原因で生じることが予想される。
　本発明者は、ヒト皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の発現低下が、ＮＭＦ産生機構の異常によって生じる皮膚バリアー機能の低下のみならず、主に免疫異常に起因するアトピー性皮膚炎や当該皮膚炎によって生じる乾燥皮膚等とも関係しているとの仮説のもと、乾燥肌ヒト試験による当該酵素の発現の変動を検証し、そしてその発現制御機構の解析等を行った。その結果、本発明者は、ブレオマイシン水解酵素の発現低下がアトピー性皮膚炎によって生じる乾燥肌と関連しており、且つ当該酵素をコードする遺伝子の５’フランキング領域内に当該酵素の発現を顕著に誘導する制御領域が存在することを見出した。詳しくは、本発明者は、ＢＨの５’‐フランキング領域をクローニングした。その欠失分析では、－２１６ｂｐ上流の中にＢＨプロモーター活性に重要な領域が同定された。電気泳動移動度シフト・アッセイでは、試験管内において、ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、及びインターフェロン調節因子（ＩＲＦ）‐１／２がこの領域に結合できることを明らかにした。そのうえ、ＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１モチーフの部位特異的突然変異誘発では、ＢＨプロモーター活性が大きく低下した。これらのデータは、ＢＨ発現がＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１を介して上方制御されることを示唆した。興味深いことに、Ｔｈ１サイトカインであるインターフェロン（ＩＦＮ）‐γは、ＢＨの発現を有意に減少させた。部位特異的突然変異誘発と低分子干渉ＲＮＡを用いた分析では、ＢＨ発現に対するＩＦＮ‐γの抑制効果を立証した。その一方、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ‐４は、ＢＨ発現に対して直接的な作用を全く示さなかった。しかしながら、それは培養ケラチノサイトにおいてＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１を下方制御したので、ＩＬ‐４がＢＨ調整のサプレッサーとして働くことができることが示唆された。最後に、ＡＤを患っている患者の皮膚においてＢＨの発現を調べた。ＢＨ活性と発現はＡＤ病変皮膚において大きく減少していたので、ＡＤにおけるフィラグリン分解経路の欠陥が示唆された。以上のとおり、本発明者は、ＢＨの転写が分化中及び炎症中の両方で調節されているであろうことを見出した。従って、本発明者は様々な薬剤、生薬についてそのブレオマイシン水解酵素産生促進活性を調べたところ、所定の薬剤、生薬についてそのような活性があることを見出し、本発明を完成するに至った。
　本願は以下の発明を包含する。
（１）イザヨイバラエキス、トウキエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス、ローズマリーエキス、ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ及びエリスリトールからなる群から選ばれる１又は複数を活性成分として含有する、ブレオマイシン水解酵素産生促進剤。
（２）イザヨイバラエキス、トウキエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス、ローズマリーエキス、ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ及びエリスリトールからなる群から選ばれる１又は複数を活性成分として含有する、天然保湿因子産生促進剤である、（１）のブレオマイシン水解酵素産生促進剤。
（３）トウエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス、ローズマリーエキス、ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ及びエリスリトールからなる群から選ばれる１又は複数を活性成分として含有する、乾燥肌改善剤である、（１）のブレオマイシン水解酵素産生促進剤。
（４）（１）～（３）のいずれかのブレオマイシン水解酵素産生促進剤を、乾燥肌の改善又は予防を必要とする被験者に適用することを含んでなる、乾燥肌を改善又は予防する方法。
（５）乾燥肌がアトピー性皮膚炎によるものである、（４）の方法。
（６）乾燥肌の改善又は予防のための、（１）～（３）のいずれかのブレオマイシン水解酵素産生促進剤の使用。
（７）乾燥肌がアトピー性皮膚炎によるものである、（６）の使用。
　本発明者により、新規のＮＭＦ産生促進剤や乾燥肌改善剤の提供が可能となる。
テープストリッピングにより得られたヒト皮膚抽出液中のブレオマイシン酵素量とテープストリッピングの回数との関係を示すウェスタンブロット図。 ヒト皮膚抽出液中のブレオマイシン酵素量と乾燥肌との関係を示すウェスタンブロット図。Ｔ，Ａ：乾燥を感じない被験者由来のサンプル；Ｎ：やや乾燥を感じる被験者由来のサンプル及び；Ｍ：乾燥を感じる被験者由来のサンプル。 ヒトの腕の角層抽出液中のブレオマイシン水解酵素量とその酵素活性との関係を示すグラフ。横軸の番号は被験者の識別番号を表す。 図３で得られたブレオマイシン水解酵素量と活性との関係についての最小二乗法による一次近似。 ヒトの腕の角層抽出液中のブレオマイシン水解酵素と皮膚パラメーター（Ａ：遊離アミノ酸、Ｂ：活性、Ｃ：ＴＥＷＬ）に関する統計的解析。BH low: ブレオマイシン水解酵素量＜１０、活性＜１．５（nmol/min/ml）; BH high: ブレオマイシン水解酵素量≧１０、活性≧１．５（nmol/min/ml）。 肌分類用アンケートフローチャート。 図６のフローチャートに従い分類された被験者の角層の皮膚パラメーター測定結果。 正常皮膚におけるブレオマイシン水解酵素及びフィラグリンの局在を示す組織染色図。 アトピー患者皮膚におけるブレオマイシン水解酵素及びフィラグリンの局在を示す組織染色図。 定量的ＰＣＲを用いたケラチノサイトの分化とブレオマイシン水解酵素の発現量との関係を示すグラフ。縦軸の値は、８０％コンフルエントの発現量を１とした場合の相対量を表す。 ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の５’フランキング領域を示す模式図。 ヒト表皮ケラチノサイトを用いたＢＨプロモーターのルシフェラーゼアッセイの結果を示すグラフ。 転写因子SP1, MZF1及びGATA1の発現とUV照射との関係を示すグラフ。 正常ヒト表皮角化細胞におけるブレオマイシン水解酵素及びプロテアーゼの発現とUV照射との関係を示すグラフ。 ＢＨの５’‐フランキング領域の連続的な５’‐欠失突然変異株をＰＣＲによって作成するために使用したプライマー。 ＢＨ及び関連因子の転写レベルを定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲによって分析するために使用したプライマー。 電気泳動移動度シフト分析に使用したプローブ。 （Ａ）ヒトＢＨの５’－フランキング領域の模式図を示す。５’‐フランキング領域内の推定転写因子結合部位はＧｅｎｏｍｅ　Ｎｅｔ　ＭＯＴＩＦプログラムによる検索で明らかにした。（Ｂ）欠失分析で決定されたＢＨのプロモーター領域。（Ｃ）ＢＨの最小プロモーターの配列及び推定転写因子結合部位を含む－２１６／－１領域のヌクレオチド配列を示す推定転写因子結合部位に下線を付した。 （Ａ）部位特異的突然変異誘発によるＢＨプロモーターにおける転写因子結合部位の特性決定。推定転写因子結合部位の欠失構築体の模式図及び培養ケラチノサイトにおけるそのルシフェラーザ活性を示す。部位特異的突然変異誘発は－６１６／＋１領域のヌクレオチド配列をまたぐ構築体で実施した。（Ｂ）ＢＨプロモーターのcis-作用エレメントに対するＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、又はＩＲＦ‐１／２の結合を示す。実験は、培養ケラチノサイトからの核抽出物、及び推定転写因子結合部位ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、又はＩＲＦ‐１／２を含むビオチン化二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いる電気泳動移動度シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）で行った。レーン１は核抽出物でのビオチニル化プローブの結合プロフィール、レーン２は２倍過剰量の非ラベル化プローブと競合させた後のビオチニル化プローブの結合プロフィールを示す。 （Ａ）ＢＨ発現のリアルタイムＲＴ－ＰＣＲ分析。ＢＨ遺伝子発現に対するＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカインの効果を示す。（Ｂ）ＩＲＦ‐１／２結合部位の突然変異分析。ＩＦＮ‐γの存在下での培養ケラチノサイトにおけるＢＨプロモーター活性を示す。ケラチノサイトをＢＨプロモーター領域のインタクトＩＲＦ‐１／２結合部位を含むｐＧＬ３－２１６でトランスフェクションし、ＩＦＮ‐γで２４時間処理した（上パネル）。ケラチノサイトを△ｐＧＬ３－６１６（ＩＲＦ‐１／２欠失突然変異体）でトランスフェクションし、10ng/mlのＩＦＮ‐γ又はＩＬ－４の存在下又は不在下で２４時間処理した（下パネル）。（Ｃ）ＩＲＦ‐１／２がＢＨのＩＦＮ‐γ誘発性下方調節の必須メディエーターであるかどうか判断するための低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用したＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２遺伝子発現の測定。ケラチノサイトをＩＲＦ‐１又はＩＲＦ‐２のｓｉＲＮＡ（40nM)でトランスフェクションし、２４時間培養し、10ng/mlのＩＦＮ‐γで処理し、さらに２４時間培養してからＲＮＡ単離を行った。右パネルにはＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２のサイレンシングの効果を示す。 （Ａ）表皮における転写調節の機構を調査するためのリアルタイムＰＣＲ法による増殖型又は分化型細胞におけるＢＨ、カルパインＩ、及び推定転写因子の発現分析。（Ｂ）培養ケラチノサイトにおける転写因子ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２発現パターン分析。 （Ａ）推定転写因子ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２の発現に対するＩＦＮ‐γの効果。（Ｂ）推定転写因子ＩＲＦ‐１、ＩＲＦ‐２、ＭＺＦ－１及びＳｐ－１の発現に対するＩＬ‐４の効果。 （Ａ）正常表皮での、抗ＢＨ抗体と抗フィラグリン抗体での二重染色により示される、顆粒層におけるＢＨとフィラグリンの同時局在。（Ｂ）ＡＤ患者の病変皮膚と非病変皮膚からの抽出物のＢＨ活性。 各種生薬及び薬剤のブレオマイシン水解酵素酸性促進効果を示す。
　ブレオマイシン水解酵素は分子量250～280kDa（六量体）の細胞質システインペプチド加水分解酵素であり、当初知られていた機能は、癌の組み合わせ化学療法に頻繁に使用される糖ペプチドブレオマイシンの代謝不活性化である。システインタンパク質分解酵素パパインスーパーファミリーの特徴的な活性部位残基を含み、コード遺伝子はヒトでは遺伝子座17ｑ11.2に存在する(Takeda et al., J Biochem., 119, 29-36, 1996)。あらゆる組織に存在し、皮膚におけるその存在も知られていたが(Kamata et al., J. Biochem., 141, 69-76, 2007)、フィラグリンとの関係については本発明者が明らかにするまで全く知られていなかった。
　組織染色の結果から、ブレオマイシン水解酵素は、フィラグリンと同様に、正常皮膚では表皮上層で多く発現していることが明らかになった（図８）。一方、アトピー性皮膚炎患者では、アトピー皮疹部で当該酵素及びフィラグリンの発現が低下する（図９）。これは、プロフィラグリン遺伝子の異常ではなく、その分解酵素系の異常がアトピー性皮膚炎の原因となることを強く示唆するものである。また、アトピー皮膚炎患者の皮膚では、病変部のみならず、非病変部でもブレオマイシン水解酵素活性は有意に低い（データは示さない）。
　更に、ブレオマイシン水解酵素の発現量の変動について培養ケラチノサイトを用いて検討した結果、当該酵素は、分化していないケラチノサイトではあまり発現していないのに対し、コンフルエントに達し分化が進んだケラチノサイトで高発現していること、基底細胞ではほとんど発現せず、分化が進み表皮細胞へと移行してから高発現することが分かった（図１０）。この結果は、上記細胞染色の結果を裏づけている。ブレオマイシン水解酵素をコードする遺伝子の５’－フランキング領域、特に転写調節領域と、当該領域に結合する転写因子とを図１１に示す。ブレオマイシン水解酵素の発現には、当該酵素のコード配列から少なくとも２１６ｂｐ下流までの領域を含んでいればよい。図１１に記載の転写因子の中でも、この領域に含まれるIRF-1, IRF-2, MZF-1, SP-1, GATA-1の結合活性を亢進することで、ブレオマイシン水解酵素の発現は特に亢進すると考えられる。事実、ブレオマイシン水解酵素は、紫外線（ＵＶ）照射によってその発現が亢進されるところ（データは示さない）、MZF-1, GATA-1の発現亢進とＵＶの強度及び照射時間との間には相関関係が見られる（図１３）。
　ブレオマイシン水解酵素産生促進は、サイトカインによっても影響を受ける。例えば、アトピー性皮膚炎に関与していることが知られている、Th2サイトカインの一種であるインターロイキン－４(IL-4)は、ブレオマイシン水解酵素の発現をダウンレギュレートする。これは、アトピー性皮膚炎患者の皮膚で見られるブレオマイシン水解酵素の低発現を裏付けるものである。一方、IL-4と反対にIgE産生を抑制する働きを有するTh1サイトカインの代表、インターフェロンγは、ブレオマイシン水解酵素の発現を有意に亢進する。また、Th2サイトカインで炎症性サイトカインの代表である腫瘍細胞壊死因子アルファ(TNFα)も当該酵素の発現を有意に亢進させる。これらの物質のみならず、ブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性は、ＵＶ照射によっても亢進される。結果は示さないが、体表面の中でも、紫外線照射を受けやすい頬などの皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の活性は、ＵＶ照射によって亢進されることが確認されている。
　イザヨイバラエキス、トウキエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス及びローズマリーエキスについては皮膚外用剤に使用されているものはあるが、いずれのエキスもブレオマイシン水解酵素産生促進効果、ＮＭＦ産生促進効果、乾燥肌改善効果を有することは知られていない。例えば、イザヨイバラエキスはセラミド合成促進効果（特開２００６－１１１５６０）、コラゲナーゼ阻害効果（特開２００６－２４１１４８）といった効果を有することが知られているにすぎない。ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ（ベンゼンスルホニル－γアミノ酪酸）、エリスリトールも同様に、皮膚外用剤に使用されているものはあるが、いずれの薬剤もブレオマイシン水解酵素促進効果、ＮＭＦ産生促進効果、乾燥肌改善効果を有することは知られていない。
　上記エキスは常法により得ることができ、例えばその起源となる植物の一部又は全部を抽出溶媒とともに常温で又は加熱して浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。溶媒抽出の前に、抽出部位を乾燥させてもよい。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等、あるいは水性溶媒、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を、それぞれ単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、溶媒として、水、メタノール、エタノール、１，３－ブチレングリコールから選ばれる１種または２種以上が好適に使用される。
　上記溶媒で抽出して得られたエキスをそのまま、あるいは例えば凍結乾燥などにより濃縮したエキスを使用でき、また必要であれば吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ－２）のカラムにて吸着させた後、所望の溶媒で溶出し、さらに濃縮したものも使用することができる。
　イザヨイバラエキス、トウキエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス及びローズマリーエキスなどのエキスやベンゼンスルホニルＧＡＢＡ、エリスリトールなどの薬剤は、濃度依存的にブレオマイシン水解酵素産生促進作用を示す。従って、このような観点からは、本発明のブレオマイシン水解酵素産生促進剤中のイザヨイバラエキス、トウキエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス及び／又はローズマリーエキスなどのエキスの配合量は、剤全量中、乾燥物として０．０００１～２０．０質量％、好ましくは０．０００１～１０．０質量％、より好ましくは０．００１～１質量％である。ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ及び／又はエリスリトールなどの薬剤の配合量は、剤全量中、乾燥物として０．０００１～２０．０ｍｍｏｌ、好ましくは０．０００１～１０．０ｍｍｏｌ、より好ましくは０．００１～１ｍｍｏｌである。
　本発明に係るブレオマイシン水解酵素産生促進剤は、常法に従って製造することができ、また同ブレオマイシン水解酵素産生促進剤を構成する成分として、上記エキスや薬剤１種又は２種以上単独でも調製可能であるが、通常医薬部外品を含む化粧品や医薬品等の皮膚外用剤等に用いられる成分、例えば油分、界面活性剤、粉末、色材、水、アルコール類、増粘剤、キレート剤、シリコーン類、酸化防止剤、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、ｐＨ調整剤、中和剤等必要に応じて適宜配合される。
　本発明のブレオマイシン水解酵素産生促進剤の剤型は特に限定されるものではなく、例えば、溶液系、可溶化系、乳化系、粉末分散系、水－油二層系、水－油－粉末三層系、軟膏、ゲル、エアゾール等の任意の剤型をとることができる。また、使用形態も特に限定されるものではなく、例えば、化粧水、乳液、クリーム、エッセンス、ゼリー、ジェル、軟膏、パック、マスク、ファンデーション等の任意の形態をとることができる。
　本発明のブレオマイシン水解酵素産生促進剤は肌に適用することで、乾燥肌の予防及び／又は改善を図るための美容方法に利用できる。かかる美容方法における本発明のブレオマイシン水解酵素産生促進剤の用法、用量も特に限定されるものではなく、剤型や処置する肌のしわの状態により適宜決定されるが、典型的には、１日当たり数回、例えば１回～５回、適量、例えば１平方ｃｍ2当たり0.1ｍｌから１ｍｌ、肌に直接すり込むか、又その適量をガーゼなどに染み込ませてから肌に貼付することができる。
　以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
　本実験では以下の材料を使用した。
　カルパインＩは、EMD Bioscience社より購入した。ブレオマイシン水解酵素は、ヒト表皮角層より、非特許文献５に従い作製した。ヒトＩＬ‐４及びＩＦＮ‐γは、PEPROTECH EC（London, England）から購入した。ヒトＩＬ‐１３及びＩＬ‐１７Ａ／Ｆは、R&D SYSTEM（MINNEAPOLIS, MN）製のものとした。シトルリン４‐メチルクマリル‐７‐アミド（Ｃｉｔ‐ＭＣＡ）をBachem Bioscience（Bubendorf, Switzerland）から入手した。使用される他のすべての化学物質は、試薬グレードのものであった。
　ケラチノサイトの培養
　新生児期表皮由来の正常ヒト表皮ケラチノサイト（Kurabo、Osaka, Japan）を、低濃度（０．０３ｍＭ）のカルシウム、及びＨＫＧＳ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Cascade Biologics）を含むＥｐｉＬｉｆｅ培地（Cascade Biologics、Portland, OR）中で培養した。すべての細胞を５％のＣＯ2を加えながら３７℃にてインキュベートし、そして継代４代以内に使用した。ケラチノサイトを、コンフルエント７０％、コンフルエント１００％、コンフルエントの２日後、及び２ｍＭのカルシウム中コンフルエントの２日後に採取した。
実験１
　ブレオマイシン水解酵素は、ＮＭＦ産生の最終段階で働いていると考えられる。この場合、乾燥肌では本酵素の発現が低下している可能性がある。本実験では、皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の発現及び／又は活性の低下が、乾燥肌と関連しているか否かについて検討した。
　皮膚角層試料は、透明粘着テープ（セロテープ（登録商標）(NICHIBAN)）を腕の皮膚表面に貼付したのち剥離するテープストリッピングにより採取した。皮膚角層の付着したこのテープを裁断、抽出バッファー（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ(ｐＨ８．０), ０．１４Ｍ ＮａＣｌ, ０．１％ Ｔｗｅｅｎ-２０, １ｍｌ）に浸漬、超音波処理（２０ ｓｅｃ ×４）にかけ、角層抽出液を作成した。当該抽出液をウェスタンブロットにかけた。使用した抗ブレオマイシン水解酵素（ＢＨ）抗体は、鎌田ら（Journal of Biological Chemistry 2009）により作製された抗体を用いた。具体的には、角層抽出液をＳＤＳ電気泳動後、Immobilon-P (Millipore社)に転写し、この転写された膜を洗浄後、抗ＢＨ抗体と室温で１時間反応させた。さらに洗浄により抗体を除去したのち、ＨＲＰ結合二次抗体を反応させた。洗浄後、ECL Plus Western Blotting Detection Kit (GE Healthcare)により発光させたＢＨ蛋白バンドをＸ線フィルムに焼付け、バンドの濃淡により、発現量を推定した。結果を図１及び図２に示す。
　図１中、検体１は本人が乾燥肌と自分で思っている人の皮膚角層試料であり、検体２は乾燥肌ではないと考えている健康な学生の皮膚角層試料である。また、図２中の検体Ｔ及びＡは、乾燥を感じない被験者由来のものであり、検体Ｎはやや乾燥すると感じる被験者、そして検体Ｍは乾燥を感じる被験者由来のものである。検体１中のブレオマイシン水解酵素の発現量は少なく、一方、検体２中の当該酵素発現量は多い。この結果から、検体１、２は、それぞれ乾燥肌、潤い肌に由来するものであることがわかる。また、検体１を用いた結果からは、乾燥肌では、ＮＭＦ産生の場である表皮表面に近いほど、ブレオマイシン水解酵素量が低下していることがわかる。図２において、検体ＴおよびＡは、特に乾燥を感じない検体から得られた抽出液、検体ＮおよびＭは、乾燥を強く意識する検体から得られた抽出液のウェスタンブロット像を示す。
実験２
　本実験では、ヒト皮膚におけるブレオマイシン水解酵素の量や活性の個体差と、当該酵素量と活性の相関とについて検討した。実験１に記載の方法に従い、２０～２５才の女子学生４０名の腕の皮膚から角層抽出液を作成した。当該抽出液中のブレオマイシン水解酵素量とその酵素活性を、Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009)らの方法に従い測定した。発現量はウェスタンブロットにより、そして酵素活性は、当該酵素のアミノペプチダーゼ活性について、蛍光基質であるＣｉｔ－β－ＮＡの分解量を測定することで評価した。結果を図３に、そしてその相関図を図４に示す。図４の結果から明らかなように、ブレオマイシン水解酵素量とその活性との間には相関関係が存在している。
　続いて、上記角層抽出液について、ブレオマイシン水解酵素と様々な皮膚パラメーターに関して統計的な解析を行った。本実験では、４０人の角層抽出液を以下の２種類に分類した。ウェスタンブロットの結果から明らかとなったブレオマイシン水解酵素量をデンシトメーターで数値化した後、１を任意の単位として表示した場合にブレオマイシン水解酵素量が１０未満であり、且つ当該酵素の活性が１．５nmol/min/ml未満である抽出液：ブレオマイシン水解酵素のタンパク質量が少なく、且つ活性が低いもの(BH low)；それ以外のもの：タンパク質量が多く、且つ活性が高いもの(BH high)。
　遊離アミノ酸は、Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009)らの方法に従い測定した。具体的には、カルパインＩで分解したフィラグリンペプチドと各抽出液とを反応させ、フルオレサミンを用いてアミノ基を定量することで遊離アミノ酸量を測定した。遊離アミノ酸の測定結果を図５Ａに示す。図５Ａ中の縦軸の単位は、測定試料３ｍｌ中の総遊離アミノ酸量(nmol）を表す。
　ブレオマイシン水解酵素の活性は、上述のとおり、当該酵素のアミノペプチダーゼ活性を、蛍光基質であるＣｉｔ－β－ＮＡの分解量を測定することで評価した。ブレオマイシン水解酵素活性の測定結果を図５Ｂに示す。図５Ｂ中の縦軸の単位は、Ｃｉｔ－β－ＮＡの分解量(nmol/min/ml)）を表す。
　上記学生の皮膚のTEWL は、Vapometer (Delfin Technologies, Ltd, Finland)を用いて測定し、 g/m2/hとして表示した。ＴＥＷＬの測定結果を図５Ｃに示す。
　図５Ｃに示すとおり、ブレオマイシン水解酵素活性の低い群（２．５Ｕ＜）と高い群とでは、角層水分量に有意な差が存在していた。更に、当該酵素の量と活性の両方が低い群では、遊離アミノ酸が少なく、そしてＴＥＷＬも高い（図５Ａ及び５Ｃ）。
　データは示さないが、遊離アミノ酸の低い群（1000<)と高い群とでは、NMF、ウロカニン酸の量に有意な差が、そしてNMFの低い群（0.8<)と高い群とでは、ウロカニン酸に有意な差が存在していた。また、TEWLの低い群（2.5<)と高い群とでは、NMF、乳酸、尿素に有意な差が存在していた。ウロカニン酸がフィラグリンに多数含まれるヒスチジンより作られることを考慮すると、ブレオマイシン水解酵素がフィラグリン分解において重要であることが分かる。
　本実験の結果から、ブレオマイシン水解酵素の絶対量が少ない場合、遊離アミノ酸量及びバリアー機能が共に有意に低下することが分かる。データは示さないが、頬由来の角層抽出液を用いた場合でも、ブレオマイシン水解酵素量とバリアー機能との比例関係が確認されている。
実験３
　本実験では、図６に記載のフローチャートに基づいて上記女子学生にアンケートを行い、各学生の肌を潤い肌、乾燥肌、乾燥型脂性肌、脂性肌の４つ分類した。アンケート結果と、上記実験２で測定した皮膚パラメーターの結果との相関関係を図７に示す。図７からは、脂性乾燥肌と分類された学生のブレオマイシン水解酵素活性が有意に高いことが分かる。
実験４
　本実験では、皮膚におけるブレオマイシン水解酵素とフィラグリンの局在について検討する。
免疫組織化学染色
　免疫組織化学染色は、Kamata et al (J. Biol. Chem., Vol. 284, Issue 19, 12829-12836, May 8, 2009)に記載の方法により行った。材料は５μｍ厚のヒト皮膚の冷凍切片、そして抗ラットＢＨ　ＩｇＧを用いた。詳しくは、ヒト皮膚標本を、インフォームドコンセントの上で、東京医科大学のアトピー性皮膚炎を患っている患者から得た。本研究は、倫理（Human Ethics）に関する東京医科大学施設内審査委員会と資生堂特別部会によって承認された。
　ヒト・アトピー性皮膚炎（病変皮膚と非病変皮膚）及び正常皮膚の切片を、抗ラットＢＨ　ＩｇＧ及び抗ヒト・フィラグリンＩｇＧと共に室温にて１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳで洗浄し、そして蛍光結合二次抗体であるＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　５５５又は４８８（Molecular Probes Inc.、Eugene, OR）と共にさらにインキュベートした。ＤＡＰＩ（４’，６’‐ジアミジノ‐２‐フェニルインドール；Molecular Probes）を核の可視化に使用した。
　正常皮膚の組織染色結果を図８に、そして健常者由来の皮膚（正常皮膚）とアトピー性皮膚炎患者由来の皮膚（アトピー皮疹部）との対比結果を図９に示す。図８に示すとおり、ブレオマイシン水解酵素は、表皮上層で高発現しており、フィラグリンと同一局在を示した。一方、アトピー皮疹部では、正常皮膚と比較してブレオマイシン水解酵素及びフィラグリンの発現が低かった（図９）。
定量的ＰＣＲ
　ケラチノサイトにおけるブレオマイシン水解酵素の発現量は、Light Cycler 480 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) を用い、以下の方法で、定量的ＰＣＲにより測定した。試薬はLight Cycler FastStart DNA Master CYBR Green Iを用いた。SYBR Green I master miｘ　10 μｌに以下のブレオマイシン水解酵素プライマーをそれぞれ 0.6 μｌ、水を6.8 μｌ加え、全量を20 μｌとし、95℃　15秒、55℃　20秒、72℃　20秒で、45サイクルのＰＣＲを行なった。得られた結果は、ハウスキーピング遺伝子であるG3PDHの結果と比較して補正した。
フォワードプライマー：　TGTGGTTTGGCTGTGATGTT （配列番号１）
リバースプライマー：　　GCACCATCCTGATCATCCTT （配列番号２）
　上記定量的ＰＣＲの結果を図１０に示す。図１０に示すとおり、ブレオマイシン水解酵素は、８０％コンフルエントのケラチノサイト、すなわち、分化していないケラチノサイトと比較して、コンフルエントに達した、すなわち、分化したケラチノサイトで高発現していた。言い換えると、本実験結果から、当該酵素が分化前の基底細胞ではあまり発現しないことが分かる。この定量的ＰＣＲの結果は、上記組織染色の結果を裏付けるものである。
実験５
１）ヒト表皮ケラチノサイトを用いたＢＨプロモーターのルシフェラーゼアッセイ：
　増殖期（約80％コンフルエント）もしくは、分化後（コンフルエント後、空気曝露し、2　ｍＭカルシウムを添加し、さらに2日培養を継続したもの）のケラチノサイトに、Lysis buffer(200 μｌを加え、細胞を溶解させる。測定には、Bright-Glo Luciferase assay System (Promega Co., Madison, WI, USA)を用いた。サンプル20 μｌを所定のチューブに移し、Auto Lumat Plus (LB953)Berthhold GmbH & Co. KG. Bad Wildbad Germany)を用いて測定した。図１２の結果から、ブレオマイシン水解酵素が発現するには、上記転写調節領域は、当該酵素のコード配列から少なくとも２１６ｂｐ下流までの領域を有していればよいことが分かる。
２）ＮＨＥＫへのＵＶ照射:
　30 mJもしくは、60 mJのUVBを照射し(Torex Fl20S-E-30/DMR, 20W, Toshiba Medical Supply)、3時間後、24時間後、48時間後に所定の方法にてRNAを回収し、定量PCRにより、ブレオマイシン水解酵素及びカルパインのmRNA発現を測定した。測定の結果、30mJ照射後48時間で回収した試料が最もブレオマイシン水解酵素のmRNAを発現していた（図１３）。
３）ブレオマイシン発現に及ぼすサイトカインの影響
　IL-4 (終濃度：０．１, 1.0, 10 ng/ml)、TNFα(終濃度：０．１, 1.0, 10 ng/ml)、IFNγ(終濃度： 1.0, 10, 100 ng/ml)のそれぞれを、増殖期の培養ケラチノサイトに添加し、２４時間インキュベートした後、Isogenを用いてＲＮＡを採取した。定量PCRにより、ブレオマイシン水解酵素のmRNA発現を測定した。結果を図１４に示す。図１４の結果から、Th2サイトカインの一種であるインターロイキン－４(IL-4)は、ブレオマイシン水解酵素の発現をダウンレギュレートすることが分かる。
実験６
ヒトＢＨ遺伝子の特性決定
１）ＢＨの５’‐フランキング領域のクローニング
　ヒトＢＨ遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて、５’‐フランキング領域を、遺伝子特異的プライマー１（ＧＳＰ１）、５’‐tccctcgagtctgtatcagagcagctaca‐３’（配列番号３）と遺伝子特異的プライマー２（ＧＳＰ２）、５’‐tgaacacgcgtccgagctgctcatggcg‐３’（配列番号４）を使用して、製造業者の取扱説明書に従いＧｅｎｏｍｅ　Ｗａｌｋｅｒ　Ｋｉｔ（Clontech、Mountain View, CA）を用いて増幅した。簡単に言えば、５％のジメチルスルホキシドの存在下、Ｅｘ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Takara、Shiga, Japan）を用いる、製造業者によって推奨されるツーステップＰＣＲプロトコール：９４℃にて２５秒間、そして７２℃にて４分間を７サイクル、それに続いて９４℃にて２５秒間、そして６７℃にて４分間を３２サイクル、そして最後の伸長６７℃にて４分間、を使用して、ＧＳＰ１とアダプタープライマー（ＡＰ）１を用いた一次ＰＣＲを実施した。次いで、一次ＰＣＲ混合物を希釈し、そしてＧＳＰ２とＡＰ２を用いた二次ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。７サイクルの代わりに５サイクルの初回サイクルと、それに続く３２サイクルの代わりに２０サイクルの使用を除いて、二次ＰＣＲは一次ＰＣＲと同一であった。ＢＨの５’‐フランキング領域の連続的な５’‐欠失突然変異株を、図１５に列挙したプライマーを使用したＰＣＲによって産出した。増幅後に、すべてのＰＣＲ産物をｐＧＥＭ‐Ｔ簡易ベクター（Promega、Madison, WI）内にクローン化し、そしてＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　３１０　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Applied Biosystems、Foster City, CA）を用いて配列決定した。
　レポーター・プラスミドｐＧＬ３‐１２１６／＋１を構築するために、ＰＣＲを、以下の条件下：最初の変性９４℃にて４分間、９４℃にて３０秒間、６０℃にて１分間、７２℃にて１分間を３０サイクル、そして最後に伸長７２℃にて４分間、鋳型としてのｐＧＥＭ‐Ｔ‐１２１６／＋１、並びに制限部位Ｋｐｎ　Ｉ及びＭｌｕ　Ｉを含む１組の特異的なＢＨプライマー（５’‐ccgggtaccatcagagttccttagaa‐３’（配列番号５）及び５’‐taaatacgcgttggcgcccacgctgccg‐３’）（配列番号６）を使用して実施した。得られたＰＣＲ産物を、Ｋｐｎ　Ｉ及びＭｌｕ　Ｉで消化し、そしてｐＧＬ３‐Ｂａｓｉｃベクター（Promega）内にクローニングした。なお、ｐＧＬ３‐Ｂａｓｉｃベクターは、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子を含んでいる。構築物のすべてを、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｄｉ　Ｋｉｔ（QIAGEN、Duesseldorf, Germany）を使用することで調製した。
２）部位特異的突然変異誘発
　ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、及びＩＲＦ‐１／２結合部位の突然変異誘発を、製造業者の取扱説明書に従ってＱｕｉｃｋ　ｃｈａｎｇｅ　ｓｉｔｅ‐ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Stratagene、La Jolla, CA）を使用することによって実施した。Ｓｐ‐１に欠失変異を作製するために、５’‐ggaccccgtttcagcctccccgcc-３’ （配列番号７）（突然変異体Ｓｐ‐１部位の順方向プライマー）と５’‐ggcggggaggctgaaacggggtcc‐３’ （配列番号８）（突然変異体Ｓｐ‐１部位の逆方向プライマー）を使用した。ＭＺＦ‐１突然変異体については、５’‐gactcagcaacgcggttttgtccctccgc‐３’（配列番号９）（突然変異体ＭＺＦ‐１部位の順方向プライマー）と５’‐gcggagggacaaaaccgcgttgctgagtca‐３’（配列番号１０）（突然変異体ＭＺＦ‐１部位の逆方向プライマー）を使用した。ＩＲＦ‐１／２突然変異体については、５’‐gccgccgagcctccggcgctcc‐３’ （配列番号１１）（突然変異体ＩＲＦ‐１／２部位の順方向プライマー）と５’‐ggagcgccggaggctcggcggc‐３’ （配列番号１２）（ＩＲＦ‐１／２部位の逆方向プライマー）を使用した。
３）トランスフェンクションとプロモーター活性の計測
　ケラチノサイトを、５×１０4細胞／ウェルの密度にて１２ウェル組織培養プレート内で培養し、そしてＦｕＧｅｎｅ　ＨＤ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ試薬（Roche Diagnostics、Basel, Switzerland）を使用して、それぞれの構築物１μｇを用いてトランスフェンクションした。トランスフェンクション効率を補正するために、すべての細胞にＨＳＶ‐ＴＫプロモーターの制御下にあるウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＧＬ４．７４［ｈＲｌｕｃ‐ＴＫ］ベクターPromega）を同時トランスフェンクションした。特に断りのない限り、細胞を、トランスフェンクションの２４時間後に採集し、そして１ウェルあたり２５０μｌのＰａｓｓｉｖｅ　ｌｙｓｉｓバッファー（Promega）を用いて溶解した。ルシフェラーゼ活性を、Ｄｕａｌ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Promega）及びＡｕｔｏｌｕｍａｔ　ｐｌｕｓ　ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Berthold Technologies、Bad Wildbad, Germany）を用いて分析した。ホタル・ルシフェラーゼ活性を、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性について標準化した。各構築物について、３つのトランスフェンクションを独立に実施し、そして結果を平均値として表した。
４）定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲ分析
　ＢＨ及び関連因子の転写レベルを、定量的リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲによって分析した。全ＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってＩＳＯＧＥＮ（Nippon Gene、Tokyo, Japan）を用いて培養細胞から抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩ（Invitrogen、Carlsbad, CA）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲを、製造業者の取扱説明書に従ってＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ　Ｍａｓｔｅｒ（Roche Diagnostics）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　ｒａｉｄ　ｃｙｃｌｅｒシステムにより実施した。使用したプライマーに関する情報を、図１６に示す。グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を基準遺伝子として使用した。増幅した断片の特異性を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ分析ソフトウェアによる融解曲線の定量分析によって確認した。ｍＲＮＡの量を、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡに対して標準化し、そして最終的に未処理対照のｍＲＮＡに対する比として示した。
５）ＩＲＦ‐１及び‐２のｓｉＲＮＡベースの抑制
　培養ケラチノサイトを、製造業者の取扱説明書に従って、４０ｎＭのｓｉＩＲＦ‐１、ｓｉＩＲＦ‐２、及びｓｉＣｏｎｔｒｏｌ　Ａ（Santa Cruz Biotechnology、Santa Cruz, CA）と共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉ　Ｍａｘ（Invitrogen、Carlsbad, CA）を使用してトランスフェンクションした。その細胞を、抗生物質不含培地中で２４時間培養し、その後、全ＲＮＡを抽出し、そして上記したように、リアルタイムＲＴ‐ＰＣＲによって分析した。
６）電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）
　二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、一本鎖ビオチン化オリゴヌクレオチドと一本鎖未標識オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製した（図１７）。核の抽出とＥＭＳＡを、Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット及びＥＭＳＡ　ｇｅｌ　ｓｈｉｆｔキット（Panomics、Santa Clara, CA）を使用することで実施した。核抽出物（４μｇ）を、１×結合バッファー及び１μｇのポリｄ（Ｉ‐Ｃ）、並びにＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＩＲＦ‐１／２、及びＧＡＴＡ‐１結合部位に対応するビオチン化プローブ（５０ｐｍｏｌ）と共に１５℃にて３０分間インキュベートした。競合アッセイのために、２倍の過剰の未標識プローブを、ビオチン化プローブの添加前に結合反応に加えた。これらのインキュベーション混合物を、次に、０．５×ＴＢＥバッファーと共に８％のポリアクリルアミドゲル中で電気泳動し、そしてＢｉｏｄｙｎｅ　Ｂナイロン膜（Pall、Port Washington, NY）に転写した。ＥＭＳＡ　ｇｅｌ　ｓｈｉｆｔキットの中の化学発光検出試薬を使用することで、バンドを可視化した。
７）結果
ヒトＢＨ遺伝子プロモーターの単離と特性決定
　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｎｅｔ　ＭＯＴＩＦプログラムによる検索で、ヒトＢＨの５’‐フランキング領域内の多数の推定転写因子結合部位が明らかになった（図１８Ａ）。特に、転写開始部位の位置に近い－２１６／＋１領域の中に、ＭＺＦ１、Ｓｐ‐１、ＩＲＦ‐１／２、及びＧＡＴＡ‐１／２によって認識されるコンセンサス配列によく合致した配列が存在したので、これらの転写因子がＢＨプロモーター活性の調整にかかわっていることが示唆された。より厳密にＢＨのプロモーター領域を決定するために、欠失分析を実施した（図１８Ｂ）。最高レベルのルシフェラーゼ活性を、ｐＧＬ３‐８１６でトランスフェンクションした分化型ケラチノサイトにおいて検出した。しかしながら、欠失プラスミドの相対ルシフェラーゼ活性は、欠失がｐＧＬ３‐２１６に進むまで高いままで残っていた。構築体の中で、（ｐＧＬ３‐４４４と表示）断片－４４４／＋１を含むプラスミドは、培養ケラチノサイトにおいて有意に低い活性を示し、－６１６／－４４４領域における上流サプレッサー活性の存在が示唆された。これらの結果が－２１６／－１領域がＢＨ遺伝子転写のための最小プロモーターを含んでいることを実証したので、そのヌクレオチド配列を図１８Ｃに示す。この配列はＴＡＴＡ‐又はＣＣＡＡＴ‐ボックスを含んでいなかったので、この遺伝子のハウスキーピング性質が示唆された。その一方で、いくつかの転写性因子結合部位、例えばＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＩＲＦ‐１／２、及びＧＡＴＡ‐１／２などがこのコア・プロモーター領域に存在していた。
ＢＨ遺伝子調節に関与する潜在的ｃｉｓ‐エレメントの同定
　ＢＨ遺伝子発現の転写調節に関与する最小プロモーターの潜在的ｃｉｓ‐エレメントを決定するために、各ｃｉｓ‐エレメントを標的とした新しい一連の欠失突然変異株を構築した。ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、及びＩＲＦ‐１／２の結合部位を欠失した場合、プロモーター活性が大きく下方制御された（図１９Ａ）。
　さらに、これらの転写因子が推定結合部位のそれぞれに実際に結合できるかどうか調査した。このために、電気泳動移動度シフト・アッセイ（ＥＭＳＡ）を培養ケラチノサイトからの核抽出物、及びＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、又はＩＲＦ‐１／２結合部位を含むビオチン化二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いて実施した。図１９Ｂに示されているように、Ｓｐ‐１、ＭＺＦ‐１、及びＩＲＦ１／２は、ＢＨプロモーターの対応する標的部位に結合したが、ＧＡＴＡ‐１／２は結合しなかった。これらの結果は、－２１６～－１０５ｂｐのプロモーター領域のこれらの結合部位が、ＢＨ転写のためのｃｉｓ‐エレメントに不可欠であることを示している。
ＢＨ遺伝子発現のサイトカイン媒介性調節
　ＢＨはＮＭＦ産出酵素であるので、それがＡＤの病態生理に関与する可能性もある。よって、ＢＨ遺伝子発現に対するＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカインの効果を調べた。図２０Ａは、増殖型ケラチノサイトにおいて、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ‐γが、用量依存的様式でＢＨ　ｍＲＮＡ発現を下方制御したことを示した。その一方、Ｔｈ２及びＴｈ１７サイトカインは、ＢＨの発現に対して有意な効果を全く示さなかった。同様の結果が分化型ケラチノサイトによって得られた（データ未掲載）。ＢＨ遺伝子発現の調整におけるＩＦＮ‐γの役割を解明するために、プロモーターアッセイを実施して、サイトカイン応答要素を特定した。図２０Ｂに示されているように、ＩＦＮ‐γは、－１３１～－１２０の間にＩＲＦ‐１／２結合配列を含んだｐＧＬ３‐ＢＨ‐６１６でトランスフェンクションした培養ケラチノサイトにおいてＢＨプロモーター活性を下方制御した。この配列の欠失後には、ＩＦＮ‐γがプロモーター活性を抑制することはもうなかった（図２０Ｂ）。加えて、ＩＲＦ‐１／２がＢＨのＩＦＮ‐γ誘発性下方調節の必須メディエーターであるかどうか判断するために、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２遺伝子発現を抑制した。ＩＦＮ‐γの活性は、ＩＲＦ‐１又は‐２　ｓｉＲＮＡ（４０ｎＭ）のいずれかでトランスフェンクションした培養ケラチノサイトにおいて有意に抑制された（図２０Ｃ）。これらの結果は、ＩＲＦ‐１／２結合配列がＢＨ遺伝子発現のＩＦＮ‐γ誘発性下方調節に不可欠であることを強く示唆している。
培養ケラチノサイトにおけるＢＨ及び関連因子の発現
　表皮における転写調節の機構を調査するために、リアルタイムＰＣＲ法によって増殖型又は分化型細胞におけるＢＨ、カルパインＩ、及び推定転写因子の発現を分析した。図２１Ａに示されているように、ＢＨ　ｍＲＮＡは、例えば、増殖型ケラチノサイトと比較した、集密期の２日後のもの（３．６倍）、及び高カルシウム濃度にて培養したもの（８．６倍）などのように、分化型ケラチノサイトにおいて上方制御された。これらの結果は、プロモーターアッセイデータと一致している（図１８Ｂ）。同様の結果を、カルパインＩ（約２．５倍の上方制御）に関して得た。また、培養ケラチノサイトにおいて、様々な転写因子、例えば、ＭＺＦ‐１、Ｓｐ‐１、ＧＡＴＡ‐１、ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２などの発現パターンを調べた。図２１Ｂに示されているように、これらの転写因子は、ＢＨの発現に沿って、分化型ケラチノサイトにおいて上方制御された。しかしながら、ＧＡＴＡ‐１　ｍＲＮＡ発現は、他の因子と比較して有意に低かった（＜１／３２）。ＧＡＴＡ‐１はケラチノサイトにおいて重要な役割を担っていないように思われる。よって、ＢＨがＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１を介して分化依存的様式で合成されることを示唆する。ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２がまた、分化刺激によっても上方制御されたという事実は、ＢＨ発現がＩＦＮ‐γに対して非常に感受性であることを示している。
推定転写因子の発現に対するＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの効果
　これらの転写因子のサイトカイン依存性調節についてさらに調査した。図２２Ａは、ＩＦＮ‐γが、用量依存式にＩＲＦ‐１　ｍＲＮＡ発現を強く上方制御したことを示す。同様に、ＩＲＦ‐２発現は、ＩＦＮ‐γの存在下で上方制御された。対照的に、ＩＲＦ‐１及びＩＲＦ‐２の発現は、１００ｎｇ／ｍｌにおいてのみＩＬ‐４の存在下で有意に増強された（図２２Ｂ）。興味深いことに、ＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１は共に、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ‐４の存在下で最も効果的に下方制御された（図２２Ｃ）。これらの結果は、ＢＨ発現が、それぞれ、直接的及び間接的にＴｈ１及びＴｈ２サイトカインによって調節されていることを示唆している。
アトピー性皮膚炎皮膚においてＢＨは下方制御される
　ＦＬＧの機能喪失型突然変異はＡＤの発症機序に関連するが、遺伝子欠損だけではなく、分解経路の障害もまたＡＤの病理に関連する可能性がある。そのため、ＡＤ患者の病変皮膚及び非病変皮膚におけるＢＨ及びフィラグリンの局在、並びにＢＨ活性を次に調べた。正常表皮では、抗ＢＨ抗体と抗フィラグリン抗体での二重染色は、上面表皮における、特に、先に報告されたように、顆粒層におけるＢＨとフィラグリンの同時局在を示した（図２３Ａ）。より高い倍率では、ＢＨが顆粒層から角化層までに局所している一方で、フィラグリンが顆粒細胞に限定されていることが明確に示された。対照的に、ＢＨ発現は、この研究で診察したＡＤ患者（ｎ＝７）の病変皮膚及び非病変皮膚において劇的に減少した。これらの患者のすべては、有意な染色が常に検出されたにもかかわらず、比較的弱いフィラグリン染色を示した（図２３Ａ）。免疫組織化学に加えて、ＢＨ活性を１８人のＡＤ患者及び３０人の健常ボランティアから得たテープ剥離サンプルからの角質細胞抽出物において計測した。ＡＤ患者の病変皮膚と非病変皮膚からの抽出物は、健常人からのそれと比較して、（それぞれ２７．１と８．８％まで）実質的に低いＢＨ活性を示した（図２３Ｂ）。これらの結果は、ＢＨがフィラグリンと同時局在化され、そしてその活性がＡＤを患っている患者の皮膚において劇的に低減されることを実証した。
考察
　この研究では、ＢＨ遺伝子発現の調節機序を、プロモーター領域のクローニング及び機能の特徴づけによって研究した。プロモーター解析では、－２１６ｂｐ上流の中にＢＨプロモーター活性にとって重要な領域を同定した（図１８Ｂ）。この領域では、推定ＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１結合部位が、ＢＨプロモーター活性に対して有意な効果を示した（図１８Ｃ及び１９Ａ）。興味深いことに、Ｓｐ‐１及びＭＺＦ‐１もまた、フィラグリン分解の開始にとって重要な酵素であるＰＡＤ１の調整に関与することが報告されている。Ｓｐ‐１は、哺乳動物細胞において転写因子として機能するジンク・フィンガー・タンパク質のＳｐ／Ｋｒｕｐｐｅｌ様ファミリーの典型的なメンバーである。増殖、アポトーシス、分化、及び腫瘍性形質転換を含めた細胞機能のほとんどすべての面に関与すると考えられる。ヒト表皮において、Ｓｐ‐１は、インボルクリン、ロリクリン、トランスグルタミナーゼ、ＰＡＤ１、２、及び３のそれを含めて、表皮分化に参加する遺伝子の重要な調節因子である。ＭＺＦ‐１は、ジンク・フィンガー・タンパク質のＫｒｕｐｐｌｅファミリーに属する転写因子であり、分化全能性造血性細胞、並びに骨髄始原細胞において発現される。しかしながら、哺乳動物表皮における転写調節でのＭＺＦ‐１の機能は報告されていない。増殖型ケラチノサイトと比較して、分化型ケラチノサイトにおいてＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１、並びにＢＨを同時に上方制御することを見つけ（図２１Ｂ）、ハウスキーピング的な役割よりむしろ分化におけるＢＨの役割を示した。我々の結果は、これらの転写因子がケラチノサイト最終分化中のＢＨの基本的な転写調節のための活性化因子として機能することを明確に示した。
　その一方で、ｃｉｓ作用エレメントの調査は、この領域内のＩＲＦ‐１／２結合部位をさらに規定した。ＥＭＳＡを使用して、ＢＨプロモーター領域へのＩＲＦｓの直接結合を確認した（図１９Ｂ）。この結合配列の部位特異的突然変異誘発は、ＢＨプロモーター活性の有意な減少をもたらした（図１９Ａ）。そのため、ＩＲＦ‐１／２転写因子もまた、基本条件の下、ＢＨ遺伝子の最小プロモーター活性に必要であろう。ＩＲＦファミリーは転写因子の群であり、今までのところ、９つのＩＲＦメンバー（ＩＲＦ‐１～‐９）が様々な細胞型及び組織で同定された。これらのＩＲＦ分子は、ＩＦＮ‐α、β、及びγによる刺激の下で、抗ウイルス防御、免疫応答／調節、及び細胞成長調節において役割を果たしている。ＩＲＦ‐１及び‐２は、多くのＩＦＮ‐γ誘導性遺伝子の調整に関与する作動薬‐拮抗薬対として機能することが示されている。興味深いことに、ＩＦＮ‐γは、ＢＨ　ｍＲＮＡ発現を顕著に抑制した（図２０Ａ及びＢ）。ノックダウン及び部位特異的突然変異誘発分析では、ＩＲＦ‐１／２結合部位がＢＨ発現のＩＦＮ‐γ媒介性抑制に関与することを確認した（図２０Ｂ及びＣ）。これらの結果は、ＩＲＦ‐１／２がヒトケラチノサイトにおけるＢＨ遺伝子のＩＦＮ‐γ媒介性下方調節のメディエーターであることを明確に示している。その一方で、Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ‐４及びＩＬ‐１３は、２４時間のインキュベーションの間、直接的な作用をまったく示さなかった（図２０Ａ）。しかしながら、これらのＴｈ２サイトカインは、アクチベーター分子であるＭＺＦ‐１及びＳｐ‐１の発現を有意に抑制した。よって、Ｔｈ２サイトカインがＢＨ発現を負に調節するのは妥当なことである。
　また、ＢＨが病変及び非病変ＡＤ皮膚において劇的に下方制御されたことも示した（図２３Ａ及びＢ）。フィラグリン突然変異はＡＤなどのバリアー障害関連疾患の主な危険因子であるが、突然変異分析では、アイルランドでの発生の５０％未満、そして日本での～２０％の割合しか占めていないことが指摘された。フィラグリン合成不全だけではなく、フィラグリンの分解傷害もバリアー機能の崩壊に関与すると仮定した。ＮＭＦの減少が乾燥肌をもたらし、それがバリアーの崩壊を進行させることは明確である。ＡＤがＴｈ２極性化疾患であることは周知である。しかしながら、最近の報告は、Ｔｈ１サイトカインもまたＡＤにおいて役割を担っていることを示唆している。例えば、「内因性ＡＤ」は、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、及びＩＬ‐１３の低い発現、及びＩＦＮ‐γの高い発現によって免疫学的に特徴づけられる。加えて、Ｔｈ１からＴｈ２へのシフトが、ＡＤ皮膚における急性相から慢性相への間に起こる。我々の結果は、ＡＤにおいて、ＩＦＮ‐γが考えられていたより重要な役割を担っている可能性もあることを示している。
　結論として、我々の結果は、ヒト表皮におけるＢＨ転写が二重様式で調節されることを示している。一方の経路はケラチノサイト最終分化の制御下にあり、そして、もう一方はＴｈ１及びＴｈ２サイトカインに依存している。これらの経路は、相互に関連しているので、バランスがＢＨ発現の下方調節に向かって容易にシフトするであろう。ＢＨの低下がＮＭＦの不足をもたらし、それを受けて乾燥肌か、さらにはバリアーの崩壊につながる。これらの結果は、ＢＨ調整とＡＤの発症機序への新しい見識を提供する。
実験７
ブレオマイシン水解酵素産生促進効果を示す薬剤・生薬のスクリーニング
　正常な包皮に由来するヒトケラチノサイト（Cascade Biologics社、ポートランド、メリーランド州）を、上皮増殖因子（0.1ng/ml）、インスリン（10μg/ml）、ヒドロコルチゾン（0.5μg/ml）、ウシ下垂体抽出物（0.4％）、ゲンタマイシン（50μg/ml）、アンホテリシンB（50ng/ml）を補足したMCDB 153培地からなるケラチノサイト増殖培地の中で、図２４に示す各種生薬エキス又は薬剤（5-50 μg/ml）の存在下で24時間室温で培養した。コントロールとしては、0.1% 1，3－ブチレングリコールを用いた。
ＲＴ－ＰＣＲ
　上記のとおりに培養したヒトケラチノサイトから単離した全RNA（500ng）を、ランダム・ヘキサマーとSuperscript II RNアーゼH-逆転写酵素（Gibco-BRL社、ゲサースバーグ、メリーランド州）を用いて逆転写した後、Taq DNAポリメラーゼ（Takara社、京都、日本国）と下記のプライマーを用いてPCR増幅した。94℃で30秒間、60℃で1分間、72℃で1分間という増幅サイクルを40回実行した。
　図２４の結果より、コントロールと比較して、イザヨイバラエキス（10μｇ／ｍｌ）、トウキエキス（10μｇ／ｍｌ）、オウバクエキス（10μｇ／ｍｌ）、オドリコソウエキス（10μｇ／ｍｌ）及びローズマリーエキス（10μｇ／ｍｌ）などのエキスやベンゼンスルホニルＧＡＢＡ（50μｇ／ｍｌ）、エリスリトール（50μｇ／ｍｌ）が、ブレオマイシン水解酵素の発現を有意に亢進させることが分かる。従って、これらの抽出がいずれもブレオマイシン水解酵素の発現を促進することがわかった。ＰＣＲに使用したプライマーは以下のとおりである。
フォワードプライマー: ５’‐TGTGGTTTGGCTGTGATGTT‐３’（配列番号１３）
リバースプライマー：　５’‐GCACCATCCTGATCATCCTT‐３’（配列番号１４）
また、内部対照としてＧＡＰＤＨをＰＣＲ増幅し、使用したプライマーは下記のとおりである。
フォワードプライマー: GGTGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGTCG（配列番号１５）
リバースプライマー：　TATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTGAGG（配列番号１６）

Claims (3)

  1. 　イザヨイバラエキス、トウキエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス、ローズマリーエキス、ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ及びエリスリトールからなる群から選ばれる１又は複数を活性成分として含有する、ブレオマイシン水解酵素産生促進剤。
  2. 　イザヨイバラエキス、トウキエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス、ローズマリーエキス、ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ及びエリスリトールからなる群から選ばれる１又は複数を活性成分として含有する、天然保湿因子産生促進剤である、請求項１記載のブレオマイシン水解酵素産生促進剤。
  3. 　トウエキス、オウバクエキス、オドリコソウエキス、ローズマリーエキス、ベンゼンスルホニルＧＡＢＡ及びエリスリトールからなる群から選ばれる１又は複数を活性成分として含有する、乾燥肌改善剤である、請求項１記載のブレオマイシン水解酵素産生促進剤。
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